CN110408668B - 一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，该方法将种子液经第一次转种接种至发酵罐培养基中通入空气进行发酵培养，一次转种后，当发酵周期进行到20h‑80h时接种种子液进行第二次转种，转种的种子液同第一次转种的种子液相同，第二次转种后继续通入空气发酵培养至放罐。本发明在阿维菌素的发酵过程中在进入次级代谢的时候将种子液二次转入发酵罐培养基中来刺激菌丝的活性，使发酵液中进入新的代谢能力旺盛的菌丝，延缓菌丝自溶导致的菌丝量的减少。同时新的菌丝中酶的活性刺激代谢低的活性从而提高发酵液的产抗能力，提高发酵生产中发酵液放罐效价。

Description

一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，具有结构新颖、农畜两用的特点，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。阿维菌素是一种常见的农药制剂，广泛应用于农业，作为杀虫剂，用于防治十字花科小菜蛾、梨树梨木虱、棉花红蜘蛛、柑橘潜叶蛾锈壁虱、棉花棉铃虫、苹果树桃小食心虫和二斑叶螨、菜青虫等。
阿维菌素是胞内产物，所以菌丝体的多少直接关系到最终的放罐效价。发酵过程是菌丝的一个生长代谢逐步衰亡的一个过程，伴随着发酵周期的延长菌丝体逐步开始自溶，菌丝的代谢能力逐步下降。因此，发酵周期越长，一方面会导致菌丝体减少，使得最终可能达到的效价值降低。另一方面随着代谢的进行菌丝体的酶的活性减弱，代谢的能力下降从而影响最终的产量。
目前，阿维菌素发酵过程中采取的是一次转种，整个过程中工艺条件不变，容易导致菌丝代谢能力降低，菌丝自溶导致菌丝量大幅度减少，使最终的放罐效价大大降低。
发明内容
针对现有的阿维菌素发酵放罐效价低的缺陷，本发明提供一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，包括步骤如下：
1)将阿维菌素菌种接种于基础培养基中，在温度25-30℃，搅拌条件下通入空气培养44-48小时，得种子液；
2)将步骤1)的种子液经第一次转种接种至发酵罐培养基中通入空气进行发酵培养，
3)一次转种后，当发酵周期进行到20h-80h时接种种子液进行第二次转种，转种的种子液同第一次转种的种子液相同，第二次转种后继续通入空气发酵培养至放罐。
根据本发明优选的，步骤1)中，培养条件为：培养温度为28℃，通入空气的流量与基础培养基重量比为0.7-0.9：1，培养压力为0.01mpa，搅拌转速为80-100rpm/min。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述的基础培养基按体积百分比计，组分如下：淀粉10-15％，酵母粉0.5-1.5％，豆饼粉1.0-3.0％，碳酸钙0.05-0.15％，硫酸铵0.03-0.05％，氯化钴0.001％-0.003，钼酸钠0.001％-0.003％，硫酸锰0.001-0.003％，淀粉酶0.005-0.0167％，其余为水。
根据本发明优选的，步骤2)中，发酵培养条件：发酵温度为26-30℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为50-80rpm/min，第一次转种量为发酵罐培养基重量的1-6％；通入空气的流量与发酵液重量比为1.0-1.2：1。此处的发酵液重量为转种的种子液与发酵罐培养基的重量之和。
根据本发明优选的，步骤3)中，一次转种后，当发酵周期进行到60h-65h时进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的1-6％。
最为优选的，步骤3)中，一次转种后，当发酵周期进行到60h时进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的2％。
根据本发明优选的，步骤3)中，二次转种后发酵条件为：发酵温度为26-30℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为50-80rpm/min，通入空气的流量与发酵液重量比为1.0-1.2：1。此处的发酵液重量为转种的种子液与一次转种后发酵得到的发酵液的重量之和。
本发明的发酵罐培养基为阿维菌菌素发酵培养中常用的培养基。
本发明意外发现，本发明的二次转种可以大大提高放罐效价，随意二次转种存在风险，会造成菌丝的二次生长(通俗的说法为菌丝返青)菌丝从次级代谢回到初级代谢，从而菌丝体不产抗达到相反的效果。因此，本发明的二次转种时机及转种量使发酵液中进入新的代谢能力旺盛的菌丝，延缓菌丝自溶导致的菌丝量的减少。同时新的菌丝中酶的活性刺激代谢低的活性从而提高发酵液的产抗能力。
本发明的优点如下：
1、本发明在阿维菌素的发酵过程中在进入次级代谢的时候将种子液二次转入发酵罐培养基中来刺激菌丝的活性，使发酵液中进入新的代谢能力旺盛的菌丝，延缓菌丝自溶导致的菌丝量的减少。同时新的菌丝中酶的活性刺激代谢低的活性从而提高发酵液的产抗能力，提高发酵生产中发酵液放罐效价。
2、本发明的发酵方法简单易行，所添加的物料用量小，有效的提高了生产水平，而且该工艺不会对产品本身及下游产品的内在质量造成影响，具有明显的经济效益和推广价值。
附图说明
图1为在不同周期进行二次转种，发酵罐发酵过程中粘度变化曲线图；
图2为在不同周期进行二次转种，发酵罐发酵过程中菌浓变化曲线图；
图3为在不同周期进行二次转种，发酵罐发酵过程中总糖变化曲线图；
图4为当发酵进行到20h、40h、60h、80h时进行二次转种以及不进行二次转种对放罐效价影响的柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施所用设备均为常规现有设备。
实施例中采用的基础培养基按体积百分比计，组分如下：淀粉10-15％，酵母粉0.5-1.5％，豆饼粉1.0-3.0％，碳酸钙0.05-0.15％，硫酸铵0.03-0.05％，氯化钴0.001％-0.003，钼酸钠0.001％-0.003％，硫酸锰0.001-0.003％，淀粉酶0.005-0.0167％，其余为水。
实施例1
一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，包括步骤如下：
1)将阿维菌素菌种接种于基础培养基中，在温度为28℃，压力为0.01mpa，搅拌转速为80rpm/min下通入空气培养46小时，得种子液；通入空气的流量与基础培养基重量的比为0.8：1，
2)将步骤1)的种子液经第一次转种接种至发酵罐培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：温度26℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为60rpm/min，通入空气进行发酵；第一次转种量为发酵罐培养基重量的2％；通入空气的流量与发酵液重量比为1.2：1；
3)一次转种后，当发酵周期进行到60h时接种步骤1)的种子液进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的2％，第二次转种后继续发酵培养至放罐，二次转种后发酵条件：温度为28℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为60rpm/min，通入空气进行发酵；通入空气的流量与发酵液重量比为1.2：1。
实施例2
一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，包括步骤如下：
1)将阿维菌素菌种接种于基础培养基中，在温度为29℃，压力为0.01mpa，搅拌转速为60rpm/min下通入空气培养46小时，得种子液；通入空气的流量与基础培养基重量比为0.9：1，
2)将步骤1)的种子液经第一次转种接种至发酵罐培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：温度28℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为80rpm/min，通入空气进行发酵；第一次转种量为发酵罐培养基重量的3％；通入空气的流量与发酵液重量比为1.3：1；
3)一次转种后，当发酵周期进行到65h时接种步骤1)的种子液进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的3％，第二次转种后继续发酵培养至放罐。二次转种后发酵条件：温度为28℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为80rpm/min，通入空气进行发酵；通入空气的流量与发酵液重量比为1.3：1。
实验例1
选取十批发酵罐，采取当发酵进行到20h、40h、60h、80h时进行二次转种以及不进行二次转种进行发酵生产阿维菌素，测试放罐效价，测试结果如图4所示，效价测试方法：高效液相色谱法，按照国标GB 29696-2013规定的方法进行。
从图4可以明显看出，发酵过程中采取二次转种可以明显提高效价，而不进行二次转种进行发酵生产阿维菌素最终放罐时的效价明显低于本发明的；当发酵进行到60h时进行二次转种，放罐效价最高。
实验例2
二次转种不同时机及不同转种量正交后对最终放罐效价的影响，结果见下表1所示：
表1
二次转种量 20h 40h 60h 80h
1％ 6022 6137 6203 6192
1.50％ 6175 6217 6334 6228
2％ 6182 6268 6466 6244
2.50％ 6078 6143 6258 6177
实验例3
选取十批发酵罐，当发酵进行到20h、40h、60h、80h时进行二次转种进行发酵生产阿维菌素，测试不同时机进行二次转种对发酵过程中粘度、菌浓及总糖的影响，测试结果如图1-图3所示。
从图1-图3中可以看出，当发酵进行到60h时进行二次转种效果最佳，粘度最大，菌浓最高。

Claims (7)

1.一种提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，包括步骤如下：
1)将阿维菌素菌种接种于基础培养基中，在温度25-30℃，搅拌条件下通入空气培养44-48小时，得种子液；
2)将步骤1)的种子液经第一次转种接种至发酵罐培养基中通入空气进行发酵培养，
3)一次转种后，当发酵周期进行到20h-80h时接种种子液进行第二次转种，转种的种子液同第一次转种的种子液相同，第二次转种后继续通入空气发酵培养至放罐。
2.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤1)中，培养条件为：培养温度为28℃，通入空气的流量与基础培养基重量比为0.7-0.9：1，培养压力为0.01mpa，搅拌转速为80-100rpm。
3.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤1)中，所述的基础培养基按体积百分比计，组分如下：淀粉10-15％，酵母粉0.5-1.5％，豆饼粉1.0-3.0％，碳酸钙0.05-0.15％，硫酸铵0.03-0.05％，氯化钴0.001％-0.003，钼酸钠0.001％-0.003％，硫酸锰0.001-0.003％，淀粉酶0.005-0.0167％，其余为水。
4.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤2)中，发酵培养条件：发酵温度为26-30℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为50-80rpm，第一次转种量为发酵罐培养基重量的1-6％；通入空气的流量与发酵液重量比为1.0-1.2：1。
5.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤3)中，一次转种后，当发酵周期进行到60h-65h时进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的1-6％。
6.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤3)中，一次转种后，当发酵周期进行到60h时进行第二次转种，第二次转种量为发酵液重量的2％。
7.根据权利要求1所述的提高阿维菌素发酵液放罐效价的发酵方法，其特征在于，步骤3)中，二次转种后发酵条件为：发酵温度为26-30℃，发酵压力为0.03mpa，搅拌转速为50-80rpm，通入空气的流量与发酵液重量比为1.0-1.2：1。
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