JP6397629B2

JP6397629B2 - 浄化剤

Info

Publication number: JP6397629B2
Application number: JP2014008492A
Authority: JP
Inventors: 昭宏栗田; 山岸　豊; 豊山岸
Original assignee: Toyo B Net Co Ltd; Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Current assignee: Toyo B Net Co Ltd; Artience Co Ltd
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2018-09-26
Anticipated expiration: 2034-01-21
Also published as: JP2015136642A

Description

本発明は、水中のアンモニウムを分解する方法に関し、より詳細には、グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセル、またはそれを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋を用いて、水中のアンモニウムを効率よく除去する方法に関する。

タンパク質などの有機化合物の分解などでも生じるアンモニウムは、養魚水や農業廃水、工業廃水など自然下や人工的環境下において様々な水中に存在する。アンモニウムは生体の健康を損ね、特に魚類などは低濃度で死に至らしめるなど有害な物質であるが、水中のアンモニウムの除去は浄化細菌を用いて亜硝酸などに分解される方法が一般的に用いられている。この方法は浄化細菌の生育と良好維持が前提であり、浄化細菌が生育できない環境や浄化機能が低下するストレス環境では有効な手段となり得ない。

アンモニウムの浄化作用を持つ酵素を処理水中にそのまま添加投与する事は、水流がある環境では非常に非効率であり、浄化反応が十分に行われない可能性が高く一般的には使用されていない。

このような事情に鑑み、速やかにアンモニアを分解除去したい廃水や汚水、生活水や養魚水など様々な水に関して短時間かつ高効率に除去でき、かつ恒常性が維持できる技術の開発が強く望まれていた。

アンモニアを分解するグルタミン合成酵素をマイクロカプセルに内包し、マイクロカプセルの薄膜を通じてカプセル内部に入ったアンモニウムイオンを酵素反応により分解する。使用不能になったマイクロカプセルはそれを固定化したシートやフィルム、内包した袋などの形態にする事で回収交換が容易となる。
本発明は、水流があって浄化作用効率が悪い水中、浄化細菌が環境ストレスにより生存もしくは生育できないかで浄化機能を発揮できない性状の水中などの水質浄化ができるようになる事、また、生体が存在しその生体の生命や健康を損ねずに水質浄化ができる事。浄化剤が水中に分散せず回収交換が容易な浄化剤を目的とする。

発明者らは、これらの問題を解決すべく、鋭意努力した結果、グルタミン合成酵素を包含したマイクロカプセルまたはそれを固定化したフィルムやシート、袋などに内包することで上記目的に合致していることを見出した。

すなわち、半透性を有するマイクロカプセルにグルタミン合成酵素を封じ込め、マイクロカプセルの薄膜を通じてカプセル内部に入ったアンモニウムイオンを酵素反応により分解する。使用不能になったマイクロカプセルを回収交換することで、継続的にアンモニアを分解し水質浄化の恒常性を維持することができる。

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）浄化作用を持つ酵素（例えば、アンモニアを分解するグルタミン合成酵素などのリガーゼ）を内包するマイクロカプセルを用いて、水中の有害物質（例えば、アンモニウム）を分解し除去や低濃度化させる方法と、そのマイクロカプセル、またはこのマイクロカプセルをシートやフィルムなどに固定化または袋などに内包させて回収交換が容易なもの。
（２）アンモニアを分解する酵素が、グルタミン合成酵素、アンモニアを原料として生成反応するリガーゼ、アンモニア分解酵素、これらに遺伝子組換えにより耐塩、耐有機溶媒、耐熱、耐冷、耐pH、好冷などの機能を付加させた酵素、アンモニア分解作用を持つ生体の可溶化液とその精製物からなる群より選択される少なくとも１種の酵素や調整液である（１）記載の方法。
（３）マイクロカプセルの被膜が、分子量1000以下のイオンや低分子物質は透過させ、グルタミン合成酵素などの（２）を透過しない半透膜である（１）記載の方法。
（４）マイクロカプセルの被膜が、アルギン酸、メトキシペクチン、硫酸セルロース、ゼラチン、キトサン、カラギーナンなどの多糖類や食物繊維及びワックスなる群より選択される少なくとも１種の材料を含む（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）１カプセル中のグルタミン合成酵素含有量が0.01 U〜500U/ｍｌである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）浄化作用を持つ酵素（例えば、アンモニアを分解するグルタミン合成酵素などのリガーゼ）を内包するマイクロカプセルを含む、有害物質（例えば、アンモニウム）除去を利用した試薬かそのキット。
（７）浄化作用を持つ酵素（例えば、アンモニアを分解するグルタミン合成酵素などのリガーゼ）を内包するマイクロカプセル、またはこのマイクロカプセルをシートやフィルムなどに固定化または袋などに内包させたもの。

本発明により、浄化細菌が生育困難な環境の水中でもアンモニウムイオンが簡便な操作でかつ短時間で除去できるようになった。また水流がある水中でも水質浄化が効率よくできるようになった。

本発明であるマイクロカプセルの概念図。マイクロカプセルを不織布の袋に内包した実例写真。

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。

本発明は、浄化作用を持つ酵素（例えば、アンモニアを分解するグルタミン合成酵素などのリガーゼを内包するマイクロカプセルを用いて、水中の有害物質（例えば、アンモニウム）を分解する。マイクロカプセル化する事やそれを固定化や内包する袋を作成する事を提供する。

アンモニアを分解する酵素として、グルタミン合成酵素、アンモニアを原料として生成反応するリガーゼ、アンモニア分解酵素、アンモニア分解作用を持つ生体の可溶化液とその精製物などを例示することができるが、これらに限定されることはない。

マイクロカプセルは、無機顔料として、二酸化チタン、亜鉛華（酸化亜鉛）、酸化鉄、酸化クロム、鉄黒、コバルトブルー、アルミナ白、酸化鉄黄、ビリジアン、硫化亜鉛、リトポン、カドミウムエロー、朱、カドミウムレッド、黄鉛、モリブデートオレンジ、ジンククロメート、ストロンチウムクロメート、ホワイトカーボン、クレー、タルク、群青、沈降性硫酸バリウム、バライト粉、炭酸カルシウム、鉛白フェロシアン化物（紺青）、燐酸塩（マンガンバイオレット）、炭素（カーボンブラック）、有機顔料として、ローダミンレーキ、メチルバイオレットレーキ、キノリンエローレーキ、マラカイトグリーンレーキ、アリザリンレーキ、カーミン6B、レーキレットC、ジスアゾエロー、レーキレット4R、クロモフタルエロー3G、クロモフタルスカーレットRN 、ニッケルアゾエロー、パーマネントオレンジHL、フタロシアニンブルー、フタロシアニングリーン、フラバンスロンエロー、チオインジゴボルドー、ペリノンレッド、ジオキサドンバイオレット、キナクリドンレッド、ナフトールエローS、ピグロントグリーンB、ルモゲンエロー、シグナルレッド、アルカリブルー、アニリンブラックなどの着色剤、さらに、酵素保護剤として、牛血清アルブミン、ゼラチン、トレハロースなどを内包してもよい。

マイクロカプセルの被膜は、グルタミン合成酵素を封じ込め、かつアンモニアを通過させる半透性を有するものであればよく、このような被膜としては、アンモニアなどの分子量1000以下のイオンは透過させ、グルタミン合成酵素は透過しない半透膜が適当である。

マイクロカプセルの平均粒度（d₅₀）は、10μm〜1 mmが適当であり、50μm〜500μmが好ましく、100μm〜300μmがより好ましい。粒度分布を表す指標である標準偏差（粒度分布）の値は、1%〜300%が適当であり、1%〜100%が好ましく、1%〜30%がより好ましい。平均粒度と粒度分布は、顕微鏡観察でカプセルの直径を顕微鏡などで実測することにより求めることができる。
マイクロカプセルの比重は、1.0以上が適当であり、1.0〜3.0が好ましく、1.0〜2.0がより好ましい。比重は、ピペット法（JIS Z8820-2:2004）に従い、測定することができる。
また、１カプセル中のATP分解酵素含有量は、0.1 ng〜1 mgであるとよく、好ましくは1 ng〜500μgであり、より好ましくは1 ng〜1μgである。カプセルに内包させるATP分解酵素量は、カプセル形成前の溶液に投入する酵素量により調節が可能である。

マイクロカプセルの被膜は、アルギン酸、メトキシペクチン、硫酸セルロース、ゼラチン、キトサン、カラギーナンなどの多糖類や食物繊維及びワックスなどの材料を含むとよい。

処理水としては、工業廃水、生活廃水、農業廃水、養魚水、家畜糞尿や畜舎汚水、農業用水、生活環境で接する環境水や天然水、工業上水、生活上水などを例示することができるが、これらに限定されることはない。

グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセルを処理水に添加することにより、処理水のアンモニウムがマイクロカプセル中のグルタミン合成酵素と反応して分解される。反応は、15〜45℃の温度条件下で、1〜60分間行うとよい。アンモニウムとグルタミン合成酵素の反応は、グルタミン合成酵素の濃度が0.1Ｕ〜50Ｕとなる反応系で行うとよい。処理水中に存在するアンモニウムの量は、処理反応水に存在するグルタミン合成酵素で完全に分解する量であればよく、除去反応量はマイクロカプセルの投与量で調節できる。

グルタミン合成酵素はＬグルタミン酸、アンモニウム、ＡＴＰを原料としてＬグルタミンを合成する際にアンモニアを使用消費する。それはアンモニウムの分解となる。

本発明の方法により、アンモニウムの分解が酵素あたり１時間以内で処理される事となり、アンモニア分解ビーズを処理水に浸漬するだけでアンモニアの分解が可能となる。

また、本発明は、グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセルと、それを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋を提供する。

マイクロカプセルは、無機顔料として、二酸化チタン、亜鉛華（酸化亜鉛）、酸化鉄、酸化クロム、鉄黒、コバルトブルー、アルミナ白、酸化鉄黄、ビリジアン、硫化亜鉛、リトポン、カドミウムエロー、朱、カドミウムレッド、黄鉛、モリブデートオレンジ、ジンククロメート、ストロンチウムクロメート、ホワイトカーボン、クレー、タルク、群青、沈降性硫酸バリウム、バライト粉、炭酸カルシウム、鉛白フェロシアン化物（紺青）、燐酸塩（マンガンバイオレット）、炭素（カーボンブラック）、有機顔料として、ローダミンレーキ、メチルバイオレットレーキ、キノリンエローレーキ、マラカイトグリーンレーキ、アリザリンレーキ、カーミン6B、レーキレットC、ジスアゾエロー、レーキレット4R、クロモフタルエロー3G、クロモフタルスカーレットRN 、ニッケルアゾエロー、パーマネントオレンジHL、フタロシアニンブルー、フタロシアニングリーン、フラバンスロンエロー、チオインジゴボルドー、ペリノンレッド、ジオキサドンバイオレット、キナクリドンレッド、ナフトールエローS、ピグロントグリーンB、ルモゲンエロー、シグナルレッド、アルカリブルー、アニリンブラックなどの着色剤、酵素保護剤として、牛血清アルブミン、ゼラチン、トレハロースなどを内包してもよい。

マイクロカプセルの材質、物性などについては上述した。

グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセルは、相分離法、液中乾燥法、融解分散冷却法、スプレードライ法、パンコーティング法、界面重合法、in situ重合法、液中硬化被覆法など公知のいかなる方法で製造してもよい。

グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセルを用いて、アンモニウムを分解除去することができる。このマイクロカプセルにより、処理水中のアンモニウムを除去し、それを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋でも同様にアンモニウムが除去できる。従って、本発明は、グルタミン合成酵素を内包するマイクロカプセルや、それを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋を提供する。

本発明のアンモニウム除去ビーズなどにおいて、グルタミン合成酵素内包カプセルは、凍結乾燥品、懸濁液（カプセル浮遊液）などのいかなる形態で包含されてもよい。懸濁液とする場合には、カプセルを適当な溶媒（例えば、トリス緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液、TES緩衝液、純水等）に分散させるとよい。

本発明のグルタミン合成酵素には、さらに、pH調整剤、酸化防止剤、保存料、防かび剤などを含めてもよい。

本発明のグルタミン合成酵素内包のマイクロカプセルやそれを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋はアンモニウムの除去に利用することができる（上述）。従って、本発明は、処理水の除去のみならず、アンモニウムの除去を必要とする試薬やキットも提供する。

本発明のグルタミン合成酵素マイクロカプセルやそれを固定化したシートやフィルムまたは内包した袋には、さらに、アンモニウムを測定する試薬、検量線作成のためのアンモニウムの標準品、取扱い説明書、アンモニウム量を換算するソフトウエア、などを含めてもよい。
以上は、浄化作用を持つ酵素及び有害物質としてグルタミン合成酵素及びアンモニウムを例にとり説明をしたが、本発明はこれらに限定されることはなく、他の浄化作用を持つ酵素及び有害物質についても応用可能である。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
Ｉ．アンモニウム除去カプセルの調製方法
１．グルタミン合成酵素（シグマ・アルドリッジ社）５０Ｕ、アルギン酸ナトリウム（和光純薬）最終濃度1.5％、顔料インキ（グラフテック社インクペン用水性顔料インク青）50 μlを純水50 mlに溶解した。
２．溶解液をマイクロカプセル作製装置（日本ビュッヒ社 Encapsulator B-390）にセットした。
３．マイクロカプセル作製装置に直径約150 μmの液滴を生成させた。
４．液滴を2%塩化カルシウム溶液中に滴下した。
５．表面がゲル化した、グルタミン合成酵素および顔料インキを含んだマイクロビーズを0.2 μm孔径のフィルター（ナルゲンフィルターユニット）を用いてろ過した。
６．フィルター上のろ物（マイクロカプセル）を滅菌水で洗浄した。
７．マイクロカプセルを適当量の滅菌水に再懸濁した。
８．上記操作で得られた上清1ｍlにアンモニアテストワコー（和光純薬工業（株））2ｍlを混合し、30分間反応させた。その後、発色試薬（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））2ｍlを混合し、その発色をプレートリーダー（バイオラッド社）で吸光度測定（Ａ630）した。なお、本操作により得られた結果とアンモニア標準液 NH3-N 400μｇ/dl（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））を添加したものの発色量を吸光度測定（Ａ630）した結果を比較し、上清液の発色量が純水の発色量に対して95%以上であることを確認し、マイクロカプセル芯剤に含有されなかったグルタミン合成酵素が存在していないことを証明した。
マイクロビーズの物性値は、以下の通りである。
・平均粒度：155.2 um
・粒度分布：16.4%
（顕微鏡観察（倍率40）でカプセルの直径を実測して、平均粒度と粒度分布を決定した。１回の観察で100粒測定し、それを3回繰り返した。平均粒度は300粒の平均値、粒度分布はその標準偏差で示す。）
・比重：1.6（ピペット法（JIS Z8820-2:2004）に従い測定した。）

II．分解ビーズによるアンモニアの除去確認（一例）
滅菌水にグルタミン酸とＡＴＰを添加したアンモニア溶液を調製して２ｍｌ採取し、グルタミン合成酵素溶液５Ｕ添加、別にアンモニウム分解ビーズ（グルタミン合成酵素３Ｕ）添加の２試料を調製した。それを３７℃３０分静置し、それぞれから各1ｍｌ採取してアンモニア発色試薬（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））を添加して吸光度測定（Ａ630）した。また、ブランク水となる滅菌水と未処理水となるアンモニア溶液も各１ｍｌも同様にアンモニア発色試薬（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））を添加して吸光度測定（Ａ630）した。結果を表１（発色の有無の写真も添付）にまとめた。未処理水の吸光度が0.687に対し、グルタミン合成酵素溶液処理は0.010、アンモニウム分解ビーズ処理は0.011、ブランク水は0.000とアンモニウムが除去できている事が確認できた。

分解ビーズの固定化タイプによるアンモニアの除去確認（一例）
滅菌水にグルタミン酸とＡＴＰを添加したアンモニア溶液1Ｌを調製し、アンモニウム分解ビーズをグルタミン合成酵素あたりで５０Ｕを封入した不織布の袋を浸漬させて、３７℃３０分静置し、1ｍｌ採取してアンモニア発色試薬（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））を添加して吸光度測定（Ａ630）した。また、未処理水となるアンモニア溶液を各１ｍｌも同様にアンモニア発色試薬（アンモニアテストワコー、和光純薬工業（株））を添加して吸光度測定（Ａ630）した。結果を表２にまとめた。未処理水の吸光度が0.726に対し、アンモニウム分解ビーズ入り不織布は0.003とアンモニウムが分解出来ている事が確認できた。

本発明は、アンモニウムなどの有害物質の分解除去に用いることができる。

Claims

アンモニアを分解する酵素を内包するマイクロカプセルを用いて、水中のアンモニウムアを分解または低濃度化させることを含む、水質浄化方法であって、前記マイクロカプセルが袋に内包されている前記方法。
アンモニアを分解する酵素が、グルタミン合成酵素、アンモニアを原料として生成反応するリガーゼ、これらの遺伝子組換え酵素、および、アンモニア分解作用を持つ生体の可溶化液からなる群より選択される少なくとも１種の酵素や調整液である請求項１記載の方法。
マイクロカプセルの被膜が、分子量1000以下の物質は透過させ、アンモニアを分解する酵素を透過しない半透膜である請求項１又は２記載の方法。
マイクロカプセルの被膜が、多糖類及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の材料を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
１カプセル中のアンモニアを分解する酵素含有量が0.01 U〜500U/ｍｌである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
アンモニアを分解する酵素を内包するマイクロカプセルを含む、水質浄化剤であって、前記マイクロカプセルが袋に内包されている前記水質浄化剤。
アンモニアを分解する酵素を内包するマイクロカプセルを内包する、水質浄化用袋。