CN110301601A - 一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法 - Google Patents

一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法，属于海洋资源加工技术领域。本发明从新鲜海带(或海带脚料)直接制备富含褐藻寡糖的可溶性海带粉。酶法生产含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的工艺步骤包括原料处理、酶解、离心过滤、脱色脱臭、脱盐、杀菌、喷雾干燥7个步骤。与目前采用生物酶法降解海带制备褐藻寡糖等可溶性活性成分均小于20％的得率相比，本发明的可溶性海带粉得率为30‑35％，提高了10‑15％，其中褐藻寡糖含量为40‑50％，聚合度为2‑7。同时该工艺步骤简化，产率高，产品品质高，增加海带的新型潜在消费市场。

Description

一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法
技术领域
本发明涉及一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法，属于海洋资源加工技术领域。
背景技术
海带是一种营养成分丰富的褐藻类植物，具有一定的药用价值，富含多种对人体有益的活性成分，如甘露醇、褐藻胶、碘、纤维素、维生素等，这些活性成分也是医药保健、化工和农业肥料等行业的重要原料。海带是我国非常重要的海洋植物资源，我国海带种植的产量和规模均居世界首位，是海带资源与综合利用大国。除了用于直接食用外，海带是褐藻工业的主要原料之一，但多年来我国对于海带的开发一直是碘、褐藻胶和甘露醇的老三样，产业总体处于水平低、附加值低、效益低、能耗高的状态，精深加工及合理有效的综合利用海带资源的成熟生产工艺路线相对缺乏，产品和企业市场竞争力较弱。同时海带的综合利用率仅约30％，有50％以上的活性成分成为废弃物，并且在海带的工业生产中大量富含有机质和营养盐的废弃物被排放置水体中，带来了一系列的环境污染问题。近年来，随着生物工程技术的快速发展，生物酶制剂广泛应用于各行各业中，生物酶法具有操作简单、反应条件温和、特异性高、副产物少、产率高等优点，是实现海带的高值化开发利用和精深加工的有效途径。
褐藻胶大量存在于褐藻植物细胞壁中，是海带的主要成分之一，但由于其分子量大、粘度大、不易被肠道消化，极大地限制了其作为功能活性成分在食品、医药等领域中的应用。褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物，含有2-20个糖单位，分子量小，能克服褐藻胶大分子不能穿过机体各种生物屏障的限制，易溶于水，应用范围更广，并能显示出比褐藻胶多糖更为卓越的生物活性。褐藻寡糖具有良好的抗凝血、降低血糖血脂、抗炎、抗氧化、免疫调节、促生长等作用，无论在医药、农业还是食品领域都有广泛的应用前景。
生物酶制剂在海带加工领域利用的研究和专利逐渐增多，但多利用蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等酶制剂进行酶解，降解效果差，活性成分含量低。利用纤维素酶、褐藻胶裂解酶直接降解海带浆液可得到大量易溶于水的褐藻寡糖，同时破坏海带的细胞壁等结构使其他单糖、多糖等可溶性物质游离出来，可大大提高可溶性海带粉得率，从而促进海带的精深加工及其在食品领域的广泛应用，如调配海带饮料、海带调味品等，并含有大量功能活性成分，如褐藻寡糖。目前采用生物酶法降解海带制备褐藻寡糖等可溶性活性成分得率均小于20％，且生产工艺复杂。
发明内容
本发明针对目前海带加工中工艺粗放、褐藻寡糖得率低、以及污染环境、耗时长等问题，提供了从新鲜海带(或海带脚料)直接制备富含褐藻寡糖的可溶性海带粉的酶法生产方法，该工艺步骤简化，反应条件温和，成本低，产率高。
本发明所述方法包括以下步骤：
(1)原料处理：称取新鲜海带(或海带脚料)，放入清水中浸泡0.5-2h，洗去泥沙及粘液，再用40-60℃的热水漂烫软化，之后加入2-3倍体积水，用打浆机打成海带浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的海带浆投入酶解罐中，加入新鲜海带湿重的1‰的褐藻胶裂解酶和1‰的纤维素酶，酶解2-4h得到酶解反应浆液，反应温度35-40℃，pH 6.5-7.5，反应过程中，添加NaCl使其浓度为0.3-1M；
(3)离心过滤：利用离心机将步骤(2)中所述酶解反应浆液离心，得到含有褐藻寡糖及其他可溶性成分的上清液，残渣用于生产海藻饲料；
(4)脱色脱臭：向步骤(3)中所述上清液加入0.5-1％的活性炭，35℃-55℃吸附1-2h；
(5)浓缩、脱盐：步骤(4)中经过吸附处理后的溶液经微滤进行过滤浓缩，得到的浓缩液再利用001*7(阴离子交换树脂)和D201(阳离子交换树脂)离子交换树脂脱盐处理，得到去除钠、镁等离子的可溶海带粉溶液；
(6)杀菌：对步骤(5)所述可溶海带粉溶液进行高温杀菌，压力100kPa，温度121-126℃，维持20-30min。
(7)喷雾干燥：将步骤(6)所述杀菌后的可溶海带粉溶液进行喷雾干燥，进风温度180℃，出风温度80℃，得到含有褐藻寡糖的可溶性海带粉。
步骤(2)所述酶解反应终点为，取上清液用DNS方法进行检测至上清液吸光值不再增加。
步骤(2)所述纤维素酶的比酶活是1万U/g、褐藻胶裂解酶的比酶活是2万U/g。
步骤(5)所述浓缩步骤浓缩至溶液固形物含量为12％左右，用折光仪进行检测。
步骤(7)所述可溶性海带粉中褐藻寡糖的聚合度为2-7，褐藻寡糖的含量约40-50％。
本发明的有益效果：本发明在于，与目前海带中可溶性成分提取率小于20％相比，本发明的可溶性海带粉得率为30-35％，提高了10-15％。在以下几方面有所改善：
(1)工艺步骤简化，原料可用新鲜海带原料，也可用海带脚料，并且处理时不需要将海带经过粉碎、过筛、干燥制成干海带粉进行酶解，即可获得较高得率。
(2)采用纤维素酶和褐藻胶裂解酶进行酶解，可有效破坏海带细胞壁等结构，有利于海带中的褐藻寡糖等寡糖多糖类可溶性成分游离出来，提高可溶性海带粉得率。与物理降解法、酸解法、氧化降解法相比，反应条件温和，生产工艺绿色环保，特异性强，产率高，适于大规模海带深加工。
(3)采用活性炭进行脱色脱臭，使可溶性海带粉产品更加美观且没有腥味，满足海带精深加工的高品质要求，增加海带的新型潜在消费市场。
(4)本发明使用的褐藻胶裂解酶能够通过降解海带中的海藻酸钠，特异性地得到特定的褐藻寡糖(例如三糖)。
生物材料保藏
需钠弧菌Vibrio natriegens SK42.001，于2017年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017011。
具体实施方式
可溶性成分提取率的计算方法：提取率＝最终得到的可溶性海带粉含量/海带干重。海带干重的确定方法：取100g新鲜海带于105℃烘箱中烘干至恒重，所得质量即为海带干重。干重除以新鲜海带的质量即新鲜海带的固形物百分含量。
本发明所得可溶性海带粉中褐藻寡糖的聚合度的测定方法：以古罗糖醛酸三塘为对照，采用高效液相法测定褐藻寡糖的聚合度。色谱条件：色谱柱：SuperdexTM Peptide(24mL)；流动相：0.1mol/L NH4HCO3；检测器：示差检测器；流速：0.3mL/min；上样量：40μL。
实施例1
(1)原料处理：称取新鲜海带(或海带脚料)，放入清水中浸泡0.5h，洗去泥沙及粘液，再用40-60℃的热水漂烫软化，之后加入3倍体积水，用打浆机打成海带浆液。
(2)酶解：将步骤(1)中所述海带浆投入酶解罐中，加入海带湿重1‰的藻胶裂解酶(采用实施例2记载的方法制备藻胶裂解酶)和1％的纤维素酶，酶解2-4h得到酶解反应浆液，反应温度35-40℃，pH 6.5-7.5，NaCl浓度为300mM。纤维素酶的比酶活是1万U/g、褐藻胶裂解酶的比酶活是2万U/g。
(3)离心过滤：利用离心机将步骤(2)中所述酶解反应浆液离心(13000g)，得到含有褐藻寡糖及其他可溶性成分的上清液，残渣用于生产海藻饲料。
(4)脱色脱臭：向步骤(3)中所述上清液加入0.5％活性炭，35℃吸附1h。
(5)脱盐：步骤(4)中所述溶液经微滤(滤膜1μm孔径)后利用001*7阴离子交换树脂和D201阳离子交换树脂进行脱盐处理，得到去除钠镁等离子的可溶海带粉溶液。
(6)杀菌：对步骤(5)所述可溶海带粉溶液进行高温杀菌，压力100kPa，温度121-126℃，维持20-30min。
(7)喷雾干燥：将步骤(6)所述杀菌后的可溶海带粉溶液进行喷雾干燥，进风温度180℃，出风温度80℃，得到含有褐藻寡糖的可溶性海带粉。可溶性海带粉得率为30-35％，可溶性海带粉中褐藻寡糖的聚合度为2-7，褐藻寡糖的含量约40-50％。
实施例2褐藻胶裂解酶的制备方法
A需钠弧菌Vibrio natriegens的筛选方法
(1)从山东省荣成市海带养殖厂附近对海泥进行采样，取1g样品在50mL无菌水中分散均匀。
(2)取1mL上清液接种于50mL筛选液体培养基中，28℃、200rpm培养2天，稀释10-6并涂布于筛选平板培养基上，28℃培养2天，挑取不同形态单菌落经多次平板划线，获得纯培养物。
(3)挑取不同形态单菌落，接种于液体培养基中，28℃、200rpm培养2天，取上清液测定菌株酶活，选取酶活较高菌株，委托中国典型培养物保藏中心保藏，并对该菌株的形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列进行分析。
B需钠弧菌Vibrio natriegens的鉴定
(1)平板菌落形态
需钠弧菌SK42.001的平板菌落形态：划线于平板培养基上迅速生长，28℃培养24h后长出单菌落，菌落呈圆形凸起、乳白色、湿润略黏、表面光滑、边缘平整、直径约0.6～0.8cm。
(2)电镜下的菌体特征
需钠弧菌SK42.001在电镜下的菌体特征：菌体短小，两端钝圆，弯曲成弧状，大小为0.6～0.8μm×1.2～1.4μm。
(3)生理生化特征
需钠弧菌SK42.001的生理生化特征：需钠弧菌是革兰氏染色阴性，好氧生长，吲哚反应阴性，可水解明胶并微弱水解七叶灵，不能水解精氨酸、尿素和β-半乳糖苷，可利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、阿拉伯糖、甘露糖，不能利用果糖、麦芽糖、菊糖、木糖、半乳糖、山梨糖、木糖醇。特别的是，本发明提供的需钠弧菌可以水解明胶，能利用淀粉、麦芽糖。
需钠弧菌SK42.001的16S rDNA与NCBI数据库中的数据进行比对，结果表明与需钠弧菌同源性极高。
C褐藻胶裂解酶的制备
对需钠弧菌(Vibrio natriegens)SK42.001进行斜面、种子、发酵三级培养生产，培养基各组分以g/L计：
a、斜面培养：斜面培养基：海藻酸钠5，(NH4)2SO4 5，NaCl 30，MgS04·7H2O 1，K2HPO4 2，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂15-20，自然pH，使用去离子水配制，121℃灭菌20min；斜面培养条件为：培养温度25～30℃，培养时间1～3天；
b、种子培养：种子培养基：海藻酸钠5，(NH4)2SO4 5，NaCl 30，MgS04·7H2O 1，K2HPO4 2，FeSO4·7H2O 0.01，自然pH，使用去离子水配制，121℃灭菌20min；种子培养条件为：于28℃、200rpm摇床培养12h；
c、发酵培养：发酵培养基：海藻酸钠8，NH4Cl 5，NaCl 30，MgS04·7H2O 1，K2HPO4 2，FeSO4·7H2O 0.01，自然pH，使用去离子水配制，121℃灭菌20min；发酵条件为：接种量5％、温度28℃、转速200rpm摇床发酵36h，得到含有褐藻胶裂解酶的发酵液。经测定，发酵液的酶活为4.5U/mL。发酵上清液用DNS方法检测酶活，以50mM、pH7.0的PB缓冲液为缓冲体系，以海藻酸钠为底物，以300mM NaCl为稳定剂，反应温度35℃、反应时间30min。酶活定义：每分钟生产1μmol还原糖所需的酶量。
将发酵液离心除掉菌体得到褐藻胶裂解酶粗酶液，经20％～80％硫酸铵分离沉淀目的蛋白、缓冲液透析、DEAE-FF 16/10离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析，最后将纯化后的Aly01纯酶液体冷冻干燥得到酶粉，纯化倍数为7.63-8.17倍，最终得率为56.5-61.3％。酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因序列如SEQ ID NO:2所示。酶活测定方法：1mL酶反应液(50mM,pH7.0的PB缓冲液)包含：5mg海藻酸钠，300mM NaCl，0.84μg褐藻胶裂解酶，35℃反应30min，取上清液用DNS方法检测酶活。酶活定义：每分钟生产1μmol还原糖所需的酶量。
对比例1
在实施例1的基础上，将步骤(2)调整为：将步骤(1)中所述海带浆投入酶解罐中，加入海带湿重1‰的藻胶裂解酶，酶解2-4h得到酶解反应浆液，反应温度35-40℃，pH 6.5-7.5，NaCl浓度为300mM。其余步骤同实施例1。测得可溶性海带粉的得率如表1所示。
对比例2
在实施例1的基础上，将步骤(2)调整为：将步骤(1)中所述海带浆投入酶解罐中，加入海带湿重1‰的藻胶裂解酶和1‰的果胶酶，酶解2-4h得到酶解反应浆液，反应温度35-40℃，pH 6.5-7.5，NaCl浓度为300mM。其余步骤同实施例1。测得可溶性海带粉的得率如表1所示。
表1复合酶配方对产物得率的影响
对比例3
在实施例1的基础上，省略步骤(4)脱色脱臭。在这种情况下，可溶性海带粉的颜色偏黄绿色，并且海带腥味明显，不利于后期作为辅料在食品中的添加应用；而脱色脱臭后的产品颜色接近白色，并且无腥味。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东海之宝海洋科技有限公司
<120> 一种含有褐藻寡糖的可溶性海带粉及其酶法生产方法
<130> BAA180800A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 521
<212> PRT
<213> 海洋弧菌SK42.001
<400> 1
Met Lys His Ile Phe Phe Lys Ser Leu Leu Ala Ser Ser Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Val Gly Cys Asn Ser Thr Ala Thr Ala Lys Ala Asp Phe Pro Asn
20 25 30
Asn Gln Glu Thr Gly Val Asp Ile Leu Thr Pro Val Ala Ile Thr Ala
35 40 45
Ser Ser His Asp Gly Asn Val Pro Glu Asn Leu Leu Asp Gln Asp Ile
50 55 60
Met Thr Arg Trp Ala Ala Asn Gly Asp Gly Glu Trp Ala Met Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Val Tyr Gly Phe Asp Ala Ile Gln Ala Ser Phe Ser Lys
85 90 95
Gly Asn Glu Arg Val Thr Ser Phe Asp Val Gln Phe Ser Thr Asp Gly
100 105 110
Glu Asn Trp Val Thr Val Ile Glu Gly Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ala
115 120 125
Leu Gly Leu Glu Arg Phe Gln Phe Glu Pro Ala Val Lys Ala Arg Tyr
130 135 140
Val Arg Tyr Val Gly His Gly Asn Thr Lys Asn Gln Trp Asn Ala Val
145 150 155 160
Thr Glu Met Ala Ala Val Asn Cys Gly Ile Asn Ala Cys Pro Ala Ser
165 170 175
His Val Ile Thr Asp Asp Val Val Lys Ala Glu Ala Thr Met Ile Ala
180 185 190
Ala Met Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gln Lys Glu Leu Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Arg Lys Gly Asp Phe Gly Glu Pro Ile Val Arg Pro Cys Gly Thr Thr
210 215 220
Val Thr Cys Asp Leu Thr Lys Ala Met Pro Ser Pro Thr Leu Pro Ala
225 230 235 240
Val Pro Leu Ala Lys Asn Ala Pro Gly Gln Asn Phe Asp Leu Thr Arg
245 250 255
Trp Lys Leu Thr Thr Pro Phe Asp His Asp Lys Asp Gly Arg Ala Asp
260 265 270
Asp Ile Asp Glu Trp Asp Met Ala Asn Gly Phe Gln His Pro Asp Ile
275 280 285
Phe Tyr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Met Val Phe Lys Ser Tyr Val Lys
290 295 300
Gly Ala Arg Thr Ser Lys Asn Thr Lys Tyr Ala Arg Thr Glu Leu Arg
305 310 315 320
Thr Met Leu Arg Ala Gly Glu Lys Ser His Ser Thr Lys Gly Val Asn
325 330 335
Pro Asn Asn Trp Val Phe Ser Ser Ala Pro Val Glu Asp Gln Lys Ala
340 345 350
Ala Gly Gly Val Asp Gly Thr Leu Glu Ala Thr Leu Lys Ile Asp His
355 360 365
Ala Thr Thr Thr Gly Gln Ser His Glu Val Gly Arg Phe Ile Ile Gly
370 375 380
Gln Ile His Asp Lys Asp Asp Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys
385 390 395 400
Leu Pro Asp Gln Pro Thr Gly Thr Val Tyr Phe Ala His Glu Lys Thr
405 410 415
Lys Thr Gly Thr Glu Asp Tyr Tyr Ser Leu Val Gly Asp Met Thr Gly
420 425 430
Glu Ile Gly Asn Asp Gly Ile Ala Leu Gly Glu Lys Phe Ser Tyr Ile
435 440 445
Ile Asp Val Lys Gly Asn Thr Met Thr Val Thr Val Lys Arg Asp Gly
450 455 460
Lys Asp Asp Val Val Gln Val Val Asp Met Ser Asp Ser Gly Tyr Asp
465 470 475 480
Glu Gly Gly Arg Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn
485 490 495
Met Tyr Gly Asn Pro Asp Asp Tyr Ala Gln Ala Thr Phe Tyr Lys Leu
500 505 510
Asp Gln Ser Phe Gly Lys Tyr Gln Gly
515 520
<210> 2
<211> 1566
<212> DNA
<213> 海洋弧菌SK42.001
<400> 2
atgaagcata ttttcttcaa aagcttgtta gcttcttcaa tcctattggc tgttggttgt 60
aacagcactg caactgcgaa ggctgatttc ccaaacaatc aagaaaccgg cgttgacatt 120
ctaactcctg ttgcaatcac ggcgagtagc catgatggta atgtgcctga gaacttactt 180
gaccaagata ttatgactcg ctgggcagcg aacggtgacg gtgagtgggc aatgttggat 240
tacggctcag tttatgggtt cgatgcaatc caagcgtcgt ttagtaaagg taatgaacgt 300
gtcacgtcat ttgatgttca gttcagcaca gatggtgaaa actgggtaac ggttattgaa 360
ggtgcacaaa gctctggtcg tgctcttggt ctggaacgct tccagttcga gcctgcggta 420
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actgaaatgg ccgcggttaa ctgtggaatc aatgcgtgcc cggcaagcca tgtcattacc 540
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gaggcaactc tgaagattga ccatgcaacc acaacgggtc agtcacacga agttggccgt 1140
ttcattatcg gtcagattca tgacaaagat gatgagccaa ttcgccttta ctaccgtaag 1200
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ggctag 1566

Claims (7)

1.一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)原料处理：称取新鲜海带或海带脚料，放入清水中浸泡0.5-2h，洗去泥沙及粘液，再用40-60℃的热水漂烫软化，之后加入2-3倍体积水，用打浆机打成海带浆液；
(2)酶解：将步骤(1)中得到的海带浆投入酶解罐中，加入新鲜海带湿重的1‰的褐藻胶裂解酶和1‰的纤维素酶，酶解2-4h得到酶解反应浆液，反应温度35-40℃，pH 6.5-7.5，反应过程中，添加NaCl使其浓度为0.3-1M；
(3)离心过滤：利用离心机将步骤(2)中所述酶解反应浆液离心，得到含有褐藻寡糖及其他可溶性成分的上清液，残渣用于生产海藻饲料；
(4)脱色脱臭：向步骤(3)中所述上清液加入0.5-1％的活性炭，35℃-55℃吸附1-2h；
(5)浓缩、脱盐：步骤(4)中经过吸附处理后的溶液经微滤进行过滤浓缩，得到的浓缩液再利用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂脱盐处理，得到去除钠、镁离子的可溶海带粉溶液；
(6)杀菌：对步骤(5)所述可溶海带粉溶液进行杀菌；
(7)喷雾干燥：将步骤(6)所述杀菌后的可溶海带粉溶液进行喷雾干燥，得到含有褐藻寡糖的可溶性海带粉。
2.根据权利要求1所述的一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，步骤(2)所述纤维素酶的比酶活是1万U/g、褐藻胶裂解酶的比酶活是2万U/g。
3.根据权利要求1或2所述的一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，步骤(5)所述浓缩步骤浓缩至溶液固形物含量为12％。
4.根据权利要求1～3任一所述所述的一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，步骤(7)所述可溶性海带粉中褐藻寡糖的聚合度为2-7，褐藻寡糖的含量为40-50％。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，步骤(6)的杀菌条件是：压力100kPa，温度121-126℃，维持20-30min。
6.根据权利要求1～5任一所述的一种制备含有褐藻寡糖的可溶性海带粉的方法，其特征在于，步骤(7)的喷雾干燥条件是：进风温度180℃，出风温度80℃。
7.根据权利要求1～6任一所述方法制备得到的可溶性海带粉。
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