JP2014208669A - タンパク質の凝集抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質の構造や活性に与える影響が限りなく低くタンパク質の凝集を抑制し、粘度の低いタンパク質溶液を調製できる、特定のペプチド界面活性剤からなる、安全なタンパク質の凝集抑制剤の提供。【解決手段】ＡＡＡＡＡＡＫの配列で表されるペプチドを含む、タンパク質溶液の粘度を下げる凝集抑制剤。該ペプチドを０．０５〜１％濃度の水溶液で用いるタンパク質の凝集抑制剤。さらに、前記タンパク質の凝集抑制剤を含む、医薬品。【選択図】図１

Description

本発明は、ペプチド界面活性剤を含むタンパク質の凝集抑制剤に関する。

タンパク質は、水溶液中で不安定であり、天然の立体構造の変化やタンパク質の会合などが原因で、凝集する。現在の技術では、タンパク質水溶液に尿素などの変性剤や特定のアミノ酸を加えることで凝集を抑制している。さらに、タンパク質の溶解性を向上する手段として、Ｔｗｅｅｎ８０やＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などのタンパク質と弱い相互作用をもつ界面活性剤が利用されている。しかし、既存の技術では、タンパク質の構造を変性したり、活性を阻害したりすることが問題となっている。

多くの疾患の治療薬となり得るタンパク質は多く存在するが、タンパク質医薬品を開発する際に、薬理効果を保ちながら製剤化することは非常に困難である。特に、近年注目を集めている抗体医薬では、抗体の凝集に起因する製剤の高い粘性が問題となり、製品の開発の妨げとなっている。これらの問題を解決するために、安全で、タンパク質の構造や活性に与える影響が限りなく低く、結果的にタンパク質溶液の粘性を低減する、タンパク質凝集抑制剤の開発が待たれている。

本発明のペプチド界面活性剤は、Ｇタンパク質結合レセプターウシロドプシンなどの膜タンパク質を安定させる作用やセルファセンブリングする性質を有することが知られている（非特許文献１及び２）。しかし、タンパク質の凝集抑制剤としての用途はこれまで知られていなかった。

Ｘ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．４７，１７７０７−１７７１２ Ａ Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．７，１−７

本発明が解決しようとする課題は、安全で、タンパク質の凝集を抑制し、粘度の低いタンパク質溶液を調製できるタンパク質の凝集抑制剤を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド界面活性剤がタンパク質凝集抑制剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。

したがって、本発明は、
１．ペプチド界面活性剤を含む安全で、かつタンパク質溶液の粘度を下げるタンパク質凝集抑制剤、
２．ペプチド界面活性剤が、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、上記１に記載のタンパク質凝集抑制剤、
３．ペプチド界面活性剤が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、上記１に記載のタンパク質凝集抑制剤、
４．タンパク質がモノクローナル抗体である、上記１に記載のタンパク質凝集抑制剤、
５．タンパク質がモノクローナル抗体である、上記２に記載のタンパク質凝集抑制剤、
６．タンパク質がモノクローナル抗体である、上記３に記載のタンパク質凝集抑制剤である。

本発明において、ペプチド界面活性剤とは、６〜１０個のアミノ酸残基を含むものであり、その長さは、約２〜３ｎｍであり、従来の界面活性剤、たとえば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＭ）やオクチル−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）と同様の特性を示す。

本発明のペプチド界面活性剤は、好ましくは、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる。

より具体的には、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＤＤ（Ｌ２Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、又はＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）、ＷＷＷＲＲ（Ｗ３Ｒ２）、ＹＹＹＹＲ（Ｙ４Ｒ）、ＦＦＦＦＲＲ（Ｆ４Ｒ２）を挙げることができるが、中でも、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）又はＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が好ましく、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が特に好ましい。

ペプチド界面活性剤の製造法は、固相合成法によって合成される。当該ペプチドは人工合成可能であるため、生体由来物質を含まず、感染リスクの心配がない。

本発明において、タンパク質凝集抑制剤とは、抗体を含むタンパク質の医療への応用を目的として製剤化する際にタンパク質の凝集を抑制するために用い、タンパク質溶液の粘性を下げることができる組成物をいう。

異なる濃度のアルブミン溶液の粘度と０．０５％Ａ６Ｋ溶液を加えた場合の粘度の比較

低濃度Ａ６Ｋ溶液による高濃度アルブミン溶液の凝集抑制
高濃度のアルブミン溶液を精製水またはＡ６Ｋ溶液で連続希釈し、全ての溶液の粘度を測定し、Ａ６Ｋのタンパク質凝集抑制効果（粘度低減効果）を解析したところ、Ａ６Ｋ溶液によって、アルブミンの凝集が抑制され、溶液の粘度が低減することを確認した。

＜粘度測定装置＞
回転式動的粘弾性測定装置：ＨＡＡＫＥ ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ ６００
試料台：直径２０ｍｍのアルミニウムプレート（装置附属）
測定センサー：直径２０ｍｍのコーン型アルミニウムキャップ（装置附属）
＜材料＞
・アルブミン（ウシ血清由来；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
濃度：１６０ｍｇ／ｍＬ
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（ストック溶液）
・精製水

＜方法＞
・アルブミン溶液の調製
アルブミン粉末３２０ｍｇを精製水１ｍＬに静かに加え、静置して溶解する。
・Ａ６Ｋ溶液の調製
１００μＬのストック溶液に精製水を９００μＬ加え、０．１％Ａ６Ｋ溶液を調製する。
・アルブミン溶液の希釈
上で調製したアルブミン溶液３００μＬに、３００μＬの精製水または０．１％Ａ６Ｋ溶液をそれぞれ加え、アルブミン濃度１６０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製する。同じ操作を続けて行い、アルブミン濃度８０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液をそれぞれ３００μＬずつ準備する。
・粘度測走装置の設定
試料台温度を２３℃に設定し、試料台とセンサーのギャップを０．５ｍｍに固定する。測定モードはＣＳ−ＣＲフローカーブを選択し、軸回転速度は線形加速で１分間の速度範囲を０−１００ｒ／ｓに設定する。
・溶液の粘度測定
上で調製したアルブミン溶液をそれぞれ１００μＬ、試料台におき、粘度を測定する。測定したせん断応力と、回転速度から粘度を計算し、求めた最大粘度をそれぞれの試料の粘度とする。測定は、各試料につき１回実施した。

＜結果＞
目視でそれぞれの溶液を確認したところ、精製水で溶解したアルブミン溶液は、時間の経過によって白濁したが、Ａ６Ｋ溶液を加えたアルブミン溶液は、澄明であった。粘度測定の結果を図１に示す。３つのアルブミン濃度において、精製水よりもＡ６Ｋ溶液を用いたほうが、アルブミン溶液の濃度が低かった。さらに、アルブミン濃度が低くなるにつれて、Ａ６Ｋ溶液によるアルブミン溶液の粘度低減効果が顕著にあらわれた。

アルブミン溶液の粘度を低減する最適なＡ６Ｋ溶液の濃度
一定濃度のアルブミン溶液に、３つの濃度のＡ６Ｋ溶液をそれぞれ加え、目視で、アルブミン溶液の凝集抑制効果を検討し、最適のＡ６Ｋ溶液濃度が０．０５％であることを確認した。

＜材料＞
・アルブミン水溶液
濃度：２００ｍｇ／ｍＬ
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（ストック溶液）
精製水

＜方法＞
・Ａ６Ｋ溶液の調製
ストック溶液に精製水を加え、下の３つの濃度のＡ６Ｋ溶液を５００μＬずつ調製する。
３濃度：１０ｍｇ／ｍＬ（１％溶液）
５ｍｇ／ｍＬ（０．５％溶液）
１ｍｇ／ｍＬ（０．１％溶液）
・アルブミン溶液の凝集抑制効果の検討
１００μＬのアルブミン溶液に、上で調製した４濃度のＡ６Ｋ溶液をそれぞれ等量ずつ加え、溶液の透明度を目視で確認する。

＜結果＞
１％、０．５％のＡ６Ｋ溶液を加えたアルブミン溶液は、白濁したが、０．１％Ａ６Ｋ溶液を加えたアルブミン溶液は澄明であった。

＜総合考察＞
実施例１と実施例２の結果と併せ、適当な濃度に調製したペプチド性界面活性剤が、タンパク質の凝集抑制に有用であると考えられた。

Claims (4)

1. ＡＡＡＡＡＡＫの配列で表されるペプチドを含む、タンパク質溶液の粘度を下げる凝集抑制剤。
2. ０．０５〜１％濃度の水溶液で用いる、請求項１記載のタンパク質の凝集抑制剤。
3. ０．０５〜０．１％濃度の水溶液で用いる、請求項２記載のタンパク質の凝集抑制剤。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の凝集抑制剤を含む、医薬品。