CN101857673B - 从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，首先用水稀释发酵液，调整pH值为2.8～3.2；经过板式过滤除菌，调整滤液pH值为6.9～7.3，乙醇沉淀，脱去沉淀中的水分；离心，分离出沉淀，减压干燥得γ-聚谷氨酸粗品；再溶解，调整pH值为6.9～7.1，加入蛋白酶保温，去除杂蛋白；调整pH值为2.9～3.1，超滤去除色素及小分子杂质；调整pH值为6.9～7.1，乙醇沉淀，减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品。本发明通过多步pH值调整、离心、沉淀和过滤来达到从发酵液中分离纯化高纯度γ-聚谷氨酸的目的。本发明具有提取纯度高、得率高、成本低和环保的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由芽孢杆菌属细菌分泌的一种胞外高分子聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通过γ-聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100～1000KDa之间，具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。
目前，γ-聚谷氨酸的生产方法主要为微生物发酵法，通过菌种制备、种子培养、发酵制得发酵液。发酵结束后，对发酵液进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求的成品。再经过精确纯化提取工艺，将发酵液的γ-聚谷氨酸提纯程度优化，以获得高纯度的γ-聚谷氨酸产品。
发酵液的纯化过程一直是一项复杂而又困难的工作，基本过程包括除菌、沉淀、离心等部分。一般采用有机溶剂沉淀后，通过离心、干燥得到产品。细胞通过离心从发酵液中分离出来，包含γ-聚谷氨酸的上清液中加入若干倍体积的甲醇，放置过夜，沉淀物通过离心收集，通过冷冻干燥得到初产品。初产品溶解在蒸馏水中，通过离心除去不溶性物质，水溶液中的γ-聚谷氨酸通过电渗透和冷冻干燥得到纯度较高的γ-聚谷氨酸。
上述纯化方法存在冻干次数多的缺点，导致分离纯化成本过高，而且γ-聚谷氨酸产品得率不高，同时，甲醇使用也带来一定的环保问题，对环境造成不利影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其按以下步骤进行：
(1)γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释2～3倍，调整pH值为2.8～3.2；
(2)用高效板式密闭过滤机进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩；
(3)调整步骤2所得滤液pH值为6.9～7.3，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置170～190分钟，脱去沉淀中的水分；
(4)离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
(5)用等体积的去离子水溶解步骤4所得γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为6.9～7.1，加入蛋白酶保温37℃保温60分钟，去除杂蛋白；
(6)调整pH值为2.9～3.1，超滤去除色素及小分子杂质；
(7)调整pH值为6.9～7.1，乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品。
进一步地，步骤(2)中过滤除菌所用的过滤膜孔径为0.2微米。
步骤(3)中所述的pH值为6.9～7.1。
步骤(5)中所述蛋白酶为效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂。
步骤(6)中超滤压力为0.18Mpa。
获取发酵液可采用常规方法，基本过程包括菌种制备、种子培养、发酵。可选用工程菌作为发酵使用菌，首先进行种子扩大培养，将保存在砂上管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种。发酵过程在无菌状态下进行，调节发酵参数和时间，发酵温度、酸碱度控制均按照大肠杆菌的培养条件进行，同时还需要加入碳源、氮源、谷氨酸添加量、培养基成分等。
本发明通过多步pH值调整、离心、沉淀和过滤来达到从发酵液中分离纯化高纯度γ-聚谷氨酸的目的。通过pH值的精确控制来控制发酵液中各组分的分离参数，是本发明分离γ-聚谷氨酸的关键因素。
与现有技术相比，本发明的优点体现在下列几个方面：
1、提取纯度高，γ-聚谷氨酸的纯度最高达99％；
2、得率高，通过多次控制发酵液的pH值、浓度等参数可以降低损失；
3、成本低，所用试剂均可使用工业级别，有助于降低成本；
4、有利于环境保护，所用试剂温和、不会破坏环境。
γ-聚谷氨酸纯品具备良好的吸水性，可作为医药中间体、食品添加剂、化妆品原料及农业保水剂等。
具体实施方式
实施例1
100mL γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释3倍，调整pH值为3.0；用高效板式密闭过滤机对稀释后的发酵液进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩，所用过滤膜孔径为0.2微米，得滤液；
调整上述滤液pH值为7.1，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置180分钟，脱去沉淀中的水分；离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
用等体积的去离子水溶解γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为7.0，加入2g效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂37℃保温60分钟，去除杂蛋白；调整pH值为3.0，超滤去除色素及小分子杂质；再调整pH值为7.0，进行乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品7.3克。
经凝胶液相色谱峰面积分布法检测，γ-聚谷氨酸的纯度为97.0％，谷氨酸的转化率为80.2％。
实施例2
100mL γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释3倍，调整pH值为3.2；用高效板式密闭过滤机对稀释后的发酵液进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩，所用过滤膜孔径为0.2微米，得滤液；
调整上述滤液pH值为7.3，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置180分钟，脱去沉淀中的水分；离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
用等体积的去离子水溶解γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为7.1，加入2g效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂37℃保温60分钟，去除杂蛋白；调整pH值为3.1，超滤去除色素及小分子杂质；再调整pH值为7.1，进行乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品5.4克。
经凝胶液相色谱峰面积分布法检测，γ-聚谷氨酸的纯度为90.5％，谷氨酸的转化率为77.1％。
实施例3
100mL γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释3倍，调整pH值为3.0；用高效板式密闭过滤机对稀释后的发酵液进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩，所用过滤膜孔径为0.2微米，得滤液；
调整上述滤液pH值为7.1，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置170分钟，脱去沉淀中的水分；离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
用等体积的去离子水溶解γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为7.0，加入2g效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂37℃保温60分钟，去除杂蛋白；调整pH值为3.0，超滤去除色素及小分子杂质；再调整pH值为7.0，进行乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品5.2克。
经凝胶液相色谱峰面积分布法检测，γ-聚谷氨酸的纯度为93.2％，谷氨酸的转化率为71.1％。
实施例4
100mL γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释3倍，调整pH值为2.8；用高效板式密闭过滤机对稀释后的发酵液进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩，所用过滤膜孔径为0.2微米，得滤液；
调整上述滤液pH值为6.9，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置170分钟，脱去沉淀中的水分；离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
用等体积的去离子水溶解γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为6.9，加入2g效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂37℃保温60分钟，去除杂蛋白；调整pH值为3.1，超滤去除色素及小分子杂质；再调整pH值为7.1，进行乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品4.8克。
经检测(凝胶液相色谱峰面积分布法)，γ-聚谷氨酸的纯度为88.0％，谷氨酸的转化率(得率)为71.4％。
以上对本发明的优选实施例进行了详细说明，对本技术领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在本发明具体实施方式和应用范围上均会有改变之处，这些改变也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是按以下步骤进行：
(1)γ-聚谷氨酸发酵液用水稀释2～3倍，调整pH值为2.8～3.2；
(2)用高效板式密闭过滤机进行过滤除菌，所用助滤剂为珍珠岩；
(3)调整步骤(2)所得滤液pH值为6.9～7.3，用3倍体积乙醇进行沉淀，在乙醇中静置170～190分钟，脱去沉淀中的水分；
(4)离心，分离出沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得γ-聚谷氨酸粗品；
(5)用等体积的去离子水溶解步骤(4)所得γ-聚谷氨酸粗品，调整pH值为6.9～7.1，加入蛋白酶37℃保温60分钟，去除杂蛋白；
(6)调整pH值为2.9～3.1，超滤去除色素及小分子杂质；
(7)调整pH值为6.9～7.1，乙醇沉淀，所得沉淀在0.2Mpa下进行减压干燥，得高纯度γ-聚谷氨酸成品。
2.如权利要求1所述从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中过滤除菌所用的过滤膜孔径为0.2微米。
3.如权利要求1所述从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的pH值为6.9～7.1。
4.如权利要求1所述从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤(5)中所述蛋白酶为效价为1000U/ml的工业蛋白酶制剂。
5.如权利要求1所述从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤(6)中超滤压力为0.18Mpa。
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