PL236352B1

PL236352B1 - Sposób oczyszczania daptomycyny

Info

Publication number: PL236352B1
Application number: PL416764A
Authority: PL
Inventors: Thomas J. Kelleher; Jan-Ji Lai; Joseph P. Decourcey; Paul D. Lynch; Maurizio Zenoni; Auro R. Tagliani
Original assignee: Cubist Pharm Inc
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2021-01-11
Also published as: US6696412B1; WO2001053330A2; ES2799702T3; CN102229650B; KR101291494B1; DE60115383T2; IL219889A; CN102671181A; BR0107731A; EP2940036A1; US20050009747A1; CN107082798A; US20070191280A1; MXPA02007132A; EP2159229A1; US8058238B2; US20130280760A1; DK1586580T3; JP2003520807A; US8853357B2

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobów oczyszczania daptomycyny. Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności sposobu oczyszczania daptomycyny, które łatwo można przeskalować do produkcji na skalę przemysłową. Szybki wzrost przypadków infekcji bakteriami gram-dodatnimi - włączając te spowodowane przez bakterie oporne na antybiotyki - wskrzesiła ponowne zainteresowanie w opracowywaniu nowych klas antybiotyków. Jedną z takich klas są antybiotyki lipopeptydowe, do których zalicza się daptomycyna. Daptomycyna posiada silną aktywność bakteriobójczą in vitro przeciwko szpitalnym szczepom bakterii gram-dodatnich, które powodują poważne i groźne dla życia choroby. Bakterie obejmują oporne patogeny, takie enterokoki oporne na wankomycynę (VRE), Staphylococcus aureus oporny na metycylinę (MRSA), Staphylococcus aureus uwrażliwiony za pośrednictwem glikopeptydu (GISA), gronkowce koagulazo-ujemne (CNS), Streptococcus pneumoniae oporny na penicylinę (PRSP), dla których istnieje zaledwie kilka alternatywnych terapii. Zobacz, np. publikacja Tally et al., 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8:1223-1238, określana dalej „Tally”. Hamujące działanie daptomycyny jest szybkim, zależnym od stężenia działaniem bakteriobójczym in vitro i in vivo, i ze stosunkowo wydłużonym, zależnym od stężenia działaniem in vivo po zakończeniu kuracji antybiotykowej.

Daptomycynę opisał Baltz w Biotechnology of Antibiotics, Wyd. 2, red. W.R Strohl (New York: Marcel Dekker, Inc.), 1997, str. 415-435, dalej „Baltz” . Daptomycyna, znana także jako LY 146032, jest antybiotykiem lipopeptydowym o strukturze cyklicznej, który może być otrzymany z fermentacji Streptomyces roseosporus. Daptomycyna jest członkiem antybiotyków typu czynnika A-21978Co S. roseosporus i składa się dekanoilowego łańcucha bocznego połączonego z N-końcowym tryptofanem 13-aminokwasowego cyklicznego peptydu (Fig. 1). Daptomycyna posiada doskonały profil aktywności, ponieważ jest wysoce skuteczna przeciwko większości bakterii gram-dodatnich; jest wysoce bakteriobójcza i szybko działająca; charakteryzuje się małą szybkością powstawania szczepów opornych i jest skuteczna przeciwko organizmom opornym na antybiotyki. Związek ten jest obecnie wprowadzany do wielu preparatów stosowanych do leczenia poważnych zakażeń powodowanych przez bakterie, włączając, lecz nie będąc ograniczonym do Staphylococcus aureus opornego na metycylinę (MRSA), i enterokoków opornych na wankomycynę (VRE).

Szereg patentów USA opisuje antybiotyki A-21978C i ich pochodne włączając daptomycynę (LY 146032), jak również sposoby otrzymywania i izolowania antybiotyków A-21978C i ich pochodnych.

Patenty USA Re. 32333, Re. 32455 i 4800157 opisują sposób syntezy daptomycyny w hodowli Streptomyces roseosporus NRL15998 w warunkach aerobowej fermentacji wgłębnej. Patent USA Nr 4885243 opisuje udoskonalony sposób syntezy daptomycyny przez zasilanie hodowli fermentacyjnej dekanowym kwasem tłuszczowym lub jego estrem albo solą.

Patenty USA Re. 21310, Re. 32311, 4537717, 4482487 i 4524135 opisują sposoby deacetylowania antybiotyku A-21978C oraz ponownego acetylowania rdzenia peptydu i pochodnych antybiotyku powstałych w tym procesie. Wszystkie te patenty opisują oczyszczony i deacetylowany rdzeń antybiotyku A-21978C lub jego pochodną, który został wyizolowany z bulionu fermentacyjnego przez filtrację i następnie oczyszczony przez chromatografię na złożu Diaion HP-20 oraz chromatografię na żelu krzemionkowym/C18.

Patenty USA Re. 32333 i Re. 32455 ujawniają sposób oczyszczania, w którym przesącz pełnego bulionu fermentacyjnego został oczyszczony przez szeregu kroków wytrąceń i ekstrakcji, w celu uzyskania surowego kompleksu A-21978C. Surowy kompleks następnie oczyszczano przez chromatografię jonowymienną na złożu IRA-68 i dwie rundy chromatografii na żelu krzemionkowym. Poszczególne czynniki A-21978C rozdzielono przez chromatografię w odwróconym układzie faz na żelu krzemionkowym lub żelu krzemionkowym/C18. Patenty USA Re. 32333 i Re. 32455 ujawniają także, że A-21978C może być oczyszczony przez wstępną chromatografię z użyciem żywicy Diaion HP-20 i następnie przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym.

Patent USA Nr 4874843 opisuje sposób oczyszczania daptomycyny, w którym bulion fermentacyjny przefiltrowano i oczyszczono na kolumnie zawierającej żywicę HP-20. Po elucji półoczyszczoną daptomycynę oczyszczono na kolumnie zawierającej HP-20ss i ponownie rozdzielono na żywicy HP-20. Patent '843 stwierdza, że końcowy rozdział i separacja daptomycyny od strukturalnie podobnych składników są w tym sposobie utrudnione ze względu na obecność zanieczyszczeń, które nie są możliwe do zidentyfikowania przez analizę UV bulionu fermentacyjnego. Patent '843 dalej stwierdza, że próby usunięcia tych zanieczyszczeń przez chromatografię w odwróconym układzie faz na żelu krze

PL 236 352 B1 mionkowym, chromatografię w normalnym układzie faz na żelu krzemionkowym lub chromatografię jonowymienną także okazały się nieskuteczne w polepszeniu czystości daptomycyny. Patent '843 ujawnia także „odwrócony sposób” oczyszczania obejmujący etapy kontaktu wodnego roztworu produktu fermentacji z niemodyfikowaną żywicą w fazie wodnej, fizycznego usunięcia wody z naładowanej żywicy, ponownego zwilżenia naładowanej żywicy polarnym rozpuszczalnikiem, przemycia żywicy rozpuszczalnikiem organicznym, elucji produktu fermentacji z żywicy przez zwiększenie polarności rozpuszczalnika i odzyskania produktu fermentacji. Patent '843 ujawnia także, że metoda ta polepsza ostateczną czystość z około 80% do około 93%, zwiększa wydajność z około 5% do około 35%; jednakże patent '843 nie ujawnia typu zanieczyszczeń obecnych w preparacie daptomycyny.

Patent USA Nr 5912226 opisuje identyfikację i izolację dwóch zanieczyszczeń powstałych w procesie wytwarzania daptomycyny. Daptomycyna, α-aspartylo-peptyd, ulega transpeptydacji do formy stabilnego produktu pośredniego, w którym grupa aspartylowa staje się grupą anhydrosukcynoimidową (Fig. 3). Patent '226 ujawnia, że obecność tego produktu pośredniego, nazwanego anhydrodaptomycyną, jest bardziej wyraźna przy pH 4-6. Ponowne uwodnienie formy anhydrosukcynoimidowej prowadzi do powstania drugiego produktu degradacji, który zawiera grupę β-aspartylową i jest nazwany β-izomerem daptomycyny (Fig. 2).

W patencie '226 ujawniono, że pochodna t-BOC anhydrodaptomycyny może być wyizolowana przez chromatografię w odwróconym układzie faz na kolumnie z żelem krzemionkowym/C18, wytrącona i ponownie oczyszczona przez chromatografię w odwróconym układzie faz na żelu krzemionkowym/C18. Patent '226 ujawnia także, że β-izomeryczna forma daptomycyny może być oczyszczona przez chromatografię na żywicy Diaion HP-20ss, odsolona przez chromatografię na żywicy Diaion HP-20 i dalej oczyszczana z użyciem kolumny C-18 w odwróconych fazach, a następnie na kolumnie z żywicą HP-20 w odwróconym układzie.

Kirch et al. (Pharmaceutical Research, 6:387-393, 1989, dalej „Kirsch”) twierdzi, że anhydrodaptomycyna i β-izomer powstawały podczas oczyszczania daptomycyny. Kirsch opisał sposoby minimalizacji ilości anhydro-daptomycyny i β-izomeru przez manipulacje warunkami pH i warunkami temperatury. Jednakże Kirsch nie był w stanie stabilizować daptomycyny i powstrzymać przemiany daptomycyny do anhydro-daptomycyny i następnie jej izomeryzacji do β-izomeru. Kirsch także nie był w stanie powstrzymać degradacji daptomycyny do innych produktów degradacji niespokrewnionych z anhydrodaptomycyną i β-izomerem.

W patencie '226 stwierdzono, że daptomycyna może być przygotowana z zastosowaniem tych procedur, tak że zawiera nie więcej niż 2,5% wagowo połączonej całkowitej ilości anhydro-daptomycyny i β-izomeru, lecz nie podaje żadnych danych o poziomach innych zanieczyszczeń. W sposobie ujawnionym w USA 4874843 i sposobach otrzymywania daptomycyny na dużą skalę do prób klinicznych najwyższe obserwowane poziomy czystości daptomycyny wynosiły 90%-93%. Istnieje potrzeba opracowania sposobu wytwarzania bardziej wysoce oczyszczonej daptomycyny, możliwego do zastosowania na skalę przemysłową i, jeśli to możliwe, zwiększenia jej wydajności po oczyszczeniu. Ponadto, byłoby pożądane uzyskanie oczyszczonej daptomycyny, która zawiera niewiele lub nie zawiera wcale anhydro-daptomycyny i β-izomerycznej formy daptomycyny. Pożądane byłoby także zmniejszenie poziomów szeregu innych zanieczyszczeń daptomycyny. Jednakże, w tej dziedzinie nie było dotąd żadnej metody, dla której pokazano by, że umożliwia dalsze zmniejszenie poziomów anhydrodaptomycyny, formy β-izomerycznej i innych zanieczyszczeń w produkcie daptomycyny.

Niniejszy wynalazek rozwiązuje te problemy przez dostarczenie możliwych do zastosowania na skalę przemysłową sposobów wytwarzania dużych ilości oczyszczonej daptomycyny. Niniejszym ujawniono możliwe do zastosowania na skalę przemysłową sposoby, których wynikiem jest daptomycyna o czystości na poziomie 95-97%. Ponadto możliwy do zastosowania na skalę przemysłową opisany niniejszym sposób oczyszczania daptomycyny prawie całkowicie eliminuje główne zanieczyszczenia w postaci anhydro-daptomycyny i β-izomeru, jak również inne zanieczyszczenia w preparatach daptomycyny. Możliwe do zastosowania na skalę przemysłową sposoby oczyszczania daptomycyny według wynalazku, obejmą oczyszczenie miceli lipopeptydowych z zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej i oczyszczenie niezasocjowanych lipopeptydów z zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej. Niniejszym ujawniono także sposoby analizy czystości daptomycyny oraz detekcji i charakteryzowania innych zanieczyszczeń daptomycyny z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), niektóre z nich były wcześniej nieznane.

Oczyszczona daptomycyna wykazuje przynajmniej 98% czystość lub jest w zasadniczo lub istotnie wolna od anhydrodaptomycyny i β-izomeru. Niniejszym ujawniono oczyszczoną daptomycynę, która

PL 236 352 B1 jest wolna lub istotnie wolna od anhydrodaptomycyny i zawiera znacznie niższy poziom β-izomeru i innych zanieczyszczeń niż było to wcześniej możliwe do uzyskania w stanie techniki. Rozwiązania według wynalazku wykorzystują właściwości daptomycyny do tworzenia miceli. Niniejszym ujawniono również kompozycje farmaceutyczne zawierające wysoko oczyszczone micele daptomycyny oraz sposoby zastosowania tych kompozycji.

W pierwszej postaci wykonania sposób oczyszczania daptomycyny według wyanalzku obejmuje etapy:

a) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 2,5-5,0 wytwarzany jest roztwór micelarnej daptomycyny; oraz

b) oddzielania miceli daptomycyny z roztworu micelarnej daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.

Korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje ponadto etapy:

c) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 6,0-7,5 wytwarzany jest roztwór monomerycznej daptomycyny; oraz

d) oddzielania cząsteczek monomerycznej daptomycyny z roztworu monomerycznej daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.

W alternatywnej postaci wykonania daptomycyna jest dostarczona w postaci micelarnej, a sposób oczyszczania jej od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów obejmuje etapy:

a) poddawania daptomycyny micelarnej warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 6,0-7,5 wytwarzana jest monomeryczna daptomycyna; oraz

b) oddzielania cząsteczek monomerycznej daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.

Korzystnie w sposobie według wynalazku monomeryczna daptomycyna znajduje się w roztworze. Korzystniej sposób według wynalazku ponadto obejmuje etapy:

c) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 2,5-5,0 wytwarzana jest micelarna daptomycyna; oraz

b) oddzielania miceli daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia strukturę daptomycyny.

Fig. 2 przedstawia strukturę zanieczyszczenia 8, CB-131010 (wcześniej zidentyfikowanego jako β-izomer, LY213846).

Fig. 3 przedstawia strukturę zanieczyszczenia 13, CB-130952 (wcześniej zidentyfikowanego jako anhydro-daptomycyną, LY178480).

Fig. 4 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 1, CB-131012 (wcześniej zidentyfikowanego jako LY212218).

Fig. 5 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 2, CB-131011.

Fig. 6 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 3, CB-131008 (wcześniej zidentyfi- kowanego jako LY213928).

Fig. 7 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 4, CB-131006.

Fig. 8 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 6, CB-130989 (wcześniej zidentyfi- kowanego jako LY213827).

Fig. 9 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 7, CB-131005.

Fig. 10 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 12, CB-131009.

Fig. 11 przedstawia proponowaną strukturę zanieczyszczenia 14, CB-131078 (wcześniej zidentyfikowanego jako LY109208).

Fig. 12 przedstawia chromatogram HPLC preparatu daptomycyny w dużej ilości, włączając zanieczyszczenia 1 do 14.

Fig. 13 przedstawia chromatogram HPLC preparatu daptomycyny po oczyszczeniu na żywicy Poros P150.

PL 236 352 B1

Fig. 14A-14C przedstawiają struktury miceli.

Fig. 14A przedstawia micelę sferyczną, w której hydrofobowe ogony cząsteczek amfipatycznych są zorientowane do środka sfery podczas, gdy hydrofitowe główki są zorientowane na zewnątrz sfery i pozostają w kontakcie ze środowiskiem wodnym.

Fig. 14A przedstawia przykład, w którym hydrofitowe główki są naładowane ujemnie. Fig. 14B przedstawia strukturę dwuwarstwy lipidowej, w której dwie warstwy cząsteczek amfipatycznych układają się w ten sposób, że hydrofobowe ogony każdej z warstw są zorientowane do siebie, podczas, gdy hydrofitowe główki po obydwu stronach dwuwarstwy są w kontakcie ze środowiskiem wodnym. Dwuwarstwy lipidowe mogą być zarówno sferyczne jak i płaskie. Fig. 14C przedstawia liposom, w którym dwuwarstwa lipidowa, taka jak ta przedstawiona na Fig. 14B, tworzy sferyczną strukturę zawierającą wodne wnętrze. Hydrofilowe główki liposomy stykają się z wodnym wnętrzem i zewnętrznym środowiskiem wodnym.

Fig. 15 przedstawia wyniki eksperymentu mającego na celu określenie krytycznego stężenia miceli (cmc, ang. critical micellar concentration) daptomycyny przy pH 4,0.

Fig. 16 przedstawia rozkład wielkości miceli daptomycyny mierzony przez rozproszenie światła. Micele daptomycyny mają średni rozmiar 5,4 nm (54 A).

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszym ujawniono sposób oczyszczania daptomycyny, który mógłby być łatwo przeskalowany do produkcji na skalę przemysłową, obejmującego unikalną kombinację chromatografii anionowymiennej i chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Sposób ten jest wykorzystywany do wytwarzania oczyszczonej daptomycyny o czystości większej niż 95%, która wykazuje zmniejszone poziomy zanieczyszczeń w porównaniu do daptomycyny otrzymywanej sposobami ze stanu techniki. Sposób taki jest wykorzystywany do wytwarzania daptomycyny przy użyciu zmniejszonej ilości rozpuszczalników w porównaniu z tymi używanymi w sposobach ze stanu techniki. Ujawniony niniejszym sposób może być wykorzystywany do wytwarzania oczyszczonych lipopeptydów pokrewnych daptomycynie o czystości większej niż 95%.

Niniejszym ujawniono także sposób zwiększenia ilości lipopeptydów wyprodukowanych przez mikroorganizmy przez zasilanie hodowli fermentacyjnej zmniejszoną ilością kwasu tłuszczowego. Stosowanie mniejszych ilości kwasu dekanowego niż te proponowane dla fermentacji daptomycyny w patencie USA 4885243 polepsza ekonomię w połączeniu z wytwarzaniem daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie w formie o wysokiej czystości. Sposób ten jest stosowany do zwiększenia stężenia i ilości daptomycyny wytworzonej przez Streptomyces roseosporus wraz z minimalizacją otrzymywania pokrewnych zanieczyszczeń. Niższe poziomy zanieczyszczeń w bulionie fermentacyjnym skutkują bardziej wydajnym odzyskiem i oczyszczeniem daptomycyny, co prowadzi do podniesienia wydajności procesu produkcji.

Niniejszym opisano również sposób oczyszczania daptomycyny z zastosowaniem ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem. Sposób taki jest stosowany do wytwarzania daptomycyny, która jest czysta przynajmniej w 98% lub która jest zasadniczo lub istotnie wolna od anhydro-daptomycyny lub β-izomeru. Możliwe jest stosowanie opisanego tu sposobu do oczyszczenia lipopeptydów pokrewnych daptomycynie do czystości przynajmniej 98%.

Niniejszym ujawniono również zastosowanie chromatografii preparatywnej do oczyszczenia lipopeptydu daptomycyny obejmującego nowatorską kombinację chromatografii anionowymiennej, chromatografii oddziaływań hydrofobowych i ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem. Ujawniony tutaj sposób jest stosowany do oczyszczania daptomycyny, jednakże możliwe jest jego zastosowanie do oczyszczania lipopeptydu pokrewnego daptomycynie. Zmodyfikowany bufor nieoczekiwanie pozwala na oddzielenie anhydro-daptomycyny od daptomycyny, co było niemożliwe we wcześniejszych sposobach chromatografii.

Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu oczyszczania lipopeptydów daptomycyny wykorzystującego micele lipopeptydowe, który można łatwo przeskalować do produkcji przemysłowej. W jednym z wykonań sposób obejmuje przekształcenie podczas procesów oczyszczania roztworu daptomycyny ze stanu monomerycznego, niemicelarnego do stanu micelarnego i odwrotnie. W korzystnym wykonaniu sposób obejmuje poddawanie lipopeptydów daptomycyny warunkom, w których formują się micele, oddzielanie miceli lipopeptydowych daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej, np. przez technikę rozdziału względem wielkości. W innym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje poddawanie lipopeptydów daptomycyny warunkom, w których są one w postaci monomerów i oddzielanie cząsteczek monomerów daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej

PL 236 352 B1 lub agregatów, np. przez technikę rozdziału względem wielkości. W bardziej korzystnym wykonaniu sposób obejmuje obydwa etapy: poddawanie lipopeptydów daptomycyny warunkom, w których formują się micele i oddzielanie miceli lipopeptydowych daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej i następnie poddanie miceli lipopeptydów daptomycyny warunkom, w których lipopeptydy daptomycyny są w postaci monomerycznej i oddzielenie monomerów lipopeptydów daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów. Te dwa etapy mogą być wykonane w dowolnej kolejności. W nawet bardziej korzystnym wykonaniu techniką rozdziału względem wielkości jest ultrafiltracja lub chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząstek.

Niniejszym opisano ulepszone sposoby pomiaru czystości lipopeptydów, w tym daptomycyny, przez zastosowanie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).

Z zastosowaniem ujawnionych tu sposobów dostarczene są lipopeptydy daptomycyny, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole lub preparaty. Sposobami tu ujawnionymi dostarczany jest oczyszczony lipopeptyd daptomycyny. Niniejszym opisane zostały również kompozycje farmaceutyczne oczyszczonego lipopeptydu daptomycyny lub jego soli. Niniejszym opisano także sposoby podawania tych kompozycji.

Niniejszym opisano również micele lipopeptydu pokrewnego daptomycynie. Sposoby podawania miceli lipopeptydowych lub ich farmaceutycznych preparatów pacjentom, którzy tego potrzebują zostały przedstawione poniżej. Micele lipopeptydowe mogą być podawane dożylnie, pozajelitowo, domięśniowo lub domiejscowo.

Definicje

Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne oraz naukowe określenia użyte tutaj mają znaczenia takie, jakie są powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do której należy tej wynalazek. Wykonanie niniejszego wynalazku obejmuje, jeżeli nie stwierdzono inaczej, standardowe techniki stosowane w chemii, biochemii i mikrobiologii oraz podstawową terminologię w nich stosowaną.

Określenie „wyizolowany” odnosi się do związku lub produktu, tj. odnosi się do związku, który stanowi przynajmniej 10%, korzystnie przynajmniej 20% lub 30%, korzystniej przynajmniej 50%, 60% lub 70%, i najkorzystniej, przynajmniej 80% lub 90% związku obecnego w mieszaninie.

Określenie „lipopeptyd” odnosi się do cząsteczki, która zawiera ugrupowanie lipido-podobne kowalencyjnie związane z ugrupowaniem peptydowym, jak również do jej soli, estrów, amidów lub eterów. Określenie „lipopeptyd” także obejmuje zabezpieczone formy lipopeptydów, w których jest zabezpieczona jedna lub większa liczba grup aminowych, karboksylowych lub hydroksylowych. Zobacz, np. „Protective Groups in Organic Synthesis” Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981 gdzie przedstawiono przykłady grup zabezpieczających. Lipopeptyd może być antybiotykiem. Lipopeptyd może być wybrany spośród LY 303366, echinokardyn, pneumoardyn, akuleacyn, surfaktyny, plipastatyny B1, amfomycyny lub pochodnej lipopeptydu ujawnionej w patencie USA 5629288. Te lipopeptydy są znane w tej dziedzinie. Zobacz, np. patent USA Nr 5202309 i międzynarodowe zgłoszenie PCT WO 00/08197. Lipopeptyd może być cząsteczką pokrewną daptomycynie, włączając między innymi daptomycynę, A54145, lipopeptyd pokrewny daptomycynie ujawniony w patencie USA nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, aktualnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o nr seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. Lipopeptydy pokrewne daptomycynie ujawnione w WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, odnoszą się do syntetycznych i półsyntetycznych lipopeptydów, w których zmodyfikowane są reszty ornityny lub kynuryny albo kwasu tłuszczowego z łańcucha bocznego daptomycyny. W rozwiązaniach według wynalazku lipopeptydem jest daptomycyna. Określenie lipopeptyd pokrewny daptomycynie odnosi się do związków opisanych powyżej i ich soli.

Określenie „daptomycyna” odnosi się n-dekanoilowej pochodnej antybiotyku typu czynnik A-21978Co lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. „Daptomycyna” jest równoznaczna z LY146032. Zobacz Fig. 1.

Określenie „anhydro-daptomycyna” odnosi się do pochodnej daptomycyny, w której grupa α-aspartylowa daptomycyny ulega transpeptydylacji do grupy anhydrosukcynoimidowej. Zobacz Fig. 3.

Określenie „β-izomer” lub „β-izomer daptomycyny” odnosi się do pochodnej daptomycyny, która zawiera grupę β-aspartylową zamiast grupy α-aspartylowej. Zobacz Fig. 2.

PL 236 352 B1

Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „zasadniczo czysty”, jeżeli przynajmniej 95% próbki stanowi daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie. Korzystnie daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „zasadniczo czysta”, jeżeli przynajmniej 97% próbki stanowi daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie.

Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „istotnie czysty”, jeżeli przynajmniej 98% próbki stanowi daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie. Korzystnie daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „istotnie czysty”, jeżeli przynajmniej 99% próbki stanowi daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie.

Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „zasadniczo wolny” od innych związków, gdy inny związek jest obecny w ilości, która nie jest większa niż 1% ilości preparatu daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie.

Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „istotnie wolny” od innych związków, gdy inny związek jest obecny w ilości, która nie jest większa niż 0,5% ilości preparatu daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie.

Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „wolny” od innego związku, gdy inny związek jest obecny w ilości, która nie jest większa niż 0,1% ilości preparatu daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie. Alternatywnie, daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie jest „wolna” od innego związku, gdy związek ten nie może być wykryty z zastosowaniem HPLC w warunkach maksymalnej czułości, w których granica detekcji wynosi w przybliżeniu 0,05% lub mniej ilości preparatu daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie. Przykładowe sposoby HPLC zostały opisane poniżej (Tabele 1 i 2).

„Oczyszczona” daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie odnosi się do zasadniczo czystej daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, istotnie czystej daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub ich soli, albo do daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub ich soli, które są zasadniczo wolne, istotnie wolne lub wolne od innego związku.

„Częściowo oczyszczona” daptomycyna lub polipeptyd pokrewny daptomycynie odnosi się do daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub ich soli o czystości mniejszej niż 90%.

Czystość daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub innego polipeptydu odnosi się do lipopeptydu przed jego włączeniem do kompozycji farmaceutycznej. Czystość może być mierzona dowolnymi sposobami, włączając w to jądrowy rezonans magnetyczny (NMR) , chromatografię gazową/spektroskopię masową (GC/MS), chromatografię cieczową/spektrometrię masową (LC/MS) i analizy mikrobiologiczne. Korzystnym sposobem do pomiaru czystości daptomycyny jest analityczna wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC).

Określenie „micela” odnosi się do agregatów cząsteczek amfipatycznych. W środowisku wodnym, domeny lipofilowe cząsteczek agregatu są zorientowane do wnętrza miceli a domeny hydrofilowe pozostają w kontakcie ze środowiskiem. Struktury miceli obejmują, ale nie ograniczają się do struktur sferycznych, laminarnych, cylindrycznych, elipsoidalnych, pęcherzykowych (liposomowych), lamelarnych i ciekłokrystalicznych. Zobacz Fig. 14.

Określenie „micela mieszana” odnosi się do szczególnego typu miceli, w którym micela zawiera więcej niż jeden typ cząsteczki amfipatycznej. W kontekście niniejszego opisu, micele mieszane zawierają lipopeptyd i przynajmniej jedną inną cząsteczkę amfipatyczną, która może być innym lipopeptydem. Micele mieszane zawierają przynajmniej 10% lipopeptydu wagowo. W innych wykonaniach micela mieszana zawiera przynajmniej 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% lipopeptydu.

Określenie „roztwór miceli” odnosi się do roztworu, w którym więcej niż 50% wagowo cząsteczek lipopeptydu w roztworze występuje w postaci miceli. Korzystnie w postaci miceli występuje przynajmniej 60%, 70%, 80%, 90% lub 95% cząsteczek. Roztwór miceli pozostaje na membranie ultrafiltracyjnej, która zatrzymuje cząsteczki o nominalnej masie cząsteczkowej (NMW, ang. nominał molecular weight) powyżej 10000 daltonów.

Określenie „krytyczne stężenie miceli” (cmc) odnosi się do specyficznego stężenia cząsteczek, które jest zależne od temperatury, stężenia soli i właściwości oraz typu cząsteczki amfipatycznej. Powyżej cmc niezasocjowane monomery i micele są w stanie równowagi.

Określenie „monomer” odnosi się do amfipatycznej cząsteczki, która nie jest częścią agregatu, ale istnieje jako pojedyncza cząsteczka. W kontekście niniejszego opisu, określenie monomer odnosi się do niezasocjowanego lipopeptydu.

Określenie „roztwór monomerów” odnosi się do roztworu, w którym więcej niż 50% wagowo cząsteczek lipopeptydu jest obecnych jako monomery. Korzystnie przynajmniej 60%, 70%, 80%, 90% lub

PL 236 352 B1

95% jest obecnych jako monomery. Roztwór monomerów nie jest zatrzymywany przez membranę ultrafiltracyjną zatrzymującą cząsteczki o NMW powyżej 10000 daltonów, ale raczej przechodzi przez membranę.

Określenie „bufor o małej sile jonowej” odnosi się do roztworu, który posiada stężenie soli poniżej 50 mM; określenie „bufor o średniej sile jonowej” odnosi się do stężenia soli pomiędzy 50-250 mM; określenie „bufor o dużej sile jonowej” odnosi się do roztworu, który zawiera stężenie soli większe niż 250 mM.

Sposoby wytwarzania oczyszczonych lipopeptydów

Niniejszym opisano sposób chromatografii preparatywnej, dzięki któremu możliwe jest wytwarzanie oczyszczonego lipopeptydu, w szczególności daptomycyny, na skalę przemysłową. Sposób chromatografii preparatywnej obejmuje zastosowanie kolejno chromatografii anionowymiennej, chromatografii oddziaływań jonowymiennych (HIC) i chromatografii anionowymiennej do oczyszczenia preparatu zawierającego lipopeptyd, taki jak daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie.

Sposób oczyszczania może być poprzedzony fermentacją prowadzoną w zmienionych warunkach, w celu zwiększenia produkcji daptomycyny i zmniejszenia zanieczyszczeń i pokrewnych produktów ubocznych powstających w hodowli fermentacyjnej Streptomyces roseosporus.

Sposób chromatografii preparatywnej jest opisany poniżej:

Streptomyces roseosporus jest poddawany fermentacji po zasileniu kwasem n-dekanowym, jak ujawniono w patencie USA Nr 4885243, z tą modyfikacją, że zasilanie kwasem dekanowym jest utrzymane na najmniejszych możliwych poziomach, bez zmniejszenia ogólnej wydajności fermentacji. W korzystnym wykonaniu resztkowy kwas dekanowy jest utrzymywany podczas fermentacji tlenowej na poziomie mniejszym niż 50 części na milion (ppm). W bardziej korzystnym wykonaniu, resztkowy kwas dekanowy jest utrzymywany podczas fermentacji tlenowej na poziomie pomiędzy jednym a 20 ppm. W nawet bardziej korzystnym wykonaniu resztkowy kwas dekanowy jest utrzymywany podczas fermentacji tlenowej na poziomie około dziesięciu ppm. W korzystnym wykonaniu stężenie resztkowego kwasu dekanowego jest mierzone podczas fermentacji i dostosowane tak, aby w sposób ciągły utrzymać poziomy resztkowego kwasu dekanowego w granicach korzystnych parametrów. W stanie techniki nie zostały opisane specyficzne in situ i niskie stałe resztkowe stężenia kwasu dekanowego wymagane do osiągnięcia optymalnej ekspresji daptomycyny zawierającej niższe poziomy zanieczyszczeń.

Po fermentacji, zewnątrzkomórkowy roztwór jest klarowany przez usunięcie grzybni z bulionu fermentacyjnego. Usunięcie grzybni z fermentacji jest wykonywane standardową techniką rozdziału, taką, jak wirowanie lub mikrofiltracja. W korzystnym wykonaniu bulion fermentacyjny jest klarowany przez mikrofiltrację, na przykład z zastosowaniem systemu membranowego Pall Sep^TM . W bardziej korzystnym wykonaniu, bulion fermentacyjny jest klarowany przez zastosowanie, wirówki przemysłowej, takiej jak wirówka Westfalia™ , a następnie proces wykańczany jest na filtrze wgłębnym. Do usunięcia grzybni z bulionu fermentacyjnego i wytworzenia klarownego bulionu odpowiedniego do chromatografii kolumnowej na dużą skalę mogą być zastosowane inne urządzenia, takie jak prasy filtracyjne, obrotowe filtry bębnowe lub jednorazowe filtry wgłębne.

Daptomycyna, przed wyklarowaniem na wirówce oddzielającej rozpuszczalnik lub na filtrze, może być wyekstrahowana bezpośrednio z pozostałości po fermentacji grzybni przez zastosowanie rozpuszczalnika organicznego, takiego jak butanol. W tym wykonaniu może być zastosowany dowolny alkohol z czterema lub większą liczbą węgli. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest n-butanol. Zastosowanie organicznego rozpuszczalnika daje dodatkowe wstępne oczyszczanie daptomycyny w porównaniu do czysto wodnego oddzielenia daptomycyny. Na przykład, daptomycyna przechodzi do n-butanolu, gdy n-butanol jest użyty w stężeniu większym niż 10% i gdy proces jest przeprowadzany w warunkach, w których n-butanol tworzy osobną fazę, np. przy pH o wartości 4-5, która jest blisko punktu izoelektrycznego daptomycyny (zobacz Przykład 4).

Daptomycyna może być też wytwarzana w unieruchomionym reaktorze, w którym używa się wstępnie aktywowanej grzybni do niefermentacyjnej produkcji daptomycyny stosując źródło energii, korzystnie cukier, związki podstawowe, takie jak aminokwasy i amoniak, oraz kwas dekanowego. Wytwarzanie daptomycyny w reaktorze z immobilizowanym enzymem prowadzi się sposobami tutaj opisanymi.

Po wyklarowaniu bulionu fermentacyjnego, poziomy daptomycyny zostają podniesione (tj. zatężone) w wyklarowanym roztworze przez chromatografię anionowymienną. Wyklarowany roztwór jest początkowo nanoszony na żywicę anionowymienną w warunkach, w których większość lub cała daptomycyna wiąże się z żywicą anionowymienną. Po związaniu, żywica jest przemywana buforem wodnym

PL 236 352 B1 o odpowiedniej sile jonowej w celu usunięcia niezwiązanego materiału i niektórych zanieczyszczeń daptomycyny. W końcu oczyszczona daptomycyna związana z żywicą jest eluowana w warunkach, w których daptomycyna oddysocjowuje od żywicy.

Etapy wiązania, przemywania i elucji mogą być wykonane przy zastosowaniu buforów i sposobów znanych w tej dziedzinie. Na przykład, elucja może być wykonana przez zastosowanie buforu zawierającego zwiększone stężenie soli w porównaniu z buforem przemywającym, buforu, który ma niższe pH w porównaniu z buforem przemywającym lub buforu, który ma zarówno wyższe stężenie soli jak i niższe pH niż bufor przemywający. W korzystnym wykonaniu, daptomycyna jest związana do żywicy anionowymiennej, która została zrównoważona buforem niezawierającym żadnych dodanych soli lub buforem o niskim stężeniu soli przy pH, które jest w zakresie od neutralnego do zasadowego. Naładowana żywica jest przemywana wodą - trzema objętościami złoża kolumny, a następnie trzema do sześciu objętościami buforu o pośrednim stężeniu soli zawierającym od 30 do 60 mM NaCl. Daptomycyna jest eluowana z kolumny jedną do trzech objętościami buforu o podniesionym stężeniu soli i/lub niższym pH zawierającego od 300 do 500 mM NaCl. Wyższe stężenia chlorku sodu i alternatywnych soli, takich jak chlorek potasu także eluuje daptomycynę z żywicy. W korzystnym wykonaniu stosowana jest żywica o dużej szybkości przepływu. W bardziej korzystnym wykonaniu stosowana jest żywica FP-DA 13 (Mitsubishi).

Chromatografia anionowymienną może być wykonana na kolumnie chromatograficznej lub może być zrealizowana w trybie wsadowym (ang. batch mode). Do produkcji na skalę handlową zastosowanie trybu wsadowego może być korzystniejsze. Żywica anionowymienną może być przemywana i eluowana skokowymi gradientami soli lub ciągłym gradientem soli. Przez odpowiedni skokowy lub ciągły gradient soli rozumie się każdy, który umożliwia oddzielenie daptomycyny od zanieczyszczeń. W korzystnym wykonaniu ciągły gradient soli zmienia się w zakresie od 0 do 1000 mM NaCl. W bardziej korzystnym wykonaniu ciągły gradient soli zmienia się w zakresie od 100 do 500 mM NaCl lub od 0 do 400 mM NaCl. Chromatografia z przepływem radialnym może także być użyta, jak opisano w Patentach USA Nr 5756680, 4865729, 4840730 lub 4708782.

Po chromatografii anionowymiennej preparat daptomycyny jest dalej oczyszczany przez chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HIC). Jedno z wykonań tego etapu jest opisane w Patencie USA Nr 4874843. Wyeluowany wodny preparat daptomycyny jest mieszany z żywicą HIC w warunkach, w których większość lub cała daptomycyna zwiąże się do żywicy. Zawartość wody w żywicy naładowanej daptomycyną jest zmniejszana przez traktowanie żywicy zwiększonym stężeniem rozpuszczalnika niepolarnego. Żywica jest przemywana rozpuszczalnikiem organicznym o odpowiedniej polarności w warunkach, w których od żywicy oddysocjowują zanieczyszczenia podczas, gdy daptomycyna pozostaje związana. Ostatecznie preparat daptomycyny jest eluowany w warunkach, w których daptomycyna oddysocjowuje od żywicy. W ogólności daptomycyna jest eluowana przy użyciu buforu zawierającego rozpuszczalnik o niższej polarności (wyższy poziom rozpuszczalnika polarnego) i/lub wyższym pH niż bufor przemywający.

W korzystnym wykonaniu, niefunkcjonalną żywicą używaną w HIC jest małocząstkowa HP-20ss (Mitsubishi). Związana daptomycyna jest specyficznie usuwana z żywicy HP-20ss rozpuszczalnikiem fazy organicznej, takim jak ten zawierający alkohol izopropylowy, acetonitryl, butanol lub inny odpowiedni rozpuszczalnik. W bardziej korzystnym wykonaniu daptomycyna jest wiązana do żywicy HP-20ss, która została zrównoważona buforem octanowym zawierającym 10% acetonitrylu lub równoważnego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak alkohol izopropylowy. Żywica naładowana daptomycyną jest przemywana przynajmniej trzema objętościami złoża kolumny buforu równoważącego. Następnie, żywica naładowana daptomycyną jest uwalniana od dodatkowych zanieczyszczeń przez przemywanie od trzech do sześciu objętościami złoża kolumny buforu octanowego do przemywania zawierającego nieeulujące stężenie rozpuszczalnika polarnego. W korzystnym wykonaniu żywica naładowana daptomycyną jest przemywana 30% acetonitrylem lub 45% alkoholem izopropylowym. Żywica naładowana daptomycyną jest eluowana od jednej do trzech objętościami złoża kolumny buforu octanowego zawierającego 35% lub więcej acetonitrylu albo więcej niż 50% alkoholu izopropylowego. W korzystnym wykonaniu daptomycyna jest eluowana 35% acetonitrylem przy pH 4,0-5,0 lub 55-60% alkoholem izopropylowym. W innym wykonaniu żywica naładowana daptomycyną jest eluowana od jednej do trzech objętościami złoża kolumny buforu o zwiększonym pH. W tym wykonaniu, pH buforu jest stopniowo zwiększane w celu elucji różnych składników z kolumny z różnymi szybkościami dzięki różnicom w ładunku. Przy podniesionym pH, np. pH 6,0-7,0, stężenie eluujące acetonitrylu jest zmniejszone do 10-20%. Podobnie, przy podniesionym pH, np. pH 6,0-7,0, stężenie eluujące alkoholu izopropylowego jest

PL 236 352 B1 zmniejszone do 20-25%. Kontrola temperatury, w której prowadzi się chromatografię także wpływa na stężenie rozpuszczalnika. Elucja w niższych temperaturach, tj. w warunkach chłodzenia wymaga podniesionych poziomów rozpuszczalnika we wszystkich warunkach pH.

Po HIC zawartość rozpuszczalnika organicznego jest zmniejszana w preparacie daptomycyny przez chromatografię anionowymienną. W korzystnym wykonaniu stosowany jest FP-DA 13 jak omówiono powyżej.

Po drugiej chromatografii anionowymiennej, oczyszczona daptomycyna jest poddana depirogenacji, filtrowana i zatężana w warunkach chłodzenia. Filtrowanie daptomycyny może być wykonane dowolnym sposobem znanym w tej dziedzinie. W jednym z wykonań filtrowanie daptomycyny i jej depirogenacja może być wykonana przez:

i) dostarczenie roztworu daptomycyny w warunkach, w których daptomycyna jest w stanie monomerycznym i niemicelarnym;

ii) filtrowanie roztworu daptomycyny w warunkach, w których daptomycyna przejdzie przez filtr, ale pirogeny nie przejdą przez filtr, np. utrzymywanie roztworu daptomycyny przy pH 6,0-8,0 i filtrowanie roztworu na ultrafiltrze, który rozdziela cząsteczki w zakresie 3000 NMW i 30000 NMW;

iii) przekształcenie roztworu daptomycyny, który przeszedł przez filtr tak, że daptomycyna agreguje, np. przez zmianę pH roztworu daptomycyny do 2,5-4,5 tak, że daptomycyna formuje micele;

iv) filtrowanie roztworu daptomycyny w warunkach, w których daptomycyna będzie zatrzy- mywana na filtrze, np. zatężanie daptomycyny na ultrafiltrze o 30000 NMW lub mniejszej, takim, jak membrana do odwróconej osmozy; oraz

v) zbieranie odpirogenizowanej daptomycyny.

W korzystnym wykonaniu daptomycyna na etapie (ii) jest filtrowana pod ciśnieniem na ultrafiltrze przepuszczającym cząsteczki poniżej 10000 daltonów (MWCO, ang. molecular weight cutoff) przy pH w przybliżeniu 7-8. W bardziej korzystnym wykonaniu, początkowe stężenie daptomycyny wynosi mniej niż 40 mg/ml, bardziej korzystnie w przybliżeniu 31,25 mg/ml. W tych warunkach daptomycyna przechodzi przez filtr, ale pirogeny takie, jak lipopolisacharydy (LPS) nie przechodzą. Po wstępnej ultrafiltracji, pH filtratu jest obniżane do pH od 2,5 do 4,5 i filtrat jest zatężony na ultrafiltrze 10000 MWCO w przybliżeniu do 120 mg/ml. W tych warunkach daptomycyna jest zatrzymywana na filtrze. W korzystnym wykonaniu pH filtratu wynosi 3,5. Po zatężaniu, stężenie daptomycyny jest doprowadzane do 105 mg/ml, sprawdzane pod kątem poziomu endotoksyn i rozlewane do fiolek w warunkach aseptycznych.

W innym wykonaniu, nanofiltracja przez odwróconą osmozę jest prowadzona przy pH 1,5-3,0. Niższe pH i warunki chłodzenia są zastosowane w celu powstrzymywania degradacji oczyszczonej daptomycyny. Daptomycyna może być dalej poddana filtracji przez filtr 0,2 μm w celu zmniejszenia zanieczyszczeń biologicznych, oraz liofilizowana, zarówno w dużej ilości, jak i w fiolkach.

Jako alternatywa dla powyższego etapu ultrafiltracji i zatężania, wyeluowane frakcje zawierające daptomycynę są mieszane z butanolem (zarówno n-, izo-, jak i t-butanolem) przy pH wynoszącym około 4,5, w stosunku więcej niż jedna część butanolu do dziewięciu części roztworu daptomycyny. W korzystnym wykonaniu, jedna część butanolu jest mieszana z czterema częściami roztworu daptomycyny z wytworzeniem 20% roztworu butanolu. Roztwór butanol-daptomycyna jest pozostawiony do rozdzielenia na fazę organiczną i wodną. Daptomycyna przechodzi do fazy organicznej, która jest zbierana. Odwodnienie daptomycyny w rozpuszczalniku organicznym może stabilizować daptomycynę i uchronić oczyszczoną daptomycynę przed degradacją do anhydrodaptomycyny, a następnie powstaniem β-izomeru. Ostatecznie, daptomycyna może być przeniesiona do fazy wodnej przez dodanie do fazy organicznej buforu o pH 6,5-7,5. Po zatężeniu lub zebraniu daptomycyny, daptomycyna jest liofilizowana.

Przedstawione tu sposoby chromatografii preparatywnej mogą być zastosowane do oczyszczania lipopeptydów innych niż daptomycyna takich, jak A54145, LY303366, echinokardyny, pneumokardyny, akuleacyna, sulfaktyna, plipastatyna B1, amfomycyna lub pochodne lipopeptydowe ujawnione w Patencie USA Nr 5629288. Sposób chromatografii preparatywnej może być również stosowany do oczyszczania lipopeptydów pokrewnych daptomycynie, włączając A54145 lub lipopeptyd ujawniony w patencie USA Nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, lub antybiotyku A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny

PL 236 352 B1 w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego.

W innym wykonaniu, do oczyszczania daptomycyny lub innych lipopeptydów zastosowany jest „Sposób Chmury Solnej” (ang. Salt Cloud Method) [Genetic Engineering News, Tom 19, Nr 20, strony 1,34 i 43, (November 15, 2000)]. Sposób Chmury Solnej jest systemem opartym na membranach, który łączy w sobie selektywny rozdział z przerobem dużych objętości. Sposób Chmury Solnej może być użyty w połączeniu z etapami preparatywnymi ujawnionymi tutaj lub osobno w celu oczyszczenia daptomycyny lub innych lipopeptydów.

Opisane tu suposobychromatografii, prowadzą do powstania wysoko oczyszczonej daptomycyny, której otrzymanie jest niemożliwe sposobami chromatograficznymi ze stanu techniki. Sposób chromatografii obejmuje zastosowanie ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem do oczyszczania preparatu zawierającego daptomycynę. Sposób ten może być użyty nie tylko do otrzymania wysoko oczyszczonej daptomycyny, ale również lipopeptydu pokrewnego daptomycynie. Zastosowanie tego sposobu do częściowo oczyszczonej daptomycyny prowadzi do otrzymania daptomycyny o czystości przynajmniej 98%. Sposób ten prowadzi także do otrzymania daptomycyny, która jest istotnie wolna od anhydro-daptomycyny. Sposób obejmuje następujące etapy:

Częściowo oczyszczona daptomycyna jest otrzymywana dowolnym sposobem znanym w tej dziedzinie lub jak tutaj opisano. Preparat daptomycyny jest następnie oczyszczany przez ulepszoną chromatografię anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem. Daptomycyna jest wiązana do żywicy anionowymiennej w obecności zmodyfikowanego buforu o odpowiedniej sile jonowej w warunkach, w których wiąże się do jonu żywicy w stanie monomerycznym i niemicelarnym. Zmodyfikowany bufor zawiera związek buforujący, taki jak, bez ograniczeń, octan, fosforan, cytrynian i Tris-HCl, lub inny związek buforujący, który dobrze buforuje przy obojętnym pH. Zmodyfikowany bufor zawiera ponadto, związki chaotropowe, włączając, bez ograniczeń, guanidynę, amoniak, mocznik, silny związek redukujący, benzoesan, askorbinian lub inny wzmacniacz jonowy zdolny do modyfikacji buforu tak, że daptomycyna ulega łatwemu oddzieleniu od zanieczyszczeń. Żywica naładowana daptomycyną jest przemywana buforem o odpowiednio zmodyfikowanej zawartości jonowej w celu elucji zanieczyszczeń, włączając anhydro-daptomycynę. Daptomycyna jest następnie eluowana w warunkach, które pozwalają na oddzielenie daptomycyny od zanieczyszczeń, które pozostają związane do żywicy, włączając β-izomer.

W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowany bufor posiada neutralne pH (pH od 6 do 8) i zawiera od 2 do 6 M mocznik. W kolejnym korzystnym wykonaniu, żywicą anionowymienną jest Porous Resin P150 lub Porous D50 (PE Biosystems). W bardziej korzystnym wykonaniu, żywicą anionowymienną jest Porous P150. W korzystnym wykonaniu, daptomycyna jest wiązana do żywicy w buforze o niskiej sile jonowej, przemywana buforem o niskiej do średniej sile jonowej i eluowana buforem o wysokiej sile jonowej. W jednym z korzystnych wykonań, daptomycyna jest wiązana do żywicy Porous P150 w buforze Tris, pH 7,0, zawierającym 6 M mocznik. Żywica Porous P150 naładowana daptomycyną jest przemywana trzema objętościami złoża kolumny buforu Tris lub innego odpowiedniego buforu zawierającego poziom soli, który usuwa zanieczyszczenia i anhydrodaptomycynę bez elucji daptomycyny. Daptomycyna jest eluowana z żywicy Porous P150 buforem Tris lub innym odpowiednim buforem w warunkach o podniesionej zawartości soli, który to bufor pozostawi dodatkowe zanieczyszczenia, łącznie ze znaczącą częścią β-izomeru, związane do kolumny. W innym korzystnym wykonaniu, zastosowana jest Porous P150 i daptomycyna jest związana do żywicy w buforze octanowym, pH 6,0, zawierającym 2 M mocznik. Żywica Porous P150 naładowana daptomycyną jest przemywana i eluowana podobnie do powyższego sposobu, z tym wyjątkiem, że stosowany jest bufor octanowy, pH 6,0, zawierający 2 M mocznik. Rozdział produktów może być mierzony przez HPLC lub monitorowanie przy użyciu UV.

Ulepszona chromatografia anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem może być prowadzona jako chromatografia kolumnowa lub może być zastosowana w trybie wsadowym. Jak opisano w patentach USA Nr 5756680, 4865729, 4840730, 4708782 może być także zastosowana chromatografia z przepływem radialnym. Ulepszona żywica anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem może być przemywana i wymywana skokowymi gradientami soli lub ciągłym gradientem soli. Odpowiednim skokowym lub ciągłym gradientem soli jest każdy, który pozwala na rozdział daptomycyny od zanieczyszczeń, włączając, lecz nie będąc ograniczonym do anhydro-daptomycyny i β-izomeru. W korzystnym wykonaniu ciągłym gradientem soli jest 0 do 1000 mM NaCl. W bardziej korzystnym wykonaniu gradientem soli jest 100 do 500 mM NaCl lub 0 do 400 mM NaCl.

PL 236 352 B1

Ulepszona chromatografia anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem może być zastosowana do oczyszczenia składników lipopeptydowych innych niż daptomycyna. Te składniki lipopeptydowe obejmują, bez ograniczeń, A54145, LY303366, echinokandyny, pneumokandyny, akuleacynę, surfaktynę i plipastatynę B1 (Tsuge et al. , 1996, Arch., Microbiol. 165:243-51) i pochodne lipopeptydów, jak przedstawiono w patencie USA nr 5629288. Ulepszona chromatografia anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem może być także zastosowana do oczyszczenia lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, takiego jak A54145, lub lipopeptyd ujawniony w Patencie USA nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego.

Do oczyszczania daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie można także zastosować nowatorską kombinację etapów chromatografii preparatywnej. Sposób obejmuje chromatografię anionowymienną, małocząsteczkową chromatografię w odwróconym układzie faz i ulepszoną chromatografię anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem. Sposób oczyszczania może dalej obejmować zmianę warunków fermentacji, w których surowy produkt zawierający A21978C jest wytwarzany przez Streptomyces roseosporus. Te sposoby prowadzą do otrzymania daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie o czystości przynajmniej 98%. Korzystnie, sposoby prowadzą do otrzymania daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, którego czystość wynosi więcej niż 99%.

Korzystne wykonanie sposobu chromatografii preparatywnej jest opisane poniżej:

Streptomyces roseosporus jest poddawany fermentacji z dodatkiem kwasu n-dekanowego, jak ujawniono w patencie USA Nr 4885243, z tą modyfikacją, że dodawanie kwasu dekanowego jest utrzymywane na najniższym możliwym poziomie bez zmniejszenia ogólnej wydajności fermentacji, jak opisano powyżej. W alternatywnym wykonaniu mogą być używane źródła zastępcze, tak długo, jak ostatecznie dostarczają grupy n-dekanowej do przyłączenia do rdzenia daptomycyny. Przykładami takich źródeł zastępczych są, bez ograniczeń, amid dekanowy, estry dekanowe, włączając estry butylu, surowe źródła oleju kokosowego lub palmowego, zwierzęce źródła kwasu dekanowego, różne sole kwasu dekanowego i petrochemiczne źródła kwasu dekanowego. Po fermentacji roztwór zewnątrzkomórkowy jest klarowany, jak opisano powyżej. W alternatywnym wykonaniu, daptomycyna może być ekstrahowana z grzybni przy użyciu rozpuszczalnika organicznego, takiego jak n-butanol, przed klarowaniem na wirówce oddzielającej rozpuszczalnik lub filtrze, jak opisano powyżej. Po wyklarowaniu bulionu fermentacyjnego, poziom daptomycyny jest wzbogacany w wyklarowanym roztworze, najpierw przez chromatografię anionowymienną, a później przez HIC, jak opisano powyżej.

Po przeprowadzeniu HIC, ilość rozpuszczalnika organicznego w preparacie daptomycyny jest zmniejszana w dowolny sposób znany w tej dziedzinie. W korzystnym wykonaniu, ilość rozpuszczalnika organicznego jest zmniejszana przez chromatografię anionowymienną, jak opisano powyżej. Daptomycyna powinna być eluowana z kolumny buforem kompatybilnym z buforem wymaganym w ulepszonej chromatografii ze zmodyfikowanym buforem. Alternatywnie, bufor elucyjny może być wymieniony na bufor zmodyfikowany przez odwróconą osmozę lub filtrację na filtrze 10000 MWCO. W innym preferowanym wykonaniu, rozpuszczalnik z chromatografii w odwróconym układzie faz i pozostała sól jest usuwana przy użyciu odwróconej osmozy przy pH 1,5-4,0 lub ultrafiltracji przy pH 2,5-4,5. Pozostały produkt może być zamrożony do przechowywania w dużej ilości lub suszony przez liofilizację, a następnie ponownie uwodniony w wodzie lub w buforze używanym do ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem.

Daptomycyna jest następnie oczyszczana przez ulepszoną chromatografię anionowymienną ze zmodyfikowanym buforem, jak opisano powyżej.

Po ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem oczyszczona daptomycyna jest filtrowana i zatężana w warunkach chłodzenia. Filtrowanie daptomycyny może być wykonane dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. W korzystnym wykonaniu daptomycyna jest depirogenizowana i zatężana, jak opisano powyżej. Alternatywnie, daptomycyna może być zatężana przez odwróconą osmozę w warunkach chłodzenia przy pH od 1,5 do 4. Niskie pH i warunki chłodzenia są stosowane w celu powstrzymywania degradacji daptomycyny.

Jako alternatywa lub dodatkowy etap do powyższego etapu filtracji i zatężania, wyeluowane w wyniku prowadzenia ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem frakcje zawierające daptomycynę mogą być zmieszane z butanolem (zarówno n-, izo- jak i t-butanolem)

PL 236 352 B1 przy pH w przybliżeniu 4,5 w stosunku większym niż jedna część butanolu do dziewięciu części roztworu daptomycyny. W korzystnym wykonaniu jedna część butanolu jest zmieszana z czterema częściami roztworu daptomycyny z wytworzeniem 20% roztworu butanolu. Roztwór butanol-daptomycyna jest pozostawiony do rozdzielenia na fazę organiczną i wodną. Daptomycyna przechodzi do fazy organicznej, która jest zbierana. Dehydratacja daptomycyny w rozpuszczalniku organicznym może stabilizować daptomycynę i chronić przed degradacją oczyszczonej daptomycyny do anhydro-daptomycyny i następnie formowania β-izomeru.

Po zatężeniu lub zebraniu daptomycyny, daptomycyna jest liofilizowana.

Chromatografia preparatywna może być zastosowana do oczyszczania lipopeptydów innych niż daptomycyna, takich jak te opisane powyżej.

Formowanie miceli lipopeptydowych i sposoby ich zastosowania

Niniejszym opisano sposoby dostarczania miceli lipopeptydowych daptomycyny, sposoby formowania miceli lipopeptydowych i sposoby ich zastosowania w sposobach oczyszczania według wynalazku. Lipopeptydem może być cząsteczka pokrewna daptomycynie, włączając między innymi, daptomycynę, A54145, lipopeptyd pokrewny daptomycynie ujawniony w patencie USA Nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego.

Micele są agregatami cząsteczek amfipatycznych. W środowisku wodnym lipofilowe fragmenty cząsteczek są zorientowane do środka miceli, a hydrofilowe fragmenty cząsteczek pozostają w kontakcie ze środowiskiem wodnym. Micele formują się spontanicznie w roztworze zawierającym cząsteczki amfipatyczne jeżeli stężenie cząsteczek jest wystarczająco wysokie.

Formowanie miceli powoduje zmiany w kilku zewnętrznych właściwościach fizycznych roztworu, włączając zmiany w ciśnieniu osmotycznym, mętności, przewodnictwie elektrycznym, napięciu powierzchniowym, oddziaływaniach przeciwjonowych i jonów o tym samym znaku (w przypadku jonowych cząsteczek amfipatycznych), współczynniku refrakcji, widmach UV i NMR, cząstkowej objętości molarnej, lepkości, współczynniku dyfuzji i solubilizacji barwnika. Cmc może być oznaczone przez pomiar jednego lub większej liczby tych zależnych od miceli właściwości fizycznych w funkcji stężenia cząsteczek amfipatycznych. Rozmiar i kształt miceli może być oznaczony przez dynamiczną analizę rozpraszania światła lasera, ultrawirowanie, lepkość i/lub eksperymenty z niskokątowym rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego. Micele mogą także istnieć w fazach ciekłokrystalicznych.

Lipopeptydy mogą agregować do postaci miceli przy stężeniu lipopeptydu większym niż cmc lipopeptydu. Cmc zależy od właściwości lipopeptydu i temperatury, stężenia soli i pH wodnego roztworu zawierającego lipopeptyd. Biorąc pod uwagę właściwości lipopeptydu, cmc zmniejsza się wraz z dodawaniem grup CH2 do lipofilowych łańcuchów węglowych. Tak więc, w porównaniu do danego cmc dla daptomycyny w poszczególnym stężeniu soli, temperaturze i pH, antybiotyk typu A-21978, w którym łańcuch boczny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego jest zastąpiony przez n-oktanoilową lub n-nonanoilową resztę kwasu tłuszczowego będzie miał wyższe cmc, podczas gdy antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego, będzie miał niższe cmc.

Cmc lipopeptydu może być zmienione przez dodanie lub odjęcie grupy CH2 w lipopeptydzie. Niniejszym opisano lipopeptyd A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. Na podstawie niniejszego opisu można obliczyć przybliżone cmc lipopeptydu. Mając podane cmc dla lipopeptydu, takiego jak daptomycyna, można obliczyć przybliżone cmc dla pokrewnego lipopeptydu, w którym łańcuch boczny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. Powyższe może być wyznaczone metodami znanymi specjaliście w tej dziedzinie.

Na podstawie cmc dla jednego lipopeptydu, można również obliczyć przybliżone cmc dla lipopeptydu, który zawiera pokrewną część białkową. Na podstawie cmc daptomycyny i wskazówek ze stanu

PL 236 352 B1 techniki, można łatwo wyznaczyć cmc pokrewnego lipopeptydu, takiego jak A54145, lipopeptyd pokrewny daptomycynie ujawniony w Patencie USA Nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271.

Cmc lipopeptydu może być regulowane przez zmianę temperatury roztworu zawierającego lipopeptyd daptomycyny. Cmc dla lipopeptydu zazwyczaj wzrasta wraz ze wzrostem temperatury roztworu. Tak więc, formowanie miceli zachodzi łatwiej przy obniżeniu temperatury i jest wstrzymane przy zwiększeniu temperatury. Na przykład, roztwór zawierający lipopeptyd może formować micele w 4°C, ponieważ w tej temperaturze cmc jest zmniejszone i stężenie lipopeptydu jest powyżej cmc; jednakże, ten sam roztwór lipopeptydu może być w postaci monomerycznej w 20°C, ponieważ cmc wzrosło wraz z temperaturą i stężenie lipopeptydu jest teraz poniżej cmc. Tak więc, w korzystnym wykonaniu, stężenie lipopeptydu daptomycyny jest większe niż cmc w jednej temperaturze, a niższe niż cmc w innej, wyższej temperaturze. Lipopeptyd może być wybrany spośród daptomycyny lub cząsteczki pokrewnej daptomycynie, takiej jak te opisane powyżej. W sposobie według wynalazku lipopeptydem jest daptomycyna.

Zdolność do manipulacji formowaniem się miceli lipopeptydowych przez użycie różnych temperatur do zmiany cmc może być zastosowana do oczyszczania lipopeptydu. Zgodnie z wynalazkiem lipopeptydem jest daptomycyna, jednakże oczyszczanym lipopeptydem może być również pokrewna cząsteczka, taka jak te opisane powyżej. W innym korzystnym wykonaniu, zdolność do manipulowania formowaniem miceli lipidowych daptomycyny przez zmianę temperatury jest użyta do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych, które są w postaci miceli w pewnych warunkach temperatury i w postaci monomerów w innych warunkach temperatury.

Do zmniejszania cmc lipopeptydu jonowego jest wykorzystywane dodawanie elektrolitu. W korzystnym wykonaniu sól, taka jak NaCl, jest dodawana do roztworu zawierającego lipopeptyd w celu zmniejszenia odpychania pomiędzy naładowanymi grupami w miceli Lipopeptydowej. Lipopeptydem może być daptomycyna lub cząsteczka pokrewna daptomycynie, taka jak ta opisana powyżej. Na przykład, peptydowa część daptomycyny zawiera trzy reszty kwasu asparaginowego i reszty kwasu L-treo3-metyloglutaminowego (3-GM), wszystkie z nich byłyby naładowane w obojętnym pH. Tak więc, dodanie elektrolitu, takiego jak NaCl lub równoważnej soli, zmniejszy cmc daptomycyny. W korzystnym wykonaniu, stężenie soli wynosi co najmniej 100 mM. W bardziej korzystnym wykonaniu, stężenie soli wynosi od 150 mM do 300 mM. W nawet bardziej korzystnym wykonaniu, solą jest NaCl.

Zmniejszenie cmc jest także obserwowane po dodaniu elektrolitu do innych lipopeptydów, takich jak cząsteczki pokrewne daptomycynie, które zawierają reszty kwasu asparaginowego, reszty 3-GM lub inne reszty naładowane. Zatem, w korzystnym wykonaniu, sól jest dodawana do roztworu w celu zmniejszenia cmc lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, takiego jak A54145, lipopeptyd pokrewny daptomycynie ujawniony w Patencie USA Nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. Stężenie soli jest zmniejszane w celu zwiększenia cmc lipopeptydu jonowego. Według wynalazku lipopeptydem jonowym jest daptomycyna.

Możliwość manipulacji formowaniem miceli lipopeptydu przez zmianę stężenia elektrolitu w celu zmiany cmc jest wykorzystywana do oczyszczania daptomycyny, jednakże może być też wykorzystywana do oczyszczania cząsteczki pokrewnej daptomycynie, takiej jak te opisane powyżej. Możliwość manipulowania formowaniem miceli lipopeptydowych przez stężenie elektrolitu jest wykorzystywana do przygotowania kompozycji farmaceutycznych, które są w postaci miceli w pewnych stężeniach elektrolitu i w postaci monomerów w innych stężeniach elektrolitu. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać daptomycynę lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie, jak opisano powyżej.

pH roztworu zawierającego lipopeptyd może być zmieniane, aby wpłynąć na cmc lipopeptydu, w szczególności daptomycyny. Obok daptomycyny lipopeptydem może być cząsteczka pokrewna daptomycynie, taka jak te opisane powyżej. W sposobie według wynalazku, pH jest zmieniane tak, że stężenie lipopeptydu jest wyższe niż cmc przy jednym pH i niższe niż cmc przy innym pH. Na przykład, dla daptomycyny cmc przy pH 4,0 w wodzie w temperaturze 20-25°C było dużo niższe niż przy pH 6,0 lub 7,5. W takich warunkach przy pH 4,0 cmc wynosi w przybliżeniu 400 (pg/ml. Zobacz Fig. 15. Z kolei, daptomycyna jest w postaci monomerów nawet w stężeniu 150 mg/ml daptomycyny przy pH 6,5 (przy

PL 236 352 B1 stężeniu soli od 150 mM do 300 mM i temperaturze 4°C). Tak więc, dla daptomycyny, cmc przy pH 4,0 jest mniejsze niż w roztworach o wyższym pH lub niższym pH. Zmiana cmc przy różnych pH może być także wykorzystana do innych naładowanych lipopeptydów, włączając lipopeptydy, które są spokrewnione z daptomycyną, jak opisano powyżej.

Możliwość manipulowania formowaniem miceli lipopeptydu przez zmianę pH powodującą zmianę cmc, jest wykorzystana do oczyszczania lipopeptydu, w szczególności daptomycyny. Jednakże może być też wykorzystywana do oczyszczania cząsteczki pokrewnej daptomycynie, takiej jak te opisane powyżej. Możliwość manipulowania formowaniem miceli lipopeptydowych przez pH może być również wykorzystana do przygotowania kompozycji farmaceutycznych, które są w postaci miceli przy pewnym pH i w postaci monomerów przy innym pH. Takie kompozycje farmaceutyczne zawierają daptomycynę lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie, jak opisano powyżej.

Lipopeptyd może być częścią miceli mieszanej. Micelą mieszaną jest taka, w której lipopeptyd formuje micelę z jednym lub większą liczbą innych typów cząsteczek amfipatycznych. Przykłady takich amfipatycznych cząsteczek obejmują, bez ograniczeń, kwasy tłuszczowe o średnich i długich łańcuchach, fosfoglicerydy (fosfolipidy), sfingomielinę, glikolipidy i cholesterol. Do miceli mogą być włączone alkohole o średniej długości łańcucha, przy czym zmniejszają one odpychanie elektrostatyczne i zawadę steryczną, przez to zmniejszając cmc lipopeptydu. Dodanie jednego lub większej liczby typów cząsteczek amfipatycznych może być użyte do zmiany struktury miceli z miceli sferycznej (Zobacz Fig. 14, część a) do struktury planarnej dwuwarstwy lipidowej (Zobacz Fig. 14 część b) lub do struktury liposomu (Zobacz Fig. 14, część c). W ogólności, micele mieszane zawierające fosfolipidy i/lub glikolipidy spowodują przekształcenie miceli sferycznej do struktury dwuwarstwy lipidowej, która pełni rolę bariery przepuszczalności dla jonów i większości cząsteczek polarnych.

Micela może być uformowana z dwóch lub większej liczby różnych lipopeptydów. Na przykład, micela mieszana może być uformowana z daptomycyny i innego lipopeptydu, takiego jak A54145 lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie, jak opisano powyżej. Micela mieszana może zawierać lipopeptyd wraz z jedną lub większą liczą cząsteczek amfipatycznych użytecznych terapeutycznie, takich jak, antybiotyk, środek przeciwzapalny lub przeciwgrzybiczy, które są znane specjalistom w tej dziedzinie. Lipopeptydem może być daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie, taki jak A54145, lipopeptydy pokrewne daptomycynie ujawnione powyżej, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. W rozwiązaniach według wynalazku lipopeptydem jest daptomycyna.

Micela mieszana lub zawierająca pojedynczy typ cząsteczki lipopeptydowej, może zawierać lipopeptyd, który jest użyteczny terapeutycznie. Lipopeptydem takim może być antybiotyk, korzystniej daptomycyna. Daptomycyna formuje micele o średnicy w przybliżeniu 5,4 nm (54 A) przy stężeniu 1 mg/ml przy pH w przybliżeniu 4,0 w wodzie. Zobacz Fig. 16.

Micele mogą zawierać jeden lub większą liczbę różnych typów substancji terapeutycznych. Substancja terapeutyczna może być zmieszana z lipopeptydem daptomycyny w roztworze tak, że z lipopeptydu formuje się micela, a substancja terapeutyczna zostaje uwięziona w hydrofobowym wnętrzu.

Substancja terapeutyczna może być też wymieszana z lipopeptydem i jedną lub większą liczbą cząsteczek amfipatycznych tak, że z lipopeptydu i innych cząsteczek amfipatycznych formuje się micela mieszana a substancja terapeutyczna zostaje uwięziona w hydrofobowym wnętrzu. Substancją terapeutyczną może być antybiotyk, środek przeciwzapalny lub przeciwgrzybiczy. Korzystnie substancją terapeutyczną jest antybiotyk lub środek przeciwgrzybiczy ujawniony poniżej. Substancja terapeutyczna może być substancją rozpuszczalną w środowisku hydrofobowym, ale nie w roztworze wodnym.

Lipopeptydy mogą być uformowane w liposomy, które są pęcherzykami, w których sferyczna dwuwarstwa lipidowa otacza wodne wnętrze. Zobacz Fig. 14, część c. Liposomy są przydatne w zastosowaniach terapeutycznych, ponieważ łatwo łączą się z błoną komórkową i mogą być także użyte do chwytania substancji w ich wewnętrznym przedziale wodnym. Substancją może być taka, która jest jedynie rozpuszczalna w roztworach wodnych. Roztwór zawierający lipopeptyd i inną cząsteczkę amfipatyczną może być poddany sonikacji w celu utworzenia liposomów. Sam lipopeptyd również może być poddany sonikacji w celu utworzenia liposomów. Liposom może zawierać daptomycynę lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie, taki jak A54145, lipopeptyd ujawniony w Patencie USA Nr 4537717, 4482487, Re. 32311, Re. 32310, 5912226, obecnie we wznowieniu jako zgłoszenie USA o numerze seryjnym 09/547357, międzynarodowych zgłoszeniach PCT WO 01/44272, WO 01/44274, oraz WO 01/44271, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej

PL 236 352 B1 reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego.

Liposomy w ich wewnętrznych przedziałach wodnych mogą zawierać jedną lub większą liczbę substancji terapeutycznych. Substancją terapeutyczną może być antybiotyk, środek przeciwzapalny lub przeciwgrzybiczy. Korzystnie substancją terapeutyczną jest antybiotyk lub środek przeciwgrzybiczy ujawniony poniżej. Substancja terapeutyczna może być substancją rozpuszczalną w roztworze wodnym. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera liposom.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać lipopeptydowy układ typu micelarnego zawierający substancję terapeutyczną. Micele lipopeptydowe mogą być micelami sferycznymi, micelami mieszanymi lub liposomami. Kompozycje farmaceutyczne zawierające micele lipopeptydowe mogą minimalizować lokalne podrażnienie po wstrzyknięciu, lub po podaniu dożylnym. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać sól, bufor do utrzymania odpowiedniego pH i miceli. Kompozycja farmaceutyczna może też zawierać jeden lub większą liczbę środków stabilizujących micele i/lub stabilizujące lipopeptyd lub inną substancję terapeutyczną. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać także jedną lub większą liczbę substancji terapeutycznych. Substancją terapeutyczną może być antybiotyk, środek przeciwzapalny lub przeciwgrzybiczy, w szczególności antybiotyk lub środek przeciwgrzybiczy ujawniony poniżej. Substancja terapeutyczna może być dodatkiem do substancji terapeutycznej, która jest inkorporowana do miceli, lub sama może być czynnikiem terapeutycznym, który jest inkorporowany do miceli.

Kompozycja farmaceutyczna może być wysuszona lub zliofilizowana, w którym to przypadku micele są formowane kiedy do kompozycji farmaceutycznej dodana jest woda lub bufor. W korzystnym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna jest zliofilizowana i zawiera sól w ilości, która po odtworzeniu daje stężenie fizjologiczne oraz bufor utrzymujący pH, przy którym micele powstają spontanicznie w temperaturze pokojowej po dodaniu wody lub innego buforu. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać daptomycynę lub pokrewny polipeptyd, taki jak A54145, lipopeptydy pokrewne daptomycynie ujawnione powyżej, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. W innym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna jest kompozycją wodną. Jest to korzystne, jeżeli wykorzystane są liposomy. W korzystnym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna zawiera środek stabilizujący liposomy.

W korzystnym aspekcie wynalazku, roztwór miceli jest izolowany i oczyszczany. W jednym z wykonań, micele są izolowane od mniejszych składników przez ultrafiltrację. Wybór membrany ultrafiltracyjnej jest oparty na rozmiarze miceli. W ogólności, membrana o 10000 NMW lub 30000 NMW będzie wystarczająca do zatrzymania miceli i przepuszczenia mniejszych składników, takich jak zanieczyszczenia. W innym wykonaniu, micele mogą być wyizolowane i/lub oczyszczone przez dializę, wirowanie w gradiencie gęstości lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek. Metody te są dobrze znane w tej dziedzinie. W jednym wykonaniu, micele są bardziej czyste niż w 30%, przy czym czystość jest mierzona jako masa miceli w porównaniu do masy monomerycznych form lipopeptydu lub innych cząsteczek. W korzystnym wykonaniu micele są czyste w stopniu wyższym niż 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 95%.

Możliwość formowania miceli i ich ponownej dysocjacji przy zmianie temperatury, pH, stężenia elektrolitu dostarcza sposobu oczyszczania lipopeptydów. W jednym z wykonań, sposób obejmuje oczyszczenie lipopeptydów z zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej przez poddanie lipopeptydów warunkom, w których lipopeptydy formują micele i następnie oddzielenie miceli od zanieczyszczeń przez technikę rozdziału względem wielkości, taką jak ultrafiltracja lub chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząstek. W innym wykonaniu wynalazku, sposób obejmuje zatężanie lipopeptydów przez poddawanie lipopeptydów warunkom, w których lipopeptydy formują micele i następnie zatężanie ich techniką rozdziału względem wielkości. W bardziej korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje zarówno oczyszczanie jak i zatężanie jako pojedynczy etap.

W innym wykonaniu wynalazku, sposób obejmuje oczyszczanie lipopeptydu od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej, włączając pirogeny (np. lipopolisacharyd) przez poddanie lipopeptydu warunkom, w których lipopeptyd jest w stanie monomerycznym i następnie rozdział monomerycznego roztworu lipopeptydu od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej techniką rozdziału względem wielkości. W korzystnym wykonaniu, techniką rozdziału względem wielkości jest ultrafiltracja, jak omówiono powyżej. W sposobie według wynalazku lipopeptydem jest daptomycyna, jednakże oczyszczane

PL 236 352 B1 mogą być również pokrewny lipopeptyd, taki jak A54145, lipopeptydy pokrewne daptomycynie ujawnione powyżej, lub antybiotyk A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego.

Korzystne wykonanie sposobu chromatografii preparatywnej przy użyciu miceli do oczyszczania daptomycyny jest opisane poniżej:

Streptomyces roseosporus jest poddawany fermentacji z zasilaniem kwasu n-dekanowego, jak opisano powyżej. Po fermentacji, roztwór zewnątrzkomórkowy jest poddawany klarowaniu jak opisano powyżej.

Wyklarowany preparat jest nanoszony na żywicę anionowymienną, taką jak FP-DA 13, jak opisano powyżej. Daptomycyna jest eluowana z kolumny jedną do trzech objętościami złoża kolumny buforu o podwyższonej zawartości soli, zawierającego od 300 do 500 mM NaCl.

Wyeluowany preparat daptomycyny jest doprowadzany do pH od 2,5 do 5,0 przy użyciu kwasu. W korzystnym wykonaniu, kwas jest rozcieńczonym kwasem fosforowym. Przy pH od 2,5 do 4,7, od 300 do 500 mM NaCl i temperaturze 2-15°C daptomycyna tworzy micele.

Preparat daptomycyny jest filtrowany na membranie ultrafiltracyjnej od 10000 do 30000 NMW. Podczas filtracji, preparat daptomycyny jest przemywany buforem zawierającym 30 mM octan sodu, pH 3,5, w temperaturze do 15°C. Początkowe stężenie soli wynikające z elucji wynosi 300 mM NaCl, ale stężenie soli zmniejsza się w trakcie przemywania. Ponieważ daptomycyna jest w postaci miceli, jest zatrzymywana na filtrze, podczas gdy zanieczyszczenia mniejsze niż 1000 do 30000 (zależnie od użytego filtru) przechodzą przez filtr. Czystość uzyskanego preparatu daptomycyny wynosi w przybliżeniu 85-90%.

Jako etap opcjonalny preparat daptomycyny może być rozcieńczony, a jego pH podniesione do 6,5 w celu przekształcenia daptomycyny do stanu monomerycznego. Preparat daptomycyny jest następnie przepuszczany przez membranę ultrafiltracyjną o 10000 NMW. Ten opcjonalny etap znacząco zmniejsza zawartość pirogenów.

Sposoby analizy czystości daptomycyny

Niniejszym opisano sposoby analityczne do pomiaru czystości daptomycyny.

W stanie techniki, wiele zanieczyszczeń, które ulegały oczyszczeniu wraz z daptomycyną było nieoznaczonych lub niezidentyfikowanych, ponieważ możliwość do wizualizacji i pomiaru zanieczyszczeń była ograniczona przez metody analityczne i możliwości sprzętowe. Zobacz, np. patent USA Nr 4874843 i Kirsch et al. Opracowanie bardziej czułych analitycznych układów i technik HPLC pozwala na rozdział szeregu zanieczyszczeń, które istnieją w partiach daptomycyny przygotowanych metodami ze stanu techniki. Sposoby o wyższej rozdzielczości HPLC pokazują, że daptomycyna oczyszczona metodami ze stanu techniki jest zanieczyszczona wcześniej zidentyfikowanymi zanieczyszczeniami, takimi jak anhydrodaptomycyna i β-izomer, oraz innymi, wcześniej nieznanymi zanieczyszczeniami, które ulegają oczyszczeniu wraz z daptomycyną (oraz eluują równocześnie z nią we wcześniej opracowanych warunkach detekcji HPLC) w przypadku stosowania metod ze stanu techniki. Na identyfikację tych zanieczyszczeń teraz pozwala opracowanie sposobów przeznaczonych do eliminacji tych zanieczyszczeń.

Jak omówiono powyżej, anhydro-daptomycyna i β-izomer zostały opisane wcześniej, jako zanieczyszczenia, które stale i niezmiennie pojawiały się podczas otrzymywania daptomycyny. Zastosowanie analiz HPLC opisanych tutaj, pozwoliło rozróżnić około dwunastu dodatkowych zanieczyszczeń powstających podczas otrzymywania daptomycyny, przy czym niektóre z nich nie były wcześniej zidentyfikowane (zobacz, np. Fig. 2-11). Ponadto, przynajmniej sześć z tych składników nie jest bezpośrednim wynikiem reakcji, która powoduje powstanie anhydro-daptomycyny i β-izomerycznej formy daptomycyny, lecz raczej są związkami powstałymi w innych, niespokrewnionych procesach, które zachodzą podczas fermentacji lub oczyszczania daptomycyny. Sposób według wynalazku i inne opisane poniżej sposoby także znacząco zmniejszają poziomy szeregu tych zanieczyszczeń (zobacz Przykłady).

Do pomiaru ilości innych składników w preparacie daptomycyny może być zastosowany dowolny sposób znany w tej dziedzinie. Sposoby identyfikacji zanieczyszczeń daptomycyny obejmują, bez ograniczeń, spektroskopię masową, spektroskopię w podczerwieni, elektroforezę kapilarną i spektroskopię jądrowego rezonansu magnetycznego. Korzystnym sposobem pomiaru ilości innych związków w preparacie daptomycyny jest HPLC.

Do pomiaru zanieczyszczeń daptomycyny zostały wykorzystane dwa sposoby. Pierwszy sposób posiada nieco słabszą rozdzielczość niż sposób drugi. W obydwu sposobach użyto Systemu Shimadzu

PL 236 352 Β1 lub HP HPLC z Oprogramowaniem Nelson's Turbochrom w Wersji 4.1. „Pierwszy” sposób rozdziału jest podsumowany w Tabeli 1 a „drugi” sposób rozdziału jest podsumowany w Tabeli 2:

Tabela 1

1. System Dozowania Rozpuszczalnika:

Tryb: Pompowanie izokratyczne

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min

Czas przebiegu: 30 minut

2. Rozpuszczalnik A: 34% acetonitryl w 0,5% NH4H2PO4, pH 4,5 Rozpuszczalnik B: 20% acetonitryl w 0,5% NH4H2PO4, pH 4,5 Docelowym warunkiem jest wymycie daptomycyny po 15,0 ±0,5 minutach. Rozpuszczalnik B może być użyty razem z rozpuszczalnikiem A w celu dostosowania warunków fazy ruchomej HPLC i osiągnięcia pożądanego czasu retencji.

3.	Chłodzenie autosamplera:	5 (4 do 6) ^qC
4.	Objętość wstrzykiwania:	5 μΐ do 75 μΐ (20 μΐ normalnie)
5.	Kolumna:	IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5μ, 4,6 mm x 250 mm (lub równoważna)
6.	Kolumna wstępna:	IB-SIL (Phenomenex, C-8, 5μ, 4,6 mm x 30 mm (lub równoważna)
7 .	Długość fali detekcji:	214 nm
8.	Temperatura kolumny:	Temperatura otoczenia
9.	Integracja:	System komputerowy lub integrator zdolny do pomiaru powierzchni piku.

Tabela 2

1. System Dozowania Rozpuszczalnika:

Tryb: Pompowanie izokratyczne

Szybkość przepływu: 1,5 ml/min

Czas przebiegu: 75 minut

2. Rozpuszczalnik A: 20% acetonitryl w 0,45% NH4H2PO4, pH 3,25 Rozpuszczalnik B: 50% acetonitryl w 0,45% NH4H2PO4, pH 3,25 Docelowym warunkiem jest w przybliżeniu 35% acetonitryl w 0,45% NH4H2PO4, pH 3,25 (50% Rozpuszczalnika B) do wymycia daptomycyny po 36,0 ± 1,5 minutach; jednakże stosunek rozpuszczalników może być użyty w celu dostosowania składu fazy ruchomej HPLC i osiągnięcia pożądanego czasu retencji.

3. Chłodzenie autosamplera: 4. Objętość wstrzykiwania: 5. Kolumna: 6. Kolumna wstępna: 7. Długość fali detekcji: 8. Temperatura kolumny: 9. Integracja:

5 (4 do 6) ^eC 5 μΐ do 75 μΐ (20 μΐ normalnie) IB-SIL (Phenomenex, C-8, 5 μ, 4,6 mm x 250 mm (lub równoważna) IB-SIL (Phenomenex, C-8, 5μ, 4,6 mm x 30 mm (lub równoważna) 214 nm 25 (22 do 28) °C System komputerowy lub integrator zdolny do pomiaru powierzchni piku.

Oczyszczone lipopeptydy, kompozycje farmaceutyczne i sposoby ich zastosowania

PL 236 352 B1

Niniejszym opisano oczyszczone lipopeptydy, w szczególności daptomycnę, jak również ich sole, estry, amidy, etery i formy zabezpieczone, a także preparaty farmaceutyczne zawierające oczyszczone lipopeptydy lub ich sole. W rozwiązaniach według wynalazku lipopeptydem jest daptomycyna. Możliwe jest również zastosowanie lipopeptów pokrewnych daptomycynie, jak opisano powyżej. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać lipopeptydowe układy typu micelarnego, takie jak micele zawierające daptomycynę albo jeden lub większą liczbę lipopeptydów pokrewnych daptomycynie. Wszystkie zawarte tutaj odniesienia do miceli lipopeptydowych dotyczą nie tylko wszystkich lipopeptydowych układów typu micelarnego, ale w szczególności dotyczą daptomycyny, lub pokrewnego lipopeptydu, takiego jak A54145, lipopeptydów pokrewnych daptomycynie ujawnionych powyżej, lub antybiotyku A-21978, w którym łańcuch boczny daptomycyny w postaci n-dekanoilowej reszty kwasu tłuszczowego, jest zastąpiony przez n-oktanoilową, n-nonanoilową, n-undekanoilową, n-dodekanoilową, n-tridekanoilową lub n-tetradekanoilową resztę kwasu tłuszczowego. Ponadto, wszystkie zawarte tutaj odniesienia do lipopeptydowych układów typu micelarnego, w szczególności dotyczą miceli sferycznych albo miceli mieszanych oraz liposomów, jak omówiono powyżej.

Oczyszczone lipopeptydy, ich farmaceutycznie dopuszczalne sole lub micele lipopeptydowe mogą być przygotowane do podania doustnego, dożylnego, domięśniowego, podskórnego, w aerozolu, domiejscowego lub pozajelitowego w celu terapeutycznego lub profilaktycznego leczenia chorób, szczególnie infekcji bakteryjnych. W korzystnym wykonaniu, oczyszczonym lipopeptydem jest oczyszczona daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie. Zawarte tutaj odniesienie do „oczyszczonej daptomycyny”, „oczyszczonego lipopeptydu pokrewnego daptomycynie” lub „oczyszczonego lipopeptydu” „obejmuje ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Micele złożone z daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub innego lipopeptydu mogą być formułowane przy użyciu dowolnego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika lub zaróbki, która jest kompatybilna z daptomycyną lub z lipopeptydem będącym przedmiotem zainteresowania. Zobacz, np. Handbook of Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name Chemical Fundaction and Manufacturer, Ashgate Publishing Co., red. M. Ash i I. Ash, 1996; The Merck Indeks: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, red. S. Budavari, annual; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA; Martindale: The Complete Drug Reference, red. K. Parfitt, 1999; i Goodman & Gilman's The Parmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY, red. L. S. Goodman et al., gdzie ogólnie opisano sposoby podawania różnych środków przeciw mikroorganizmom w terapii ludzi. Micele złożone z daptomycyny oczyszczonej sposobem według wynalazku, jak i micele z lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub innego opisanego niniejszym lipopeptydu mogą być zmieszane z konwencjonalnymi nośnikami i zarobkami farmaceutycznymi i stosowane w postaci tabletek, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków, kremów i tym podobnych. Micele złożone z daptomycyny oczyszczonej sposobem według wynalazku, jak i opisane niniejszym micele z lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub innego lipopeptydu mogą być zmieszane z innymi środkami terapeutycznymi i antybiotykami, takimi jak te omówione niniejszym. Kompozycje zawierające opisany niniejszym czynnik będą zawierać od około 0,1 do około 90% wagowo składnika czynnego,a bardziej ogólnie od około 10 do około 30%.

Kompozycje opisane niniejszym mogą być dostarczane przy użyciu systemów dostarczania o kontrolowanym (np. kapsułki) lub o stałym poziomie uwalniania (np. matryce ulegające biodegradacji). Przykładowe systemy dostarczania leku o opóźnionym uwalnianiu leku, które są odpowiednie do podawania wyżej wskazanych kompozycji są opisane w patentach USA Nr 4452775 (dla Kent), 5239660 (dla Leonard), 3854480 (dla Zaffaroni).

Kompozycje mogą zawierać powszechnie stosowane nośniki i zarobki, takie jak skrobia kukurydziana lub żelatyna, laktoza, sacharoza, celuloza mikrokrystaliczna, kaolin, mannitol, fosforan dwuwapniowy, chlorek sodu i kwas alginowy. Kompozycje mogą zawierać kroskarmelozę sodową, celulozę mikrokrystaliczną, skrobię kukurydzianą, glikolan sodowy skrobi i kwas alginowy.

Substancjami wiążącymi w tabletkach, które mogą być stosowane są guma arabska, metyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidon (Powidon), hydroksypropylometyloceluloza, sacharoza, skrobia i etyloceluloza.

Środki poślizgowe, które mogą być zastosowane, obejmują stearynian magnezu lub inne stearyniany metali, kwas stearynowy, płyn silikonowy, talk, woski, oleje i krzemionkę koloidalną.

Aromaty, takie jak mięta pieprzowa, olejek ze starzęśli, aromat wiśniowy lub podobne mogą być również stosowane. Może być także pożądane dodanie środka barwiącego, aby uczynić dawkę bardziej estetyczną w wyglądzie lub pomóc w identyfikacji produktu.

PL 236 352 B1

Do stosowania doustnego szczególnie użyteczne są preparaty stałe, takie jak tabletki i kapsułki. Mogą być także opracowane preparaty o stałym uwalnianiu lub dojelitowe preparaty powlekane. Do zastosowań w pediatrii i geriatrii szczególnie użyteczne są zawiesiny, syropy i tabletki do żucia. Do podawania doustnego kompozycje farmaceutyczne są w postaci, na przykład, tabletki, kapsułki, zawiesiny lub płynu. Kompozycja farmaceutyczna jest w sposób korzystny wykonana w postaci dawki zawierającej terapeutycznie efektywną ilość składnika aktywnego. Przykładami takich dawek są tabletki i kapsułki. Do celów terapeutycznych, tabletki i kapsułki, oprócz składnika aktywnego, mogą zawierać dodatkowo standardowe nośniki, takie jak substancje wiążące, na przykład, guma arabska, żelatyna, poliwinylopirolidon, sorbitol lub tragakanta; wypełniacze, na przykład, fosforan wapnia, glicyna, laktoza, skrobia kukurydziana, sorbitol lub sacharoza; środki poślizgowe, na przykład, stearynian magnezu, glikol polietylenowy, krzemionka, lub talk; środki rozsadzające, na przykład, skrobia ziemniaczana, aromaty lub środki barwiące, albo środki zwilżające. Doustne preparaty ciekłe ogólnie są w postaci roztworów wodnych lub oleistych, zawiesin, emulsji, syropów lub eliksirów i mogą zawierać standardowe dodatki, takie jak środki zawieszające, środki emulgujące, środki bezwodne, konserwanty, środki barwiące i aromaty. Doustne preparaty ciekłe mogą zawierać micele lipopeptydowe lub formy monomeryczne lipopeptydu. Przykłady dodatków do preparatów ciekłych obejmują gumę arabską, olejek migdałowy, alkohol etylowy, frakcjonowany olej kokosowy, żelatynę, syrop glukozowy, glicerynę, utwardzone oleje jadalne, lecytynę, metylocelulozę, para-hydroksybenzoesan metylu lub propylu, glikol propylenowy, sorbitol, lub kwas sorbinowy.

Do zastosowania dożylnego (IV) rozpuszczalne w wodzie postacie daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub innego lipopeptydu mogą być rozpuszczone w dowolnym powszechnie stosowanym płynie dożylnym i podane przez infuzję. W przypadku miceli lipopeptydowych, lipopeptyd jest rozpuszczony i preparacie dożylnym w warunkach, w których lipopeptyd jest obecny w stężeniu powyżej jego cmc. Specjalista w tej dziedzinie może zmieniać pH, temperaturę lub stężenie soli postępując według wskazówek z niniejszego opisu w celu uzyskania roztworu dożylnego zawierającego micele lipopeptydowe. Dalej, roztwór lipopeptydów można poddać sonikacji w celu uzyskania liposomów lipopeptydowych. Preparaty dożylne mogą zawierać nośniki, zarobki lub stabilizatory włączając, bez ograniczeń, wapń, ludzką albuminę surowiczą, cytrynian, octan, chlorek wapnia, węglan, i inne sole. Płyny dożylne obejmują, bez ograniczeń, roztwór soli fizjologicznej lub roztwór Ringer'a. Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie może także być umieszczony w strzykawkach, kaniulach, cewnikach i rurkach.

Preparaty do podawania pozajelitowego mogą być w postaci wodnych lub bezwodnych izotonicznych sterylnych roztworów lub zawiesin do iniekcji. Te roztwory i zawiesiny mogą być przygotowane ze sterylnych proszków lub granulatów zawierających jeden lub większą liczbę wymienionych nośników do zastosowania w preparatach do podawania doustnego. Micele lipopeptydowe mogą być szczególnie pożądane przy podawaniu pozajelitowym. Związki mogą być rozpuszczone w glikolu polietylenowym, glikolu propylenowym, etanolu, oleju kukurydzianym, alkoholu benzylowym, chlorku sodu, i/lub różnych buforach. W preparatach domięśniowych, sterylny preparat związku lipopeptydowego lub postaci odpowiednio rozpuszczalnej soli związku, na przykład chlorowodorku, może być rozpuszczony i podawany w rozcieńczalniku farmaceutycznym, takim jak woda do iniekji (WFI), sól fizjologiczna lub 5% glukoza.

Micele lipopeptydowe mogą być szczególnie pożądane do podawania pozajelitowego, ponieważ raczej nie powodują one miejscowego podrażnienia w miejscu iniekcji. Nie wiążąc tego z żadną teorią, jest prawdopodobne, że micele polipeptydowe będą powodowały mniejsze miejscowe podrażnienie niż lipopeptydy monomeryczne, ponieważ ogony lipidowe, które mogą powodować podrażnienie będą odizolowane we wnętrzu miceli, podczas gdy rdzeń peptydowy, który w mniejszym stopniu może powodować miejscowe podrażnienie niż ogon lipidowy, będzie wyeksponowany na tkankę. Micele lipopeptydowe mogą być przygotowane w postaci preparatów domięśniowych i pozajelitowych zgodnie postępowaniem tu opisanym, w celu uzyskania preparatu zawierającego micele lipopeptydowe. Ponadto, roztwór lipopeptydów można poddać sonikacji w celu uzyskania liposomów lipopeptydowych. Odpowiednie nierozpuszczalne postacie składników mogą także być przygotowane i podawane, jako zawiesina na bazie wodnej lub bazie farmaceutycznie dopuszczalnego oleju, np. estru kwasu tłuszczowego o długim łańcuchu, takim jak oleinian etylu.

Formy do iniekcji typu depot mogą być przygotowane przez formowanie matryc związku w mikrokapsułkach w polimerach ulegających biodegradacji, takich jak polimleczan-poliglikolan. W zależności od stosunku leku do polimeru i właściwości poszczególnych zastosowanych polimerów, uwalnianie leku może być kontrolowane. Przykłady innych polimerów ulegających biodegradacji obejmują poli(ortoestry)

PL 236 352 B1 i poli(bezwodniki). Preparaty do iniekcji typu depot są także przygotowane przez inkorporowanie leku w mikroemulsjach, które są kompatybilne z tkankami ciała.

Do zastosowania domiejscowego składniki i micele oczyszczone zgodnie z wynalazkiem mogą także być przygotowane w odpowiednich postaciach do zastosowania na skórze, lub błonach śluzowych nosa i gardła, i mogą przybrać postać kremów, maści, płynów w sprayu lub środków do inhalacji, pastylek do ssania, lub środków do pędzlowania gardła. Takie preparaty domiejscowe mogą ponadto obejmować składniki chemiczne, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO) do ułatwienia przenikania przez powierzchnię składników aktywnych. W preparatach domiejscowych, sterylne preparaty daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, ich odpowiednich soli lub miceli lipopeptydowych mogą być podawane w kremach, maściach, sprayach lub innych formach do stosowania domiejscowego. Preparaty domiejscowe mogą także być w postaci bandaży, które były zaimpregnowane oczyszczoną kompozycją daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub miceli lipopeptydowych.

Do stosowania do oczu lub uszu, związki oczyszczone według wynalazku mogą być obecne w postaci ciekłej lub półciekłej opartej na hydrofobowych lub hydrofiłowych bazach, takich jak maści, kremy, roztwory do pędzlowania lub zasypki.

Do podawania doodbytniczego związki oczyszczone według wynalazku mogą być podawane w postaci czopków domieszkowanych standardowymi nośnikami, takimi jak masło kakaowe, wosk lub inny gliceryd.

W preparatach aerozolowych sterylne preparaty oczyszczonej daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie lub związku w postaci soli w mogą być zastosowane w inhalatorach, takich jak inhalatory z odmierzaną dawką i rozpylaczach. W preparacie aerozolowym może być także zastosowany sterylny preparat miceli lipidowych. Formy aerozolowe mogą być szczególnie użyteczne do leczenia infekcji układu oddechowego, takich jak zapalenie płuc i infekcje obejmujące zatoki.

Alternatywnie, związki oczyszczone według wynalazku mogą być w postaci proszku do odtworzenia w chwili podania w odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych nośnikach. Jeżeli postać proszku ma być odtworzona jako micele lipopeptydowe, proszek może zawierać bufor i/lub sól, tak, że odtworzenie odpowiednią ilością wody sterylnej lub soli fizjologicznej, spowoduje formowanie się miceli. Alternatywnie, postać proszkowa może zawierać instrukcje uwzględniające ilość i typ farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, który może zostać użyty do odtworzenia lipopeptydu w celu uzyskania miceli. W innym wykonaniu, dawka jednostkowa związku może być roztworem związku, jego soli, lub miceli lipopeptydowych w odpowiednim rozcieńczalniku w sterylnych, hermetycznie zamkniętych ampułkach. Stężenie związku w dawce może się zmieniać, np. od około 1 procentu do 50 procent, w zależności od użytego związku i jego rozpuszczalności oraz dawki zaleconej przez lekarza. Jeżeli kompozycje zawierają dawki jednostkowe, każda dawka w sposób korzystny zawiera od 50-500 mg substancji aktywnej. Do leczenia dorosłych osób, zastosowana dawka w sposób korzystny waha się od 100 mg do 3 g dziennie, w zależności od sposobu i częstości podawania.

W niniejszym opisie przedstawiono sposoby leczenia infekcji, szczególnie, tej powodowanej przez bakterie gram-dodatnie, u ludzi i innych zwierząt. Określenie „leczenie” jest użyte do oznaczenia zarówno zapobiegania infekcji, jak i kontroli rozwiniętej infekcji po zainfekowaniu zwierzęcego organizmu gospodarza. Rozwinięta infekcja może być infekcją ostrą lub przewlekłą. Sposób obejmuje podawanie człowiekowi lub innemu zwierzęciu efektywnej dawki związku oczyszczonego według wynalazku. Dawka efektywna jest ogólnie pomiędzy około 0,1 i około 25 mg/kg oczyszczonej daptomycyny, lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Daptomycyna lub lipopeptyd pokrewny daptomycynie może być w postaci monomerycznej lub być częścią miceli lipopeptydowej. Korzystna dawka wynosi od około 1 do 25 mg/kg oczyszczonej daptomycyny lub lipopeptydu pokrewnego daptomycynie, albo ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Bardziej korzystna dawka wynosi od około 1 do 12 mg/kg oczyszczonej daptomycyny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Opisany niniejszym jest sposób leczenia infekcji u osobnika, szczególnie tej spowodowanej przez bakterie gram- dodatnie, terapeutycznie efektywną ilością daptomycyny lub lipopeptydu antybakteryjnego. Daptomycyna lub lipopeptyd antybakteryjny może być w postaci monomerów lub miceli lipopeptydowych. Przykładowe procedury dostarczania środka antybakteryjnego są opisane w Patencie USA Nr 5041567, dla Regers, i w zgłoszeniu patentowym PCT numer EP 94/02552 (publikacja nr WO 95/05384). Używane tutaj określenie „dawka efektywna terapeutycznie” oznacza taką ilość daptomycyny oczyszczonej według wynalazku, która zapobiega pojawieniu się, łagodzi objawy, lub powstrzymuje progresję infekcji bakteryjnej. Określenie „leczenie” jest zdefiniowane jako podawanie osobnikowi

PL 236 352 B1 terapeutycznie efektywnej ilości związku oczyszczonego według wynalazku, zarówno w celu zapobiegania pojawieniu się infekcji, jak również kontroli lub zwalczania infekcji. Określenie „osobnik”, jak opisano tutaj, jest zdefiniowane jako ssak, roślina lub hodowla komórkowa. W korzystnym wykonaniu, osobnikiem jest człowiek lub inny pacjent zwierzęcy wymagający leczenia związkiem lipopeptydowym.

Antybiotyk lipopeptydowy może być podawany jako pojedyncza dawka dzienna lub w wielu dawkach dziennie. Tryb leczenia może wymagać podawania przez dłuższy okres czasu, np. przez kilka dni lub przez dwa do czterech tygodni. Ilość w podawanej dawce lub całkowita podana ilość będzie zależeć od takich czynników, jak właściwości i nasilenie infekcji, wiek i ogólny stan zdrowia pacjenta, tolerancja pacjenta na antybiotyk i mikroorganizmu lub mikroorganizmów zaangażowanych w infekcji. Sposób podawania jest ujawniony w międzynarodowym zgłoszeniu PCT WO 00/18419.

Sposoby opisane niniejszym obejmują podawanie oczyszczonej daptomycyny lub innego antybiotyku lipopeptydowego, lub ich kompozycji farmaceutycznych pacjentowi wymagającemu ich w ilości, która jest skuteczna w zmniejszeniu lub zwalczeniu infekcji bakteriami gram-dodatnimi. Daptomycyna lub antybiotyk lipopeptydowy mogą być zarówno w postaci monomeru lub mogą być obecne w miceli lipopeptydowej. Antybiotyk może być podany doustnie, pozajelitowo, przez inhalację, domiejscowo, doodbytniczo, nosowo, policzkowo, dopochwowo, lub przez implantowany zbiornik, zewnętrzną pompę lub cewnik. Antybiotyk może być przygotowany do zastosowań okulistycznych lub aerozolowych. Oczyszczona daptomycyna, antybiotyk lipopeptydowy, lub ich kompozycje farmaceutyczne mogą być bezpośrednio wstrzykiwane lub podawane do ropienia, komory lub stawu. Podawanie pozajelitowe obejmuje drogę podskórną, dożylną, domięśniową, dostawową, domaziówkową, zbiornikową, dokanałową, wewnątrzwątrobową, w miejsce zmiany chorobowej lub wewnątrzczaszkową iniekcję lub wlew. Korzystnie, daptomycyna lub inny lipopeptyd jest podawany dożylnie, podskórnie lub doustnie.

Sposób opisany niniejszym może być zastosowany do leczenia pacjenta z infekcją bakteryjną, u którego infekcja jest wywołana lub zaostrzona przez dowolny typ bakterii gram-dodatnich. Oczyszczona daptomycyna, lipopeptyd pokrewny daptomycynie, inny lipopeptyd lub ich kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane pacjentom zgodnie ze sposobami tu opisanym. Infekcja bakteryjna może być wywołana lub zaostrzona przez bakterie włączając nieograniczająco, gronkowce wrażliwe na metycylinę i oporne na metycylinę (włączając Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus i gronkowce koagulazo-ujemne), uwrażliwiony za pomocą glikopeptydu Staphylococcus aureus (GISA), paciorkowce wrażliwe na penicylinę i oporne na penicylinę (włączając Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus lactis, Streptococcus sangius i Streptococc i Grupa C, Streptococci Grupa G i paciorkowce wirulentne), enterokoki (włączając szczepy wrażliwe na wankomycynę i oporne na wankomycynę, takie jak Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium), Clostridium difficile, Clostridium dostridiiforme, Clostridium innocuum, Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium,

Bifidobacterium spp., Eubacterium aerofaciens, Eubacterium lentum, Lactobacillus, acidophilus, Lactobacillus easel, Lactobacillus plantarum, Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus asaccarolyticus, Peptostreptococcus magnus, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus prevotii, Peptostreptococcus productus, Propionibacterium acnes i Actinomyces spp.

Aktywność przeciwbakteryjna daptomycyny przeciwko klasycznym „opornym” szczepom jest porównywalna do tej przeciwko „wrażliwym” szczepom w eksperymentach in vitro. Ponadto, wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla daptomycyny przeciwko szczepom wrażliwym przeważnie jest 4 razy mniejsza niższa niż dla wankomycyny. Zatem oczyszczona daptomycyna, antybiotyk lipopeptydowy pokrewny daptomycynie, lub ich kompozycje farmaceutyczne są podawane pacjentowi, który wykazuje objawy infekcji bakteryjnej, która jest oporna na leczenie innymi antybiotykami, włączając wankomycynę. Ponadto, inaczej niż antybiotyki glikopeptydowe, daptomycyna wykazuje szybką, zależną od stężenia aktywność bakteriobójczą przeciwko organizmom gram-dodatnim. Tak więc, oczyszczona daptomycyna, antybiotyk lipopeptydowy lub ich farmaceutyczne kompozycje są podawane pacjentowi wymagającemu terapii antybiotykiem o szybkim działaniu.

Sposób może być użyty w infekcji bakteriami gram- dodatnimi w dowolnym narządzie lub tkance ciała. Te narządy lub tkanki obejmują, bez ograniczeń, mięsień szkieletowy, skórę, krwiobieg, nerki, serce, płuco i kość. Sposób tu opisany może być użyty do leczenia, bez ograniczeń, infekcji skóry i tkanek miękkich, bakteremii i infekcji dróg moczowych.

PL 236 352 B1

Sposób ten może być użyty do leczenia infekcji układu oddechowego nabytych w dużych zbiorowiskach ludzkich, włączając, bez ograniczeń, zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, przewlekłe zapalenie oskrzeli i płuc, włączając zapalenie płuc powodowane przez lekooporny Streptococcus pneumoniae lub Haemophilus influenzae. Sposób może być także użyty do leczenia mieszanych infekcji, które obejmują różne typy bakterii gram-dodatnich, lub które obejmują bakterie zarówno gram-dodatnie jak i gram-ujemnie, włączając bakterie tlenowe, kaprolityczne lub beztlenowe. Te typy infekcji obejmują infekcje wewnątrzbrzuszne i infekcje położnicze/ginekologiczne. Ujawnione tu sposoby mogą być użyte w terapii zwalczającej infekcje szpitalne, włączając, bez ograniczeń, zapalenie płuc, posocznicę wewnątrzbrzuszną, infekcje skóry i tkanek miękkich oraz infekcje stawów i kości. Sposób taki może być także użyty do leczenia infekcji, włączając, bez ograniczeń, zapalenie wsierdzia, zapalenie nerek, septyczne zapalenie stawów i zapalenie szpiku. W korzystnym wykonaniu, dowolna z wyżej opisanych chorób może być leczona z użyciem oczyszczonej daptomycyny, antybiotyku lipopeptydowego, lub ich kompozycji farmaceutycznych. Ponadto, choroby te mogą być leczone przy użyciu daptomycyny lub antybiotyku lipopeptydowego w postaci monomerów lub miceli.

Daptomycyna, lipopeptyd pokrewny daptomycynie lub inny lipopeptyd mogą być także podawane w diecie lub pożywieniu pacjenta lub zwierzęcia. Jeżeli są podawane jako część ogólnego pożywienia, ilość daptomycyny lub innego lipopeptydu może być mniejsza niż 1% wagowy diety i korzystnie nie większa niż 0,5% wagowego. Dieta dla zwierząt może stanowić normalne artykuły żywnościowe, do których może być dodana daptomycyna lub lipopeptyd, lub może ona być dodana do przedmieszki.

Sposób może być także stosowany podczas podawania jednego lub większej liczby środków przeciwgrzybiczych i/lub jednego lub większej liczby antybiotyków innych niż daptomycyna lub inny antybiotyk lipopeptydowy. Równoczesne podawanie środka przeciwgrzybiczego i antybiotyku innego niż daptomycyna lub inny antybiotyk lipopeptydowy może być użyteczne w infekcjach mieszanych, takich jak te powodowane przez różne typy bakterii gram-dodatnich, te powodowane przez bakterie zarówno gram-dodatnie jak i gram-ujemne lub te, które są powodowane zarówno bakterie jak i grzyby. Ponadto, daptomycyna lub inny antybiotyk lipopeptydowy może polepszać profil toksyczności jednego lub większej liczby antybiotyków podawanych równocześnie. Zostało wykazane, że podawanie daptomycyny i aminoglikozydu może polepszyć toksyczność nerkową powodowaną przez aminoglikozyd. W korzystnym wykonaniu antybiotyk i/lub środek przeciwgrzybiczy może być podawany równocześnie z oczyszczoną daptomycyną, innym antybiotykiem lipopeptydowym, lub w kompozycjach farmaceutycznych zawierających oczyszczoną daptomycynę lub inny antybiotyk lipopeptydowy.

Równoczesne podawanie innego środka terapeutycznego z daptomycyną lub innym antybiotykiem lipopeptydowym może być wykonane przy użyciu daptomycyny lub antybiotyku lipopeptydowego w postaci monomerów lub miceli. Jak omówiono powyżej, sferyczne micele lipopeptydowe mogą być użyte do wspomagania rozpuszczania środków, które wykazują słabą rozpuszczalność w wodzie. Ponadto, liposomy lipopeptydowe mogą być użyte do pułapkowania wewnątrz pęcherzyka liposomu środków, które są rozpuszczalne w środowisku wodnym. Postępując zgodnie ze wskazówkami z opisu, specjalista w tej dziedzinie byłby zdolny do przygotowania miceli lipopeptydowych zawierających środki terapeutyczne, takie jak środki przeciwzapalne, środki przeciwgrzybicze lub inne antybiotyki.

Środki przeciwbakteryjne i ich klasy, które mogą być podawane równocześnie z daptomycyną lub innym antybiotykiem lipopeptydowym obejmują, bez ograniczeń, penicyliny i leki pokrewne, karbapenemy, cefalosporyny i leki pokrewne, aminoglikozydy, bacytracyn, gramicydynę, mupirocynę, chloramfenikol, tiamfenikol, fusydian sodu, linkomycynę, klindamycynę, makrolidy, nowobiocynę, polimyksynę, ryfamycynę, spektynomycynę, tetracykliny, wankomycynę, teikoplaninę, streptograminę, środki antyfolanowe, łącznie z sulfonamidami, trimetoprimem i ich kombinacje oraz pirymetaminą, syntetyczne leki przeciwbakteryjne, łącznie z nitrofuranami, migdalanem metenoaminy i hipuranem metenoaminy, nitroimidazolem, chinolonami, fluorochinolonami, izoniazydem, etambutolem, pirazynamidem, kwasem para- aminosalicylowym (PAS), cykloseryną, kapreomycyną, etionamidem, protionamidem, tiaacetazonem, wiomycyną, eweminomycyną, glikopeptydem, glicylocykliną, ketolidami oraz oksazolidynonem; imipenen, amikacynę, netylmycynę, fosfomycynę, gentamycynę, ceftriakson, Ziracin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Linezolid, Synercid, Aztreonam i Metronidazol, Epiroprim, OCA-983, GV-143253, Sanfetrinem sodowego, CS-834, Biapenem, A-99058.1, A-165600, A179796, KA 159, Dynemicynę A, DX8739, DU 6681; Cefluprenamę, ER 35786,Cefoselis, Sanfetrinem celeksetylowy, HGP-31, Cefpirom, HMR- 3647, RU-59863, Mersacidinę, KP 736, Rifalazil; Kosan, AM 1732, MEN 10700, Lenapenem, BO 2502A, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, Veneprim, PD 138312, PD 140248, CP

PL 236 352 B1

111905, Sulopenem, ritipenam akoksylowy, RO-65-5788, Cyclotialidinę, Sch-40832, SEP-132613, mikakocydynę A, SB-275833, SR-15402, SUN A0026, TOC 39, karumonam, Cefozopran, Cefetamet piwoksylowy i T 3811.

Środki przeciwbakteryjne, które mogą być podawane wraz z daptomycyną obejmują, bez ograniczeń, imipenen, amikacynę, netylmycynę, fosfomycynę, gentamycynę, ceftriakson, teikoplaninę, Ziracin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Linezolid, Sycercid, Aztreonam i Metronidazol.

Środki przeciwgrzybicze, które mogą być podawane z daptomycyną lub innym antybiotykiem lipopeptydowym obejmują, bez ograniczeń, Caspofungen, Voriconazol, Sertaconazol, IB-367, FK-463, LY-303366, Sch-56592, Sitafloxacin, DB-289, polieny, takie jak Amtoterycyna, Nystatyna, Primarycyna; azole, takie jak Fluconazol, Itraconazol i Ketoconazol; alliloaminy, takie jak Naftifina, i Terbinafina; oraz antymetabolity, takie jak Flucytozyna. Inne środki przeciwgrzybicze obejmują bez ograniczeń te ujawnione w Fostel et al., Frug Discovery Today 5:25-32 (2000). Fostel et al. ujawnia związki przeciwgrzybicze obejmujące Corynecandin, Mer-WF3010, Fusakandyny, Artrichitin/LL 15G256y, Sornaryny, Cispentacin, Azoxybacillin, Aureobasidin i Khafrefungin.

Daptomycyna lub inny antybiotyk lipopeptydowy, włączając lipopeptydy pokrewne daptomycynie, mogą być podawane zgodnie z takim sposobem, dopóki infekcja bakteryjna nie zostanie zwalczona lub ograniczona. Daptomycyna lub inny lipopeptyd jest podawany przez okres czasu od 3 dni do 6 miesięcy, korzystnie przez 7 do 56 dni, korzystniej przez 7 do 28 dni, a najkorzystniej przez 7 do 14 dni. Daptomycyna lub inny lipopeptyd może być podawana przez dłuższy lub krótszy okres czasu jeżeli jest to pożądane.

W celu pełniejszego zrozumienia tego wynalazku, poniżej przedstawione są przykłady. Przykłady te są przedstawione tylko w celu ilustracji i ich celem nie jest w żaden sposób ograniczenie zakresu zastosowań niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Hodowla fermentacyjna S. roseosporus NRRL Szczep 15998 jest prowadzona jako fermentacja z kontrolowanym zasilaniem kwasem dekanowym na poziomach, które optymalizują wytwarzania antybiotyku oraz minimalizują produkcję zanieczyszczeń. Zasilanie resztkowym kwasem dekanowym jest mierzone chromatografią gazową i docelowy poziom resztkowy wynosi 10 ppm kwasu dekanowego od początku indukcji (w przybliżeniu w 30 godzinie) do zbioru. Wirowanie hodowli i następnie analiza wyklarowanego bulionu są stosowane do pomiaru poziomu produkcji daptomycyny przez HPLC. Miano zbioru jest typowo pomiędzy 2,1 a 2,6 gramów na litr bulionu fermentacyjnego.

Fermentacja jest kończona przez mikrofiltrację z użyciem Pall-Sep lub przez zastosowanie wirowania na pełną skalę przemysłową i filtra wgłębnego. Wyklarowany bulion jest nanoszony na żywicę jonowymienną, Mitsubishi FP-DA 13, przemywany 30 mM NaCl przy pH 6,5 i eluowany 300 mM NaCl przy pH 6,0-6,5. Alternatywnie, kolumna FP-DA 13 jest przemywana 60 mM NaCl przy pH 6,5 i eluowana 500 mM NaCl o pH 6,0-6,5. Eluat jest nanoszony na żywicę HIC HP-20ss, przemywany 30% acetonitryłem i eluowany 35% acetonitrylem przy pH 4,0-5,0. Alternatywnie, żywica HIC jest przemywana 45% alkoholem izopropylowym i eluowana 55-60% alkoholem izopropylowym. Eluat jest nanoszony na żywicę FP-DA 13 i przemywany oraz eluowany jak poprzednio. Końcowy etap chromatografii anionowymiennej zmniejsza ilość rozpuszczalnika o jedną trzecią lub więcej. Diafiltracja z odwróconą osmozą i zatężanie przy pH 1,5-2,5 jest wykonywane przy użyciu filtra 0,2 ^m, a następnie preparat daptomycyny jest zamrażany. Końcowa diafiltracja z odwróconą osmozą jest przeprowadzana przy użyciu wody do iniekcji (WFI) w celu przemycia daptomycyny i uregulowania jej stężenia przez napełnianiem w warunkach sterylnych. Fiolki lub daptomycyna w masie jest następnie liofilizowana.

P r z y k ł a d 2

Daptomycyna została otrzymana w hodowli fermentacyjnej S. roseosporus i częściowo oczyszczona Daptomycyna (9,9 Kg) została oczyszczona przez mikrofiltrację z 5500 litrów bulionu fermentacyjnego sposobem opisanym w patencie USA Nr 4885243. Częściowo oczyszczona daptomycyna została następnie oczyszczona sposobem opisanym w patencie USA Nr 4874843 i otrzymana w postaci preparatu daptomycyny w masie o czystości 91%. Preparat daptomycyny zawierał czternaście zanieczyszczeń stwierdzonych na podstawie analizy HPLC (zobacz Przykład 10). Preparat daptomycyny został naniesiony na żywicę anionowymienną Poroś P150 (PE Biosystems) w buforze Tris, pH 7,0, zawierającym 6M mocznik i pozostawiony do związania z żywicą. Żywica została przemyta buforem - trzema objętościami złoża kolumny - przed rozpoczęciem gradientu NaCl w tym samym buforze. Alternatywnie, zanieczyszczenia mogą być skutecznie usunięte z kolumny przy ustalonym poziomie soli wynoszącym 30 mM NaCl. Elucja oczyszczonej daptomycyny z żywicy następuje w przybliżeniu przy 300 mM NaCl,

PL 236 352 B1 podczas zmiany gradientu od 0 do 1000 mM NaCl. Daptomycyna wyeluowana z kolumny była o czystości większej niż 99% mierząc „pierwszym” sposobem HPLC. Oczyszczona daptomycyna zawierała tylko jedno zanieczyszczenie daptomycyny. Anhydro-daptomycyna i β-izomer były niewykrywalne (mniej niż 0,01% zanieczyszczenia). Poziom niezidentyfikowanego zanieczyszczenia był większy niż 0,1% i mniejszy niż 0,5%.

P r z y k ł a d 3

Preparat daptomycyny w masie o czystości 91% został przygotowany jak opisano w Przykładzie 2. Produkt został naniesiony na żywicę anionowymienną Poros D50 (PE Biosystems) w buforze octanowym pH 7,0 zawierającym 6M mocznik. Żywica Poros D50 została przemyta i wyeluowana w tej sam sposób, jak opisano w Przykładzie 2. Daptomycyna wyeluowana z kolumny była czysta w 96,92% mierząc „drugim” sposobem HPLC. Oczyszczony produkt zawierał tylko dwa z początkowych czternastu zanieczyszczeń (mniej niż 0,5% zanieczyszczenia). Anhydro-daptomycyna nie była wykrywana w oczyszczonym preparacie daptomycyny (mniej niż 0,01% zanieczyszczenia, a przy dokładnym pomiarze mniej niż 0,05%).

P r z y k ł a d 4

Bulion fermentacyjny zawierający daptomycynę został otrzymany jak opisano w Przykładzie 2. Bulion fermentacyjny został wyklarowany przez mikrofiltrację. Wyklarowany produkt został wyekstrahowany 20% n-butanolem lub izo-butanolem przy pH 4,5 (jedna część butanolu do czterech części wyklarowanego roztworu). Aby osiągnąć wydajność częściowo oczyszczonej daptomycyny większą niż 90% całkowitej daptomycyny w wyklarowanym roztworze, została wykonana ponowna ekstrakcja wyklarowanego roztworu. Daptomycyna została odzyskana z fazy butanolowej przez dodanie buforu wodnego, pH 6,5 w objętości wynoszącej półtora lub więcej objętości butanolu w celu ekstrakcji daptomycyny z fazy butanolowej do fazy wodnej. W wyniku etapu ekstrakcji butanolowej otrzymano preparat częściowo oczyszczonej daptomycyny oczyszczony pięciokrotnie i zatężony dziesięciokrotnie w porównaniu z roztworem wyklarowanym.

Wodny preparat daptomycyny został następnie oczyszczony sposobem ujawnionym w patencie USA Nr 4874843, w wyniku którego otrzymano daptomycynę o czystości 91 %. Daptomycyna zawierała czternaście zanieczyszczeń. Produkt został naniesiony na żywicę Poros D50 w buforze Tris, pH 7,0, zawierającym 6M mocznik. Żywica została następnie przemyta trzema objętościami złoża kolumny buforu Tris, pH 7,0, zawierającego 6M mocznik przed rozpoczęciem zmiany gradientu NaCl od 0 do 1000 mM w tym samym buforze. Elucja oczyszczonej daptomycyny z żywicy występowała w przybliżeniu przy 300 mM NaCl. Daptomycyna miała czystość 98% mierząc „drugim” sposobem HPLC.

P r z y k ł a d 5

Daptomycyna jest otrzymywana w wyniku fermentacji, jak opisano w Przykładzie 2. 5500 litrów bulionu fermentacyjnego zawiera 13 kg daptomycyny. Bulion fermentacyjny jest bezpośrednio ekstrahowany 20% n-butanolem, pH 4,5, w którym daptomycyna przechodzi do butanolu. Aby osiągnąć wydajność większą niż 90% całkowitej daptomycyny w bulionie fermentacyjnym wykonywane są ponowne ekstrakcje bulionu fermentacyjnego butanolem. Faza butanolowa jest ekstrahowana wodnym buforem octanowym, pH 6,5, w wyniku czego otrzymuje się daptomycynę oczyszczoną 5-krotnie (35%) i zatężoną 10-krotnie, w porównaniu z bulionem fermentacyjnym. Wodny roztwór daptomycyny jest poddawany mikrofiltracji sposobem opisanym w patencie USA Nr 4885243, a następnie oczyszczony sposobem z patentu USA Nr 4874843. Sposób ten prowadzi do otrzymania daptomycyny o czystości w przybliżeniu 91%. Daptomycyna zawiera 14 zanieczyszczeń wykrytych sposobem HPLC używanym w stanie techniki. Produkt został naniesiony na kolumnę z żywicą Poros D50 w buforze octanowym, pH 7,0, zawierającym 6M mocznik. Przemywanie i elucja żywicy jest wykonywana jak wskazano w Przykładzie 2. Produkt po etapie chromatografii posiada czystość w przybliżeniu 98% do 99% mierząc drugim sposobem HPLC.

P r z y k ł a d 6

Daptomycyna została otrzymana w procesie hodowli fermentacyjnej S. roseosporus, z tym wyjątkiem, że w celu polepszenia jakości fermentacji do około 10% czystości po wyklarowaniu przez mikrofiltrację lub wirowanie, zastosowano zasilanie resztkowym kwasem dekanowym. Poziom kwasu dekanowego był monitorowany i okresowo uzupełniany, aby w trakcie fermentacji utrzymać poziomy resztkowego kwasu dekanowego poniżej 50 ppm, a korzystnie pomiędzy 1 a 10 ppm. Bulion fermentacyjny został poddany mikrofiltracji sposobem opisanym w patencie USA Nr 4885243 z wytworzeniem 12,1 kg częściowo oczyszczonej daptomycyny z 5500 litrów bulionu fermentacyjnego. Wyklarowany bulion fermentacyjny został związany do żywicy anionowymiennej FP-DA 13 (Mitsubishi) w buforze octanowym

PL 236 352 B1 o obojętnym pH, przemyty buforem octanowym zawierającym 30 mM NaCI i następnie wyeluowany buforem octanowym z 300 mM NaCl. W wyniku tego etapu chromatografii anionowymiennej otrzymano daptomycynę o czystości większej niż 70%. Ta częściowo oczyszczona daptomycyna została następnie oczyszczona sposobem z patentu USA Nr 4874843, z tą modyfikacją, że zastosowano żywicę HP-20ss. W szczególności, częściowo oczyszczona daptomycyna została naniesiona na HP- 20ss w buforze octanowym zawierającym 10% acetonitryl, przemyta buforem octanowym zawierającym 30% acetonitryl i eluowana 40% acetonitrylem w buforze octanowym, z wytworzeniem daptomycyny o czystości od około 94 do 96% mierząc „drugim” sposobem HPLC. Produkt jest poddany ulepszonej chromatografii anionowymiennej ze zmodyfikowanym buforem przy użyciu żywicy Poroś D50 jak opisano w Przykładzie 5. Daptomycyna jest więcej niż w 99% czysta i zawiera tylko dwa z czternastu zanieczyszczeń otrzymanych sposobami ze stanu techniki.

P r z y k ł a d 7

Preparat daptomycyny o czystości 93% został otrzymany jak opisano w Przykładzie 2. Produkt został naniesiony na żywicę Poros P150 (PE Biosystems) w buforze octanowym pH 6,0 zawierającym 2M mocznik. Żywicę Poros P150 przemyto buforem - trzema objętościami złoża kolumny. Daptomycyna została wyeluowana z żywicy przy użyciu gradientu 0 do 400 mM NaCl w buforze octanowym, pH 6,0, zawierającym 2M mocznik. Daptomycyna eluowała się pomiędzy 150 a 300 mM NaCl. Daptomycyna wyeluowana z kolumny miała czystość od 99,0 do 99,5% mierząc „pierwszym” sposobem HPLC. Daptomycyna zawierała śladowe ilości czterech zanieczyszczeń, które stanowiły mniej niż 1% całkowitej daptomycyny. Anhydro- daptomycyna nie była wykrywana w preparacie oczyszczonej daptomycyny (mniej niż 0,02% zanieczyszczenia).

P r z y k ł a d 8

Preparat daptomycyny o czystości 93% został otrzymany jak opisano w Przykładzie 2. Produkt został naniesiony na żywicę Poros P150 (PE Biosystems) w buforze octanowym, pH 6,0, zawierającym 2M mocznik. Kolumnę przemyto sześcioma objętościami złoża kolumny 60 mM NaCl w buforze octanowym, pH 6,0, zawierającym 2M mocznik („bufor przemywający”). Bufor przemywający może się wahać od 50-75 mM NaCl. Przemywanie usuwa praktycznie całą anhydro-daptomycynę. Daptomycyna jest eluowana szesnastoma objętościami złoża kolumny 250 mM NaCl w buforze octanowym, pH 6,0, zawierającym 2M mocznik. Czystość daptomycyny wynosi od 98,5 do 99,5 mierząc „pierwszym” sposobem HPLC.

P r z y k ł a d 9

Preparat daptomycyny, jak opisano w Przykładzie 2 został otrzymany używając sposobu, który znacząco zmniejsza stężenie rozpuszczalnika koniecznego do wykonania chromatografii HP- 20ss. Nieoczekiwanie rozpuszczalnik do elucji daptomycyny, 40% acetonitryl lub 55-60% alkohol izopropylowy zastał zmniejszony do odpowiednio 12% i 25%, kiedy chromatografia HP-20ss była przeprowadzana raczej w obojętnym pH niż w kwaśnym pH, jak opisano w patencie USA Nr 4874843. W korzystnym wykonaniu, zmiany pH mogą być użyte do ponownego wykorzystania żywicy HP-20ss bez usuwania rozpuszczalnika.

Po elucji z kolumny FP-DA13 przy pH 6,5-7,0 daptomycyna jest nanoszona na zrównoważoną kolumnę HP-20ss, taką jak ta, która została zrównoważona 60 mM octanem, pH 6,6. Kolumna jest przemywana pięcioma do ośmiu objętościami złoża kolumny (CBV, ang. column bed valume) buforu przemywającego. Przykładowym buforem przemywającym jest 5% alkohol izopropylowy/60 mM octan, pH 6,6. Daptomycyna jest eluowana z kolumny buforem elucyjnym. Przykładowym buforem elucyjnym są dwie do trzech CBV 25% alkoholu izopropylowego/60 mM octan pH 6,6. Kolumna jest przepłukiwana buforem płukającym. W jednym wykonaniu, kolumna jest przepłukiwana jedną CBV 40% alkoholu izopropylowego/60 mM octan pH 6,6-7,0. Roztwór daptomycyny jest doprowadzany do pH 3,5-4,0 i ponownie nanoszony na kolumnę HP-20ss w celu dalszego zwiększenia czystości. W jednym z wykonań daptomycyna wyeluowana z kolumny HP-20s przy pH 6,5 jest doprowadzana do pH 3,5 przy użyciu 0,25 M kwasu fosforowego. Roztwór daptomycyny jest ponownie nanoszony na uprzednio przepłukaną kolumnę HP-20ss, która została zrównoważona 60 mM octanem, pH 3,5. Kolumna jest przemywana buforem regulującym pH tak, że pH wynosi 6,5. Przykładowym buforem regulującym pH jest pięć do ośmiu CBV 5% alkoholu izopropylowego/60 mM octan, pH 6,6. Daptomycyna jest eluowana buforem elucyjnym i może być dalej oczyszczana na chromatografii anionowymiennej lub innymi metodami oczyszczania, jeżeli jest to pożądane. Kolumna HP-20ss jest przepłukiwana buforem przepłukującym i czyszczona przed następnym użyciem. Przykładowy proces czyszczenia obejmuje mycie trzema CBV

PL 236 352 Β1

0,5M NaOH, przemywanie jedną CBV wody i przemywanie 0,25M kwasem fosforowym przed zrównoważeniem. Kolumna może być przechowywana w 0,5 NaOH.

Przykład 10

Daptomycyna w masie otrzymana, jak opisano w Przykładzie 2 została scharakteryzowana półpreparatywnym HPLC oraz scharakteryzowana przez chromatografię cieczową/spektroskopię masową (LC/MS) przy użyciu trybów jonów zarówno dodatnich jak i ujemnych. Profil zanieczyszczeń daptomycyny w masie przed chromatografią na żywicy anionowymiennej Poroś P150 jest przedstawiony w Tabeli 3, a chromatogram preparatu daptomycyny w masie jest przedstawiony na Fig. 12.

Tabela 3

ID zanieczyszczenia	Czas retencji	Obserwowana MW	ID Lilly	ID Cubist	% Całkowitej Powierzchni w HPLC
1	7,96	1638	LY212218	CB-131012	>0,5%, <1,0%
2	9,11	1638		CB-131011	<0,5%, >0,1%
3	11,54	745	LY213928	CB-131008	>0,5%, <1,0%
4	12,28	1624		CB-131006	<0,5%, >0,1%
5	13,10	1618		Nieznany-1	<0,5%, >0,1%
6	14,43	587	LY213827	CB-130989	>0,5%, <1,0%
7	14,43	1606		CB-131005	>0,5%, <1,0%
8	15,10	1620	LY213846	CB-131010	>1,0%, <4,0%
Daptomycyna	16,68	1620	LY146032	CB-139187	>90%
9	17,92	874		Nieznany-2	<0,5%, >0,1%
10	19,57	1810		Nieznany-3	<0,5%, >0,1%
11	19,57	1635		Nieznany-4	<0,5%, >0,1%
12	20,93	859		CB-131009	<0,5%, >0,1%
13	23,11	1602	LY178480	CB-130952	>1,0%, <4,0%
14	24,53	1634	LY109208	CB-131078	<0,1

Proponuje się, że Zanieczyszczenie 1 (CB-131012), które eluuje się około 7,96 minuty (MW: 1638) jest produktem hydrolizy laktonowej daptomycyny (Fig. 4). Wyniki wydają się odpowiadać LY212218, który został wcześniej zidentyfikowany przez Lilly, jako pochodna daptomycyny z otwartym pierścieniem decylowym.

Proponuje się, że również Zanieczyszczenie 2 (CB-131011), które eluuje się około 9,11 minuty (MW: 1638) jest produktem hydrolizy laktonowej β-izomeru (Fig. 5).

Proponuje się, że Zanieczyszczenie 3 (CB-131008), które eluuje się około 11,54 minuty (MW: 745) jest liniowym lipopeptydem składającym się z pięcioaminokwasowego łańcucha zawierającego tryptofan, asparaginę, asparaginian, treoninę i glicynę z łańcuchem kwasu dekanowego (Fig. 6). Ten wynik wydaje się odpowiadać LY213928, wcześniej zidentyfikowanemu przez Lilly.

Proponuje się, że Zanieczyszczenie 4 (CB-131006), które eluuje się około 12,28 minuty (MW: 1624) jest utlenionym analogiem daptomycyny, w którym aminokwas tryptofan został utleniony do kwasu kinurowego (Fig. 7).

Zanieczyszczenie 5, które eluuje się około 13,10 minuty (MW: 1618), nie ma jeszcze przypisanej struktury.

Zanieczyszczenie 6 (CB-130989) i Zanieczyszczenie 7 (CB-131005) eluują się razem około 14,43 minuty. CB-130989 (MW: 587) wydaje się odpowiadać LY213827 - liniowemu lipopeptydowi składającemu się z trójaminokwasowego łańcucha tryptofanu, asparaginy i asparaginianu z łańcuchem kwasu dekanowego (Fig. 8), jak to zostało wcześniej zidentyfikowane przez Lilly. CB-131005 (MW: 1606) odpowiada analogowi daptomycyny, w którym kwas dekanowy pozbawiony jest jednej grupy metylowej (Fig. 9).

PL 236 352 B1

Zanieczyszczenie 8 (CB-131010), które eluuje się około 15,10 minuty (MW: 1620) odpowiada LY213846 (β-izomer) , jak to zostało wcześniej zidentyfikowane przez Lilly (Fig. 2). Ilości β-izomeru są większe niż 1%.

Zanieczyszczenie 9, które eluuje się około 17,92 minuty (MW: 874), nie ma jeszcze przypisanej struktury.

Zanieczyszczenia 10 i 11, które eluują się razem około 19,57 minuty nie mają jeszcze przypisanej struktury.

Proponuje się, że Zanieczyszczenie 12 (CB-131009), które eluuje się około 20,93 minuty (MW: 859) jest liniowym lipopeptydem składającym się z sześcioaminokwasowego łańcucha tryptofanu, asparaginy, asparaginianu, treoniny, glicyny i ornityny z łańcuchem kwasu dekanowego (Fig. 10).

Proponuje się, że Zanieczyszczenie 13 (CB-130952), które eluuje się około 23,11 minuty (MW: 1602) jest anhydro-daptomycyną (Fig. 3) i okazuję się być tożsame z LY178480. Ilości anhydro-daptomycyny są większe niż 1%.

Zanieczyszczenie 14 (CB-131078), które eluuje się około 24,53 minuty (MW: 1634) okazuje się być tożsame z LY109208, wcześniej zidentyfikowanym przez Lilly, jako analog daptomycyny zawierający dodatkową grupę metylową w łańcuchu kwasu dekanowego (Fig. 11).

Daptomycyna w masie może być oczyszczona na Poros P150, jak to opisano wyżej w Przykładach 2 lub 7-8, lub może być oczyszczona na Poroś D50, jak to opisano wyżej w Przykładach 3-5. Po oczyszczeniu na Poroś P150, jak to opisano w Przykładzie 2, chromatogram (Fig. 13) pokazuje, że czystość daptomycyny jest większa niż 99,0% z izomerem β anhydro-daptomycyną poniżej poziomu detekcji (mniej niż 0,05% całości}. Jest jedno niezidentyfikowane zanieczyszczenie, które jest obecne w ilości większej niż 0,1%, ale mniejszej od 0,5%.

P r z y k ł a d 11

Hodowla fermentacyjna S. roseosporus NRRL Szczep 15998 jest prowadzona w fermentacji z kontrolowanym zasilaniem kwasem dekanowym na poziomach, które optymalizują wytwarzanie antybiotyku oraz minimalizują produkcję zanieczyszczeń. Zasilanie resztkowym kwasem dekanowym jest mierzone przy użyciu chromatografii gazowej, a docelowy poziom resztkowy wynosi 10 ppm kwasu dekanowego od początku indukcji (w przybliżeniu w 30 godzinie) do zbioru. Wirowanie hodowli i następnie analiza wyklarowanego buliony są stosowane do pomiaru produkcji daptomycyny przez HPLC. Miano zbioru jest typowo pomiędzy 1,0 a 3,0 gramów na litr bulionu fermentacyjnego.

Fermentacja jest kończona przez mikrofiltrację z użyciem Pall-Sep lub przez zastosowanie wirowania na pełną skalę przemysłową i filtra wgłębnego. Wyklarowany bulion jest nanoszony na żywicę jonowymienną, Mitsubishi FP-DA 13, przemywany 30 mM NaCl przy pH 6,5 i eluowany 300 mM NaCl przy pH 6, 0-6,5. Alternatywnie, kolumna Mitsubishi FP-DA 13 jest przemywana 60 mM NaCl przy pH 6,5 i eluowana 500 mM NaCl, pH 6, 0-6,5. pH jest doprowadzane do 3,0 do 4,8 a temperatura jest doprowadzana do 2-15°C. W tych warunkach daptomycyna formuje micele. Roztwór miceli daptomycyny jest oczyszczany przez przemywanie preparatu miceli, wtedy gdy jest on zatrzymywany na ultrafiltrze, przy użyciu filtra 10000 NMW (AG Technology Corp. UF o strukturze porowatej lub równoważnego) w dowolnej konfiguracji. Micele daptomycyny są zatrzymywane na filtrze, ale duża liczba zanieczyszczeń jest eliminowanych, ponieważ przechodzą one przez filtr 1000 NMW. Ultrafiltracja miceli daptomycyny zwiększa czystość daptomycyny z około 40% do 80% lub więcej.

Eluat jest nanoszony na żywicę HIC HP-20ss, przemywany 30% acetonitryłem i eluowany 35% acetonitrylem o pH 4,0-5,0. Alternatywnie, żywica HIC jest przemywana 20-30% alkoholem izopropylowym i eluowana 30-40% alkoholem izopropylowym przy pH 3,5-6,5. W tych warunkach zwiększonej ilości rozpuszczalnika i wyższego pH 6,0-7,5 daptomycyna powraca do niemicelarnego stanu wolnego. Eluat jest nanoszony na kolumnę z żywicą FP-DA 13 i przemywany oraz eluowany jak poprzednio. Końcowy etap chromatografii anionowymiennej zmniejsza ilość rozpuszczalnika o jedną trzecią lub więcej. Diafiltracja z odwróconą osmozą oraz zatężanie przy pH 1,5-2,5 jest wykonywane przy użyciu filtra 0,2 (um i preparat daptomycyny jest zamrażany. Końcowa diafiltracja z odwróconą osmozą jest wykonywana w wodzie do iniekcji (WFI) w celu przemycia daptomycyny i doprowadzenia jej stężenia do odpowiedniej wartości przed sterylnym pakowaniem. Fiolki z daptomycyny lub porcje w dużej ilości są następnie liofilizowane.

P r z y k ł a d 12

Zliofilizowana daptomycyna oczyszczona, jak opisano w dowolnym z powyższych przykładów, na przykład w Przykładzie 11, jest odtwarzana w roztworze soli fizjologicznej (w przybliżeniu 140 mM

PL 236 352 B1

NaCl) przy pH 4,5-5,0. W tych warunkach daptomycyna jest obecna w postaci miceli i może być użyta do iniekcji lub podania dożylnego, pozajelitowego, doustnego lub domiejscowego.

P r z y k ł a d 13

Daptomycyna jest otrzymywana w procesie fermentacji i klarowana z bulionu przez mikrofiltrację, jak opisano w Przykładzie 11. Wyklarowany bulion jest nanoszony na żywicę jonowymienną, Mitsubishi FP-DA 13, przemywany 30 mM NaCl o pH 6,5 i eluowany 300 mM NaCl przy pH 6,0-6,5 dając preparat daptomycyny o czystości w przybliżeniu 40%. Eluat jest doprowadzany do pH 3,5 rozcieńczonym kwasem fosforowym tak, że praktycznie cała daptomycyna tworzy micele. Preparat miceli jest nanoszony na membranę ultrafiltracyjną o 10000 NMW. Preparat daptomycyny jest przemywany 30 mM octanem sodu, pH 3,5, w temperaturze do 15°C. Zmniejszenie objętości i przemycie zmniejsza poziom zanieczyszczenia, co prowadzi do otrzymania preparatu daptomycyny o czystości 85%. Preparat daptomycyny może być dalej oczyszczony przy użyciu dowolnych sposobów opisanych tutaj.

P r z y k ł a d 14

Daptomycyna jest otrzymywana w procesie fermentacji, klarowana z bulionu przez mikrofiltrację i frakcjonowana na żywicy FP-DA 13 jak w Przykładzie 11. Eluat jest doprowadzany do pH 3,5 rozcieńczonym kwasem fosforowym tak, że praktycznie cała daptomycyna tworzy micele. Preparat miceli jest nanoszony na membranę ultrafiltracyjną o 10000 NMW. Preparat daptomycyny jest przemywany 30 mM octanem sodu, pH 3,5, w temperaturze do 15°C. Zmniejszenie objętości i przemycie zmniejsza poziom zanieczyszczenia, co prowadzi do otrzymania preparatu daptomycyny o czystości 80-90%. Preparat daptomycyny może być dalej oczyszczony przy użyciu dowolnych sposobów opisanych tutaj.

P r z y k ł a d 15

Daptomycyna jest otrzymywana w procesie fermentacji w klarowana z bulionu przy użyciu mikrofiltracji, jak opisano w Przykładzie 11. Preparat jest oczyszczany przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych, jak opisano w patencie USA Nr 4874843. W tym sposobie zastosowana jest kilkakrotnie powtarzana chromatografia na żywicy HP-20 i HP-20ss. Czystość daptomycyny wynosi 93% z widocznymi zanieczyszczeniami na chromatogramach HPLC i mierzalnymi ilościami pirogenów. Produkt jest rozcieńczany w wodzie, a jego pH jest doprowadzane do pH 6,5 przy użyciu NaOH lub jego odpowiednika. Preparat daptomycyny jest filtrowany przez membranę ultrafiltracyjną o 10000 NMW. W tych warunkach daptomycyna jest w stanie monomerycznym i przechodzi przez membranę ultrafiltracyjną. Czystość otrzymanego produktu pozostaje na poziomie 93%, ale kilka zanieczyszczeń, które były obecne na poziomie 0,1-0,2% zostało usuniętych na membranie ultrafiltracyjnej. Ponadto, zawartość pirogenów jest zmniejszona do poziomów niewykrywalnych.

P r z y k ł a d 16

Preparat daptomycyny o czystości w przybliżeniu 93% jest otrzymany, jak opisano w Przykładzie 15. Preparat daptomycyny jest przekształcony do stanu micelarnego przez obniżenie pH do 4,7 przy użyciu HC1 lub jego odpowiednika oraz oziębienie preparatu daptomycyny do 2-5°C. Produkt jest zatężany z 400 litrów do trzech litrów i stężenia końcowego w przybliżeniu 100 mg/ml przez filtrację na membranie ultrafiltracyjnej o 10000 NMW. W tych warunkach daptomycyna jest zatrzymywana na membranie. W wyniku tego uzyskuje się duży wzrost stężenia daptomycyny. Czystość wynosi w przybliżeniu 93%.

P r z y k ł a d 17

Preparat daptomycyny jest otrzymany, jak opisano w Przykładzie 16. Fiolki są napełniane w przybliżeniu 250 mg daptomycyny i liofilizowane. Daptomycyna jest odtwarzana w 50 ml sterylnej 150 mM soli fizjologicznej o pH 4, 0-5,0 w celu podania pacjentowi ludzkiemu lub zwierzęcemu. Dawka daptomycyny, która jest podawana będzie zależeć od natury iniekcji, wieku i wagi pacjenta oraz gatunku zwierzęcia. Przy pH 4,0-5,0 w 150 mM soli fizjologicznej daptomycyna będzie obecna w stanie micelarnym, który jest rozpuszczalny i odpowiedni do iniekcji dożylnej, domięśniowej lub pozajelitowej. Preparat zminimalizuje lokalne podrażnienie dzięki lipopeptydowej naturze daptomycyny.

P r z y k ł a d 18

Micele daptomycyny zostały otrzymane z użyciem daptomycyny w stężeniu 1,0 mg/ml w wodzie o pH 4,0 w 25°C. Wielkość miceli daptomycyny została zmierzona przy użyciu Zetasizer™ (Malvern Instruments, Model 3000 HS) . Szybkość zliczeń 36,3, typem komory była komora kapilarna, kąt detekcji (deg) wynosił 90°, a długość fali (nm) wynosiła 633. Wyniki wskazywały, że średnica miceli wynosiła 54 A, co jest około dwukrotną średnicą pojedynczej monomerycznej cząsteczki daptomycyny. Zobacz Fig. 18.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oczyszczania daptomycyny, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 2,5-5,0 wytwarzany jest roztwór micelarnej daptomycyny; oraz

b) oddzielania miceli daptomycyny z roztworu micelarnej daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.
2. Sposób zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto obejmuje etapy:

c) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 6,0-7,5 wytwarzany jest roztwór monomerycznej daptomycyny; oraz

d) oddzielania cząsteczek monomerycznej daptomycyny z roztworu monomerycznej daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.
3. Sposób oczyszczania daptomycyny dostarczonej w postaci micelarnej od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) poddawania daptomycyny micelarnej warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 6,0-7,5 wytwarzana jest monomeryczna daptomycyna; oraz

b) oddzielania cząsteczek monomerycznej daptomycyny od zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej lub agregatów z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że monomeryczna daptomycyna jest w roztworze.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że ponadto obejmuje etapy:

c) poddawania daptomycyny warunkom, w których przez zmianę pH do wartości 2,5-5,0 wytwarzana jest micelarna daptomycyna; oraz

b) oddzielania miceli daptomycyny od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej z zastosowaniem techniki rozdziału względem wielkości obejmującej ultrafiltrację lub chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek.