CN107206050A - 高纯度奥利万星及其生产方法 - Google Patents

Abstract

公开了具有高纯度的奥利万星的药物物质制剂，以及包含这样的奥利万星药物物质制剂的药物组合物，以及包含这样的药物组合物的药物产物或剂型。

Description

高纯度奥利万星及其生产方法

发明背景

用于给予受试者(诸如人类)的药物产物必须含有高纯度药物物质制剂和药物组合物，并配制为含有一致量的活性药物成分(API)的剂型。

不管API，所有的药物物质制剂含有不同量的杂质。这些杂质可通常基于它们的化学特性在类别中分组，并且包括“与产物相关的杂质”，即，在结构上与API类似的杂质(例如，对映异构体)和“与工艺相关的杂质”，即，通过用于制备API的过程引入的或由用于制备API的过程得到的杂质。

在药物产物(尤其是药物物质和由其制备的药物组合物)中杂质的鉴定、定量和许可是确保化学疗法治疗的安全性、效力和一致性的关键的方面。然而，当药物物质制剂通过使用生物学过程(诸如发酵)而得到时，杂质的表征可能特别难以实现，比起完全合成过程，生物学过程可预期性和可控性较差。生物学过程通常利用活的原核生物或真核生物细胞来生产关注的药物物质，并且大的和缠结(intricate)的杂质组可能与所生产的通常在结构上复杂的物质关联。在实践中，非常难以充分表征所有潜在的杂质，并且理解当将药物物质制剂掺入到药物产物中时，对于安全性和效力它们可能遇到的影响。因此，最安全的途径是使杂质在关注的药物物质中最小化。

杂质的问题性质对于dalbaheptides特别严重，dalbaheptides为与万古霉素相关的一类复合物糖肽抗生素，对于面临可用于细菌感染的下降数量的有效治疗的挑战的患者和医疗护理提供者，其为重要的抗菌剂。例如，在二十世纪五十年代后期，万古霉素被批准用于商业化，但是直至二十世纪八十年代，其相对无用，主要部分因为察觉到的毒性，特别是肾毒性和耳毒性。现在理解所报道的副作用是由于在早期的许多药物中的较高水平的杂质，当改进纯度时，杂质消失(Moellering，R.C. Jr.，Clin. Infect. Dis. 2006，42，S3;Levine，D.P.，Clin. Infect. Dis. 2006，42，S5)。

高度受控纯化此类化合物的重要性被化学结构的小变化可导致具有广泛不同的安全性和/或效力特性的药物物质制剂的事实进一步证明。例如，在受试者中快速灌注万古霉素已与“红色人”综合征关联，为组胺样响应，其特征为红斑、瘙痒、低血压和血管性水肿的组合，在灌注密切相关的药物替考拉宁期间看不到这些响应(Levine，D.P.，Clin. Infect. Dis. 2006，42，S5; Sahai. J.等人，Antimicrob. Agents Chemother. 1990，34，765)。类似地，显示特拉万星(telavancin) (具有高度类似化学结构的另一种药物)在动物模型中产生畸形，而万古霉素和替考拉宁二者在相同的模型中不产生畸形(Damodaran，S.E.，Madhan，S. J.，Pharmacol. Pharmacother. 2011，2，135)。

关于光谱或效力，化学结构的小变化还可导致对抗菌活性无法预料的影响。例如，化合物A40926与替考拉宁密切相关，但是针对凝固酶-阴性葡萄球菌具有小得多的活性，而针对这些相同的微生物，达巴万星(dalbavancin)比替考拉宁更有效一个量级(Malabarba，A.，Goldstein，B.P.J.，Antimicrob. Chemother. 2005，55 Suppl.S2，ii15)。

因此，明显的是，开发高纯度药物物质制剂和用于药物产物的包含dalbaheptides的药物组合物是重要的目标，具有降低数量的杂质和降低量的不能完全除去的那些杂质。本发明涉及该重要的目标和其它目标。

发明概述

在本发明的其它重要的实施方案中，本发明一般性涉及具有高纯度的奥利万星的药物物质制剂、包含这样的奥利万星药物物质制剂的药物组合物、包含这样的药物组合物的药物产物或剂型，以及制备所述药物产物或剂型的方法。

在第一实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1 (奥利万星因子A)和杂质7 (奥利万星因子C)的峰面积，其具有不大于2.1%的最大杂质水平。

在第二实施方案中，本发明涉及一种用于制备奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐的方法，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1和杂质7的峰面积，其具有不大于2.1%的最大杂质水平，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，和使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星，从而制备奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1和杂质7的峰面积，其具有不大于2.1%的最大杂质水平。

在第三实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1和杂质7的峰面积，其具有不大于2.1%的最大杂质水平，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星。

在第一至第三实施方案的某些方面，通过杂质1和杂质7的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于1.6%的最大杂质水平。

在第一至第三实施方案的某些方面，通过杂质1的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于1.5%的最大杂质水平，通过杂质7的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于0.6%的最大杂质水平。

在第一至第三实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A(其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第二和第三实施方案的某些方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为选自以下属中的一种的微生物物类：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

在第一实施方案的某些方面，药物物质制剂的氮原子衍生自非动物来源。

在第四实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，其具有约90%或更大的纯度。

在第五实施方案中，本发明涉及一种用于制备奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐的方法，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，其具有约90%或更大的纯度，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星，从而制备奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，其具有约90%或更大的纯度。

在第六实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，其具有约90%或更大的纯度，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星。

在第四至第六实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约96%或更大的纯度。

在第四至第六实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约90-96%纯度。

在第四至第六实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A(其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第五和第六实施方案的某些方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为选自以下属中的一种的微生物物类：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

在第四实施方案的某些方面，药物物质制剂的氮原子衍生自非动物来源。

在第七实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，其具有约90%或更大的纯度。

在第八实施方案中，本发明涉及一种用于制备奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐的方法，其具有约90%或更大的纯度，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星，从而制备具有约90%或更大纯度的奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐。

在第九实施方案中，本发明涉及奥利万星的奥利万星药物物质制剂或其盐，其具有约90%或更大的纯度，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星。

在第七至第九实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约96%或更大的纯度。

在第七至第九实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约90-96%纯度。

在第七至第九实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A(其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第八和第九实施方案的某些方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为选自以下属中的一种的微生物物类：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

在第七实施方案的某些方面，药物物质制剂的氮原子衍生自非动物来源。

在第十实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过在图2中显示的峰B和J限定的杂质2 (DEV A)和杂质10 (奥利万星CR)的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平。

在第十一实施方案中，本发明涉及一种用于制备药物组合物的方法，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过图2的峰B和J限定的杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平，所述方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，且将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液，从而制备包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中通过分别通过图2的峰B和J限定的杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平。

在第十二实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过图2的峰B和J限定的杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，且将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液。

在第十至第十二实施方案的某些方面，通过杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于3.0%的最大杂质水平。

在第十至第十二实施方案的某些方面，通过杂质2的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于1.9%的最大杂质水平，而通过杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于2.9%的最大杂质水平。

在第十至第十二实施方案的某些方面，在药物组合物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，在药物组合物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A (其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第十一和第十二实施方案的某些方面，在冻干d)之前，将经过滤的c)的溶液加入到灭菌小瓶中。

在第十一和第十二实施方案的某些方面，在b)中将pH调节至3.6-3.8。

在第十一和第十二实施方案的某些方面，冻干实现小于约5%重量的水分水平。

在第十至第十二实施方案的某些方面，一种或多种药学上可接受的赋形剂选自甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。

在第十至第十二实施方案的某些方面，药学上可接受的赋形剂为甘露醇。

在第十至第十二实施方案的某些方面，药物物质制剂与一种或多种赋形剂的重量比率为2:1。

在第十至第十二实施方案的某些方面，药物组合物包含约56-68%的奥利万星药物物质制剂和约44-32%的一种或多种药学上可接受的赋形剂，基于所述药物组合物的重量。

在第十三实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。

在第十四实施方案中，本发明涉及一种用于制备药物组合物的方法，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度，所述方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，且将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液，从而制备药物组合物，所述组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。

在第十五实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，且将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液。

在第十三至第十五实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约96%或更大的纯度。

在第十三至第十五实施方案的某些方面，奥利万星药物物质制剂的纯度水平为约90-96%纯度。

在第十三至第十五实施方案的某些方面，在药物组合物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，在药物组合物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A (其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第十四和第十五实施方案的某些方面，在冻干d)之前，将经过滤的c)的溶液加入到灭菌小瓶中。

在第十四和第十五实施方案的某些方面，在b)中将pH调节至3.6-3.8。

在第十四和第十五实施方案的某些方面，冻干实现小于约5%重量的水分水平。

在第十四和第十五实施方案的某些方面，一种或多种药学上可接受的赋形剂选自甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。

在第十四和第十五实施方案的某些方面，药学上可接受的赋形剂为甘露醇。

在第十三至第十五实施方案的某些方面，药物物质制剂与一种或多种赋形剂的重量比率为2:1。

在第十三至第十五实施方案的某些方面，药物组合物包含约56-68%的奥利万星药物物质制剂和约44-32%的一种或多种药学上可接受的赋形剂，基于所述药物组合物的重量。

在第十六实施方案中，本发明涉及一种药物产物或剂型，其包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。

在第十七实施方案中，本发明涉及一种用于制备药物产物或剂型的方法，其包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度，所述方法包括在注射用水或5%水中的葡萄糖中溶解本发明的药物组合物，以形成溶液，其中在溶液中奥利万星的浓度为约5-约30 mg/mL，从而制备包含本发明的药物组合物的药物产物或剂型。

在第十八实施方案中，本发明涉及一种药物产物或剂型，其包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度，其通过一种方法制备，所述方法包括在注射用水或5%水中的葡萄糖中溶解本发明的药物组合物，以形成溶液，其中在溶液中奥利万星的浓度为约5-约30 mg/mL。

在第十六至第十八实施方案的某些方面，药物产物或剂型为包含5%水中的葡萄糖的静脉内溶液。

在第十六至第十八实施方案的某些方面，在药物产物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，在药物产物中奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25(v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A (其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

在第十九实施方案中，本发明涉及高纯度氯伊瑞霉素或其盐，通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，其具有不大于18.0%的最大杂质水平。

在第二十实施方案中，本发明涉及一种用于制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐的方法，通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，其具有不大于18.0%的最大杂质水平，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，和

d) 干燥氯伊瑞霉素晶体，从而制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐，通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，其具有不大于18.0%的最大杂质水平。

在第二十一实施方案中，本发明涉及高纯度氯伊瑞霉素或其盐，通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，其具有不大于18.0%的最大杂质水平，其通过一种方法制备，所述方法包括：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，和

d) 干燥氯伊瑞霉素晶体。

在第十九至第二十一实施方案的某些方面，通过由图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，药物物质制剂具有不大于15.0%的最大杂质水平。

在第二十和第二十一实施方案的某些方面，氯伊瑞霉素的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，氯伊瑞霉素的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括苯基衍生的反相固定相和流动相B (其为约40/60/0.2/0.03 (v/v/v/v)比率的乙腈/水/甲酸/三乙胺)在流动相A (其为约100/0.2/0.03 (v/v/v)比率的水/甲酸/三乙胺)中的梯度。

在第二十和第二十一实施方案的某些方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为选自以下属中的一种的微生物物类：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

在第十九实施方案的某些方面，高纯度氯伊瑞霉素的氮原子衍生自非动物来源。

在第二十二实施方案中，本发明涉及具有约82%或更大纯度的高纯度氯伊瑞霉素或其盐。

在第二十三实施方案中，本发明涉及一种用于制备具有约82%或更大纯度的高纯度氯伊瑞霉素或其盐的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，和

d) 干燥氯伊瑞霉素晶体，从而制备具有约82%或更大纯度的高纯度氯伊瑞霉素或其盐。

在第二十四实施方案中，本发明涉及具有约82%或更大纯度的高纯度氯伊瑞霉素或其盐，其通过以下方法制备，所述方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，和

d) 干燥氯伊瑞霉素晶体。

在第二十二至第二十四实施方案的某些方面，氯伊瑞霉素的纯度水平为约90%或更大。

在第二十二至第二十四实施方案的某些方面，氯伊瑞霉素的纯度水平为约82%-95%。

在第二十二至第二十四实施方案的某些方面，氯伊瑞霉素的纯度水平通过HPLC测量。在具体的方面，氯伊瑞霉素的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括苯基衍生的反相固定相和流动相B (其为约40/60/0.2/0.03 (v/v/v/v)比率的乙腈/水/甲酸/三乙胺)在流动相A (其为约100/0.2/0.03 (v/v/v)比率的水/甲酸/三乙胺)中的梯度。

在第二十三至第二十四实施方案的某些方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为选自以下属中的一种的微生物物类：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

在第二十二实施方案的某些方面，高纯度氯伊瑞霉素的氮原子衍生自非动物来源。

在第二十五实施方案中，本发明涉及包含本发明的药物组合物的冻干的粉末的小瓶。

在第二十五实施方案的某些方面，在化学惰性干燥气体下，将小瓶塞紧。在某些优选的方面，化学惰性干燥气体为氮气或氩气。

前述已相当宽泛地描述了本发明的特征和技术优势，以便可以更好地理解接下来的本发明的详细说明。此处将描述本发明的另外的特征和优点，其形成本发明的权利要求的主题。本领域技术人员认识到，本文公开的任何观念和具体实施方案可容易用作用于修改或设计其它结构的基础，用于进行本发明的相同的目的。本领域技术人员还应认识到，这样的等价结构不偏离如在所附权利要求中描述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，由以下描述将更好地理解认为是本发明的特征的新的特征(关于其组织和操作方法二者)以及其它目的和优点。然而，明显地应理解的是，提供任何描述、图、实施例等仅用于说明和描述的目的，绝不旨在限定本发明的限度。

附图简述

图1为使用将奥利万星因子A (峰A)与奥利万星分离的方法，奥利万星药物物质制剂的HPLC色谱图。

图2为使用将峰B-P与奥利万星分离的方法，奥利万星药物物质制剂的HPLC色谱图。

图3为氯伊瑞霉素制剂的HPLC色谱图。

图4提供核因子B二乙酸盐制造过程的流程图。

图5提供奥利万星药物物质制剂化学性的流程图。

图6提供制造过程的示例性过程流程图。

图7A-7B提供来自在核因子B (图7A)和奥利万星(图7B)制剂中某些杂质水平的HPLC试验的结果。

发明详述

I. 定义

如本文使用的“一个”或“一”可指一个或多个。当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一”可指一个或多于一个。如本文使用的“另一个”可指至少第二个或更多。此外，除非上下文另外需要，否则，单数术语包括复数，并且复数术语包括单数。

如本文使用的“约”指数值，包括，例如，整数、分数和百分数，无论是否明确指示。术语“约”通常指本领域普通技术人员将认为与引用值等价(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，引用值的+/- 5-10%)。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入至最接近有效数字的数值。

如本文使用的“治疗”以及所有它的形式和时态(包括，例如，治疗、治疗中、经治疗的和治疗)指治疗性治疗和预防性或防止性治疗二者。需要治疗的那些包括已经患有细菌感染的那些以及其中待预防细菌感染的那些。

如本文使用的“药物物质制剂”或“活性药物成分”以及所有它们的形式和时态指旨在用于制造药物组合物或药物(医学)产物的任何物质或物质的混合物，并且当用于生产药物组合物或药物产物时，用作药物组合物或药物产物的活性成分。这样的物质旨在供给药理学活性或在诊断、治愈、缓和、治疗或预防疾病或影响身体的结构和功能中的其它直接效果。

如本文使用的“药物组合物”以及所有它的形式和时态指(i) 药物物质制剂或活性药物成分和(ii) 一种或多种药学上可接受的赋形剂的制剂。这样的制剂通常为药物物质制剂形式，例如，其通过制造商制备并且运输至医院药房。其为能储存数天、数周、数月或数年的稳定的药物物质制剂形式，在给予受试者之前，通常将立即与一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂进一步混合。药物组合物通常为包含药物物质制剂和药学上可接受的赋形剂的冻干的制剂，将其储存在密封的小瓶或安瓿中。

如本文使用的“药物产物”或“剂型”以及所有它的形式和时态指在无需进一步处理适用于给予患者的制剂中的药物物质制剂或活性药物成分。取决于药物物质制剂的特性，药物产物将为两种形式中的一种。其可包含(i) 药物物质制剂或活性药物成分，和(ii)一种或多种药学上可接受的赋形剂，或者其可包含(i) 药物组合物，和(ii) 一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。

II. 本发明

奥利万星(I)为一种新型、半合成的糖肽抗生素，具有针对抗糖肽(特别是，万古霉素)的革兰氏阳性微生物的活性。由于其快速杀菌活性(Belley等人，Antimicrob. Agents Chemother. 2010，54，5369)、其复杂的作用机理(Zhanel等人，Clin. Infect. Dis. 2012，54，S214)及其针对浮游和休眠微生物的活性(WO 2009/126502)，奥利万星在开发治疗可能与抗性微生物相关或不相关的严重的细菌感染中为有希望的试剂(Poulakou，G.和Giamarellou，H.，Expert Opin. Investig. Drugs 2008，17，225; Karaoui等人，Am. J. Health-Syst. Pharm. 2013，70，23)。

特别是，与奥利万星的浓度依赖性杀灭以及允许单一剂量治疗的长半衰期(US 8,420,592)的其药物动力学和药效学曲线提供具有用于治疗许多类型的困难感染的显著潜在性的奥利万星。

奥利万星在两个主要阶段中制造。在第一阶段，经由禾谷镰孢菌菌株(起初为东方 诺卡氏菌，在US 5,312,738、US 5,843,437、EP 265,071中)的发酵，生物合成地得到天然产物氯伊瑞霉素(II；在一些情况下也称为“核因子B”)。在第二阶段，经由还原性烷基化，将4-(4-氯苯基)苄基加入到氯伊瑞霉素，以供应奥利万星(US 5,952,466；US 5,998,581；US 5,939,382)。

在两个阶段，产生关注的化合物，接着进行冗长的分离程序，涉及将氯伊瑞霉素与发酵培养基层析法分离(如通过US 4,845,194举例说明的)，和从反应混合物分离奥利万星。

如预期的，生产氯伊瑞霉素的生物合成过程还导致生产多种化学相关的杂质，且特别是核因子A (A82846A，伊瑞霉素，III)、核因子C (A82846C，IV)和核因子D (V)。在氯伊瑞霉素还原性烷基化成奥利万星期间，这些杂质可能被烷基化，并且转化为杂质奥利万星因子A (VI)、奥利万星因子C (VII)和奥利万星因子D (VIII)。

给定这些杂质和期望的化合物(氯伊瑞霉素和奥利万星)之间的小的差别，任何层析分离(尤其是商业规模)将仅能够提供适度的分离。

存在与氯伊瑞霉素关联的多种另外的密切相关的杂质，包括物质P、Q、R和S，其缺乏结构特性，但是与氯伊瑞霉素紧密共洗脱。这些导致在奥利万星中大量存在的其它未指定的杂质。实际上，在奥利万星的层析曲线中，已鉴定40个不同的峰。

给定奥利万星在化学上复杂的性质，还存在可由奥利万星本身的处理得到的多种杂质，诸如制备药物产物(即，包含奥利万星和赋形剂的药物组合物)的过程，和在储存后。这些杂质可由去糖基化、酰胺键水解或构型变化至在分子中大量结构元素而引起。

对于一些杂质，可得到关于杂质的抗菌活性和安全性的有限量的信息。然而，出于明显的实践原因，对于在临床上遇到的数千细菌菌株，针对单个杂质不能确定关于活性的具体信息，并且针对这一点，已评价药物本身(奥利万星)，以建立光谱(参见例如：Arhin等人，Antimicorb. Agents Chemother. 2009，53，53)。类似地，虽然简单的短期毒理学研究对于少量可分离的杂质会是可能的，但是对于所有杂质，无法实施这样的研究，当然也没到评价奥利万星本身以建立安全性的程度。结果是，控制药物产物中的杂质水平是用于确保患者的安全和有效治疗的唯一手段。

鉴于奥利万星的医学和治疗性应用，并且在单个杂质对药物的安全性和效力的影响非常难以确定的情况下，在本发明的其它重要的实施方案中，本发明涉及(i) 具有低水平的杂质的药物物质制剂，(ii) 用于生产这样的药物物质制剂的方法，(iii) 包含药物物质制剂和一种或多种赋形剂的药物组合物，配制以抑制形成杂质，(iv) 用于生产这样的药物组合物的方法，(v) 药物产物(在旨在在患者中使用而无需进一步处理的制剂中的药物组合物)，配制以抑制形成杂质，和(vi) 用于生产这样的药物产物的方法。

为了实现本发明的每一个实施方案，本发明人已发现关键的是发酵产生非常低水平的杂质，确保氯伊瑞霉素和奥利万星二者满足足够水平的纯度以用作药物。在美国专利5,312,738、美国专利5,843,437和欧洲专利265071中报道的用于生产氯伊瑞霉素的初始发酵培养基涉及使用动物-来源的材料(ASM)作为在发酵期间络合物氮的来源。在广泛研究之后，本发明人意外地发现，转换至缺乏ASM的培养基导致较高纯度氯伊瑞霉素，因此导致较高纯度奥利万星。该发现允许实现本文描述的本发明的每一个实施方案。

在另外的广泛研究之后，本发明人发现，在具体情况下，可处理、配制和储存奥利万星，使得在最终药物组合物中杂质的存在最小化，因此实现本发明的方面(iii)和(iv)。使用本发明的药物物质制剂和药物组合物，通过生产药物产物，还已实现方面(v)和(vi)。此外，还实现本文描述的高纯度氯伊瑞霉素。

包含奥利万星的药物物质制剂

本发明包括奥利万星的药物物质制剂或其盐(本文中也称为“奥利万星药物物质制剂”)，其中在制剂中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质)。在本发明的一方面，奥利万星药物物质制剂的纯度/杂质的水平通过在HPLC色谱图上一种或多种所选杂质的峰面积来限定。在一个具体的实施方案中，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1 (奥利万星因子A)和杂质7 (奥利万星因子C)的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于3.0%的最大杂质水平。在备选的方面，通过杂质1和杂质7的峰面积，最大杂质水平不大于2.9%，2.8%，2.7%，2.6%，2.5%，2.4%，2.3%，2.2%，2.1%，2.0%，1.9%，1.8%，1.7%，1.6%，1.5%，1.4%，1.3%，1.2%，1.1%，1.0%，0.9%，0.8%，0.7%，0.6%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，或0.1%。在具体的方面，通过杂质1和杂质7的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于2.1%的最大杂质水平。在另一个具体的方面，通过杂质1和杂质7的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于1.6%的最大杂质水平。杂质1和7的相对量可变化，并且包括不大于2.9%，2.8%，2.7%，2.6%，2.5%，2.4%，2.3%，2.2%，2.1%，2.0%，1.9%，1.8%，1.7%，1.6%，1.5%，1.4%，1.3%，1.2%，1.1%，1.0%，0.9%，0.8%，0.7%，0.6%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，或0.1%的杂质1，以在药物物质制剂中杂质1和7的组合量计。

在另一个具体的实施方案中，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。在备选的方面，通过相对于杂质1-16的峰面积，制剂具有约86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%或更大的纯度。在具体的方面，通过相对于杂质1-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。在另一个具体的方面，通过相对于杂质1-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85-90%，约86-91%，约87-92%，约88-93%，约89-94%，约90-95%，约90-96%，约91-96%，或约92-97%的纯度。

在另一个具体的实施方案中，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。在备选的方面，奥利万星药物物质制剂具有约86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%或更大的纯度。在具体的方面，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。在另一个具体的方面，奥利万星药物物质制剂具有约85-90%，约86-91%，约87-92%，约88-93%，约89-94%，约90-95%，约90-96%，约91-96%，或约92-97%的纯度。

本发明的每一种奥利万星药物物质制剂可通过其随时间的稳定性来进一步表征。在一方面，当冷冻储存时，在48个月内，本发明的奥利万星药物物质制剂通过杂质2和10的峰面积水平呈现小于1.0%提高。在其它方面，经2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。在另一方面，当冷冻储存时，在48个月内，本发明的奥利万星药物物质制剂通过杂质1-16的峰面积水平呈现小于1.5%提高。在其它方面，经2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。在其它方面，当冷冻储存时，在48个月内，本发明的奥利万星药物物质制剂呈现杂质小于1.5%提高。在其它方面，经2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。

用于制备包含奥利万星的药物物质制剂的方法

本发明还包括制备如本文定义的奥利万星的药物物质制剂或其盐的方法，其中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质)。

在一个具体的实施方案中，制备本发明的奥利万星药物物质制剂的方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星，从而制备本发明的奥利万星药物物质制剂。这样的药物物质制剂包括(i) 奥利万星的药物物质制剂或其盐，通过分别通过图1的峰A和图2的峰G限定的杂质1 (奥利万星因子A)和杂质7 (奥利万星因子C)的峰面积，其具有不大于3.0%的最大杂质水平；(ii) 奥利万星的药物物质制剂或其盐，通过相对于分别通过图1的峰A和图2的峰B-P限定的杂质1-16的峰面积，其具有约85%或更大的纯度；和(iii) 奥利万星的药物物质制剂或其盐，其具有约85%或更大的纯度。

在用于制备以上描述的奥利万星药物物质制剂的方法中，产生氯伊瑞霉素的微生物可为固有地产生氯伊瑞霉素或加工以产生氯伊瑞霉素的任何微生物。合适的微生物包括但不限于一种或多种以下属的微生物：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

步骤(a)的发酵条件通常涉及在30-35℃下使用碳水化合物、氮、少量元素、阳离子和磷酸盐的来源。

不含动物-来源的材料(ASM)的培养基为补充有不衍生自动物的氮来源的培养基。可在培养基中使用的氮的合适的来源包括但不限于大豆粕/粉的酶消化。关键因素在于其用作有机氮的来源。合适的培养基包括但不限于镁、钙、钾、磷酸盐和初级生长的酵母的水溶液。

通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件包括但不限于20-40℃的温度范围和足以维持微生物生长的充气和搅动速率。

用于从发酵肉汤回收氯伊瑞霉素的合适的聚合交换树脂包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的磺化的大孔共聚物。

用于使回收的氯伊瑞霉素脱色的合适的聚合吸附剂树脂包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的非官能化的大孔共聚物。

用于通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素的合适的疏水聚合树脂柱包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的非官能化的大孔共聚物。

用于沉淀经分离的氯伊瑞霉素的合适的有机溶剂包括但不限于甲醇。

用于制备经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐的溶液的合适的有机溶剂包括但不限于甲醇。

用于使铜从奥利万星-铜络合物解络的合适的含水酸包括但不限于甲酸和磷酸。

用于分离经解络的奥利万星的合适的聚合疏水树脂包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的非官能化的大孔共聚物。

用于浓缩从树脂洗脱的奥利万星溶液的合适的手段包括但不限于在减压下蒸馏挥发性溶剂或超滤/渗滤。

用于干燥经沉淀的奥利万星的合适的手段包括但不限于在托盘上或在Nutsche过滤器中在升高的温度和减压下干燥。

用于制备奥利万星药物物质制剂的方法可包括一些另外的任选的步骤。例如，浓缩步骤和沉淀步骤可在脱色之后和在层析法之前实施。浓缩步骤可通过减压蒸馏挥发性溶剂来实施。沉淀步骤可通过调节溶液至碱性pH来实施。此外，浓缩步骤可在层析法之后和在沉淀之前实施。该浓缩步骤可通过减压蒸馏挥发性溶剂来实施。此外，经脱色的氯伊瑞霉素可通过层析法在反相硅胶上分离而不是使用疏水聚合树脂柱。此外，包含氯伊瑞霉素和铜盐的溶液与4-氯-4’-联苯甲醛的反应可使用氢化物试剂终止。最后，使铜从奥利万星-铜络合物解络为任选的步骤，因为在聚合疏水树脂上分离经解络的奥利万星的步骤将也用于从奥利万星除去铜。

本发明还包括通过本文提供的方法制备的奥利万星药物物质制剂。

包含奥利万星药物物质制剂的药物组合物

本发明包括药物组合物，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂(即，奥利万星的药物物质制剂或其盐，其中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质))和一种或多种药学上可接受的赋形剂。在本发明的一方面，奥利万星药物物质制剂的纯度/杂质的水平通过在HPLC色谱图上一种或多种所选杂质的峰面积来限定。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过在图2中显示的峰B和J限定的杂质2 (DEV A)和杂质10 (奥利万星CR)的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于5.5%的最大杂质水平。在备选的方面，通过杂质2和杂质10的峰面积，最大杂质水平不大于5.4%，5.3%，5.2%，5.1%，5.0%，4.9%，4.8%，4.7%，4.6%，4.5%，4.4%，4.3%，4.2%，4.1%，4.0%，3.9%，3.8%，3.7%，3.6%，3.5%，3.4%，3.3%，3.2%，3.1%，3.0%，2.9%，2.8%，2.7%，2.6%，2.5%，2.4%，2.3%，2.2%，2.1%，2.0%，1.9%，1.8%，1.7%，1.6%，1.5%，1.4%，1.3%，1.2%，1.1%，1.0%，0.9%，0.8%，0.7%，0.6%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，或0.1%。在具体的方面，通过杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平。在另一个具体的方面，通过杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于3.0%的最大杂质水平。杂质2和10的相对量可变化，并且包括不大于5.4%，5.3%，5.2%，5.1%，5.0%，4.9%，4.8%，4.7%，4.6%，4.5%，4.4%，4.3%，4.2%，4.1%，4.0%，3.9%，3.8%，3.7%，3.6%，3.5%，3.4%，3.3%，3.2%，3.1%，3.0%，2.9%，2.8%，2.7%，2.6%，2.5%，2.4%，2.3%，2.2%，2.1%，2.0%，1.9%，1.8%，1.7%，1.6%，1.5%，1.4%，1.3%，1.2%，1.1%，1.0%，0.9%，0.8%，0.7%，0.6%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，或0.1%的杂质2，以在药物物质制剂中杂质2和10的组合量计。

在另一个具体的实施方案中，药物组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。在备选的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%或更大的纯度。在具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。在其它具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约96%或更大的纯度。在另一个具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85-90%，约86-91%，约87-92%，约88-93%，约89-94%，约90-95%，约90-96%，约91-96%，或约92-97%的纯度。

合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。在具体的方面，药学上可接受的赋形剂为甘露醇。药物物质制剂与一种或多种赋形剂的比率可变化，并且包括10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，和1:10 wt/wt。以另一种方式陈述，本发明的药物组合物包含约50-75%范围的奥利万星药物物质制剂和约50-25%范围的一种或多种药学上可接受的赋形剂，基于药物组合物的重量。在一方面，本发明的药物组合物包含约55-70%范围的奥利万星药物物质制剂和约45-30%重量范围的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在另一方面，本发明的药物组合物包含约56-68%范围的奥利万星药物物质制剂和约44-32%重量范围的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在其它方面，本发明的药物组合物包含约16-21%范围的奥利万星药物物质制剂和约84-79%重量范围的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些方面，在药物组合物中奥利万星药物物质制剂的量不大于组合物的约70%，69%，68%，67%，66%，65%，64%，63%，62%，61%，60%，59%，58%，57%，56%，55%，54%，53%，52%，51%或50%重量，剩下的重量包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、水分和反荷离子。

包含本发明的奥利万星药物物质制剂的药物组合物可通过其随时间的稳定性来进一步表征。在一方面，当在大约室温下储存时，在36个月内，本发明的药物组合物通过杂质2和10的峰面积水平呈现小于1.0%提高。在其它方面，经2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。在另一方面，在36个月内，本发明的药物组合物通过杂质2-16的峰面积水平呈现小于2.0%提高。在其它方面，经2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。

包含本发明的奥利万星药物物质制剂的药物组合物还可通过其pH来表征。包含奥利万星药物物质制剂的药物组合物可具有2.0-5.0，2.5-4.5，3.0-4.5，3.0-4.0，3.5-4.5的pH，或为约2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9或5.0的pH。

用于制备包含奥利万星药物物质制剂的药物组合物的方法

本发明还包括制备药物组合物的方法，所述组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂(即，奥利万星的药物物质制剂或其盐，其中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质))和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在一个具体的实施方案中，制备药物组合物的方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，且将溶液的pH调节至3.0-4.5，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液，从而制备包含本发明的药物物质制剂的药物组合物。这样的药物组合物包括(i) 包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中通过分别通过图2的峰B和J限定的杂质2和杂质10的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有不大于5.5%的最大杂质水平；和(ii) 包含本发明的奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。

在方法的某些方面，在冻干d)之前，将经过滤的c)的溶液加入到灭菌小瓶中。

在方法的某些方面，在b)中将pH调节至3.1-4.4，3.2-4.3，3.3-4.3，3.4-4.2，3.5-4.1，3.5-4.0，3.6-3.9，3.6-3.8，或3.7-4.2。

在方法的某些方面，冻干实现小于约7.0%，6.5%，6.0%，5.5%，5.0%，4.5%，4.0%，3.5%，3.0%，2.5%，2.0%，1.5%，1%或0.5%重量的水分水平。

用于调节溶液pH的合适的手段包括但不限于向溶液中加入磷酸，直至实现期望的pH。

用于过滤b)的溶液的合适的手段包括但不限于按顺序使用0.45和0.22 µm过滤器。

本发明还包括通过本文提供的方法制备的药物组合物。

包含药物组合物的药物产物

本发明包括药物产物或剂型，其包含本发明的药物组合物(即，药物组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂(即，奥利万星的药物物质制剂或其盐，其中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质)))和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。

在本发明的一方面，奥利万星药物物质制剂的纯度/杂质的水平通过在HPLC色谱图上一种或多种所选杂质的峰面积来限定。在一个具体的实施方案中，药物产物或剂型包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。在备选的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%或更大的纯度。在具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。在其它具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约96%或更大的纯度。在另一个具体的方面，通过相对于杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85-90%，约86-91%，约87-92%，约88-93%，约89-94%，约90-95%，约90-96%，约91-96%，或约92-97%的纯度。

合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。在具体的方面，药学上可接受的赋形剂为甘露醇。药物物质制剂与一种或多种赋形剂的比率可变化，并且包括10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，和1:10 wt/wt。

包含本发明的药物组合物的药物产物或剂型可通过其随时间的稳定性来进一步表征。在一方面，在3个月内，本发明的药物产物或剂型通过杂质2-16的峰面积水平呈现小于0.5%提高。在其它方面，经1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多小时，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多天，1，2，3，4，5，6，7，8或更多周，或1，2，3，4，5，6或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。

包含本发明的药物组合物的药物产物或剂型还可通过其pH来表征。药物产物或剂型可具有2.0-5.0，2.5-4.5，3.0-4.5，3.0-4.0，3.5-4.5的pH，或为约2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9或5.0的pH。

用于制备包含药物组合物的药物产物的方法

本发明还包括制备药物产物或剂型的方法，其包含本发明的药物组合物(即，药物组合物包含本发明的奥利万星药物物质制剂(即，奥利万星的药物物质制剂或其盐，其中已实现最低水平的纯度(或最大水平的杂质)))和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。

在一个具体的实施方案中，用于制备包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂的药物产物或剂型的方法包括在注射用水或5%水中的葡萄糖中溶解本发明的药物组合物，以形成溶液，从而制备包含本发明的药物组合物的药物产物或剂型。这样的药物产物或剂型包括药物产物或剂型，其包含本发明的药物组合物和一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，奥利万星药物物质制剂具有约85%或更大的纯度。

在某些方面，在溶液中奥利万星的浓度为约0.5-100，1-50，2.5-40，5-30，7.5-25，0.5-50，0.5-40，0.5-30，5-100，5-50或5-50 mg/mL。

本发明还包括通过本文提供的方法制备的药物产物。

高纯度氯伊瑞霉素

本发明包括高纯度氯伊瑞霉素或其盐。在本发明的一方面，氯伊瑞霉素的纯度/杂质的水平通过在HPLC色谱图上一种或多种所选杂质的峰面积而限定。在一个具体的实施方案中，本发明涉及高纯度氯伊瑞霉素或其盐，通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，其具有不大于25.0%的最大杂质水平。在备选的方面，通过由图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，氯伊瑞霉素或其盐具有不大于24.5%，24%，23.5%，23%，22.5%，22%，21.5%，21%，20.5%，20%，19.5%，19%，18.5%，18%，17.5%，17%，16.5%，16%，15.5%，15%，14.5%，14%，13.5%，13%，12.5%，12%，11.5%，11%，10.5%，10%或更少的最大杂质水平。在具体的方面，通过由图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，氯伊瑞霉素或其盐具有不大于18%的最大杂质水平。

在另一个具体的实施方案中，高纯度氯伊瑞霉素或其盐具有80%或更大的纯度。在备选的方面，高纯度氯伊瑞霉素或其盐具有约81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%或更大的纯度。在具体的方面，高纯度氯伊瑞霉素或其盐具有约82%或更大的纯度。在其它具体的方面，高纯度氯伊瑞霉素或其盐具有约90%或更大的纯度。在另一个具体的方面，高纯度氯伊瑞霉素或其盐具有约80-95%，约81-95%，约82-95%，约83-95%，约85-95%，约86-95%，约87-95%，约88-95%，或约89-95%的纯度。

本发明的高纯度氯伊瑞霉素可通过其随时间的稳定性来进一步表征。在一方面，本发明的高纯度氯伊瑞霉素通过杂质3、1、7、2、4、5和6的峰面积水平呈现在冷冻条件下，在12个月内，小于1.0%提高。在其它方面，经1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。在另一方面，在冷冻条件下，在12个月内，本发明的高纯度氯伊瑞霉素呈现杂质水平小于2.0%提高。在其它方面，经1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或更多个月，提高小于0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，或1.0%提高。

用于制备高纯度氯伊瑞霉素的方法

本发明还包括制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐的方法。

在一个具体的实施方案中，用于制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐的方法包括以下步骤：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，和

d) 干燥氯伊瑞霉素晶体，从而制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐。这样的高纯度氯伊瑞霉素或其盐，包括通过分别通过图3的峰3、1、7、2、4、5和6限定的杂质核因子A、C和D以及物质P、Q、R和S的峰面积，具有不大于18.0%的最大杂质水平的氯伊瑞霉素。

在用于制备以上描述的高纯度氯伊瑞霉素的方法中，产生氯伊瑞霉素的微生物可为固有地产生氯伊瑞霉素或加工以产生氯伊瑞霉素的任何微生物。合适的微生物包括但不限于一种或多种以下属的微生物：诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属和拟孢囊菌属。在具体的方面，产生氯伊瑞霉素的微生物为禾谷镰孢菌。

步骤(a)的发酵条件通常涉及在30-35℃下使用碳水化合物、氮、少量元素、阳离子和磷酸盐的来源。

不含动物-来源的材料(ASM)的培养基为补充有不衍生自动物的氮来源的培养基。可在培养基中使用的氮的合适的来源包括但不限于大豆粕/粉的酶消化。关键因素在于其用作有机氮的来源。合适的培养基包括但不限于镁、钙、钾、磷酸盐和初级生长的酵母的水溶液。

通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件包括但不限于20-40℃的温度范围和足以维持微生物生长的充气和搅动速率。

用于从发酵肉汤回收氯伊瑞霉素的合适的聚合交换树脂包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的磺化的大孔共聚物。

用于使回收的氯伊瑞霉素脱色的合适的聚合吸附剂树脂包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的非官能化的大孔共聚物。

用于通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素的合适的疏水聚合树脂柱包括但不限于苯乙烯和二乙烯基苯的非官能化的大孔共聚物。

用于沉淀经分离的氯伊瑞霉素的合适的有机溶剂包括但不限于甲醇。

用于干燥氯伊瑞霉素晶体的合适的手段包括但不限于在托盘上或在Nutsche过滤器中在升高的温度和减压下干燥。

用于制备高纯度氯伊瑞霉素或其盐的方法可包括一些另外的任选的步骤。例如，浓缩步骤和沉淀步骤可在脱色之后和在层析法之前实施。浓缩步骤可通过减压蒸馏挥发性溶剂来实施。沉淀步骤可通过调节溶液至碱性pH来实施。此外，浓缩步骤可在层析法之后和在沉淀之前实施。该浓缩步骤可通过减压蒸馏挥发性溶剂来实施。此外，经脱色的氯伊瑞霉素可通过层析法在反相硅胶上分离而不使用疏水聚合树脂柱。

本发明还包括通过本文提供的方法制备的高纯度氯伊瑞霉素。

用于测量纯度的手段

奥利万星或奥利万星药物物质制剂或奥利万星药物物质制剂在药物组合物、药物产物或剂型中的水平纯度可通过HPLC测量。在具体的方面，纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A (其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

氯伊瑞霉素或氯伊瑞霉素在药物物质制剂、药物组合物、药物产物和包含氯伊瑞霉素的剂型中的纯度水平也可通过HPLC来测定。在具体的方面，氯伊瑞霉素的纯度水平通过HPLC测量，其中所述HPLC方法包括苯基衍生的反相固定相和流动相B (其为约40/60/0.2/0.03 (v/v/v/v)比率的乙腈/水/甲酸/三乙胺)在流动相A (其为约100/0.2/0.03 (v/v/v)比率的水/甲酸/三乙胺)中的梯度。

用于从HPLC色谱图测定峰面积的手段

在HPLC色谱图上杂质峰的面积可通过标准色谱图积分软件来测定，例如但不限于来自Agilent的ChemStation、来自Waters的Empower、来自Shimadzu的LabSolutions。

包含药物组合物的小瓶

本发明还涉及包含本发明的药物组合物的冻干的粉末的小瓶。在某些方面，小瓶为在化学惰性干燥气体下塞紧的玻璃小瓶。合适的化学惰性干燥气体包括但不限于氮和氩气。

III. 实施例

1)制造过程和过程控制综述

奥利万星药物物质(DS)为在两个阶段中制造的半合成的糖肽。第一阶段涉及使用通过菌株改进技术由菌株NRRL 18098衍生的细菌禾谷镰孢菌的菌株的经典发酵，以产生中间体核因子B (氯伊瑞霉素)。第二阶段为涉及核因子B的还原性烷基化的合成步骤，以产生奥利万星药物物质。核因子B和奥利万星二磷酸盐的制造过程在分别在图4和图5中提供的流程图中描述。

2)制造核因子B

核因子B的制造涉及发酵、回收、纯化和沉淀，如下提供。

A. 发酵

用于产生核因子B的发酵(从工作储液小瓶到生产发酵罐)为用于产生细胞团的经典的发酵过程。核因子B为细胞的细胞代谢的产物，并且通过培养物的天然遗传组成来支配。生产培养物为禾谷镰孢菌。

接种瓶/摇瓶

在核因子B发酵过程中该步骤的目的是提供足够的生物质，以在随后的种子发酵罐步骤中实现培养物的足够生长。

接种瓶(摇瓶)接种有全部或部分禾谷镰孢菌的冷冻的工作储液小瓶。在接种之前，将摇瓶培养基在120-127℃下高压处理不小于20分钟。在旋转振荡器上培养接种瓶，以支持培养物的生长，导致细胞团增加。接种瓶的主动生长的细胞用于接种种子发酵罐。

接种瓶培养基的典型组成在表1中列出。培养基含有水，以及支持培养物的生长的碳和氮来源。先前，在发酵阶段用于生长培养基的一些原料含有动物组织的消化液。本文提供的方法学局限于使用不含动物-来源的材料(ASM)的试剂，并且不使用这些材料生产的奥利万星称为不含ASM的奥利万星药物物质制剂。碳和氮来源与在表2中列出的其它类似的成分可互换，并且浓度可变化，以提供一致的生长。对于其中使用含有ASM的试剂的对照实验，动物组织的消化液(诸如猪皮消化液)用于代替基于植物的材料的消化液(诸如植物蛋白胨，大豆粕/粉的消化液，表1)。对于所有实验，接种瓶的标称操作温度为33 ± 2℃，搅动速率为240 + 10 RPM。温度和搅动范围之外的操作是可接受的，条件是良好的生长是显然的。通过测量细胞密度(在600 nm下，培养基的光密度测量值)并且得到7 (通常10-15)的最小光密度，确定合适的生长。摇瓶的典型的周期时间为40小时。还检查生长培养物的纯度或其它微生物的不存在。

表1：用于接种瓶培养基的材料

组分	典型的培养基组成(g/L)
		一水合葡萄糖	15.0
酵母提取物	9.0
		植物蛋白胨(大豆粕的木瓜蛋白酶(papaic)消化液)	10.0
可溶性淀粉	10.0
		Mops缓冲液(3-(N-吗啉代丙磺酸)	2.1
消泡剂	1-2滴
		自来水	至体积

表2：碳和氮来源

水，自来水
	氨水，18%
氨水，28%
	硫酸铵，FCC
碳酸钙，ACS级别
	碳酸钙，沉淀的
碳酸钙，技术级，粉末
	六水合氯化钴(ACS)
玉米淀粉
	玉米糖浆，D.E.95
玉米糖浆，D.E.95，含水稀释
	硫酸酮
一水合葡萄糖(非USP)，粉末
	甘油
淀粉，可溶性，非NF
	硫酸镁晶体，Epsom Salts，技术级
硫酸镁，技术级，无水
	硫酸镁，USP (七水合物)
大豆蛋白，水解的，技术级
	甘油，USP/EP
氯化钾，USP
	磷酸钾，一碱式，非NF
马铃薯糊精(Perfectamyl B1102)
	氯化钠
氢氧化钠，NF，粒料
	氢氧化钠溶液，50%苛性钠
大豆粉，专用级别
	大豆粕，木瓜蛋白酶消化液(植物蛋白胨)
缓冲液，3-(N-吗啉代)丙磺酸
	硫酸，66，食品化学法典
硫酸，试剂级别
	硫酸，技术级
氯化钾，USP
	酵母提取物
酵母提取物(Tastone 154)
	酵母提取物，自体溶解
酵母，啤酒商，干燥的
	酵母，干燥的

种子发酵罐

在核因子B发酵过程中该步骤的目的是提供足够的生物质，以在随后的生产发酵罐步骤中实现培养物的足够生长。控制种子发酵罐周期时间(年龄)以及环境控制过程变量(温度、充气、搅动和背压)，以确保生长一致性和生产率(产率)。种子发酵罐批次的尺寸为转移至生产发酵罐中期望的接种体体积的函数。通常，生产发酵罐体积的3%-10%的种子接种体体积提供足够量的细胞，用于在生产发酵罐中优化生长和生产率(产率)。种子批次的典型的体积为3000 L，生产发酵罐的典型的体积为42000 L。

将种子发酵罐培养基在121℃-125℃下蒸汽热处理45 ± 5分钟，冷却至接种温度，随后从接种瓶的内含物无菌接种。使用选自在表2中列出的原料的成分来制备种子发酵罐培养基。动物-来源的材料仅用于实验对照。将种子发酵罐搅动，充气，且保持在恒定的温度下。在热处理后，在种子发酵罐上保持正背压，以防止外来的有机体进入。种子发酵罐的主动生长细胞用于无菌接种生产发酵罐。

种子发酵罐培养基的典型的组成在表3中列出。培养基含有水、矿物质、维生素、有机和无机盐、消泡剂以及支持培养物生长的碳、氮和磷酸盐来源。成分与在表2中列出的其它类似的成分互换(即，葡萄糖(dextrose)可被葡糖(glucose)替代)，并且浓度可变化，以提供一致的生长。对于其中使用含有ASM的试剂的对照实验，使用胰酶解酪蛋白大豆肉汤(含有牛乳酪蛋白的消化液)和大豆蛋白胨(大豆粕的猪胰腺消化液)代替Hy-Soy (表3)。

表3：用于种子发酵培养基的材料

组分	典型的培养基浓度(g/L)
		Hy-Soy (水解的大豆蛋白)	5.0
酵母，初级生长	5.0
		玉米淀粉	5.0
碳酸钙	1.0
		一水合葡萄糖	10.0
消泡剂	0.3
		自来水	至体积

种子发酵罐的温度保持在20℃-40℃的受控的目标温度，直至在所有实验中实现适量的细胞团。搅动和充气速率取决于种子发酵罐的尺寸，并且改变以实现足够的氧输送。在这些范围之外的短暂偏移是可接受的，条件是良好的生长是显然的。通过间接测量代谢过程变量，包括pH和氧消耗，并且直接通过微观检查，监控生长和生存性。通过实施纯度试验，检查种子发酵罐外来物生长的存在。这些试验包括生长培养物的标准革兰氏染色和在一般性目的培养基(酪蛋白大豆消化液肉汤)中生长的培养物的革兰氏染色。证实存在所选的有机体并且不存在外来的微生物。来自种子发酵罐的纯培养物随后释放，以用于生产发酵罐。在该阶段实现生长所需的典型的周期时间为约42-60小时。种子发酵罐的典型的操作条件在表4中提供。

表4：种子发酵罐操作条件

操作条件	典型的目标设定点
		温度	32 ± 0.5℃
喷射气流	100 cfm
		搅动	100 rpm
背压	10 psig

CFM = 立方英尺/分钟；PSI = 磅/平方英寸；RPM = 转/分钟。

生产发酵罐

生产发酵罐的目的是繁殖培养物至高细胞密度，和保持该细胞团的生存性达足够的时间段，用于通过培养物来生物合成核因子B。

将生产发酵罐周期时间(年龄)以及环境控制过程变量(温度、搅动、充气、pH和背压)控制在操作范围内，以确保生长一致性和生产率(产率)。生产发酵罐的尺寸为转移至回收过程期望的细胞团体积的函数。生产发酵罐体积在18,000 L-60,000 L范围内，典型的发酵罐体积为42,000 L。

将生产发酵罐培养基在121℃-125℃下蒸汽热处理40 ± 5分钟。生产发酵罐用在种子发酵步骤中产生的培养物无菌接种。使用选自在表2中列出的原料的成分来制备生产发酵罐培养基。动物-来源的材料仅用于实验对照。在热处理后，在生产发酵罐上保持正背压，以防止外来的有机体进入。

生产发酵罐培养基的典型的组成在表5中列出。培养基含有化学限定的成分和复杂的农业产物。此外，通过多种成分提供有机体的生长所需的营养物，以补偿与在过程中使用的复杂原料相关的潜在的可变性。原料包括水、矿物质、维生素、有机和无机盐、消泡剂以及支持培养物生长的碳、氮和磷酸盐来源。成分与在表2中列出的其它类似的成分互换(即，大豆粉可被大豆粗粉替代)，并且浓度可变化，以提供一致的生长。此外，还可将碳和/或氮来源进料至发酵，以维持培养物的生存性和提供一致性和生产率(产率)。对于其中使用含有ASM的试剂的对照实验，使用蛋白胨PSR #5 (猪皮酶消化液)代替大豆粉(表5)。

表5：用于生产发酵的材料

组分	典型的培养基浓度(g/L)
		不含ASM的培养基
大豆粉	6.0
		初级生长的酵母	6.5
玉米糖浆(DE95)	80.4
		氯化钾(USP)	5.4
硫酸镁晶体	1.2
		磷酸钾，一碱式	0.17
硫酸铵，FCC	4.4
		碳酸钙	4.9
消泡剂	1.0
		氨水	17
自来水	至体积

FCC = 食品化学法典；USP = 美国药典

生产发酵罐的温度保持在20℃-40℃的受控目标温度，以在所有实验中促进细胞生长和保持细胞团的生存性。搅动和充气速率取决于生产发酵罐的尺寸，并且改变以实现足够的氧输送。生产发酵罐的pH控制在6.6-6.8，以保持培养物的生存性。在这些范围之外的短暂偏移是可接受的，条件是良好的生长是显然的。在整个发酵周期，进料糖和氨水，用于维持核因子B的生长和生物合成。通过间接测量代谢过程变量，包括pH、氧、葡糖和铵消耗，监控生长和生存性。还实施培养基的微观检查。在整个发酵周期，每天对肉汤取样，并且试验外来生长。这些试验包括生长培养物的标准革兰氏染色和在一般性目的培养基(酪蛋白大豆消化液肉汤)中生长的培养物的革兰氏染色。证实存在所选的有机体并且不存在外来的微生物。发酵周期的总长度通常为284 ± 8小时。发酵的收获年龄是期望的批次产率和细胞生存性的函数，并且不是关键性过程决定。收获具有较短周期的发酵导致较低的发酵批次滴定度，而由于无法支撑的生存性，延长发酵周期时间不会改进批次滴定度。在周期结束时收获培养物，并且转移用于回收核因子B。过程的生产发酵罐阶段用于促进细胞生长和合成核因子。对于所有实验，生产发酵罐的典型的操作条件在表6中提供。

在发酵中核因子B的滴定度产率是细胞生长、培养基浓度和发酵周期的函数，并且通常在2-4 g/L范围。在完成发酵后，测定核因子B的滴定度产率。

表6：典型的生产发酵罐操作条件

操作条件	典型的目标设定点
		温度	34.5 ± 0.5 ℃
喷射空气	1000 CFM
		搅动	125 RPM
背压	10 psig
		pH	6.7 ± 0.2

CFM = 立方英尺/分钟；PSI = 磅/平方英寸；RPM = 转/分钟。

B.回收

因子捕获

这些步骤的目的是将核因子B和糖肽相关的物质与发酵肉汤分离。将发酵肉汤与聚合阳离子交换树脂混合约6小时，且温热至约50℃，以在树脂上吸附核因子。通过过滤和用水洗涤，将树脂与用过的肉汤分离。

通过与碱性水混合，将核因子B和相关的结构从树脂脱附。树脂随后用水洗涤，和分离。收集含有已脱附的核因子的洗脱物和洗涤物，且合并。将合并的洗脱物和洗涤物的pH调节至pH 6.5-9.6。过滤因子捕获洗脱物，且试验核因子B浓度。

C. 纯化

脱色

这些步骤的目的是从因子捕获洗脱物除去有色组分。在聚合吸附剂树脂上吸附在合并的因子捕获洗脱物和洗涤物中的核因子，且树脂用水洗涤。核因子使用含水异丙醇和乙酸溶液洗脱。

在一些情况下，作为多个脱色批次处理因子捕获洗脱物。随后将脱色批次合并，以形成脱色池。试验脱色池中四种核因子[A+B+C+D] 的浓度。

层析分离

这些步骤的目的是纯化脱色池中的核因子B。使用氢氧化铵，将脱色池的pH调节至6.5-8.9。池用纯化水稀释，以根据以下规格控制IPA含量：

如果溶液pH >7.5，则将IPA含量调节至NMT 3.0% v/v；

如果溶液pH ≤ 7.5，则将IPA含量调节至NMT 1.5% v/v。

将溶液负载到聚苯乙烯二乙烯基苯树脂柱上(负载NMT 50g总合并的因子[A+B+C+D]/L树脂)。

柱用NLT 1.8 BV (床体积)的1% v/v异丙醇/含水磷酸铵缓冲液、NLT 1.8 BV的3%v/v异丙醇/含水一碱式磷酸铵缓冲液和最后5% v/v异丙醇/含水一碱式磷酸铵缓冲液连续洗脱。一个床体积定义为在柱中树脂的体积。针对NLT 70 PA%因子B、NMT 8 PA%因子A和NMT6 PA%因子C的最低级分品质标准，通过HPLC分析所选的早期和后期级分。

将通过最低级分品质标准的早期和后期级分与在它们之间并列的级分合并。在一些情况下，使用磷酸和/或氢氧化铵调节级分池pH。针对在表7中列出的级分池规格，通过HPLC验证级分池品质。

表7：级分池规格

化合物	接受标准(峰面积%)
		核因子B	NLT 80.0%
核因子A	NMT 5.0%
		核因子C	NMT 1.9%
核因子D	NMT 10.0%
		核因子A+C总和	NMT 5.0%
RS-Q (RRT 1.08)	NMT 5.0%
		单一最大未指定的物质(SLUS)	NMT 2.0%

缩写：NLT = 不小于；NMT = 不大于。

浓缩(超滤/渗滤)

合并的级分通过超滤而部分浓缩，且浓缩物(称为存留物)用纯化水渗滤。使用含水氢氧化钠和/或乙酸，将经渗滤的存留物的pH调节至9.6-10.5，且使用NLT 2.8渗滤体积(DV)的纯化水再次渗滤。一个DV定义为存留物体积。

通过用于磷酸盐的离子层析法测定存留物，且当磷酸盐浓度为NMT 0.40 mg/mL时，终止渗滤。存留物使用乙酸酸化，以形成乙酸盐，且在一些情况下，进一步浓缩和/或渗滤。存留物按需用纯化水稀释。通过HPLC测定在存留物中的核因子B浓度。

D. 沉淀

盐沉淀

将水溶液加热，并且与甲醇乙酸钠混合。按需，通过用分离的核因子B接种，辅助沉淀。将浆料冷却，加入另外的甲醇乙酸钠，且将浆料进一步冷却。通过离心收集经沉淀的核因子B二乙酸盐，且用NLT 3 L甲醇/kg核因子B洗涤。

干燥和研磨

将湿饼在NMT 45℃下减压干燥NMT 48小时，或可替代地在NMT 35℃下干燥NMT 96小时。通过气相色谱法监测干燥，具有NMT 7% w/w残留溶剂的过程中限度。在一些情况下，将经干燥的材料机械磨碎和共混。将经干燥的材料在NMT 8℃下储存。

经由HPLC测定在经干燥的材料中的某些杂质的水平。如在图7A中可见的，当使用不含ASM的培养基时，某些杂质的水平降低。

可作为多个批次实施因子捕获、脱色、层析分离、浓缩(超滤/渗滤)、沉淀和干燥步骤。核因子B的典型的总回收率为在发酵肉汤中估计的核因子B Kg的20-50%。

3) 奥利万星二磷酸盐的制造(还原性烷基化)

涉及核因子B合成转化为奥利万星药物物质的步骤包括还原性烷基化、层析分离、通过超滤和渗滤而浓缩、盐结晶和干燥。反应化学计量学在表8中提供。

表8：反应化学计量学

NLT = 不小于。N/A = 不适用

^a 另外的试剂，硼氢化钠(NaBH₄)，以非化学计量使用，以淬灭未反应的醛。

^b 通过所有反应物(核因子A、B、C和D)消耗的试剂的装载因子补偿。

^c 使用浓度的装载因子计算。

A.还原性烷基化

在环境温度下，混合核因子B (通常20-45 kg)和乙酸铜(II)在甲醇中的溶液，直至溶解，以产生核因子B的铜络合物。向该溶液中加入作为固体或在四氢呋喃中的溶液的原料4-氯-4’-联苯甲醛，接着加入氰硼氢化钠在四氢呋喃中的溶液。将溶液加热。

按需加入另外的4-氯-4’-联苯甲醛，以驱动反应完成和/或消耗位点-2单烷基化衍生物。过程中控制：针对位点-2单烷基化衍生物的相对于奥利万星的NMT 1.2% w/w比率的限度，通过HPLC监测反应进展。

将反应混合物冷却至环境温度，且通过加入硼氢化钠而终止，以将残留的4-氯-4’-联苯甲醛转化为相应的醇。在一些情况下，分成多份加入硼氢化钠。

按需使用乙酸和含水氢氧化钠调节反应混合物。减压浓缩混合物，加入乙腈，以沉淀奥利万星，作为其铜络合物。收集奥利万星铜络合物，按需用乙腈和甲醇的混合物洗涤。在NMT 23℃温度下，将湿饼脱水NMT 24小时。将湿饼在NMT 8℃下储存。

B. 层析分离

在稀释的乙腈和含水磷酸的混合物中溶解奥利万星铜络合物，以使奥利万星解络。在含有事先用乙腈和含水磷酸的混合物平衡的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂的柱上负载经解络的溶液。

通过连续施用14-18 v/v % (NLT 2.0 BV床体积)和24-27 v/v %在含水磷酸铵中的乙腈，从树脂洗脱奥利万星。在本体级分中收集洗脱物。对含有奥利万星的连续的本体级分取样，以产生用于试验的复合样品池。

过程中控制：针对在表9中列出的池规格，通过HPLC分析复合样品池。合并取样的本体级分，以组成通过的复合样品池。

C. 浓缩(UF/DF)

通过超滤浓缩合并的级分，随后使用纯化水渗滤。按需通过超滤进一步浓缩浓缩物。按需用纯化水稀释浓缩物。

按需使用含水磷酸和/或氢氧化钠溶液调节浓缩物pH。测量在浓缩物(称为存留物)中奥利万星游离碱和磷酸盐浓度。

过程中控制：针对在表9中列出的存留物规格，通过HPLC分析存留物。将存留物在NMT 25℃下储存8周。

表9：层析法池和存留物规格

化合物	接受标准(峰面积%)
		核DEV A	NMT 0.90
奥利万星因子C	NMT 1.9
		RS-K	NMT 0.50
RS-L	NMT 0.90
		奥利万星CR	NMT 1.0
RS-N	NMT 0.60
		RS-O	NMT 0.90
RS-M	NMT 0.90
		奥利万星F	NMT 0.40
指定的RS-E/G	NMT 0.8
		单一最大未指定的杂质(SLUI)	NMT 0.40
总杂质	NMT 6.6
		总未指定的杂质	NMT 1.1

NMT = 不大于。RS = 相关的物质

D. 盐结晶和干燥

将浓缩物加热，且加入乙醇，以得到含有40-70 v/v%乙醇的溶液。加入磷酸铵的水溶液。该溶液用奥利万星二磷酸盐接种。冷却混合物，且加入第二部分磷酸铵水溶液。进一步冷却悬浮液，分离晶体。饼用不小于1 L含水乙醇/kg在存留物中测得的奥利万星游离碱洗涤。按需，可分离固体并且分成多份洗涤。

将饼在NMT 40℃下减压干燥，取样测定水分和残留的溶剂。针对NMT 4.0% w/w水的限度，通过Karl Fischer，和针对NMT 5.0% w/w乙醇的限度，通过GC，监测干燥。按需，在NMT 40℃下，将饼进一步干燥NMT 7天。按需将经干燥的材料机械磨碎。

经由HPLC测定在经干燥的材料中杂质的水平。如在图7B中可看到的，当生产奥利万星用在不含ASM的培养基中生产的核因子B引发时，杂质的水平降低。

由核因子B，奥利万星二磷酸盐的总产率通常为45-72%。

4) 再加工程序

A. 制造核因子B

开发以下再加工程序，用于：1) 杂质规格失效；2) 磷酸盐失效；3) 残留的溶剂失效；和4) 惰性颗粒污染。一种或多种类似地受影响的批次可合并，用于再加工。

杂质的再加工

通过重复层析分离、浓缩、盐沉淀和干燥步骤，对失效过程中接受标准的级分池再加工。

磷酸盐的再加工

通过连续(或适当地，重复)碱性渗滤，直至得到通过的过程中磷酸盐结果，在任何阶段再加工磷酸盐失效。如前所述，实施进一步下游加工。

不溶性外来物质污染的再加工

对于惰性颗粒污染，通过在水中溶解、过滤和作为盐沉淀再引入到过程，以及重复干燥，按需再加工核因子B。

B. 制造奥利万星二磷酸盐(烷基化)

开发以下再加工程序，用于：1) 分析失效的药物物质存留物；2) 外来物质失效的奥利万星二磷酸盐；和3) 纯度失效的奥利万星二磷酸盐。一种或多种类似地受影响的批次可合并，用于再加工。

池或杂质的存留物的再加工

再加工在表9中列出的相关的和指定的物质的接受标准失效的层析法池或UF存留物。

池进行渗滤过程。重复层析分离，收集级分，分析样品复合池，将可接受的本体级分合并。如果针对在表9中的规格可接受，则继续将再加工材料盐结晶和干燥。

外来材料的再加工

重新组成对于非纯度相关的规格(诸如澄清度、点火时的残渣或不溶性外来物质)失效的奥利万星二磷酸盐药物物质至存留物阶段并且再加工。

在纯化水中溶解奥利万星二磷酸盐。如果需要，使用含水磷酸和氨水调节pH。溶液过滤，且如前所述实施和盐结晶和干燥步骤。

杂质的药物物质再加工

纯度失效的奥利万星二磷酸盐药物物质也可再加工。在纯化水和乙腈在含水磷酸中的混合物中溶解奥利万星二磷酸盐，并且在树脂上负载。实施层析分离和收集级分，分析样品复合池，将可接受的本体级分合并。实施UF浓缩，并且针对在表9中列出的存留物规格分析再加工的材料。如果可接受，继续将再加工的材料进行如前所述的结晶和干燥步骤。

5) 制造过程和过程控制的描述

制造，试验用于注射药物产物的奥利万星，使用标准加工技术初步包装。

制造过程可按比例放大和可再现并且包括以下步骤：

● 奥利万星药物物质的平衡

● 制备奥利万星本体药物产物溶液

● 预过滤和生物负担降低

● 组分制备

● 无菌过滤和填充

● 冻干和加塞

● 加盖和本体包装

● 二级包装。

概述商业制造程序的流程图在图6中呈现。所用的设备在表10中列出。

表10：用于制造注射用奥利万星所用的设备

奥利万星药物物质的平衡

在一个实施例中，在称重前，将药物物质容器从2-8℃平衡至室温(15-25℃)。在湿度受控的环境(诸如绝缘体)中实施称重。

制备奥利万星本体药物产物溶液

以等于约85%的本体溶液最终适量重量的量将注射用水(WFI)加入到配衡的混配容器。整个溶液制备阶段在15-30℃温度下实施。在混合时，加入磷酸溶液(6% w/v)，将内含物的pH调节至2.8-3.0。

将甘露醇加入到混配容器中，混合，直至溶解，如通过视觉检查来测定。将奥利万星二磷酸盐分成多份缓慢加入到混配容器中，其中混合速率避免过量发泡。检查溶液pH，在每一次API加入之后，用稀磷酸溶液调节至pH 3.6-3.8。如果需要，继续混合，直至奥利万星二磷酸盐溶解，如通过视觉检查来测定。

加入WFI，直至达到最终重量。将溶液混合，实施最终pH检查，按需用稀磷酸溶液将pH调节至pH 3.6-3.8。对本体溶液取样，用于外观、pH和生物负担试验。

预过滤和生物负担降低

将本体溶液通过串联连接的0.45 μm和0.22 μm过滤器(生物负担降低)过滤。在合适尺寸的不锈钢槽中收集经过滤的溶液，并且保持在15-30℃。在API加入和开始冻干之间的本体保持时间不大于确认的时间段。

组分制备

在确认的隧道中装载玻璃小瓶。开始时，将它们洗涤，随后去热原，使得内毒素水平得到3 log降低。将塞子灭菌，按照确认的周期，在高压釜中干燥。按照确认的周期，在无菌区域3高压釜中实施过滤器和其它小部件的灭菌。按照确认的周期，在烘箱中，将冻干托盘去热原，具有以下设定：

● 温度设定点：220℃

● 过程温度范围：210℃-250℃

● 去热原时间：300分钟

与最终的本体容器、过滤设备和填充注射器的所有连接在A级(类别100)区域中无菌实施。

无菌过滤和填充

在临填充前，通过使溶液通过串联连接的两个0.22 µm过滤器，过滤最终的本体药物产物溶液。在开始灭菌过滤之前，取过程中样品用于外观、密度和生物负担试验。在A级环境(类别100)中使用无菌填充程序，将13.51g无菌溶液的目标填充重量填充至每一个灭菌的小瓶。

在填充过程之前和期间，实施填充重量检查，以证实准确性。填充后，将塞子部分放置在小瓶上。

冻干和加塞

在填充后，将小瓶转移至冻干器，并且经历事先限定的冷冻干燥周期。在周期结束时，在冻干器中将小瓶完全塞紧。冻干参数在表11中列出。开始无菌过滤和开始冻干之间的时间不大于24小时。

加盖和本体包装

将小瓶输送至适当的加盖机器，在这里在LAF A级空气供应下对小瓶加盖。加盖后，在D级环境中收集小瓶。在折边上对批号喷墨。视觉检查小瓶，本体填充。

表11：冻干参数概要

步骤	储存温度(oC) ± 3℃	压力(µbar)	时间(小时:分钟)
				负载	5	大气压	N/A
冷冻	5--40	大气压	02:00
				冷冻	-40	大气压	06:00
抽空	-40	133	N/A
				初级干燥	-40至-15	133	02:00
初级干燥	-15	133	64:00
				二级干燥	-15-35	133	02:00
二级干燥	35	133	07:00
				二级干燥	35-25	133	00:30
二级干燥	25	133	00:30
				预充气(氮)	25	0.83×106	N/A
加塞	25	0.83×106	N/A
				充气	25	大气压	N/A
保存	20	大气压	N/A

经由HPLC测定在冻干的材料中杂质的水平。对于由本身已经由不含ASM的过程生产的奥利万星药物物质而生产的奥利万星药物产物，所有杂质和未指定的杂质的水平分别为3.6±0.43%和2.4±0.37%。对于由本身已经由含有ASM的过程生产的奥利万星药物物质而生产的奥利万星药物产物，相同的水平分别为4.2±0.71%和2.9±0.27%。

过程中控制

在制造过程的示意性流程图中指示过程中控制(图6)。过程中控制方法及限度在表12中制表。

表12：对于奥利万星药物产物制造的过程中控制的概要

* 在每次API加入之后，经由滴定，使用稀磷酸溶液，在生产中将溶液的pH调价至3.7的目标。

* * * *

虽然已参考其某些具体的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不偏离本发明的精神和范围下可以进行各种修改。所附权利要求的范围不局限于所描述的具体实施方案。

在本说明书中提及的所有专利和公布指示本发明所属领域技术人员的水平。每一个引用的专利和公布通过引用而全文结合到本文中。

Claims (15)

1.一种药物组合物，所述组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度。

2.权利要求1的药物组合物，其中通过峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有约95%或更大的纯度。

3. 一种药物组合物，所述组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过在图2中显示的峰B和J限定的杂质2 (DEV A)和杂质10(奥利万星CR)的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平。

4.权利要求3的药物组合物，其中通过峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有不大于3.0%的最大杂质水平。

5.权利要求3的药物组合物，其中通过杂质2的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有不大于1.9%的最大杂质水平，且通过杂质10的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有不大于2.9%的最大杂质水平。

6.权利要求1或3的药物组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。

7.权利要求1或3的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为甘露醇。

8.权利要求1或3的药物组合物，其中所述药物物质制剂与所述一种或多种赋形剂的重量比率为2:1。

9.权利要求1或3的药物组合物，其中所述奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量。

10. 权利要求9的药物组合物，其中所述奥利万星药物物质制剂的纯度水平通过HPLC测量，并且其中所述HPLC测量利用C18反相固定相和流动相B (其为约1/1000/1500/25 (v/v/v/v)比率的磷酸/水/乙腈/四氢呋喃)在流动相A (其为约1/1000/10 (v/v/v)比率的磷酸/水/四氢呋喃)中的梯度。

11.一种用于制备权利要求1或3的奥利万星药物物质制剂的方法，所述方法包括：

a) 在不含动物-来源的材料(ASM)的培养基中的发酵条件下，和在通过培养物促进氯伊瑞霉素的生物合成的条件下，生长产生氯伊瑞霉素的微生物的培养物，

b) 使用聚合交换树脂，从a)的发酵肉汤回收氯伊瑞霉素，

c) 使用聚合吸附剂树脂，使在b)中回收的氯伊瑞霉素脱色，使用疏水聚合树脂柱，通过层析法分离经脱色的氯伊瑞霉素，以及使用有机溶剂，沉淀经分离的氯伊瑞霉素，

d) 制备c)的经沉淀的氯伊瑞霉素和铜盐在有机溶剂中的溶液，使所述溶液与4-氯-4’-联苯甲醛反应，以及使用乙腈，从溶液沉淀奥利万星-铜络合物，

e) 通过加入含水酸，从d)的奥利万星-铜络合物使铜解络，且使用聚合疏水树脂分离经解络的奥利万星，其中所述加入和分离同时或序贯实施，

f) 浓缩在e)中从所述树脂洗脱的奥利万星溶液，

g) 在含水乙醇中从f)的浓缩物沉淀奥利万星，和

h) 干燥经沉淀的奥利万星，从而制备奥利万星药物物质制剂。

12.一种用于制备权利要求1或3的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，并将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液。

13.权利要求12的方法，其中所述冻干实现小于约5%重量的水分水平。

14.一种药物组合物，所述组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过相对于分别通过图2的峰B-P限定的杂质2-16的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有约90%或更大的纯度，其通过以下方法制备，所述方法包括：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，并将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液。

15. 一种药物组合物，所述组合物包含奥利万星药物物质制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中通过分别通过在图2中显示的峰B和J限定的杂质2 (DEV A)和杂质10(奥利万星CR)的峰面积，所述奥利万星药物物质制剂具有不大于4.8%的最大杂质水平，其通过以下方法制备，所述方法包括：

a) 在pH为2.5-3.5的水中溶解一种或多种药学上可接受的赋形剂，以形成溶液，

b) 在a)的溶液中溶解奥利万星药物物质制剂，并将溶液的pH调节至3.5-4.0，

c) 过滤b)的溶液，和

d) 冻干经过滤的c)的溶液。