CN112684043A

CN112684043A - 一种达托霉素有关物质的检测方法

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Publication number: CN112684043A
Application number: CN202011485734.5A
Authority: CN
Inventors: 唐咏群; 黄锡伟; 董海霞; 胡铮; 田欣欣
Original assignee: NANJING JIANYOU BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NANJING JIANYOU BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明涉及一种达托霉素有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱对达托霉素有关物质进行定性检测，其高效液相色谱条件包括：以镶嵌极性基团C18硅胶键合相为色谱柱；采用体积比为62～68:38～32的流动相A和流动相B为混合流动相进行等度洗脱；所述流动相A为体积比为72～76:28～24的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液；所述流动相B为体积比为48～52:52～48的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液。本发明的检测方法能够在制备达托霉素或达托霉素制剂的过程中，对产生的杂质进行检测，专属性强，重现性好，结果准确可靠，从而对达托霉素或达托霉素制剂产品的质量进行准确的评价。

Description

一种达托霉素有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种达托霉素有关物质的检测方法。

背景技术

达托霉素是一种由玫瑰孢链霉菌发酵产生的酸性酯肽类抗生素，分子式：C₇₂H₁₀₁N₁₇O₂₆，分子量：1620.68，其结构式为：

达托霉素是继万古霉素之后上市的新一代环脂肽类抗生素，用于治疗革兰阳性菌引起的复杂皮肤感染、结构性皮肤感染、心脏感染和菌血症等。它主要通过抑制细菌细胞壁的主要成分—肽聚酶的生物合成过程来改变细菌细胞膜的性质，以破坏后者的结构，使细菌细胞膜变得极其脆弱，而细胞膜内的胞浆等重要物质溶液泄露出来，从而达到杀菌目的。2003年在美国批准上市，现如今销量稳定在八亿美元。目前，国内有一家进口和三家本土企业也已上市。

达托霉素为发酵半合成类新型抗生素，其化学结构复杂，并在发酵、纯化、生产和贮藏过程均会产生杂质，为了保证药物的安全性，对杂质必须能够有效分离并进行严格控制尤为重要。目前，现有文献中的有关物质方法不能有效分离内酯水解物、脱水达托霉素、β-异构体、杂质3(RRT0.95)、杂质4(RRT0.90)、杂质5(RRT1.07)和未知杂质RRT0.82等杂质，且使用的色谱柱phenomenex IB-SIL C8(250mm×4.6mm×5μm)对于分离主峰与主峰相邻峰的重现性效果不佳，因此急需开发出一种能够有效分离各杂质的检测方法，以对达托霉素产品质量进行准确的评价，以确保该产品的质量可靠及用药的安全性。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种达托霉素有关物质的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种达托霉素有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱对达托霉素有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：以镶嵌极性基团C18硅胶键合相为色谱柱；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行等度洗脱，其中流动相A和流动相B的体积比为62～68:38～32；对于本发明而言，流动相A为无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，在流动相A中无水硫酸钠溶液和乙腈的体积比为72～76:28～24；流动相B也为无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，在流动相B中无水硫酸钠溶液和乙腈的体积比为48～52:52～48；流动相A和流动相B中采用的无水硫酸钠溶液的浓度为0.02～0.03mol/L，以磷酸调节pH至3.2～3.6。

本发明的检测方法，可用于检测达托霉素原料药、达托霉素片剂、达托霉素粉针剂或达托霉素注射液中的达托霉素及有关物质。

在等度洗脱的过程中，供试品溶液的洗脱时间可以一般为120分钟，但是为了节约时间，对照品溶液的洗脱时间可以缩短至75分钟。

本发明以镶嵌极性基团C18硅胶键合相为色谱柱，在一种优选方案中，色谱柱为Waters XBridge Shield RP 18，进一步优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm。即，Waters XBridge Shield RP 18(4.6×250mm，3.5μm)。

采用本发明的检测方法，在等度洗脱时，需严格控制流动相A和流动相B的体积比为62～68:38～32，在一种优选方案中，流动相A和流动相B的体积比为64～66:36～34。例如，流动相A和流动相B的体积比为64:36或66:34。

采用本发明的检测方法，在等度洗脱时，对流动相A和流动相B中无水硫酸钠溶液和乙腈的体积比也需要严格控制。在流动相A中，无水硫酸钠溶液和乙腈的体积比为72～76:28～24，无水硫酸钠溶液的浓度为0.02～0.03mol/L，以磷酸调节pH至3.2～3.6。在一种优选方案中，流动相A为体积比为74:26的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，无水硫酸钠溶液的浓度为0.024mol/L，以磷酸调节pH至3.5。

在流动相B中，无水硫酸钠溶液和乙腈的体积比为48～52:52～48，无水硫酸钠溶液的浓度为0.02～0.03mol/L，以磷酸调节pH至3.2～3.6。在一种优选方案中，流动相B为体积比为50:50的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，无水硫酸钠溶液的浓度为0.024mol/L，以磷酸调节pH至3.5。

采用本发明的检测方法，其高效液相色谱条件还包括：

检测波长为220～226nm，优选为223～226nm。

柱温为28～32℃，优选为30～32℃。

流速为0.4～0.6mL/min；优选为0.4～0.5mL/min。

进样量为8～12μL；优选为10μL。

采用本发明的检测方法检测达托霉素及其有关物质，还包括配制如下溶液：

供试品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素，以乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素0.8～1.2mg，作为供试品溶液。

对照品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素对照品，以乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素0.008～0.012mg，作为对照品溶液。

在一种优选方案中，配制供试品溶液或者对照品溶液时溶解样品并进一步稀释的乙腈水溶液的体积浓度为10％。

在一种优选方案中，供试品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素，以10％乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素1.0mg，作为供试品溶液。

在一种优选方案中，对照品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素对照品，以10％乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素0.01mg，作为对照品溶液。

采用本发明的技术方案，优势如下:

采用本发明的检测方法能够有效分离达托霉素及其相关杂质，解决了现有文献中不能将内酯水解物、脱水达托霉素、β-异构体、杂质3(RRT0.95)、杂质4(RRT0.90)、杂质5(RRT1.07)和未知杂质RRT0.82等杂质进行分离的问题，以及采用色谱柱phenomenex IB-SIL C8(250mm×4.6mm×5μm)进行色谱分析时，主峰与主峰相邻峰的重现性效果不佳问题。本发明的检测方法能够在制备达托霉素或达托霉素制剂的过程中，对产生的杂质进行检测，专属性强，重现性好，结果准确可靠，从而对达托霉素或达托霉素制剂产品的质量进行准确的评价，保证达托霉素或达托霉素制剂产品的质量。

附图说明

图1实施例1中达托霉素有关物质检测的空白溶液图谱；

图2实施例1中达托霉素有关物质检测的供试品溶液图谱；

图3实施例1中达托霉素有关物质检测的对照品溶液图谱；

图4实施例2中达托霉素有关物质检测的供试品溶液图谱；

图5实施例3中达托霉素有关物质检测的供试品溶液图谱；

图6实施例4中达托霉素有关物质检测的供试品溶液图谱；

图7是对比例1达托霉素有关物质检测的供试品溶液图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行详尽地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

1、色谱条件

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters

Shield RP 18 250×4.6mm，3.5μm；

流动相：流动相A(体积比为74:26的无水硫酸钠和乙腈的混合溶液)和流动相B(体积比为50:50的无水硫酸钠和乙腈的混合溶液)的体积比为64:36的混合溶液；

检测波长：223nm；

柱温：30℃；

样品盘温度：4℃；

流速：0.5mL/min；

进样量：10μL；

运行时间：对照品溶液75min，供试品溶液120min；

2、样品制备

(1)流动相制备

流动相A：0.024mol/L的无水硫酸钠溶液(用磷酸调节pH为3.5)和乙腈的体积比为74:26混合溶液；流动相B：0.024mol/L的无水硫酸钠溶液(用磷酸调节pH为3.5)和乙腈的体积比为50:50混合溶液；流动相：流动相A和流动相B的体积比为64:36混合溶液。

(2)空白溶液(稀释剂)

超纯水和乙腈的体积比为90:10混合液。

(3)供试品溶液制备

取注射用达托霉素约500mg，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为1.0mg，作为供试品溶液。

(4)对照品溶液制备

取达托霉素对照品约10mg，精密称定，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为0.01mg，作为对照品溶液。

3、实验结果

分别向高效液相色谱仪中注入空白溶液、供试品溶液、对照品溶液10μL，记录色谱图，图谱见说明书附图1、2、3。

结果显示：空白溶液对达托霉素及其杂质峰没有干扰，可以将供试品溶液中内酯水解物、脱水达托霉素、β-异构体、杂质3(RRT0.95)、杂质4(RRT0.90)、杂质5(RRT1.07)和未知杂质RRT0.82进行有效分离。

实施例二：

1、色谱条件

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters

Shield RP 18 250×4.6mm，3.5μm；

流动相：流动相A(体积比为74:26的无水硫酸钠和乙腈的混合溶液)和流动相B(体积比为50:50的无水硫酸钠和乙腈的混合溶液)的体积比为66:34的混合溶液；

检测波长：223nm；

柱温：32℃；

样品盘温度：4℃；

流速：0.5mL/min；

进样量：10μL；

运行时间：供试品溶液120min；

2、样品制备

(1)流动相制备

(2)供试品溶液制备

按照实施例1中“供试品溶液制备”的方法进行。

3、实验结果

向高效液相色谱仪中注入供试品溶液10μL，记录色谱图，图谱见说明书附图4。

实施例三：

1、色谱条件

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters

Shield RP 18 250×4.6mm，3.5μm；

检测波长：223nm；

柱温：30℃；

样品盘温度：4℃；

流速：0.4mL/min；

进样量：10μL；

运行时间：供试品溶液120min；

2、样品制备

(1)流动相制备：按照实施例1中“流动相”的方法进行。

(2)供试品溶液制备：按照实施例1中“供试品溶液制备”的方法进行。

3、实验结果

向高效液相色谱仪中注入供试品溶液10μL，记录色谱图，图谱见说明书附图5。

实施例四：

1、色谱条件

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters

Shield RP 18 250×4.6mm，3.5μm

检测波长：226nm；

柱温：30℃；

样品盘温度：4℃；

流速：0.5mL/min；

进样量：10μL；

运行时间：供试品溶液120min；

2、样品制备

(1)流动相制备方法：按照实施例1中“流动相”的方法进行。

(2)供试品溶液制备方法：按照实施例1中“供试品溶液制备”的方法进行。

3、实验结果

向高效液相色谱仪中注入供试品溶液10μL，记录色谱图，图谱见说明书附图6。

对比例1：

色谱柱：phenomenex IB-SIL C8(250mm×4.6mm×5μm)；

流动相：流动相A(体积比为50:50的磷酸二氢铵和乙腈的混合溶液)和流动相B(体积比为80:20的磷酸二氢铵和乙腈的混合溶液)的体积比为46:54的混合溶液；

检测波长：214nm；

柱温：25℃；

样品盘温度：4℃；

流速：1.5mL/min；

进样量：10μL；

运行时间：供试品溶液75min。

由图7可知，对于分离主峰与主峰相邻峰的重现性效果不佳，且不能有效分离内酯水解物、脱水达托霉素、β-异构体、杂质3(RRT0.95)、杂质4(RRT0.90)、杂质5(RRT1.07)和未知杂质RRT0.82等杂质。

实施例五：

未破坏：取注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为1.0mg/mL，作为供试品溶液。

酸破坏：取注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为10mg/mL；准确移取上述溶液5.0mL至西林瓶中，加5mL 3mol/L HCl，轻轻摇匀，放置4h后，移取2.0mL溶液于10mL容量瓶中，加10％乙腈稀释定容至刻度，摇匀，即得。

碱破坏：取注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为10mg/mL；准确移取上述溶液5.0mL至西林瓶中，加5mL 0.02mol/LNaOH，轻轻摇匀，放置10min后，移取2.0mL溶液于10mL容量瓶中，加10％乙腈稀释定容至刻度，摇匀，即得。

氧化破坏：取注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为10mg/mL；准确移取上述溶液5.0mL至西林瓶中，加5mL 30％H₂O₂，轻轻摇匀，放置10min后，移取2.0mL溶液于10mL容量瓶中，加10％乙腈稀释定容至刻度，摇匀，即得。

高温破坏：取放置80℃烘箱6h的注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为1.0mg/mL，作为供试品溶液。

高湿破坏：取放置75％湿度24h的注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为1.0mg/mL，作为供试品溶液。

光照破坏：取放置光照(光照强度：5000Lux；紫外光照射强度：100μw/cm²)11天的注射用达托霉素1瓶(约500mg)，加10％乙腈溶解并稀释至每毫升溶液中约含达托霉素为1.0mg/mL，作为供试品溶液。

向高效液相色谱仪中注入上述溶液各10μL，记录色谱图。

表1专属性试验结果

上述结果表明：酸破坏、碱破坏、氧化破坏和高温破坏条件下，均能产生杂质；其他条件均较稳定。

在本发明的色谱条件下，空白溶液对达托霉素及其有关物质的测定均无干扰；供试品溶液中达托霉素主峰与强制降解后产生的各杂质均能有效分离，且峰纯度符合要求，可用于本品的有关物质检测，专属性试验良好。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱对达托霉素有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：以镶嵌极性基团C18硅胶键合相为色谱柱；采用体积比为62～68:38～32的流动相A和流动相B为混合流动相进行等度洗脱；所述流动相A为体积比为72～76:28～24的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液；所述流动相B为体积比为48～52:52～48的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液；所述无水硫酸钠溶液的浓度为0.02～0.03mol/L，以磷酸调节pH至3.2～3.6。

2.根据权利要求1所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters XBridge Shield RP 18；优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm。

3.根据权利要求2所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，在等度洗脱时，流动相A和流动相B的体积比为64～66:36～34；优选地，流动相A和流动相B的体积比为64:36或66:34。

4.根据权利要求3所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为体积比为74:26的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，所述无水硫酸钠溶液的浓度为0.024mol/L，以磷酸调节pH至3.5。

5.根据权利要求4所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B为体积比为50:50的无水硫酸钠溶液和乙腈的混合溶液，所述无水硫酸钠溶液的浓度为0.024mol/L，以磷酸调节pH至3.5。

6.根据权利要求5所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件还包括：检测波长为220～226nm，优选为223～226nm；柱温为28～32℃，优选为30～32℃。

7.根据权利要求6所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件还包括：流速为0.4～0.6mL/min；优选为0.4～0.5mL/min；进样量为8～12μL；优选为10μL。

8.根据权利要求7所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，供试品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素，以乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素0.8～1.2mg，作为供试品溶液。

9.根据权利要求8所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，对照品溶液按照如下方法配制：称取达托霉素对照品，以乙腈水溶液溶解并稀释至每毫升溶液中含达托霉素0.008～0.012mg，作为对照品溶液。

10.根据权利要求所述8或9所述的达托霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述乙腈水溶液的体积浓度为10％。