KR20140091739A - 테이코플라닌의 정제 방법 - Google Patents

테이코플라닌의 정제 방법 Download PDF

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KR20140091739A
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레크 파마슈티칼스 디.디.
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Abstract

본 발명은 테이코플라닌의 정제 방법, 특히 시판용 소수성 또는 약간 극성의 흡착 수지 상에서의, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 배양물의 발효 브로쓰의 여과물로부터의 특정 용해 성분의 흡착과, 추가의 수지로부터의 생성물의 선택적 용리에 의한 효율적인 불순물 제거 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 방법은, 다양한 정제 공정 단계에서의, 예컨대 상기 언급된 용리 단계에서의 및/또는 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 단계에서의 수용액 중 수-혼화성 유기 용매의 혼합물의 사용을 포함한다. 방법은, 예를 들어 용리 후 및 한외여과 전에, 테이코플라닌 용액을 목탄으로 처리하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 수-혼화성 유기 용매는 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.

Description

테이코플라닌의 정제 방법 {PROCESS OF PURIFICATION OF TEICOPLANIN}
본 발명은 화학 기술 분야, 보다 구체적으로는 항생제 테이코플라닌의 신규하고 효과적인 정제 방식에 관한 것이다.
테이코플라닌은, 예를 들어 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)와 같은 진균 미생물에 의해 생성된, 반코마이신-리스토세틴 패밀리로부터의 글리코펩티드 항생제의 군에 대해 통상적으로 사용되는 용어이다. 테이코플라닌은, 테이코마이신 A1, A2 및 A3이라 불리는 3개의 인자의 혼합물로서 문헌 [J. Antibiotics 31 (1978), p. 170-177]에 최초로 개시되었다. 인자 A2 (이후에는 테이코플라닌 A2라 불림)가 주성분으로서 확인되었고, 이는 세파덱스(Sephadex) LH-20™ 상에서의 칼럼 크로마토그래피에 의해 단리되었다. 테이코플라닌 A2는 이후에 5종의 분자의 혼합물로서 인식되었고 (문헌 [J. Antibiotics 37 (1984), p. 615-620]), 이들은 곧 아실-지방족 측쇄의 성질이 상이한 구조로서 규명되었다 (문헌 [J. Am. Chem. Soc. 106 (1984), 4895-4902]). 테이코플라닌의 전형적 예시 화합물 표시를 도 1에 나타내었다 (R은 다양한 C10-C11-알킬 잔기를 나타낼 수 있음). 이들 5종의 A2 화합물은 또 다른 주성분 (A3) 및 일부 부성분 (예를 들어 RS-1 내지 RS-4)과 함께 테이코플라닌을 구성한다.
제한된 비율 변화의 이들 성분들의 혼합물은 그람-양성 박테리아에 의한 감염 치료를 위한 타르고시드(Targocid)?로서 시판된다. 반코마이신 및 반코마이신-유사 항생제 이외에도, 이는 또한 고도 내성 미생물에 대해 중요한 활성 화합물로 남아있다.
미생물의 배양 브로쓰(broth)로부터 테이코플라닌을 분리하고 테이코플라닌을 정제하여 제약학적 등급에 도달하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다. US 4239751에서의 최초 공개에 따르면, 배양 브로쓰를 균사체 케이크 및 여과물로 분할한다. 케이크 처리 후, 두 분획을 산성 pH에서 부탄올로 추출하고, 용매의 부분적 제거 후에 조 발효 생성물을 침전시켰다. 침전물을 수집하고, 세파덱스 LH20 칼럼 및 산성 이온 교환 수지, 예컨대 앰벌라이트(Amberlite) IR-120 및 도웩스(Dowex) 50 상에서 정제하고, 4℃에서의 침전에 의해 생성물의 최종 단리를 수행하였다. 그러나, 이 방법은 복잡성, 품질, 비용 및 수율의 관점에서 산업적 용도에 있어서는 여러 단점을 갖는 단리의 실험실 시험이다.
이러한 테이코플라닌의 자가-억제된 제조에서 발효의 수율을 향상시키기 위해서는, 배양 브로쓰에 수-혼화성 유기 용매, 예컨대 아세톤, n-프로판올, 및 아세토니트릴을 첨가함으로써 (한국 특허 번호 367890), 또는 강한 산성 양이온 교환 수지, 예컨대 다우(Dow) XFS-43278.00 및 디아이온(Diaion) SK-1 02를 첨가함으로써 (한국 특허 번호 118034) 생성물을 연속적으로 제거하도록 시도되었다. 그러나 이러한 방법들은, 여전히 테이코플라닌을 추출하기 위해 다량의 유기 용매를 필요로 하고, 이는 취급 문제 및 환경 오염을 일으킨다.
US 특허 출원 4,845,194에는, 이전의 pH 조정이 없는 양이온 교환 기술을 포함한 테이코플라닌의 정제 방법이 보고되어 있다. 약 9 내지 약 12의 pH 값을 갖는 용액을 사용하여 양이온 교환 수지로부터 테이코플라닌을 용리시킨다.
테이코플라닌의 단리에 있어서의 추가의 진전은, 특정 폴리아미드 수지를 사용하는, 최초로 EP 0241758에 개시된, 소수성 수지에 대한 테이코플라닌의 효율적인 결합의 발견, 및 1차 개시된 방법 (EP 0479086)의 간소화로서의 알칼리 pH에서의 균사체로부터의 테이코플라닌의 추출 공정에 의한 정제의 추가의 등급상승에 의해 이루어졌다. 그러나, 테이코플라닌의 순도는 85% 이하였으며, 탈색이 불충분하였다.
바람직하게는 현탁액 처리에서보다는 칼럼으로서 적용되는, 시판용 소수성 수지의 도입은 추가의 진전을 나타내었다. 공개 문헌 [J. Biochem. 275 (2000), p. 6201-6206]에는, 시판용 소수성 수지 디아니온(Dianion) HP2 MGL™의 사용과 NaOH 용액을 사용한 추가의 용리가 기재되어 있다. 그러나, 이 접근은 알칼리-감응성 생성물의 에피머화를 막기 위해 용리액의 연속적 중화를 필요로 하였다. 순수한 테이코플라닌을 얻기 위한 다른 특정 접근이 수반되는 경우에도, 단지 50 내지 60% (w/w)의 순도의 관점에서, 이러한 실험실 방법은 제약 성분으로서의 사용 이외의 목적에 더 적합하다.
한국 특허 번호 321304에는, 중성 흡착 수지, 및 앰벌라이트 XAD 16, 디아이온 HP 20, 실리카 겔, 및 활성탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 수지를 사용한 렉틴-고정화 친화성 크로마토그래피 단계가 개시되어 있다. 그러나, 염기성 용액으로부터 추출된 여과 배양 브로쓰가 디아이온 HP 20과 같은 수지에 흡착되는 경우, 상당량의 테이코플라닌이 흡착 단계에서 손실되고, 메탄올 농도 구배에 의해 용리된 테이코플라닌의 순도가 매우 낮다. 또한, 렉틴-고정화 수지에 용액을 적용하기 위해 메탄올을 제거하는 것이 필수적이다. 또한, 렉틴-고정화 수지의 비용으로 인해 상기 전략을 대규모 제조에 적용하는 것은 바람직하지 않다.
한국 특허 출원 2003/017067에 따르면, 배양 브로쓰의 테이코플라닌을 다공성 흡착 수지에 흡착시키고, 다공성 흡착 수지를 희석된 염산으로 세척하고, 테이코플라닌을 물과 아세톤의 혼합 용액을 사용하여 흡착 수지로부터 탈착시킨다. 테이코플라닌을 함유하는 용리액을 진공 증류에 의해 농축시키고, 활성탄으로 처리하고, 침전 공정에 적용하고, 이로써 테이코플라닌을 정제한다. 또한, 상기 방법은, 수지에 대한 테이코플라닌의 비가역적 흡착이 수율을 감소시키는 것으로 인해, 또한 다량의 용매가 사용되는 것으로 인해, 규모 상승에는 불충분하다. 또한, 다공성 흡착 수지를 사용하는 단일 방법만을 사용하여서는 테이코플라닌을 95 면적% 이상으로 정제하기가 어렵다.
다르게는, 일부 다른 연구들은, 배양 브로쓰로부터 테이코플라닌을 분리하고 정제하기 위해 역상 수지를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Chromatographia 24 (1987) p. 295-301]에 공개된 방법은, 리크로소르브(Lichrosorb)™ 수지를 사용한 테이코플라닌의 정제를 제안하였지만, 다량의 아세토니트릴의 사용 및 빈번한 수지의 교환은 제조 비용을 상당히 상승시킬 수 있다. 두가지 다른 대안은, 추가의 정제 방식에 의한 역상 수지 상에서의 크로마토그래피 방법을 달성하였다. 예를 들어, 한국 특허 출원 2003/092504에는, 수성 아세톤을 사용한 발효 생성물의 추출 후, 실란 코팅된 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피, 활성탄 상에서의 흡착 (단리 및 한외여과 단계에서)이 이어지는 것이 기재되어 있다. US 7405267에는, 합성 흡착제를 사용한 1차 정제 단계, 양이온-교환 수지, 촉매 수지, 또는 킬레이트 수지를 사용한 2차 정제, 역상 수지를 사용한 3차 정제 단계, 및 최종 동결건조 단계를 포함하는, 배양 브로쓰로부터의 테이코플라닌의 정제 방법이 언급되어 있다. 따라서, 보다 고가의 역상을 단독으로 사용하는 것은 추가의 흡착제의 사용을 피할 수 없고, 따라서 이는 추가의 비용을 정당화하지 못한다.
요약하면, 상기에 기재된 모든 방법은 단지 부분적 해결책만을 제공하고, 이들은 테이코플라닌의 단리 및 정제의 복잡성을 해결하지 못한다. EP 1735337B1 (WO 2005/116059)은 지금까지 테이코플라닌의 단리 및 정제에 대한 가장 포괄적인 해결책을 제공하였다. 이는 하기와 같은 테이코플라닌의 정제 및 단리의 핵심적 단계를 나타내는 소수성 수지 상에서의 흡착 방법에 대한 것이었다:
- 여과물 중에 용해된 테이코플라닌으로부터의 균사체의 분리,
- pH 6.5 내지 7.5의 중성 10 내지 40% 수성 C1-C4-알콜 또는 C3-C4-케톤 매질로부터의 다공성 흡착 수지에 대한 대충 정제된 테이코플라닌의 흡착, 그 후 주의깊은 염 농도 조절 하에서의 40 내지 90% 수성 C1-C4-알콜로의 용리,
- 최대 30%로 수성 메탄올로부터 대략 계산된, 희석된 수성 알콜 용액을 사용한 활성탄에 대한 불순물의 흡착,
- 다공성 수지에 대한 흡착, 그 후 40 내지 90% 수성 C1-C4-알콜로의 용리에 의한 탈염,
- 20% 미만 농도의 정제된 테이코플라닌의 희석된 수성 알콜 용액을 사용한 0 내지 4 kPa의 압력에서의 3 내지 100 kDa의 세공 크기를 갖는 멤브레인 상에서의 한외여과,
- 테이코플라닌의 침전.
상기 방법은 테이코플라닌 단리에 대한 최선의 문헌 선택사항을 나타낼 수 있지만, 놀랍게도 그의 재현은 상당한 결점을 나타낸다:
- 다공성 수지로부터의 탈착이 완전하지 않음 (최대 87.6%);
- 세공이 테이코플라닌 분자 반경보다 상당히 더 큼에도 불구하고, 한외여과에서 세공 크기 감소는 놀랍게도 멤브레인을 통한 테이코플라닌의 통과를 감소시키며, 보다 큰 세공의 사용은 선택성을 감소시키고, 따라서, 용매 매질 양을 거대 부피로 향상시키는 수회의 한외여과 사이클이 필요함;
- 수지 상에서의 흡착 단계에서나 목탄 상에서의 탈색 및 한외여과 동안 색이 완전히 제거되지 않기 때문에, 착색 불순물의 제거가 주요 문제로 남아있음.
이후의 공개 문헌 CN 101423547A에는,
- 여과물 중에 용해된 테이코플라닌으로부터의 균사체의 분리,
- 다공성 흡착 수지에 대한 대충 정제된 테이코플라닌의 흡착, 그 후 수 혼화성 유기 용매 및 물의 약간 산성인 (pH 값이 3임) 조성물로의 용리,
- 활성탄에 대한 불순물의 흡착,
- 실용예에서의 나노여과, 임의로 언급된 한외여과의 이용
과 같은 이전 단계에 이어지는, 테이코플라닌 용액을 2.5 내지 6으로 조정하는 것에 의한 상기 포괄적 절차의 수정이 나타나 있다.
이들 이전 단계의 방법의 이점은 명확히 확인되지 않는다. 테이코플라닌의 분자량이 나노멤브레인 및 울트라멤브레인의 평균 컷-오프(cut-off) 사이에 있고, 따라서 이들의 기능이 동일하지 않기 때문에, 나노여과에 대한 대안으로서의 한외여과는 특히 불명확하다.
따라서, 제약학적 등급의 테이코플라닌의 효율적인 포괄적 단리 절차에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 하기 측면, 청구 사항 및 바람직한 실시양태를 제공하며, 이들은 각각 단독으로 또는 조합되어 본 발명의 목적을 해결하는 데 추가로 기여한다.
1. a) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키는 단계;
b) 물 및 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 매질을 사용하여 상기 수지로부터 테이코플라닌을 탈착시키는 단계;
c) 테이코플라닌을 포함하는 용액을 목탄으로 처리한 후 목탄을 제거하는 단계;
d) 테이코플라닌을 포함하며, 20% (v/v) 초과의 수-혼화성 유기 용매 및 90% (v/v) 이하의 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 용액을 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 방법에 적용하는 단계;
e) 임의로는, 단계 d)에 정의된 한외여과 후에, 1000 Da 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌-함유 용액을 농축시키고/거나 탈염시키는 단계; 및
f) 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
를 포함하는, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
2. 단계 a) 내지 f)를 항목 1에 기재된 바와 같은 순서로 수행하는 것인, 항목 1에 따른 방법.
3. 앞서, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 배양물에 유기 용매를 첨가하고, 여과 및/또는 원심분리에 의해 균사체 및 다른 불용성 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 1 또는 2에 따른 방법.
4. 소수성 흡착 수지가 20 내지 500 Å의 세공 크기를 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지인, 항목 1 또는 3 중 어느 하나에 따른 방법.
5. 소수성 흡착 수지가 100 내지 500 Å의 세공 크기를 갖는 것인, 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 방법.
6. 소수성 흡착 수지가 하이퍼졸-마크로넷(Hypersol-Macronet)?, 도웩스? 옵티포어(Optipore), 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180, 디아이온? HP20, 디아이온? 세파비즈(Sepabeads) SP207 및 디아니온? HP2MG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법.
7. 소수성 흡착 수지가 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600 및 앰벌라이트? XAD 1180으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 방법.
8. 소수성 흡착 수지에 대한 흡착을 30% (v/v) 이하의 수-혼화성 용매를 포함하는 용액 중에서 수행하는 것인, 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법.
9. 소수성 흡착 수지로부터의 테이코플라닌의 탈착 단계를 40% (v/v) 이상의 수-혼화성 유기 용매를 포함하는 수성 매질을 사용하여 수행하는 것인, 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법.
10. 수-혼화성 유기 용매가 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로부터 선택되는 것인, 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법.
11. 수-혼화성 용매가 메탄올인, 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법.
12. 소수성 흡착 수지로부터의 테이코플라닌의 탈착 단계를 60 내지 70% (v/v)의 메탄올을 포함하는 수성 매질을 사용하여 수행하는 것인, 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법.
13. 소수성 흡착 수지로부터의 테이코플라닌의 탈착 단계를 4 미만의 pH 값을 갖는 수성 매질을 사용하여 수행하는 것인, 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법.
14. 수성 매질이 2 내지 2.5의 pH 값을 갖는 것인, 항목 13에 따른 방법.
15. 수성 매질의 pH 값을 무기 산, 유기 산 또는 산성 완충제의 수용액의 첨가에 의해 조정하는 것인, 항목 12 또는 14에 따른 방법.
16. 수성 매질의 pH 값을 염산, 황산, 인산 또는 시트르산의 첨가에 의해 조정하는 것인, 항목 13 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법.
17. 단계 b)에서 얻어진 용액을 단계 c)의 목탄 처리 전에 농축시키는 것인, 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법.
18. 단계 b)에서 얻어진 용액의 pH 값을, 목탄 처리 전에, 무기 수산화물, 탄산염, 인산염으로부터 선택된 염기의 첨가에 의해 또는 완충제의 첨가에 의해 6.0 내지 8.0의 pH로 조정하는 것인, 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 방법.
19. 목탄 처리가 행해지는 용액의 매질이 단계 b)로부터 유래되고, 40% (v/v) 이상의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴의 군으로부터 선택된 유기 용매를 포함하는 것인, 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 방법.
20. 단계 b)에서 얻어진 용액이 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 포함하거나, 또는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올 농도를 갖도록 신선한 용매의 첨가에 의해 보정되는 것인, 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 방법.
21. 용액 중 테이코플라닌과 활성탄 사이의 중량비가 1 : 0.05 내지 1 : 2, 바람직하게는 1 : 0.2 내지 1 : 1, 가장 바람직하게는 1 : 0.5 내지 1 : 0.8인, 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 방법.
22. 단계 d)의 한외여과를, 20% (v/v) 초과 및 90% (v/v) 이하의 C1-C4 알콜을 포함하는, 단계 c)에서 얻어진 용액 상에서 수행하는 것인, 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법.
23. 단계 d)의 한외여과를, 20% (v/v) 초과 및 90% (v/v) 이하의 C1-C4 알콜을 포함하도록 신선한 용매의 첨가에 의해 보정된, 단계 c)에서 얻어진 용액 상에서 수행하는 것인, 항목 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 방법.
24. 단계 d)의 한외여과를, 40 내지 80% (v/v)의 메탄올, 바람직하게는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 포함하는, 단계 c)에서 얻어진 용액 상에서 수행하는 것인, 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 방법.
25. 단계 d)의 한외여과를, 3 내지 100 kDa, 바람직하게는 5 내지 100 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷-오프 멤브레인을 사용하여 수행하는 것인, 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 방법.
26. 단계 d)의 한외여과가 0.65 이하, 보다 바람직하게는 0.4 이하의, 테이코플라닌 농도의 잔류물/투과물 비율을 특징으로 하는 것인, 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 방법.
27. 단계 e)의 한외여과를 1000 Da 컷-오프 멤브레인을 사용하여 수행하는 것인, 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 방법.
28. 단계 f)에서 정제된 테이코플라닌을 얻는 것을, 증발, 진공 증발, 동결건조, 분무 건조 또는 역용매 첨가에 의한 침전을 이용한 용매 제거를 포함하는 테이코플라닌 단리에 의해 수행하는 것인, 항목 1 내지 27 중 어느 하나에 따른 방법.
29. 아세톤을 역용매로서 사용하는 것인, 항목 28에 따른 방법.
30. 침전된 테이코플라닌을 여과 또는 원심분리에 의해 단리시키고, 임의로 진공에서 건조시키는 것인, 항목 28 또는 29에 따른 방법.
31. 정제된 테이코플라닌이 제약학적 용도를 위한 것인, 항목 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 방법.
32. 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 방법을 포함하며, 정제된 테이코플라닌을 하나 이상의 제약 부형제 또는 담체와 혼합하는 것인, 제약 조성물의 제조 방법.
33. 단계 b) 및 c)에서의 매질이 40% (v/v) 이상의 수-혼화성 유기 용매를 포함하고, 3 미만의 단계 b)에서의, 또한 임의로 단계 c)에서의 pH 값을 갖는 것인, 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법.
34. a) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키는 단계;
b) 물 및 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 매질을 사용하여 상기 수지로부터 테이코플라닌을 탈착시키는 단계;
c) 테이코플라닌을 포함하는 용액을 목탄으로 처리한 후 목탄을 제거하는 단계;
d) 테이코플라닌을 포함하며, 60% (v/v) 초과의 수-혼화성 유기 용매 및 90% (v/v) 이하의 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 용액을 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 방법에 적용하는 단계;
e) 임의로는, 단계 d)에 정의된 한외여과 후에, 1000 Da 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌-함유 용액을 농축시키고/거나 탈염시키는 단계; 및
f) 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 b) 및 c)에서의 매질이 40% (v/v) 이상의 수-혼화성 유기 용매를 포함하고, 3 미만의 단계 b)에서의, 또한 임의로 단계 c)에서의 pH 값을 갖는 것인, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
도 1: 테이코플라닌의 전형적 예시 화합물 표시를 나타냄.
도 2: 전형적인 테이코플라닌의 탈아미노화를 개략적으로 나타냄.
도 3: 본 발명에 따른 예시적 방법의 개략적 개요를 제공함.
도 4: 흡착된 테이코플라닌의 부분을 초기 농도에 대한 주어진 시점에서의 농도의 비율로서 나타냄.
도 5: 중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD16™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 관련 불순물의 탈착: 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을, 2 세트의 실험의 결과로서 도표로 나타내었음.
도 6: 중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1600™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착: 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을, 2 세트의 실험의 결과로서 도표로 나타내었음.
도 7: 중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1180™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착: 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었음.
도 8: 산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD16™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착: 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었음.
도 9: 산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1600™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착: 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었음.
도 10: 산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1180™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착: 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물 부분 (테이코플라닌과 비교한 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었음.
도 11: 물-메탄올 혼합물 중 활성탄을 사용한 테이코플라닌 용액 탈색: 메탄올 농도에 따른 수율 (원) 및 상대적 흡수 감소 (정사각형)를 도표로 나타내었음.
도 12: 다양한 로드로 활성탄을 사용한 테이코플라닌 용액 탈색: 다양한 목탄 로드 (테이코플라닌에 대한 w/w로서 나타냄)에 따른 수율 (원) 및 상대적 흡수 감소 (정사각형)를 도표로 나타내었음.
도 13: 상이한 메탄올/물 혼합물에서의 한외여과 멤브레인을 통한 테이코플라닌 투과율: 투과물 및 농축물의 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였음.
발명의 상세한 설명
이제, 본 발명을 바람직한 실시양태 및 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 이는 단지 예시적 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
따라서, 본 발명은, 예를 들어 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스와 같은 테이코플라닌을 생성하는 진균 미생물의 발효 배양물로부터 테이코플라닌을, 상당한 색 제거와 함께 제약학적 용도를 위한 등급으로 단리시키는 저비용의 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "테이코플라닌"은, 화합물의 혼합물로 이루어진 글리코펩티드 항생제 또는 상기 혼합물의 단일 성분들에 관한 것이다. 혼합물의 단일 성분들은 전형적으로 5종의 주성분 (A2-1, A2-2, A2-3, A2-4, A2-5), 코어 글리코펩티드 A3-1 및 부성분, 예컨대 RS-1, RS-2, RS-3 및 RS-4를 포함한다. 본원에서 언급되는 바와 같은 본 발명의 배경기술의 기재를 명시적으로 참조한다. 단일 성분들의 함량비는 일정하지 않을 수 있으며, 사용되는 균주, 배양 조건 또는 적용되는 정제 방법에 따라 달라질 수 있다.
테이코플라닌의 발효는 강력하게 갈색 내지 거의 흑색으로 착색된 브로쓰를 생성하고, 이는 당업자에게 공지된 흡착 및 크로마토그래피 방법에 의한 소정의 기술적 절차를 통해 점차 탈색되어, 여전히 황색 또는 갈색을 띠는 상당히 착색된 최종 생성물을 형성하고, 이는 저장에 의해 추가로 어두워질 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도, 착색 불순물은 적어도 3개의 물리화학적 그룹에 속하는 것이고, 이는 단지 하나의 기술적 작업에 의해서는 제거될 수 없다는 것을 발견하였다. 중요 불순물은 하기 그룹으로 분류될 수 있다.
하나의 그룹은 고분자량 착색 불순물을 나타내고, 이는 수지에 대한 흡착 또는 겔 여과와 같은 큰 분자에 적합한 분리 방법에 의해 제거될 수 있다. 이들은 주로 셀 구조의 거대분자 잔류물을 포함한다.
또 다른 그룹은, 또한 이중 결합된 지질 부분을 갖는 분자를 포함하는 비특이적 셀 성분에서 유래된, 보다 낮은 극성의, 아마도 1000 Da 미만의 저분자량 불순물을 나타낸다.
제3 그룹은, 아마도 산화적 아미노분해에 의해 생성된, 공개 문헌 [J. Antibiotics 49 (1996), p. 644-650]에서 특성화된, 밀접하게 관련된 분해 생성물을 나타낸다. 아미노 기가 케토 기로 대체됨으로써 이중 효과가 제공된다: 분자의 영향 부분은 공액 퀴논 유사 구조가 되어, 흡수 최대를 가시 스펙트럼으로 이동시키고, 분자는 염기 특성을 잃는다 (도 2).
따라서, 본 발명은, 시판용 소수성 또는 약간 극성의 흡착 수지 상에서의, 테이코플라닌 생성 진균 미생물의 배양물, 바람직하게는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 배양물의 발효 브로쓰의 여과물로부터의 특정 용해 성분의 흡착과, 추가의 수지로부터의 생성물의 선택적 용리에 의한 효율적인 불순물 제거 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 방법은, 다양한 정제 공정 단계에서의 수용액 중 수-혼화성 유기 용매의 혼합물의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 수-혼화성 유기 용매는 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 배양물의 발효 브로쓰의 여과물은, 숙련된 생물공학자에게 공지된 절차에 의해 제조된 균사체를 갖지 않는 여과된 배양 브로쓰를 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 방법은,
a) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키는 단계;
b) 물 및 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 매질을 사용하여 상기 수지로부터 테이코플라닌을 탈착시키는 단계;
c) 테이코플라닌을 포함하는 용액을 목탄으로 처리한 후 목탄을 제거하는 단계;
d) 테이코플라닌을 포함하며, 20% (v/v) 초과의 수-혼화성 유기 용매 및 90% (v/v) 이하의 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 용액을 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 방법에 적용하는 단계;
e) 임의로는, 단계 d)에 정의된 한외여과 후에, 1000 Da 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌-함유 용액을 농축시키고/거나 탈염시키는 단계; 및
f) 마지막으로 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
를 포함한다.
상업적으로 입수가능한 소수성 또는 약간 극성의 흡착 수지는, 상표명 하이퍼졸-마크로넷?, 앰벌라이트? XAD, 디아이온? HP 및 세파비즈 SP, 또는 도웩스? 옵티포어로부터 선택된 (이에 제한되지는 않음) 20 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 상표명 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180, 디아이온? HP20, 디아이온? 세파비즈 SP207, 디아니온? HP2MG로부터 선택된, 가장 바람직하게는 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180으로부터 선택된 100 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 수지로부터 선택될 수 있다. 이러한 유형의 수지는, 수용액으로부터, 테이코플라닌과 같은 약간 큰 분자량의 분자를 포함한 친지질성 잔기를 갖는 분자를 선택적으로 흡착하고, 이온성 용질을 포함한 저분자량 극성 성분 및 각종 거대분자를 용액 중에 남긴다. 보다 덜 극성인 분자가 수용액으로부터 흡착되고, 이는 30% (v/v) 이하의 수 혼화성 용매, 바람직하게는 20% 이하의 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴, 바람직하게는 메탄올을 함유한다.
흡착 용이성은 수지의 유형에 따라 달라지고; 보다 덜 유리한 흡착은 보다 긴 처리 시간에 의해 보상될 수 있다. 대표적 실시예 2는 세가지 전형적 수지: 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180에 대한 테이코플라닌의 흡착의 동력학을 나타낸다. 세가지 수지 모두 우수한 흡착을 나타내지만, 이들 일부는 다른 것들보다 더 빠르게 흡착한다. 앰벌라이트? XAD 1180을 사용하면, 초기에 존재하는 테이코플라닌의 90% 초과가 2시간 내에 용액으로부터 흡착되며, XAD16 사용시에는 단지 50%가 흡착된다. 보다 큰 세공을 갖는 수지 (예를 들어 앰벌라이트? XAD 1180)는 보다 작은 세공을 갖는 것 (예를 들어 앰벌라이트? XAD16)보다 더 빠르게 흡착하지만, 이는 보다 작은 입자 및 보다 큰 표면적에 의해 보상될 수 있다 (예를 들어 앰벌라이트? XAD 1600). 유리한 동력학은 보다 효율적인 칼럼 흡착을 제공하고, 이는 테이코플라닌의 효율적인 산업적 규모 제조에 있어 중요하다.
상기 용액으로부터, 흡착제는 전체 테이코플라닌의 80% 이상, 바람직하게는 전체 테이코플라닌의 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상을 제거한다. 흡착 방법은, 상기 테이코플라닌 용액 중에 현탁된 수지를 0 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 2시간 이상 동안, 바람직하게는 12시간 이상 동안, 가장 바람직하게는 24시간 이상 동안 진탕시킴으로써 수행된다. 마지막으로, 테이코플라닌 함유 수지를 여과하고, 임의로 재현탁 또는 헹굼에 의해 물로 세척한다. 다르게는 테이코플라닌 함유 여과 브로쓰를, 포화시까지 흡착제 상에 발효 생성물을 로딩하여 상기 흡착제의 칼럼을 통해 용리시킨다.
바람직한 실시양태에서, 흡착된 물질은, 바람직하게는 40% (v/v) 이상의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로부터 선택된 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 함유하는, 유기 용매 풍부 수용액으로의 용리에 의해 수지로부터 방출된다. 수지로부터의 테이코플라닌 용리 정도는 유기 용매 첨가에 의해 향상될 수 있다. 그러나, 용리는 완전하지 않고, 매우 선택성이 아니다. 테이코플라닌과 함께, 또한 대부분의 불순물이 용리된다. 테이코플라닌의 용리를 위한 유기 용매의 농도는 유기 용매 중에서의 테이코플라닌의 용해도에 의해 제한된다. 예를 들어, 메탄올/물 혼합물 적용시, 테이코플라닌 용리 정도는 수지 유형에 따라 60 내지 80% (v/v)의 메탄올 농도에서 최대에 도달하지만, 용리 정도는 흡착된 총 테이코플라닌의 60% 훨씬 미만이다. 염 첨가를 통해 이온 강도를 향상시킴으로써, 87.6%의 테이코플라닌이 용리될 수 있으나 (EP 1735337B1), 선택성은 불충분하게 남아있거나 심지어 감소되고; 특히 착색 불순물의 제거가 여전히 불량하다. 일반적으로, 용리 시스템에 염기를 첨가하는 것 (문헌 [J. Biochem. 275 (2000), p. 6201-6206])이 또 다른 해결책이지만, 이 접근은 테이코플라닌이 알칼리 매질 중에서 안정하지 않기 때문에 특정 경우의 테이코플라닌에서는 따를 수 없다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 용리 매질이 바람직하게는 무기 산에 의해, 가장 바람직하게는 염산에 의해 산성화된다. 놀랍게도, 테이코플라닌 용리 효율은 선행 기술에서 기재된 중성 용리 방법을 이용하는 경우에 비해 더 높다는 것이 발견되었다. 한층 더, 본 발명에 따른 접근은 상기 산화적 탈아미노화로부터 유래된 착색 불순물의 제거 관점에서 선택성을 향상시킨다. 실시예 3 내지 5 (상응하는 도에 의해 보충됨)는, pH 값이 6 내지 7인 중성 매질 중에서 유기 용매 농도의 함수로서의 세가지 전형적 수지 (앰벌라이트? XAD 16, XAD1600 및 XAD 1180)로부터의 테이코플라닌 및 그의 산화적 불순물의 용리 효율을 나타내며, 실시예 6 내지 8은 각각 pH 값 2, 3 및 4에서의 산성 매질 중에서의 유사한 시험을 나타낸다. 중성 매질 중에서 착색 불순물의 상대적 농도는, 테이코플라닌의 탈착이 그의 최대값을 갖는 유기 용매 농도에서 HPLC 분석의 면적%로 측정시 테이코플라닌 농도의 7 내지 12%에 도달한다는 것이 명백하다. 산성 매질 중에서 상기 불순물의 상대적 농도는 6% 이하이고, pH 2에서는 4% 이하이다. 2 내지 3배 더 낮은 수준의 불순물은 후속 테이코플라닌 단리 단계에서 정량적으로 제거하기가 상당히 더 용이하다. 또한, 테이코플라닌은 알칼리 매질에서보다 산성 조건에서 훨씬 더 안정하다.
실시예 6 내지 8 및 도 8 내지 10은, 배치식 방법에서의 착색 불순물을 고려하여 테이코플라닌 방출 정도 및 선택성에 대한 산성 매질의 유리한 효과를 나타낸다. 용리를 60% (v/v) 유기 용매 (메탄올)를 사용하여 수행하는 경우, pH 값 2에서의 용리된 테이코플라닌 중 불순물 함량은 3% 미만이지만, 동일한 용리 조건에서 pH 값을 3 또는 4로 증가시키는 경우, 불순물 함량은 8%까지 증가한다. 제약학적 등급의 테이코플라닌은 Ph. Eur. 7.2에 따라 최대 5%의 불순물을 갖도록 허용된다.
착색 불순물로부터의 테이코플라닌의 분리는, 방법이 먼저 테이코플라닌을 용리시킨 후 상기 불순물의 용리를 수행하는 크로마토그래피 방법과 유사하게 진행되는 경우, 테이코플라닌 로딩 수지로 패킹된 칼럼으로부터의 연속적 용리에 의해 개선될 수 있다. 여기서, 선택성은 부가적 분획 컷-오프 점에 따라 달라진다. 보다 우수한 선택성은 통상적으로 수율을 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 수율/선택성 비율은 보다 긴 칼럼을 사용함으로써 향상되고, 따라서 불순물의 상대적 함량이 HPLC에 의해 측정된 상대적 면적%로 4% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만으로 감소된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 테이코플라닌은, 4 미만의 pH 값에서, 바람직하게는 2 내지 2.5의 pH 값에서, 40% (v/v) 이상의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로부터 선택된 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 함유하는, 가장 바람직하게는 60 내지 70% (v/v)의 메탄올을 함유하는 수성 매질에 의해, 바람직하게는 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180으로부터 선택된, 20 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지로부터 용리된다. pH 값은, 바람직하게는 염산, 황산, 인산 또는 시트르산으로부터 선택된 무기 또는 유기 산의 수용액 또는 산성 완충제에 의해 조절된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서는, 테이코플라닌 분자를 함유하는 용액을 활성탄으로 처리하고, 여기서 용액은 40% (v/v) 이상의 수-혼화성 유기 용매를 함유한다. 출발 용액은 바람직하게는, 소수성 흡착 수지 상에서의 흡착/탈착에 의해, 보다 바람직하게는 산성 매질을 사용한 탈착에 의해 미리 정제된다. 가장 바람직한 경우, 용매/물 비율이 목탄 처리 전에 보정되지 않고, 즉 테이코플라닌의 용액은, 단지 pH 값을 6 내지 8의 중성 범위로 조정함으로써 이전 단계로부터 직접 전달된다.
흡착 수지 및 목탄으로의 조합 처리가 EP 1735337B1 (WO 2005/116059)에 기재되어 있다. 상기 문헌에서의 기재에 따르면, 바람직하게는 먼저 메탄올 용액을 물로 희석하여 계산에 의해 40% (v/v) 이하의 메탄올을 갖는 용액을 달성하고, 이어서 이를 목탄으로 처리한다. 이 단계는 또한, 비-극성 화합물이 보다 극성인 매질로부터 목탄에 더 잘 흡착된다는 것을 인지하는 당업자에게 명백하다. 본 발명자들은 놀랍게도, 이러한 물로의 희석이 필수적이지 않음을 발견하였다. 처리는, 친지질성 불순물의 제거 효율을 손실하지 않으면서 매질의 수화 없이 계속될 수 있고, 한층 더, 착색 불순물의 제거가 메탄올-풍부 수성 혼합물에서 더욱 효율적이다. 이러한 거동은 변칙적이지만, 수성 매질 중에서 친유성 코어를 갖는 거대분자 미셀로 어셈블리될 수 있는, 테이코플라닌 분자의 양친매성 특성에 의해 가설로 설명된다. 상기 코어는 일부 친지질성 불순물을 트랩핑하여 이들이 목탄 표면과 접촉되는 것을 막을 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 활성탄 상에서의 테이코플라닌 용액의 개선된 정제 및 탈색 방법은, 40% (v/v) 이상의, 특히 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴의 군으로부터 선택된 유기 용매, 바람직하게는 메탄올, 보다 바람직하게는 60 내지 80% (v/v) 메탄올을 함유하는, 유기 용매 풍부 테이코플라닌 용액의 처리를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 테이코플라닌/목탄 중량비는 1 : 0.05 내지 1 : 2, 바람직하게는 1 : 0.2 내지 1 : 1, 보다 바람직하게는 1 : 0.5 내지 1 : 0.8이다. 여기서는, 바람직하게는 인큐베이션을 0 내지 60℃, 바람직하게는 실온에서 5분 내지 12시간, 바람직하게는 0.5 내지 2시간 동안 수행한다. 이어서, 활성탄을 여과하고, 감소된 황색을 갖는 테이코플라닌의 용액을 추가 처리하여 고체 생성물을 단리한다. 개선된 목탄 처리는 주로 친유성 저분자량 착색 화합물 및 보다 낮은 극성의 다른 불순물의 수준을 감소시킨다.
바람직한 실시양태에서는, 이전에 저분자량 유기 불순물로부터 실질적으로 정제된 테이코플라닌 용액을 1 kDa 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 추가로 처리한다.
한외여과는 발효 생성물의 단리에 빈번히 이용되는 방법이다. 방법은 주로 거대분자 불순물의 제거에 이용된다. 이는, 이러한 거대분자가 발열 활성을 가질 수 있기 때문에 비경구 용도를 위한 제약 성분에 있어 특히 중요하다. 한외여과 방법에서는, 고분자량 분자를 다시 유지하면서, 보다 작은 분자의 통과를 가능하게 하는 다공성 멤브레인이 사용된다. 멤브레인 내의 세공 크기는, 어떤 분자가 멤브레인을 통과하는지 (투과 용액), 또한 어떤 분자가 컷오프되는지 (잔류 용액)에 대하여 결정적이다. 1 kDa 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인은, 목적에 따라, 통상적으로 한외여과에 사용된다. 주로 용매에 의해, 또한 염에 의해 투과되는, 작은 세공을 갖는 멤브레인은 잔류물의 농축 및 탈염에 사용되며, 보다 큰 세공을 갖는 멤브레인은 보다 큰 분자의 제거에 사용된다 (이 방법은 또한 정용여과라 불림). 세공 크기에 가까운 분자량을 갖는 분자는 투과물과 잔류물 사이에 분포된다. 높은 잔류물/투과물 농도 비율의 경우, 투과물 중 생성물의 허용가능한 수율에 도달하기 위해, 신선한 용매를 사용한 수 사이클의 정용여과가 수행될 수 있다.
1900 Da에 가까운 분자량을 갖는 테이코플라닌 분자는 5 kDA 초과의 세공을 갖는 멤브레인을 용이하게 투과할 것으로 예상되고, 따라서 5 kDa 또는 100 kDa 컷-오프 멤브레인이 테이코플라닌으로부터의 보다 큰 분자의 우수한 분리를 위해 유용할 것이다. 대부분의 거대분자는 상기에 기재된 바와 같은 비-극성 수지 상에서의 흡착 방법에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 이 방법은 보다 큰 분자의 완전한 제거를 제공하지는 않고, 따라서 상당량의 잠재적 발열원, 거대분자 색 및 다른 보다 큰 분자를 용액 중에 남긴다. EP 1735337B1에는, 최대 20% (v/v)의 메탄올 또는 이소프로판올을 갖는 테이코플라닌 용액을 사용한 30 kDa 또는 50 kDa의 멤브레인을 통한 한외여과가 기재되어 있다. 이러한 절차는, 발열원 제거를 위해서는 3 kDa 내지 10 kDa 중량 컷-오프 멤브레인이 필요하기 때문에, 발열원 제거의 관점에서 불충분할 수 있다. 또한, 30 kDa 내지 50 kDa 컷-오프 멤브레인 사용시, 잔류물/투과물 농도 비율이 매우 높다는 것이 발견되었다 (예를 들어 20% (v/v)까지 희석된 알콜 용액 사용시 50 내지 100 kDa 멤브레인에서도 80% 초과임). 수일이 걸리고, 막대한 양의 신선한 용매가 사용되는 수 사이클의 정용여과가 적용되어야 한다. 무발열원성 생성물을 얻기 위해 보다 작은 세공을 사용하는 경우, 한외여과는 선행 기술 방법 적용시 거의 비생산적으로 된다. 이러한 관찰은 놀라운 것이며, 테이코플라닌의 계산된 분자량 (이는 멤브레인의 평균 컷-오프보다 수배 더 작음)에 의해 설명될 수 없다.
본 발명에 따르면, 테이코플라닌의 용액을 3 내지 100 kDa, 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷-오프 멤브레인을 통한 한외여과에 의해 처리하고, 여기서 용액은 20% (v/v) 초과, 바람직하게는 60% (v/v) 초과의 수-혼화성 유기 용매, 및 90% (v/v) 이하의 수-혼화성 유기 용매 (이는 특히 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴의 군으로부터 선택됨), 바람직하게는 메탄올, 보다 바람직하게는 40 내지 80% (v/v)의 메탄올, 가장 바람직하게는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 함유한다. 바람직한 실시양태에서는, 5 내지 10 KDa 분자량 컷-오프 멤브레인 유형 및 테이코플라닌 용액 중 60 내지 80% (v/v)의 바람직한 메탄올 농도가 이용된다. 테이코플라닌 농도의 잔류물/투과물 비율은 0.65 이하이고, 바람직하게는 0.4 이하이고, 여기서 투과물은 가시적으로 황색을 갖지 않는다. 바람직하게는, 방법은, 투과물 중 테이코플라닌의 95% 초과 수율을 얻기 위해 (여긱서 황색은 실질적으로 제거됨), 각각, 5 kDa 멤브레인 상에서 6 사이클 이하의 정용여과를 필요로 하고, 10 kDa 멤브레인 상에서는 4 사이클 이하를 필요로 한다. 이 방법은 주로 거대분자 착색 불순물, 및 잠재적 발열원을 포함한 다른 거대분자 불순물을 제거한다. 바람직한 실시양태에서는, 방법을 다른 방법과 조합하여 다른 화학적 부류의 색을 제거한다.
한외여과 단계에서 테이코플라닌 용액 중 향상된 유기 용매 농도의 놀라운 이점은, 추가로, 테이코플라닌 분자가 물-풍부 용액에서 단분자로 용해되지 않고, 다분자 클러스터로 어셈블리되는 것으로 보이며, 이들은 하나의 분자에 대해 이론적으로 충분히 큰, 그러나 클러스터에 대해서는 충분히 크지 않은 한외여과 멤브레인의 세공을 투과할 수 없다는 것이다.
임의로, 얻어진 테이코플라닌의 용액을 1000 Da 컷-오프 멤브레인을 통한 한외여과에 의해 추가로 처리하여 용액을 탈염시키고 농축시킨다. 용액을, 바람직하게는 에스테르, 니트릴 또는 케톤의 군으로부터 선택된 역용매, 바람직하게는 아세톤으로 추가로 처리하여, 95 면적% 이상, 바람직하게는 98 면적% 이상의 테이코플라닌의 백색 침전물을 얻을 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른, 테이코플라닌 생성 배양물의 발효 브로쓰로부터의 상이한 분자 유형의 착색 물질 및 다른 발효 및 분해 생성물의 제거를 포함하는, 증가된 순도를 갖는 테이코플라닌의 전체적 제조 방법은,
i) 발효 브로쓰의 용액을 제조하는 단계;
ii) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키는 단계;
iii) 물 및 수-혼화성 용매를 함유하는 산성 매질에 의해 상기 수지로부터 테이코플라닌을 탈착시키는 단계;
iv) 40% (v/v) 이상의 유기 용매를 함유하는 얻어진 용액을 목탄으로 처리한 후 목탄을 제거하는 단계;
v) 20% (v/v) 초과의 유기 용매를 함유하는 용액을 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 방법에 적용하는 단계;
vi) 임의로는, 1000 Da 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 용액을 농축시키고 탈염시키는 단계;
vii) 고체 테이코플라닌을 단리시키는 단계
를 포함한다.
이러한 실시양태에 따르면, 단계 i)은 테이코플라닌을 생성하는 진균 미생물, 바람직하게는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 배양물을 사멸시키고, 유기 용매를 첨가하여 셀 구조를 분해시키고, 여과 또는 원심분리에 의해 균사체 및 다른 불용성 발효 생성물을 제거하여, 투명하지만 진하게 착색된 갈색 또는 거의 흑색 용액을 얻는 것을 포함한다.
단계 ii)의 소수성 흡착 수지는, 상표명 하이퍼졸-마크로넷?, 앰벌라이트? XAD, 디아이온? HP 및 세파비즈 SP, 또는 도웩스? 옵티포어의 군으로부터 선택된 20 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지로부터 선택되고, 바람직하게는 상표명 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180, 디아이온? HP20, 디아이온? 세파비즈 SP207, 디아니온? HP2MG로부터 선택된, 가장 바람직하게는 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180으로부터 선택된 100 내지 500 Å의 세공 반경을 갖는 수지로부터 선택된다. 흡착은, 0 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 1 내지 48시간 동안, 바람직하게는 2시간 이상 동안, 보다 바람직하게는 12시간 이상 동안, 가장 바람직하게는 24시간 이상 동안 추가로 교반 또는 진탕시키면서 수지를 용액에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 테이코플라닌 함유 수지를 여과하고, 임의로 재현탁 또는 헹굼에 의해 물로 세척한다. 다르게는, 발효 생성물을 상기 수지로 충전된 칼럼 상에서의 용액 로딩에 의해 흡착시킨 후, 임의로 세척한다.
단계 iii)의 탈착은, 흡착된 물질을, 4 미만의 pH 값에서, 바람직하게는 2 내지 2.5의 pH 값에서, 40% (v/v) 이상의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로부터 선택된 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 함유하는, 가장 바람직하게는 60 내지 70% (v/v)의 메탄올을 함유하는 수성 매질로 용리함으로써 수행될 수 있다. pH 값은, 바람직하게는 염산, 황산, 인산 또는 시트르산으로부터 선택된 무기 또는 유기 산의 수용액의 첨가에 의해 또는 산성 완충제의 첨가에 의해 조절된다.
이 실시양태의 단계 iv)에서는, 용액을 먼저 임의로 농축시키고, 무기 수산화물, 탄산염, 인산염으로부터 선택된 염기를 첨가함으로써 또는 완충제를 첨가함으로써 6 내지 8의 pH로 조정하고, 이어서 활성탄으로 처리한다. 이 단계의 처리에 사용되는 용액의 매질은 단계 iii)으로부터 유래될 수 있고, 이는 40% (v/v) 이상의, C1-C4-알칸올, 아세톤 또는 아세토니트릴의 군으로부터 선택된, 바람직하게는 메탄올로부터 선택된 유기 용매, 바람직하게는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 함유하거나, 또는 상기 용매 함량을 달성하도록 신선한 용매를 첨가함으로써 보정된다. 용액 중 활성탄의 양은 테이코플라닌의 분석에 대해 상대적으로 측정된다. 테이코플라닌/목탄 중량비는 1 : 0.05 내지 1 : 2, 바람직하게는 1 : 0.2 내지 1 : 1, 가장 바람직하게는 1 : 0.5 내지 1 : 0.8이다. 용액을 0 내지 60℃에서, 바람직하게는 실온에서 5분 내지 12시간 동안, 바람직하게는 0.5 내지 2시간 동안 목탄으로 처리한다. 이어서, 활성탄을 여과하여 감소된 황색을 갖는 테이코플라닌 용액을 얻는다.
단계 v)의 한외여과는 바람직하게는 이전 단계의 용액을 사용하여 수행된다. 임의로, 20 내지 90% (v/v)의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴의 군으로부터 선택된 수-혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 함유하도록, 보다 바람직하게는 40 내지 80% (v/v)의 메탄올, 가장 바람직하게는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 함유하도록 신선한 용매를 첨가함으로써 혼합물을 보정할 수 있다. 이 단계의 멤브레인은 3 내지 100 kDa, 바람직하게는 5 내지 100 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷-오프 멤브레인으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 멤브레인은 5 내지 10 KDa의 컷-오프를 갖고, 메탄올의 농도는 60 내지 80% (v/v)이다. 테이코플라닌 용액에서, 테이코플라닌 농도의 잔류물/투과물 비율은 0.65 이하이고, 바람직하게는 0.4 이하이다.
임의의 단계 vi)의 한외여과는, 바람직하게는 1000 Da 컷-오프 멤브레인을 사용하여 이전 단계의 용액 상에서 수행된다. 테이코플라닌은 잔류물 중에 남아있고, 일부 작은 분자, 예컨대 용매 및 무기 염은 투과된다. 용액은 다음 단계에서의 높은 수율을 제공하기 위해 적합한 용매 비율 및 테이코플라닌 농도에 도달하도록 농축되어야 한다.
단계 vii)에서 테이코플라닌의 단리는, 증발, 진공 증발, 동결건조, 분무 건조 또는 역용매 첨가에 의한 침전을 이용한 용매 제거에 의해 적합하게 수행될 수 있다. 염기성 용액으로서 이전 단계의 용액을, 또한 역용매로서 유기 용매, 바람직하게는 아세톤을 사용하는, 역용매에 의한 침전이 바람직하다. 침전된 생성물을 여과 또는 원심분리에 의해 단리시키고, 진공에서 건조시킨다.
본 발명에 따른 실시양태의 전체 방법을 도 3에 개략적으로 나타내었다.
고순도의 테이코플라닌 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물의 제조가 본 발명의 추가의 측면이다. 본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여에 적합하고, 임의의 주어진 경우에 본 발명에 따른 테이코플라닌의 치료학적 용량은 치료할 질병의 성질 및 중증도에 따라 달라진다. 용량 및 투여 빈도수는 또한, 개개의 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 적합한 용량은 1일 당 50 mg 내지 800 mg, 바람직하게는 100 mg 내지 400 mg의 범위 내이고, 바람직하게는 100 내지 800 mg의 총 1일 투여량이다. 투여 형태는 분산액, 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말, 이식물을 포함하고, 여기서 테이코플라닌의 가장 바람직한 투여 형태는 건조 분말 주사 및 주입액이다. 가장 바람직한 실시양태에서는, 본원에 기재된 신규한 테이코플라닌을, 안정화제, 완충제 및 첨가제와 함께 멸균 및 무발열원성 물 중에 용해시키고, 혼합물을 동결건조시켜 무정형 분말을 얻고, 이를 사용 직전에 준비된 액체 중에서 재구성한다. 재구성된 주사액을 정맥내 또는 근육내 투여할 수 있다. 정맥내 주사는, 예를 들어 볼루스로서 또는 30분 주입으로서 투여할 수 있다. 투여는 통상적으로 1일 1회이지만, 중증 감염의 경우, 필요한 혈청 농도에 보다 빨리 도달하기 위해 제1일에 제2 주사액을 투여하여야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하는 것이다. 이들은 단지 예시적 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
대표적 실험 실시예의 다양한 중간체 용액 또는 단리된 고체 중간체 및 최종 생성물 중 테이코플라닌 성분의 양을 애질런트(Agilent) 1100™ 기기 상에서의 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 이동 상 A는 pH 4.9의 5 mM 인산염 완충제를 함유하고, 이동 상 B는 아세토니트릴을 함유하였다. 크로마토그래피 피크를 280 nm에서 검출하였고, 칼럼 온도는 45℃였고, 5 ㎕의 샘플을 주입하였다. 프리칼럼 C18, 2 cm x 4.0 mm, 3 ㎛이 장착된 칼럼 아센티스 익스프레스(Ascentis Express) C18™, 10 cm x 4.6 mm, 2.7 ㎛ 상에서 분리를 수행하였다. 유량은 2.2 ml/min이었고, 크로마토그래피 동안 구배는 하기와 같았다.
표 1
Figure pct00001
값을 모든 테이코플라닌 성분의 합계 또는 특정 성분 자체의 면적 백분율로서 나타내었고, 이들은 주로 상대적 또는 비교적 의미를 갖는다.
퍼킨 엘머 람다(Perkin Elmer Lamda) 25 UV-VIS 분광계 상에서 405 nm에서, 또한 물 중의 40 g/l의 샘플 중 테이코플라닌 농도에서 투과도를 측정하였다.
실시예 1
조 발효 브로쓰의 단리
악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 종료 직후 수집된 신선한 전체 브로쓰를 실험에 사용하였다. 실험실 원심분리기 (메가퓨즈(Megafuge) 1.0R™, 헤라에우스(Heraeus))에서 10 내지 30분 동안 4000 내지 6000 rpm으로 브로쓰를 원심분리함으로써 브로쓰 상청액 (정화된 브로쓰)을 생성시켰다. 상청액을 추가로 소결 유리 필터 깔때기 (다공도 4 및 5, 스코트 두란 게엠베하(Schott Duran GmbH))로 여과하고, 이후에 HPLC로 분석하였다.
교차-유동 여과에 의해 투명한 여과물 (투과물)을 생성시켰다. 0.1 ㎛ 세공 크기를 갖는 세라믹 여과 모듈 (멤브랄록스(Membralox) 1P19-60™)을 사용하였다. 투과물을 수집하고, HPLC로 분석하였다.
실시예 2
앰벌라이트 XAD16™, 앰벌라이트 XAD1600™ 및 앰벌라이트 XAD1180™에 대한 테이코플라닌 흡착 동력학
등량 (4 g)의 흡착제 앰벌라이트 XAD16™, 앰벌라이트 XAD1600™ 및 앰벌라이트 XAD1180™ (롬 앤 하스(Rohm & Haas)의 상표명)을 25 mL 플라스크 내로 칭량 투입하였다 (각각의 수지에 대해 각각 15개의 대응물). 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 20 mL의 테이코플라닌 브로쓰 상청액을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 실험실 진탕기 상에서 실온에서 격렬히 진탕시켰다 . 플라스크를 소정의 시간 간격으로 (최초 8시간 내에는 매시간, 그 후 다음 4시간 내에는 2시간마다, 또한 24시간 까지는 4시간마다) 진탕기로부터 제거하였다. 슬러리를 여과하고, 여과물의 샘플을 HPLC로 분석하였다. 흡착된 테이코플라닌의 부분을 초기 농도에 대한 주어진 시점에서의 농도의 비율로서 도표로 나타내었다 (도 4).
실시예 3
중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD16™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 관련 불순물의 탈착
26.01 g의 앰벌라이트 XAD16™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 420 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 600 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를 10개의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 1 g씩)한 후, 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 특정 플라스크 내에 첨가함). 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 샘플 용액을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을, 2 세트의 실험의 결과로서 도표로 나타내었다 (도 5).
실시예 4
중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1600™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착
26.02 g의 앰벌라이트 XAD1600™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 420 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 600 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를 10개의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 1 g씩)한 후, 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 특정 플라스크 내에 첨가함). 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 샘플 용액을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을, 2 세트의 실험의 결과로서 도표로 나타내었다 (도 6).
실시예 5
중성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1180™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착
25 g의 앰벌라이트 XAD1180™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 400 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 150 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를 11개의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 1 g씩)한 후, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 특정 플라스크 내에 첨가함). 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 용액 샘플을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었다 (도 7).
실시예 6
산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD16™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착
26 g의 앰벌라이트 XAD16™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 440 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 600 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를, 각각의 세트가 7개의 플라스크를 갖는 3 세트의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 수지 1 g씩)한 후, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 각각의 세트의 특정 플라스크 내에 첨가함). 특정 플라스크 세트의 pH 값을 각각 pH 2, 3 및 4로 조정하였다. 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 샘플 용액을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었다 (도 8).
실시예 7
산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1600™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착
26.4 g의 앰벌라이트 XAD1600™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 440 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 500 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를, 각각의 세트가 7개의 플라스크를 갖는 3 세트의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 수지 1 g씩)한 후, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 각각의 세트의 특정 플라스크 내에 첨가함). 특정 플라스크 세트의 pH 값을 각각 pH 2, 3 및 4로 조정하였다. 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 샘플 용액을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었다 (도 9).
실시예 8
산성 물-메탄올 혼합물을 사용한 앰벌라이트 XAD1180™ 흡착 수지로부터의 테이코플라닌 및 그의 불순물의 탈착
26.4 g의 앰벌라이트 XAD1180™ 수지 (롬 앤 하스의 상표명)를 1000 mL 플라스크 내로 칭량 투입하고, 440 mL의 테이코플라닌 브로쓰 여과물을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 수지를 여과하고, 500 mL의 탈염수로 헹구었다. 얻어진 테이코플라닌 함유 수지를, 각각의 세트가 7개의 플라스크를 갖는 3 세트의 25 mL 플라스크로 분할 (각각에 수지 1 g씩)한 후, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% v/v 비율을 갖는 메탄올/물 혼합물을 첨가하였다 (각각을 각각의 세트의 특정 플라스크 내에 첨가함). 특정 플라스크 세트의 pH 값을 각각 pH 2, 3 및 4로 조정하였다. 모든 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 24시간 후, 샘플 용액을 취하여 테이코플라닌 및 상응하는 착색된 산화 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다. 상이한 용리액의 pH에서의 (pH = 2 - 실선, pH = 3 - 파선, pH = 4 - 점선) 메탄올 농도에 대한, 탈착된 테이코플라닌의 농도 (원) 및 착색된 관련 불순물의 부분 (테이코플라닌과 비교하여 면적%로서 나타냄) (정사각형)의 의존성을 도표로 나타내었다 (도 10).
실시예 9
물-메탄올 혼합물 중 활성탄을 사용한 테이코플라닌 용액 탈색
활성탄 노리트(Norit) CA1을 10개의 50 mL 플라스크 내로 칭량 투입하였다 (테이코플라닌 1 g 당 대략 0.57 g 활성탄). 20 mL의 테이코플라닌 용액 (0, 20, 40, 60 및 80% vol. 메탄올-물 혼합물 중 1 리터 당 4.5 g 테이코플라닌)을 각각의 플라스크 내에 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 1시간 후, 슬러리를 여과하고, 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였다. 샘플의 UV 스펙트럼을 분광광도계로 기록하였다. 메탄올 농도에 따른 수율 (원) 및 상대적 흡수 감소 (정사각형)를 도표로 나타내었다 (도 11).
실시예 10
다양한 로드로 활성탄을 사용한 테이코플라닌 용액 탈색
다양한 로드의 활성탄 노리트 CA1™을 6개의 25 mL 플라스크 내로 칭량 투입하였다. 15 mL의 테이코플라닌 용액 (80% vol. 메탄올-물 혼합물 중 1 리터 당 5 g 테이코플라닌)을 각각의 플라스크 내에 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 실험실 진탕기 상에서 격렬히 진탕시켰다. 1시간 후, 슬러리를 여과하고, 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였다. 샘플의 UV 스펙트럼을 분광광도계로 기록하였다. 다양한 목탄 로드 (테이코플라닌에 대한 w/w로서 나타냄)에 따른 수율 (원) 및 상대적 흡수 감소 (정사각형)를 도표로 나타내었다 (도 12).
실시예 11
흡착 수지 상에서의 칼럼 흡착에 의한 조 테이코플라닌의 제조
4.9 cm 직경의 실험실 규모 칼럼을 앰벌라이트 XAD-1180™으로 충전시켰다. 흡착제 층 높이는 84 cm였다. XAD-1180의 동적 로딩 용량은 0.5 내지 1 BV/h에서 흡착제 1 리터 당 65 내지 70 g 이상의 테이코플라닌으로 추정되었다. 0.76 BV/h. 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 1.9 g/L의 테이코플라닌을 함유하는 57.5 L의 테이코플라닌 브로쓰 투과물을 0.76 BV/h에서 칼럼을 통해 펌핑하였다 . 흡착이 완료된 후, 흡착제를 27 BV의 탈염수 (1.14 BV/h), 25 BV의 15 vol.% 메탄올 (1.14 BV/h), 6.4 BV의 탈염수 (1.9 BV/h), 0.56 BV의 탈염수 pH=2 (1.9 BV/h)로 헹구고, 50 vol.% 메탄올/pH=2 (0.38 BV/h)로 용리시켰다. 2개의 분획, 즉 14.8 g/L 테이코플라닌 및 100 면적%의 크로마토그래피 순도를 갖는 1700 mL 및 11 g/L 테이코플라닌 및 98.29 면적%의 크로마토그래피 순도를 갖는 5560 mL를 수집하였다 (표 2).
50 g의 활성탄 노리트 CA1™를 7260 mL의 합쳐진 분획에 첨가하였다. 현탁액을 2시간 동안 격렬히 교반하고, 이어서 활성탄을 여과하였다. 남아있는 여과물을 수산화나트륨 용액으로 pH 2.8로부터 pH 6.6으로 중화시키고, 진공 증발 (T<40℃)에 의해 1000 mL로 농축시켰다. 테이코플라닌을 침전시키기 위해, 아세톤:농축물의 비율이 대략 11:1이 될 때까지 아세톤을 교반하며 농축물에 연속적으로 첨가하였다. 생성된 현탁액을 세라믹 필터 (다공도 B4) 상에서 여과하여 침전물을 회수하고, 이를 100 mL의 아세톤으로 2회 세척하고, 이어서 40℃에서 20시간 동안 진공 건조기에서 건조시켜, 98.07 면적%의 크로마토그래피 순도를 갖는 60.3 g의 갈색 테이코플라닌 분말을 수득하였다.
표 2
Figure pct00002
표는, 당업자가 한편으로 공정의 경제성 및 기술적 단순성과, 또한 다른 한편으로 환자에 대한 안전성을 포함한 규제 요건 사이의 조화를 고려하여 분획을 수집할 수 있음을 보여준다. 당업자는 검출가능한 관련 불순물을 갖지 않는 100%에 가까운 극도의 순도를 갖는 제한된 수확물을 수집할 수 있다. 당업자는, 보다 긴 칼럼을 사용함으로써 불충분한 분획의 부분을 추가로 감소시킬 수 있거나, 또는 불충분한 분획을 다음 배치에서 추가의 칼럼 처리 사이클에 사용할 수 있다.
실시예 12
상이한 메탄올/물 혼합물 중의 한외여과 멤브레인을 통한 테이코플라닌 투과율
물/메탄올 혼합물 중의 실시예 11에 따라 제조된 조 테이코플라닌 결정의 용액 (5 g/L)으로부터의 착색 불순물의 제거를, 상표명 알파 라발(Alfa Laval)의 시판용 멤브레인으로부터 선택된 5, 10, 20, 50 및 100 kDa의 컷-오프를 갖는 다양한 멤브레인 상에서 교반 한외여과 셀 아미콘(Amicon) 8050 (밀리포어(Millipore)의 상표명) 중에서 시험하였다. 상이한 실험에서, 0, 20, 40, 60, 80 v/v % 비율의 메탄올/물 혼합물을 투과율에 대해 시험하였다. 50 mL의 용액을 교반 셀에 첨가하고, 질소를 사용한 셀의 가압에 의해 여과를 개시하고, 자기 교반기를 고속으로 셋팅하여 농도 양극화의 효과를 감소시켰다. 투과물을 눈금 실린더 내에 수집하였다. 대략 5의 부피 농도 인자 (VCF)에 도달하였을 때 여과를 중단하였다. 투과물 및 농축물의 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였다. 실험 결과를 표 3에 요약하였다.
표 3
Figure pct00003
실시예 13
한외여과에 의한 테이코플라닌의 정제
실시예 11의 제1 단락에 기재된 바와 같은 앰벌라이트 XAD1180™으로부터의 테이코플라닌의 탈착 후 크로마토그래피 분획의 수집에 의해 제조된, 50 mL의 테이코플라닌 용액 (물-메탄올 혼합물, 2.8 g 테이코플라닌/L, pH 7.3)을 5 kDa 분자량 컷-오프 한외여과 멤브레인 (알파 라발?의 상표명)을 갖는 교반 UF 셀 아미콘 8050™ (밀리포어, 미국 매사추세츠주) 내에 첨가하고, 질소를 사용한 셀의 가압에 의해 여과를 개시하였다. 자기 교반기를 고속 (200 rpm)으로 셋팅하여 농도 양극화의 효과를 감소시켰다. 투과물을 눈금 실린더 내에 수집하였다. 5배 배치 농축 후 5회 정용여과 (각각 40 mL의 80 vol.% MeOH 사용)를 수행하였다 . 투과물 및 농축물의 샘플을 취하여 HPLC로 분석하였다. 배치 농축 및 정용여과 조합의 전체 수율은 >95%였다 (도 13).
실시예 14
테이코플라닌 분말의 제조
2.1 g의 테이코플라닌을 함유하는, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 배양물로부터의 50 L의 테이코플라닌 브로쓰 투과물을, 90 cm 층 높이의 앰벌라이트 XAD-1180™으로 로딩된, 4.9 cm 직경의 칼럼을 통해 펌핑하였다. 흡착 후, 수지를 30BV 탈염수, 25 BV 15 vol.% 메탄올, 10 BV 탈염수 및 1 BV의 희석 HCl (pH 2)로 헹구었다. 10% (w/w) HCl을 사용하여 pH를 2로 조정하고, 50 vol.% 메탄올을 사용하여 흡착제로부터 테이코플라닌을 용리시켰다. 4개 분획을 수집하고 (총 7.6 BV), 테이코플라닌의 순도를 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 제1 분획 (0.5 BV)을 폐기하고, 전체 착색된 산화 불순물 함량이 2.36 면적%인 제2 테이코플라닌-풍부 분획 (4.1 BV, 11.8 g/L 테이코플라닌)을 추가로 정제하고, 전체 착색된 산화 불순물 함량이 6.72 면적%인 제3 분획 (1.5 BV, 5.2 g/L 테이코플라닌)을 임의의 재-정제를 위해 유지하였다. 전체 착색된 산화 불순물 함량이 >8.5 면적%인 제4 분획 (1.5 BV)을 폐기하였다.
주 분획을 기계적 교반기가 장착된 비커로 옮기고, 테이코플라닌 1 g 당 0.6 g의 활성탄 노리트 CA1™을 첨가하였다 . 혼합물을 2시간 동안 격렬히 교반하고, 목탄을 여과하였다. 생성된 여과물 (6.2 L)을 수성 1% (w/w) 수산화나트륨으로 pH 6.5로 중화시켰다. 중화된 여과물을, 155 cm2 여과 면적을 갖는 5 kDa 분자량 컷-오프 편평 시트 한외여과 멤브레인 UF X5 pHt (알파 라발)를 사용하여 교차유동 한외여과 (SEPA CF II, 지이 오스모닉스(GE Osmonics), MN™)에 의해 추가로 정제하였다. 공급물 용액을 먼저 배치식으로 6배 농축시킨 후, 각각 1.5 L의 80% (v/v) MeOH로 6회 정용여과를 수행하였다. 막횡단 압력 강하를 2.5 내지 5 bar로, 또한 농축물의 온도를 23 내지 25℃로 유지하였다. 투과물 (14.2 L, 4.3 g/L 테이코플라닌)을 회전증발기에서 진공 하에 증발에 의해 농축시켜 대략 80 g/L 테이코플라닌을 갖는 농축물을 수득하였다. 농축물 (0.76 L)을 추가로 10 L 용기로 옮기고, 생성된 혼합물을 격렬히 교반하면서 7 L의 아세톤을 적가하였다. 얻어진 현탁액을 추가의 2시간 동안 교반하고, 이어서 침전물을 여과하고, 40℃에서 진공 건조기에서 건조시켜, 98.13 면적%의 순도를 갖는 55.8 g의 약간 황색 분말을 수득하였다.

Claims (15)

  1. a) 테이코플라닌을 소수성 흡착 수지에 흡착시키는 단계;
    b) 물 및 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 매질을 사용하여 상기 수지로부터 테이코플라닌을 탈착시키는 단계;
    c) 테이코플라닌을 포함하는 용액을 목탄으로 처리한 후 목탄을 제거하는 단계;
    d) 테이코플라닌을 포함하며, 20% (v/v) 초과의 수-혼화성 유기 용매 및 90% (v/v) 이하의 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 용액을 3 내지 100 kDa 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과 방법에 적용하는 단계;
    e) 임의로는, 단계 d)에 정의된 한외여과 후에, 1000 Da 컷-오프 멤브레인 상에서의 한외여과에 의해 테이코플라닌-함유 용액을 농축시키고/거나 탈염시키는 단계; 및
    f) 정제된 테이코플라닌을 얻는 단계
    를 포함하는, 정제된 테이코플라닌의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 a) 내지 f)를 제1항에 기재된 바와 같은 순서로 수행하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 앞서, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)의 배양물에 유기 용매를 첨가하고, 여과 및/또는 원심분리에 의해 균사체 및 다른 불용성 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 소수성 흡착 수지가 20 내지 500 Å의 세공 크기를 갖는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트 가교 비-이온성 거대망상형 수지인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 흡착 수지가 하이퍼졸-마크로넷?, 도웩스? 옵티포어, 앰벌라이트? XAD16, 앰벌라이트? XAD 1600, 앰벌라이트? XAD 1180, 디아이온? HP20, 디아이온? 세파비즈 SP207 및 디아니온? HP2MG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 흡착 수지로부터의 테이코플라닌의 탈착 단계를 40% (v/v) 이상의 수-혼화성 유기 용매를 포함하는 수성 매질을 사용하여 수행하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수-혼화성 유기 용매가 C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 흡착 수지로부터의 테이코플라닌의 탈착 단계를 4 미만의 pH 값을 갖는 수성 매질을 사용하여 수행하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 수성 매질의 pH 값을 무기 산, 유기 산 또는 산성 완충제의 수용액의 첨가에 의해 조정하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 목탄 처리가 행해지는 용액의 매질이 단계 b)로부터 유래되고, 40% (v/v) 이상의, C1-C4 알콜, C3-C4 케톤 또는 C2-C4 니트릴의 군으로부터 선택된 유기 용매를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 얻어진 용액이 60 내지 80% (v/v)의 메탄올을 포함하거나, 또는 60 내지 80% (v/v)의 메탄올 농도를 갖도록 신선한 용매의 첨가에 의해 보정되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 한외여과를, 20% (v/v) 초과 및 90% (v/v) 이하의 C1-C4 알콜을 포함하는, 단계 c)에서 얻어진 용액 상에서, 또는 20% (v/v) 초과 및 90% (v/v) 이하의 C1-C4 알콜을 포함하도록 신선한 용매의 첨가에 의해 보정된, 단계 c)에서 얻어진 용액 상에서 수행하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 한외여과를 3 내지 100 kDa, 바람직하게는 5 내지 100 kDa, 보다 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷-오프 멤브레인을 사용하여 수행하고/거나, 단계 e)의 한외여과를 1000 Da 컷-오프 멤브레인을 사용하여 수행하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 f)에서 정제된 테이코플라닌을 얻는 것을, 증발, 진공 증발, 동결건조, 분무 건조 또는 역용매 첨가에 의한 침전을 이용한 용매 제거를 포함하는 테이코플라닌 단리에 의해 수행하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법을 포함하며, 정제된 테이코플라닌을 하나 이상의 제약 부형제 또는 담체와 혼합하는 것인, 제약 조성물의 제조 방법.
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