ES2181281T5 - Formulaciones liquidas de interferon beta. - Google Patents
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Abstract
Formulación líquida que contiene interferón humano como sustancia activa, un tampón para el ajuste de un valor pH de 5 a 8 y uno o varios aminoácidos y, después del almacenamiento durante 3 meses a 25ºC, presenta una estabilidad a largo plazo de la actividad biológica in vitro de al menos 80% de la actividad inicial, con la condición de que la formulación no contenga ningún aminoácido ácido, arginina ni glicina en una fracción en peso de 0,3 a 5%.
Description
Formulaciones líquidas de interferón
\beta.
La presente invención se refiere a formulaciones
líquidas de interferón \beta humano. Las formulaciones se
caracterizan porque presentan un valor pH comprendido en el
intervalo de débilmente ácido a neutro entre 5 y 8, así como por
darse una alta estabilidad de la solución de interferón \beta con
conservación de la integridad molecular.
Los interferones que se encuentran en la
naturaleza son proteínas específicas de la especie, en parte
glucoproteínas, que son producidas por distintas células del cuerpo
tras la inducción con virus, ARN de doble cadena, otros
polinucleótidos así como antígenos. Los interferones poseen
numerosas actividades biológicas como, p.ej., propiedades
antivirales, antiproliferativas así como inmunomoduladoras. Han sido
identificados al menos 3 tipos de interferones humanos distintos,
los cuales son producidos por leucocitos, linfocitos, fibroblastos,
así como por células del sistema inmune y son designados
interferones \alpha, \beta y \gamma. Además, los tipos
individuales de interferón se pueden subdividir en numerosos
subtipos.
El interferón \beta humano nativo se puede
preparar industrialmente mediante superinducción de cultivos
celulares de fibroblastos humanos con poli-IC así
como posterior aislamiento y purificación del interferón \beta
mediante técnicas cromatográficas y electroforéticas. Mediante
tecnologías de ADN recombinante se pueden preparar también
proteínas o polipéptidos que presentan propiedades comparables con
el interferón \beta nativo (documentos
EP-A-0 028 033;
EP-A-0 041 313;
EP-A-0 070 906;
EP-A-0 287 075; Chernajovsky et
al. (1984) DNA 3, 297-308; Mc Cormick et
al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 166-172). En
éstas se puede producir interferón \beta humano recombinante
tanto en células eucarióticas (p. ej. células CHO) como también en
células procarióticas (p. ej. E. coli). Los correspondientes
interferones se designan interferón \beta-1a o
bien interferón \beta-1b. Al contrario del
\beta-1b, el interferón \beta-1a
está glucosilado (Goodkin (1994) Lancet 344,
1057-1060).
El empleo terapéutico de interferón \beta
presupone que se lleva a un preparado galénico, que hace almacenable
la proteína durante un largo espacio de tiempo con conservación de
la integridad molecular. El interferón \beta es inestable y está
sujeto a distintas reacciones de degradación. A éstas pertenecen
especialmente la disociación de enlaces peptídicos, desamidación,
oxidación de la metionina a sulfuro de metionina, intercambio de
puentes disulfuro así como a cambios de las cadenas laterales de
azúcar, incluso hasta la deglucosilación.
Debido al uso terapéutico de los interferones,
se han desarrollado en los años pasados una serie de formulaciones,
presentando todas ellas, sin embargo, ciertas desventajas. La
patente de EE.UU. nº 4,647,454 (Inter-Yeda Ltd.)
describe una formulación de interferón \beta de fibroblastos que
se puede estabilizar mediante adición de polivinilpirrolidona (PVP)
en el intervalo fuertemente ácido (pH 3,5). Otras sustancias
coadyuvantes preferidas son manitol, albúmina de suero humano así
como tampón acetato. La formulación se liofiliza y se conserva a
4ºC.
La memoria de patente japonesa 59 181 224
(Sumitomo Chemical Co.) describe una solución acuosa de interferones
en la cual se emplean aminoácidos polares como arginina,
asparagina, ácido glutámico, glutamina, histidina, lisina, serina,
así como treonina o bien sus sales sódicas junto con albúmina de
suero humano, para la estabilización de los interferones.
La solicitud de patente internacional WO
95/31213 (Applied Research Systems ARS Holding) describe una
formulación líquida para interferón \beta que se estabiliza
mediante adición de un poliol, preferiblemente manitol, y un azúcar
no reductor o un aminoácido. La formulación contiene, además, un
tampón (tampón acetato, pH 3,0 a 4,0) así como albúmina de suero
humano. Mientras que las recetas con un valor pH comprendido entre 5
y 6 mostraron una inmediata pérdida de actividad biológica, las
recetas preferidas en la memoria de la patente son suficientemente
estables a valores pH de 3,0 así como de 4,0. La manifestación de
estabilidad se refiere, además, sólo a la actividad biológica de la
formulación pero no a la integridad molecular de la sustancia
activa.
La solicitud de patente europea EP 0 215 658
(Cetus Corp.) describe una formulación para interferón \beta
recombinante en la cual el compuesto biológicamente activo se
disuelve en un medio acuoso a un valor pH comprendido entre 2 y 4
con adición de agentes estabilizantes como albúmina de suero humano
o fracciones de proteína de plasma humano así como, eventualmente,
dextrosa. Otra solicitud de patente de Cetus Corp. (WO 89/05158)
describe una formulación para interferón \beta en la que se
emplean como estabilizantes, a un valor pH comprendido entre 2 y 4,
o glicerina o polímeros de polietilenglicol con un peso molecular
medio comprendido entre 190 y 1.600 dalton. Como componentes tampón
adecuados se mencionan glicina, ácido fosfórico así como ácido
cítrico.
La solicitud de patente europea EP 0 217 645
(Cetus Corp.) describe preparados farmacéuticos con
IL-2 o interferón \beta, que se disuelven en un
medio portador a un valor pH de 7 a 8 y se estabilizan con adición
de laurato sódico como compuesto tensioactivo. Además, para la
estabilización de estos compuestos se precisa también SDS como
compuesto tensioactivo iónico adicional.
La patente europea EP 0 270 799 (Cetus Oncology
Corp.) describe una formulación para interferón \beta recombinante
no glucosilado en un medio portador inerte a base de agua que
contiene como estabilizadores detergentes polímeros no iónicos.
La solicitud de patente europea EP 0 529 300
(Rentschler Biotechnolgie GmbH) describe formulaciones líquidas de
interferón \beta que contienen una concentración de 30 o bien 70
MU/ml de IFN-\beta recombinante, cloruro sódico y
tampón de imidazol o bien de fosfato sódico, y presentan un valor pH
de 7,5 (Ejemplo 3). Estas formulaciones son estables, en lo que a
su actividad biológica se refiere, durante 4 semanas a una
temperatura de almacenamiento de 25ºC. Estas composiciones, sin
embargo, tienen la desventaja de que la concentración de interferón
\beta empleada (\geq 30 MU/ml) es demasiado alta para
aplicaciones prácticas. Además, en el documento
EP-A-0 529 300 no se encuentra
ningún tipo de indicación de que, mediante la adición de albúmina de
suero humano disminuye la estabilidad de las formulaciones líquidas
de interferón \beta. Al contrario, la adición de albúmina de
suero humano se indica como preferida.
La solicitud de patente internacional WO
98/28007 (Biogen, Inc.) describe el uso de aminoácidos ácidos
arginina y glicina como agentes estabilizantes en formulaciones que
contienen interferón.
Junto a formulaciones para interferón \beta,
se describen también formas de administración farmacéutica con
interferón \alpha. La memoria de patente europea 0 082 481
(Schering Corp.) revela una formulación acuosa destinada a
liofilización que, junto a un tampón fosfato y glicina, contiene
albúmina de suero humano. Como componente adicional opcional se
menciona alanina. El valor pH de la solución después de la
reconstitución se sitúa entre 7,0 y 7,4. Otra solicitud de patente
de Schering Corp. (WO 96/11018) revela soluciones acuosas estables
con interferón \alpha que, a un valor pH comprendido entre 4,5 y
7,1, contiene agente quelante (NaEDTA o ácido cítrico), un
compuesto tensioactivo (Polysorbat 80), un agente isotonificante
(cloruro sódico) así como agentes conservantes adecuados como
metilparaben, propilparaben, m-cresol o fenol. Las
formulaciones acuosas reveladas se muestran estables en lo
referente a la actividad biológica (método estándar de inhibición
del efecto citopático (CPE) de un virus como describe W.P. Protzman
en J. Clinical Microbiology, 1985, 22, p. 596-599)
a 25ºC durante 6 meses (actividad biológica >90% de la actividad
de partida). Sin embargo, una determinación del contenido de
proteína mediante HPLC llevada a cabo en paralelo demuestra ya,
después de 6 meses a 25ºC, pérdidas en el contenido comprendidas
entre 20,2 (Tab. 3) o 32,5% (Tab. 4).
El documento
EP-A-0 736 303
(Hoffmann-LaRoche AG) revela composiciones acuosas
de interferón \alpha que comprenden, junto con un interferón
\alpha, un detergente no iónico, un tampón para el ajuste del
intervalo pH entre 4,5 y 5,5, alcohol bencílico y, eventualmente,
un agente isotonificante. En la determinación mediante HPLC se
detecta, después de un almacenamiento de tres meses a 25ºC y una
concentración inicial de 18 MU de interferón
\alpha-2a, un contenido residual de 84,5%, bajando
este valor a 62,8% con la omisión de alcohol bencílico
estabilizador.
El documento
EP-A-0 641 567 (Ciba Geigy AG)
describe composiciones farmacéuticas que contienen interferón
\alpha híbrido y, como estabilizador, un tampón con un valor pH
comprendido entre 3,0 y 5,0.
La patente de EE. UU. 5,358,708 (Schering Corp.)
describe formulaciones acuosas de interferón \alpha que contienen
como estabilizadores metionina, histidina o mezclas de ellos.
Después de un almacenamiento de dos semanas de una solución de
interferón \alpha a 40ºC se encontró una merma del contenido de
sustancia activa de aproximadamente el 20%.
Desde el punto de vista actual, las
formulaciones para interferones indicadas anteriormente están unidas
con desventajas puesto que, por razones de exigencias crecientes de
seguridad ante contaminaciones con virus a través del donante de
sangre se debería renunciar, p. ej., a la adición de albúmina de
suero humano para la estabilización de proteínas. Además, para una
pluralidad de las formulaciones descritas anteriormente es necesaria
una adición de aminoácidos y/o una liofilización. Pero los
productos liofilizados son de muy costosa preparación y en
consecuencia caros y, por la necesidad de la reconstitución,
precisan una etapa de trabajo adicional que a menudo, especialmente
para pacientes con motricidad limitada, sólo se puede efectuar con
mucha dificultad. Una serie de recetas presentan valores pH no
fisiológicos por debajo de 5,0. Aunque tales valores no son del
todo inhabituales (véase también S. Sweetana y N.J. Aders. Journal
of Pharmaceutical Sciences and Technology, 1996, 50:
330-342), en la administración intramuscular o
subcutánea hay que contar con irritaciones dolorosas. El uso de
compuestos tensioactivos como Polysorbat 80 está permitido
ciertamente conforme a Sweetana y Akers, pero se han descrito una
serie de efectos secundarios, especialmente también en niños y
recién nacidos, que cuestionan el empleo de tales sustancias
coadyuvantes. Sobre la toxicidad de compuestos tensioactivos se
informa a modo de compendio por Attwood y Florence (Surfactant
Systems, their Chemistry, Pharmacy and Biology, Chapman and Hall;
London, 1983). Una panorámica sobre la farmacología de Polysorbat 80
se encuentra en R.K. Varma et al. (Arzneim.-Forsch./Drug
Res. 35, 1985, 804-808).
Debido a las desventajas mencionadas
anteriormente, una formulación óptima para interferón \beta
debería reunir las siguientes propiedades:
- -
- Conservación de la actividad biológica durante el espacio de tiempo de almacenamiento.
- -
- Conservación de la integridad molecular de la molécula de sustancia activa biológica durante el espacio de tiempo de almacenamiento.
- -
- Formulación líquida, renuncia a una cara liofilización así como a una reconstitución adicional.
- -
- Renuncia a sustancias coadyuvantes unidas a riesgo, como albúmina de suero humana o compuestos tensioactivos (detergentes).
- -
- Valor pH en el intervalo de neutro a débilmente ácido.
Todas las exigencias se satisfacen mediante el
procedimiento escrupulosamente descrito en el siguiente
apartado.
Sorprendentemente se encontró una composición de
receta que asegura la integridad molecular de interferón \beta en
forma líquida en un intervalo de pH fisiológico comprendido entre 5
y 8, preferiblemente entre 5,5 y 8, durante un largo espacio de
tiempo sin que se tenga que recurrir a las desventajosas sustancias
coadyuvantes conocidas del estado de la técnica.
Un primer aspecto de la invención es una
formulación farmacéutica líquida que contiene
IFN-\beta glucosilado humano como sustancia
activa, un tampón para el ajuste de un valor pH entre 5 y 8,
preferiblemente entre 5,5 y 8, y metionina, que está libre de
albúmina de suero humano, con la condición de que la formulación no
contenga ningún aminoácido ácido, arginina ni glicina en una
fracción en peso comprendida entre 0,3-5% y presente
una estabilidad a largo plazo de la actividad biológica (in
vitro) de al menos 80% de la actividad inicial después del
almacenamiento a 25ºC durante 3 meses.
La medición de la estabilidad a largo plazo de
formulaciones farmacéuticas líquidas se efectuó a 25ºC. Se eligió
la temperatura de 25ºC por una parte para provocar una aceleración
de las reacciones de degradación, por otra parte para no originar
artefactos provocados por sobretemperaturas. Los métodos analíticos
adecuados para la determinación de la estabilidad de interferón
\beta están descritos en los artículos de síntesis de J. Geigert
(J. Parent. Sci. Technol. 43 (1989), 220-224) o de
M.C. Manning, K. Patel y R.T. Borchardt (Pharm. Res. 6 (1989),
903-918).
La medición de la actividad biológica después
del tiempo de conservación respectivamente elegido se efectuó
mediante el método estándar de inhibición del efecto citopático de
un virus. Una descripción exacta del método de ensayo empleado se
encuentra en Stewart, W.E. II (1981): The Interferon System (Second,
enlarged Edition), Editorial Springer: Viena, New York; Grossberg,
S.E. et al. (1984), Assay of Interferons. En: Came, P.E.,
Carter W.A. (eds) Interferons and their Applications, Editorial
Springer: Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, págs.
23-43. Una formulación conforme a la invención
presenta, después de la conservación durante tres meses a 25ºC, una
actividad biológica de al menos 80%, preferiblemente de al menos 85%
y con especial preferencia de al menos 90% de la actividad
inicial.
Preferiblemente, una formulación conforme a la
invención posee, después de una conservación durante seis meses a
25ºC, una actividad biológica de al menos 80%, preferiblemente de al
menos 85% de la actividad inicial.
También para una conservación a temperaturas más
altas, p. ej. 37ºC, las formulaciones conformes a la invención
presentan una estabilidad de la actividad biológica a largo plazo
sorprendentemente alta. Así, después de una conservación durante un
mes a 37ºC, se encontró una actividad biológica de al menos 70% y,
preferiblemente, de al menos 80% de la actividad inicial.
Las formulaciones farmacéuticas líquidas
conformes a la invención están exentas de albúmina de suero humano
y, con especial preferencia - con excepción de la sustancia activa -
exentas de polipéptidos humanos o animales, especialmente de
proteínas de suero. Además, es preferido que la formulación
farmacéutica líquida conforme a la invención este exenta de agentes
tensioactivos, especialmente exenta de detergentes iónicos o/y de
tensioactivos no iónicos.
Las formulaciones conformes a la invención
contienen como sustancia activa un interferón \beta glucosilado
humano, es decir un polipéptido, el cual presenta propiedades
biológicas o/e inmunológicas de interferón \beta humano nativo y
puede ser un interferón \beta de origen natural o recombinante.
Preferiblemente, la formulación contiene un interferón \beta
recombinante de células CHO. Con la mayor preferencia se emplean
especies de interferón \beta como las que son obtenibles de la
línea celular BIC 8622 (ECACC 87 04 03 01) y están descritas, por
ejemplo, en los documentos EP-B-0
287 075 y EP-A-0 529 300.
La sustancia activa se encuentra en las
formulaciones conformes a la invención, preferiblemente, en una
concentración de hasta 25 MU/ml. Es preferida, sin embargo, una
dosificación comprendida en el intervalo de 1 a 25 MU/ml, con
especial preferencia de 3 a 20 MU/ml, con la máxima preferencia de 3
a 10 MU/ml. Estos intervalos de dosificación permiten una
aplicación inmediata sin dilución adicional unida con una
estabilidad especialmente buena a alta temperatura.
Otra característica preferida de la formulación
farmacéutica líquida conforme a la invención es que presenta una
integridad química después del almacenamiento a 25ºC durante 3 meses
y preferiblemente durante 6 meses, es decir que es estable ante a
la disociación de péptidos, oxidación y deglucosilación. La medición
de la integridad química se efectúa mediante mapeo de péptidos,
absorción Western así como análisis de glucosilación. Se deben
considerar químicamente estables en relación con la presente
invención las composiciones en las cuales se conserva el interferón
\beta, en relación con la formulación en al menos 85%,
preferiblemente en al menos 90% de la integridad química en las
condiciones de almacenamiento elegidas.
Otra característica preferida de las
formulaciones farmacéuticas líquidas conformes a la invención es que
presenta una integridad física después del almacenamiento a 25ºC
durante 3 meses y preferiblemente durante 6 meses. En este caso, la
integridad física se evalúa mediante medición de la transmitancia a
420 nm así como mediante apreciación visual de las soluciones. Se
consideran físicamente estables aquellas soluciones cuya
transmisión se sitúa en más del 90%, preferiblemente en más del 93%
en las condiciones de almacenamiento elegidas y en las cuales no se
puede comprobar ningún enturbiamiento en la apreciación visual.
Mediante la presente invención se pueden poner a
punto, sorprendentemente, formulaciones líquidas de interferón
\beta que son biológica, química y físicamente estables durante un
largo espacio de tiempo estando también exentas de contenido de
sustancias indeseadas como, por ejemplo, albúmina de suero humano o
agentes tensioactivos. Las formulaciones conformes a la invención
contienen, junto con la sustancia activa, un tampón que se
encuentra preferiblemente en una concentración de 10 mmol/l a 1
mol/l, con especial preferencia en una concentración de 20 mmol/l a
200 mmol/l, p. ej. de aproximadamente 50 mmol/l a 100 mmol/l y que
sirve para mantener el valor pH de la formulación en el intervalo
de 5 a 8, preferiblemente de 5,5 a 8 y con mayor preferencia entre 6
y 7,4. Es especialmente preferido un intervalo de pH comprendido
entre 6 y 7,2 y, con la máxima preferencia, entre 6,2 y 6,8 puesto
que aquí se consigue una estabilidad especialmente alta con
conservación de la integridad molecular. El tampón se elige entre
tampones aceptables farmacéuticamente, p. ej. tampones borato,
succinato, L-malato, TRIS, salicilato,
glicilglicina, trietanolamina, isocitrato, maleato, fosfato, citrato
y acetato o mezclas de ellos. Se emplean preferiblemente tampones
fosfato, citrato y acetato o mezclas de ellos, con especial
preferencia tampón fosfato/citrato.
La formulación conforme a la invención puede
contener, junto con la sustancia activa y el tampón otras sustancias
coadyuvantes tolerables fisiológicamente, por ejemplo sustancias
coadyuvantes para la adaptación de la tonicidad a la tonicidad de
la sangre o tejidos, p. ej. azúcares no reductores, azúcares
alcoholes como manita, sorbita, xilita o glicerina. A la
formulación conforme a la invención se le añade el aminoácido
metionina para el aumento adicional de la estabilidad química. La
concentración de metionina se sitúa preferiblemente en el intervalo
de 0,1 a 4 mmol/l. Es preferida especialmente una concentración de 2
mmol/l. Además, la composición puede contener agente espesante para
el aumento de viscosidad, p. ej. para fines oftalmológicos. Son
ejemplos de agentes espesantes adecuados los polímeros adecuados
oftalmológicamente, p. ej. carbopol, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa, etc.
Además, la composición conforme a la invención
puede contener también agentes conservantes. Para fines
oftalmológicos se puede emplear, por ejemplo, tiomersal en una
cantidad de 0,001 a 0,004% (peso/volumen).
La invención se refiere, además, a preparados
farmacéuticos que contienen una formulación líquida que contiene a
su vez interferón \beta como la anteriormente descrita. Estos
preparados farmacéuticos son adecuados especialmente para la
administración oral, parenteral u oftalmológica. Las formulaciones
se encuentran preferiblemente en dosis individuales de 1 a 25 MU de
IFN-\beta. Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de los preparados farmacéuticos
de este tipo, en donde se prepara una formulación conforme a la
invención y, eventualmente, otras sustancias coadyuvantes galénicas
necesarias y se lleva a una forma de administración adecuada.
La formulación conforme a la invención se puede
almacenar en viales de cristal adecuados (clase hidrolítica 1),
lavados así como esterilizados, con tapones de goma aceptables
farmacéuticamente.
Además, con las formulaciones conformes a la
invención también se pueden rellenar en condiciones asépticas, y
emplearse, inyecciones preparadas o cápsulas para el empleo en
sistemas de autoinyección. Las soluciones acuosas se pueden
liofilizar - aunque esto no es preferido - mediante la adición de
otras sustancias coadyuvantes conocidas por el especialista en la
materia y ponerse a disposición después, tras la reconstitución, en
forma líquida.
Con empleo de agentes conservantes adecuados se
pueden preparar formas medicamentosas líquidas de dosis múltiples
así como soluciones para gotas oculares y soluciones en gotas para
la administración oral.
Las sustancias coadyuvantes adicionales
necesarias para la preparación de las correspondientes formas de
administración son conocidas por el especialista en la materia.
Finalmente, la invención se refiere a un
procedimiento para la mejora de la estabilidad de una formulación
líquida que contiene interferón \beta glucosilado humano como
sustancia activa y un tampón para el ajuste de un valor pH de 5 a
8, preferiblemente de 5,5 a 8, caracterizado porque se emplea una
formulación sin albúmina de suero humano y con metionina, con la
condición de que la formulación no contenga ningún aminoácido ácido,
arginina ni glicina en una fracción en peso comprendida de 0,3 a
5%. La mejora de la estabilidad comprende una mejora de la
estabilidad a largo plazo de la actividad biológica (in
vitro), de la integridad química o/y de la integridad física,
como se ha indicado anteriormente.
Además, la invención se explica mediante los
siguientes ejemplos y ejemplos de comparación.
En todos los ejemplos se empleó un interferón
\beta obtenido de células CHO.
Se ensayaron las siguientes formulaciones:
- Formulación 1: 50 mmol/l de citrato sódico, pH 5,0.
- Formulación 2: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0, 15 mg/ml de albúmina de suero humano, 2 mmol/l de metionina, 50 mg/ml de glicerina.
- Formulación 3: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0, 50 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 4: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 5: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0.
- Formulación 17: 70 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, 2 mmol/l de metionina, pH 6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones se diluyeron a un contenido de
aproximadamente 10 a 15 MU/ml (es decir 10 a 15 x 10^{6}
U.I./ml).
Las formulaciones, con excepción de la
formulación 17 (véase más adelante), se almacenaron a 25ºC durante
el espacio de tiempo indicado en viales de cristal de la clase
hidrolítica 1 (Viales DIN 2R), que se cerraron con tapones de goma
de clorobutilo corrientes del comercio. La determinación de la
actividad biológica (in vitro) se efectuó como se describe
en Stewart, W.E. II (1981): The Interferon System (Second, enlarged
Edition), Editorial Springer: Viena, New York; Grossberg, S.E.
et al. (1984), Assay of Interferons. En: Came, P.E., Carter
W.A. (eds.) Interferons and their Applications, Editorial Springer:
Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, págs.
23-43.
Los resultados están representados en las Tablas
1 a 5. En "% (Ref)" se trata de la indicación de la actividad
biológica referida a la actividad biológica de una muestra de
referencia almacenada a -20ºC durante el espacio de tiempo
indicado. En "% (0me)" se trata de la actividad biológica
porcentual referida al valor inicial a 0 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En las tablas anteriores, es evidente que las
formulaciones que no contienen albúmina de suero humano
(formulaciones 1, 3, 4, 5) presentan, sorprendentemente, una mejor
estabilidad que una formulación que contiene albúmina de suero
humano (formulación 2).
En la formulación 17 (véase anteriormente) se
ajustó una solución de interferón sin albúmina de suero humano,
bajo condiciones asépticas, a una actividad de 6 MU/0,5 ml. A
continuación, la solución clara, incolora, se esterilizó por
filtración y con ella se rellenaron respectivas inyecciones de un
solo uso de 0,5 ml, previamente esterilizadas, y se cerraron. Las
inyecciones preparadas se almacenaron a 25ºC y se ensayó su
claridad, valor pH así como actividad biológica. En esto, arrojaron
los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron las siguientes formulaciones en
inyecciones preparadas:
- Formulación 6: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 7: 50 mmol/l de citrato sódico, pH 5,0, 18 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 8: 50 mmol/l de citrato sódico, pH 5,0, 18 mg/ml de glicerina, 15 mg/ml de albúmina de suero humano, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 9: 50 mmol/l de citrato sódico, pH 6,0, 18 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina.
- Formulación 10: 50 mmol/l de citrato sódico, pH 6,5, 18 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones se ensayaron en niveles de
dosis de 3 MU por 0,5 ml (nivel de dosis 3), 6 MU por 0,5 ml
(nivel de dosis 6) y 12 MU por ml (nivel de dosis 12).
Los resultados están representados en la
siguiente Tabla 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
De los resultados de la Tabla 6 es evidente que
las formulaciones conformes a la invención sin albúmina de suero
humano presentan, sorprendentemente, una estabilidad mejorada a
37ºC.
Para investigar la estabilidad química de
formulaciones líquidas de IFN-\beta, se formularon
7 muestras y se almacenaron a 25ºC. Después de 3 ó bien de 6 meses
se efectuó una caracterización de la proteína mediante un mapeo con
Lys-C y una analítica completa de hidratos de
carbono. Se dedicó una especial atención a la formación de
sulfóxido de metionina y a la desialilación.
Además de la formulación 10 (véase
anteriormente) se ensayaron las siguientes formulaciones:
- Formulación 11: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, 2 mmol/l de metionina, pH 7,0 a 7,2.
- Formulación 12: 50 mmol/l de citrato sódico, 50 mmol/l de fosfato sódico, pH 7,0 a 7,2.
- Formulación 13: 50 mmol/l de citrato sódico, 18 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina, pH 5,0 a 5,2.
- Formulación 14: 50 mmol/l de citrato sódico, 18 mg/ml de glicerina, pH 5,0 a 5,2.
- Formulación 15: 50 mmol/l de citrato sódico, 15 mg/ml de albúmina de suero humano (grado médico), 18 mg/ml de glicerina, 2 mmol/l de metionina, pH 5,0 a 5,2.
- Formulación 16: 50 mmol/l de citrato sódico, 15 mg/ml de albúmina de suero humano (grado médico), 18 mg/ml de glicerina, pH 5,0 a 5,2 (comparación).
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido en IFN-\beta se
situó en todas las muestras entre 10 y 11 MU/ml.
Para el desarrollo de la analítica fue necesaria
una concentración de las muestras. Además, en las muestras 15 y 16
hubo de separarse la albúmina de suero humano. Por eso, las muestras
se aplicaron sobre una columna cromatográfica
anti-\beta. El volumen inicial por muestra era de
32 ml. Las muestras 13 a 16 se neutralizaron antes de la
cromatografía anti-\beta mediante la adición de
2,1 ml de Na_{2}HPO_{4} de 0,4 mol/l y 2,1 ml de
Na_{3}PO_{4} de 0,4 mol/l.
Para la inmunoadsorción de interferón \beta a
un anticuerpo monoclonal contra interferón \beta (BO2 Sepharose
6B, reticulado de la Firma Celltech) se empaquetó una columna de
cromatografía C10 (Firma Pharmacia) con 5 ml de BO2 Sepharose y se
lavó 3 veces, cada una de ellas con 5-10 Gelvolumina
PBS, fosfato sódico de 0,1 mol/l, pH 2,0 y PBS/KCl de 1 mol/l, con
un flujo lineal de 1,0 cm/min.
La aplicación de aprox. 32 ml de la solución que
contenía interferón/HSA se efectuó con un flujo lineal de 0,5
cm/min.
El lavado se efectuó con 10 Gelvolumina PBS/KCl
de 1 mol/l con un flujo lineal de 1 cm/min hasta caída del OD a la
línea base. La elución se efectuó con aprox. 1-2
Gelvolumina, fosfato sódico de 0,1 mol/l, pH 2, con un flujo lineal
de 1 cm/min. En este caso, se obtiene el interferón \beta en forma
de pico individual con alta pureza. Este eluato es adecuado para la
subsiguiente caracterización de la proteína.
Con la enzima endoproteinasa
Lys-C de Achromobacter (AP), bajo condiciones
reductoras, el interferón \beta se disocia en 12 péptidos por el
extremo C terminal de lisina.
En un matraz de reacción Eppendorf se pusieron
50 \mul de eluato de la cromatografía anti-\beta
(12,5-50 \mug de interferón \beta) y se
mezclaron con 5 \mul de TRIS de 2 mol/l. A ello se añadió
endoproteinasa de la Firma Wako en una relación enzima/sustrato de
1:10 (solución de endoproteinasa Lys-C en TRIS/ClH
de 50 mmol/l, pH 9,0). La solución se mezcló y se incubó a 30ºC
durante 2 horas. Después de esto se efectuó una adición a la
muestra de 5 \mul de DTT de 0,1 mol/l.
La separación del péptido se efectuó sobre una
columna de fase invertida (Vydac C18, 300 \ring{A}, 5 \mum, 2,1
mm) en una instalación de HPLC HP Serie 1090 M con detector de array
de diodos a 214 nm, habiéndose empleado un gradiente de A: 0,1%
(v/v) de TFA y B: 0,1% (v/v) de TFA/70% (v/v) de acetonitrilo. Los
péptidos se numeraron por orden de sus tiempos de retención y se
coordinan con las siguientes secuencias.
Utsumi et al. (1989).
Characterization of four different
mammalian-cell-derived recombinant
human interferon-\beta1. Eur. J. Biochem.
181, 545-553.
Utsumi et al. (1988):
Structural characterization of fibroblast human
interferon-\beta1. J. Interferon Res. 8,
375-384.
Allen, G. (1981): Laboratory
techniques in biochemistry and molecular biology. Sequencing of
proteins and peptides. Editorial Elsevier.
Castagnola et al. (1988):
HPLC in Protein sequence determinations. J. Chromatography
440, 213-251.
\vskip1.000000\baselineskip
En los péptidos designados con (ox) el
aminoácido metionina se encuentra en forma de sulfóxido de
metionina. La cuantificación se apoya sobre la determinación de la
razón de la superficie del pico del péptido oxidado a la superficie
total de péptido intacto y péptido oxidado. Las fracciones de
metionina oxidada son muy pequeñas en preparaciones recientes de
interferón \beta. Durante el almacenamiento, esta fracción crece
más o menos fuertemente según las condiciones de almacenamiento
(tampón, valor pH, temperatura, etc.). Este cambio no es deseado
puesto que puede contribuir a la inestabilidad de la molécula de
interferón \beta o bien influir significativamente en las
propiedades in-vivo.
La fracción de péptido oxidado AP4(ox),
AP6(ox), AP8(ox) y AP10(ox) es, por lo tanto,
un importante criterio para la evaluación de la integridad química
de la molécula de interferón \beta en una formulación líquida.
En la primera etapa se separaron los
oligosacáridos del polipéptido y se desalinizaron.
Se dializaron aproximadamente 0,7 ml del eluato
de la cromatografía anti-\beta en un tubo de
diálisis (6 mm de diámetro, Sigma nº D-9277) contra
500 ml de tampón de diálisis (fosfato sódico de 0,05 mol/l, NaCl de
0,10 mol/l, pH 7,25) a temperatura ambiente, con ligera agitación,
durante 16-20 horas. Después de esto, se cortó el
tubo por un extremo y se pasó el contenido a un matraz de reacción
Eppendorf. El volumen de muestra después de la diálisis era de 1
ml.
Sobre la muestra dializada se pipetearon 20
\mul de Tween 20 (del 10%) y 15 \mul de solución de
N-glucosidasa-F (Boehringer
Mannheim). Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 24 horas. Después de
acabada la incubación se centrifugó a 10.000 rpm durante 10
minutos, se filtró sobre 0,45 \mum y a continuación se
cromatografió sobre una columna de desalinización (HR 10/10
Pharmacia nº 17-0591-01) con un
gradiente isocrático (eluyente A: agua destilada) con un flujo de
1,0 ml/min y se fraccionó. La detección de oligosacáridos libres se
efectuó a 206 nm.
En la segunda etapa los oligosacáridos liberados
se separaron sobre un intercambiador de iones, diferenciados por el
número de sus restos de ácido siálico.
Los oligosacáridos contenidos en el eluato de la
columna de desalinización, aprox. 2 ml, se unieron a un
intercambiador de aniones (Mono Q HR 5/5, Pharmacia nº
17-0546-01). Las formas asialo se
encuentran en la corriente circulante. Con ayuda de un gradiente
plano de ClNa eluyeron formas monosialo, disialo y trisialo en el
orden de sucesión indicado, claramente separadas entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
- Eluyente A:
- Milli-Q-agua
- Eluyente B:
- NaCl de 0,10 mol/l
Gradiente:
- Flujo:
- 0,75 ml/min
- Tiempo de elución:
- 26 min (con regeneración 36 min)
- Detección:
- UV 206 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de las fracciones individuales de
oligosacáridos se efectuó por medio de un detector de UV a 206 nm.
El cálculo cuantitativo se llevó a cabo sobre la integración de las
superficies de los picos individuales.
Las fracciones de oligosacáridos monosialo,
disialo y trisialo se hicieron pasar a través de una columna de
desalinización, como se describió anteriormente.
En la tercera etapa, los oligosacáridos cargados
se transformaron en oligosacáridos neutros para lo que se
disociaron hidrolíticamente, bajo condiciones ácidas de pH, los
restos de ácidos siálicos terminales.
Para esto, de cada fracción de oligosacáridos se
pusieron aprox. 15 \mul más 15 \mul de Milli Q Wasser en un
tubito de microensayo y se añadieron 30 \mul de H_{2}SO_{4} de
10 mmol/l. A continuación se calentó a 80ºC durante 90 min.
Después de esto, se centrifugó a 5.000 rpm
durante 1 min y se pipeteó la muestra a un minivial. Los hidratos
de carbono ahora neutros, a valor de pH alcalino, se convierten en
aniones débiles y se unen a una columna intercambiadora de aniones
(CarboPac PA1 (4x250 mm) P/N 35391, Dionex). La elución se efectúa
con un gradiente de
\vskip1.000000\baselineskip
- Eluyente A:
- NaOH de 0,16 mol/l,
- Eluyente B:
- NaOH de 0,16 mol/l, acetato de Na de 0,10 mol/l,
- Eluyente C:
- NaOH de 0,16 mol/l, acetato de Na de 0,75 mol/l.
\newpage
Gradiente:
- Flujo:
- 1,0 ml/min
- Tiempo de elución:
- 50 min
- Detección:
- PAD
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de los oligosacáridos se
emplea el PAD (Pulsed Amperometric Detection). La molécula de
oligosacárido se oxida electroquímicamente y se mide la corriente
con ello originada. La PAD se distingue por una alta sensibilidad,
de modo que es posible sin dificultad una identificación en el orden
de magnitud de los ng. La señal inicial en el detector (en mV) es
directamente proporcional a la cantidad de hidratos de carbono. La
cuantificación se efectúa sobre la integración de la superficie de
los picos.
Entre la deglucosilación y el análisis las
muestras se almacenaron a -20ºC.
Townsend (1988):
High-performance anion-exchange
chromatography of oligosaccharides. Analytical Biochemistry
174, 459-470.
El mapeo con Lys-C de las
muestras 11 a 16 no mostró ninguna diferencia con el valor inicial
desde el punto de vista de los tiempos de retención y la
calificación de los péptidos.
La determinación del contenido de sulfóxido de
metionina durante el almacenamiento del líquido arrojó los
resultados mostrados en las Tablas 7 (almacenamiento durante 3
meses) y 8 (almacenamiento durante 6 meses).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De la Tabla 7 es evidente que, en un
almacenamiento de tres meses, las muestras 13 y 15 que contienen
metionina presentan, frente a las muestras exentas de metionina,
una fracción más pequeña de sulfóxido de metionina. Después de un
almacenamiento de seis meses se hace más clara la influencia de la
metionina añadida a las muestras 11, 13 y 15. Allí sólo es
identificable un aumento muy pequeño del contenido de sulfóxido de
metionina. En las muestras exentas de metionina, el contenido de
sulfóxido de metionina crece algo más intensamente, pero en la suma
de todas las fracciones de metionina oxidada al contenido total de
metionina se sitúa por debajo del 10%.
En las Tablas 9a, 9b, 10a, 10b, 11a y 11b se
indican los resultados de la determinación de hidratos de carbono
después de tres o bien después de 6 meses de almacenamiento.
El interferón \beta-1ª posee
en su cadena de aminoácidos una estructura de hidrato de carbono que
está constituida por una sucesión definida de monosacáridos. Según
el tipo de ramificación, se habla de estructuras biantenarias (2
brazos), triantenarias (3 brazos) y tetra-antenarias
(4 brazos).
La estructura de hidrato de carbono está
constituida por los monosacáridos manosa, fucosa,
N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico.
En este caso, el ácido siálico adopta una
posición especial desde varios puntos de vista:
- -
- Es el monosacárido individual con un grupo cargado (grupo carboxilo).
- -
- Se presenta siempre en posición terminal en la cadena de hidrato de carbono.
- -
- Esencialmente, es disociable, enzimáticamente o bien hidrolíticamente, más fácilmente que los demás monosacáridos.
- -
- Mientras la cadena neutra de hidrato de carbono es muy constante en su estructura, en la parte de ácido siálico se presentan grandes fluctuaciones que dependen, entre otras cosas, del cultivo celular y del procedimiento de purificación del interferón.
Kagawa et al., J. Biol.
Chem. 263 (1988), 17508-17515; documento
EP-A-0 529 300.
Se investigó el estatus de sialo (fracción
porcentual de estructuras sialo individuales) tras almacenamiento
durante tres meses (Tabla 9a) o bien tras almacenamiento durante
seis meses (Tabla 9b). Una estructura de hidrato de carbono que no
contiene ningún ácido siálico en posición terminal se designa
asialo. Una estructura de hidrato de carbono que contiene un ácido
siálico en posición terminal se designa monosialo. Una estructura de
hidrato de carbono que contiene dos ácidos siálicos en posición
terminal se designa disialo. Una estructura de hidrato de carbono
que contiene tres ácidos siálicos en posición terminal se designa
trisialo.
Además, se determinó la antenaridad (fracción
porcentual de tipos individuales de ramificación) tras
almacenamiento durante tres meses (Tabla 10a) o bien tras
almacenamiento durante seis meses (Tabla 10b). Una estructura de
hidrato de carbono con una ramificación y, por ello, con dos
galactosas terminales se designa biantenaria. Puede estar coronada
en posición terminal con cero a dos ácidos siálicos. Una estructura
de hidrato de carbono con dos ramificaciones y, por ello, con tres
galactosas terminales se designa triantenaria. Puede estar coronada
en posición terminal con cero a tres ácidos siálicos.
Además, se investigó el grado de sialilación
(coronación porcentual de restos galactosa terminales con ácido
siálico) tras almacenamiento durante tres meses (Tabla 11a) o bien
tras almacenamiento durante seis meses (Tabla 11b).
De los resultados, es evidente que mediante el
almacenamiento a pH 5 tiene lugar una desialilación pequeña pero
reproducible. Un almacenamiento a pH 7 no influye en el grado de
sialilación.
La fracción afuco indicada en las muestras 15 y
16 procede probablemente de proteínas extrañas de la albúmina de
suero humano añadida, que no se separaron cuantitativamente mediante
la cromatografía anti-\beta.
En lo referente a antenaridad, no resulta
ninguna influencia mensurable por el almacenamiento del líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Erwin-Rentschler-Str. 21
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Laupheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- DISTRITO POSTAL: D-88471
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Formulaciones líquidas de interferón \beta
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version#1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 109-115
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 100-105
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Leu Glu Glu Lys}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 46-52
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 116-123
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INDICACIONES:/producto= "Xaa = Met(oxidada)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Xaa Ser Ser Leu His Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 116-123
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 34-45
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- POSICIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- OTRAS INDICACIONES:/producto= "Xaa = Met(oxidada)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Xaa Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 124-134
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 34-45
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 20-33
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr
Cys Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 1-19
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- OTRAS INDICACIONES:/producto= "Xaa = Met(oxidada)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
Ser Ser Ans Phe Gln}
\sac{Cys Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 1-19
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
Ser Ser Ans Phe Gln}
\sac{Cys Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 137-166
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 53-99
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- POSICIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- OTRAS INDICACIONES:/producto= "Xaa = Met(oxidada)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 53-99
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Formulación líquida que contiene interferón
\beta glicosilado humano como sustancia activa, un tampón para el
ajuste de un valor pH de 5 a 8 y metionina y, después del
almacenamiento durante 3 meses a 25ºC, presenta una estabilidad a
largo plazo de la actividad biológica in vitro de al menos
80% de la actividad inicial, con la condición de que la formulación
no contenga ningún aminoácido ácido, arginina ni glicina en una
fracción en peso de 0,3
a 5%.
a 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Formulación según la reivindicación 1 ó
2,
caracterizada porque
el interferón \beta procede de células
CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 2,
caracterizada porque
contiene el tampón en una concentración de 10
mmol/l a 1 mol/l.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 3,
caracterizada porque
contiene un tampón elegido del grupo compuesto
por tampones fosfato, citrato y acetato y mezclas de ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Formulación según la reivindicación 4,
caracterizada porque
contiene un tampón fosfato/citrato.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 5,
caracterizada porque
presenta un valor pH entre 6 y 7,2.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 6,
caracterizada porque
aparte de la sustancia activa, está exenta de
polipéptidos humanos o animales.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 7,
caracterizada porque
está exenta de compuestos tensioactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Formulación según una de las reivindicaciones
1 a 8,
caracterizada porque
presenta una integridad química después del
almacenamiento a 25ºC durante 6 meses.
\newpage
10. Formulación según una de las
reivindicaciones 1 a 9,
caracterizada porque
presenta una integridad física después del
almacenamiento a 25ºC durante 6 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Formulación según la reivindicación 1,
caracterizada porque
la metionina se encuentra en una concentración
de 0,1 a 4 mmol/l.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Formulación según una de las
reivindicaciones 1 a 11,
caracterizada porque
contiene además sustancias coadyuvantes para el
ajuste de la tonicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Formulación según una de las
reivindicaciones 1 a 12,
caracterizada porque
contiene además agentes espesantes para el
aumento de la viscosidad.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Formulación según una de las
reivindicaciones 1 a 13,
caracterizada porque
contiene además agentes conservantes
fisiológicamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Preparado farmacéutico
caracterizado porque
contiene una formulación líquida según una de
las reivindicaciones 1 a 14.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Preparado farmacéutico según la
reivindicación 15 para la administración oral, parenteral u
oftalmológica.
17. Preparado farmacéutico según la
reivindicación 15 ó 16 en forma de dosis individuales de 1 a 25
MU.
18. Procedimiento para la producción de un
preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 15 a
17,
caracterizado porque,
se prepara una formulación según una de las
reivindicaciones 1 a 14 y eventualmente otras sustancias
coadyuvantes galénicas necesarias y se lleva a una forma de
administración adecuada.
19. Procedimiento para la mejora de la
estabilidad de una formulación líquida que contiene interferón
\beta humano como sustancia activa y un tampón para el ajuste de
un valor pH de 5 a 8,
caracterizado porque
se usa una formulación sin albúmina de suero
humano o/y con metionina, con la condición de que la formulación no
contenga ningún aminoácido ácido, arginina ni glicina en una
fracción en peso de 0,3 a 5%.
20. Procedimiento según la reivindicación
19,
caracterizado porque
la mejora de la estabilidad comprende una mejora
de la estabilidad a largo plazo de la actividad biológica in
vitro, de la integridad química o/y de la integridad física.
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