CN105001303B - 一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法。该方法包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经过滤，去除菌体，制得澄清液；(2)向澄清液中流加稀盐酸，室温静置，弃上清液，制得浆状流体；(3)向浆状流体中加入萃取剂，搅拌均匀，萃取，离心后，经有机膜微滤，制得滤液；(4)将滤液在‑25～‑10℃的条件下结晶，经微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。本发明首次公开了低温冷冻环境储存环境条件下，萃取体系中的无机盐可以充分析出，析出微滤后的有机溶液再次低温冷冻储存时不会再发生结晶现象，可以解决目前抗菌脂肽制备过程中杂质盐不易取出的难题。

Description

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法

技术领域

本发明涉及一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，属于抗菌肽纯化技术领域。

背景技术

抗菌脂肽(antimicrobial lipopeptide)是抗菌肽(antimicrobial peptide)的一种，一般是革兰氏阳性杆菌产生的代谢产物。抗菌脂肽的分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽除了抗菌活性之外还具有表面活性剂的特性。在生物医药、农业、石油开采、食品及化妆品和环境治理等领域，抗菌脂肽有着重要的应用前景，已引起广泛的关注。

目前已经发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬介素(fengycin)、伊枯草菌素(iturins)、杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。

解淀粉芽孢杆菌的发酵产物经过酸沉、乙醇萃取和脱盐、水相置换等浓缩纯化操作，使用液质联用检测，发现分子量为994Da、1008Da、1022Da、1036Da，与目前文献报道的表面活性素的分子量相吻合，经鉴定，解淀粉芽孢杆菌表达的抗菌脂肽为表面活性素(surfactin)。

表面活性素，由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的β-羟基缩合形成环状结构。肽链中典型的氨基酸组成顺序为(L-)Glu-(L-)Leu-(D-)Leu-(L-)Val-(L-)Asp-(D-)Leu-(L-)Leu，其分子结构式如下：

从该分子结构式中可以看出，氨基酸组分包含中性的亮氨酸、缬氨酸和酸性的谷氨酸、天冬氨酸，在发酵过程中生成的主要是谷氨酸和天冬氨酸的钾盐形式，因此该物质的分泌使得发酵过程中pH升高。

目前抗菌肽方面主要的研究重点均集中于以下三个方面：

1、各类抗菌肽基因的构建、电转、鉴定和筛选的分子生物学过程；

2、抗菌肽的人工化学合成以及天然抗菌肽的化学提取法；

3、抗菌肽作为杀虫剂、饲料添加剂以及各类昆虫抗菌肽的有效成分的深加工和应用。鲜有报道抗菌脂肽浓缩纯化和脱盐的专利。至今，国内没有抗菌脂肽表面活性素发酵液适合中试、大规模的微滤用膜、低温脱盐的发酵下游后处理方法。

南京农业大学的陆兆新、艾嘉等人使用高压液相建立了一套准确可信的检测抗菌脂肽的方法，在制备较纯的标准品过程中，对提取方法进行了优化，如图7所示。

但上述方法仅适用于实验室验证，存在无法大规模应用、有机溶剂毒性较大的问题，并且，由于抽提过程中不可避免掺入了少量水，盐的存在使得抗菌脂肽在储存过程中更容易水解，在向其他有机相转换过程中容易出现结晶沉淀；在定性检测时有脱尾峰现象，从而最终产品纯度不高。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽的有机溶液中脱盐的方法。

发明概述

本发明对发酵液依次进行的后处理操作为：板框澄清→酸沉沉降，虹吸→离心压实沉降物→萃取抽提→有机膜微滤→低温冷冻盐析→保留液体，去除盐结晶→无菌有机膜微滤。以上操作中，控制萃取抽提操作中的无水乙醇的体积用量，达到浓缩目的。根据酸沉物组分在乙醇和水中溶解度的不同，使用乙醇萃取抽提达到了纯化目的。在低温冷冻环境长期存放的过程中，原先存留在离心沉降湿物质中的无机盐类逐渐析出，停留在容器底部，很容易去除。本发明采取的后处理操作容易适应大规模中试甚至生产的需求，操作技术难度低，通过正规培训容易掌握操作技能，通过处理后的浓缩纯化液在冷冻和冷藏环境中不结冰，保持清澈状态，可以根据生产需要置换溶剂或进行稀释。

发明详述

本发明的技术方案如下：

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经过滤，去除菌体，制得澄清液；

(2)向步骤(1)制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为1.8～2.5，室温静置16小时以上，弃上清液，制得浆状流体；

(3)向步骤(2)制得的浆状流体中加入萃取剂，萃取剂的加入量为步骤(1)中发酵液体积的5％～10％，搅拌均匀，0～20℃萃取3～5小时，离心后，经0.22微米的有机膜微滤，制得滤液；

所述的萃取剂为无水乙醇或植物油；

(4)将步骤(3)制得的滤液在-25～-10℃的条件下放置5～10天进行结晶，经0.22微米的有机膜微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的过滤为80～200目滤布的板框过滤；进一步优选的，所述的板框过滤的滤布为预涂硅藻土的滤布，硅藻土的涂布量为每百升发酵液0.8～1.5kg。

该操作可以一次性去除99％的菌体湿重，5平方米的100目的滤布可以达到的平均滤速为200升/小时。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中还包括对浆状流体进行离心，去除上清留沉淀，得到固形物湿重10～20g/L(浆状流体)的步骤。

一般情况下，酸沉物可以自动压实到酸沉体系的10％～20％体积，该过程大大降低了后续离心操作的劳动强度。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中流加稀盐酸为在搅拌条件下进行，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.4～0.8mol的盐酸。

由于该发酵液具有一定的缓冲能力，因此要缓慢流加，充分搅拌，该pH环境使得期间该菌的发酵活性受到抑制，同时也降低了其他杂菌污染的可能性。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的无水乙醇为食品级无水乙醇；植物油为大豆油、花生油、山茶油、棉籽油。

该萃取步骤使用的是无水乙醇，否则会在萃取过程中造成乙醇进一步被稀释，在使用有机相滤膜聚醚砜(PES)时会造成过滤阻力变大。经无水乙醇充分萃取后，浆状流体中的组分发生了转移，一方面，湿物质中约55％(m/m)是水分，该水分溶解在无水乙醇中，剩余的45％(m/m)固形物质中，抗菌脂肽约占60％～70％抗菌脂肽物质，该部分物质也溶解在乙醇中，剩下的物质是水溶的，乙醇不溶解的，经检测没有活性的物质，该步骤通过控制无水乙醇的用量，起到了浓缩作用。

根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的有机膜为聚醚砜(PES)有机膜。

聚醚砜(PES)有机膜不容易被乙醇溶蚀，植物油不存在该问题。

步骤(4)中结晶时间要足够长，使得其中的硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钾充分析出，这也是纯化步骤，主要是除盐。0.22微米的有机膜微滤的主要目的是除菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，发酵液采用如下方法制备：

(i)将发酵培养基灭菌后，调节温度至25～28℃，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖15～25g/L，L-谷氨酸钠5～14g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.15mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸铜0.16mg/L；

(ii)将解淀粉芽孢杆菌种子液接种于步骤(i)标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度25～28℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

(iii)当发酵过程中pH值较初始pH值升高大于1.2时，或者当发酵过程中pH值较初始pH值升高大于1且在1小时内pH值升高幅度小于0.2时，结束发酵。

发明人发现该细菌分泌的目标产物抗菌脂肽是有机弱酸盐，在水基环境中显示碱性，因此在发酵过程中，pH值会持续升高，采用pH增幅判断发酵终点，使发酵终点控制更加精确；

根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中的接种量为1％～2％(体积百分比)。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至25～28℃的条件下，活化1-2天，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子液培养基中，在温度至25～28℃的条件下，培养18～24小时，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

所述种子液培养基组分如下：

葡萄糖20g/L，酵母浸粉5～10g/L，蛋白胨10～20g/L，氯化钠5～10g/L。

有益效果

1、本发明首次公开了低温冷冻环境储存环境条件下，萃取体系中的无机盐可以充分析出，析出微滤后的有机溶液再次低温冷冻储存时不会再发生结晶现象，可以解决目前抗菌脂肽制备过程中杂质盐不易取出的难题；

2、本发明通过先进行过滤和酸沉步骤，去除了大量的其他杂质物质，为后续的萃取、纯化节约了大量人力物力，适合工业化生产；

3、本发明首先采用板框压滤机进行发酵液的澄清操作，除去99％的菌体，避免了酸沉过程中发生菌体和抗菌脂肽的相互絮凝包裹，使得乙醇抽提萃取过程更容易进行；

4、本发明能够以大通量的方式从发酵液中快速浓缩提纯抗菌脂肽，最终达到无菌脱盐的效果；

5、本发明首次采用pH增幅判断发酵终点，使发酵终点控制更加精确，减少了副产物等其他杂质的生成，为后续的提纯处理、获得高纯度产品提供了保障；

6、本发明所述的种子液培养基和接种量符合发酵的接种量规则，适量接种后的种子液中的残留酵母浸粉和蛋白胨成分，可以缩短发酵休眠期，此外，还可以减少发酵液中的杂质蛋白数量，减少下游萃取体系在低温冷冻环境中析出面粉状物质的可能性。

附图说明

图1高压液相色谱仪(Agilent1200)与Agilent6300(离子肼质谱仪)联用检测抗菌脂肽的总峰图；

图2分子量为994Da的组分的质谱图；

图中：Peak1:M+H＝994.6 M+Na＝1018.6 M+K＝1032.6；

图3分子量为1008Da的组分的质谱图；

图中：Peak2:M+H＝1008.6 M+Na＝1030.6 M+K＝1046.6；

图4分子量为1022Da的组分的质谱图；

图中：Peak3:M+H＝1022.6 M+Na＝1044.6 M+K＝1060.6；

图5分子量为1022Da的组分的质谱图；

图中：Peak4:M+H＝1022.6 M+Na＝1044.6 M+K＝1060.6；

图6分子量为1036Da的组分的质谱图；

图中：Peak5:M+H＝1036.6 M+Na＝1058.6 M+K＝1074.6。

图7为现有技术的检测抗菌脂肽方法的流程图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

菌种来源：

解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，菌种编号1A10599。

培养基说明：

PDA固体培养基：

土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉18g/L；

将土豆去皮，然后切成1厘米左右的小方块，放于水中煮沸，保持沸腾1小时，然后过滤，得到清液，按比例配置合适体积的培养基，倒平板冷凝，待冷凝水完全蒸发后即可使用。

种子液培养基：

无水葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；

葡萄糖和其他组分分开单独高压；

发酵培养基：

无水葡萄糖20g/L，L-谷氨酸钠7.5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.15mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸铜0.16mg/L。

实施例1

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经100目滤布的板框过滤，滤布预涂硅藻土，硅藻土的涂布量为每百升发酵液1.5kg，平均过滤通量为40升/(小时·平方米)，去除菌体，制得澄清液；

(2)在搅拌条件下，向步骤(1)制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为2.5，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.6mol的盐酸，室温静置16小时以上，弃上清液，经离心，去除上清留沉淀，制得固形物湿重为20g/L的浆状流体；

(3)向步骤(2)制得的浆状流体中加入食品级无水乙醇，食品级无水乙醇的加入量为步骤(1)中发酵液体积的5％，搅拌均匀，10℃萃取4小时，离心后，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤，过滤速度51L/(平方·分钟)，制得滤液；

(4)将步骤(3)制得的滤液在-20℃的条件下放置7天进行结晶，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。

所述步骤(1)中，发酵液采用如下方法制备：

(i)将发酵培养基灭菌后，调节温度至26℃，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

(ii)将解淀粉芽孢杆菌种子液按体积百分比2％接种于步骤(i)标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度25℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

(iii)当发酵1天后，pH值较初始pH值升高1.2时，结束发酵。

所述步骤(ii)中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至26℃的条件下，活化2天，待长出缝衣针针眼大小的单菌落时，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于4ml种子液培养基中，在温度26℃、220rpm的条件下，培养24小时，然后，进行进一步扩大培养，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

经检测，制得抗菌脂肽溶液成分经高压液相色谱仪(Agilent1200)与Agilent6300(离子肼质谱仪)联用检测抗菌脂肽的结果如图1～图6所示。制得的抗菌脂肽溶液抗菌脂肽浓度为0.67g/L，盐浓度为1.5g/L。

实施例2

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经150目滤布的板框过滤，滤布预涂硅藻土，硅藻土的涂布量为每百升发酵液0.8kg，平均过滤通量为40升/(小时·平方米)，去除菌体，制得澄清液；

(2)在搅拌条件下，向步骤(1)制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为1.8，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.8mol的盐酸，室温静置16小时以上，弃上清液，制得浆状流体；

(3)向步骤(2)制得的浆状流体中加入食品级无水乙醇，食品级无水乙醇的加入量为步骤(1)中发酵液体积的10％，搅拌均匀，10℃萃取4小时，离心后，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤，过滤速度5L/(平方·分钟)，制得滤液；

(4)将步骤(3)制得的滤液在-20℃的条件下放置7天进行结晶，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。

所述步骤(1)中，发酵液采用如下方法制备：

(i)将发酵培养基灭菌后，调节温度至26℃，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

(ii)将解淀粉芽孢杆菌种子液按体积百分比1％接种于步骤(i)标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度28℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

(iii)当发酵1天后，pH值较初始pH值升高1.2时，结束发酵。

所述步骤(ii)中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至26℃的条件下，活化2天，待长出缝衣针针眼大小的单菌落时，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于4ml种子液培养基中，在温度26℃、220rpm的条件下，培养24小时，然后，进行进一步扩大培养，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

经检测，制得的抗菌脂肽溶液抗菌脂肽浓度为0.4g/L，盐浓度为1.7g/L。

实施例3

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经100目滤布的板框过滤，滤布预涂硅藻土，硅藻土的涂布量为每百升发酵液1.5kg，平均过滤通量为20升/(小时·平方米)，去除菌体，制得澄清液；

(2)在搅拌条件下，向步骤(1)制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为2.5，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.6mol的盐酸，室温静置16小时以上，弃上清液，经离心，去除上清留沉淀，制得固形物湿重为15g/L的浆状流体；

(3)向步骤(2)制得的浆状流体中加入食品级无水乙醇，食品级无水乙醇的加入量为步骤(1)中发酵液体积的5％，搅拌均匀，10℃萃取4小时，离心后，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤，过滤速度51L/(平方·分钟)，制得滤液；

(4)将步骤(3)制得的滤液在-20℃的条件下放置7天进行结晶，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。

所述步骤(1)中，发酵液采用如下方法制备：

(i)将发酵培养基灭菌后，调节温度至26℃，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

(ii)将解淀粉芽孢杆菌种子液按体积百分比2％接种于步骤(i)标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度25℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

(iii)当发酵2天后，结束发酵。

所述步骤(ii)中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至26℃的条件下，活化2天，待长出缝衣针针眼大小的单菌落时，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于4ml种子液培养基中，在温度26℃、220rpm的条件下，培养24小时，然后，进行进一步扩大培养，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

经检测，制得的抗菌脂肽溶液抗菌脂肽浓度为0.6g/L，盐浓度为1.7g/L。

对比例

一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经100目滤布的板框过滤，滤布预涂硅藻土，硅藻土的涂布量为每百升发酵液1.5kg，平均过滤通量为40升/(小时·平方米)，去除菌体，制得澄清液；

(2)在搅拌条件下，向步骤(1)制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为2.5，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.6mol的盐酸，室温静置16小时以上，弃上清液，经离心，去除上清留沉淀，制得固形物湿重为20g/L的浆状流体；

(3)向步骤(2)制得的浆状流体中加入食品级无水乙醇，食品级无水乙醇的加入量为步骤(1)中发酵液体积的5％，搅拌均匀，10℃萃取4小时，离心后，经0.22微米的聚醚砜(PES)有机膜微滤，过滤速度51L/(平方·分钟)，制得滤液；

(4)将步骤(3)制得的滤液使用真空蒸发设备，控制温度在55-60℃，真空度在0-0.01MPa以上，浓缩体积到原有机相体积的十分之一；一边加入浓缩前5倍体积的纯化水进行溶剂的替换，一边使用适当浓度的氢氧化钠溶液调节pH，直到乳白色的液体瞬间变得清澈，停止调节pH，此时pH范围应该6.5-7.5之间；使用截流分子量不大于1000的超滤膜进行浓缩，弃去4份体积透过清液，保留1粉体积浓缩液；盐酸酸沉浓缩液，离心保留沉降物，乙醇抽提沉降物；

所述步骤(1)中，发酵液采用如下方法制备：

(i)将发酵培养基灭菌后，调节温度至26，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

(ii)将解淀粉芽孢杆菌种子液按体积百分比2％接种于步骤(i)标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度25℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

(iii)当发酵1天后，pH值较初始pH值升高1.2时，结束发酵。

所述步骤(ii)中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至26℃的条件下，活化2天，待长出缝衣针针眼大小的单菌落时，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于4ml种子液培养基中，在温度26℃、220rpm的条件下，培养24小时，然后，进行进一步扩大培养，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

经检测，制得的抗菌脂肽溶液抗菌脂肽浓度为0.2g/L，盐浓度为1.3g/L。

结果分析

由实施例1和实施例2的数据可以看出，经过离心后的浆状流体较未经过离心的浆状流体在过有机膜微滤时，过滤速度显著提高，二者相差十倍。

由实施例1和实施例3的数据可以看出，通过pH值控制发酵终点较时间控制发酵终点，由于控制不准确导致发酵时间延长，造成菌体死亡破碎，显著影响了板框过滤的速度，并且由于发酵时间延长造成了部分抗菌脂肽自发水解，导致抗菌脂肽含量下降。

由实施例1和对比例的数据可以看出，虽然采用其他除盐方式也可以较好的去除溶液中的盐，但抗菌脂肽的损耗非常大，严重影响产品得率。

Claims (10)

1.一种利用低温冷冻环境从抗菌脂肽溶液中除盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将解淀粉芽孢杆菌发酵制备抗菌脂肽后得到的发酵液经过滤，去除菌体，制得澄清液；

（2）向步骤（1）制得的澄清液中流加稀盐酸至pH值为1.8～2.5，室温静置16小时以上，弃上清液，制得浆状流体；

（3）向步骤（2）制得的浆状流体中加入萃取剂，萃取剂的加入量为步骤（1）中发酵液体积的5%～10%，搅拌均匀，0～20℃萃取3～5小时，离心后，经0.22微米的有机膜微滤，制得滤液；

所述的萃取剂为无水乙醇或植物油；

（4）将步骤（3）制得的滤液在-25～-10℃的条件下放置5～10天进行结晶，经0.22微米的有机膜微滤过滤去除结晶，制得抗菌脂肽溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的过滤为80～200目滤布的板框过滤。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的板框过滤的滤布为预涂硅藻土的滤布，硅藻土的涂布量为每百升发酵液0.8～1.5kg。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中还包括对浆状流体进行离心，去除上清留沉淀，得到固形物湿重10～20g/L的步骤。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中流加稀盐酸为在搅拌条件下进行，稀盐酸的速度为每升澄清液每分钟流加0.4～0.8mol的盐酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的无水乙醇为食品级无水乙醇；植物油为大豆油、花生油、山茶油、棉籽油。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的有机膜为聚醚砜有机膜。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，发酵液采用如下方法制备：

（i）将发酵培养基灭菌后，调节温度至25～28℃，在通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下，标定溶氧的相对百分点；

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖15～25g/L，L-谷氨酸钠5～14g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.15mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸铜0.16mg/L；

（ii）将解淀粉芽孢杆菌种子液接种于步骤（i）标定溶氧的相对百分点后的发酵培养基中，在温度25～28℃、通气量为1vvm、搅拌速度为200rpm的条件下进行发酵培养，标定初始pH值，并标记为发酵起始零点；

（iii）当发酵过程中pH值较初始pH值升高大于1.2时，或者当发酵过程中pH值较初始pH值升高大于1且在1小时内pH值升高幅度小于0.2时，结束发酵。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii）中的接种量为体积百分比1%～2%。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii）中的解淀粉芽孢杆菌种子液，制备步骤如下：

a、将解淀粉芽孢杆菌接种于PDA固体培养基中，在温度至25～28℃的条件下，活化1-2天，制得活化后的解淀粉芽孢杆菌；

b、将步骤a制得的活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子液培养基中，在温度至25～28℃的条件下，培养18～24小时，制得解淀粉芽孢杆菌种子液；

所述种子液培养基组分如下：

葡萄糖20g/L，酵母浸粉5～10g/L，蛋白胨10～20g/L，氯化钠5～10g/L。