CN101776675A - 一种新的注射用复方阿莫西林钠克拉维酸钾的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种新的高效液相色谱(HPLC)方法，可以同时检测注射用阿莫西林钠克拉维酸钾复方中两种单一成分的含量及有关杂质，相较以往检测，其对克拉维酸含量相对较低的7∶1复方制剂有更高的精密度，对纯度要求更高的注射制剂有更好的分离度，且检测过程中阿莫西林与克拉维酸两种成分不相互干扰与影响。该方法操作简单易行，专属性强，灵敏度高，线性范围大，稳定性好，重复性好，可用于复方无菌注射制剂与原料的检测。

Description

一种新的注射用复方阿莫西林钠克拉维酸钾的检测方法

发明背景

阿莫西林/克拉维酸是由在Beecham工作的英国研究人员于1977年至1978年间所创，并于1984年获得美国专利(US4,441,609)。

在该复方中，阿莫西林(或钠盐)属于内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、体内杀菌能力强、吸收好(75-90％)、达峰时间短(1~2小时)的特点(HandsfieldHH，Clark H，Wallace JF，Holmes KK，Turck M.等，1973)，自20世纪60年代上市以来，一直在临床上得到广泛使用。但由于不断广泛出现的产内酰胺酶致病菌，使阿莫西林中内酰胺环水解失活，从而产生耐药性。克拉维酸钾是从链霉素的培养液中分离出的氧青霉烷化合物，含一个内酰胺酶环，它只有微弱的抗菌活性，但具有强大的广谱内酰胺酶抑制作用，可保护不耐酶的内酰胺类抗生素，使之不被病菌所产酶灭活，从而增强内酰胺类抗生素的抗菌作用(Reading C，Cole M.，1977)。

由于该复方的临床应用前景广泛，因此人们在原有的基础上，又不断开发出不同比例、不同制剂的复方制剂。为了保证制剂的质量，相应地发明出针对各种制剂的特定的各种检测方法。

发明内容

我们在阿莫西林钠克拉维酸钾5:1注射制剂的基础上，又从提高疗效降低副作用的角度，特别开发出比例为7:1的复方注射制剂，而目前的参考文献中都没有针对该比例注射制剂的专属性强的成熟检测方法：虽然有文献报道了阿莫西林/克拉维酸含量的检测，但是均没有明确表示出注射用复方中阿莫西林/克拉维酸的比例，可以从他们检测方法的描述中推断出其复方中的克拉维酸比例较7:1的复方为高，用这些检测方法检测克拉维酸含量相对较低的7:1复方制剂时，精密度和重复性均得不到保证。又如文献(陈雷，2001)报道了7:1复方制剂的检测方法，但其是针对口服制剂，考虑辅料、杂质等因素，对于纯度要求更高的注射制剂，其流动相中无机相与有机相比例仍存有缺陷，经我们实验验证发现其方法就7:1的复方注射制剂检测而言，分离度不够。

综上，我们通过反复实验和摸索发明了一种新的注射用阿莫西林钠/克拉维酸钾(7:1)的检测方法，该方法检测出复方中单一成分的含量和有关杂质的同时，具有更高的精密度、更好的专属性和更便利的操作，且能够很方便地被制剂工厂以及各地检测机构或医院使用于产品质量检查和监控中。

专利实例：

实施例一、制剂的初步检测

实验采用“注射用阿莫西林钠克拉维酸钾”，比例为7:1，规格为1.6g。试验样品为白色、类白色或微黄白色粉末，进行以下各种试验。

1、鉴别试验：

两种组分阿莫西林以钠盐形式和克拉维酸以钾盐形式存在，灼烧时应呈现钠盐的火焰反应。取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取本品，在无色的火焰中燃烧，火焰显鲜黄色，以及夹杂着淡淡紫色。

两种组分阿莫西林钠和克拉维酸钾极性不同，可通过HPLC法进行分离，并用对照品进行对照鉴别。取本品和阿莫西林钠和克拉维酸钾的标准品，分别用流动相制成每1ml含1.40mg阿莫西林钠和0.20mg克拉维酸钾的溶液，按照本专利以下描述的含量测定项下高效液相色谱法试验，结果供试品峰与对照品峰一致。(试验方法见实施例二、三)

2、检测试验

试验样品酸度检查：取试验样品加注射用水制成每ml含150mg的溶液，用酸度计测定，结果试验样品的pH在8.0-10.0之间，为合格产品。

试验样品溶液澄清度检查：取试验样品5瓶，分别加水制成每1ml中约含阿莫西林0.1g的溶液，与2号浊度标准液进行比较，检查澄清度。结果试验样品为澄明液体，未超过2号浊度标准液，澄清度符合相关规定，为合格样品。

试验样品水分检查，取试验样品1g，按水分检测法测定，结果试验样品水分含量均在2％左右符合标准，为合格样品。

实施例二、制剂的分析和质量控制方法

为控制产品的质量，必须对产品中的有可能出现的杂质进行分析研究。之前由于没有将两个物质混合在一起使用的经验，所以现有的成熟的方法也只针对单一阿莫西林钠(或克拉维酸钾)中有关杂质的检验方法。

这样的检验方法虽然是对单一物质检验有效，但是否能够检验混合物中的有关杂质还不清楚，因为制备成混合制剂以后两种主要成分是否会相互影响对方的检测，两种杂质是否也会影响对方的检测有很多不确定因素，需要进行大量的试验来验证。所以，我们根据阿莫西林钠、克拉维酸钾单一物质检测方法，建立了相应的对复方物质中杂质的检测方法。

有关杂质物质检测：

由于HPLC方法已经能够很好地用于单一的两种成分检测，因此我们采用HPLC方法建立复方的杂质检测方法。

试验首先进行破坏性试验，按照药物稳定性试验指南分别进行了1)碱破坏：分别取阿莫西林钠约28mg、克拉维酸钾约4mg，以及样品用0.1mol/L的NaOH溶液20ml溶解，室温放置6小时。2)然后采用酸破坏：分别取阿莫西林钠约28mg、克拉维酸钾约4mg，以及样品用0.1mol/L的盐酸溶液20ml溶解，室温放置6小时。3)再采用氧化降解：分别取阿莫西林钠约105mg、克拉维酸钾约15mg，以及样品用30％H₂O₂20ml溶解，置室温6小时。

取经过上述三种破坏性试验的溶液精密量取5ml，置25ml量瓶中，用流动相(配方见后)稀释至刻度，在下述色谱条件下测试，检测阿莫西林钠、克拉维酸钾是否有明显降解，以降解产物峰与主峰分离>2.0，阿莫西林钠降解产物与克拉维酸钾主峰分离度>1.5为合格标准的判断指标。

我们首先采用如下的色谱条件进行筛选最佳的检测方法：

色谱条件(1)：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS2250×4.6mm，流动相采用0.00125mol/L四丁基氢氧化铵(磷酸调节pH至5.0-5.4)：乙腈＝75-90：25-10，流速0.1~3.0ml/min，检测波长采用210-230nm，柱温为室温，进样量为10-30μl。

色谱条件(2)：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS2250×4.6mm，流动相采用0.05mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇(70~99：30~1)，流速0.1~3.0ml/min，检测波长采用210-230nm，柱温为室温，进样量为10-30μl。

色谱条件(3)：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS2250×4.6mm，流动相采用0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(65~90：45~10)，流速0.1~3.0ml/min，检测波长采用210-230nm，柱温为室温，进样量为10-30μl。

色谱条件(4)：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS24.6×200mm，柱温为25℃，流动相采用0.01mol/L磷酸二氢钾溶液980mL(pH6.0)和乙腈20mL混合抽滤，流速1.5mL/min，检测波长采用220nm，进样量为10μl。

色谱条件(5)：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS24.6×200mm，柱温为25℃，流动相采用0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH4.4)-甲醇(95:5)，流速1.0mL/min，检测波长采用220nm，进样量为20μl。

采用上述方法检测发现，色谱条件(1)、(3)、(4)、(5)的复方检测方法虽然也可以用于检测但分离度都小于1.0，两组分都分不开，而色谱条件(2)的分离度较好，但还需优化。经过三种破坏性试验的样品在色谱条件(2)试验条件下阿莫西林钠、克拉维酸钾均无明显降解，阿莫西林钠杂质峰与克拉维酸钾主峰分离度>1.5。

那是不是方法学不够灵敏没检测出杂质？还是本身就没有出现杂质？对此，我们首先采用LC-MS对样品进行了检验，发现经过上述三种破坏试验的样品，在LC-MC检测条件下也没有发现有杂质出现，说明本检验方法是可靠。

更进一步，我们采用极端手段将上述的破坏条件增强2-10倍，用LC-MS首先检测以保证出现杂质，观察本试验条件是否可以检测出来。结果发现，采用更强烈的破坏条件后，阿莫西林钠和克拉维酸钾均在不同程度上出现了降解，这样的降解在3倍强化的酸破坏的条件下刚刚出现，杂质量很低，用LC-MS可以检测到杂质的出现，更强烈破坏条件可以产生更多的杂质。我们采用上述建立的检测方法，对于3倍强化的酸破坏的条件下刚刚出现杂质进行分析，结果该方法可以发现杂质的出现。

我们以“3倍强化的酸破坏的条件下刚刚出现杂质的溶液”作为检测对象，对我们建立的HPLC检测方法进行了优化，最后确定了以下方法作为最佳鉴定方法，较已报道的0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液(pH4.4)-甲醇(95:5)为流动相(陈雷，2001)的结果分离度更好，精密度更高，更加适用于注射用7:1复方制剂的检测。

色谱条件：试验采用Waters515泵，Waters2487紫外检测器，色谱柱采用Hypersil ODS2 250×4.6mm，流动相采用磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.9±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(97:3)，流速1.0ml/min，检测波长采用220nm，柱温为室温，进样量为10μl。

我们以上述检验方法，对检验样品进行了检测，结果如下：

样品溶液制备：取本品适量，精密称定，用流动相溶解制成每1ml中含阿莫西林钠1.4mg和克拉维酸钾0.20mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取0.33ml至10ml量瓶，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液。取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使阿莫西林钠峰高度约为记录仪满量程的10~25％；再精密量取上述两种溶液各10μl分别进样，记录供试液色谱图至阿莫西林钠主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如显示杂质峰，计算各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主成分的峰面积。

试验检验了三批生产样品有关物质检查结果均符合规定。结果见表1及图1~3

表1有关物质检查结果

实施例三、用于该复方制剂的新检测方法的建立和制剂含量测定验证

为控制产品的质量，对复方制剂中两个主要成分的含量控制是个重要指标，对于单一阿莫西林钠、克拉维酸钾两种含量检测已经有比较多的研究方法建立，中国药典也有指定的方法。但是，在制备成混合物后，是否这样的方法仍然能够用于混合物中成分的检测？或者说，混合物中两个物质是否会相互影响对方的检测？这样的问题尚无人进行研究，其中还有很多不确定因素需要面对和解释。对此，我们对于如何开展复方制剂中两种成分的含量进行检测方法进行了研究。

由于HPLC方法已经能够很好地用于单一的两种成分检测，同时HPLC方法也是中国药典推荐的方法，因此，我们采用HPLC方法建立复方的两个成分含量的检测方法。

色谱条件选用：仪器：Waters515泵和Waters2487紫外检测器，试验采用色谱柱为Hypersil ODS2250×4.6mm，5μm；流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(97:3)，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温为室温，进样量为10μl。

流动相的选择和优化：本品为复方制剂，流动相的选择主要考虑两主峰的出峰时间，分离效果以及主峰与杂质峰的分离情况，选用四丁基氢氧化铵-乙腈为流动相及磷酸二氢钾溶液-乙腈为流动相测定时，两组份的分离度太小，而且阿莫西林钠的保留时间过长，不适于测定。适当调节流动相组成：为避免阿莫西林钠保留时间过长，阿莫西林钠杂质峰与克拉维酸钾主峰和阿莫西林主峰分离度不好(R<1.5)，采用调节流动相中甲醇比例(85~99：15~2)，将流动相组成调节为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.9±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(97：3)，阿莫西林杂质峰与克拉维酸主峰和阿莫西林主峰分离度均大于1.5，能获得较佳的分离效果。

检测波长的选择和优化：提取阿莫西林、克拉维酸及其杂质色谱峰的二极管阵列色谱图与光谱图，结果阿莫西林及其杂质在200nm～400nm均有强吸收，在230nm波长处有最大吸收；克拉维酸为末端吸收，同时克拉维酸的量为阿莫西林的1/7，所占比例较小，为不使克拉维酸的吸收度太小、并兼顾阿莫西林、克拉维酸及其杂质的检测，同时参照中国药典2000年版注射用阿莫西林钠克拉维酸钾(5：1)、注射用阿莫西林钠与克拉维酸钾的质量标准，选择220nm为含量测定与有关物质测定的检测波长。

在上述研究的基础上，我们采用选定的色谱条件首先进行了系统适用性试验，在上述色谱条件下，溶剂峰保留时间约3min，不干扰主成分测定。分别注入克拉维酸、阿莫西林对照品以及样品供试溶液，记录色谱图。克拉维酸保留时间7.098min，理论塔板数为13722；阿莫西林保留时间14.534min，理论塔板数为10027。样品溶液谱图中，克拉维酸(7.126min)与杂质峰(6.016min)分离度，阿莫西林主峰(14.637min)与杂质峰(11.603min)分离度均大于2.0(见图4~6)。

我们进一步对检测方法的线性范围进行了研究：精密称取克拉维酸钾对照品(批号130483-200102，纯度92.0％)22.40mg，阿莫西林钠对照品(批号0430-200002，纯度90.6％)150.00mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。精密吸取1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml溶液，置于10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。各精密吸取10μl进样测定，以峰面积对进样浓度进行回归。结果表明，克拉维酸钾在0.078016mg/ml～0.85008mg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系；阿莫西林钠在0.14496mg/ml~5.7248mg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。结果见表2，线性图见图7和8。

表2克拉维酸钾与阿莫西林钠线性范围

再进一步，我们对这个检测方法的精密度进行了试验，分别配制高、中、低三个样品浓度的溶液，照含量测定项下的方法进行实验，各进样3次，计算精密度，结果见表3，色谱图见图9和10。

表3精密度试验结果

我们对这个方法的灵敏度也进行了研究，取克拉维酸钾浓度为0.952μg/ml，阿莫西林钠浓度为6.024μg/ml的对照品溶液，照前述含量测定方法，进样5μl测定。以信号是噪音的3倍所对应的样品量进行计算，结果克拉维酸钾的检测灵敏度为1.21ng，阿莫西林钠的检测灵敏度为0.32ng。

我们还对这个检测方法进行了重复性试验，称取同一批号的样品6份，按照前述含量测定方法制备供试液，测定克拉维酸钾和阿莫西林钠的含量。测得克拉维酸钾含量相对标准偏差为0.95％，阿莫西林钠含量相对标准偏差为0.89％，结果见表4，色谱图见图11~14。

表4重复性试验测定结果

我们还进行了样品检测的回收率试验，该复方制剂为原料直接分装，未添加辅料，故准确度以标准品的不同浓度测定回收率。分别配制样品浓度的80％、100％、120％的溶液，照含量测定项下的方法进行实验，各测定3次，计算回收率。结果见表5，色谱图见图15~23。

表5回收率测定结果

从上面的试验结果表明，我们建立的这个含量测定方法，具有灵敏度、稳定性好，重复性高。是个理想的用于检验复方药物两个成分的方法。

实施例四、采用新的检测方法对注射用复方阿莫西林钠克拉维酸钾样品进行检测

进一步，我们采用这个新的检验方法对三批GMP条件下生产的试验样品含量测定。按照前述含量测定方法进行，取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成每ml含阿莫西林钠1.05mg和含克拉维酸钾0.15mg的溶液，精密量取10μ1，注入色谱仪；另取阿莫西林钠和克拉维酸钾钠对照品适量，同法稀释并测定，按外标法计算供试品中克拉维酸钾和阿莫西林钠的含量。

说明：W对：对照品的称样量，W样：样品的称样量，W装：样品的平均装量，A标：对照品的峰面积，A样：样品的峰面积，对％：对照品的纯度，标示量：样品的标示量

三批样品含量测定结果见表6，色谱图见图24~25。

表6三批样品含量测定结果

实施例五、新检测方法对不同配比的复方制剂的检测

采用上述实例建立的检测方法，我们对不同配比的阿莫西林钠克拉维酸钾的复方制剂进行了检测，以观察这样的方法是否可以用于不同的配比的复方制剂的检测，结果发现，对于阿莫西林钠/克拉维酸钾20:1，10:1，8:1，7:1，6:1，4:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:7，1:8，1:10，1:20等12个不同配比的样品的检测，本专利建立的新方法均能很好的对两个组成成分进行测定，尤其针对7:1比例该方法有很好的灵敏度和可靠性。

实施例六、采用该种检验方法评判为合格制剂的进行动物试验的结果

根据GMP规范进行三批样品制备，按照本专利实例一、二、三的方法对三批样品进行检验，采用上述标准检验合格的制剂样品进行动物试验，检查通过上述新检测方法检验合格的样品是否能够符合动物试验的要求。

试验样品首先进行无菌检查。在无菌室内进行无菌操作，取三批试验样品各6支，分别加入100ml0.9％无菌氯化钠溶液使溶解，摇匀，打开滤器盖，在火焰旁打开样品供试液的塞子使瓶口通过火焰，立即倒入滤器中，并闭滤器盖，打开排液架的阀门，启动真空泵进行减压抽滤，待干后，用灭菌生理盐水照上述操作冲洗滤膜3次，每次100ml。打开抽气瓶排气管，将过滤器取下，用灭菌镊子将滤膜取出放入灭菌双碟中。用灭菌剪刀将滤膜平均分成3份，分别置于各含50ml硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中，其中一份做阳性对照。按规定的温度培养14天。培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。结果无细菌生长，无菌试验符合规定，为合格产品。

试验样品进行异常毒性检查：取三批试验样品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.15g的溶液，取15只小鼠分成三组，每组5只尾静脉注射同一批号的溶液0.5ml，观察48小时的内无异常反应也无死亡，结果为合格产品。

试验样品进行热原检查：取三批试验样品，加灭菌注射用水制成每1ml中含0.15g的溶液，取9只家兔分成3组，每组3只，测定其正常体温后15分钟内，剂量按家免体重每1kg注射1ml，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。各兔体温升高均低于0.6℃，而且每组家兔体温升高总和低于1.4℃，因此三批样品可判断为热源检查符合规定，三批样品为合格产品。结果见表7

表7：热原检查结果

实施例七、采用该种检验方法评判为合格的制剂进行人体试验的结果

根据国家食品药品监督管理局临床研究许可精神，并获得相关研究单位人体伦理委员会同意，采用本专利所描述的检验方法，对三批GMP条件下生产的样品进行了检验，并用检验合格的样品进行了人体临床试验研究。

人体临床试验研究结果表明，在健康人体志愿者药物代谢和耐受性研究中，在每日剂量6克以下该样品是安全的。在多中心、单盲、阳性药物对照的临床试验中，252例临床试验病例证明该试验样品能够有效治疗中、重度急性细菌性呼吸道、和泌尿系感染。

以上所有实例证明本专利所发明的检测方法可以便捷、精确地检测注射用复方阿莫西林钠克拉维酸钾，尤其针对7∶1比例的该复方制剂。该制剂可以很好的应用于临床，而本发明确保了该复方的质量。

附图说明图1是WMAC0301批有关物质检查图谱  图2是WMAC0302批有关物质检查图谱图3是WMAC0303批有关物质检查图谱  图4是克拉维酸对照品图谱图5是阿莫西林对照品图谱          图6是样品图谱图7是线性试验图谱1               图8是线性试验图谱2图9是精密度试验图谱1             图10是精密度试验图谱2图11是重复性试验图谱1            图12是重复性试验图谱2图13是重复性试验图谱3            图14重复性试验图谱4图15是回收率试验图谱1            图16是回收率试验图谱2图17是回收率试验图谱3            图18是回收率试验图谱4图19是回收率试验图谱5            图20是回收率试验图谱6图21是回收率试验图谱7            图22是回收率试验图谱8图23是回收率试验图谱9            图25  3批含量测定图谱图24阿莫西林、克拉维酸含量测定对照图谱。

Claims (8)

1.一种新的用于检测注射用阿莫西林钠与克拉维酸钾复方制剂的检测方法。

2.根据权利要求1所述，其特征在于该方法采用高效液相色谱法，所采用的流动相可以是四丁基氢氧化胺、乙腈、磷酸二氢钠、甲醇、水等其中优选的是磷酸二氢钠和甲醇：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(97:3)。

3.根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于该方法所采用的检测波长可以是210~260nm，优选的波长采用220nm。

4.根据权利要求1、2、3所述的方法，其特征在于该方法所采用的流动相流速可以是0.1~3.0ml/min，优选地流速采用1.0ml/min。

5.根据权利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于该方法所采用的可以是胺基柱，氰基柱，十八烷基硅烷键合硅胶柱，八烷基硅烷键合硅胶柱，四烷基硅烷键合硅胶柱，苯基硅烷键合硅胶柱等；优选地采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(C18柱)。

6.根据权利要求1、2、3、4、5所述的方法，其特征在于该方法对于不同比例的注射用阿莫西林钠克拉维酸钾复方均能检测，注射用阿莫西林钠克拉维酸钾两者成分的比例可以包括6:1~15:1，优选地用于7:1。

7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述的方法，其特征在于该方法可以用于无菌阿莫西林钠克拉维酸钾复方的原料检测，也可以用于该复方的制剂检测。

8.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述方法，这种检测注射用阿莫西林钠克拉维酸钾复方的方法，对两个组分的含量及杂质能很好地检测，并且这样的检验不受另一成分的干扰，有很好的灵敏度、专属性、简便易行，该方法可以用于制药公司在该复方的原料与制剂生产过程中对于产品质量的检测，也可以用于药检所、医院等单位对制剂质量的监控。

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