CN104651432B - 一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法，采用淀粉浓度为6～10％，硫铵浓度为0.01～0.05％，酵母浓度为0.1～0.5％，淀粉酶浓度为0.002～0.01％的混合物为补料，在发酵的中后期进行补料，该补料方法确保了料罐碳源、氮源的合适浓度，以及补料的合适时机，使得阿维菌素生产水平有提高3‑5％，有效提高了发酵生产水平，而且不对产品本身及下游产品的内在质量造成影响，具有明显的经济效益和推广价值。

Description

一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法

技术领域：

本发明涉及一种生物农药的制备方法，具体涉及一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法。

背景技术：

阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，具有结构新颖、农畜两用的特点，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。阿维菌素是一种常见的农药制剂，广泛应用于农业，作为杀虫剂，用于防治十字花科小菜蛾、梨树梨木虱、棉花红蜘蛛、柑橘潜叶蛾锈壁虱、棉花棉铃虫、苹果树桃小食心虫和二斑叶螨、菜青虫等。阿维菌素的发酵是一个产热的过程，伴随着温度升高的同时，发酵液中的水分也在不断地蒸发，同时由于空气温度的影响，也存在水分的蒸发。因此一方面会引起发酵液的粘度上升，使得溶氧降低，不利于菌体的生长代谢和酶的催化作用，使得效价增长受阻，另一方面水分的蒸发，导致最终放罐的体积缩小，单罐总亿降低，影响产量，同时会使得发酵液浓缩，单位体积内糖的含量增加，不利于菌体的代谢。

目前，阿维菌素采取的是分批式发酵，所需营养物质一次性加入培养基中，直至本批发酵结束，发酵过程略有补糖。但采取中后期补糖后，过浓会导致糖阻，菌丝返青等现象，影响效价生长；过稀会导致培养基基质浓度降低，氮源不足。目前，虽然已有阿维菌素发酵补料工艺的研究，在阿维菌素发酵中后期通过流加或批补葡萄糖液来增加产量，但是效果并不明显，仅能增加部分放罐体积，而培养基利用不彻底、单位干物质发酵产率下降、发酵设备利用率低等问题仍未得到彻底解决。

因此，解决阿维菌素发酵中后期补料工艺有待提高。

发明内容：

针对现有生产阿维菌素发酵过程补料出现的问题，本发明提供一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法，该补料方法选用特定补料，以及在合适时机进行补料，提高了发酵效价，使得阿维菌素生产水平有提高3-5％。

本发明的技术方案如下：

一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法，所需要的阿维菌素发酵补料由淀粉、硫铵、酵母粉、淀粉酶和水组成；按各组分质量比之和百分之百计，其中，淀粉为6～10％，硫铵为0.01～0.05％，酵母为0.1～0.5％，淀粉酶为0.002～0.01％，其余为水；

补料方法按如下步骤进行：

(1)将阿维菌素发酵补料输送至补料罐中，升温至70～80℃进行液化45～50min，使部料罐内还原糖为1.5～1.7g/100ml，然后升温至110～130℃进行灭菌20～30min，最后降温至70～80℃，得灭菌后的液化补料，备用；

(2)发酵罐发酵周期进行到160～180h，发酵罐内总糖低于5.5～6.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料；发酵罐发酵周期进行到190～210h，发酵罐内总糖低于4.5～5.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料；发酵罐发酵周期进行到220～240h，发酵罐内总糖低于4.0～4.5g/100ml时，补加灭菌后的液化补料；每次补料按发酵罐内料液质量的1～3％补加。

本发明优选的，按各组分质量比之和百分之百计，淀粉为8-10％，硫铵为0.02-0.03％，酵母粉为0.2-0.3％，淀粉酶为0.008-0.01％。

进一步优选的，按各组分质量比之和百分之百计，淀粉为10％，硫铵为0.02％，酵母粉为0.2％，淀粉酶为0.01％。

本发明优选的，所述的淀粉酶α-淀粉酶。

本发明优选的，所述的酵母为啤酒酵母。α-淀粉酶、啤酒酵母均为普通市购产品。

本发明优选的，步骤(1)中灭菌压力为0.11～0.13MPa。

本发明优选的，灭菌后的液化补料的补加方式为批补。本发明的补料于发酵中后期进行，也即发酵周期进行到160～240h时，每隔24h测试发酵罐内总糖，当发酵周期进行到160～180h，发酵罐内总糖低于5.5～6.0g/100ml时，发酵罐发酵周期进行到190～210h，发酵罐内总糖低于4.5～5.0g/100ml时，发酵罐发酵周期进行到220～240h，发酵罐内总糖低于4.0～4.5g/100ml时，进行补加，高于此浓度时，无需进行补料。

进一步优选的，发酵罐发酵周期进行到160～180h，发酵罐内总糖低于6.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2％补加。

进一步优选的，发酵罐发酵周期进行到190～210h，发酵罐内总糖低于5.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2％补加。

进一步优选的，发酵罐发酵周期进行到220～240h，发酵罐内总糖低于4.5g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2％补加。

本发明意外发现，阿维菌素发酵补料提高了发酵水平和发酵效价，碳源、氮源不足则发酵产物较少，碳源过量则产生糖阻效应，而氮源过量则菌丝返青，回到初级代谢，影响产抗。碳源在发酵培养基中有两个主要功能，一是为微生物细胞的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分，二是为合成目的产物提供所需的碳成分。葡萄糖是最容易利用的碳源，并且是加速微生物生长的有效糖。但是葡糖糖的使用会产生葡糖糖效应，抑制某些代谢产物的合成；有时过多的葡萄糖会过分的加速菌体细胞的呼吸，导致发酵过程中溶解氧不足，使一些中间代谢产物积累，pH下降，影响某些酶活性，从而抑制微生物生长和产物合成。有些菌种淀粉酶活力较高可以使用淀粉作为碳源，从而以总糖水平作为补糖依据。许多品种发酵的残糖控制并不是整个周期都控制在一个水平，往往前期、中期控制残糖比较高而到后期控制较低，到放罐时残糖控制在较低水平，有利于下游产物提取。本发明通过阿维菌素发酵补料与补料方法有机结合，严格控制补料时间、补料量提高了发酵效价，使得阿维菌素生产水平有提高3-5％。

本发明的有益效果：

1.本工艺的料罐配比及补料时机恰当的补充了发酵所需的营养成分，有利于发酵产物合成，从而提高了发酵生产水平。

2.本工艺设备简单易行，所添加的物料用量小，有效提高了发酵生产水平，而且不对产品本身及下游产品的内在质量造成影响，具有明显的经济效益和推广价值。

附图说明

图1为不同淀粉浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，硫铵浓度为0.02％，酵母粉浓度为0.2％，淀粉酶浓度为0.01％，横坐标为淀粉浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价；

图2为不同硫铵浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，淀粉浓度为9％，酵母粉浓度为0.2％，淀粉酶浓度为0.01％，横坐标为硫铵浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价；

图3为不同酵母浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，淀粉浓度为9％，硫铵浓度为0.02％，淀粉酶浓度为0.01％，横坐标为酵母浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价；

图4为于阿维菌素发酵的中后期补加不同的补料对最终放罐效价的影响图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例所用的设备均为常规现有设备。

实施例中使用的原料，α-淀粉酶购自河北邢台万达生物工程有限公司，啤酒酵母购自湖北中农华威生物工程有限公司。

实施例1：

一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法，所需要的阿维菌素发酵补料由淀粉、硫铵、酵母粉、淀粉酶和水组成；其中，淀粉1000kg、硫铵2kg、啤酒酵母20kg，α-淀粉酶1kg，水8977kg，阿维菌素发酵补料总计：10吨。

补料方法按如下步骤进行：

(1)将淀粉、硫铵、酵母粉、α-淀粉酶和水混合后输送至补料罐中，升温至75℃进行液化50min，灭菌后取样测得还原糖1.65g/100ml；然后升温至120℃进行灭菌30min，最后降温至75℃，得灭菌后的液化补料，备用；

(2)发酵罐发酵周期进行到168h，测得发酵罐内总糖低于5.6g/100ml，补加灭菌后的液化补料；补料前发酵液重量120吨，补入2.4吨灭菌后的液化补料，补料后该罐放罐B1a的效价为6853μ/ml，与不补料、不作任何处理的对照罐相比，放罐时效价高于对照罐210μ/ml。

实施例2：

同实施例1的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，不同之处在于：

阿维菌素发酵补料：淀粉800kg、硫铵2kg、啤酒酵母20kg，α-淀粉酶0.8kg，水9177.2kg

步骤(1)灭菌后取样测得还原糖1.58g/100ml，

步骤(2)发酵罐发酵周期进行到216h，测得发酵罐内总糖低于5g/100ml，补入2吨灭菌后的液化补料，补料后该罐放罐B1a的效价为6934μ/ml，与不补料、不作任何处理的对照罐相比，放罐时效价高于对照罐264μ/ml。

实施例3：

同实施例1的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，不同之处在于：

阿维菌素发酵补料：淀粉600kg、硫铵1kg、啤酒酵母10kg，α-淀粉酶0.5kg，水9388.5kg

步骤(1)灭菌后取样测得还原糖1.58g/100ml，

步骤(2)发酵罐发酵周期进行到230h，测得发酵罐内总糖低于4.5g/100ml，补加灭菌后的液化补料；补料前发酵液重量120吨，补入2吨灭菌后的液化补料，补料后该罐放罐B1a的效价为7056μ/ml，与不补料、不作任何处理的对照罐相比，放罐时效价高于对照罐218μ/ml。

实验例一

选取十批发酵罐，采取不同淀粉浓度的阿维菌素发酵补料、不同硫铵浓度的阿维菌素发酵补料以及不同酵母浓度的阿维菌素发酵补料于发酵中后期(160-180h，190-210h，220-240h)进行补料实验，分别测定其效价及效价增幅，

效价测试方法：高效液相色谱法，按照国标GB 29696-2013规定的方法进行。

图1给出了不同淀粉浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，从图1中可以看出，淀粉浓度为6～10％的补料，阿维菌素效价涨幅达到峰值，当淀粉浓度为10％时效价涨幅最高。

图2给出了不同硫铵浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，从图2中可以看出，硫铵浓度为0.01～0.05％的补料，阿维菌素效价涨幅达到峰值，当硫铵浓度为0.02时，效价涨幅最高。

图3给出了不同酵母浓度的阿维菌素发酵补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到160～180h、190～210h、220～240h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，酵母浓度0.1～0.5％的补料，阿维菌素效价涨幅达到峰值，当酵母浓度为0.2％时，效价涨幅最高。

经过上述实验确定补料淀粉、硫铵、以及酵母的最优浓度，再将三种料按最优浓度混合(淀粉10％，硫铵0.02％，酵母粉0.2％，图中称之为混合料)，与只补一种料，只补两种料，作对比，测定其最终放罐效价，测试结果见图4所示，从图4中可以明显看出，补混合料发酵效价提高最为明显。

实验例二

1、不同时机补料对阿维菌素发酵总糖效价涨幅的影响：

分别在不同发酵周期，各选取几批总糖高于、低于标准值的发酵罐，进行补料、不补料对比，测定其补料后第二天效价涨幅，对照效果见下表1所示：

表1

由上表1可以看出，不同周期高于标准糖值补料效果不明显。

2、不同补料量对阿维菌素发酵总糖效价涨幅的影响：

分别在不同发酵周期，各选取发酵罐按不同补料量进行补料，测定其补料后第二天效价涨幅，对照效果见下表2所示：

表2

由上表2可以看出，按发酵质量2％的量补入效果最佳，通过阿维菌素发酵补料中各原料配比与补料方法有机结合，严格控制补料时间、补料量提高了发酵效价、阿维菌素生产水平。

Claims (5)

1.一种提高阿维菌素发酵水平的补料方法，所需要的阿维菌素发酵补料由淀粉、硫铵、酵母粉、淀粉酶和水组成；按各组分质量比之和百分之百计，其中，淀粉为8-10%，硫铵为0.02-0.03%，酵母粉为0.2-0.3%，α-淀粉酶为0.008-0.01%，其余为水；

补料方法按如下步骤进行：

（1）将阿维菌素发酵补料输送至补料罐中，升温至70～80℃进行液化45～50min，使部料罐内还原糖为1.5～1.7g/100ml，然后升温至110～130℃进行灭菌20～30min，最后降温至70～80℃，得灭菌后的液化补料，备用；

（2）发酵罐发酵周期进行到160～180h，发酵罐内总糖低于6.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2%补加；发酵罐发酵周期进行到190～210h，发酵罐内总糖低于5.0g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2%补加；发酵罐发酵周期进行到220～240h，发酵罐内总糖低于4.5g/100ml时，补加灭菌后的液化补料；补料按发酵罐内料液质量的1～3%补加。

2.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，其特征在于，按各组分质量比之和百分之百计，淀粉为10%，硫铵为0.02%，酵母粉为0.2%，淀粉酶为0.01%。

3.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，其特征在于，所述的酵母为啤酒酵母。

4.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，其特征在于，步骤（1）中灭菌压力为0.11～0.13MPa。

5.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，其特征在于，发酵罐发酵周期进行到220～240h，发酵罐内总糖低于4.5g/100ml时，补加灭菌后的液化补料，补料量按发酵罐内料液质量的2%补加。