KR20010015599A

KR20010015599A - 액체 인터페론-베타 조제물

Info

Publication number: KR20010015599A
Application number: KR1020007003036A
Authority: KR
Inventors: 최페미하일; 지클로지토마스; 슈뢰더페터; 호퍼한스
Original assignee: 베. 바이스; 렌트슐러 비오테히놀로기 게엠베하 운트 체오. 카게
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2001-02-26
Also published as: AU741300B2; KR100826621B1; EP1224940B1; CA2304808C; EP1224940B2; US8337826B2; JP2001517635A; ES2223017T5; ES2223017T3; IL211048A; EP1017413B2; IL135186A; ES2181281T3; KR20060088910A; DK1017413T4; DE59811910D1; US20050186177A1; JP4293497B2; AU9627698A; EP1224940A1

Abstract

본 발명은 인간 인터페론-β의 액체 조제물에 관한다. 이 조제물은 pH가 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 약산성 내지 중성 범위인 완충제를 포함하고, 분자 통합성을 보유하면서 용액내 인터페론-β의 안정성이 높은 것을 특징으로 한다.

Description

액체 인터페론-베타 조제물{LIQUID INTERFERON-β FORMULATIONS}

본 발명은 인간의 인터페론-β 액체 조제물에 관한다. 이러한 조제물은 5-8 사이의 약산성 내지 중성의 pH 범위를 가진다는 것과 인터페론-β가 분자 통합성을 보유하면서 용액에서 매우 안정하다는 것을 특징으로 한다.

자연적으로 발생하는 인터페론은 바이러스, 이중쇄 RNA, 기타 폴리누클레오티드 및 안티겐으로 유도된 후 여러가지 체세포에 의하여 생성되는 종-특이적인 단백질, 몇몇의 경우 글리코단백질이다. 인터페론은 예를들어 항바이러스, 항증식 및 면역조절 특성과 같은 많은 생물학적 활성을 보인다. 3가지 형태 이상의 상이한 인간 인터페론이 확인되었는데 이들은 류코시트, 림포시트, 섬유 아세포 및 면역 시스템 세포들에 의하여 생성되어 α-, β- 및 γ-인터페론으로 명명된다. 각 형태의 인터페론은 다수의 세부형태로 더 나눌 수 있다.

본래의 인간 인터페론-β는 폴리-IC로 인간의 섬유 아세포 배양을 초과 유도한 다음 크로마토그래피 및 전기영동 기법으로 인터페론-β를 분리 및 정제하여 상품으로 제조할 수 있다. 천연 인터페론-β와 유사한 특성을 보이는 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수도 있다(EP-A-0 028 033; EP-A-0 041 313; EP-A-0 070 906; EP-A-0 287 075; Chernajovsky등 (1984) DNA 3, 297-308; McCormic등 (1984) Mol. Cell. Biol. 4. 166-172). 재조합 인간 인터페론-β는 진핵세포(예를들어 CHO 세포) 및 원핵세포(예를들어 E. coli)에서 생성될 수 있다. 이러한 인터페론은 각각 인터페론-β-1a 및 인터페론-β-1b라 불린다. 인터페론-β-1b와는 대조적으로 인터페론-β-1a는 글리코실화된다(Goodkin(1994) Lancet 344, 1057-1060).

인터페론-β를 치료용으로 사용하기 위한 전제는 이것이 분자의 통합성을 유지하면서 단백질이 장기간 저장에 안정하도록 제약학적으로 조제된다는 것이다. 인터페론-β는 불안정하여 여러가지 분해 반응을 거치게 된다. 여기에는 특히 펩티드 결합의 분해, 탈아미드화, 메티오닌 설파이드로 메티오닌의 산화, 디설파이드 교환 및 탈글리코실화를 포함하는 설탕 부사슬 변화가 포함된다.

인터페론의 제약학적 이점 때문에 최근 일련의 조제물이 개발되었으나 이들 모두는 어떤 단점을 보인다. 미국 특허 제4,647,454호(Inter-Yeda Ltd.)는 높은 산성 범위(pH 3.5)의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 가하여 안정화시킬 수 있는 섬유아세포 인터페론-β 조제물에 대하여 기술하고 있다. 다른 바람직한 보조물은 마니톨, 인간 혈청 알부민 및 아세테이트 완충액이다. 조제물은 동결 건조시켜 4℃에서 보관한다.

일본 특허 제59 181 224호(Sumitomo Chemical Co.)는 인터페론을 안정화시키기 위하여 인간 혈청 알부민과 함께 아르기닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 리신, 세린 및 트레오닌과 같은 극성 아미노산 및 이들의 소듐염을 사용하는 수성 인터페론 용액에 대하여 기술하고 있다.

국제 특허 출원 제WO 95/31213호(Applied Research Systems ARS 보유)는 폴리올, 바람직하게는 마니톨 및 비환원성 설탕 또는 아미노산을 가하여 안정화되는 인터페론-β를 위한 액체 조제물에 대하여 기술하고 있다. 조제물은 완충액(아세테이트 완충액 pH 3.0-4.0) 및 인간 혈청 알부민을 더 포함한다. pH 5-6의 조제물은 즉각적인 생물학적 활성을 보이는데 반해 본 특허 명세서에서 바람직한 조제물은 pH 3.0 및 4.0에서 충분히 안정하다. 또한, 안정성에 대한 언급은 조제물의 생물학적 활성뿐만 아니라 활성 성분의 분자 통합성 또한 말한다.

유럽 특허 출원 제EP 0 215 658호(Cetus Corp.)는 인간 혈청 알부민 또는 인간 플라스마 단백질 조각 및 적절한 경우 덱스트로즈와 같은 안정화제를 가하여 pH 2-4의 수성 매질내에 생물활성 화합물을 용해시킨 재조합 인터페론-β 조제물에 대하여 기술하고 있다. Cetus Corp.의 또다른 특허 출원(제WO 89/05 158호)은 평균 분자량이 190-1600 달톤인 글리세린 또는 폴리에틸렌 글리코폴리머를 pH 2-4에서 안정화제로 사용하는 인터페론-β 조제물에 대하여 기술하고 있다. 언급되는 적당한 완충액 성분은 글리신, 포스포르산 및 시트르산이다.

유럽 특허 출원 제EP 0 217 645호(Cetus Corp.)는 pH 7-8의 매질에 용해시키고 계면활성제로서 소듐 라우레이트를 가하여 안정화시킨 IL-2 또는 인터페론-β를 함유하는 제약학적 제조물에 대하여 기술하고 있다. 또한, 이들 제조물을 안정화시키기 위하여 SDS가 추가의 이온성 계면활성제로서 필요하다.

유럽 특허 제EP 0 270 799호(Cetus Oncology Corp.)는 안정화제로서 비이온성 중합체 세제를 포함하는 비활성 수-베이스 매질내 글리코실화되지 않은 재조합 인터페론-β 조제물에 대하여 기술하고 있다.

유럽 특허 출원 제EP 0 529 300호(Rentschler Biotechnologie GmbH)는 농도 30 또는 70 MU/ml의 제조합 IFN-β, 소듐 클로라이드 및 이미다졸 완충액 또는 소듐 포스페이트 완충액을 포함하고 pH가 7.5인(실시예 3) 액체 인터페론-β 조제물에 대하여 기술하고 있다. 이들 조제물은 25℃의 저장온도에서 4주동안 생물학적 활성이 안정하다. 그러나 이들 조성물의 단점은 사용되는 인터페론-β의 농도가 실제로 적용하기에는 너무 높다(30 MU/ml 이상)는 것이다. 또한 제EP-A-0 529 300호에는 인간 혈청 알부민의 부가로 인해 인터페론-β의 안정성이 감소되는 것에 대한 언급이 없다. 대조적으로 인간 혈청 알부민의 부가가 바람직한 것으로 기술되어 있다.

인터페론-β 조제물 외에, 인터페론-α와 제약학적 투약 형태 또한 기술되어 있다. 유럽 특허 명세서 제0 082 481호(Schering Corp.)는 글리신 및 포스페이트 완충액 외에 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결 건조 의도된 수성 조제물에 대하여 기술하고 있다. 알라닌은 추가적인 광학 성분으로서 언급된다. 재구성후 용액의 pH는 7.0-7.4이다. Schering Corp.의 또다른 특허 출원(제WO 96/11018호)은 킬레이트제(NaEDTA 또는 시트르산), 계면활성제(Polysorbat 80), 등장제(소듐 클로라이드) 및 pH 4.5-7.1의 메틸파라벤, 프로필파라벤, m-크레졸 또는 페놀과 같은 적당한 보존제를 포함하는 인터페론-α내 안정한 수성 용액에 대하여 기술하고 있다. 생물학적 활성(W.P. Protzman이 J. Clinical Microbiology, 1985, 22, pp.596-599에 기술한 바와 같은 바이러스의 세포변성 효과(CPE)를 저해하는 표준 방법)에 대하여는 기술된 수성 조제물은 25℃에서 6달동안 안정한 것으로 밝혀졌다(생물학적 활성은 초기 활성의 90%가 넘음). 그러나 평형적으로 수행한 HPLC에 의하여 단백질 함량을 측정하였더니 25℃에서 6달 후 20.2(표3) 또는 32.5%(표4)의 함량 손실을 보인다.

제EP-A-0 736 303호(Hoffman-LaRoche AG)는 인터페론-α외에 비이온성 세제, pH를 4.5-5.5로 세팅시키기 위한 완충제, 벤질 알콜 및 적절할 경우 등장제를 포함하는 수성 인터페론-α 조성물에 대하여 기술하고 있다. HPLC에 의한 측정은 18 MU 인터페론-α2a의 출발 농도 및 25℃에서 3달동안 저장한후 84.5%의 잔류 농도를 나타내는 반면 이 수치는 안정화제 벤질 알콜을 생략할 경우 62.8%로 떨어진다.

제EP-A-0 641 567호(Ciba Geigy AG)는 하이브리드 인터페론-α 및 안정화제로서 pH 3.0 및 5.0의 완충액을 포함하는 제약학적 조성물에 대하여 기술하고 있다.

미국 특허 제5,358,708호(Schering Corp.)는 안정화제로서 메티오닌, 히스티딘 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수성 인터페론-α 조제물에 대하여 기술하고 있다. 40℃에서 2주간 인터페론-α 용액을 저장한후 활성 성분 함량이 20% 감소한 것으로 나타났다.

전술한 인터페론 조제물은 예를들어 혈액 공급자에 의한 바이러스 감염으로부터의 안전성이 매우 요구되므로 단백질을 안정화시키기 위한 인간 혈청 알부민의 부가가 없어야 하는 까닭에 현재로서는 단점을 가진다. 또한, 다수의 상기한 조제물은 아미노산의 부가 및/또는 동결-건조를 필요로한다. 그러나 동결건조된 제품은 제조하기 복잡하여 고가이므로 재구성할 필요가 있어 추가의 경로를 요하는데 이러한 추가 경로는 특히 운동력이 제한되어 있는 환자에 대하여 종종 수행하기 어렵다. 일련의 조제물은 5.0 이하의 비생리학적인 pH치를 가진다. 이러한 수치가 완전히 이상한 것은 아니나(S. Sweetana 및 N.J. Aders의 Journal of Pharmaceutical Sciences and Technology, 1996, 50:330-342를 참조하시오) 근육내 또는 피하 투약의 경우 고통스러운 자극을 예상하여야 한다. Sweetana 및 Akers에 따르면 Polysorbat 80과 같은 계면활성제의 사용을 허용할 수 있으나 특히 신생아 및 아동에게 이러한 문제의 여지가 있는 보조물의 사용이 야기하는 일련의 부작용을 기술하였다. Attwood 및 Florence(Surfactant Systems, their Chemistry, Pharmacy and Biology, Chapman and Hall; 런던 1983)에서 이러한 계면활성제의 독성에 대한 재검토를 볼 수 있다. Polysorbat 80의 R.K.Varma등이 재검토하였다(Arzneim.-Forsch./Drug Res. 35, 1985, 804-808).

전술한 단점을 기초로 할때, 최적의 인터페론-β 조제물은 다음 특성을 가져야한다:

- 저장시 생물학적 활성을 보류할 것,

- 저장시 활성 성분 분자의 분자 통합성을 보유할 것,

- 고가의 동결-건조 및 추가의 재구성 없는 액체 조제물일 것.

- 계면활성제(세제) 또는 인간 혈청 알부민과 같은 위헙성 보조물이 없을 것,

- pH가 중성에서 약산 범위일 것.

모든 조건을 본 발명은 만족시키고 있는데 이것은 이어지는 단락에서 상세히 기술한다.

놀랍게도 바람직하지 않는 것으로 공지된 선행의 보조물에 의존하지 않고도 5-8, 바람직하게는 5.5-8 범위의 생리학적 pH에서 장기간 액체 형태의 인터페론-β의 분자 통합성을 확보하는 조성물을 발견하였다.

따라서 본 발명의 제1의 양상은 활성 성분으로서 25MU/ml 이하 농도의 인간 인터페론-β 및 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 pH를 세팅하는 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민이 없으며 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 보이는 액체 제약학적 조제물이다.

본 발명의 제2의 양상은 활성 성분으로서 인간 인터페론-β 및 6-7.2의 pH를 세팅하는 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민이 없으며 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 보이는 액체 제약학적 조제물이다.

본 발명의 제3의 양상은 활성 성분으로서 인간 IFN-β, 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 pH를 세팅하는 완충제 및 하나 이상의 아미노산을 포함하고 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 보이는 액체 제약학적 조제물이다.

액체 제약학적 조성물의 장기간 안정성은 25℃에서 측정하였다. 한편으로는 가속화된 분해 반응을 일으키기 위하여, 다른 한편으로는 불필요한 고온으로 야기되는 인위구조를 피하기 위하여 25℃의 온도를 선택하였다. 인터페론-β의 안정성을 측정하는 적당한 분석 방법은 J. Geigert(J. Parent. Sci. Technol. 43 (1989), 220-224) 또는 M. C. Manning, K. Patel 및 R. T. Borchardt(Pharm. Res. 6 (1989), 903-918)의 검토에서 발견할 수 있다.

각 경우 선택된 저장 기간후 생물학적 활성은 바이러스의 세포변화 효과를 저해하는 표준 방법으로 측정하였다. 사용되는 테스트 방법의 상세한 설명은 Stewart, W.E. II(1981):The Interferon System(제2 증보판), Springer-Verlag:뉴욕, 비엔나; Grossberg, S.E.등(1984), Assay of Interferons. In:Came, P. E., Carter W. A.(eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag:베를린, 하이델베르크, 뉴욕, 동경, pp.23-43에서 찾아볼 수 있다. 25℃에서 6달간 저장한 후 본 발명 조제물은 초기 활성의 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상의 생물학적 활성을 가진다.

예를들어 37℃에서와 같은 고온에서 저장할 경우에도 본 발명 조제물은 놀랍게도 장기간 높은 안정성의 생물학적 활성을 보인다. 예를들어 37℃에서 한달간 저장한 후 초기 활성의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 생물학적 활성이 발견된다.

본 발명 액체 제약학적 조제물은 바람직하게는 인간 혈청 알부민이 없고 특히 바람직하게는 활성 성분은 차치하고 특히 혈청 단백질내 인간 또는 동물 폴리펩티드가 없다. 본 발명 액체 제약학적 조제물은 계면활성제, 특히 이온성 세제 및/또는 비이온성 세제가 없는 것이 더 바람직하다.

본 발명 조제물은 활성성분으로서 인터페론-β, 즉 천연 인간 인터페론-β의 생물학적 및/또는 면역학적 특성을 보이고 자연적으로 발생하는 또는 재조합 인터페론-β일 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 조제물은 바람직하게는 글리코실화된 인터페론-β, 특히 바람직하게는 CHO 세포로부터 얻는 재조합 인터페론-β를 포함한다. 가장 바람직하게 사용되는 인터페론-β 종은 예를들어 BIC 8622(ECACC 87 04 03 01)에서 얻을 수 있는, 예를들어 제EP-B-0 287 075호 및 제EP-A-0 529 300호에 기술된 것들이다.

바람직하게는 활성성분은 25MU/ml 이하의 농도로 본 발명 조제물내 존재한다. 그러나, 1-25MU/ml의 투약량이 바람직하고 3-20MU/ml가 특히 바람직하며 3-10MU/ml가 가장 바람직하다. 이 범위의 투약량은 고온에서 안정성이 특히 양호하면서 추가로 희석시키지 않고도 즉시 사용할 수 있게 한다.

본 발명 액체 제약학적 조제물의 또다른 바람직한 양상은 25℃에서 3달간, 바람직하게는 6달간 저장후에도 화학적인 통합성을 보인다는 것, 즉 펩티드 분해, 산화 및 탈글리코실화에 안정하다는 것이다. 화학적 통합성은 펩티드 맵핑, 웨스턴 블롯 및 글리코실화 분석에 의하여 측정한다. 조제후 인터페론-β가 선택된 저장 조건에서 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 화학적 통합성을 보유하는 조성물이 본 발명 목적에서 화학적으로 안정한 것이다.

본 발명 액체 제약학적 조제물의 또다른 박람직한 양상은 25℃에서 3달간, 바람직하게는 6달간 저장한 후의 물리적 통합성이다. 이 경우 물리적 통합성은 420nm에서 투과도를 측정하고 용액을 육안으로 관찰하여 측정한다. 선택된 저장 조건에서 투과도가 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상이고 육안 관찰시 혼탁함이 관찰되지 않는 용액이 물리적으로 안정한 것이다.

본 발명은 놀랍게도 저장시 생물학적, 화학적 및 물리적으로 안정하고 예를들어 인간 혈청 알부민 또는 계면활성제와 같은 바람직하지 않은 성분이 없는 인터페론-β 조제물 제공을 가능하게 한다. 본 발명 조제물은 활성성분 외에 바람직하게는 10 mmol/l - 1 mol/l, 특히 바람직하게는 20 mmol/l - 200 mmol/l, 예를들어 대략 50 mmol/l - 100 mmol/l의 농도로 존재하고 조제물의 pH를 5-8, 바람직하게는 5.5-8 이상, 더 바람직하게는 6-7.4 범위로 유지하는 역할을 하는 완충제를 포함한다. 6-7.2의 pH 범위가 특히 바람직하고 6.2-6.8의 pH 범위가 가장 바람직한데 이 범위에서 분자 통합성이 유지되면서 특히 높은 안정성이 얻어지기 때문이다. 완충액은 제약학적으로 허용가능한 완충제, 예를들어 보레이트, 숙시네이트, L-말레이트, TRIS, 살리실레이트, 글리실글리신, 트리에탄올아민, 이소시트레이트, 말레에이트, 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충액 또는 이들의 혼합물에서 선택된다. 바람직하게는 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충액 또는 이들의 혼합물이 사용되며 포스페이트/시트레이트 완충액이 특히 바람직하다.

본 발명 조제물은 활성성분 및 완충액 외에 기타 생리학적으로 허용가능한 보조물, 예를들어 혈액 또는 조직 강장용 보조물, 예를들어 비환원성 설탕, 마니톨, 소르비톨, 크실리톨 또는 글리세린과 같은 설탕 알콜을 포함할 수 있다. 또한, 예를들어 알라닌, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 및/또는 메티오닌과 같은 하나 이상의 아미노산을 본 발명 조제물에 가하여 화학적 안정성을 증가시킬 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서 메티오닌이 바람직하다. 메티오닌 농도는 바람직하게는 0.1-4 mmol/l 범위이다. 또한, 본 조성물은 예를들어 안과학적 목적에서 점도 증대용의 증량제를 포함할 수 있을 것이다. 적당한 증량제의 예로는 안과학적으로 적당한 중합체, 예를들어 Carbopol, 메틸셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈등이 있다.

또한, 본 발명 조성물은 보존제를 포함할 수 있을 것이다. 안과학적인 목적에서 예를들어 티오메르살레이트를 0.001-0.004% w/v의 양으로 사용할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 상기 기술한 바와 같은 조제물을 포함하는 액체 인터페론-β를 포함하는 제약학적 제조물에 관한다. 이들 제약학적 제조물은 경구, 비경구 또는 안과학적인 적용에 특히 바람직하다. 본 조제물은 바람직하게는 1-25MU IFN-β의 단위 사용량으로 존재한다. 본 발명은 또한 본 발명 조제물 및 적절할 경우 필요한 기타의 제약학적 조제 보조물을 제조하여 적당한 사용 형태로 조제하는, 상기 제약학적 제조물의 제조 방법에 관한다.

본 발명 조제물은 제약학적으로 허용가능한 고무 스탑퍼가 장착된 적당한 살균 및 소독된 유리 바이알(가수분해류 1)내에 저장할 수 있다.

또한, 본 발명 조제물은 기성 주사기 또는 자기-주사 시스템용 캡슐내에 패킹하여 사용할 수 있다. 이것은 바람직하지 않으나 당업자에 공지된 기타의 보조물을 가하여 동결-건조시키고 재구성후 액체 형태로 사용할 수 있다.

적당한 보존제를 사용하여 여러번 사용하는 액체 형태, 안약 용액 및 한방울씩 경구 투약하는 용액을 제조할 수 있다.

적당한 용량 형태를 제조하는데 추가적으로 필요한 보조물은 당업자에 공지되어 있다.

최종적으로 본 발명은 인간 혈청 알부민이 없고 하나 이상의 아미노산을 함유하는 조제물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 활성성분으로서 인간 인터페론-β 및 pH를 5-8, 바람직하게는 5.5-8 이상으로 세팅하기 위한 완충제를 포함하는 액체 조제물의 저장 수명을 개선시키는 방법에 관한다. 저장 수명의 개선은 상기 나타낸 바와 같은 생물학적 활성(시험관내), 화학적 통합성 및/또는 물리적 통합성의 개선된 장기간 안정성에 관한다.

본 발명은 다음 실시예로 좀더 예시된다.

CHO 세포로 부터 얻은 인터페론-β를 하기 모든 실시예에 사용하였다.

1. 25℃에서의 액체 인터페론-β조제물의 장-기간 안정도

하기 조제물들을 테스트하였다.

조제물 1 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트 pH 5.0

조제물 2 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민, 2 mmol/l의 메티오닌, 50 mg/ml의 글리세린

조제물 3 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 50 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

조제물 4 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 2 mmol/l의 메티오닌

조제물 5 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0

조제물 17 : 70 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 6.5

상기 조제물을 약 10 내지 15 MU/ml (즉, 10 내지 15×10⁶IU/ml)의 함량으로 희석시켰다.

조제물 17(상기 참조)을 제외하고는, 상기 조제물을 상업상 이용가능한 클로로부틸 고무 마개를 사용하여 밀봉되는 가수분해 등급 1의 유리병(DIN 2R 유리병)에 지시된 기간동안 25℃로 저장하였다.

Stewart, W.E.II(1981): 인터페론 시스템 (제2판, 증보판) Springer-Verlag: 비엔나, 뉴욕; Grossberg, S.E. 등(1984)의 인터페론의 분석. In: Came, P.E., Carter W.A. (eds.) 인터페론 및 이들의 출원, Springer-Verlag; 베를린, 하이델베르그, 뉴욕, 도꾜, pp. 23-43에 기술된 바와 같이, (실험관 안에서) 생물학상 활성도를 측정하였다.

상기의 결과는 표 1 내지 5에 나타내었다. " % (ref.) " 는 지시된 기간동안 -20℃에서 저장되었던 참조 시료의 생물학상 활성도를 기준으로 하는 생물학상의 활성도를 나타내는 것이다. " %(0mo) " 는 0 달에서의 초기값을 기준으로 하는 생물학상 활성도의 % 함량이다.

상기 표를 통해 알 수 있는 바와 같이, 인간 혈청 알부민(조제물 1, 3, 4, 5)을 함유하지 않는 조제물은 인간 혈청 알부민(조제물 2)을 포함하는 조제물 보다 놀랍게도 더 우수한 안정도를 갖는다.

조제물 17(상기 참조)에 있어서, 인간 혈청 알부민이 배제된 인터페론 용액은 무균 조건하에 6 MU/0.5 ml의 활성도를 나타내었다. 무색의 깨끗한 용액을 연이어 여과-살균하고, 0.5-ml의 앨리콧을 예비-살균된 일회용 주사기에 가득채워 밀봉하였다. 예비용 주사기를 25℃에 저장하고, 투명도, pH 및 생물학상 활성도를 측정하였다. 다음과 같은 결과가 얻어졌다:

2. 37℃에서의 액체 IFN-β조제물의 장-기간 안정도

예비용 주사기 내의 하기 조제물을 테스트하였다:

조제물 6 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 2 mmol/l의 메티오닌

조제물 7 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 5.0, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

조제물 8 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 5.0, 18 mg/ml의 글리세린, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민, 2 mmol/l의 메티오닌

조제물 9 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 6.0, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol의 메티오닌

조제물 10 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 6.5, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

상기 조제물들을 0.5ml 당 3MU의 투약 농도(dosage strength; 투약 농도 3), 0.5ml 당 6MU의 투약 농도(투약 농도6) 및 12 MU/ml (투약 농도 12)로 측정하였다.

상기 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6의 결과로 알 수 있는 바와 같이, 놀랍게도 인간 혈청이 배제된 본 발명에 따른 조제물이 37℃에서 개선된 안정도를 갖는 것으로 나타났다.

3. 25℃에서의 화학적 안정도

INF-β의 액체 조제물의 화학적 안정도를 측정하기 위하여, 7 배취를 조제하고, 25℃하에 저장하였다. 3 및 6달이 경과된 후, 상기 단백질을 Lys-C 맵핑(mapping)에 의하여 특성화하고, 탄수화물의 분석을 완료시켰다. 메틸오닌 설폭사이드 및 탈시알릴화(desialylation)의 조제물을 특히 조심스럽게 검사하였다.

조제물 10(상기 참조)과 더불어, 다음과 같은 조제물들을 테스트하였다:

조제물 11 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트, 2 mmol/l의 메틸오닌 pH 7.0 내지 7.2

조제물 12 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0 내지 7.2

조제물 13 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 5.0 내지 5.2

조제물 14 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 18 mg/ml의 글리세린, pH 5.0 내지 5.2

조제물 15 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민(의약 등급), 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 5.0 내지 5.2

조제물 16 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민(의약 등급), 18 mg/ml의 글리세린, pH 5.0 내지 5.2(비교)

모든 배취에 있어서, INF-β함량은 10 내지 11 MU/ml이었다.

테스트 절차

상기 분석을 수행하기 위해서는 상기 시료를 농축시켜야 한다. 더욱이, 배취 15 및 16의 경우에 있어서는 인간 혈청 알부민을 제거하여야 한다. 이는 상기 배취들이 항- β크로마토그래피 컬럼에 통과되었기 때문이다. 배취 당 초기 체적은 32ml이었다. 0.4mol/l의 Na₂HPO₃(2.1ml) 및 0.4mol/l의 Na₃PO₄(2.1ml)를 가하여 항-β크로마토그래피를 수행하기에 앞서, 배취 13 내지 16을 중화시켰다.

인터페론-β(BO2 세파로즈(sepharose) 6B, 셀테크(celltech)와 가교결합됨)에 대항하는 모노클론 항체상의 인터페론-β의 면역흡착을 위해, C10 크로마토그래피 칼럼 (Pharmacia)을 5ml의 BO2 세파로즈로 채우고, 각각 5-10 겔 체적의 PBS, 0.1 mol/l의 소듐 포스페이트 pH 2.0 및 PBS/l mol/l 로 선형 유속 1.0 cm/min하에 3번 세척하였다.

약 32 ml의 인터페론/HSA-함유 용액을 0.5 cm/분의 선형 유속에서 사용하였다.

OD가 기준선(baseline)까지 방울져 떨어질 때 까지, 1 cm/분의 선형 유속으로 10 겔 체적의 PBS/1 mol/1 KCl을 사용하여 세척하였다 1 cm/분의 선형 유속으로 약 1 - 2 겔 체적의 0.1 mol/l 소듐 포스페이트 pH 2.0를 사용하여 용출을 수행하였다. 인터페론-β는 단일 피크인 고 순도로서 얻어졌다. 이 용출액이 수반되는 단백질 특성을 위해 적당하다.

분석 절차

1. Lys-C 맵핑

아크로모백터(AP) 효소 엔도프로테이나제 Lys-C를 사용하여, 인터페론-β를 Lysin의 C-말단부로 감압하에 절단하여 12 펩티드를 얻는다.

항-β크로마토그래피로 부터 얻은 50㎕의 용출액(12.5-50㎍의 인터페론-β)을 Eppendorf 반응 용기에 담고, 이에 5㎕의 2mol/l의 TRIS를 가하였다. Wako 엔도프로테이나제를 1:10 비의 효소/기질 내에 가하였다 (50mol/l의 TRIS/HCl, pH 9.0 내 엔도프로테이나제 Lys-C 용액). 상기 용액을 혼합하고 30℃하에 2시간 동안 배양하였다. 이후, 5㎕의 0.1mol/l DTT를 상기 배취에 가하였다.

상기 펩티드는, 다이오드 정열 검출기가 장착된 HPLC 시스템 HP 1090M 시리즈를 사용하여, 214mm에서 역-상 칼럼(Vydac C18, 300Å, 5㎛, 2.1mm)으로 분리되었는데, A의 증감을 목적으로 하여 0.1% (v/v) TFA 및 B: 0.1% (v/v) TFA/70% (v/v) 아세토니트릴을 사용하였다. 상기 펩티드를 이들의 머무른 시간의 서열에 따라 연속적으로 번호를 매겼는데, 그 서열은 다음과 같다 :

참고문헌:

Utsumi와 그의 동료 (1989) : 4개의 상이한 포유류-세포로 유도된 재조합 인간 인터페론-β1의 특성화. Eur. J. Biochem. 181, 545-553.

Utsumi와 그의 동료 (1988) : 섬유아세포 인간 인터페론-β1의 구조 특성화. J. 인터페론 Res. 8, 375-384.

Allen, G. (1981) : 생화학 및 분자 생물학에 있어서의 실험실 기술. 단백질 및 펩티드의 서열화. Elsevier Verlag.

Castagnola와 그의 동료 (1988) : 단백질 서열 측정에서의 HPLC. J. 크로마토그래피 440, 213-251.

(OX)로 표시된 펩티드에 있어서, 아미노산 메티오닌은 메티오닌 설폭사이드의 형태이다. 양을 정함에 있어서는(quantification) 처리되지 않은 펩티드 및 산화된 펩티드의 총 면적에 대한 산화된 펩티드의 피크 면적의 비율을 측정함에 근거한 것이다. 산화된 메티오닌의 비율은 생생한 인터페론- β조제물에 있어서 매우 낮다. 그러나, 상기 비율은 저장 조건(완충용액, pH, 온도 등)에 의존하여 저장하는동안 철저하게 다소 증가된다. 이 변화는 인터페론-β 분자의 안정도에 영향을 끼치거나 생체 내의 특성에 상당한 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않다.

따라서, 산화된 펩티드 AP4(OX), AP6(OX), AP8(OX) 및 AP10(OX)의 비율은 액체 조제물 내 인터페론-β 분자의 화학적 보전성을 평가하기 위한 중요한 평가기준이다.

2. 탄수화물의 측정법

제 1 단계에 있어서, 올리고당을 폴리펩티드로 부터 분리하고 탈염화하였다.

약 0.7ml의 항-β크로마토그래피 용출액을 천천히 교반시키면서 500ml의 투석 완충용액(0.05mol/l 소듐 포스페이트, 0.10mol/l NaCl, pH 7.25)에 대한 투석 관(직경 6mm, 시그마 번호 D-9277) 내에서 실온하에 16 - 20 시간동안 투석하였다. 그후, 상기 관의 한쪽 말단부를 절단하여 개방하고, 상기 내용물을 Eppendorf 반응 용기 안에 밀어 넣었다. 투석 후, 상기 시료의 체적은 1ml이었다.

20㎕ 의 Tween 20 (10% 농도) 및 15㎕의 N-글리코시다제 F 용액 (Boehringer Mannheim)을 상기 투석 시료에 피펫으로 가하였다. 이 혼합물을 37℃하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양을 종료한 후, 상기 혼합물을 10,000rpm으로 10분동안 원심분리하고, 0.45㎛의 여과기를 통하여 여과한 다음, 연속하여 크로마토그래피를 수행하고 이소크라틱 증감(용출액 A: 증류수)을 갖는 탈염 칼럼(HR 10/10 Pharmacia 번호. 17-0591-01)을 사용하여 1.0ml/분의 유속으로 분류하였다. 유리된 올리고당은 206nm에서 검출되었다.

제 2 단계에서, 유리된 올리고당을 이온 교환기로 시알산 잔기의 수에 의한 작용으로 분리하였다.

상기 탈염된 칼럼의 용출액 내 함유된 올리고당(약 2mㅣ)을 음이온 교환기 (Morro Q HR 5/5, Pharmacia 번호. 17-0546-01)에 결박시켰다. 상기 아시알로 형성물은 용출액 내에 존재한다. 약간의 NaCl 증감에 따라, 모노시알로, 디시알로 및 트리시알로 형성물은 다음과 같이 나타낸 서열로 하나씩 분리되어 명백하게용출되었다.

용출액 A : Milli-Q 수

용출액 B : 0.10 mol/l NaCl

유속 : 0.75 ml/분

크로마토그래피 시간 : 26분 (재발생을 포함하여 36분)

검출 : UV 206nm

상기 각각의 올리고당 분류물은 UV 검출기로 206nm에서 검출되었다. 상기의 양적 계산은 각각의 피크 면적을 모두 합하여 수행되었다.

상기 올리고당 분류물 모노시알로, 디시알로 및 트리시알로를, 상술한 바와 같이 연속적으로 탈염화 칼럼에 통과시켰다.

제 3 단계에 있어, 상기 대전된 올리고당을 산성 pH 조건하에 말단 시알산 잔기를 가수분해로 제거함으로써 중성 올리고당으로 개질하였다.

상기 단계를 종료시키기 위하여, 15㎕의 Milli Q 수와 더불어 약 15㎕의 각각의 올리고당 분류물을 마이크로-테스트 관에 넣고, 30㎕의 10mmol/l H₂SO₄를 가하였다. 이후, 상기 혼합물을 80℃하에서 90분 동안 가열하였다.

이후, 상기 배취를 5000rpm에서 1분 동안 원심분리시키고, 작은병에 피펫으로 담았다. 중성인 상기 탄수화물을 알카리 pH에서 약 음이온에 결박하고 음이온-교환기 칼럼(CarboPac PAI(4×250mm) P/N 35391, Dionex)을 수행하였다. 다음의 용출액 증감으로 용출을 수행하였다:

용출액 A : NaOH 0.16 mol/l

용출액 B : NaOH 0.16 mol/l 소듐 아세테이트 0.10 mol/l

용출액 C ; NaOH 0.16 mol/l 소듐 아세테이트 0.75 mol/l

유속 : 1.0 ml/분

크로마토그래피 시간 : 50 분

검출기 : PAD

상기 올리고당을 측정하기 위해 PAD(펄스파 암페로메트릭 검출기; pulsed amperometric detection)를 사용하였다. 상기 올리고당 분자를 전기화학적으로 산화하고, 이후 생성된 전류를 측정하였다. PAD는 고감도로서 구별되며, 따라서 ng 범위 내의 검출도 별 어려움이 없었다. 검출기(mV) 내의 출력 신호는 탄수화물의 양에 대하여 정비례한다. 상기 피크 면적을 합하여 양(quantification)을 정하였다.

상기 탈글리코실화 및 분석을 하는 중간에, 상기 시료들을 -20℃에서 중간 저장시켰다.

참고문헌 :

Townsend (1998) : 올리고당의 고-성능 음이온-교환 크로마토그래피. 분석화학 174, 459-470.

결과

1. Lys-C 맵핑

배취 11 내지 16의 Lys-C 맵핑은 상기 펩티드의 머무른 시간 및 양적 측정에 관하여 초기값과 상이하지 않게 나타났다.

액체 저장 동안의 메티오닌 설폭사이드 함량의 측정은 하기 표 7 (3달 동안의 저장) 및 8 (6달 동안의 저장)에 나타낸 결과를 보인다.

상기 표 7은 메티오닌-함유 배취 13 및 15가 메티오닌이 배제된 배취와 비교하여 3달 동안의 저장에 있어 더 낮은 메티오닌 설폭사이드 함량을 보여줌을 나타낸 것이다. 6달 동안 저장시킨 후, 배취 11, 13 및 15 내에 가해진 메티오닌의 영향은 더욱 명백하다. 메티오닌 설폭사이드 함량에 있어서 아주 작은 증가가 상기 배취들에서 검출될 수 있었다. 메티오닌이 배제된 배취들에 있어서, 메티오닌 설폭사이드 함량이 약간 더 증가되었지만, 모든 산화된 메티오닌의 전체 함량은 10% 미만의 전체 메티오닌 함량에 달하였다.

2. 탄수화물의 측정

3 또는 6달 동안 저장한 후의 탄수화물 측정의 결과는 표 9a, 9b, 10a, 10b, 11a 및 11b에 나타내었다.

인터페론-β-1a는 정의된 서열의 1탄당(monosaccharides)들로 구성되는 이의 아미노산 사슬에 탄수화물 구조를 갖는다. 가지의 형태에 따라, 이 구조들은 2분지형(biantennary)(2개의 가지), 3분지형(triantennary)(3개의 가지) 및 4분지형(tetraantennary)(4개의 가지)으로 명명된다.

상기 탄수화물 구조는 1탄당 맨노스, 푸코스, N-아세틸글루코스아민, 갈락토스 및 시알산으로 구성된다.

이러한 관계에 있어서, 시알산은 몇몇의 관점에 있어 특이점을 갖는다:

- 이는 대전된 그룹(카복실 그룹)을 갖는 1탄당이다.

- 이는 항상 탄수화물 사슬의 말단에서 얻어진다.

- 이는 잔류하는 1탄당 보다 더 용이하게 효소작용으로 또는 가수분해로서 상당히 제저될 수 있다.

- 중성 탄수화물 사슬의 구조는 상당히 일정한 반면, 시알산 부분은 특히 인터페론의 정제 및 세포 배양에 따라 상당히 다양해진다.

참고문헌 :

Kagawa 및 그의 동료. J. Biol. Chem. 263 (1998), 17508-17515; EP-A-0 529 300.

3달 동안의 저장(표 9a) 또는 6달 동안의 저장(표 9b) 후에 시알로 형태 (각각의 시알로 구조의 %)를 조사하였다. 말단 시알산을 함유하지 않는 탄수화물 구조는 아실알로로 명명된다. 한개의 말단 시알산을 함유하는 탄수화물 구조는 모노시알로로 명명된다. 두개의 말단 시알산을 함유하는 탄수화물 구조는 디시알로로 명명된다. 세개의 말단 시알산을 함유하는 탄수화물 구조는 트리시알로로 명명된다.

더욱이, 상기 분지도(antennarity; 각각의 분지형의 함량 %)를 3달 동안 저장(표 10a) 및 6달 동안 저장(표 10b)한 후에 측정하였다. 한개의 분지와 두개의 말단 갈락토스를 갖는 탄수화물 구조는 2분지형으로 명명된다. 이는 0 내지 2개의 말단 시알산을 가질 수 있다. 2개의 분지와 3개의 말단 갈락토스를 갖는 탄수화물 구조는 3분지형으로 명명된다. 이는 0 내지 3개의 말단 시알산을 가질 수 있다.

또한, 3달 동안의 저장(표 11a) 및 6달 동안의 저장(표 11b) 후 시알릴화의 정도(시알산이 갖는 말단 갈락토스 잔기가 차지하는 함량%)를 조사하였다.

상기 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, pH 5에서의 저장은 미약하지만 재생가능한 탈시알화를 일으킬 수 있다. pH 7에서의 저장은 시알릴화의 정도에 영향을 주지 않는다.

배취 15 및 16에 관하여 기술된 아푸코(afuco) 함량은 아마도 상기 가해진 인간 혈청 알부민으로 부터 얻은 외래 단백질에 기한 것인데, 이는 항-β크로마토그래피에 의해 양적으로 제거되지 않는다.

상기 분지형에 관하여, 액체 저장은 측정가능한 결과가 얻어지지 않았다.

Claims

활성성분으로서 농도 25 MU/ml 이하의 인간 인터페론-β 및 pH를 5-8로 세팅시키기 위한 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민이 없으며 25℃에서 3달간 저장후 생물학적 활성(시험관내)이 초기 활성의 80% 이상인 장기간 안정성을 보이는 액체 조제물.
활성성분으로서 인간 인터페론-β 및 pH를 6-7.2로 세팅시키기 위한 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민이 없으며 25℃에서 3달간 저장후 생물학적 활성(시험관내)이 초기 활성의 80% 이상인 장기간 안정성을 보이는 액체 조제물.
활성성분으로서 인간 인터페론-β, pH를 5-8로 세팅시키기 위한 완충제 및 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 25℃에서 3달간 저장후 생물학적 활성(시험관내)이 초기 활성의 80% 이상인 장기간 안정성을 보이는 액체 조제물.
제1항에 있어서, 글리코실화된 인터페론-β를 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제2항에 있어서, 인터페론-β가 CHO 세포들에서 유래하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 10 mmol/l - 1 mol/l 농도의 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물,
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충액 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제7항에 있어서, 포스페이트/시트레이트 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 6-7.2인 것을 특징으로 하는 조제물.
제3항에 있어서, 인간 혈청 알부민이 없는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 활성성분은 차치하고 인간 또는 동물 폴리펩티드가 없는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 없는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서 6달간 저장후 화학적 통합성을 보이는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서 6달간 저장후 물리적 통합성을 보이는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제3항 또는 제15항에 있어서, 메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제16항에 있어서, 메티오닌이 0.1-4 mmol/l의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 강장 조절용 보조물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 점도 증대용 증량제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조제물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 액체 조제물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 제조물.
제21항에 있어서, 경구, 비경구 또는 안과학적으로 투여하는 제약학적 제조물.
제21항 또는 제22항에 있어서, 1-25 MU의 단위 사용량을 가지는 액체 제조물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조제물 및 적절할 경우 필요한 기타 제약학적 조제 보조물을 제조하여 적당한 투약 형태로 조제하는 것을 특징으로 하는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제약학적 제조물을 제조하는 방법.
인간 혈청 알부민이 없고 및/또는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 조제물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 활성성분으로서 인간 인터페론-β 및 pH를 5-8로 세팅시키기 위한 완충제를 포함하는 액체 조제물의 저장수명을 개선시키는 방법.
제25항에 있어서, 개선된 저장수명이 생물학적 활성(시험관내), 화학적 통합성 및/또는 물리적 통합성의 개선된 장기간 안정성에 관하는 것을 특징으로 하는 방법.