CN107356690B - 眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法，属药物分析领域。包括配制待测物溶液，进样，于以下条件进行分离：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈～缓冲溶液和乙腈；流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％；检测。该方法能有效分离待测物中的有关物质。配制各有关物质的对照液，采用相同方法进行高液分析，读取峰面积，并计算待测物中各物质的含量。此方法可快速准确的同时测定待测物中各有关物质的含量，以便于把控产品质量。

Description

眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，且特别涉及一种眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法。

背景技术

氟喹诺酮类代表药物氧氟沙星的左旋异构体，抗菌谱广，对需氧革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强杀灭作用，因此，国内外制药企业利用其良好的杀菌作用制备出眼用凝胶剂。该凝胶剂具有水溶性好，附着性强，溶出度高，无油腻感和皮肤、粘膜刺激性，作用持久等特点，可用于眼部细菌性感染疾病的治疗。

由于盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂的组成成分复杂，原辅料中的杂质及生产、存储产生的杂质均会对药品的安全性与有效性产生不利影响，为保证盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂的安全性和质量属性，需提供一种能够检测其有关杂质成分的含量检测方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种眼用凝胶剂中各有关物质的分离方法，该方法简单、能有效分离待测物中的各有关物质，且各有关物质的分离度较高。

本发明的另一目的在于提供一种眼用凝胶剂中各有关物质的检测方法，该检测方法可快速准确的同时测定待测物种各有关物质的含量，便于把控产品质量。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种眼用凝胶剂中各有关物质的分离方法，其包括以下步骤：

将眼用凝胶剂配制成待测物溶液，取待测物溶液注入高效液相色谱仪，于以下条件进行分离：

色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为体积比为(10:90)～(20:80)的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。

乙腈～缓冲溶液中的缓冲溶液的pH值为2.0～3.0。

洗脱条件：洗脱时间及洗脱时间内流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。

在分离过程中的柱温为25～45℃。

分离过程中流动相A和流动相B的流速均为0.8～1.2mL/min。

上述待测物溶液经以下步骤制备：待测物由极性溶液稀释至浓度为0.5～1.5mg/mL，离心，取上清液。

上述极性溶液为纯化水或浓度为0.05～0.5mol/L的盐酸。

上述待测物溶液注入高效液相色谱仪的体积为10～20μL。

眼用凝胶剂中有关物质包括杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E中的至少一种。其中杂质A、环丙沙星与杂质E属于制剂中主药左氧氟沙星合成过程中的中间体，羟苯甲酸属于制剂防中防腐剂羟苯甲酯的降解产物。

上述极性溶液通过称取醋酸铵和高氯酸钠，加水溶解后，用磷酸调节pH至2.0～3.0。

本发明还提出了一种盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中各有关物质的检测方法，其包括以下步骤：

将眼用凝胶剂配制成待测物溶液，配制需检测含量的有关物质成分的对照液。

上述有关物质成分包括杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E中的至少一种。

按上述分离方法中的分离条件分别对待测物溶液和对照液进行色谱检测，并按以下方式计算待测物溶液中物质成分的含量：

w_物质成分＝(A_{测有关物质成分}×m_{对有关物质成分})/(A_{对有关物质成分}×m_测)×100％；

其中，A_测为待测物溶液中有关物质成分的色谱峰面积，A_对为对照液中有关物质成分的色谱峰面积，m_对为对照液中有关物质成分的质量，m_测为待测物质量。

上述杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星与杂质E的检测波长分别为：230～245nm、250～260nm、290～300nm和290～300nm

本发明实施例的眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法的有益效果是：

采用本申请提供的方法可同时检测眼用凝胶中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量，实现该眼用凝胶中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A与制剂中其它物质完全分离，保证在测定过程中不受干扰，所属色谱峰峰形对称，无明显拖尾，前后分离度均满足大于1.5的要求且理论塔板数计算达到2000，具有较好的柱效，同时本方法操作简便、检测耗时短，从而保证眼用凝胶剂的安全性和质量属性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在238nm的HPLC色谱图；

图2为本发明实施例1中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在254nm的HPLC色谱图；

图3为本发明实施例1中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在294nm的HPLC色谱图；

图4为本发明实施例2中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在230nm的HPLC色谱图；

图5为本发明实施例2中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在250nm的HPLC色谱图；

图6为本发明实施例2中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在290nm的HPLC色谱图；

图7为本发明实施例3中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在238nm的HPLC色谱图；

图8为本发明实施例3中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在260nm的HPLC色谱图；

图9为本发明实施例3中盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在300nm的HPLC色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的眼用凝胶剂中有关物质的分离与检测方法进行具体说明。

本方案中的眼用凝胶剂可以为盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂。将盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂配制成待测物溶液，作为可选地，上述盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂为产自湖北远大天天明制药有限公司的产品。该待测物溶液可以经以下步骤得到：将上述待测物由极性溶液稀释至浓度为0.5～1.5mg/mL，离心，取上清液作为待测物溶液。

作为可选地，上述极性溶液例如可以选自纯化水或盐酸。较优地，盐酸的浓度可以为0.08～0.12mol/L；更优地，本实施例中的盐酸的浓度为0.1mol/L。

离心可以在转速为2500～3500r/min的条件下进行10～20min，较佳地，本实施例中的离心是在3000r/min的条件下进行15min。

取上述待测物溶液注入高相液相色谱仪中进行测定。作为可选地，待测物溶液注入高效液相色谱仪的体积可以为10～20μL，较佳地，注入体积为10μL。

进一步地，本实施例中的高效液相色谱的分离条件如下：

一、色谱条件：

色谱柱：优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250×4.6mm，5μm)。

流动相：包括流动相A和流动相B。具体地，流动相A为乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。其中，乙腈～缓冲溶液可以由乙腈与缓冲溶液以体积比(10:90)～(20:80)混合而成，较优地，乙腈与缓冲溶液的体积比为15:85。

缓冲溶液优选为pH值为2.0～3.0的醋酸铵和高氯酸钠的混合溶液。具体地，可以将4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至2.0～3.0。更优地，上述缓冲溶液的pH值为2.2。

作为可选地，分离过程中柱温可控制在25～45℃范围内。进一步地，柱温优选为40℃。二、洗脱条件：

洗脱时间：优选不超过60min，更优地，控制在50min内。

洗脱方式：梯度洗脱。

洗脱时间内A流动相和流动相B在流动相中的体积含量如下：

洗脱流速：分离过程中流动相A和流动相B的流速均可控制为0.8～1.2mL/min。优选地，流动相A和流动相B的流速均为1mL/min。

三、检测条件：

作为可选地，分离过程中柱温可控制在38～42℃范围内。进一步地，柱温优选为40℃。

此外，本实施除了提供上述的盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E的分离方法外，还提供了盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中物质成分的含量检测方法。该含量检测方法可以包括以下步骤：将盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂配制成待测物溶液，配制需检测含量的物质成分的对照液，按上述的分离方法中的分离条件分别对待测物溶液和对照液进行色谱检测，杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E的检测波长分别可以为230～245nm、250～260nm、290～300nm和290～300nm。进一步地，上述4种成分的检测波长分别优选为238nm、254nm、294nm和294nm并按以下方式计算待测物溶液中物质成分的含量：

w_物质成分＝(A_{测有关物质成分}×m_{对有关物质成分})/(A_{对有关物质成分}×m_测)×100％

其中，A_测为待测物溶液中有关物质成分的色谱峰面积，A_对为对照液中有关物质成分的色谱峰面积，m_对为对照液中有关物质成分的质量，m_测为待测物质量。

上述有关物质成分包括杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E中的至少一种。

具体地，盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E的含量的检测方法可以包括以下步骤：

将盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂按照上述分离方法中的步骤配制成待测物溶液，并分别配制杂质A对照液、羟苯甲酸对照液、环丙沙星对照液和杂质E对照液。其中，羟苯甲酸对照液和环丙沙星对照液均直接分别用水稀释羟苯甲酸对照品和环丙沙星对照品即可。

杂质E对照液例如可经以下步骤得到：将杂质E对照品用极性溶液稀释至浓度为4.5～5.5μg/mL。该极性溶液也可以选自纯化水或盐酸。较优地，盐酸的浓度可以为0.08～0.12mol/L；更优地，盐酸的浓度为0.1mol/L。具体地，例如可以取杂质E对照品，加入0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至每毫升杂质E对照液中含有5μg的杂质E。

杂质A对照液例如可经以下步骤得到：将杂质A对照品用氨溶液及水稀释至溶质(杂质A)的浓度为0.1～0.2mg/mL。该氨溶液的浓度优选为5～7mol/L，更优地，氨溶液的浓度为6mol/L。具体地，例如可以取15mg杂质A对照品，加入1mL浓度为6mol/L的氨溶液，并加入水混合至溶液体积为100mL，得到浓度为0.15mg/mL的杂质A对照液。

然后按照上述盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的分离方法中的分离条件分别对待测物溶液、羟苯甲酸对照液、杂质E对照液、环丙沙星对照液和杂质A对照液进行色谱检测，得到各成分的高效液相色谱图，读取各成分对应的谱图中的色谱峰的峰面积，并分别按以下方式计算待测物溶液中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量：

w_羟苯甲酸＝(A_{测羟苯甲酸}×m_{对羟苯甲酸})/(A_{对羟苯甲酸}×m_测)×100％；

w_杂质E＝(A_测杂质E×m_对杂质E)/(A_对杂质E×m_测)×100％；

w_环丙沙星＝(A_{测环丙沙星}×m_{对环丙沙星})/(A_{对环丙沙星}×m_测)×100％；

w_杂质A＝(A_测杂质A×m_对杂质A)/(A_对杂质A×m_测)×100％。

其中，A_测为待测物溶液中有关物质成分的色谱峰面积，A_对为对照液中有关物质成分的色谱峰面积，m_对为对照液中有关物质成分的质量，m_测为待测物质量。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

用0.1mol/L的盐酸稀释盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂至浓度为1mg/mL，于3000r/min的条件下离心进行15min，取上清液为待测物溶液。

用水分别稀释羟苯甲酸对照品和环丙沙星对照品，得到羟苯甲酸对照液和环丙沙星对照液。用0.1mol/L的盐酸稀释杂质E对照品至浓度为5μg/mL，得到杂质E对照液。用6mol/L的氨水以及水稀释杂质A对照品至浓度为0.15mg/mL，得到杂质A对照液。

分别取待测物溶液、羟苯甲酸对照液、杂质E对照液、环丙沙星对照液和杂质A对照液各10μL，注入戴安U3000高效液相色谱仪，按以下条件进行分离，得到如图1至图3所示的高效液相色谱图。

色谱条件：色谱柱为Thermo Scientific AcclaimTM 120 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，

)；流动相A为体积比为15：85的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。乙腈～缓冲溶液由4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至2.2而得。

洗脱条件：采用梯度洗脱，洗脱时间及洗脱时间内流动相中的流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。洗脱流速为1mL/min。

检测条件：羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长分别为254nm、294nm、294nm和238nm。分离过程中柱温为40℃。

读取高效液相色谱图中上述各成分对应的色谱峰的峰面积，并按以下方式计算待测物溶液中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量：

w_羟苯甲酸＝(A_{测羟苯甲酸}×m_{对羟苯甲酸})/(A_{对羟苯甲酸}×m_测)×100％；

w_杂质E＝(A_测杂质E×m_对杂质E)/(A_对杂质E×m_测)×100％；

w_环丙沙星＝(A_{测环丙沙星}×m_{对环丙沙星})/(A_{对环丙沙星}×m_测)×100％；

w_杂质A＝(A_测杂质A×m_对杂质A)/(A_对杂质A×m_测)×100％。

其结果为：盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量分别为0.033％、0.016％、0.011％、0.020％。

实施例2

用0.05mol/L的盐酸稀释盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂至浓度为0.5mg/mL，于2500r/min的条件下离心进行20min，取上清液为待测物溶液。

用水分别稀释羟苯甲酸对照品和环丙沙星对照品，得到羟苯甲酸对照液和环丙沙星对照液。用0.08mol/L的盐酸稀释杂质E对照品至浓度为4.5μg/mL，得到杂质E对照液。用5mol/L的氨水以及水稀释杂质A对照品至浓度为0.1mg/mL，得到杂质A对照液。

分别取待测物溶液、羟苯甲酸对照液、杂质E对照液、环丙沙星对照液和杂质A对照液各15μL，注入Agilent1260高效液相色谱仪，按以下条件进行分离，得到如图4至图6所示的高效液相色谱图。

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，

)；流动相A为体积比为10：90的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。乙腈～缓冲溶液由4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至2.0而得。

洗脱条件：采用梯度洗脱，洗脱时间及洗脱时间内流动相中的流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。洗脱流速为0.8mL/min。

检测条件：羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长分别为250nm、290nm、290nm和230nm。分离过程中柱温为45℃。

读取高效液相色谱图中上述各成分对应的色谱峰的峰面积，并按以下方式计算待测物溶液中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量：

w_羟苯甲酸＝(A_{测羟苯甲酸}×m_{对羟苯甲酸})/(A_{对羟苯甲酸}×m_测)×100％；

w_杂质E＝(A_测杂质E×m_对杂质E)/(A_对杂质E×m_测)×100％；

w_环丙沙星＝(A_{测环丙沙星}×m_{对环丙沙星})/(A_{对环丙沙星}×m_测)×100％；

w_杂质A＝(A_测杂质A×m_对杂质A)/(A_对杂质A×m_测)×100％。

其结果为：盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量分别为0.036％、0.012％、0.009％、0.023％。

实施例3

用0.5mol/L的盐酸稀释盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂至浓度为1.5mg/mL，于3500r/min的条件下离心进行10min，取上清液为待测物溶液。

用水分别稀释羟苯甲酸对照品和环丙沙星对照品，得到羟苯甲酸对照液和环丙沙星对照液。用0.12mol/L的盐酸稀释杂质E对照品至浓度为5.5μg/mL，得到杂质E对照液。用7mol/L的氨水以及水稀释杂质A对照品至浓度为0.2mg/mL，得到杂质A对照液。

分别取待测物溶液、羟苯甲酸对照液、杂质E对照液、环丙沙星对照液和杂质A对照液各20μL，注入Waters Alliance2695高效液相色谱仪，按以下条件进行分离，得到如图7至图9所示的高效液相色谱图。

色谱条件：色谱柱为Thermo Hypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，

)；流动相A为体积比为20：80的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。乙腈～缓冲溶液由4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至3.0而得。

洗脱条件：采用梯度洗脱，洗脱时间及洗脱时间内流动相中的流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。洗脱流速为1.2mL/min。

检测条件：羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长分别为260nm、300nm、300nm和238nm。分离过程中柱温为25℃。

读取高效液相色谱图中上述各成分对应的色谱峰的峰面积，并按以下方式计算待测物溶液中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量：

w_羟苯甲酸＝(A_{测羟苯甲酸}×m_{对羟苯甲酸})/(A_{对羟苯甲酸}×m_测)×100％；

w_杂质E＝(A_测杂质E×m_对杂质E)/(A_对杂质E×m_测)×100％；

w_环丙沙星＝(A_{测环丙沙星}×m_{对环丙沙星})/(A_{对环丙沙星}×m_测)×100％；

w_杂质A＝(A_测杂质A×m_对杂质A)/(A_对杂质A×m_测)×100％。

其结果为：盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量分别为0.030％、0.015％、0.010％、0.018％。

试验例1

按以下条件范围分别对实施例1～实施例3的分离和检测方法进行多次试验。

待测样品浓度：0.5～1.5mg/mL；盐酸浓度：0.08～0.12mol/L；离心转速：2500～3500r/min；离心时间：10～20min；进样体积：10～20μL；乙腈与缓冲溶液的体积比：10:90～20:80；缓冲溶液pH值：2.0～3.0；洗脱时间：小于等于60min；洗脱流速：0.8～1.2mL/min；羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长：250～260nm、290～300nm、290～300nm和230～245nm；柱温：38～42℃；杂质E对照液浓度：4.5～5.5μg/mL；杂质A对照液浓度：0.1～0.2mg/m；氨溶液浓度：5～7mol/L。极性溶液例选自纯化水或上述浓度范围的盐酸。

经试验，按以上条件范围试验均可对盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A达到分离及含量测定，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于2000，表明本发明实施例所提供的盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的分离度及柱效较高。

试验例2

对盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂进行破坏降解试验，采用光二极管阵列检测器进行主峰纯度检查以验证本方法专属性是否达到要求。

仪器：戴安U3000高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为Dionex Acclaim120 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，

)；流动相A为体积比为15：85的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。乙腈～缓冲溶液由4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至2.2而得。

洗脱条件：采用梯度洗脱，洗脱时间及洗脱时间内流动相中的流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。

检测条件：羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长分别为254nm、294nm、294nm和238nm。分离过程中柱温为40℃。

待测物溶液：用0.1mol/L的盐酸稀释盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

光破坏试验：取盐酸左氧氟沙星眼用凝胶适量，分别置光照仪器内，于照度为(4500±500)lx的条件下，放置10天后，用0.1mol/L的盐酸稀释至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

高温破坏试验：称取盐酸左氧氟沙星眼用凝胶适量，置105℃烘箱内加热4h后，精密称取适量，用0.1mol/L的盐酸稀释至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

酸破坏试验：称取盐酸左氧氟沙星眼用凝胶适量，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解，水浴2h后，用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和，随后用0.1mol/L的盐酸稀释至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

碱破坏试验：称取盐酸左氧氟沙星眼用凝胶适量，加入0.01mol/L氢氧化钠溶液溶解，水浴2h后，用0.01mol/L盐酸溶液中和，随后用0.1mol/L的盐酸溶液稀释至0.11mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

氧化破坏试验：称取盐酸左氧氟沙星眼用凝胶适量，加入30％的双氧水溶液溶解，水浴2h后，用0.1mol/L的盐酸稀释至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

吸取上述试验样品溶液10μL注入高效液相色谱仪，同时采用光二极管阵列检测器，对各样品溶液进行200～400nm的UV波长扫描，试验结果如表1所示。

表1盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂的破坏降解试验结果

由表1可以看出，上述盐酸左氧氟沙星眼用凝胶在高温与氧化条件下易降解，而在强光照射(lx4500±500)、酸、碱破坏条件下较稳定。利用二极管阵列检测器全波长扫描四个目标峰，通过纯度分析可知四个目标峰纯度均小于纯度阈值，达到要求，显示本方法专属性好，无干扰。

试验例3

对盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂进行结果精密度试验，以考察本方法精密度好坏。

仪器：戴安U3000高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为Dionex Acclaim120 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，

)；流动相A为体积比为15：85的乙腈～缓冲溶液，流动相B为乙腈。乙腈～缓冲溶液由4g醋酸铵、7g高氯酸钠与1300mL的水混合，然后用磷酸调节混合溶液的pH值至2.2而得。

洗脱条件：采用梯度洗脱，洗脱时间及洗脱时间内流动相中的流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％。洗脱流速为1mL/min。

检测条件：羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的检测波长分别为254nm、294nm、294nm和238nm。分离过程中柱温为40℃。

对照液配制：用水分别稀释羟苯甲酸对照品和环丙沙星对照品，得到羟苯甲酸对照液和环丙沙星对照液。用0.08mol/L的盐酸稀释杂质E对照品至浓度为4.5μg/mL，得到杂质E对照液。用5mol/L的氨水以及水稀释杂质A对照品至浓度为0.1mg/mL，得到杂质A对照液。

待测物溶液：用0.1mol/L的盐酸稀释盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂至浓度为1mg/mL。同法配置空白辅料溶液。

检测：分别精密吸取待测物溶液与对照液各10μL，重复注入高效液相色谱仪6次，注入高效液相色谱仪，并分别读取待测物中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的色谱峰峰面积A_{测羟苯甲酸}、A_测杂质E、A_{测环丙沙星}和A_测杂质A，与对照液中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的色谱峰峰面积A_{对羟苯甲酸}、A_对杂质E、A_{对环丙沙星}和A_对杂质A，目标峰理论塔板数与分离度均满足要求，按照外标法公式计算得到羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量如表2所示。

表2盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂的结果精密度的试验结果

由表2可以看出，测定所得的羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量的相对标准偏差均小于2.0％，表明本方案实施例提供的方法具有较好的结果精密度。

综上所述，本发明实施例的盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的分离方法简单，能有效分离待测物中的上述各成分，且各成分的分离度较高。且上述盐酸左氧氟沙星眼用凝胶剂中羟苯甲酸、杂质E、环丙沙星和杂质A的含量检测方法可快速准确的同时测定待测物中上述各成分的含量，便于把控产品质量。保证该凝胶剂的安全性和质量属性，且该方法简便、快速、专属性高、检测限低及准确度与精密度均良好。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种眼用凝胶剂中有关物质成分的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

将眼用凝胶剂配制成待测物溶液，取所述待测物溶液注入高效液相色谱仪，于以下条件进行分离：

色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相包括流动相A和流动相B，其中，所述流动相A为体积比为(10:90)～(20:80)的乙腈～缓冲溶液，所述流动相B为乙腈；

所述乙腈～缓冲溶液中的缓冲溶液的pH值为2.0～3.0；

洗脱条件：洗脱时间及所述洗脱时间内所述流动相B的体积含量如下：0～18min，0％；18～25min，0～30％；25～39min，30％；39～40min，30～0％；40～50min，0％；

所述待测物溶液经以下步骤得到：所述待测物由极性溶液稀释至浓度为0.5～1.5mg/mL，离心，取上清液；

所述眼用凝胶剂中所述有关物质包括杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，分离过程中的柱温为25～45℃。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，分离过程中所述流动相A和所述流动相B的流速均为0.8～1.2mL/min。

4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述极性溶液为纯化水或浓度为0.05～0.5mol/L的盐酸。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述待测物溶液注入所述高效液相色谱仪的体积为10～20μL。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述缓冲溶液包含醋酸铵、高氯酸钠与磷酸。

7.一种眼用凝胶剂中有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

将眼用凝胶剂配制成待测物溶液，配制需检测含量的所述有关物质成分的对照液；所述有关物质成分包括杂质A、羟苯甲酸、环丙沙星和杂质E中的至少一种；

按如权利要求1所述的分离方法中的分离条件分别对所述待测物溶液和所述对照液进行色谱检测，并按以下方式计算所述待测物溶液中所述有关物质成分的含量：

w_物质成分＝(A_{测有关物质成分}×m_{对有关物质成分})/(A_{对有关物质成分}×m_测)×100％；

其中，A_测为待测物溶液中所述有关物质成分的色谱峰面积，A_对为对照液中所述有关物质成分的色谱峰面积，m_对为对照液中所述有关物质成分的质量，m_测为待测物质量。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述杂质A、所述羟苯甲酸、所述环丙沙星与所述杂质E的检测波长分别为：230～245nm、250～260nm、290～300nm和290～300nm。

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