CN116407570A - 一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物及其应用 - Google Patents
一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物涉及微生物的应用技术领域，由嗜酸乳杆菌LA‑G80和两歧双歧杆菌BB‑G90复合而成。本发明提供的嗜酸乳杆菌LA‑G80、两歧双歧杆菌BB‑G90复合益生菌组合物能对小鼠肉瘤180(S180)具有明显得抑制作用，对带有艾氏癌腹水型(EAC)‑‑腹水瘤的小鼠具有延长生命的作用。从而有利人体健康和预防肿瘤的发生。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的应用技术领域，特别涉及一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物及其应用。
背景技术
肿瘤往往令人细思极恐，尤其是涉及到恶性肿瘤时，大多谈之色变。目前在恶性肿瘤的治疗方面，往往还是非常被动的。一些药物、手段，往往副作用、副反应大。而且，很多肿瘤的发现，往往已经是到了中晚期，预后不佳。
预防医学的发展，目的就是为了“治未病”，或者说将疾病的苗头扼杀在萌芽状态之中。另外，食疗作为药物、手术等治疗手段的有益补充，往往比之更加温和，并且副作用、副反应小，也成为一种日久弥新的延年益寿的手段。
本发明正是基于食疗与预防医学为出发点，开发出一种有利于抗肿瘤作用的益生菌组合物，为消费者带来维护健康的新手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物及其应用，该益生菌组合物对小鼠肉瘤180(S180)具有明显得抑制作用。对带有艾氏癌腹水型(EAC)--腹水瘤的小鼠具有延长生命的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案 ：
一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物，由嗜酸乳杆菌LA-G80和两歧双歧杆菌BB-G90复合而成，所述嗜酸乳杆菌LA-G80的分类名为嗜酸乳杆菌LA-G80（Lactobacillusacidophilus LA-G80），保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2013337，保藏时间为2013年7月16日；所述的两歧双歧杆菌BB-G90的分类名为两歧双歧杆菌BB-G90（Bifidobacterium bifidum BB-G90），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013194，保藏时间为：2013年5月9日。
本发明还具有以下附加技术特征：
本发明还提供上述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用。
优选的，所述益生菌组合物为含有嗜酸乳杆菌LA-G80、两歧双歧杆菌BB-G90、及添加常规辅料制备成食品、药品或保健品。
优选的，所述益生菌组合物为含有嗜酸乳杆菌LA-G80、两歧双歧杆菌BB-G90活菌制备成的复合益生菌粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、液体制剂或胶囊剂。
所述胶囊中可以含有辅料，所述辅料为食品上和(或)药学上可接受的辅料。
优选的，所述上述每粒胶囊成品出厂时含有活菌数50亿以上。
优选的，所述上述胶囊的净含量为0.18~0.25g/粒。
优选的，所述益生菌组合物具体的制备步骤为：
（1）制备嗜酸乳杆菌LA-G80冻干菌粉；
（2）制备两歧双歧杆菌BB-G90冻干菌粉；
（3）将步骤（1）和步骤（2）得到的菌粉按活菌数量比混合后添加辅料按照常规方法制备成食品、药品或保健品；
所述步骤（1）中菌粉的制备过程包括菌种活化、种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎；
所述步骤（2）中菌粉的制备过程包括菌种活化，种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎等。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中菌粉均为将发酵后收集到的菌体与基础保护剂按照质量比1:5混合后置于温度为-45℃中冻干后粉碎而成，所述菌体的基础保护剂为20％wt脱脂乳粉+5％wt蔗糖+75％wt水。
具体的，所述嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉的获得方法如下：
嗜酸乳杆菌LA-G80，获取来源：广西巴马地区健康老人。
嗜酸乳杆菌LA-G80，保藏编号CCTCC NO:M2013337，典藏时间，2013年7月16日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学。
嗜酸乳杆菌LA-G80的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行相对厌氧培养。培养温度为35-39℃。优选37-39℃。进一步可优先37~38℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加质量体积分数为0~0.6%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制pH值。发酵罐采用通入非氧气不活泼气体（如纯度在99%以上的氮气等等），并保持罐压为0.02-0.1MPa。优选0.03-0.08MPa罐压条件下培养。发酵起始pH值控制在6.8±0.2范围内，后期发酵过程的pH值控制在5.2±0.2范围内，偏酸时采用碱液（如20%~25%的氢氧化钠或氨水中的一种或二种）流加控制，使得pH值控制在5.2±0.1范围内。在菌体繁殖生长的稳定期初期，结束发酵。
嗜酸乳杆菌LA-G80发酵罐用的基础培养基：葡萄糖，2~6%；牛肉浸粉，0.5~1%；蛋白胨，0.6~1%；酵母膏，0.5~1.5%；无水乙酸钠，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.025~0.05%；一水硫酸锰，0.005~0.01%，L半胱氨酸盐酸盐0.03~0.08%，碳酸钙，0.3~0.8%，其余为水，以上均按质量分数计。
发酵结束后，将发酵液降温，然后收集菌体，通常可采用离心的方法获得菌体。
菌体的基础保护剂为20%脱脂乳粉+5%蔗糖。在考虑规避过敏性物料的情况下，采用海藻糖，菊粉、低聚果糖、蔗糖等非乳基及过敏性原料的组合物作为菌体保护剂。
将保护剂与菌体混合均匀，得到乳化液。
将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）中，进行真空低温冷冻干燥。获得菌饼。
菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。
具体的，所述两歧双歧杆菌BB-G90菌粉的获得方法如下：
两歧双歧杆菌BB-G90，获取来源：内蒙古健康成人。
两歧双歧杆菌BB-G90，保藏编号CCTCC NO:M2013194，典藏时间，2013年5月9日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学。
两歧双歧杆菌BB-G90的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行相对厌氧培养。培养温度为36-39℃，优选37-38℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加质量体积分数为0~0.5%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制pH值。发酵罐采用通入非氧气不活泼气体（如纯度在99%以上的氮气等等），并保持罐压为0.02-0.1MPa。优选0.03-0.08MPa罐压条件下培养。发酵起始pH值控制在7.0±0.2范围内，后期发酵过程的pH值控制在5.5±0.2范围内，偏酸时采用碱液（如20%~25%的氢氧化钠或氨水中的一种或二种）流加控制，使得pH值控制在5.5±0.2范围内。在菌体繁殖生长的对数期末期，结束发酵。
两歧双歧杆菌BB-G90的基础培养基：乳糖，2~5%；葡萄糖0~2%；牛肉浸粉，0.6~1.2%；蛋白胨，0.6~1.2%；酵母膏，0.5~1.5%；大豆蛋白栋，0.1~0.5%；无水乙酸钠，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；L-半胱氨酸盐酸盐，0.06~0.12%，吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.04~0.08%；一水硫酸锰，0.01~0.03%，碳酸钙，0~0.5%；其余为水，以上均按质量分数计。
发酵结束后，将发酵液降温，然后收集菌体，通常可采用离心的方法获得菌体。
菌体的基础保护剂为20%脱脂乳粉+5%蔗糖。在考虑规避过敏性物料的情况下，采用海藻糖，菊粉、低聚果糖、蔗糖等非乳基及过敏性原料的组合物作为菌体保护剂。
将保护剂与菌体混合均匀，得到乳化液。
将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）中，进行真空低温冷冻干燥，获得菌饼。菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。
具体的，所述益生菌组合物制备过程主要包括菌种活化，种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎、包装等过程，
以上所述益生菌组合物，还包含上述两种菌粉经加入常规辅料，通过混合均匀混合后获得。其中两种菌粉的活菌数比例为（1:50~50:1）。
优选的，嗜酸乳杆菌：两歧双歧杆菌活菌数比为1:1。
优选的，再经包装、或胶囊充填后再包装，获得产品。
在一个实施例中，将所述益生菌组合物制备成胶囊剂，所述2#胶囊净含量为0.22±0.02g/粒，每粒胶囊含有活菌数10亿以上。
本发明和现有技术相比，其优点在于：
本发明提供的嗜酸乳杆菌LA-G80、两歧双歧杆菌BB-G90复合益生菌组合物能对小鼠肉瘤180(S180)具有明显得抑制作用。对带有艾氏癌腹水型(EAC)--腹水瘤的小鼠具有延长生命的作用。从而有利人体健康和预防肿瘤的发生。
具体实施方式
以下公开本发明的一些实施例，本领域技术人员可以根据本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：制备嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉和两歧双歧杆菌BB-G90菌粉
（一）制备嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉，获取来源：广西巴马地区健康老人。
嗜酸乳杆菌LA-G80，保藏编号CCTCC NO:M2013337，典藏时间，2013年7月16日；
嗜酸乳杆菌LA-G80的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行厌氧培养。培养温度为37.5±0.5℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加0.5%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制pH值。发酵罐采用通入氮气，并保持罐压为0.05±0.02MPa罐压条件下培养。发酵起始pH值控制在6.86，后期发酵过程的pH值控制在5.2±0.2范围内，偏酸时采用碱液（25%的氢氧化钠）流加控制，使得pH值控制在5.2±02范围内。在菌体繁殖生长的稳定期初，结束发酵。
具体培养基：葡萄糖，4%；牛肉浸粉，1.0%；蛋白胨，1.0%；酵母膏，1.0%；无水乙酸钠，0.5%；碳酸钙，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.06%；一水硫酸锰，0.02%；L-半胱氨酸盐酸盐，0.05%；其余为水，以上均按质量分数计。
培养基经115℃，15分钟灭菌，降温后调pH值为6.86，接种后在37.5±0.5℃条件下发酵培养。
发酵结束后，将发酵液降温至8℃，然后采用加速沉降技术收集菌体。
菌体的基础保护剂为20%脱脂乳粉+5%蔗糖。
将保护剂与菌体按照质量比5:1混合均匀，得到乳化液。
将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）进行 -40~-45℃真空低温冷冻干燥，获得菌饼。
菌饼经过粉碎后，获得菌粉，菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。本例过60目筛。
（二）制备两歧双歧杆菌BB-G90菌粉，获取来源：内蒙古健康成人。
两歧双歧杆菌BB-G90，保藏编号CCTCC NO:M2013194。典藏时间，2013年5月9日；
两歧双歧杆菌BB-G90的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行厌氧培养。培养温度为37.5±0.5℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加0.2%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制pH值。发酵罐采用通入氮气，并保持罐压为0.05-±0.03MPa罐压条件下培养。发酵起始pH值为7.02，后期发酵过程的pH值控制在5.5±0.2范围内，偏酸时采用碱液（25%的氢氧化钠）流加控制，使得pH值控制在5.5±0.2范围内。在菌体繁殖生长的对数期末，结束发酵。
具体培养基：乳糖，4%；牛肉浸粉，1.0%；蛋白胨，1%；酵母膏，1.0%；无水乙酸钠，0.5%；大豆蛋白栋，0.25%；碳酸钙，0.25%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；L-半胱氨酸盐酸盐，0.1%；七水硫酸镁，0.06%；一水硫酸锰，0.02%；其余为水，以上均按质量分数计。
培养基经115℃，15分钟灭菌，降温后调pH值为7.02，接种后在37-38℃条件下发酵培养。在益生菌生产的培养基灭菌方式上，培养基经115℃，15分钟灭菌。与传统的培养基121℃，30分钟灭菌有所不同，有利于节约能源。
发酵结束后，将发酵液降温至8℃，然后收集菌体。
菌体的基础保护剂为20%脱脂乳粉+5%蔗糖。
将保护剂与菌体按照质量比5：1混合均匀，得到乳化液。
将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）进行真空低温冷冻干燥，获得菌饼。
菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。本实施例过60目筛。
实施例2：制备嗜酸乳杆菌LA-G80和两歧双歧杆菌BB-G90组合物：
将以上制得的嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉、两歧双歧杆菌BB-G90菌粉，各自用食品级原料抗性糊精进行标准化。活菌数控制在2.5*1010CFU/g以上。
将以上制得的嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉、两歧双歧杆菌BB-G90菌粉活菌比例按照优选的1:1混合，并加入添加剂，混合均匀，总活菌数控制在5*109CFU/g以上，具体实例测得为5.6*109CFU/g。
添加剂按质量分数计为脱脂奶粉25%、乳糖20%、低聚果糖15%、菊粉10%，低聚木糖6%、果胶2%作为复配的辅料与22%的菌粉混合后作为混粉制备成胶囊剂，2#胶囊的净填充含量为0.22±0.02g/粒。
实施例3辅助抑制肿作用测定
1.样品处理：以实施例2所得产品（混粉）作为样品。样品内容物为淡黄色粉末，以蒸馏水调制成各浓度，供试；
2.实验动物：昆明种雄性小白鼠，体重范围20-22克，由上海医科大学动物房提供的清洁级动物(本站SPF动物房饲养)，合格证号:02--22--1；
3实验瘤株:小鼠肉瘤180(S180)和小鼠艾氏癌腹水型(EAC)均由上海医科大学附属肿瘤医院提供。
4.剂量设计:样品人体每日推荐剂量为0.42/60kg 本实验设低、中、高三剂量组分别为0.035、0.07、0.21g/kg，另设蒸馏水为阴性对照组。
4.1给样方式:灌胃，灌胃容积为0.4m1/20g，每日一次，连续四周。
5.实验方法与结果:
5.1S180肉瘤:动物连续给样四周后，抽取健康的腹水型S180小鼠腹水,进行计数后，根据活细胞数，用生理盐水稀释腹水至细胞数为107个/ml，每只小鼠腹部皮下接种0.2m1，接种后继续给样，接种10天后，将小鼠称重，颈椎脱白处死，取皮下瘤块称重，并重复实验一次。
表1 样品对动物体重的影响
由表1可见，样品各剂量组与对照组相比，均无显著性差异。
表2 S180肿瘤抑制试脸
*P005与对照组相比(经方差分析)
由表2可见，样品高剂量组动物在二次实验中S180实体瘤瘤重均明显低于对照组，均有显著性差异，且抑制率均大于30%。
5.2 EAC 腹水瘤实验方法
5.2.1抽取腹水：取接种后7-10天健康动物，颈椎脱臼，腹部消毒，抽取腹水(乳白色浓稠液体)。
5.2.2细胞计数：取一滴腹水于载玻片上，制片，瑞氏染色，镜下进行细分类计数，瘤细胞应≥95%。另取少量腹水置于加有肝素的干试管内，生理盐水稀释10倍及100倍，取稀释液0.9m1，加0.2%台盼蓝生理盐水液0.1ml。混匀，用白细胞计数法计瘤细胞总数，同时计算受感染的死组胞数。
5.2.3给样方式：灌胃，灌胃容积为0.1ml/20g，每日一次，连续四周。
5.2.4 接种： 根据活细胞数用无菌葡萄糖的平街盐水稀释腹水至细胞数为107个/m1，每只小鼠腹腔注射0.2mL(60分钟内完成)。接种后次日分别对各组动物称体重，观察动物生存情况，逐日记录。
5.2.5数据处理：计算各组动物平均生存时间，采用方差分析进行统计。以上试验经两批动物重复试验。
5.2.6.结果:
表3 EAC肿瘤抑制试验(第一次)
*P<0.05与对照组相比(经方差分析)
表4 EAC肿瘤抑制试验(第二次)
*P0.05 与对照组相比(经方差分析)
由表3、表4可见，样品高剂量组动物在二次实验中的平均生存时间均明显长于对照组，均有显著性差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种有抗肿瘤作用的益生菌组合物，其特征在于，包括嗜酸乳杆菌LA-G80和两歧双歧杆菌BB-G90，所述嗜酸乳杆菌LA-G80的分类名为嗜酸乳杆菌LA-G80（Lactobacillusacidophilus LA-G80），保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013337，保藏时间为2013年7月16日；所述的两歧双歧杆菌BB-G90的分类名为两歧双歧杆菌BB-G90（Bifidobacterium bifidum BB-G90），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013194，保藏时间为：2013年5月9日。
2.权利要求1所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用。
3.根据权利要求2所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，所述益生菌组合物中还添加有常规辅料制备成食品、药品或保健品。
4.根据权利要求3所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，将所述益生菌组合物制备成粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、液体制剂或胶囊剂。
5.根据权利要求3所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，所述益生菌组合物中嗜酸乳杆菌LA-G80、两歧双歧杆菌BB-G90活菌数比例为1:1，总活菌数在5*109cfu/g以上。
6.根据权利要求3所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，将所述益生菌组合物制备成胶囊剂，所述2#胶囊净含量为0.22±0.02g/粒，每粒胶囊含有活菌数10亿以上。
7.根据权利要求2所述的益生菌组合物在抗肿瘤方面的应用，其特征在于，所述益生菌组合物具体的制备步骤为：
（1）制备嗜酸乳杆菌LA-G80菌粉；
（2）制备两歧双歧杆菌BB-G90菌粉；
（3）将步骤（1）和步骤（2）得到的菌粉按活菌数量比混合后添加辅料按照常规方法制备成食品、药品或保健品；
所述步骤（1）中菌粉的制备过程包括菌种活化、种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎；
所述步骤（2）中菌粉的制备过程包括菌种活化、种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎。
8.根据权利要求7所述的益生菌组合物在护肝方面的应用，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中菌粉均为将发酵后收集到的菌体与基础保护剂按照质量比1:5混合后置于温度为-45℃中冻干后粉碎而成，所述菌体的基础保护剂为20%wt脱脂乳粉+5%wt蔗糖+75%wt水。
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