PL218313B1

PL218313B1 - Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych

Info

Publication number: PL218313B1
Application number: PL392774A
Authority: PL
Inventors: Krystyna Dąbrowska; Anna Oślizło; Paulina Budynek; Agnieszka Piotrowicz; Andrzej Górski; Grzegorz Figura; Barbara Owczarek; Agnieszka Kopciuch
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Doświadczalnej Pan
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2014-11-28
Also published as: US20130295647A1; PL392774A1; EP2632940A1; EP2632940B1; US10160956B2; WO2012057643A1; RU2590609C2; RU2013123514A

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania bakteriofagów prezentujących na swojej powierzchni obce peptydy lub białka bez konieczności ingerencji w genom fagowy i bez konieczności zastosowania szczepów fagowych defektywnych pod względem wybranych genów (metoda nie wymaga użycia szczepów modyfikowanych genetycznie). Uzyskane preparaty bakteriofagowe mogą znaleźć liczne zastosowania, zwłaszcza w oczyszczaniu bakteriofagów w celu wytwarzania produktów wymagających wysokiej czystości takich jak produkty lecznicze, oraz w wytwarzaniu bakteriofagów prezentujących wybrane peptydy lub białka w innych celach, np. w produkcji szczepionek.

W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.

W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów biotechnologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek.

Efektywne usunięcie pirogenów a także aktywnych białek z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.

Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publicatiom US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO02083710A1; WO04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sei Appl. 693(1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4):1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dąbrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).

Nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu oczyszczania lizatów bakteriofagowych, zwłaszcza z endotoksyn, który mógłby być wykorzystany do przemysłowej produkcji preparatów bakteriofagowych przeznaczonych do stosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi.

Wyjściowe miana nieoczyszczonych lizatów mogą zawierać LPS o aktywności 10⁴-10⁵. Pomimo mnogości opisanych metod oczyszczania lizatów bakteriofagowych, nie spełniają one w stopniu dostatecznym wymogów stawianych przed sposobami przemysłowej produkcji preparatów o wskazanym powyżej przeznaczeniu.

Metoda prezentacji dowolnych białek lub peptydów na kapsydzie bakteriofagowym: phagedisplay opiera się na (i) wprowadzaniu genów kodujących te białka lub peptydy do genomu bakteriofagowego (tworzenie GMO) lub (i) wykorzystaniu szczepu bakteriofagowego defektywnego pod względem wybranego genu kodującego białko nieesencjonalne dla bakteriofaga a następnie suplementacji tego braku z użyciem rekombinowanych białek ekspresjonowanych z konstrukcji wektorowych, zwykle w systemie bakteryjnym (tworzenie szczepu z delecją wybranego genu). W obu przypadkach prezentacja białek lub peptydów wymaga wcześniejszych modyfikacji genetycznych szczepu stanowiącego platformę prezentującą.

PL 218 313 B1

Nieoczekiwanie sposób spełniający wymogi stawiane przed sposobami przemysłowej produkcji oczyszczonych preparatów fagowych w celach leczniczych, a jednocześnie umożliwiający prezentację obcych peptydów lub białek na kapsydzie fagowym bez wprowadzania zmian do genomu fagowego (także na fagu dzikim) został zaproponowany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bakteriofagów charakteryzujący się tym, że: a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, do dalszego oczyszczania lub innych zastosowań

b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa,

d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą fuzję białka wchodzącego w skład kapsydu bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie z (i) polipeptydem posiadającym powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b), jeśli celem jest uzyskanie oczyszczonego preparatu bakteriofaga lub (i) innym polipeptydem o wymaganej aktywności, jeśli celem jest prezentacja innych motywów aktywnych.

Korzystnie szczep bakteriofagowy modyfikowany i/lub oczyszczany tą metoda może być dowolnym szczepem dzikim, niemodyfikowanym genetycznie. Szczególnie korzystnie hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga niemodyfikowanym genetycznie w celu prezentacji metodą phage-display, tj. bakteriofagiem dzikim lub modyfikowanym w innym celu, a bakteriofag ten prezentuje na swojej powierzchni wybrane obce polipeptydy.

Korzystnie polipeptyd umożliwiający oczyszczenie bakteriofaga, posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST. Przykładowy polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego jest kodowany przez sekwencję kodującą białko gp23* tj. dojrzałą postać głównej proteiny kapsydowej gp23* (po cięciu proteolitycznym w etapie dojrzewania główki), sekwencja ta przedstawiona jest na figurze 1.

Korzystnie w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

Korzystnie w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μιτι.

Chromatografia powinowactwa jest ustaloną, bardzo wydajną strategią oczyszczania pojedynczych białek różnego pochodzenia. Nieoczekiwanie zastosowanie tej metody w sposobie według wynalazku do izolowania całych kapsydów bakteriofagowych, stanowiących złożone i rozbudowane przestrzennie struktury białkowe, pozwoliło na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej izolowanych bakteriofagów, mimo iż ich kapsydy zostały istotnie zmodyfikowane w celu umożliwienia stosowania chromatografii powinowactwa. W przykładowej realizacji wykorzystano technikę phage display do wprowadzenia motywów wiążących do kapsydu fagowego, a następnie oparto się na wiązaniu tak zmodyfikowanych bakteriofagów do złoża powinowactwa odpowiedniego dla wybranego motywu wiążącego.

Opis uzupełniono następującymi figurami:

Na figurze 1 przedstawiona została sekwencja fragmentu genu 23 kodującego dojrzałą postać głównej proteiny kapsydowej gp23* (po cięciu proteolitycznym);

Na figurze 2 przedstawiona została kaseta ekspresyjna - białko gp23* w fuzji z GST - oczekiwana masa produktu 23*GST : 78 kDa; wytłuszczeniem zaznaczono sekwencje pochodzące z wektora pDEST15 Invitrogen, podkreślając charakterystyczne dla wektora pDEST15 miejsca rekombinacji, zwykłą czcionką opisano pozostałe elementy operatorowe, dodatkowo oznaczając je następująco: pojedyncze podkreślenie: promotor T7, podwójne podkreślenie: RBS, przerywane podkreślenie: GST, podkreślenie zygzakiem: terminator T7; czcionką pochyłą zaznaczono zawierający gen 23* konstrukt obejmujący m. cięcia dla AcTev (pojedyncze podkreślenie), 3xSer (podwójne podkreślenie), gen 23* (przerywane podkreślenie).

Na figurze 3 przedstawiona została kaseta ekspresyjna - białko 23* w fuzji z Histag - oczekiwana masa produktu 23*Histag : 50 kDa; Wytłuszczeniem zaznaczono sekwencje pochodzące z wektora pDEST15 Invitrogenu, podkreślając charakterystyczne dla wektora pDEST15 miejsca rekombinacji, zwykłą czcionką opisano pozostałe elementy operatorowe, dodatkowo oznaczając je następująco: pojedyncze podkreślenie: promotor T7, podwójne podkreślenie: RBS, przerywane podkreślenie: Histag, podkreślenie zygzakiem: terminator T7; czcionką pochyłą zaznaczono zawierający gen 23* konstrukt obejmujący m. cięcia dla AcTev (pojedyncze podkreślenie), 3xSer (podwójne podkreślenie), gen 23* (przerywane podkreślenie);

PL 218 313 B1

Na figurze 4 przedstawiona została ekspresja białek gp23* i gpWac w fuzji z GST i Histag w komórkach E. coli Rosetta (panel A, B, C, D), Panel A - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko 23* w fuzji z Histag :1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4- nie dotyczy, 5-23*Histag 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel B - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko Wac w fuzji z Histag : 1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4, 5- nie dotyczy, 6-WacHistag 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel C - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko Wac w fuzji z GST :1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4-nie dotyczy, 5-WacGST 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel D - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko gp23* w fuzji z GST :1-Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3- nie dotyczy, 4-23*GST 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką).

Na Figurze 5 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 2).

Na Figurze 6 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1).

Na Figurze 7 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 1).

Na Figurze 8 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1).

Na Figurze 9 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego dzięki trawieniu proteolitycznemu (1 doba), po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa).

Na Figurze 10 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu niklowo-agarozowym NiNTA (brak dializy, frakcja 1)

P r z y k ł a d 1.

Procedura zakłada przygotowanie i wykorzystanie szczepu bakteriofaga macierzystego bez zmian genetycznych. W roli gospodarza dla bakteriofaga T4 wykorzystano szczepy ekspresyjne Escherichia coli transformowane ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen 23* lub poprawny gen wac w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw peptydowy przewidziany do prezentacji na kapsydzie. W tak prowadzonej hodowli bakteriofag ma możliwość kompetytywnego włączania białka rekombinowanego ekspresjonowanego jednocześnie w komórce bakteryjnej z ekspresyjnego plazmidu: gp23* w fuzji z motywem wiążącym lub gpWac w fuzji z motywem wiążącym. Powstają stabilne struktury kapsydowe zawierające rekombinowane białko, a zatem zawierające i prezentujące na powierzchni motywy o silnym powinowactwie do złóż wiążących.

Mogą być zastosowane dwa alternatywne sposoby uwalniania bakteriofagów ze złoża: (i) elucja kompetytywna, tj. wypieranie za pomocą związków zdolnych do oddziaływania z motywami wiążącymi na kapsydach i/lub złożem wiążącym (glutation, imidazol), lub (ii) uwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy rozpoznającej rzadkie motywy aminokwasowe. Druga strategia wymaga wprowadzenia na etapie projektowania ekspresyjnej konstrukcji plazmidowej przewidzianej do produkcji w komórce rekombinowanego białka, sekwencji rozpoznawanej przez odpowiednią proteazę. W wypadku uwalniania proteolitycznego kapsyd bakteriofagowy jest pozbawiany motywów wiążących.

Szczegółowy przykład realizacji sposobu według wynalazku podano poniżej.

Komórki gospodarza bakteryjnego uzyskano stosując szczepy ekspresyjne Escherichia coli, które transformowano ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen 23* lub wac w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw wiążący. W przykładowej realizacji wykorzystano plazmid pDEST15 (Invitrogen), który zawierał kasetę ekspresyjną pozwalającą uzyskać białko zawierające gp23* lub gpWac w fuzji z GST (figura 2) lub kasetę ekspresyjną kodującą białko zawierające gp23* lub gpWac w fuzji z Histag (figura 3).

Skuteczność transformacji komórek E. coli Rosetta badano obserwując ekspresję białka gp23* lub gpWac w fuzji z tagami GST i Histag (figura 4).

PL 218 313 B1

Rekombinowane komórki gospodarza bakteryjnego hodowano w temp. 37°C do OD600 0,7 na medium LB (LB-Broth, high salt) o składzie: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 10g/l, ekstrakt drożdżowy 5g/l, chlorek sodu 10g/l, pH 7,5. Następnie komórki przenoszono do świeżego LB (w stosunku 1:100 względem LB) opcjonalnie: prowadzono hodowlę do OD600=0,1, następnie dodawano IPTG do 0,0025 M oraz 1:100 objętości lizatu faga HAPl (~3x10⁹ pfu/ml). Indukcja ekspresji oraz infekcja miały zatem miejsce jednocześnie. Zainfekowane komórki hodowano w 37°C przy 160 rpm przez 8-12 godzin.

W opisywanej przykładowej realizacji wynalazku rekombinowane bakterie Escherichia coli zakażano dzikim bakteriofagiem T4 indukując jednocześnie ekspresję białka Hoc, prowadzono jednocześnie lizę fagową i indukcję ekspresji białka rekombinowanego gp23* lub gpWac.

Lizat fagowy filtrowano, opcjonalnie poddawano dializie do buforu fosforanowego identycznego z buforem przewidzianym do płukania kolumn na membranie o porach 300 kDa, po czym inkubowano z odpowiednim złożem agarozowym: sefaroza glutationowa (ang. Glutathione sepharose) lub agarozowym z jonami metali kompleksujących reszty imidazolowi histydyn (np. NiNTA agarowe). Lizaty inkubowano z odpowiednim złożem przez noc w temp. 4°C z lekkim kołysaniem. Po usunięciu niezwiązanej frakcji stosowano typową dla chromatografii powinowactwa procedurę oczyszczania tj. złoże poddano płukaniu 4 I buforu : 50 mM Na2HPO4,300 mM NaCI, pH 7,5 (złoże GST) lub 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCI, 50-100 mM imidazol, pH 7,5 (złoże niklowe), następnie bakteriofagi eluowano lub zwalniano ze złoża proteolitycznie.

W przypadku złoża GST stosowano dwa sposoby elucji:

elucję kompetytywną, 40 mM zredukowanym glutationem (1 lub 2 frakcja);

- bufor do elucji: 40 mM zredukowany glutation, 50 mM Tris, pH 8.0. Przed zebraniem każdej frakcji, złoże inkubowano z buforem 20 minut; zwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy AcTEV;

-zastosowanie zwalniania proteolitycznego wymaga wcześniejszej analizy teoretycznej sekwencji lub empirycznego testu wrażliwości bakteriofaga na działanie proteazy (poprzez kontrolę spadku miana); tu zastosowano analizę teoretyczną opartą na analizie sekwencji zewnętrznych białek kapsydu T4

- bufor dla proteazy: 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0. Enzymu dodawano w ilości μΐ na 1 ml złoża (aktywność - 10 U/μΙ). Proteolizę prowadzono 1 dzień w 4°C

W przypadku złoża NiNTA fagi wypierano imidazolem w gradiencie 100-500 mM (1 lub 2 frakcja) -bufor do elucji: 100-500 mM imidazol (zależnie od frakcji), 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCI, pH 7,5 Płukanie oraz elucje prowadzono w temperaturze pokojowej.

Metody analizy wyników

Specyficzność bakteriofagów modyfikowanych względem złoża wnioskowano na podstawie porównania profilu elucji fagów T4 modyfikowanych tagiem specyficznym dla danego złoża i tagiem niepasującym do złoża. Profil elucji wyznaczano poprzez ocenę miana fagowego w poszczególnych frakcjach. Kontrolnie oceniano miano fagowe w ostatniej partii buforu płuczącego; eksperyment uznawano za efektywny przy założeniu, że miano w tej partii nie było większe niż 1% miana fagów związanych, wykrywanych w eluowanych następnie frakcjach. Efektywność oczyszczania sprawdzano poprzez oznaczanie poziomu endotoksyn w eluowanych (bądź zwalnianych) frakcjach.

Wyniki

Uzyskane wyniki przedstawiono na zawartych w niniejszym opisie figurach oraz tabeli.

Przedstawione na figurach wykresy zawierają porównanie wybranych frakcji elucji. W przypadku eksperymentów porównawczych, które miały potwierdzić specyficzność fagów do złoża, wyjściowe miana preparatu kontrolnego oraz potencjalnie specyficznego były identyczne. Te same objętości lizatów inkubowano z tą samą ilością złoża, płukano oraz eluowano w tych samych warunkach.

Fig. 5 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 2) Powinowactwo do złoża praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) ponad 15-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.

Fig. 6 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1). Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) 20-krotnie przekracza

PL 218 313 B1 powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.

Fig. 7 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 1). Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) prawie 4,5-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.

Fig. 8 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1) Powinowactwo do złoża praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) prawie 24-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.

Fig. 9 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych dzięki trawieniu proteolitycznemu AcTev, po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa). Miano praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) 10-krotnie przekracza miano preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.

Fig. 10 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1) Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (His-tag) prawie 2-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (GST), co świadczy o słabym specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem His-tag.

Tab. 1. Tabela przedstawia uzyskane wartości endotoksyn dla oczyszczanych preparatów fagowych oraz odpowiadające im miana.

Preparat fagowy	Poziom endotoksyn (EU/ml)
Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, lizat	1000
Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, dializowany	24
Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gpWac, lizat	88
Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gpWac, dializowany	51
Elucja: T4 modyfikowany Histag w fuzji z gp23*, lizat	1000
Proteoliza: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, dializa	38

Wnioski

Proponowana metoda umożliwia jednoetapowe a zarazem efektywne oczyszczenie preparatów fagowych, pozwala na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej bakteriofagów zarówno w wypadku strategii opartej o wypieranie związanych bakteriofagów ze złoża jak i o uwalnianie proteolityczne. Nie wymaga osobnych kroków podejmowanych dla usuwania zanieczyszczeń białkowych i niebiałkowych (w tym LPS). Modyfikacja białek płaszcza fagowego odpowiednimi motywami wiążącymi może umożliwiać oczyszczenie także innych szczepów bakteriofagowych techniką chromatografii powinowactwa. Proponowana metoda umożliwia prezentację wybranych peptydów lub białek na fagach niemodyfikowanych genetycznie do celów phage-display tj. dzikich, występujących naturalnie, lub innych (laboratoryjnych szczepach różnego zastosowania).

Claims

1. Sposób otrzymywania bakteriofagów, znamienny tym, że:

a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa, d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą białko fuzyjne zawierające obcy polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b) oraz polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCI.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga niemodyfikowanym genetycznie w celu prezentacji metodą phage-display.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.