KR101291494B1 - 고순도 리포펩티드와 그 제조 방법, 리포펩티드 미셀과 그 제조 방법, 및 고순도 리포펩티드 및 리포펩티드 미셀을 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

고순도 리포펩티드와 그 제조 방법, 리포펩티드 미셀과 그 제조 방법, 및 고순도 리포펩티드 및 리포펩티드 미셀을 함유하는 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고도로 정제된 답토마이신(daptomycin), 및 이 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피의 순차(sequential) 단계를 포함하는 답토마이신의 정제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개질 완충액 증강(modified buffer enhanced) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 답토마이신을 정제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 로세오스포러스(Streptomyces roseosporus)의 발효에 의해 답토마이신을 생산하는, 개선된 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 답토마이신 순도의 분석을 위한 고압 액체 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀, 및 상기 미셀의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 항생제(예컨대, 답토마이신)를 정제하기 위해 리포펩티드 미셀을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

고순도 리포펩티드와 그 제조 방법, 리포펩티드 미셀과 그 제조 방법, 및 고순도 리포펩티드 및 리포펩티드 미셀을 함유하는 약학 조성물{HIGH PURITY LIPOPEPTIDES, LIPOPEPTIDE MICELLES, PROCESSES FOR PREPARING SAME AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM}
본 발명은 종래의 항생제에 대한 내성이 있는 균주를 비롯하여 그람 양성 박테리아에 대해 강력한 살균(bactericidal) 활성을 가지는 리포펩티드 항생제인, 답토마이신을 비롯한 고도로 정제된 형태의 리포펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고도로 정제된 형태의 리포펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀의 약학 조성물, 및 상기 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포펩티드의 비회합(non-associated) 단량체로부터 리포펩티드 미셀을 제조하는 방법, 및 리포펩티드 미셀을 비회합 단량체로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상업적 목적에 따라 일정한 비율로 제조하기 용이한 미셀을 사용하여 리포펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
그람 양성 감염(항생제 내성 박테리아에 의해 기인하는 감염을 포함) 발생의 급격한 증가는 신규한 클래스(class)의 항생제 개발에 대한 관심을 다시 새롭게 촉발시켰다. 상기 클래스 중 하나인 항생제는 답토마이신을 비롯한 리포펩티드 항생제이다. 답토마이신은 생명에 위협을 주는 심각한 질병을 야기하는, 임상적으로 관련성이 있는 그람 양성 박테리아에 대해 시험관내에서 강력한 살균 활성을 갖는다. 상기 박테리아는 내성 병원체[예컨대, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스(VRE), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 글리코펩티드 매개 감수성 스타필로코쿠스 아우레우스(GISA), 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스(CNS) 및 페니실린 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아(PRSP)]를 포함하는데, 이에 대한 치료적 대안은 거의 없다. 예컨대, Tally 등의 문헌 [Exp. Opin. Invest. Drugs, 8:1223∼1238, 1999](이하, "Tally"라 칭함)을 참조한다. 답토마이신의 저해 효과는 시험관내 및 생체내에서의 신속한 농도 의존적 살균 효과, 및 생체내에서의 상대적으로 지연된 농도 의존적 항생제 투여 후 효과(post-antibiotic effect)이다.
답토마이신은 Baltz의 문헌 [Biotechnology of Antibiotics, 제2판, ed. W.R. Strohl(New York: Marcel Dekker, Inc.), 1997, pp. 415∼435](이하, "Baltz"라 칭함)에 기재되어 있다. LY 146032로도 알려진 답토마이신은 스트렙토마이세스 로세오스포러스(Streptomyces roseosporus)의 발효로 얻을 수 있는 고리형 리포펩티드 항생제이다. 답토마이신은 스트렙토마이세스 로세오스포러스의 인자 A-21978C0형 항생제 중 일원으로, 고리형 13-아미노산 펩티드의 N-말단 트립토판에 연결된 데카노일 측쇄로 이루어져 있다(도 1). 답토마이신은 대부분의 그람 양성 박테리아에 대한 효능이 우수하고, 살균 효과와 속효성이 우수하며, 내성율이 낮고, 항생제 내성 유기체에 대한 효능이 있기 때문에, 우수한 활성 프로필을 나타낸다. 최근, 상기 화합물은 박테리아[메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA) 및 반코마이신 내성 엔테로코쿠스(VRE)를 포함하나 이들에 한정되지 않음]에 기인하는 심각한 감염을 치료하기 위한 각종 제제로 개발되고 있다.
답토마이신(LY 146032)를 비롯한 A-21978C 항생제 및 그 유도체, A-21978C 항생제 및 그 유도체의 제조 및 분리 방법은 다수의 미국 특허에 기재되어 있다.
미국 특허 제Re. 32,333호, 제Re. 32,455호 및 제4,800,157호에는 액침(submerged) 호기성 발효 조건 하에서 스트렙토마이세스 로세오스포러스 NRL15998을 배양하여 답토마이신을 합성하는 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제4,885,243호에는 발효 배양물에 데카노일 지방산 또는 이의 에스테르 또는 이의 염을 공급하여 답토마이신을 제조하는 개선된 방법이 기재되어 있다.
미국 특허 제Re. 32,310호, 제Re. 32,311호, 제4,537,717호, 제4,482,487호 및 제4,524,135호에는 A-21978C 항생제를 탈아실화하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 항생제 유도체 및 펩티드 핵을 재아실화하는 방법이 기재되어 있다. 상기 모든 특허에는 여과에 의해 발효 브로스(broth)로부터 분리된 후 Diaion HP-20 크로마토그래피 및 실리카 겔/C18 크로마토그래피에 의해 정제된 탈아실화 A-21978C 항생제 핵 또는 그 유도체가 기재되어 있다.
미국 특허 제Re. 32,333호 및 제Re. 32,455호에는 다수의 침전 및 추출 공정을 통해 전체 발효 브로스의 여과물을 정제하여 조(粗) A-21978C 복합체를 수득하는 정제 방법이 기재되어 있다. IRA-68 상에서의 이온 교환 크로마토그래피 및 2회의 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 상기 조(粗) 복합체를 추가로 정제하였다. 역상 실리카 겔 또는 실리카 겔/C18에 의해 개별 A-21978C 인자들을 분리하였다. 또한, 미국 특허 제Re. 32,333호 및 제Re. 32,455호에는 Diaion HP-20 수지를 사용하는 회분식 크로마토그래피를 수행한 후, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 A-21978C를 정제할 수 있다는 것이 기재되어 있다.
미국 특허 제4,874,843호에는 발효 브로스를 여과하고, HP-20 수지를 함유하는 컬럼을 통해 통과시키는 것을 특징으로 하는 답토마이신 정제 방법이 기재되어 있다. 용출 후, 반정제된 답토마이신은 HP-20ss를 함유하는 컬럼을 통해 통과시킨 뒤, HP-20 수지 상에서 다시 분리시켰다. 상기 미국 특허 제4,874,843호에는, 상기 방법에 의해 구조적으로 유사한 화합물들로부터 유래한 답토마이신의 최종 분해(resolution) 및 분리가 발효 브로스의 자외선(UV) 분석으로 동정할 수 없는 불순물의 존재에 의해 방해된다는 것이 기재되어 있다. 상기 미국 특허 제4,874,843호에는 실리카 겔 상에서의 역상 크로마토그래피, 실리카 겔 상에서의 정상 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 불순물을 제거하려는 시도가 답토마이신의 순도를 유의적으로 향상시킬 수 없다는 것도 기재되어 있다. 또한, 상기 미국 특허 제4,874,843호에는 수상(水相) 중의 비기능성 수지와 발효 생성물 수용액을 접촉시키는 단계; 하전된 수지로부터 물을 물리적으로 제거하는 단계; 하전된 수지를 극성 유기 용매로 재습윤시키는 단계; 수지를 유기 용매로 세척하는 단계; 용매의 극성을 증가시켜, 수지로부터 발효 생성물을 용출시키는 단계; 및 발효 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 정제를 위한 "역(逆) 방법(reverse method)"이 기재되어 있다. 상기 미국 특허 제4,874,843호는, 이 방법이 최종 순도를 약 80% 내지 약 93% 향상시키고, 수율을 약 5% 내지 약 35% 향상시킨다는 것을 교시하나; 상기 미국 특허 제4,874,843호에는 답토마이신 제제 내에 존재하는 불순물의 형태는 기재되어 있지 않다.
미국 특허 제5,912,226호에는 답토마이신의 제조 과정 중 생성된 2가지 불순물의 동정 및 분리가 기재되어 있다. 답토마이신, 즉 α-아스파르틸 펩티드는 펩티드 전이되어, 아스파르틸기가 안하이드로-숙신이미도기로 되는 안정한 중간체를 형성한다(도 3). 상기 미국 특허 제5,912,226호는 안하이드로-답토마이신이라 칭하는 상기 중간체의 존재가 pH 4∼6에서 보다 현저하다는 것을 교시한다. 안하이드로-숙신이미도 형태의 재수화는 β-아스파르틸기를 함유하고 β-이성체 형태의 답토마이신이라 불리는 제2 분해 산물(degradation product)을 생성시킨다(도 2).
상기 미국 특허 제5,912,226호에는 안하이드로-답토마이신의 t-BOC 유도체를 역상 실리카 겔/C-18 컬럼에 의해 분리하고, 침전시키고, 역상 실리카 겔/C-18 크로마토그래피에 의해 재정제할 수 있다는 것이 기재되어 있다. 또한, 상기 미국 특허 제5,912,226호는 Diaion HP-20ss 수지 상에서의 크로마토그래피로 β-이성체 형태의 답토마이신을 정제하고, Diaion HP-20 수지 상에서의 크로마토그래피로 탈염시키며, 또한 역상 C-18 컬럼을 사용한 후 역(逆) 방식으로 HP-20 수지를 사용하여 정제할 수 있다는 것을 교시한다.
Kirsch 등의 문헌 [Pharmaceutical Research, 6:387∼393, 1989](이하, "Kirsch"라 칭함)에는 답토마이신 정제시 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체가 생성된다는 것이 기재되어 있다. Kirsch에는 pH 조건 및 온도 조건의 조작을 통해 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체의 레벨을 최소화하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, Kirsch에는 답토마이신을 안정화시킬 수 없으며, 답토마이신의 안하이드로-답토마이신으로의 전환 및 이의 β-이성체로의 후속 이성체화를 방지할 수 없다는 것이 기재되어 있다. 또한, Kirsch에는 답토마이신이 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체와 무관한 다른 분해 산물로 분해되는 것을 방지할 수 없다는 것이 기재되어 있다.
상기 미국 특허 제5,912,226호에는 답토마이신이 2.5 중량% 이하의 안하이드로-답토마이신과 β-이성체의 조합물을 함유하지만 다른 불순물의 레벨은 표시되지 않도록, 상기 방법들을 사용하여 이를 제조할 수 있다는 것이 기재되어 있다. 미국 특허 제4,874,843호에 교시된 방법 및 임상 시험용 답토마이신의 대규모 제조에 있어서 관찰된 최고도의 답토마이신 순도 레벨은 약 90∼93%였다. 보다 고도로 정제된 답토마이신을 제조하고, 가능하다면 정제 후의 답토마이신 수율을 증가시키기 는 상업적 실행가능 방법이 필요하다. 더욱이, 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체 형태의 답토마이신을 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않는 정제된 답토마이신을 수득하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업계에 안하이드로-답토마이신, β-이성체 형태, 및 답토마이신 생성물 내의 기타 불순물의 레벨을 더 감소킬 수 있다고 밝혀진 유용한 방법은 없었다.
본 발명은 고레벨의 정제된 리포펩티드를 생산하는 상업적 실행가능 방법을 제공함으로써, 상기 문제들을 역점을 두어 다룬다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 본 발명의 일 실시태양에 있어서, 95∼97%의 순도 레벨에서 답토마이신을 생성시키는 상업적 실행 가능 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 답토마이신 제조시 주요 불순물인 안하이드로-답토마이신과 β-이성체 뿐만 아니라 다른 불순물도 거의 완전히 제거하는 상업적 실행 가능 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 저분자량의 오염물로부터 리포펩티드 미셀을 분리하는 단계, 및 고분자량의 오염물로부터 비회합 리포펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 리포펩티드(답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함함) 정제를 위한 상업적 실행가능 방법이 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 답토마이신의 순도를 분석하고, 답토마이신 내의 다른 불순물을 검출 및 특성화하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법을 제공하는데, 상기 방법 중 일부는 공지되어 있지 않다.
또한, 본 발명은 98% 이상의 순도를 보유하거나, 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체가 실질적으로 없거나 본래 없는 정제된 답토마이신을 제공한다. 본 발명은 안하이드로-답토마이신이 실질적으로 없거나 본래 없으며, 선행 기술에 있어서 이전에 수득가능했던 것보다 더 저레벨의 β-이성체 및 기타 오염물을 함유하는 정제된 답토마이신을 제공한다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 미셀은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 고도로 정제된 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 미셀을 포함하는 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 목적은 음이온 교환 크로마토그래피와 소수성 상호작용 크로마토그래피의 독특한 조합을 포함하는, 상업적 목적에 따라 일정한 비율로 제조하기 용이한 리포펩티드를 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 95% 이상의 순도를 가지며, 선행 기술 방법에 의해 제조된 답토마이신에 비해 불순물의 레벨이 감소된, 정제된 답토마이신을 제조하기 위해 이 방법을 사용한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 선행 기술 방법에 사용된 용매에 비해 레벨이 감소된 용매를 사용하여 답토마이신을 제조하기 위해 이 방법을 사용한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 순도가 95% 이상인 정제된 답토마이신 관련 리포펩티드를 제조하기 위해 이 방법을 사용한다.
본 발명의 제2 목적은 발효 배양물에 감소된 레벨의 지방산을 공급함으로써, 미생물에 의해 생산된 리포펩티드의 레벨을 증가시키기 위한 방법을 제공하는 것이다. 미국 특허 제4,885,243호에서 답토마이신 발효를 위해 제안된 데칸산보다 더 저레벨의 데칸산을 사용하면, 고도로 순수한 형태의 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 경제성이 향상된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 관련된 오염물의 생성을 최소화하면서 스트렙토마이세스 로세오스포러스에 의해 생산된 답토마이신의 농도 및 양을 증가시키기 위해 상기 방법을 사용한다. 발효 브로스 중의 보다 저레벨의 오염물은 보다 효율적인 답토마이신의 회수 및 정제를 초래하며, 이는 보다 고수율의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 목적은 개질 완충액 증강(modified buffer enhanced) 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함하는, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 98% 이상의 순도를 가지거나, 실질적으로 또는 본질적으로 안하이드로-답토마이신 또는 β-이성체가 없는 답토마이신을 생산하는 데 상기 방법을 사용한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 답토마이신 관련 리포펩티드를 98% 이상의 순도로 정제하는 데 상기 방법을 사용한다.
본 발명의 제4 목적은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 개질 완충액 증강 음이온 교환 크로마토그래피의 신규한 조합을 포함하는, 리포펩티드를 정제하기 위한 프로세스 크로마토그래피(process chromatography) 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 정제하는 데 프로세스 크로마토그래피 방법을 사용한다. 의외로, 개질 완충액은 종래 선행 기술의 크로마토그래피 방법으로는 불가능한, 답토마이신으로부터의 안하이드로-답토마이신의 분리를 가능하게 한다.
본 발명의 제5 목적은 리포펩티드 미셀을 사용하여 상업적 목적에 따라 일정한 비율로 제조하기 용이한 리포펩티드를 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 일 실시태양에 있어서, 상기 방법은 단량체성 비(非)미셀 상태로부터 미셀 상태로 리포펩티드 용액을 전환시키고, 정제 절차 도중 다시 역으로 전환시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 리포펩티드에 미셀 형성 조건을 가하는 단계; 및. 예컨대 입도 분리 기법에 의해 저분자량의 오염물로부터 리포펩티드 미셀을 분리하는 단계를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 리포펩티드가 단량체 형태로 존재하는 조건을 리포펩티드에 가하는 단계; 및, 예컨대 입도 분리 기법에 의해 고분자량의 분자 또는 응집물(aggregate)로부터 단량체성 리포펩티드 분자를 분리하는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 다음 2단계를 모두 포함한다: 리포펩티드에 미셀 형성 조건을 가하고, 저분자량의 오염물로부터 리포펩티드 미셀을 분리하는 단계; 이어서 리포펩티드가 단량체 형태로 존재하는 조건을 리포펩티드 미셀에 가하고, 고분자량의 분자 또는 응집물로부터 리포펩티드 단량체를 분리하는 단계. 상기 2단계는 어느 순서로든 수행할 수 있다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 입도 분리 기법은 한외여과법 또는 크기 배제 크로마토그래피법이다.
본 발명의 제6 목적은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 답토마이신을 비롯한 리포펩티드의 순도를 측정하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제7 목적은 정제된 리포펩티드(예컨대, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드), 및 이의 약학적 허용 염 또는 제제를 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재되어 있는 방법들 중 하나에 의해 정제된 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 정제된 리포펩티드 또는 이의 염을 함유하는 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물의 투여 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 정제된 답토마이신을 포함한다.
본 발명의 제8 목적은 리포펩티드 미셀 및 이의 약학적 허용 제제를 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 답토마이신 미셀 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 미셀, 및 이의 약학적 허용 제제를 제공한다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 또한 리포펩티드 미셀 또는 이의 약학적 제제를 필요로 하는 환자에게 리포펩티드 미셀 또는 이의 약학적 제제를 투여하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 정맥내 투여, 비경구 투여, 근육내 투여 또는 국소 투여 방식으로 리포펩티드 미셀을 투여한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 특별한 언급이 없는 한, 본 발명의 실시는 종래의 화학, 생화학 및 미생물 기법, 및 본 명세서에 사용된 기초 용어를 이용한다.
"분리된(isolated)"이란 용어는 혼합물 내에 존재하는 10% 이상, 바람직하게는 20% 또는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50%, 60% 또는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 또는 90% 이상의 화합물을 나타내는 화합물과 관련있는 화합물 또는 생성물을 의미한다.
"리포펩티드(lipopeptide)"란 용어는 펩티드 부분과 공유 결합된 지질양(lipid-like) 부분 뿐만 아니라, 이의 염, 에스테르, 아미드 및 에테르를 포함하는 분자를 의미한다. 또한, "리포펩티드"란 용어는 1 이상의 아미노기, 카르복실레이트기 또는 히드록실기가 보호된, 보호된 형태의 리포펩티드를 포함한다. 예컨대, 보호기의 예에 관한 Theodora W. Greene, John Wiley 및 Sons의 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis", 뉴욕, 1981]을 참조한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 항생제이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 미국 특허 제5,629,288호에 기재되어 있는 LY303366, 에키노칸딘스(echinocandins), 뉴모칸딘스(pneumocandins), 아쿨레아신스(aculeacins), 수르팍틴(surfactin), 플리파스타틴 B1(plipastatin B1), 암포마이신 또는 리포펩티드 유도체이다. 상기 리포펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,202,309호 및 PCT 국제공개공보 제WO 00/08197호를 참조한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 특히, 답토마이신, A54145, 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 제5,912,226호(최근 미국 일련 번호 제09/547,357호로서 재발행됨), PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271[상기 미국 특허 및 PCT 국제공개공보의 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함]에 기재되어 있는 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 A-21978 항생제(답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환됨)를 비롯한 답토마이신 관련 분자이다. 상기 PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 답토마이신 관련 리포펩티드는 답토마이신의 오르니틴 잔기, 키누린 잔기 또는 지방산 측쇄가 개질된 합성 또는 반합성 리포펩티드에 관한 것이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 답토마이신 관련 리포펩티드는 전술한 화합물 또는 이의 염을 의미한다.
"답토마이신(daptomycin)"이란 용어는 인자 A-21978C0형 항생제의 n-데카노일 유도체, 또는 이의 약학적 허용 염을 의미한다. "답토마이신"은 LY146032와 동의어이다. 도 1을 참조한다.
"안하이드로-답토마이신(anhydro-daptomycin)"이란 용어는 답토마이신의 α-아스파르틸기가 안하이드로-숙신이미도기로 펩티드 전이된 답토마이신 유도체를 의미한다. 도 3을 참조한다.
"β-이성체" 또는 "답토마이신의 β-이성체"란 용어는 α-아스파르틸기 대신에 β-아스파르틸기를 함유하는 답토마이신 유도체를 의미한다. 도 2를 참조한다.
샘플의 95% 이상이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드인 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 "실질적으로 순수한" 것이다. 바람직하게는, 샘플의 97% 이상이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드인 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 "실질적으로 순수한" 것이다.
샘플의 98% 이상이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드인 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 "본질적으로 순수한" 것이다. 바람직하게는, 샘플의 99% 이상이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드인 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 "본질적으로 순수한" 것이다.
다른 화합물이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 제제의 양의 1% 이하의 양으로 존재하는 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드에는 다른 화합물이 "실질적으로 없는" 것이다.
다른 화합물이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 제제의 양의 0.5% 이하의 양으로 존재하는 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드에는 다른 화합물이 "본질적으로 없는" 것이다.
다른 화합물이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 제제의 양의 0.1% 이하의 양으로 존재하는 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드에는 다른 화합물이 "없는" 것이다. 대안으로, 검출 한계가 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 제제의 양의 약 0.05% 이하인 최대 감수성의 조건 하에 HPLC로 화합물을 검출할 수 없을 경우에, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드에는 다른 화합물이 "없는" 것이다. 대표적인 HPLC 방법은 본 명세서에 기재되어 있다(표 1 및 표 2).
"정제된" 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 실질적으로 순수한 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드, 본질적으로 순수한 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 이들의 염을 의미하거나; 또는 다른 화합물이 실질적으로 없거나, 본질적으로 없거나, 없는 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 이들의 염을 의미한다.
"부분적으로 정제된" 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 순도가 90%보다 적은 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 이들의 염을 의미한다.
답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드의 순도는 약학 조성물 중에 제제화되기 이전의 리포펩티드에 관한 것이다. 핵 자기 공명(NMR), 가스 크로마토그래피/질량 분석(GC/MS), 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS) 또는 미생물학적 검정을 비롯한 임의의 수단에 의해 순도를 측정할 수 있다. 답토마이신의 순도를 측정하기 위한 바람직한 수단은 분석용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 것이다.
"미셀(micelle)"이란 용어는 양친매성 분자의 응집물을 의미한다. 수성 매질에 있어서, 상기 응집물 분자의 친유성 도메인은 미셀의 내부를 향하고, 친수성 도메인은 매질과 접촉하고 있다. 미셀의 구조는 구형 구조, 층상(laminar) 구조, 원통형 구조, 타원형 구조, 다공질(리포솜형) 구조, 박층(lamellar) 구조 및 액정 구조를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 도 14를 참조한다.
"혼합형 미셀(mixed micelle)"이란 용어는 미셀이 1 이상의 단일 형태의 양친매성 분자를 함유하는 특정 형태의 미셀을 의미한다. 본 발명에 있어서, 혼합형 미셀은 하나의 리포펩티드, 및 다른 리포펩티드일 수 있는 1 이상의 다른 양친매성 분자를 함유한다. 혼합형 미셀은 10 중량% 이상의 리포펩티드를 함유한다. 다른 실시태양에 있어서, 혼합형 미셀은 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 리포펩티드를 함유한다.
"미셀 용액(micellar solution)"이란 용어는 중량으로 측정할 때, 용액 중의 리포펩티드 분자의 50% 이상이 미셀로 존재하는 용액을 의미한다. 바람직하게는, 상기 분자의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 미셀로 존재한다. 미셀 용액은 공칭 분자량(NMW) 컷오프(cutoff)가 10,000 달톤인 한외여과 막 상에 보유된다.
"임계 미셀 농도(cmc)"란 용어는 온도, 염 농도, 및 양친매성 분자의 성질 및 형태에 의존적인, 분자의 특정 농도를 의미한다. cmc를 초과하는 농도에서, 비회합 단량체와 미셀이 평형 상태로 존재한다.
"단량체"란 용어는 응집물의 일부가 아니지만, 단일 분자로서 존재하는 양친매성 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 단량체란 용어는 비회합 리포펩티드를 의미한다.
"단량체성 용액"이란 용어는 중량으로 측정했을 때, 리포펩티드 분자의 50% 이상이 단량체로서 존재하는 용액을 의미한다. 바람직하게는, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 단량체로서 존재한다. 단량체성 용액은 NMW 컷오프가 10,000 달톤인 한외여과 막 상에 보유되지 않고, 오히려 상기 막을 통과한다.
"낮은 이온 강도의 완충액"이란 용어는 염 농도가 50 mM 미만인 용액을 의미하고; "중간 정도의 이온 강도의 완충액"이란 용어는 염 농도가 50∼250 mM인 용액을 의미하며; "높은 이온 강도의 완충액"이란 용어는 염 농도가 250 mM보다 큰 용액을 의미한다.
정제된 리포펩티드의 제조 방법
본 발명의 일 실시태양은 상업적으로 실행가능한 방식으로 정제된 리포펩티드를 제조하는 프로세스 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 프로세스 크로마토그래피 방법은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용하여, 리포펩티드(예컨대, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드)를 함유하는 제제를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 정제 방법은 A21978C-함유 조 생성물이 스트렙토마이세스 로세오스포러스에 의해 생산되는 발효 조건을 변경하여, 답토마이신 생산을 증가시키고, 스트렙토마이세스 로세오스포러스 발효 배양에 의해 생성되는 불순물 및 관련 오염물을 감소시키는 단계를 더 포함한다.
프로세스 크로마토그래피 방법의 바람직한 실시태양은 후술하는 바와 같다:
데칸산의 공급이 발효의 총수율을 감소시키지 않으면서, 가능한 한 최저 레벨로 유지되도록 변형함으로써, 미국 특허 제4,885,243호에 기재되어 있는 것과 같이 n-데칸산을 공급하여 스트렙토마이세스 로세오스포러스를 발효시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 잔류 데칸산은 호기성 발효 과정 중 50 ppm 이하로 유지된다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 잔류 데칸산은 호기성 발효 과정 중 1∼20 ppm으로 유지된다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에 있어서, 잔류 데칸산은 호기성 발효 과정 중 약 10 ppm으로 유지된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 발효의 전 과정 중 잔류 데칸산의 농도를 측정하고, 데칸산의 공급 레벨을 조절하여 바람직한 매개변수 내에서 잔류 데칸산 레벨을 계속 유지시킨다. 선행 기술에는 보다 저레벨의 불순물을 함유하는 답토마이신의 최적 발현을 달성하는 데 필요한 계내(in situ) 특이성 및 저잔류의 일정한 데칸산 농도가 기재되어 있지 않다.
발효 후, 발효 브로스로부터 균사체를 제거함으로써 세포외 용액을 정화시킨다. 임의의 표준 분리 기법(예, 원심분리 또는 정밀여과)에 의해, 발효물로부터 균사체를 제거한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 정밀여과에 의해(예, Pall Sep
Figure 112012035226500-pat00001
막 시스템을 사용하여) 발효 브로스를 정화시킨다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 산업용 원심분리기(예컨대, Westfalia
Figure 112012035226500-pat00002
원심분리기)를 사용한 후, 마무리용 심층 여과기(finishing depth filter)를 사용하여, 발효 브로스를 정화시킨다. 발효 브로스로부터 균사체를 제거하기 위해 다른 장치[예, 필터 프레스(filter press), 회전 원통 여과기(rotary drum filter) 또는 휴대용 심층 여과기]를 사용하여, 대규모 컬럼 크로마토그래피에 적절한 정화된 브로스를 제조할 수 있다.
다른 실시태양에 있어서, 용매 분리용 원심분리기 또는 필터 상에서의 정화 이전에 유기 용매(예컨대, 부탄올)를 직접 사용하여, 균사체 발효물로부터 답토마이신을 추출할 수 있다. 이 실시태양에 따라, 4개 이상의 탄소를 가지는 임의의 알코올을 추출에 사용할 수 있다. 바람직한 용매는 n-부탄올이다. 유기 용매를 사용함으로써, 답토마이신의 순수 수성 분리에 비하여 답토마이신의 초기 부가 정제를 달성한다. 예를 들어, 10% 초과의 농도로 n-부탄올을 사용하는 경우, 및 n-부탄올이 예컨대 4∼5의 pH 값(이는 답토마이신의 등전점 근처임)에서 분리 상(相)을 형성하는 조건 하에서 공정을 수행하는 경우, 답토마이신은 n-부탄올로 분배된다(실시예 4 참조).
다른 실시태양에 있어서, 에너지원, 바람직하게는 당, 기본 성분(elemental component)(예: 아미노산 및 암모니아), 및 데칸산을 사용하는 답토마이신 비발효 제조용 예비 활성화된 균사체를 사용하여 고정화 반응기 내에서 답토마이신을 제조한다. 이어서, 전술한 방법에 의해 고정화 효소 반응기 내에서의 답토마이신 제조 공정을 수행한다.
발효 브로스의 정화 후, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화 용액 중의 답토마이신 레벨을 증강시킨다(즉, 농축시킨다). 먼저, 대부분의 또는 모든 답토마이신이 음이온 교환 수지에 결합하는 조건 하에서 음이온 교환 수지와 정화 용액을 접촉시킨다. 결합 후, 적당한 수성 이온 완충액으로 수지를 세정하여, 비결합 물질 및 답토마이신 불순물의 일부를 제거한다. 마지막으로, 답토마이신이 수지로부터 해리되는 조건 하에서 수지에 결합된 정제된 답토마이신을 용출시킨다.
당업계에 공지된 완충액 및 방법을 사용하여, 본 발명에 따른 결합, 세정 및 용출 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 세정 완충액에 비하여 상승된 염 농도를 함유하는 완충액, 세정 완충액보다 pH가 낮은 완충액, 또는 세정 완충액보다 염 농도가 높고 pH는 낮은 완충액을 사용함으로써, 용출 단계를 수행할 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, 부가 염을 함유하지 않거나, 또는 중성에서 염기성에 이르는 pH에서 낮은 염 농도를 함유하는 완충액 중에서 평형 상태인 음이온 교환 수지에 답토마이신을 결합시킨다. 3개의 컬럼층(column bed) 부피의 물로 적재된 수지를 세정한 후, 30 mM 내지 60 mM의 NaCl을 함유하는 3개의 컬럼층 내지 6개의 컬럼층 부피의, 중간 정도의 염 완충액으로 세정한다. 300 mM 내지 500 mM의 NaCl을 함유하고, 증강된 염 및/또는 보다 낮은 pH를 가지는, 1개의 컬럼층 내지 3개의 컬럼층 부피의 완충액을 사용하여, 컬럼으로부터 답토마이신을 용출시킨다. 또한, 고농도의 염화나트륨 및 대체 염(예컨대, 염화칼륨)은 수지로부터 답토마이신을 용출시킬 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 높은 유속의 음이온 교환 수지를 사용한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, FP-DA 13 수지(미쯔비시)를 사용한다.
음이온 교환 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행하거나, 또는 배치 모드(batch mode)로 수행할 수 있다. 상업적 제조의 경우, 배치 모드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 음이온 교환 수지를 세정하고, 단계식 염 구배(stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배(continuous salt gradient)로 용출시킨다. 적당한 단계식 또는 연속식 염 구배는 오염물로부터 답토마이신의 분리를 허용하는 것이라면 어느 것이든 무방하다. 바람직한 실시태양에 있어서, 연속식 염 구배는 0 mM 내지 1000 mM NaCl의 범위인 것이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 연속식 염 구배는 100 mM 내지 500 mM NaCl 또는 0 mM 내지 400 mM NaCl의 범위인 것이다. 또한, 미국 특허 제5,756,680호, 제4,865,729호, 제4,840,730호 또는 제4,708,782호에 기재되어 있는 바와 같이 방사류(radial flow) 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 답토마이신 제제를 추가로 정제한다. 이 공정의 일 실시태양은 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있다. 대부분의 또는 모든 답토마이신이 수지와 결합할 수 있는 조건 하에서 용출된 수성 답토마이신 제제를 HIC 수지와 접촉시킨다. 증가된 농도의 비극성 용매와 수지를 접촉시킴으로써, 답토마이신 적재 수지의 물 함량을 감소시킨다. 답토마이신이 비결합 상태로 남아있는 동안에 불순물이 수지로부터 해리되는 조건 하에서 적당한 극성 유기 용매로 수지를 세정한다. 마지막으로, 답토마이신이 수지로부터 해리되는 조건 하에서 답토마이신 제제를 용출시킨다. 일반적으로, 세정 완충액보다 더 낮은 극성(보다 높은 극성 용매 레벨) 및/또는 더 높은 pH를 가지는 용매 함유 완충액으로 답토마이신을 용출시킨다.
바람직한 실시태양에 있어서, HIC용 비기능성 수지는 소립자 HP-20ss(미쯔비시)이다. 결합된 답토마이신은 유기상 용매(예컨대, 이소프로필 알코올, 아세토니트릴, 부탄올 또는 기타 적당한 용매를 함유하는 유기상 용매)를 보유하는 HP-20ss 수지로부터 특이적으로 제거된다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 10% 아세토니트릴 또는 등가물(equivalent) 극성 용매(예컨대, 이소프로필 알코올)를 함유하는 아세테이트 완충액 중에 평형 상태로 존재하는 HP-20ss 수지에 답토마이신을 결합시킨다. 적어도 3개의 컬럼층 이상의 부피의 평형 완충액으로 답토마이신 적재 수지를 세정한다. 또한, 비용출(non-eluting) 농도의 극성 용매를 함유하는 6개의 컬럼층 부피의 아세테이트 세정 완충액으로 세정함으로써, 답토마이신 적재 수지에서 부가(additional) 불순물을 제거한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 30% 아세토니트릴 또는 45% 이소프로필 알코올로 답토마이신 적재 수지를 세척한다. 35% 이상의 아세토니트릴 또는 50% 초과의 이소프로필 알코올을 함유하는 1개 또는 3개의 컬럼층 부피의 아세테이트 완충액으로 답토마이신 적재 수지를 용출시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, pH 4.0∼5.0의 35% 아세토니트릴, 또는 55∼60% 이소프로필 알코올로 답토마이신을 용출시킨다. 다른 실시태양에 있어서, 증가된 pH에서 1개 내지 3개의 컬럼층 부피의 완충액으로 답토마이신 적재 수지를 용출시킨다. 이 실시태양에 있어서, 완충액의 pH를 점차 증가시켜, 전하차에 기인한 상이한 속도로 컬럼으로부터 상이한 화합물들을 용출시킨다. 상승된 pH, 예컨대 pH 6.0∼7.0에서, 용출 농도의 아세토니트릴은 10∼20%로 감소된다. 마찬가지로, 상승된 pH, 예컨대 pH 6.0∼7.0에서, 용출 농도의 이소프로필 알코올은 20∼25%로 감소된다. 또한, 크로마토그래피를 수행하는 온도의 조절은 용매 농도에 영향을 미친다. 보다 낮은 농도에서의 용출, 즉 냉동 조건 하에서의 용출은 모든 pH 조건에서 증가된 레벨의 용매를 필요로 한다.
HIC 후, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 답토마이신 제제 중의 유기 용매를 감소시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 전술한 바와 같이 FP-DA 13을 사용한다.
제2 음이온 교환 크로마토그래피 후, 냉동 조건 하에서 정제된 답토마이신으로부터 발열원을 제거하고, 여과하고, 농축시켰다. 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 답토마이신 여과를 수행할 수 있다. 한 실시태양에 있어서, 여과 및 발열원 제거는,
ⅰ) 답토마이신이 단량체 또는 비미셀 상태(non-micellart state)로 존재하는 조건 하에서 답토마이신 용액을 제공하는 단계;
ⅱ) 답토마이신은 여과기를 통과하지만, 발열원(pyrogen)은 여과기를 통과하지 않는 조건, 예컨대 pH 6.0∼8.0에서 답토마이신 용액을 보유하는 조건 하에서 답토마이신 용액을 여과하고, 3,000 NMW 내지 30,000 NMW 속도의 한외여과기로 상기 용액을 여과하는 단계;
ⅲ) 예컨대, 답토마이신이 응집하도록 답토마이신의 pH를 답토마이신이 미셀을 형성시킬 정도인 2.5∼4.5로 변화시켜, 여과기를 통과한 답토마이신 용액을 변경하는 단계;
ⅳ) 답토마이신이 여과기 상에 보유되는 조건[예컨대, 3,000 NMW 이하의 한외여과기(예: 역삼투막) 상의 답토마이신을 농축시키는 조건] 하에 답토마이신 용액을 여과하는 단계; 및
ⅴ) 발열원이 제거된 답토마이신을 수거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행할 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, 약 7∼8의 pH에서, 10,000 달톤의 분자량 컷오프(MWCO) 한외여과기 상에서 상기 단계 (ⅱ)의 답토마이신을 여과한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 40 mg/ml 이하의 초기 농도에서, 보다 바람직하게는 약 31.25 mg/ml의 농도에서, 답토마이신이 존재한다. 이 조건 하에서 답토마이신은 여과기를 통과하지만, 발열원[예컨대, 리포폴리사카라이드(LPS)]은 통과하지 못한다. 초기 한외여과 후, 여과물의 pH를 2.5 내지 4.5로 낮추고, 10,000 MWCO 한외여과기 상에서 여과물을 약 120 mg/ml로 농축시킨다. 이 조건 하에서 답토마이신은 여과기 상에 보유된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 여과물의 pH는 3.5이다. 농축 후, 답토마이신의 농도는 105 mg/ml로 조절하고, 내독소 레벨을 검사하며, 무균 조건 하에서 바이알을 충전시키는 데 사용한다.
다른 실시태양에 있어서, pH 1.5∼3.0에서 역삼투 나노여과를 수행한다. 낮은 pH 및 냉동 조건을 사용하여, 정제된 답토마이신의 분해를 지연시킨다. 0.2 ㎛ 여과기를 통해 답토마이신을 추가로 여과함으로써 생물적재물(bioburden)을 감소시킨 후, 대량으로 또는 바이알 중에 동결건조시킨다.
상기 한외여과 및 농축 공정에 대한 대안으로서, 약 4.5의 pH에서 부탄올 대 답토마이신 용액의 비율이 1부:9부 이상이 되도록 부탄올(n-, iso- 또는 t-부탄올)과 답토마이신 함유 용출 분획을 혼합한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 4부의 답토마이신 용액과 1부의 부탄올을 혼합하여, 20% 부탄올 용액을 수득한다. 부탄올-답토마이신 용액을 유기상과 수상(水相)으로 분리시킬 수 있다. 답토마이신은 수거된 유기상으로 분배시킨다. 유기 용매 중의 답토마이신의 탈수는 답토마이신을 안정화시키고, 정제된 답토마이신이 안하이드로-답토마이신으로 분해되고 연이어 β-이성체가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 마지막으로, pH 6.5∼7.5에서 유기상에 완충액을 가함으로써, 답토마이신을 수상으로 되돌릴 수 있다. 답토마이신의 농축 또는 수거 후, 답토마이신을 동결건조시킨다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 답토마이신 이외의 리포펩티드(예컨대, A54145, LY303366, 에키노칸딘스, 뉴모칸딘스, 아쿨레아신, 수르팍틴, 플리파스타틴 B1, 암포마이신, 또는 미국 특허 제5,629,288호에 기재되어 있는 리포펩티드 유도체)를 정제하는 데 프로세스 크로마토그래피 방법을 사용한다. 다른 실시태양에 있어서, A54145, 또는 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 최근 미국 일련번호 제09/547,357호로 재발행된 제5,912,226호, PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제를 비롯한 답토마이신 관련 리포펩티드를 정제하는 데 프로세스 크로마토그래피 방법을 사용한다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, "염운(Salt Cloud) 방법"[Genetic Engineering News, Vol. 19, No. 20, 1, 34 및 43 페이지(1999년 11월 15일)]은 답토마이신 또는 기타 리포펩티드의 정제에 사용한다. 염운 방법은 고용적의 처리 성능(throughput)과 선택적 분리를 조합하는 막계(membrane-based) 시스템이다. 본 명세서에 기재되어 있는 프로세스 단계와 함께 또는 별개로 염운 방법을 사용하여, 답토마이신 또는 기타 리포펩티드를 정제한다.
본 발명의 다른 실시태양은 선행 기술의 크로마토그래피 방법에 의해서는 달성할 수 없는, 고도로 정제된 리포펩티드를 제조하는 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 상기 크로마토그래피 방법은 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 리포펩티드 함유 제제를 정제하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 고도로 정제된 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 제조하는 데 상기 방법을 사용한다. 부분적으로 정제된 답토마이신을 이용하는 경우, 상기 방법은 순도가 98% 이상인 답토마이신을 생산한다. 또한, 상기 방법은 안하이드로-답토마이신이 없거나 본질적으로 없는 답토마이신을 생산한다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 부분적으로 정제된 답토마이신을 제조한다. 이어서, 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 답토마이신 제제를 추가로 정제한다. 답토마이신이 단량체 상태 및 비미셀 상태로 수지 이온에 결합하는 조건 하에, 적당한 이온성 개질 완충액의 존재 하에서 음이온 교환 수지에 답토마이신을 결합시킨다. 개질 완충액은 완충제(상기 완충제의 예로는 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트 및 Tris-HCl을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아님), 또는 중성 pH에서 완충 작용이 우수한 임의의 다른 완충제를 포함한다. 개질 완충액은 답토마이신이 불순물로부터 용이하게 분리되도록 완충액을 개질시킬 수 있는, 구아니딘, 암모니아, 우레아, 강력한 환원제, 벤조에이트, 아스코르베이트 또는 다른 이온성 증강제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 1 이상의 무질서유발제(chaotropic agent)를 추가로 포함한다. 적당한 이온성 개질 완충액으로 답토마이신 적재 수지를 세정하여, 안하이드로-답토마이신을 비롯한 불순물을 용출시킨다. 이어서, β-이성체를 비롯하여, 수지에 결합 상태로 남아있는 불순물로부터, 답토마이신의 분리를 가능하게 하는 조건 하에서 답토마이신을 용출시킨다.
바람직한 실시태양에 있어서, 개질 완충액은 중성 pH(pH 6 내지 8)에서 존재하고, 2 M 내지 6 M의 우레아를 함유한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 음이온 교환 수지는 Porous Resin P150 또는 Porous D50(PE Biosystems)이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 음이온 교환 수지는 Porous P150이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 낮은 이온 강도의 완충액 중의 수지에 답토마이신을 결합시키고, 낮은 이온 강도 내지 중간 정도의 이온 강도의 완충액으로 세정하고, 높은 이온 강도의 완충액으로 용출시킨다. 일 바람직한 실시태양에 있어서, 6 M의 우레아를 함유하는 pH 7.0의 Tris 완충액 중의 Porous P150 수지에 답토마이신을 결합시킨다. 답토마이신의 용출 없이 오염물 및 안하이드로-답토마이신을 제거하는 염 레벨을 함유하는 3개의 컬럼층 부피의 Tris 완충액 또는 다른 적당한 완충액으로 답토마이신 적재 Porous P150 수지를 세정한다. 컬럼에 결합된, β-이성체의 유의성 부분(significant portion)을 비롯하여 추가의 불순물을 남기는 상승된 염 조건 하에서 Tris 완충액 또는 다른 적당한 완충액으로 Porous P150 수지로부터 답토마이신을 용출시킨다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, Poros P150을 사용하고, 2 M의 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액 중의 수지에 답토마이신을 결합시킨다. 2 M의 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액을 사용한다는 점을 제외하고는 상기 방법과 유사하게 답토마이신 적재 Poros P150 수지를 세정하고, 용출시킨다. HPLC 또는 UV 모니터링에 의해 생성물 분획(fractionation)을 측정할 수 있다.
개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행하거나 배치 모드로 수행할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,756,680호, 제4,865,729호, 제4,840,730호 또는 제4,708,782호에 기재되어 있는 바와 같이, 방사류 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 수지를 세정하고, 단계식 염 구배 또는 연속식 염 구배로 용출시킬 수 있다. 적당한 단계식 또는 연속식 염 구배는, 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 불순물로부터 답토마이신의 분리를 가능하게 하는 것이면 어느 것이라도 무방하다. 바람직한 실시태양에 있어서, 연속식 염 구배는 0 내지 1000 mM NaCl이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 염 구배는 100 내지 500 mM NaCl 또는 0 내지 400 mM NaCl이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 답토마이신 이외의 리포펩티드 화합물을 정제한다. 상기 리포펩티드 화합물은 A54145, LY303366, 에키노칸딘스, 뉴모칸딘스, 아쿨레아신, 수르팍틴, 플리파스타틴 B1(Tsuge 등, 1996, Arch. Microbiol. 165:243∼251) 및 미국 특허 제5,629,288호에 나타나 있는 바와 같은 리포펩티드 유도체를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시태양에 있어서, 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 답토마이신 관련 리포펩티드[예컨대, A54145, 또는 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 최근 미국 일련번호 제09/547,357호로 재발행된 제5,912,226호, PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제]를 정제한다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 프로세스 크로마토그래피의 신규한 조합을 사용하여, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 정제한다. 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피, 소립자 역상 크로마토그래피, 및 개질 완충액이 증강된 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 상기 정제 방법은 스트렙토마이세스 로세오스포러스에 의해 A21978C 함유 조생성물을 생산하는 발효 조건을 변경시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 순도가 98% 이상인 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 생성시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 순도가 99% 이상인 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 생성시킨다.
프로세스 크로마토그래피 방법의 바람직한 실시태양은 후술하는 바와 같다:
전술한 바와 같이 데칸산을 공급하여 발효의 총수율을 감소시키지 않으면서, 가능한 최저 레벨로 유지되도록 변형함으로써, 미국 특허 제4,885,243호에 기재되어 있는 것과 같이 n-데칸산을 공급하여 스트렙토마이세스 로세오스포러스를 발효시킨다. 대안의 실시태양에 있어서, 상이한 공급원료(feedstock)를 답토마이신 핵에의 부가를 위해 n-데카노일기를 궁극적으로 제공하는 한, 상이한 공급원료를 사용할 수 있다. 상기 공급원료의 예로는 데칸산 아미드, 데칸산 에스테르(부틸 에스테르를 포함함), 코코넛 또는 야자유의 조(粗) 공급원, 데칸산의 동물 공급원, 각종 데칸산 염 및 데칸산의 석유화학 공급원을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 발효 후, 전술한 바와 같이 세포외 용액을 정화한다. 대안의 실시태양에 있어서, 전술한 바와 같이, 용매 분리용 원심분리기 또는 여과기 상에서의 정화 공정 이전에 유기 용매(예컨대, n-부탄올)를 사용하여 균사체로부터 답토마이신을 추출할 수 있다. 전술한 바와 같이, 발효 브로스의 정화 후, 우선 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후 HIC를 수행함으로써, 정화 용액 중의 답토마이신 레벨을 증강시킨다.
HIC의 완결 후, 당업계에 공지된 방법에 의해 답토마이신 제제 중의 유기 용매를 감소시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 전술한 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 유기 용매를 감소시킨다. 개질 완충액 증강 크로마토그래피를 위해 필요한 완충액과 상용성이 있는 완충액 중에서 컬럼으로부터 답토마이신을 용출시켜야 한다. 대안으로, 용출 완충액을 10,000 MWCO 여과기 상에서의 역삼투 또는 여과에 의한 개질 완충액으로 교환할 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 완충액 중에서의 증발 또는 희석에 의해 유기 용매를 감소시킨다. 제3의 바람직한 실시태양에 있어서, pH 1.5∼4.0에서의 역삼투 또는 pH 2.5∼4.5에서의 한외여과를 사용하여, 역상 크로마토그래피 용매 및 잔류 염을 제거한다. 그 결과로 생성되는 생성물은 대량 저장을 위해 동결시키거나 또는 동결건조에 의해 건조시킨 후, 개질 완충액 증강 음이온 교환 크로마토그래피를 위해 수중에서 또는 사용된 완충액 중에서 재수화시킨다.
전술한 바와 같이, 개질 완충액 증강 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 답토마이신을 추가로 정제한다.
개질 완충액 증강 음이온 교환 크로마토그래피 후, 냉동 조건 하에서 정제된 답토마이신을 여과하고 농축시킨다. 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 답토마이신 여과를 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 전술한 바와 같이 답토마이신에서 발열원을 제거하여 농축시킨다. 대안으로, 1.5 내지 4의 pH에서 냉동 조건 하에 역삼투에 의해 답토마이신을 농축시킬 수 있다. 낮은 pH 및 냉동 조건을 사용하여, 정제된 답토마이신의 분해를 지연시킨다.
상기 여과 및 농축 공정의 대안으로서 또는 상기 여과 및 농축 공정 이외에, 부탄올:답토마이신 용액의 비율이 1부:9부 이상이 되도록 약 4.5의 pH에서 개질 완충액 증강 음이온 교환 크로마토그래피로부터 유래한 답토마이신을 함유하는 용출 분획을 부탄올(n-, iso- 또는 t-부탄올)과 혼합할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 4부의 답토마이신 용액과 1부의 부탄올을 혼합하여, 20%의 부탄올 용액을 수득한다. 부탄올-답토마이신 용액을 유기상과 수상으로 분리시킬 수 있다. 답토마이신을 유기상에 분배시키고, 이를 수거한다. 유기 용매 중의 답토마이신의 탈수는 답토마이신을 안정화시키고, 정제된 답토마이신이 안하이드로-답토마이신으로 분해된 후 연이어 β-이성체를 형성시키는 것을 방지한다.
답토마이신의 농축 및 수거 후, 답토마이신을 동결건조시킨다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 프로세스 크로마토그래피를 사용하여, 답토마이신 이외의 리포펩티드(전술한 바와 같음)를 정제한다.
리포펩티드 미셀의 형성 및 이의 사용 방법
본 발명의 다른 실시태양은 리포펩티드 미셀, 리포펩티드 미셀을 형성하는 방법, 리포펩티드의 정제를 위해 리포펩티드 미셀을 사용하는 방법, 및 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 특히 답토마이신, A54145, 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 제5,912,226호(최근 미국 일련 번호 제09/547,357호로서 재발행됨), PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 A-21978 항생제(답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환됨)를 비롯한 답토마이신 관련 분자이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다.
미셀은 양친매성 분자의 응집물이다. 수성 매질에서, 상기 분자의 친유성 부분은 미셀의 내부를 향하고, 상기 분자의 친수성 부분은 수성 매질과 접촉한다. 분자의 농도가 충분히 높은 경우, 미셀은 양친매성 분자를 함유하는 용액 중에서 동시에 형성된다.
미셀 형성은 삼투압, 탁도(濁度), 전기 전도성, 표면 장력, 공이온(co-ion)과 상대 이온의 활성(이온성 양친매성 분자의 경우), 굴절률, UV 및 NMR 스펙트럼, 부분 몰부피, 점도, 확산 계수 및 염료의 가용성에 있어서의 변화를 비롯한 몇몇 총괄(bulk) 물리적 특성에 있어서의 변화를 야기한다. 양친매성 분자의 농도의 함수로서 상기 1 이상의 미셀 의존성 물리적 특성을 측정함으로써, cmc를 결정할 수 있다. 동적(dynamic) 레이저광 산란, 초원심분리, 점도 및/또는 저각도(low-angle) X선 산란 실험에 의해, 미셀의 크기 및 형상을 측정할 수 있다. 또한, 미셀은 액정상 중에 존재할 수 있다.
cmc를 초과하는 일정 농도의 리포펩티드를 제공함으로써, 리포펩티드를 미셀로 응집시킬 수 있다. cmc는 리포펩티드의 성질 및 온도, 리포펩티드를 포함하는 수용액의 염 농도 및 pH에 의존적이다. 리포펩티드의 성질의 경우, 친유성 탄소쇄에 CH2기를 부가함으로써, 리포펩티드의 cmc를 감소시킬 수 있다. 따라서, 특정 염 농도, 온도 및 pH에서 답토마이신에 대한 cmc가 주어진 경우, 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일 또는 n-노나노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 타입의 항생제는 답토마이신의 cmc에 비하여 상대적으로 더 높은 cmc를 갖는 반면에, 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제는 답토마이신의 cmc에 비하여 상대적으로 더 낮은 cmc를 갖는다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 리포펩티드에 CH2기를 가감(加減)함으로써, 리포펩티드의 cmc를 조작할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978이다. 다른 실시태양에 있어서, 본 명세서의 교시에 따라, 대략적인 리포펩티드의 cmc를 계산할 수 있다. 리포펩티드(예컨대, 답토마이신)에 대한 cmc가 주어진 경우, 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 관련 리포펩티드의 대략적인 cmc를 계산할 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, 하나의 리포펩티드에 대한 cmc가 주어진 경우, 관련 펩티드 부분을 함유하는 리포펩티드에 대한 대략적인 cmc를 계산할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 답토마이신에 대한 cmc 및 선행 기술의 교시가 주어진 경우, A54145, 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 제5,912,226호(최근 미국 일련 번호 제09/547,357호로서 재발행됨), PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 답토마이신 관련 리포펩티드와 같은 관련 리포펩티드에 대한 cmc를 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 리포펩티드를 포함하는 용액의 온도를 변화시킴으로써, 리포펩티드의 cmc를 조작한다. 통상, 상기 용액의 온도가 증가됨에 따라 리포펩티드의 cmc는 증가한다. 따라서, 상기 온도를 감소시킴으로써 미셀 형성을 촉진시키고, 상기 온도를 증가시킴으로써 미셀 형성을 지연시킨다. 예를 들어, 리포펩티드를 포함하는 용액은 4℃에서 미셀을 형성시킬 수 있는데, 이는 상기 온도에서 cmc가 낮아지고, 리포펩티드 농도가 cmc보다 높기 때문이다. 그러나, 동일한 리포펩티드 용액은 20℃에서 단량체성일 수 있는데, 이는 온도의 증가에 따라 cmc가 증가하고, 리포펩티드 농도가 cmc보다 낮기 때문이다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드의 농도는 온도가 높아짐에 따라, 한 온도에서는 cmc보다 높고, 다른 온도에서는 cmc보다 낮다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 분자이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, cmc에 영향을 미치도록 상이한 온도를 사용함으로써, 리포펩티드 미셀의 형성을 조작할 수 있는 성능을 리포펩티드의 정제에 사용한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 분자이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 온도를 변경함으로써 리포펩티드 미셀 형성을 조작할 수 있는 성능은, 특정 온도 조건 하에서 미셀성(micellar)이고, 다른 온도 조건 하에서 단량체성인 약학 조성물을 제조하는 데 사용한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 답토마이신을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 전해질을 첨가함으로써, 이온성 리포펩티드의 cmc를 감소시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드를 포함하는 용액에 염(예컨대, NaCl)을 첨가하여, 리포펩티드 미셀 내의 하전된 작용기 간의 반발(repulsion)을 감소시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 분자이다. 예를 들어, 답토마이신의 펩티드 부분은 3개의 아스파르트산 잔기 및 1개의 L-트레오-3-메틸글루탐산 잔기(3-MG)를 함유하는데, 상기 잔기들은 모두 중성 pH에서 하전된다. 따라서, 전해질(예컨대, NaCl 또는 등가물의 염)의 첨가는 답토마이신의 cmc를 감소시킬 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 염 농도는 100 mM 이상이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 염 농도는 150 mM 내지 300 mM이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 염은 NaCl이다.
아스파르트산 잔기, 3-MG 잔기 또는 기타 하전된 잔기를 함유하는 답토마이신과 관련된 분자와 같은 다른 리포펩티드의 경우, 전해질를 첨가함에 따라 cmc가 감소된다는 것이 관찰된다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어서, 용액에 염을 첨가하여, A54145, 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 제5,912,226호(최근 미국 일련 번호 제09/547,357호로서 재발행됨), PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제와 같은 답토마이신 관련 리포펩티드의 cmc를 감소시킨다. 다른 실시태양에 있어서, 염 농도를 감소시킴으로써, 이온성 리포펩티드의 cmc를 증가시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 이온성 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, cmc에 영향을 미치도록 전해질 농도를 변경시킴으로써 리포펩티드 미셀의 형성을 조작할 수 있는 성능은 리포펩티드의 정제에 사용한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 전해질 농도에 의해 리포펩티드 미셀 형성을 조작할 수 있는 성능은, 특정 전해질 농도에서 미셀성이고, 다른 전해질 농도 하에서는 단량체성인 약학 조성물을 제조하는 데 사용한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 답토마이신을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 리포펩티드를 포함하는 용액의 pH를 조작하여, 리포펩티드의 cmc에 영향을 미친다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 일 실시태양에 있어서, pH를 조작함으로써, 리포펩티드의 농도가 한 pH에서는 cmc보다 높고, 다른 pH에서는 cmc보다 낮도록 한다. 예를 들어, 답토마이신의 경우, 20∼25℃의 수중에서 pH 4.0일 때의 cmc는 pH 6.0 또는 7.5일 때의 cmc보다 더 낮았다. pH 4.0일 때, cmc는 상기 조건 하에서 약 400 ㎍/ml이다. 도 15를 참조한다. 또한, 답토마이신은 pH 6.5일 때 150 mg/ml의 답토마이신 농도에서도 단량체성이다(여기서, 염 농도는 150 mM 내지 300 mM NaCl이고, 온도는 4℃이다). 따라서, 답토마이신의 경우, pH 4.0일 때의 cmc는 상기 pH보다 높거나 낮은 pH의 용액 중에 존재할 때보다 더 낮다. 또한, 상이한 pH 레벨에서의 cmc 변화는 전술한 바와 같은 답토마이신과 관련된 리포펩티드를 비롯하여, 다른 하전된 리포펩티드에 사용할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, cmc에 영향을 미치도록 pH를 변경시킴으로써 리포펩티드 미셀의 형성을 조작할 수 있는 성능은 리포펩티드의 정제에 사용한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, pH에 의해 리포펩티드 미셀 형성을 조작할 수 있는 성능은, 특정 pH에서는 미셀성이고, 다른 pH 하에서는 단량체성인 약학 조성물을 제조하는 데 사용한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 전술한 바와 같은 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 약학 조성물은 답토마이신을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 리포펩티드는 혼합형 미셀의 일부일 수 있다. 혼합형 미셀은 리포펩티드가 1 이상의 다른 타입의 양친매성 분자와 함께 미셀을 형성하는 것이다. 상기 양친매성 분자의 예로는 중쇄 및 장쇄 지방산, 포스포글리세리드(인지질), 스핑고마이엘린, 당지질 및 콜레스테롤을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일 실시태양에 있어서, 중쇄 길이의 알코올은 미셀 내로 혼입될 수 있는데, 이 때 정전기적 반발 및 입체 장해를 감소시킨다. 다른 실시태양에 있어서, 1 이상의 타입의 양친매성 분자의 첨가는 미셀 구조를 구형 미셀[도 14 (a) 참조]에서 평면형(planar) 지질 이중층 구조[도 14 (b) 참조] 또는 리포솜 구조[도 14 (c) 참조]로 변경시키는 데 사용할 수 있다. 일반적으로, 인지질 및/또는 당지질을 포함하는 혼합형 미셀은 구형 미셀을 이온 및 대부분의 극성 분자에 대한 투과 장벽으로서의 역할을 하는 지질 이중층 구조로의 전환을 야기할 것이다.
다른 실시태양에 있어서, 2 이상의 상이한 리포펩티드로부터 혼합형 미셀을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 답토마이신 및 다른 리포펩티드(예컨대, 전술한 바와 같은 A54145 또는 답토마이신 관련 리포펩티드)로부터 혼합형 미셀을 형성시킬 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 혼합형 미셀은 1 이상의 치료적으로 유용한 양친매성 분자(예컨대, 당업자에게 공지된 항생제, 소염제 또는 항진균제)와 함께 리포펩티드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드(예컨대, A54145, 전술한 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제)이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 미셀(혼합되거나 또는 단일 타입의 리포펩티드 분자를 포함하는)은 치료적으로 유용한 리포펩티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 항생제이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 답토마이신은 수중에서 pH가 약 4.0이고 농도가 1 mg/ml일 때 약 5.4 nm(54 Å)의 미셀을 형성시킨다. 도 16을 참조한다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, 미셀은 1 이상의 상이한 타입의 치료 물질을 포함한다. 일 실시태양에 있어서, 용액 중에서 리포펩티드와 치료 물질을 혼합함으로써, 리포펩티드로부터 미셀을 형성시키고, 소수성 내부에서 치료 물질을 포집할 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 리포펩티드 및 1 이상의 다른 양친매성 분자와 치료 물질을 혼합함으로써, 리포펩티드 및 다른 양친매성 분자로부터 미셀을 형성시키고, 소수성 내부에서 치료 물질을 발견한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 항생제, 소염제 또는 항진균제이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 상기 항생제 또는 항진균제이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 소수성 환경에서는 가용성이지만, 수용액에서는 불용성이다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 구형 지질 이중층이 수성 내부를 둘러싸는 소포체인 리포솜 내에 리포펩티드를 형성시킬 수 있다. 도 14(c)를 참조한다. 리포솜은 원형질막(plasma membrane)과 용이하게 융합하기 때문에 치료용으로 장점이 있으며, 또한 내부 수성 구획 내의 물질을 포집하는 데 사용할 수 있다. 상기 물질은 수용액 중에서 오로지 가용성인 것이다. 일 실시태양에 있어서, 리포펩티드 및 다른 양친매성 분자를 포함하는 용액을 초음파 처리하여, 리포솜을 생성시킬 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 리포펩티드만 초음파 처리하여, 리포솜을 생성시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포솜은 답토마이신, 또는 답토마이신 관련 리포펩티드[예컨대, A54145, 미국 특허 제4,537,717호, 제4,482,487호, 제Re. 32,311호, 제Re. 32,310호, 제5,912,226호(최근 미국 일련 번호 제09/547,357호로서 재발행됨), PCT 국제공개공보 WO 01/44272, WO 01/44274 및 WO 01/44271에 기재되어 있는 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제]를 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, 리포솜은 내부 수성 구획 내에 1 이상의 치료 물질을 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 항생제, 소염제 또는 항진균제이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 전술한 항생제 또는 항진균제이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 수용액에서 가용성이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 리포솜을 포함한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 치료 물질을 함유하는 리포펩티드 미셀 타입의 구성체(arrangement)를 포함한다. 리포펩티드 미셀 타입의 구성체는 구형 미셀, 혼합형 미셀 또는 리포솜일 수 있다. 리포펩티드 미셀을 포함하는 약학 조성물은 주사시 또는 정맥내 투여시 국소 자극을 최소화할 수 있다. 일 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 염, 완충액을 포함하여 특정 pH 및 미셀을 유지한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 1 이상의 제제를 포함하여, 미셀을 안정화시키고/안정화시키거나, 리포펩티드 또는 다른 치료 물질을 안정화시킨다. 일 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 1 이상의 치료 물질도 또한 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 항생제, 소염제 또는 항진균제이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 치료 물질은 전술한 항생제 또는 항진균제이다. 치료 물질은 미셀 중에 혼입하는 치료 물질 뿐만 아니라, 미셀 중에 혼입하는 치료제일 수 있다.
약학 조성물은 건조시키거나 동결건조시킬 수 있는데, 이 경우 약학 조성물에 수용액(예컨대, 물) 또는 완충액을 첨가할 때 미셀이 형성된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 동결건조되고, 재구성될 때 생리적 농도의 염을 함유하며, 무균수 또는 다른 완충액이 첨가될 때 실온에서 미셀이 자발적으로 형성되는 pH를 유지하는 완충액을 함유한다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 답토마이신 또는 관련 리포펩티드(예컨대, A54145), 전술한 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제를 포함한다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다. 다른 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 수성이다. 이는 리포솜을 사용하는 경우에 바람직하다. 바람직한 실시태양에 있어서, 약학 조성물은 리포솜용 안정화제를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 미셀 용액을 분리 및/또는 정제한다. 일 실시태양에 있어서, 한외여과에 의해 보다 작은 치환기로부터 미셀을 분리시킨다. 한외여과 막의 선택은 미셀의 크기에 기초한다. 일반적으로, 10,000 NMW 또는 30,000 NMW의 막은 보다 작은 치환기(예컨대, 오염물)를 관통하여 흐르도록 허용하는 동안 미셀을 보유시키는 데 충분하다. 다른 실시태양에 있어서, 투석, 밀도 구배 원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 미셀을 분리 및/또는 정제할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시태양에 있어서, 미셀의 순도는 30% 이상인데, 상기 순도는 단량체 형태의 리포펩티드 또는 다른 분자의 중량과 비교되는 미셀의 중량으로서 측정한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 미셀의 순도는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 리포펩티드 미셀을 형성시킨 후, 온도, pH, 전해질 농도 및/또는 리포펩티드 농도를 변경시킴으로써 상기 미셀을 해리시킬 수 있는 성능은 리포펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 일 실시태양에 있어서, 상기 방법은 리포펩티드가 미셀을 형성시키는 조건을 리포펩티드에 가함으로써, 저분자량의 오염물로부터 리포펩티드를 정제하는 단계; 및 이어서, 크기 선별 기법(예컨대, 한외여과법 또는 크기 배제 크로마토그래피법)에 의해 오염물로부터 미셀을 분리시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 상기 방법은 리포펩티드가 미셀을 형성시키는 조건을 리포펩티드에 가함으로써, 리포펩티드를 농축시키는 단계; 및 이어서, 크기 선별 기법에 의해 리포펩티드를 농축시키는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 단일 단계로서의 정제 및 농축 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 상기 방법은 리포펩티드가 단량체성인 조건을 리포펩티드에 가함으로써, 발열원(예: 리포폴리사카라이드)을 비롯한 고분자량의 오염물로부터 리포펩티드를 정제하는 단계; 및 이어서, 크기 분리 기법에 의해 고분자량의 오염물로부터 단량체성 리포펩티드를 분리시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 크기 분리 기법은 전술한 한외여과법이다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신 또는 관련 리포펩티드(예컨대, A54145), 전술한 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제이다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 답토마이신이다.
미셀을 사용하여 답토마이신을 정제하는 프로세스 크로마토그래피 방법의 바람직한 실시태양은 후술하는 바와 같다:
전술한 n-데칸산을 공급하여 스트렙토마이세스 로세오스포러스를 발효시킨다. 발효 후, 전술한 바와 같이 세포외 용액을 정화한다.
이어서, 전술한 바와 같이 음이온 교환 수지(예컨대, FP-DA 13)에 정화된 제제를 도포한다. 300 mM 내지 500 mM NaCl을 함유하는 1개 내지 3개의 컬럼층 부피의 상승된 염 완충액으로 컬럼으로부터 답토마이신을 용출시킨다.
산을 사용하여, 용출된 답토마이신 제제의 pH를 2.5 내지 5로 조절한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 산은 묽은 인산이다. 2.5 내지 4.7의 pH, 300 mM 내지 500 mM NaCl 및 2∼15℃의 온도에서, 답토마이신은 미셀을 형성한다.
10,000 NMW 내지 30,000 NMW의 한외여과 막 상에서 답토마이신 제제를 여과한다. 한외여과 과정 중, pH 3.5 및 최대 15℃의 온도에서 30 mM의 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 답토마이신 제제를 세정한다. 용출 조건 때문에 초기 염 농도는 300 mM NaCl이나, 세정이 계속됨에 따라 염 농도는 감소한다. 답토마이신은 미셀 형태로 존재하기 때문에, 10,000 내지 30,000보다 작은 불순물(사용되는 여과기에 의존됨)이 여과기를 통과하는 동안, 답토마이신은 여과기 상에 보유된다. 수득되는 답토마이신 제제는 약 85∼90%의 순도를 가진다.
임의의 공정으로서, 답토마이신 제제를 희석시키고, 답토마이신 제제의 pH를 6.5로 상승시켜, 답토마이신을 단량체 상태로 전환시킬 수 있다. 이어서, 10,000 NMW의 한외여과 막을 통해 답토마이신 제제를 통과시킨다. 상기 임의의 공정은 발열원 함량을 유의적으로 감소시킨다.
답토마이신의 순도를 분석하는 방법
본 발명의 다른 실시태양은 답토마이신의 순도를 측정하는 분석 방법을 제공한다.
선행 기술에 있어서, 불순물을 가시화하고 측정할 수 있는 성능이 이용가능한 분석 방법 및 장비에 의해 제한되기 때문에, 답토마이신과 함께 공(共)정제되는 다수의 오염물은 미분해되거나 미동정된다. 예컨대, 미국 특허 제4,874,843호 및 Kirsch 등의 문헌을 참조한다. 보다 우수한 감도의 분석용 HPLC 시스템 및 기법의 개발은 선행 기술의 방법에 의해 제조된 답토마이신 배치 내에 존재하는 다수의 오염물의 분해를 가능하게 한다. 고도의 분해능의 HPLC 방법은, 선행 기술의 방법에 의해 정제된 답토마이신이 선행 기술의 방법의 실시 도중 이전에 동정된 불순물(예컨대, 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체), 및 답토마이신(및 이전에 공표된 HPLC 검출 조건 하의 공용출물)과 함께 공정제되는 다른 미지의 오염물로 오염된다는 것을 입증한다. 이제, 상기 오염물의 동정은 상기 오염물을 제거하도록 고안된 방법의 개발을 가능하게 한다.
전술한 바와 같이, 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체는 답토마이신의 제조 과정 중 계속하여 일관되게 발생되는 불순물이다. 본 명세서에 기재되어 있는 HPLC 분석을 사용하여, 답토마이신 제조 과정 중에 생성되는 추가의 약 12종의 불순물을 구별하였는데, 종래에는 그 중 일부가 미동정되었다. 상기 불순물은 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 방법에 의한 정제 후에 제거되지 않았다. 이들 화합물 중 10종 이상은 동정되었다(예컨대, 도 2∼11 참조). 더욱이, 이들 화합물 중 6종 이상은 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체 형태의 답토마이신을 생성시키는 반응의 직접적인 결과물이 아니라, 오히려 답토마이신의 발효 또는 정제 과정 중에 발생하는, 다른 비관련 방법에 의해 생성되는 화합물이다. 또한, 후술하는 본 발명의 방법은 다수의 상기 불순물의 레벨을 유의적으로 감소시킨다(실시예 참조).
당업계에 공지된 방법을 사용하여, 답토마이신 제제 중의 다른 화합물의 양을 측정할 수 있다. 답토마이신 오염물을 동정하는 방법은 질량 분광법, 적외선 분광법, 모세관 전기영동법 및 핵 자기 공명 분광법을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 답토마이신 제제 중의 다른 화합물의 양을 측정하는 바람직한 방법은 HPLC 방법이다.
2가지 방법을 사용하여, 본 발명에 있어서의 답토마이신 불순물을 측정하였다. 제1 방법은 제2 방법보다 약간 저분해능인 분해 방법이다. 2가지 방법 모두에 있어서, PE Nelson의 Turbochrom 소프트웨어 버전 4.1이 장착된 Shimadzu 또는 HP HPLC 시스템을 사용한다. "제1" 분해 방법은 표 1에 요약되어 있고, "제2" 분해 방법은 표 2에 요약되어 있다.
표 1
1. 용매 전달 시스템:
방식(Mode): 등용매 펌프(Isocratic Pumping) 방식
유속: 1.5 ml/분
운전 시간: 30분
2. 용매 A: pH 4.5에서, 0.5% NH4H2PO4 중의 34% 아세토니트릴
용매 B: pH 4.5에서, 0.5% NH4H2PO4 중의 20% 아세토니트릴
표적(target) 조건은 15.0 ± 0.5분일 때 답토마이신을 보유시키는 것이다. 용매 A와 함께 용매 B를 사용하여, HPLC 이동상 조건을 조절함으로써, 소정의 머무름 시간(retention time)을 달성할 수 있다.
3. 자동 시료 주입기(autosampler) 냉각기: 5℃(4 내지 6℃)
4. 주입 부피: 5 ㎕ 내지 75 ㎕(통상 20 ㎕)
5. 컬럼: IB-SIL(Phenomenex), C-8, 5 μ, 4.6 mm × 250 mm(또는 등가물)
6. 예비 컬럼(Pre-Column): IB-SIL(Phenomenex), C-8, 5 μ, 4.6 mm × 30 mm(또는 등가물)
7. 검출 파장: 214 nm
8. 컬럼 온도: 상온
9. 적분: 피크 면적을 측정할 수 있는 컴퓨터 시스템 또는 적분기(integrator)
표 2
1. 용매 전달 시스템:
방식: 등용매 펌프 방식
유속: 1.5 ml/분
운전 시간: 75 분
2. 용매 A: pH 3.25에서, 0.45% NH4H2PO4 중의 20% 아세토니트릴
용매 B: pH 3.25에서, 0.45% NH4H2PO4 중의 50% 아세토니트릴
표적 조건은 36.0 ± 1.5분일 때 답토마이신을 보유시키는, pH 3.25에서, 0.45% NH4H2PO4 중의 약 35% 아세토니트릴(50%의 용매 B)이다; 그러나, 용매의 비율을 이용하여, HPLC 이동상 조건을 조절함으로써, 소정의 머무름 시간을 달성할 수 있다.
3. 자동 시료 주입기 냉각기: 5℃(4 내지 6℃)
4. 주입 부피: 5 ㎕ 내지 75 ㎕(통상 20 ㎕)
*5. 컬럼: IB-SIL(Phenomenex), C-8, 5 μ, 4.6 mm × 250 mm(또는 등가물)
6. 예비 컬럼: IB-SIL(Phenomenex), C-8, 5 μ, 4.6 mm × 30 mm(또는 등가물)
7. 검출 파장: 214 nm
8. 컬럼 온도: 25℃(22 내지 28℃)
9. 적분: 피크 면적을 측정할 수 있는 컴퓨터 시스템 또는 적분기
정제된 리포펩티드, 약학 조성물, 및 이들의 사용 방법
본 발명의 다른 목적은 정제된 리포펩티드, 이의 염, 에스테르, 아미드, 에테르, 및 보호 형태 뿐만 아니라, 정제된 리포펩티드 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드는 전술한 바와 같이 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 본 발명의 또 다른 목적은 리포펩티드 미셀 타입의 구성체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 바람직한 실시태양에 있어서, 리포펩티드 미셀은 답토마이신 또는 1 이상의 답토마이신 관련 리포펩티드를 포함하는 미셀이다. 본 명세서에서 리포펩티드 미셀이라 함은 모든 리포펩티드 미셀을 의미할 뿐만 아니라, 구체적으로는 답토마이신, 관련 리포펩티드(예컨대, A54145), 전술한 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 답토마이신의 n-데카노일 지방산 측쇄가 n-옥타노일, n-노나노일, n-운데카노일, n-도데카노일, n-트리데카노일 또는 n-테트라데카노일 지방산 측쇄로 치환된 A-21978 항생제를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 리포펩티드 미셀 타입의 구성체라 함은 구체적으로 전술한 바와 같은 구형 미셀, 혼합형 미셀 및 리포솜을 의미한다.
정제된 리포펩티드, 이의 약학적 허용 염 또는 리포펩티드 미셀은 질병, 특히 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 에어로졸 투여, 국소 투여 또는 비경구 투여용으로 제제화할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 정제된 리포펩티드는 정제된 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드이다. 본 명세서에서 "정제된 답토마이신", "정제된 답토마이신 관련 리포펩티드" 또는 "정제된 리포펩티드"라 함은 이들의 약학적 허용 염을 포함한다. 답토마이신 또는 소정의 리포펩티드와 상용성인 임의의 약학적 허용 담체 또는 부형제를 사용하여, 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드 미셀을 제제화할 수 있다. 예컨대, 인간의 질병을 치료하기 위한 각종 항미생물 제제를 투여하는 방법의 일반적 설명이 기재되어 있는 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name, Chemical, Function, and Manufacturer, Ashgate Publishing Co., eds., M. Ash and I. Ash, 1996], [The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, ed. S. Budavari, annual]; [Remington's Pharmaceutical Sciences, 펜실베니아주 이스톤 소재 Mack Publishing Company]; [Martindale: The Complete Drug Reference, ed. K. Parfitt, 1999] 및 [Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 뉴욕주 뉴욕 소재 Pergamon Press, ed. L. S. Goodman 등](상기 문헌들의 내용은 본 명세서에 참고로 인용함)을 참조한다. 본 발명의 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드 미셀을 종래의 약학적 허용 담체 및 부형제와 혼합하고, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 현탁제, 시럽제, 카세제(wafer), 크림제 등의 형태로 사용할 수 있다. 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드 미셀을 전술한 바와 같은 다른 치료 제제 및 항생제와 혼합할 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약 0.1 내지 약 90 중량%, 보다 일반적으로는 약 10 내지 약 30 중량%의 활성 화합물을 함유할 것이다.
방출 조절성 전달 시스템(예: 캡슐제) 또는 서방성 전달 시스템[예: 생체침식성(bioerodable) 매트릭스]을 사용하여 본 발명의 조성물을 전달할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여에 적당한, 대표적인 약물 전달용 서방성 전달 시스템은 미국 특허 제4,452,775호(Kent에게 부여됨), 제5,239,660호(Leonard에게 부여됨) 및 제3,854,480호(Zaffaroni에게 부여됨)에 기재되어 있다.
상기 조성물은 통상의 담체 및 부형제(예컨대, 옥수수 전분 또는 젤라틴, 락토오스, 수크로오스, 미정질 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 염화나트륨 및 알긴산을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 크로스카르멜로오스 나트륨, 미정질 셀룰로오스, 옥수수 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 알긴산을 함유할 수 있다.
정제의 결합제로는 아카시아, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 수크로오스, 전분 및 에틸셀룰로오스를 들 수 있다.
사용가능한 활택제로는 마그네슘 스테아레이트 또는 기타 금속 스테아레이트, 스테아르산, 실리콘 유체, 운모, 왁스, 오일 및 콜로이드성 실리카를 들 수 있다.
또한, 향미제(flavoring agent)(예컨대, 박하, 동백유, 체리 향미제 등)를 사용할 수 있다. 또한, 착색제를 첨가하여, 제형의 외형을 보다 미적으로 하거나 또는 제품의 확인을 돕는 것이 바람직하다.
경구용의 경우, 고형 제제(예컨대, 정제 및 캡슐제)가 특히 유용하다. 또한, 서방성 제제 또는 장용 코팅 제제를 고안할 수 있다. 소아용 및 노인용의 경우, 현탁제, 시럽제, 저작정(chewable tablet)이 특히 적당하다. 경구 투여용의 경우, 약학 조성물은 예컨대 정제, 캡슐제, 현탁제 또는 액체의 형태로 존재한다. 바람직하게는, 치료 유효량의 활성 성분을 함유하는 제형 단위의 형태로 약학 조성물을 제조한다. 상기 제형 단위의 예는 정제 및 캡슐제이다. 치료 목적의 경우, 정제 및 캡슐제는 활성 성분 뿐만 아니라, 종래의 담체[예컨대, 결합제(예: 아카시아 검, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 소르비톨 또는 트라가칸트), 충전제(예: 인산칼슘, 글리신, 락토오스, 옥수수 전분, 소르비톨 또는 수크로오스), 활택제(예: 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카 또는 운모), 붕해제(예: 감자 전분), 향미제 또는 착색제, 또는 허용가능 습윤제]를 함유할 수 있다. 일반적으로 수성 또는 유성 용액 제제, 현탁제, 유제, 시럽제 또는 엘릭실제의 형태로 존재하는 경구용 액제는 종래의 첨가제(예: 현탁화제, 유화제, 비수용성 제제, 보존제, 착색제 및 향미제)를 함유할 수 있다. 경구용 액제는 리포펩티드 미셀 또는 단량체 형태의 리포펩티드를 포함할 수 있다. 액제용 첨가제의 예로는 아카시아, 아몬드 오일, 에틸 알코올, 분별증류된 코코넛 오일, 젤라틴, 글루코오스 시럽, 글리세린, 가수소화 식용 지방, 레시틴, 메틸 셀룰로오스, 메틸 또는 프로필 파라-히드록시벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 소르브산을 들 수 있다.
정맥내(IV) 투여용의 경우, 수용성 형태의 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드는, 통상 사용되는 정맥내 유체 중에 용해시키고, 주입(infusion)에 의해 투여할 수 있다. 리포펩티드 미셀의 경우, 리포펩티드가 cmc 초과의 농도에서 존재하는 조건 하에서 정맥내 투여용 제제 중에 리포펩티드를 용해시킨다. 당업자는 본 발명의 교시에 따라 pH, 온도 또는 염 농도를 다양하게 변화시켜, 리포펩티드 미셀을 포함하는 정맥내 투여용 용액을 수득할 수 있다. 또한, 당업자는 리포펩티드 용액을 초음파 처리하여, 리포펩티드 리포솜을 수득할 수 있다. 정맥내 투여용 제제는 칼슘, 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 염화칼슘, 카르보네이트 및 기타 염을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 정맥내 수액(intravenous fluid)은 생리 식염수 또는 링거액을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드를 주사기, 카뉼라(cannula), 카테터(catheter) 및 라인(line) 내에 배치할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 수성 또는 비수성의 등장성 무균 주사 용액 제제 또는 현탁제의 형태로 존재할 수 있다. 상기 용액 제제 또는 현탁제는 경구 투여용 제제에 사용되는 전술한 1 이상의 담체를 함유하는 무균 분말 또는 과립으로부터 제조할 수 있다. 리포펩티드 미셀은 비경구 투여용으로 특히 바람직할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수유, 벤질 알코올, 염화나트륨 및/또는 각종 완충액 중에 상기 화합물을 용해시킬 수 있다. 근육내 투여용 제제의 경우, 리포펩티드 화합물 또는 적당한 가용성 염(예컨대, 염산 염) 형태의 화합물의 무균 제제는 약제학적 희석제[예컨대, 주사용수(WFI), 생리 식염수 또는 5% 글루코스] 중에 용해시켜 투여할 수 있다.
리포펩티드 미셀은 주사 부위에서 국소 자극을 일으키지 않을 가능성이 있기 때문에, 비경구 투여에 특히 적합할 수 있다. 어떤 이론에도 얽매이지 않는다면, 주사시 자극을 일으킬 수 있는 지방질 꼬리(lipid tail)가 미셀 내부에서 격리되기 때문에 리포펩티드 미셀은 단량체성 미셀보다 국소 자극을 덜 일으키는 반면에, 지방질 꼬리보다 국소 자극을 일으킬 가능성이 적은 펩티드 핵은 조직에 노출될 것 같다. 본 발명의 교시에 따라 리포펩티드 미셀을 근육내 투여용 및 비경구 투여용 제제로 제조하여, 리포펩티드 미셀을 포함하는 제제를 수득할 수 있다. 또한, 리포펩티드 용액을 초음파 처리하여, 리포펩티드 리포솜을 수득할 수 있다. 또한, 적당한 비가용성 형태의 화합물은 수성 염기 또는 약학적 허용 오일 염기(예: 에틸 올레에이트와 같은 장쇄 지방산 에스테르) 중의 현탁제로서 제조 및 투여할 수 있다.
생체분해성 중합체(예컨대, 폴리락티드-폴리글리콜리드) 중 화합물의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 형성시킴으로써, 주사사능 데포(depot) 형태를 제조할 수 있다. 약물 대 중합체의 비율 및 이용되는 특정 중합체의 성질에 따라 다르겠지만, 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 다른 생체분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 들 수 있다. 또한, 체조직과 상용성인 마이크로에멀젼 내에 약물을 포착(entrapping)함으로써, 데포 주사가능 제제를 제조할 수 있다.
또한, 국소용의 경우, 본 발명의 화합물 및 미셀을 적당한 형태로 제조하여, 피부, 또는 비(脾) 점막 및 인후 점막에 도포할 수 있고, 크림제, 연고제, 액체 스프레이제(liquid spray) 또는 흡입제, 로젠지(lozenge), 또는 인후 도포제(throat paint)의 형태로 섭취할 수 있다. 또한, 상기 국소 제제는 화학적 화합물[예컨대, 디메틸설폭시드(DMSO)]를 포함하여, 활성 성분의 표면 투과를 촉진시킬 수 있다. 국소 제제의 경우, 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드, 이들의 적당한 염 형태 또는 리포펩티드 미셀의 무균 제제를 크림제, 연고제, 스프레이제 또는 기타 국소 드레싱제(dressing)로 투여할 수 있다. 또한, 국소 제제는 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 리포펩티드 미셀 조성물로 함침된 붕대의 형태로 존재할 수 있다.
눈 또는 귀에의 용도의 경우, 본 발명의 화합물은 연고제, 크림제, 로션제, 도포제 또는 분말제로서 소수성 염기 또는 친수성 염기에서 제제화된 액체 또는 반액체(semi-liquid) 형태로 존재할 수 있다.
직장내 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 종래의 담체(예컨대, 코코아 버터, 왁스 또는 기타 글리세리드)와 혼합된 좌제의 형태로 투여할 수 있다.
에어로졸 제제의 경우, 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드, 또는 염 형태의 상기 화합물의 무균 제제를 흡입기[예컨대, 정량식 흡입기(metered dose inhaler)] 및 분무기(nebulizer)에서 사용할 수 있다. 또한, 리포펩티드 미셀의 무균 제제는 에어로졸 제제용으로 사용할 수 있다. 에어로졸화된 제형은 호흡기 감염[예컨대, 폐렴 및 동계(洞系; sinus-based) 감염]을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
대안으로, 본 발명의 화합물은 전달 시간에 적당한 약학적 허용 담체 내에서 재구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 분말 제형을 리포펩티드 미셀로서 재구성하는 경우, 분말은 완충액 및/또는 염을 포함하여, 특정 양의 무균수 또는 무균 식염수를 재구성하여 리포펩티드가 미셀을 형성하도록 할 수 있다. 대안으로, 약학적 허용 담체의 양 및 타입에 관한 지령(instruction)을 포함할 수 있는 분말 제형을 사용하여, 리포펩티드를 재구성함으로써 미셀을 수득할 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 화합물의 단위 제형은 무균의 밀봉된 앰플 내의 적당한 희석제 중의 화합물, 이의 염 또는 리포펩티드 미셀의 용액일 수 있다. 단위 용량 내의 화합물의 농도는 사용된 화합물 및 이의 용해도, 및 의사의 처방 용량에 따라 다르겠지만, 예컨대 약 1% 내지 약 50%로 다양하게 변화될 수 있다. 상기 조성물이 제형 단위를 함유하는 경우, 각각의 제형 단위는 50∼500 mg의 활성 물질을 함유하는 것이 바람직하다. 성인 치료의 경우, 사용되는 용량은 투여 경로 및 빈도에 따라 다르겠지만, 하루에 100 mg 내지 3 g의 범위가 바람직하다.
다른 측면에 있어서, 인간 및 다른 동물에 있어서의 감염, 특히 그람 양성 박테리아에 기인한 감염을 치료하는 방법을 제공한다. "치료"란 용어는 감염의 예방, 및 숙주 동물이 감염된 후의 확정된(established) 감염의 제어를 가리키는 데 사용한다. 확정된 감염은 급성 또는 만성 감염이다. 상기 방법은 본 발명의 화합물의 유효량을 인간 또는 다른 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 이들의 약학적 허용 염의 유효량은 약 0.1 내지 약 25 mg/kg이다. 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드는 단량체성이거나 또는 리포펩티드 미셀의 일부일 수 있다. 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 이들의 약학적 허용 염의 바람직한 용량은 약 1 내지 약 25 mg/kg이다. 정제된 답토마이신 또는 이의 약학적 허용 염의 더 바람직한 용량은 약 1 내지 약 12 mg/kg이다.
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 치료 유효량의 답토마이신 또는 다른 항균 (antibacterial) 리포펩티드로 피험체 내의 감염, 특히 그람 양성 박테리아에 의해 기인한 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 답토마이신 또는 항박테리아 리포펩티드는 단량체성이거나 또는 리포펩티드 미셀 내에 존재할 수 있다. 항균제를 전달하는 방법의 예는 Rogers에 부여된 미국 특허 제5,041,567호 및 PCT 특허 출원 번호 제EP94/02552호(공보 번호 제WO 95/05384호)에 기재되어 있는데, 상기 공보의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료 유효량(therapeutically-effective amount)"이라 함은 질병의 개시를 예방하고, 증상을 경감시키며, 박테리아 감염의 진행을 방지하는, 본 발명에 따른 답토마이신 또는 항균 리포펩티드의 양을 의미한다. "치료(treating)"란 용어는 피험체에게 치료 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써, 감염의 발생을 예방하고, 감염을 제어 또는 제거하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "피험체(subject)"란 용어는 포유동물, 식물 또는 세포 배양물을 의미한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 피험체는 리포펩티드 화합물 치료가 필요한 인간 또는 다른 동물 환자를 의미한다.
*1일 단일 투여 용량(single daily dose) 또는 1일 다중 투여 용량(multiple dose per day)으로서 리포펩티드 항균 화합물을 투여할 수 있다. 치료 요법은 연장 기간(extended period of time)을 초과하여, 예컨대 7일 동안 또는 2주 내지 4주 동안 투여하는 것을 요할 수 있다. 매 투여 용량 또는 총 투여 용량은 감염의 성질 및 심각성, 환자의 연령 및 일반적 건강 상태, 항생제에 대한 환자의 내성, 및 감염에 연루된 미생물 또는 미생물들과 같은 인자에 따라 다를 것이다. 투여 방법은 PCT 국제공개공보 WO 00/18419에 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 정제된 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제, 또는 이의 약학 조성물을 필요로 하는 환자에게 그람 양성 박테리아의 감염을 감소시키거나 제거하는 데 효능이 있는 양의 정제된 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제, 또는 이의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 답토마이신 또는 리포펩티드 항생제는 단량체성이거나 또는 리포펩티드 미셀 내에 존재할 수 있다. 상기 항생제는 경구 투여, 비경구 투여, 흡입 투여, 국소 투여, 직장내 투여, 비강 투여, 구강 투여, 질내 투여, 이식된 저장기(implanted reservoir), 외부 펌프 또는 카테터에 의한 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 항생제는 안(ophthalmic) 용도 또는 에어로졸화 용도로 제조할 수 있다. 또한, 정제된 답토마이신, 리포펩티드 항생제 또는 이들의 약학 조성물은 농양(abscess), 실(室; ventricle) 또는 연결 부위(joint) 내로 직접 주사하거나 투여할 수 있다. 비경구 투여는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 조(槽: cisternal), 초내(intrathecal), 간내, 병소내(intralesional) 및 두개내(intracranial) 주사 또는 주입을 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 답토마이신 또는 다른 리포펩티드는 정맥내 투여, 피하 투여 또는 경구 투여 방식으로 투여한다.
본 발명의 방법은 감염이 임의의 타입의 그람 양성 박테리아에 의해 기인하거나 악화되는 박테리아 감염을 보유하는 환자를 치료하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법에 따라, 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드, 다른 리포펩티드 또는 이들의 약학 조성물을 환자에게 투여한다. 다른 바람직한 실시태양에 있어서, 박테리아 감염은 메티실린 감수성 및 메티실린 내성 스타필로코쿠스(스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 스타필로코쿠스 해모리티쿠스, 스타필로코쿠스 호미니스, 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 및 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스를 포함함), 글리코펩티드에 중간 정도의 감수성이 있는 스타필로코쿠스 아우레우스(GISA), 페니실린 감수성 및 페니실린 내성 스트렙토코쿠스(스트렙토코쿠스 뉴모니아, 스트렙토코쿠스 파이오제네스, 스트렙토코쿠스 아갈락티아, 스트렙토코쿠스 아비움, 스트렙토코쿠스 보비스, 스트렙토코쿠스 락티스, 스트렙토코쿠스 산기우스 및 스트렙토코쿠스 그룹 C, 스트렙토코쿠스 그룹 G, 및 비리단스 스트렙토코쿠스를 포함함), 엔테로코쿠스(엔테로코쿠스 패칼리스 및 엔테로코쿠스 패시움과 같은 반코마이신-감수성 및 반코마이신 내성 균주를 포함함), 클로스트리듐 디피실레, 클로스트리듐 클로스트리디이포르메, 클로스트리디듐 이노큐엄, 클로스트리듐 퍼프링겐스, 클로스트리듐 라모숨, 해모필루스 인플루엔자, 리스테리아 모노사이토제네스, 코리네박테리움 제이케이움, 비피도박테리움 spp., 유박테리움 애로파시엔스, 유박테리움 렌툼, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 플란타룸, 락토코쿠스 spp., 류코노스톡 spp., 페디오코쿠스, 펩토스트렙토코쿠스 아나에로비우스, 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스, 펩토스트렙토코쿠스 마그누스, 펩토스트렙토코쿠스 미크로스, 펩토스트렙토코쿠스 프레보티, 펩토스트렙토코쿠스 프로덕투스, 프로피오니박테리움 아크네스, 및 악티노마이세스 spp.를 포함하나 이들에 한정되지 않는 박테리아에 의해 기인하거나 악화될 수 있다.
시험관내 실험에 있어서, 고전적 "내성" 균주에 대한 답토마이신의 항균 활성은 고전적 "감수성" 균주에 대한 항균 활성에 필적할 만하다. 또한, 감수성 균주에 대한 답토마이신의 최소 저지 농도(MIC) 값은 일반적으로 반코마이신의 MIC 값보다 4배 낮다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어서, 반코마이신을 비롯한 다른 항생제에 내성이 있는 박테리아 감염을 나타내는 환자에게 본 발명의 방법에 따라 정제된 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 항생제 또는 이들의 약학 조성물을 투여한다. 또한, 글리코펩티드 항생제와 달리, 답토마이신은 그람 양성균에 대한 신속한 농도 의존적 항균 활성을 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어서, 신속하게 작용하는 항생제 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 방법에 따라 정제된 답토마이신, 리포펩티드 항생제 또는 이들의 약학 조성물을 투여한다.
본 발명의 방법은 체내 임의의 기관 또는 조직의 그람 양성 박테리아 감염에 사용할 수 있다. 상기 기관 또는 조직은 골격근, 피부, 혈류, 신장, 심장, 폐 및 골(骨)을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법은 피부 및 연조직(soft tissue) 감염, 균혈증(bacteriemia) 및 요로 감염 등(이들에 한정되는 것은 아님)을 치료하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 중이염, 부비동염, 만성 기관지염 및 폐렴(약물 내성이 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니아 또는 해모필루스 인플루엔자에 의해 기인한 폐렴을 포함함)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 사회 획득성(community acquired) 호흡기 감염을 치료하는 데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상이한 타입의 그람 양성 박테리아를 포함하거나, 호기성, 호이산화탄소성(caprophilic) 또는 혐기성 박테리아를 비롯하여 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아 모두를 포함하는 혼합형 감염을 치료하는 데 사용할 수 있다. 상기 타입의 감염은 복내(腹內) 감염 및 산과(産科; obstetrical)/부인과(婦人科; gynecological) 감염을 포함한다. 본 발명의 방법은 폐렴, 복내 패혈증, 피부 및 연조직 감염, 및 골 및 연결 부위 감염을 포함하나 이들에 한정되지 않는 병원 감염(hospital infection)에 대한 스텝-다운(step-down) 방식 요법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 심내막염, 신염, 패혈성 관절염 및 골수염을 포함하나 이들에 한정되지 않는 감염을 치료하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 정제된 답토마이신, 리포펩티드 항생제, 또는 이들의 약학 조성물을 사용하여, 임의의 상기한 질병을 치료할 수 있다. 또한, 단량체 또는 미셀 형태의 답토마이신 또는 리포펩티드 항생제를 사용하여, 상기 질병을 치료할 수 있다.
또한, 환자 또는 동물의 음식물 또는 사료 중에 답토마이신, 답토마이신 관련 리포펩티드 또는 다른 리포펩티드를 투여할 수 있다. 전체 음식물 섭취의 일부로서 투여하는 경우, 답토마이신 또는 다른 리포펩티드의 양은 음식물의 중량을 기준으로 1 중량% 미만, 바람직하게는 0.5 중량% 이하일 수 있다. 동물용 사료는 답토마이신 또는 리포펩티드가 첨가되거나, 또는 예비 혼합물(premix)에 첨가될 수 있는 통상의 식료품(foodstuff)일 수 있다.
또한, 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제 이외에 1 이상의 항균제 및/또는 1 이상의 항생제를 함께 투여하는 동안 본 발명의 방법을 실시할 수 있다. 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제 이외의 항진균제 및 항생제의 공투여(co-administration)는 혼합형 감염(예컨대, 상이한 타입의 그람 양성 박테리아에 의해 기인한 감염, 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아 모두에 의해 기인한 감염, 또는 박테리아 및 진균 모두에 의해 기인한 감염)에 유용할 수 있다. 더욱이, 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제는 1 이상의 공투여된 항생제의 독성 프로필을 개선할 수 있다. 답토마이신 및 아미노글리코시드의 투여는 아미노글리코시드에 의해 기인하는 신장 독성을 개선할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 바람직한 실시태양에 있어서, 정제된 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제와 함께, 또는 정제된 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제를 포함하는 약학 조성물 중에 포함시켜, 항생제 및/또는 항진균제를 투여할 수 있다.
답토마이신 또는 리포펩티드 항생제를 단량체 또는 미셀 형태로 사용하여, 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제와 다른 치료제의 공투여를 수행할 수 있다. 전술한 바와 같이, 구형 리포펩티드 미셀을 사용하여, 낮은 수용해성(aqueous solubility)를 나타내는 가용화제를 보조할 수 있다. 또한, 리포펩티드 리포솜은 리포솜의 소포체 내부의 수성 매질에 가용성인 포집제(trap agent)에 사용할 수 있다. 본 명세서의 교시에 따름으로써, 당업자는 치료제(예컨대, 소염제, 항진균제 및 다른 항생제)를 포함하는 리포펩티드 미셀을 제조할 수 있다.
답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제와 공투여할 수 있는 항균제 및 그 부류(class)는 페니실린류 및 관련 약물, 카르바페넴류, 세팔로스포린류 및 관련 약물, 아미노글리코시드류, 바시트라신, 그라미시딘, 무피로신, 클로람페니콜, 티암페니콜, 푸시데이트 나트륨, 린코마이신, 클린다마이신, 마크로라이드류, 노보비오신, 폴리믹신류, 리파마이신류, 스펙티노마이신, 테트라사이클린류, 반코마이신, 테이코플라닌, 스트렙토그라민류, 항엽산제(설폰아미드류, 트리메토프림, 이들의 조합물, 및 피리메타민을 포함함), 합성 항균제(니트로푸란류, 메텐아민 만델레이트 및 메텐아민 히푸레이트, 니트로이미다졸류, 퀴놀론류, 플루오로퀴놀론류, 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드, 파라-아미노살리실산(PAS), 사이클로세린, 카프레오마이신, 에티온아미드, 프로티온아미드, 티아세타존, 비오마이신, 에베미노마이신, 글리코펩티드, 글리실실클린(glycylcylcline), 케토라이드류 및 옥사졸리디논을 포함함), 이미페넨, 아미카신, 네틸미신, 포스포마이신, 젠타미신, 세프트리악손, 지라신, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, 리네졸리드, 시너시드, 아즈트레오남, 및 메트로니다졸, 에피로프림, OCA-983, GV-143253, 산페트리넴 나트륨, CS-834, 비아페넴, A-99058.1, A-165600, A-179796, KA 159, 다이네미신 A, DX8739, DU 6681; 세플루프레남, ER 35786, 세포셀리스, 산페트리넴 셀렉세틸, HGP-31, 세프피롬, HMR-3647, RU-59863, 메르사시딘, KP 736, 리팔라질; 코산, AM 1732, MEN 10700, 레나페넴, BO 2502A, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, 베네프림, PD 138312, PD 140248, CP 111905, 술로페넴, 리티페남 아콕실, RO-65-5788, 사이클로티알리딘, Sch-40832, SEP-132613, 미카코시딘 A, SB-275833, SR-15402, SUN A0026, TOC 39, 카루모남, 세포조프란, 세페타메트 피복실, 및 T 3811을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명에 따라, 이미페넨, 아미카신, 네틸미신, 포스포마이신, 젠타미신, 세프트리악손, 테이코플라닌, 지라신, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, 리네졸리드, 시너시드, 아즈트레오남 및 메트로니다졸을 포함하나 이들에 한정되지 않는 항균제를 답토마이신과 함께 공투여할 수 있다.
답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제와 함께 공투여할 수 있는 항균제는 카스포푼겐, 보리코나졸, 세르타코나졸, IB-367, FK-463, LY-303366, Sch-56592, 시타플록사신, DB-289, 폴리엔류(예컨대, 암포테리신, 니스타틴, 프리마리신), 아졸류(예컨대, 플루코나졸, 이트라코나졸 및 케토코나졸), 알릴아민류(예컨대, 나프티핀 및 테르비나핀), 및 항대사산물(예컨대, 플루시토신)을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 항균제는 본 명세서에 참고로 인용한 Fostel 등의 문헌 [Drug Discovery Today 5:25∼32 (2000)]에 기재되어 있는 것들을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 Fostel 등의 문헌에는 코리네칸딘, Mer-WF3010, 푸사칸딘류, 아르트리키틴/LL 15G256γ, 소르다린류, 시스펜타신, 아족시바실린, 아우레오바시딘 및 카프레푼긴(Khafrefungin)을 비롯한 항균 화합물이 개시되어 있다.
박테리아 감염이 근절되거나 감소될 때까지 본 발명의 방법에 따라 답토마이신 또는 다른 리포펩티드 항생제(답토마이신 관련 리포펩티드를 포함함)를 투여할 수 있다. 일 실시태양에 있어서, 3일 내지 6월의 기간 동안 답토마이신 또는 다른 리포펩티드를 투여한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 7일 내지 56일 동안 답토마이신 또는 다른 리포펩티드를 투여한다. 더 바람직한 실시태양에 있어서, 7일 내지 28일 동안 답토마이신 또는 다른 리포펩티드를 투여한다. 보다 더 바람직한 실시태양에 있어서, 7일 내지 14일 동안 답토마이신 또는 다른 리포펩티드를 투여한다. 바람직하다면, 보다 장기간 동안 또는 보다 단기간 동안 답토마이신 또는 다른 리포펩티드를 투여할 수 있다.
본 발명은 고레벨의 정제된 리포펩티드를 생산하는 상업적 실행가능 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 리포펩티드 미셀을 제공한다. 또한, 본 발명은 고도로 정제된 답토마이신 또는 답토마이신 관련 리포펩티드 미셀을 포함하는 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 답토마이신의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 불순물 8, CB-131010(β-이성체, LY213846으로서 미리 동정됨)의 구조를 도시한 것이다.
도 3은 불순물 13, CB-130952(안하이드로-답토마이신, LY178480으로서 미리 동정됨)의 구조를 도시한 것이다.
도 4는 불순물 1, CB-131012(LY212218로서 미리 동정됨)의 계획 구조 (proposed structure)를 도시한 것이다.
도 5는 불순물 2, CB-131011의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 6은 불순물 3, CB-131008(LY213928로서 미리 동정됨)의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 7은 불순물 4, CB-131006의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 8은 불순물 6, CB-130989(LY213827로서 미리 동정됨)의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 9는 불순물 7, CB-131005의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 10은 불순물 12, CB-131009의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 11은 불순물 14, CB-131078(LY109208로서 미리 동정됨)의 계획 구조를 도시한 것이다.
도 12는 불순물 1 내지 14를 비롯한 답토마이신의 대량 제조용 HPLC 크로마토그램(chromatogram)을 도시한 것이다.
도 13은 Poros P150 수지 상에서의 정제 후 답토마이신의 제조용 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 14A∼14C는 미셀 구조를 도시한 것이다. 도 14A는, 양친매성(amphipathic) 분자의 소수성 꼬리 부분이 구의 중앙 쪽을 향하는 반면, 양친매성 분자의 친수성 머리 부분은 수성 환경과 접촉되어 있는 구의 외부 쪽을 향하는 것인 구형 미셀을 도시한 것이다. 도 14A는 친수성 머리 부분이 음으로 하전된 예를 나타낸 것이다. 도 14B는, 양친매성 분자의 2개의 층이 집결하여, 각 층의 소수성 꼬리 부분이 다른 층의 소수성 꼬리 부분을 향하는 반면, 이중층의 양측 상의 친수성 머리 부분이 수성 환경과 접촉하는 것인 지질 이중층 구조를 도시한 것이다0. 지질 이중층은 구형이거나 평면형일 수 있다. 도 14C는, 도 14B에 도시된 것과 같은 지질 이중층이 수성 내부를 둘러싸는 구형 구조를 형성하는 리포솜을 도시한 것이다. 리포솜의 친수성 머리 부분은 수성 내부 및 외부 수성 환경을 향한다.
도 15는 pH 4.0에서 답토마이신의 임계 미셀 농도(cmc)를 측정하는 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 빛의 산란에 의한 답토마이신 미셀의 크기 분포를 나타낸 것이다. 답토마이신 미셀의 평균 크기는 5.4 nm(54 Å)이다.
본 발명을 보다 완전히 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 상술한다. 하기 실시예는 예시 목적을 위한 것일 뿐이고, 어떤 식으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
항생제의 생산은 최적화하지만 오염물의 생산은 최소화하는 레벨로 조절된 데칸산 공급원 발효물 중에서, 스트렙토마이세스 로세오스포러스 NRRL 균주 15998의 발효 배양을 수행하였다. 가스 크로마토그래피에 의해 잔류 데칸산 공급원을 측정하며, 유도 시작(약 30시간일 때)부터 수거까지의 목표 잔류 레벨은 10 ppm 데칸산이다. 배양물의 원심분리 및 연이은 정화 브로스의 분석을 사용하여 답토마이신 생산을 HPLC로 측정한다. 수집 역가(harvest titer)는 통상적으로 발효 브로스 1리터 당 2.1 내지 2.6 그램이다.
Pall-Sep을 사용하는 정밀여과에 의해 또는 완전한 상업적 규모의 원심분리 및 심층 여과기에 의해 발효물을 수집한다. 음이온 교환 수지, Mitsubishi FP-DA 13에 정화 브로스를 도포하고, pH 6.5에서 30 mM NaCl로 세정하고, pH 6.0∼6.5에서 300 mM NaCl로 용출시켰다. 대안으로, pH 6.5에서 FP-DA 13 컬럼을 60 mM NaCl로 세정하고, pH 6.0∼6.5에서 500 mM NaCl로 용출시켰다. HIC 수지, HP-20ss에 용출물을 도포하고, 30% 아세토니트릴로 세정하고, pH 4.0∼5.0에서 35% 아세토니트릴로 용출시켰다. 대안으로, HIC 수지를 45% 이소프로필 알코올로 세정하고, 55∼60% 이소프로필 알코올로 용출시켰다. FP-DA 13 수지에 용출물을 도포하고, 전술한 바와 같이 세정하고, 용출시켰다. 최종 음이온 교환 공정은 용매를 3분의 1 이상 감소시켰다. 0.2 ㎛ 여과기를 사용하여 pH 1.5∼2.5에서 역삼투 투석여과 및 농축을 수행하고, 답토마이신 제제를 동결시켰다. 주사용수(WFI)로 최종 역삼투 투석여과를 수행하여, 답토마이신을 세정하고, 무균 충전 이전에 답토마이신 농도를 조절한다. 이어서, 바이알(vial) 또는 벌크(bulk) 양의 답토마이신을 동결건조시켰다.
실시예 2
미국 특허 제4,885,243호에 기재되어 있는 방법에 따라, 스트렙토마이세스 로세오스포러스의 발효 배양에 의해 답토마이신을 생산하고, 5500 리터의 발효 브로스로부터 정밀여과에 의해 부분적으로 정제된 답토마이신(9.9 Kg)을 정제하였다. 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 방법에 의해, 부분적으로 정제된 답토마이신을 추가로 정제함으로써, 순도가 91%인 대량의 답토마이신 제제가 생성되었다. HPLC 분석 결과, 답토마이신 제제는 14종의 불순물을 함유하였다(실시예 10 참조). 6 M 우레아를 함유하는 pH 7.0의 Tris 완충액 중의 Poros P150 음이온 교환 수지(PE Biosystems)에 답토마이신 제제를 도포하고, 수지에 결합시켰다. 3개의 컬럼층 부피의 완충액 중에서 NaCl 구배의 개시 전에 3개의 컬럼층 부피의 완충액으로 상기 수지를 세정하였다. 대안으로, 30 mM NaCl의 고정(fixed) 염 레벨을 가지는 컬럼으로부터 오염물을 효과적으로 제거할 수 있다. 0 내지 1000 mM NaCl 구배 과정 중, 약 300 mM NaCl에서 수지로부터 정제된 답토마이신의 용출이 일어났다. "제1" HPLC 방법에 의한 측정시, 컬럼으로부터 용출된 답토마이신의 순도는 99% 이상이었다. 정제된 답토마이신은 단 1종의 검출가능 답토마이신 오염물을 함유하였다. 안하이드로-답토마이신 및 β-이성체는 검출불가능하였다(0.01% 미만의 오염). 미동정 오염물의 레벨은 0.01% 초과 0.5% 미만이었다.
실시예 3
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 순도가 91%인 대량의 답토마이신 제제를 제조하였다. 6 M 우레아를 함유하는 pH 7.0의 아세테이트 완충액 중의 Poros D50 음이온 교환 수지(PE Biosystems)에 생성물을 도포하였다. 실시예 2에 기재되어 있는 것과 동일한 방식으로 Poros D50 수지를 세정하고 용출시켰다. "제2" HPLC 방법에 의한 측정시, 컬럼으로부터 용출된 답토마이신의 순도는 96.92%였다. 상기 본 발명의 생성물은 초기 14종의 불순물 중 단 2종만을 함유하였다(0.5% 미만의 오염). 정제된 답토마이신 제제 중에서 안하이드로-답토마이신을 검출할 수 없었다(0.01% 미만의 오염, 정확한 정량으로는 0.05% 미만).
실시예 4
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 답토마이신을 함유하는 발효 브로스를 생산하였다. 정밀여과에 의해 발효 브로스를 정화하였다. pH 4.5에서 20%의 n-부탄올 또는 iso-부탄올로 정화 생성물을 추출하였다(부탄올 대 정화 용액의 비율은 1부 대 4부임). 정화 용액의 재추출을 수행하여, 정화 용액 중의 답토마이신의 총중량을 기준으로 90% 이상의 부분적으로 정제된 답토마이신의 수득율을 달성하였다. 부탄올 부피의 2분의 1 이상인 부피의 pH 6.5 수성 완충액을 첨가하여 부탄올 상(相)으로부터 답토마이신을 회수하여, 부탄올 상으로부터 수상(水相)으로 답토마이신을 추출하였다. 부탄올 추출 공정으로 정화 용액에 비하여 상대적으로 5배 정제되고 10배 농축된, 부분적으로 정제된 답토마이신 제제를 생성하였다.
이어서, 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 방법에 의해 수성 답토마이신 제제를 정제함으로써, 순도가 91%인 답토마이신이 생성되었다. 답토마이신은 14종의 불순물을 함유하였다. 6 M 우레아를 함유하는 pH 7.0의 Tris 완충액 중의 Poros D50 수지에 생성물을 도포하였다. 6 M 우레아를 함유하는 3개의 컬럼층 부피의 pH 7.0 Tris 완충액 중에서 0 내지 1000 mM NaCl 구배의 개시 이전에 6 M 우레아를 함유하는 3개의 컬럼층 부피의 pH 7.0 Tris 완충액으로 상기 수지를 세정하였다. 약 300 mM NaCl에서 수지로부터 정제된 답토마이신의 용출이 일어났다. "제2" HPLC 방법에 의한 측정시, 답토마이신의 순도는 98%였다.
실시예 5
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 답토마이신을 발효시켰다. 5500 리터의 발효 브로스는 13 Kg의 답토마이신을 함유하였다. pH 4.5에서 20%의 n-부탄올로 발효 브로스를 직접 추출하고, 이는 답토마이신을 부탄올 중에 분배시켰다. 부탄올로 발효 브로스를 재추출하는 공정을 수행하여, 발효 브로스 중의 답토마이신의 총중량을 기준으로 90% 이상의 수득율을 달성하였다. pH 6.5에서 수성 아세테이트 완충액으로 부탄올 상을 추출함으로써, 발효 브로스에 비하여 상대적으로 5배(35%) 정제되고 10배 농축된 답토마이신을 생성시켰다. 미국 특허 제4,885,243호에 기재되어 있는 방법에 의해 수성 답토마이신을 정밀여과한 후, 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 방법에 의해 정제하였다. 이 방법은 순도가 약 91%인 답토마이신을 생성시켰다. 선행 기술의 시기에 사용된 HPLC 방법의 수행 결과, 답토마이신은 14종의 불순물을 함유하였다. 6 M 우레아를 함유하는 pH 7.0의 아세테이트 완충액 중의 Poros D50 수지 컬럼에 생성물을 도포하였다. 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 수지의 세정 및 용출을 수행하였다. 제2 HPLC 방법에 의한 측정시, 크로마토크래피 공정의 생성물의 순도는 약 98% 내지 99%였다.
실시예 6
정밀여과 또는 원심분리에 의한 정화시 약 10%의 순도까지 발효의 질을 향상시키기 위해 감소된 잔류 데칸산 공급원을 사용했다는 것을 제외하고는, 스트렙토마이세스 로세오스포러스의 발효 배양에 의해 답토마이신을 생산하였다. 데칸산 레벨을 모니터링하고, 정기적으로 조절하여, 발효 과정 중의 잔류 데칸산 레벨을 50 ppm 미만, 바람직하게는 1 ppm 내지 10 ppm으로 유지시켰다. 미국 특허 제4,885,243호에 기재되어 있는 방법에 의해 발효 브로스를 정밀여과하여, 5500 리터의 발효 브로스로부터 12.1 Kg의 부분적으로 정제된 답토마이신을 생산하였다. 중성 pH의 아세테이트 완충액 중의 음이온 교환기, FP-DA 13(Mitsubishi)에 정화 발효 브로스를 결합시키고, 30 mM NaCl을 함유하는 아세테이트 완충액 중에서 세정하고, 연이어 300 mM NaCl에서 아세테이트 완충액으로 용출시켰다. 이 음이온 교환 공정은 순도가 70% 이상인 답토마이신을 생성시켰다. HP-20ss 수지를 사용한, 미국 특허 제4,874,843호의 방법의 변형법에 의해 상기 부분적으로 정제된 답토마이신을 추가로 정제하였다. 구체적으로, 10% 아세토니트릴을 함유하는 아세테이트 완충액 중의 HP-20ss 상에 부분적으로 정제된 답토마이신을 적재하고, 30% 아세토니트릴을 함유하는 아세테이트 완충액으로 세척하고, 아세테이트 완충액 중의 40% 아세토니트릴로 용출시킴으로써, "제2" HPLC 방법에 의한 측정시, 순도가 약 94% 내지 96%인 답토마이신을 생성시켰다. 실시예 5에 기재되어 있는 바와 같이, 생성물에 대하여 Poros D50 수지를 사용하는 개질 완충제 증강 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 답토마이신은 99% 이상의 순도를 가지며, 선행 기술의 방법에 의해 생산된 14종의 불순물 중 2종만을 함유하였다.
실시예 7
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 순도가 93%인 답토마이신 제제를 제조하였다. 2 M 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액 중의 Poros P150 수지(PE Biosystems)에 생성물을 도포하였다. 3개의 컬럼층 부피의 완충액으로 Poros P150 수지를 세정하였다. 2 M 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액 중의 0 내지 400 mM NaCl 구배를 사용하여, 수지로부터 답토마이신을 용출시켰다. 150 mM NaCl과 300 mM NaCl 사이에서 답토마이신을 용출시켰다. "제1" HPLC방법에 의한 측정시, 컬럼으로부터 용출된 답토마이신의 순도는 99.0% 내지 99.5%였다. 답토마이신은 답토마이신의 총중량을 기준으로 1% 미만인 미량의 4종의 불순물을 함유하였다. 정제된 답토마이신 제제 중에서 안하이드로-답토마이신을 검출할 수 없었다(0.02% 미만의 오염).
실시예 8
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 순도가 93%인 답토마이신 제제를 제조하였다. 2 M 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액 중의 Poros P150 수지(PE Biosystems)에 생성물을 도포하였다. 2 M 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액("세정 완충액") 중의 6개의 컬럼층 부피의 60 mM NaCl로 컬럼을 세정하였다. 세정 완충액은 50∼75 mM NaCl로부터 변화할 수 있다. 실제로, 세정은 모든 안하이드로-답토마이신을 제거한다. 2 M 우레아를 함유하는 pH 6.0의 아세테이트 완충액 중의 16개의 컬럼층 부피의 250 mM NaCl로 답토마이신을 용출시킨다. "제1" HPLC 방법에 의한 측정시, 답토마이신의 순도는 98.5% 내지 99.5%였다.
실시예 9
HP-20ss 크로마토그래피를 수행하는 데 필요한 용매의 농도를 유의적으로 감소시키는 방법을 사용하여, 실시예 2에 기재되어 있는 것과 같은 답토마이신 제제를 제조하였다. 의외로, 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 바와 같은 산성 pH보다 오히려 중성 pH에서 HP-20ss 크로마토그래피를 수행할 때, 답토마이신 용출용 용매인 40% 아세토니트릴 또는 55∼60% 이소프로필 알코올이 각각 12%와 25%로 감소되었다. 바람직한 실시태양에 있어서, pH 이동(shift)은 용매를 제거하지 않고 HP-20ss 수지를 재생시키는 데 사용할 수 있다.
pH 6.5∼7.0에서 FP-DA13 컬럼으로부터의 용출 후, 평형 HP-20ss 컬럼(예컨대, pH 6.6의 60 mM 아세테이트 중에서 평형인 HP-20ss 컬럼) 상에 답토마이신을 적재하였다. 5개 내지 8개의 컬럼층 부피(CBV)의 세정 완충액으로 컬럼을 세정하였다. 예시적인 세정 완충액은 pH 6.6의 5% 이소프로필 알코올/60 mM 아세테이트이다. 용출 완충액으로 컬럼으로부터 답토마이신을 용출시켰다. 예시적인 용출 완충액은 pH 6.6의 2개 내지 3개의 CBV의 25% 이소프로필 알코올/60 mM 아세테이트이다. 스트립(strip) 완충액으로 컬럼을 스트리핑하였다. 일 실시태양에 있어서, pH 7.0의 1개의 CBV의 40% 이소프로필 알코올/60 mM 아세테이트로 컬럼을 스트리핑하였다. 답토마이신 용액의 pH를 3.5∼4.0으로 조절하고, HP-20ss 컬럼 상에 재적재함으로써, 순도를 더 향상시켰다. 일 실시태양에 있어서, 0.25 M 인산을 사용하여, pH 6.5에서 HP-20ss 컬럼으로부터 용출된 답토마이신의 pH를 3.5로 조절하였다. pH 3.5의 60 mM 아세테이트 중에서 평형인, 미리 스트리핑된 HP-20ss 컬럼 상에 답토마이신 용액을 재적재하였다. pH 조절 완충액으로 컬럼을 세정하면, pH는 6.5가 된다. 예시적인 pH 조절 완충액은 pH 6.6의 5개 내지 8개의 CBV의 5% 이소프로필 알코올/60 mM 아세테이트이다. 용출 완충액으로 답토마이신을 용출시키고, 필요한 경우 음이온 교환 또는 다른 정제 방법으로 추가 정제할 수 있다. 스트립 완충액으로 HP-20ss 컬럼을 스트리핑하고, 재사용 전에 클리닝한다. 예시적인 클리닝 방법은 3개의 CBV의 0.5 M NaOH로 세정하는 단계, 1개의 CBV의 물로 세정하는 단계, 및 이어서 평형 이전에 0.25 M 인산으로 세정하는 단계를 포함한다. 0.5 M NaOH 중에 컬럼을 저장할 수 있다.
실시예 10
실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이 제조된 대량의 답토마이신은, 반(半)-분취(semi-preparative) HPLC를 통해 특징지워지며, 양이온 모드 및 음이온 모드 둘 다를 사용하는 액체 크로마토그래피/질량 분광기(LC/MS)에 의해 특징지워진다. Poros P150 음이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피 이전의 대용량의 답토마이신의 불순물 프로필은 표 3에 나타나 있으며, 대량의 답토마이신 제제의 크로마토그램은 도 12에 나타나 있다.
불순물 ID 머무름 시간 관찰된 MW Lilly ID Cubist ID HPLC에 의한 총면적 %
1 7.96 1638 LY212218 CB-131012 >0.5%, <1.0%
2 9.11 1638 CB-131011 <0.5%, >0.1%
3 11.54 745 LY213928 CB-131008 >0.5%, <1.0%
4 12.28 1624 CB-131006 <0.5%, >0.1%
5 13.10 1618 비공지-1 <0.5%, >0.1%
6 14.43 587 LY213827 CB-130989 >0.5%, <1.0%
7 14.43 1606 CB-131005 >0.5%, <1.0%
8 15.10 1620 LY213846 CB-131010 >1.0%, <4.0%
답토마이신 16.68 1620 LY146032 CB-109187 >90%
9 17.92 874 비공지-2 <0.5%, >0.1%
10 19.57 1810 비공지-3 <0.5%, >0.1%
11 19.57 1635 비공지-4 <0.5%, >0.1%
12 20.93 859 CB-131009 <0.5%, >0.1%
13 23.11 1602 LY178480 CB-130952 >1.0%, <4.0%
14 24.53 1634 LY109208 CB-131078 <0.1%
약 7.96분일 때 용출하는 불순물 1(CB-131012)(MW: 1638)은 답토마이신의 락톤 가수분해 생성물이라고 제안된다(도 4 참조). 그 결과는 데실 고리가 개방된 답토마이신 유도체로서 Lilly에 의해 이전에 동정된 것처럼 LY212218에 필적하는 것 같다.
또한, 약 9.11분일 때 용출하는 불순물 2(CB-131011)(MW: 1638)은 β-이성체의 락톤 가수분해 생성물이라고 제안된다(도 5 참조).
약 11.54분일 때 용출하는 불순물 3(CB-131008)(MW: 745)은, 데칸산쇄와 함께 트립토판, 아스파라긴, 아스파르테이트, 트레오닌 및 글리신을 함유하는 5개의 아미노산 사슬로 이루어진 선형 리포펩티드라고 제안된다(도 6 참조). 이 결과는 Lilly에 의해 이전에 동정된 것처럼 LY213928에 필적하는 것 같다.
약 12.28분일 때 용출하는 불순물 4(CB-131006)(MW: 1624)는, 아미노산인 트립토판이 키누르산(kynuric acid)으로 산화된, 답토마이신의 산화성 유사체 (oxidative analog)라고 제안된다(도 7 참조).
약 13.10분일 때 용출하는 불순물 5(MW: 1618)는 아직 지정된 구조가 없다.
불순물 6(CB-130989) 및 불순물 7(CB-131005)은 약 14.43분일 때 공용출한다. CB-130989(MW: 587)은 Lilly에 의해 이전에 동정된 것처럼, LY213827, 즉 데칸산쇄를 보유하는 3개의 아미노산쇄(트리토판, 아스파라라긴 및 아스파르테이트)로 이루어진 선형 리포펩티드에 필적하는 것 같다(도 8 참조). CB-131005(MW: 1606)는 답토마이신 유사체(여기서, 데칸산은 1개의 메틸기가 결핍됨)에 상응한다(도 9 참조).
약 15.10분일 때 용출하는 불순물 8(CB-131010)(MW: 1620)은 Lilly에 의해 이전에 동정된 것처럼 LY213846(β-이성체)에 필적한다(도 2 참조). β-이성체의 레벨은 1% 이상이다.
약 17.92분일 때 용출하는 불순물 9(MW: 874)는 아직 지정된 구조가 없다.
약 19.57분일 때 공용출하는 불순물 10 및 11은 아직 지정된 구조가 없다.
20.93분일 때 용출하는 불순물 12(CB-131009)(MW: 859)는 데칸산쇄를 보유하는 6개의 아미노산쇄(트립토판, 아스파라긴, 아스파르테이트, 트레오닌, 글리신 및 오르니틴)로 이루어진 선형 리포펩티드라고 제안된다(도 10 참조).
약 23.11분일 때 용출하는 불순물 13(CB-130952)(MW: 1602)은 안하이드로-답토마이신이라고 제안되며(도 3 참조), 이는 LY178480과 동일한 것으로 보인다. 안하이드로-답토마이신의 레벨은 1% 이상이다.
약 24.53분일 때 용출하는 불순물 14(CB-131078)(MW: 1634)는 데칸산쇄 내에 1개의 메틸기를 더 함유하는 답토마이신 유사체로서 Lilly에 의해 이전에 동정된 LY109208과 동일한 것으로 보인다(도 11 참조).
대량의 답토마이신은 상기 실시예 2 또는 7∼8에 기술되어 있는 바와 같이 Poros P150 상에서 정제할 수 있거나, 또는 상기 실시예 3∼5에 기술되어 있는 바와 같이 Poros D50 상에서 정제할 수 있다. 상기 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이 Poros P150 상에서 정제한 후의 크로마토그램(도 13 참조)은 답토마이신의 순도가 99.0% 이상으로, 검출 레벨 미만(총 0.05% 미만)의 β-이성체 및 안하이드로-답토마이신을 보유한다는 것을 나타낸다. 0.1% 초과 0.5% 미만의 양으로 존재하는 1종의 미동정 불순물이 존재한다.
실시예 11
항생제의 생산은 최적화하지만 오염물의 생산은 최소화하는 레벨로 조절된 데칸산 공급원 발효물 중에서, 스트렙토마이세스 로세오스포러스 NRRL 균주 15998의 발효 배양을 수행하였다. 가스 크로마토그래피에 의해 잔류 데칸산 공급원을 측정하고, 유도 시작(약 30시간일 때)부터 수거까지의 목표 잔류 레벨은 10 ppm 데칸산이다. 배양물의 원심분리 및 연이은 정화 브로스의 분석을 사용하여 답토마이신 생산을 HPLC로 측정한다. 수집 역가는 통상적으로 발효 브로스 1리터 당 1.0 내지 3.0 그램이다.
Pall-Sep을 사용하는 정밀여과에 의해 또는 완전한 상업적 규모의 원심분리 및 심층 여과기에 의해 발효물을 수집한다. 음이온 교환 수지, Mitsubishi FP-DA 13에 정화 브로스를 도포하고, pH 6.5에서 30 mM NaCl로 세정하고, pH 6.0∼6.5에서 300 mM NaCl로 용출시켰다. 대안으로, pH 6.5에서 FP-DA 13 컬럼을 60 mM NaCl로 세정하고, pH 6.0∼6.5에서 500 mM NaCl로 용출시켰다. pH를 3.0∼4.8로 조절하고, 온도를 2∼15℃로 조절하였다. 상기 조건 하에서 답토마이신은 미셀을 형성한다. 임의의 입체배치로 10,000 NMW의 여과기(AG Technology Corp. UF 중공 섬유 또는 등가물)를 사용하는 한외여과기 상에 보유되는 미셀 제제를 세정함으로써, 미셀 답토마이신 용액을 정제하였다. 답토마이신은 여과기에 의해 보유되지만, 다수의 불순물은 10,000 NMW의 여과기를 통과하기 때문에 제거되었다. 답토마이신 미셀의 한외여과는 답토마이신 순도를 약 40% 내지 80% 이상 증가시켰다.
HIC 수지, HP-20ss에 용출물을 도포하고, 30% 아세토니트릴로 세정하고, pH 4.0∼5.0에서 35% 아세토니트릴로 용출시켰다. 대안으로, pH 3.5∼6.5에서 HIC 수지를 20∼30% 이소프로필 알코올로 세정하고, 30∼40% 이소프로필 알코올로 용출시켰다. 상기 증가된 용매 및 pH 6.0∼7.5보다 높은 pH의 조건 하에서 답토마이신은 단일 비미셀 상태로 되돌아간다. FP-DA 13 수지 컬럼에 용출물을 도포하고, 전술한 바와 같이 세정하고, 용출시켰다. 최종 음이온 교환 공정은 용매를 3분의 1 이상 감소시켰다. 0.2 ㎛ 여과기를 사용하여 pH 1.5∼2.5에서 역삼투 투석여과 및 농축을 수행하고, 답토마이신 제제를 동결시켰다. 주사용수(WFI)로 최종 역삼투 투석여과를 수행하여, 답토마이신을 세정하고, 무균 충전 이전에 답토마이신 농도를 조절하였다. 이어서, 바이알(vial) 또는 벌크(bulk) 양의 답토마이신을 동결건조시켰다.
실시예 12
임의의 상기 실시예(예, 실시예 11)에 기재되어 있는 바와 같이 정제된 동결건조된 답토마이신은 4.0∼5.0의 pH에서 생리 식염수(약 140 mM NaCl) 중에서 재구성된다. 상기 조건 하에서 답토마이신은 미셀로 존재하며, 주사용, 또는 정맥내, 비경구, 경구 또는 국소 투여용으로 사용할 수 있다.
실시예 13
실시예 11에 기재되어 있는 바와 같이, 발효에 의해 답토마이신을 생산하고, 정밀여과에 의해 브로스로부터 정화하였다. 음이온 교환 수지, Mitsubishi FP-DA 13에 정화 브로스를 도포하고, pH 6.5에서 30 mM NaCl로 세정하고, pH 6.0∼6.5에서 300 mM NaCl로 용출시켜, 순도가 약 40%인 답토마이신 제제를 수득하였다. 묽은 인산으로 용출물의 pH를 3.5로 조절하여, 사실상 모든 답토마이신이 미셀을 형성하도록 하였다. 10,000 NMW의 한외여과 막 상에 상기 미셀 제제를 적재하였다. pH 3.5 및 최대 15℃의 온도에서 30 mM 아세트산나트륨으로 답토마이신 제제를 세정하였다. 부피 감소 및 세정은 불순물 레벨을 저하시키는데, 그 결과, 85% 순도의 답토마이신 제제가 생성된다. 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 방법을 사용하여, 답토마이신 제제를 추가로 정제할 수 있다.
실시예 14
실시예 11에 기재되어 있는 바와 같이, 답토마이신을 발효에 의해 생산하고, 정밀여과에 의해 브로스로부터 정화하고, FP-DA 13 수지 상에서 분획하였다. 묽은 인산을 사용하여 용출물의 pH를 3.5로 조절하여, 사실상 모든 답토마이신이 미셀을 형성하도록 하였다. 10,000 NMW의 한외여과 막 상에 상기 미셀 제제를 적재하였다. pH 3.5 및 최대 15℃의 온도에서 30 mM 아세트산나트륨으로 답토마이신 제제를 세정하였다. 부피 감소 및 세정은 오염물 레벨을 저하시키는데, 그 결과, 80∼90% 순도의 답토마이신 제제가 생성된다. 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 방법을 사용하여, 답토마이신 제제를 추가로 정제할 수 있다.
실시예 15
실시예 11에 기재되어 있는 바와 같이, 답토마이신은 발효에 의해 생산하고, 정밀여과를 사용하여 브로스로부터 정화하였다. 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제4,874,843호에 기재되어 있는 바와 같이, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 상기 제제를 정제하였다. 이 방법에 있어서, HP-20 및 HP-20ss 수지 상에서의 반복된 컬럼 크로마토그래피를 사용하였다. HPLC 크로마토그래피 상의 가시(可視) 불순물 및 측정가능 발열원을 보유하는 답토마이신의 순도는 93%였다. 수중에서 생성물을 희석시키고, NaOH 또는 등가물을 사용하여 이의 pH를 6.5로 조절하였다. 10,000 NMW의 한외여과 막을 통해 답토마이신 제제를 여과하였다. 상기 조건 하에서 답토마이신은 단량체성이고, 한외여과 막을 통과하였다. 그 결과로 생성되는 생성물은 93%의 순도로 잔존하지만, 0.1∼2.0%로 존재하는 여러 불순물은 한외여과 막에 의해 제거되었다. 또한, 발열원의 함량을 검출불가능한 레벨로 감소시켰다.
실시예 16
실시예 15에 기재되어 있는 바와 같이, 약 93% 순도의 답토마이신 제제를 제조하였다. HCl 또는 등가물을 사용하여 pH를 4.7로 저하시키고, 답토마이신 제제를 2∼5℃로 저온 처리(chilling)함으로써, 답토마이신 제제를 미셀 상태로 전환시켰다. 10,000 NMW의 한외여과 막 상에서의 여과에 의해 생성물을 400 리터에서 3 리터로 농축시키고, 최종 농도가 약 100 mg/ml가 되게 하였다. 상기 조건 하에서 답토마이신은 상기 막에 의해 보유된다. 이는 답토마이신 농도의 현저한 증가를 초래하였다. 순도는 약 93%였다.
실시예 17
실시예 16에 기재되어 있는 바와 같이, 답토마이신 제제를 제조하였다. 바이알에 약 250 mg의 답토마이신을 충전시키고, 동결건조시켰다. 인간 또는 동물 환자에게 투여하기 위해, pH 4.0∼5.0에서 50 ml의 무균 150 mM 식염수 중에서 답토마이신을 재구성하였다. 투여되는 답토마이신의 용량은 감염의 성질, 환자의 연령 및 중량, 및 동물의 종에 따라 달라질 것이다. 150 mM 식염수 중 4.5 내지 5.0의 pH에서, 답토마이신은 가용성으로, 정맥내, 근육내 또는 비경구 투여에 적당한 미셀 상태로 존재할 것이다. 상기 제제는 답토마이신의 리포펩티드 성질 때문에 임의의 국소 자극을 최소화할 수 있다.
실시예 18
pH 4.0, 25℃, 및 1.0 mg/ml의 수중 농도에서 답토마이신을 사용하여 답토마이신 미셀을 생산하였다. Zetasizer
Figure 112012035226500-pat00003
(Malvern Instruments, Model 3000 HS)를 사용하여 답토마이신 미셀의 크기를 측정하였다. 계수율(count rate)은 36.3이고, 세포 타입은 모세혈관 세포이고, 검출각(deg)은 90°이며, 파장(nm)은 633이었다. 그 결과, 미셀의 직경은 54 Å이었는데, 이는 단일 단량체성 답토마이신 분자 직경의 약 2배었다. 도 16을 참조한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참고로 인용된다고 구체적·개별적으로 지시된 것처럼, 본 명세서에 참고로 인용된다. 전술한 발명이 명확한 이해를 목적으로 예시되고 실시예에 의해 다소 상세하게 기술되어 있다 하더라도, 첨부된 특허청구범위의 기술 사상 및 범주를 벗어나지 않는 한 본 발명의 특정 변화 및 수정이 가능하다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게는 자명할 것이다.

Claims (19)

  1. a) n-데칸산 공급원으로 스트렙토마이세스 로세오스포러스(Streptomyces roseosporus)를 발효시킴으로써, 발효 브로스(fermentation broth) 내에서 답토마이신을 생산하는 단계,
    b) 발효 브로스를 정화하여 정화된 용액을 얻는 단계,
    c) 정화된 용액에 대하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써, 증강된(enriched) 답토마이신 조성물을 수득하는 단계,
    d) 산을 사용하여 증강된 답토마이신 조성물의 pH를 2.5 내지 5.0로 조정하여 미셀(micelles)을 형성하는 단계,
    e) 증강된 답토마이신 조성물을 HP-20ss 수지와 접촉시켜 반 정제 답토마이신 조성물을 얻는 단계로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 동안 pH 3.5 내지 6.5에서 30 -40 % 이소프로필 알콜로 용출하여 답토마이신 미셀을 pH 6.0 - 7.5에서 답토마이신 단량체로 해리시키는 단계, 및
    f) 반 정제된 답토마이신 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 정제 답토마이신을 수득하는 단계를
    포함하는 답토마이신의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에 있어서의 n-데칸산 공급원을 조절하여, 발효 과정 중에 n-데칸산의 잔류 농도가 100만 분의 50부(50 ppm) 이하가 되도록 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 정화는 여과 또는 원심분리 및 심층 여과를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 c)에 있어서의 음이온 교환 크로마토그래피는 FP-DA 13 수지 상에서 수행하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 f)에 있어서의 음이온 교환 크로마토그래피는 FP-DA 13 수지 상에서 수행하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 f)에 있어서의 음이온 교환 크로마토그래피가 단계 b)로부터의 용매 수준을 낮추기 위하여 사용되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 연속 유동 크로마토그래피를 통하여 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 답토마이신을 여과 또는 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 답토마이신을 한외여과를 이용하여 발열원을 제거 하는(depyrogenating) 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 발열원을 제거하는 단계는
    a) 답토마이신이 단량체 및 비미셀 상태로 존재하는 조건에서 답토마이신 용액을 제공하는 단계;
    b) 답토마이신은 필터를 통과하고 발열원(pyrogen)은 필터를 통과하지 못하는 조건에서 답토마이신을 여과하는 단계;
    c) 답토마이신 미셀을 형성하는 조건으로 답토마이신 용액을 처리하는 단계;
    d) 답토마이신 미셀이 필터 상에 유지되는 조건에서 답토마이신 응집체를 여과하는 단계; 및
    e) 답토마이신 미셀을 수집하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 답토마이신을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 정화는 정밀여과 또는 원심분리를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 답토마이신을 여과 및 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 d)에서 얻어진 증강된 답토마이신을 한외여과에 의하여 저 분자량 물질로부터 분리하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 답토마이신을 발열원을 제거하는(depyrogenating) 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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