CN112662719B - 一种阿维菌素的生产方法、其产品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域,具体涉及一种阿维菌素的生产方法,其产品及应用。本发明的方法中在发酵培养基中添加有二价铜离子的可溶性盐,并在发酵过程中补加液化淀粉。本发明的生产方法显著提高阿维发酵水平,同时大幅提高了发酵液中阿维菌素B1a的比例。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体涉及一种阿维菌素的生产方法,其产品及应用。
背景技术
阿维菌素,英文名称Avermectins,是由日本北里大学大村智和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物,具有结构新颖、农畜两用的特点,由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。其杀虫作用是通过刺激神经末梢释放神经传导抑制GABA,从而抑制神经传导至死。而以GABA作传导介质的神经仅存在于哺乳动物的中枢神经系统,正常使用剂量下由于血脑屏障的作用,其进入中枢神经系统的数量很少不会引起中毒,阿维菌素类药物安全指数可达8~10,符合理想抗寄生虫药的安全性要求,在自然环境中阿维菌素与土壤结合紧密,不易被冲刷和下渗,而且在光照条件下或在土壤微生物作用下迅速降解成无活性的化合物,其分子碎片最终作为碳源被植物和微生物分解利用,没有任何残留毒性,具有高效、低毒、广谱的用药特性,成为当今最受关注的生物杀虫杀螨剂之一,被农业部作为推荐使用的高效低毒的农药产品。
阿维菌素共含有8个组分,其组分中作用的效果以B1组分最佳,其杀虫活性最高,而毒性最小。B1中B1a的活性又远远高于B1b活性,B1a可作为前体合成伊维菌素,伊维菌素毒性更低,且比较稳定,己成为重要的动物健康药并用于治疗人体盘尾丝虫病,产品在国际市场上有很强的竞争力,生产中只有高B1a比例的阿维菌素才能用于合成伊维菌素,现发酵产物中B1a比例一般在94~95%。因此,提高阿维菌素B1a比例意义重大。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种阿维菌素的生产方法。
本发明的第二发明目的在于提出采用该方法生产得到的阿维菌素。
本发明的第三发明目的在于提出该方法在提高发酵液中阿维菌素B1a比例中的应用。
为了完成本发明的目的,采用的技术方案为:
本发明涉及一种阿维菌素的生产方法,至少包括以下步骤:
S1、将生产阿维菌素的菌种接种于种子培养基,进行种子培养,得到种子液;
S2、将所述种子液接种于发酵培养基中,进行发酵,得到含阿维菌素的发酵液;所述发酵培养基中添加有二价铜离子的可溶性盐,在所述发酵过程中补加液化淀粉;所述二价铜离子的可溶性盐的加入量为所述发酵培养基质量的0.01~0.1%,优选为0.05%;
优选的,发酵100~140小时后加入液化淀粉,然后继续发酵100~140小时;
优选的,所述二价铜离子的可溶性盐选自硫酸铜或氯化铜。
可选的,在S1中,所述接种的条件为:斜面孢子的接种量为0.8*0.8cm的成熟孢子斜面块,优选的种子培养基的装量体积为培养瓶体积的5~10%,优选6.7%。
在S1中,所述种子培养的条件为:温度为27~29℃、湿度为30~60%、转速为220~240rpm、时间为35~45小时,得到种子液;
所述转速优选为220rpm,培养的时间优选为40小时。
可选的,所述种子培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉3.0~5.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.5~0.7%、棉籽饼粉0.1~0.3%、酵母粉1.0~1.2%、酵母膏0.4~0.6%、氯化钴0.003~0.005%,余量为水;
优选为:玉米淀粉4.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.6%、棉籽饼粉0.2%、酵母粉1.2%、酵母膏0.5%、氯化钴0.004%,余量为水;
所述发酵培养基的pH进一步优选为7.5~8.5。
可选的,在S2中,所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的4~6%,优选为5%;
优选的,发酵培养基的装量体积为培养瓶体积的6~12%,优选8%。
可选的,在S2中,所述发酵的条件为:温度27~29℃、湿度30~60%,转速220~240rpm。
可选的,所述发酵培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉11~13.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.7~0.9%、酵母粉0.3~0.5%、酵母膏0.2~0.4%、氯化钴0.003~0.005%、钼酸钠0.015~0.02%、硫酸锰0.001~0.003%、硫酸铵0.01~0.03%、碳酸钙0.02~0.04%、GPE 0.1~0.3%、有机硅0.1~0.3%、淀粉酶0.003~0.006%,余量水;
优选为:玉米淀粉12.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.8%、酵母粉0.4%、酵母膏0.3%、氯化钴0.004%、钼酸钠0.018%、硫酸锰0.002%、硫酸铵0.02%、碳酸钙0.03%、GPE 0.2%、有机硅0.2%、淀粉酶0.0048%,余量水;
所述发酵培养基的pH进一步优选为7.2~7.6;
和/或,所述发酵培养基配置后经121℃灭菌35min后使用。
可选的,所述液化淀粉的体积为所述发酵液体积的4~6%,优选5%;
所述液化淀粉的质量百分比浓度为25~35%,优选30%;
和/或,所述液化淀粉为单次加入;
和/或,所述液化淀粉的DE值为20~25%。
本发明还涉及一种采用上述的方法制备得到的阿维菌素。
本发明还涉及上述方法在用于提高发酵液中阿维菌素B1a比例中的应用。
本发明的技术效果至少包括:
本发明的生产方法显著提高阿维发酵水平,同时大幅提高了发酵液中阿维菌素B1a的比例,经实验证实,本发明的条件下阿维菌素水平提高至7500u,B1a的比例由92%提高到了98%。
附图说明
图1为实施例2的菌体形态图;
图2为对比例1的菌体形态图;
图3为对比例3的菌体形态图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。下述实施例中未注明的具体技术或条件,均为常规技术或条件,或按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。
本发明实施例提出一种阿维菌素的发酵生产方法,该方法能提高阿维发酵水平,同时大幅提高阿维菌素B1a的比例,至少包括以下步骤:
S1、将生产阿维菌素的菌种接种于种子培养基,进行种子培养,得到种子液;
S2、将种子液接种于发酵培养基中,进行发酵,得到含阿维菌素的发酵液;发酵培养基中添加有二价铜离子的可溶性盐,在发酵过程中补加液化淀粉;二价铜离子的可溶性盐的加入量为发酵培养基质量的0.01~0.1%。
本发明实施例的二价铜离子的可溶性盐的加入对发酵成球形态起到了影响,发酵菌球边缘菌丝增加,增加了对溶解氧的接触面及吸收效率,从而改进菌球中心的供氧效率,使得阿维菌素B1a的比例得到大大提高。同时在发酵运行至中期加入液化淀粉,促进菌体代谢活力延续高强度次级代谢,发酵全程代谢平稳,两者协同作用,使阿维菌素水平达7500u,B1a的比例可达98%。
二价铜离子的加入对发酵成球形态起到了影响,本发明实施例中二价铜离子可溶性盐的加入量优选为发酵培养基质量的0.05%,发酵菌球边缘菌丝增加,增加了对溶解氧的接触面及吸收效率,从而改进菌球中心的供氧效率,使得阿维菌素B1a的比例得到大大提高。通过研究发现,如果二价铜离子的可溶性盐含量过高,则对菌体有毒害作用,抑制菌体生长,如果过低则起不到积极作用。
本发明实施例中,在发酵100~140小时后总糖、还原糖下降,菌体代谢淀粉能力下降,此时加入液化淀粉,然后继续发酵100~140小时。经研究发现,发酵基础料含12%淀粉,进一步加量会抑制早期代谢同时增加灭菌难度,采取过程补加利于发酵长周期控制,如果液化淀粉加入过早则菌体增殖过快,造成溶氧下降,进而引起发酵代谢异常,如果加入过晚则菌体因大量衰老无法充分吸收利用,一方面造成原料的浪费,另一方面造成培养基pH降低进而影响菌体正常代谢,优选的,在发酵110~130小时后加入液化淀粉,然后继续发酵110~130小时,更进一步优选的,在发酵120小时后加入液化淀粉,然后继续发酵120小时。
其中,液化淀粉的质量百分比浓度为25~35%,液化淀粉的体积为发酵液体积的4~6%,如果加入量过大则造成培养基pH降低进而影响菌体正常代谢。如果加入量过小则无法满足后期菌体代谢需要,达不到提升发酵水平的效果,并优选5%。更优选的,液化淀粉的DE值为20~25%,液化强度高的液化淀粉利于菌体利用,DE值为20~25%与补入时发酵液还原糖:总糖比例相当,不改变培养基结构比对发酵无负面影响,液位淀粉的补入补充了菌体代谢所限碳源,延续了菌体代谢高活力。
本发明实施例中,液化淀粉的补加方式为单次加入,不仅便于操作,并且技术优势为一次补足菌体所需碳源,有利于菌体代谢最佳状态的维持,同时减少过程操作,降低无菌风险。
其中,本发明实施例的培养方式适用于灰色链霉菌,本发明实施例中的灰色链霉菌和阿维菌素标准品均为市售,阿维菌素标准品购自中国兽药监察所。
在本发明实施例的步骤S1中,接种的条件为:斜面孢子的接种量为0.8*0.8cm的成熟孢子斜面块,种子培养基的装量体积为培养瓶体积的5~10%,优选6.7%,并优选采用体积为750mL装液50mL。
本发明实施例的步骤S1中,种子培养的条件为:温度为27~29℃、湿度为30~60%、转速为220~240rpm、时间为35~45小时,得到种子液;
进一步的,转速优选为220rpm,培养的时间优选为40小时。如果转速过高则不利于菌丝结球,菌丝成散菌丝,导致代谢偏离、水平低。过低则无法满足菌体生长所需溶氧。种子培养时间过长则菌丝过老,接发酵后延迟期长,发酵后劲不足,培养时间过短则菌丝未达到对数生长后期,菌丝量少、接种量不足,影响发酵代谢。
进一步的,本发明实施例中的种子培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉3.0~5.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.5~0.7%、棉籽饼粉0.1~0.3%、酵母粉1.0~1.2%、酵母膏0.4~0.6%、氯化钴0.003~0.005%,余量为水;优选为:玉米淀粉4.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.6%、棉籽饼粉0.2%、酵母粉1.2%、酵母膏0.5%、氯化钴0.004%,余量为水;发酵培养基的pH进一步优选为7.5~8.5。本发明实施例对种子培养基进行了筛选,发现在该培养基条件下菌丝生长速度快,菌丝舒展及结球状态最佳。
进一步的,本发明实施例中的种子液的接种量为发酵培养基体积的4~6%,优选为5%;本发明实施例通过研究发现,技术优势为节省种子液、可同步接多个发酵瓶,数据稳定、提高可对比性及可操作性,且发酵水平最高、下瓶参数稳定。
优选的,发酵培养基的装量体积为培养瓶体积的6~12%,优选8%。
在本发明实施例的步骤S2中,发酵的条件为:温度27~29℃、湿度30~60%,转速220~240rpm。
进一步的,本发明实施例中的发酵培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉11~13.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.7~0.9%、酵母粉0.3~0.5%、酵母膏0.2~0.4%、氯化钴0.003~0.005%、钼酸钠0.015~0.02%、硫酸锰0.001~0.003%、硫酸铵0.01~0.03%、碳酸钙0.02~0.04%、GPE 0.1~0.3%、有机硅0.1~0.3%、淀粉酶0.003~0.006%,余量水;优选为:玉米淀粉12.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.8%、酵母粉0.4%、酵母膏0.3%、氯化钴0.004%、钼酸钠0.018%、硫酸锰0.002%、硫酸铵0.02%、碳酸钙0.03%、GPE 0.2%、有机硅0.2%、淀粉酶0.0048%,余量水;发酵培养基的pH进一步优选为7.2~7.6。本发明实施例对发酵培养基进行了筛选,发现在该培养基条件下发酵水平、B1a比例达到最佳。
具体的,发酵培养基配置后经121℃灭菌30~35min后使用。
本发明实施例还涉及一种采用上述的方法制备得到的阿维菌素。采用本发明实施例制备得到的发酵液中,阿维菌素水平提高至7500u,B1a的比例可达98%。
本发明实施例还涉及上述方法在用于提高发酵液中阿维菌素B1a比例中的应用。
本发明实施例中,阿维菌素测量采用液相法,具体步骤为:
1、样品溶液制备:将阿维菌素发酵液放罐样放至室温,用电子天平称取,记下称量克数(G1),然后将发酵液摇匀移入250mL容量瓶中,将空样品盒再次放入电子天平上称量,记下重量(G2),计算发酵液的称量克数m,用甲醇稀释摇匀,静置20分钟,用甲醇定容至刻度,摇匀,移入具塞三角瓶中,磁力搅拌20分钟,吸取5ml悬浮液于100ml碘量瓶中,加入45mL甲醇,超声波中超声20分钟,摇匀冷却,取上清液用0.45μm微孔滤膜后得样品溶液。
2、进样测量
系统适用性试验检测符合要求后,分别注入等体积(约20μL)的样品溶液到高效液相色谱仪中,记录色谱图。
B1a=XvB1a×CRB1a×D/XsB1a
B1=(Xv(B1a+B1b)×CR(B1a+B1b)×D)/Xs(B1a+B1b)
比例(%)=B1a效价/B1效价×100%
其中:
XvB1a:样品溶液中B1a的峰面积;
XsB1a:样品溶液中B1a的峰面积;
CRB1a:阿维菌素标准品溶液中B1a的浓度(ug/mL);
Xv(B1a+B1b):样品溶液中(B1a+B1b)的峰面积;
Xs(B1a+B1b):样品溶液中(B1a+B1b)的峰面积;
CR(B1a+B1b):阿维菌素标准品溶液中(B1a+B1b)的浓度(ug/mLl);
D:样品溶液稀释倍数=[250×(5+45)]/(m×5);
m:样品称量克数g(G1-G2)。
实施例1
一、培养基配置及培养工艺
(一)、种瓶培养
1、种子培养基按质量百分比的组成为:
玉米淀粉4.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.6%、酵母粉1.2%、酵母膏0.5%、氯化钴0.004%,棉籽饼粉0.2%,pH7.5~8.5;纯化水配制,121℃灭菌30min。
2、控制工艺
斜面孢子的接种量为0.8*0.8cm的成熟孢子斜面块,种瓶培养基的装量为750mL装液50mL。在温度28.0±1℃、湿度30-60%、转速220rpm的条件下培养40hr,得到种子液;
培养40h指标见表1所示:
表1
(二)、发酵培养
1、发酵培养基按质量百分比的组成为:
玉米淀粉12.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.8%、酵母粉0.4%、酵母膏0.3%、氯化钴0.004%、钼酸钠0.018%、硫酸锰0.0020%、硫酸铵0.02%、碳酸钙0.03%、GPE0.2%、有机硅0.2%、淀粉酶0.0048%,氯化铜0.01%,余量水,pH7.2~7.6;121℃灭菌35min。
2、控制工艺
种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵培养基体积的5%,发酵瓶培养基的装量为750mL装液60mL,在温度28.0±1℃、湿度30~60%,转速220~240rpm的条件下培养120hr,补加液化淀粉,液化淀粉的质量百分比浓度为30%,液化淀粉的体积为发酵液体积的5%,DE值为20-25%,继续培养120h,即得到含阿维菌素的发酵液。
实施例2
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基添加了0.05%的氯化铜,菌体形态如图1所示。
实施例3
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基添加了0.1%的氯化铜。
实施例4
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵80小时后补加液化淀粉。
实施例5
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵160小时后补加液化淀粉。
实施例6
按实施例1方法进行制备,不同处在于:液化淀粉的体积为发酵液体积的2%。
实施例7
按实施例1方法进行制备,不同处在于:液化淀粉的体积为发酵液体积的8%。
实施例8
按实施例1方法进行制备,不同处在于:发酵80小时后补加液化淀粉体积为发酵液体积的2.5%,发酵160小时后再补加液化淀粉体积为发酵液体积的2.5%。
实施例9
按实施例1方法进行制备,不同处在于:发酵培养基配方不同,如下:
玉米淀粉13.0%、热榨豆饼粉1.2%、花生饼粉0.8%、酵母粉0.5%、酵母膏0.3%、氯化钴0.004%、钼酸钠0.018%、硫酸锰0.002%、硫酸铵0.02%、碳酸钙0.02%、GPE0.2%、有机硅0.2%、淀粉酶0.0048%,余量水;优选为:玉米淀粉12.0%、热榨豆饼粉1.0%、花生饼粉0.8%、酵母粉0.4%、酵母膏0.3%、氯化钴0.004%、钼酸钠0.018%、硫酸锰0.002%、硫酸铵0.02%、碳酸钙0.03%、GPE 0.2%、有机硅0.2%、淀粉酶0.0048%,余量水;pH7.2~7.6;121℃灭菌35min。
对比例1
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基不添加氯化铜。菌体形态如图2所示。
对比例2
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基添加了0.01%的硫酸亚铁。
对比例3
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基添加了0.05%的硫酸亚铁。菌体形态如图3所示。
对比例4
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵培养基添加了0.1%的硫酸亚铁。
对比例5
按实施例1方法进行制备,不同处在于发酵过程中不补加液化淀粉。
将上述实施例和对比例按上述方法检测发酵瓶效价,检测结果如表2所示。
表2
发酵组 | 发酵水平100% | B1a比例 | 提升率(%) |
对比例1 | 7485 | 92.0% | 0.0% |
实施例1 | 7522 | 94.0% | 2.0% |
实施例2 | 7478 | 98.0% | 6.0% |
实施例3 | 6878 | 98.5% | 6.5% |
实施例4 | 7078 | 93.6% | 1.6% |
实施例5 | 7106 | 94.1% | 2.1% |
实施例6 | 7127 | 94.5% | 2.5% |
实施例7 | 7206 | 93.9% | 1.9% |
实施例8 | 7325 | 94.9% | 2.9% |
实施例9 | 7006 | 91.9% | -0.1 |
对比例2 | 7518 | 92.5% | 0.5% |
对比例3 | 7245 | 92.0% | 0.0% |
对比例4 | 6870 | 92.1% | 0.1% |
对比例5 | 6543 | 91.8% | -0.2% |
由表2可见,改发酵方法阿维发酵水平可达7500u工艺水平,培养基添加无机盐对阿维B1a代谢产生影响,有资料显示高等生物中氧的专递借助铁元素进行,而低等生物中借助铜元素进行,此发明在微生物发酵中添加了氯化铜,也起到了改善了氧传递的效果,菌体形态变化见图1~3所示。
结球是进入次级代谢的关键,结球散菌丝初级代谢旺盛,营养消耗快,B1a比例高但水平低,收球紧菌体快速进入次级代谢,但不利于发酵液中溶氧向球心传递,导致中心菌体缺氧,影响B1a的合成转化,发酵B1a比例低,出现杂质升高、质量低问题,同时影响提炼纯化处理。铁、铜离子的添加,对阿维菌素菌体形态产生了影响,此形象的发现为不同配比条件下形态的控制奠定了基础和调控手法,在一定量添加范围不影响发酵水平,但能提高阿维菌素B1a的比例,本发明在发酵培养方法利于发酵早期快速生长、成球,中期补加高DE至液化淀粉促进了代谢整体加强,效价水平提高至7500u,而培养基中添加0.05%氯化铜后控制成球形状提高溶氧传递,阿维发酵B1a比例由92%提高到了98%,提升明显。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种阿维菌素的生产方法,其特征在于,至少包括以下步骤:
S1、将生产阿维菌素的菌种接种于种子培养基,进行种子培养,得到种子液;
S2、将所述种子液接种于发酵培养基中,进行发酵,得到含阿维菌素的发酵液;所述发酵培养基中添加有二价铜离子的可溶性盐,在所述发酵过程中补加液化淀粉;所述二价铜离子的可溶性盐的加入量为所述发酵培养基质量的0.01~0.1%;
其中,发酵100~140小时后加入液化淀粉,然后继续发酵100~140小时;
所述二价铜离子的可溶性盐为氯化铜;
所述发酵培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉11~13.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.7~0.9%、酵母粉0.3~0.5%、酵母膏0.2~0.4%、氯化钴0.003~0.005%、钼酸钠0.015~0.02%、硫酸锰0.001~0.003%、硫酸铵0.01~0.03%、碳酸钙0.02~0.04%、GPE 0.1~0.3%、有机硅0.1~0.3%、淀粉酶0.003~0.006%,余量水。
2.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,在S1中,所述接种的条件为:斜面孢子的接种量为0.8*0.8cm的成熟孢子斜面块;
种子培养基的装量体积为培养瓶体积的5~10%。
3.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,在S1中,所述种子培养的条件为:温度为27~29℃、湿度为30~60%、转速为220~240rpm、时间为35~45小时,得到种子液。
4.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,所述种子培养基的质量百分比的组成为:玉米淀粉3.0~5.0%、热榨豆饼粉0.8~1.2%、花生饼粉0.5~0.7%、棉籽饼粉0.1~0.3%、酵母粉1.0~1.2%、酵母膏0.4~0.6%、氯化钴0.003~0.005%,余量为水;
所述发酵培养基的pH为7.5~8.5。
5.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,在S2中,所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的4~6%;
发酵培养基的装量体积为培养瓶体积的6~12%。
6.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,在S2中,所述发酵的条件为:温度27~29℃、湿度30~60%,转速220~240rpm。
7.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,所述发酵培养基的pH为7.2~7.6;
和/或,所述发酵培养基配置后经121℃灭菌35min后使用。
8.根据权利要求1所述的生产方法,其特征在于,所述液化淀粉的体积为所述发酵液体积的4~6%;
所述液化淀粉的质量百分比浓度为25~35%;
和/或,所述液化淀粉为单次加入;
和/或,所述液化淀粉的DE值为20~25%。
9.如权利要求1~8任一项所述的方法在用于提高发酵液中阿维菌素B1a比例中的应用。
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