KR100711990B1

KR100711990B1 - 액상 인터페론-베타 제제

Info

Publication number: KR100711990B1
Application number: KR1020007003036A
Authority: KR
Inventors: 최페미하일; 지클로지토마스; 슈뢰더페터; 호퍼한스
Original assignee: 렌트슐러 비오테히놀로기 게엠베하
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2007-05-02
Also published as: JP4293497B2; EP1017413B2; CA2304808A1; CA2304808C; AU9627698A; EP1224940B2; ATE224726T1; ES2223017T3; IL135186A; AU741300B2; KR100826621B1; DK1017413T4; EP1224940B1; WO1999015193A1; EP1224940A8; ATE274917T1; KR20060088910A; PT1017413E; ES2223017T5; DE59811910D1

Abstract

본 발명은 인간 인터페론-β의 액상 제제에 관한다. 이 제제는 pH가 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 약산성 내지 중성 범위인 완충제를 포함하고, 분자 무결성을 보유하면서 용액내 인터페론-β의 안정성이 높은 것을 특징으로 한다.

Description

액상 인터페론-베타 제제{LIQUID INTERFERON-β FORMULATIONS}

본 발명은 인간의 인터페론-β 액상 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 5-8 사이의 약산성 내지 중성의 pH 범위를 가진다는 것과 인터페론-β가 분자 무결성(integrity)을 보유하면서 용액에서 매우 안정하다는 것을 특징으로 한다.

자연적으로 발생하는 인터페론은 바이러스, 이중가닥 RNA, 기타 폴리누클레오티드 및 항원으로 유도된 후 여러가지 체세포에 의하여 생성되는 종-특이적인 단백질이며, 몇몇의 경우 글리코단백질이다. 인터페론은 예를 들어 항바이러스, 항증식 및 면역조절 특성과 같은 많은 생물학적 활성을 보인다. 3가지 이상의 서로 다른 종류의 인간 인터페론이 확인되었는데 이들은 백혈구, 림프구, 섬유 아세포, 및 면역 시스템 세포들에 의하여 생성되어 α-, β- 및 γ-인터페론으로 명명된다. 각 형태의 인터페론은 다수의 서브타입으로 더 나눌 수 있다.

본래의 인간 인터페론-β는 폴리-IC로 인간의 섬유 아세포 배양을 초과 유도한 다음 크로마토그래피 및 전기영동 기법으로 인터페론-β를 분리 및 정제하여 상품으로 제조할 수 있다. 천연 인터페론-β와 유사한 특성을 보이는 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수도 있다(EP-A-0 028 033; EP-A-0 041 313; EP-A-0 070 906; EP-A-0 287 075; Chernajovsky등 (1984) DNA 3, 297-308; McCormic등 (1984) Mol. Cell. Biol. 4. 166-172). 재조합 인간 인터페론-β는 진핵세포(예를들어 CHO 세포) 및 원핵세포(예를들어 E. coli)에서 생성될 수 있다. 이러한 인터페론은 각각 인터페론-β-1a 및 인터페론-β-1b라 불린다. 인터페론-β-1b와는 대조적으로 인터페론-β-1a는 글리코실화된다(Goodkin(1994) Lancet 344, 1057-1060).

인터페론-β를 치료용으로 사용하기 위한 전제조건은 이것이 분자의 무결성을 유지하면서 단백질이 장기간 저장에 안정하도록 약제학적으로 제제화 된다는 것이다. 인터페론-β는 불안정하여 여러가지 분해 반응을 거치게 된다. 여기에는 특히 펩티드 결합의 분해, 탈아미드화, 메티오닌 설파이드로 메티오닌의 산화, 디설파이드 교환, 및 탈글리코실화를 포함하는 당 측쇄의 변화가 포함된다.

인터페론의 치료학적 이점 때문에 최근 일련의 제제가 개발되었으나 이들 모두는 어떤 단점을 나타낸다. 미국 특허 제4,647,454호(Inter-Yeda Ltd.)는 높은 산성 범위(pH 3.5)의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 가하여 안정화시킬 수 있는 섬유아세포 인터페론-β 제제에 대하여 기술하고 있다. 다른 바람직한 보조물은 마니톨, 인간 혈청 알부민 및 아세테이트 완충액이다. 상기 제제는 동결 건조시켜 4℃에서 보관한다.

일본 특허 제59 181 224호(Sumitomo Chemical Co.)는 인터페론을 안정화시키기 위하여 인간 혈청 알부민과 함께 아르기닌, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 리신, 세린, 및 트레오닌과 같은 극성 아미노산 및 이들의 소듐염을 사용하는 수성 인터페론 용액에 대하여 기술하고 있다.

국제 특허 출원 제WO 95/31213호(Applied Research Systems ARS 보유)는 폴리올, 바람직하게는 만니톨 및 비환원당 또는 아미노산을 가함으로써 안정화되는 인터페론-β 액상 제제에 대하여 기술하고 있다. 상기 제제는 완충액(아세테이트 완충액 pH 3.0-4.0) 및 인간 혈청 알부민을 더 포함한다. pH 5-6의 제제는 즉각적인 생물학적 활성의 손실을 나타내는데 반해 상기 특허 명세서에서 바람직한 제제는 pH 3.0 및 4.0에서 충분히 안정하다. 또한, 안정성에 대한 여기에서의 언급은 제제의 생물학적 활성만을 말하는 것이며, 활성 성분의 분자 무결성을 일컫는 것은 아니다.

유럽 특허 출원 제EP 0 215 658호(Cetus Corp.)는 인간 혈청 알부민 또는 인간 혈장 단백질 분획 및 적절한 경우 덱스트로즈와 같은 안정화제를 가하여 pH 2-4의 수성 매질내에 생활성 화합물을 용해시킨 재조합 인터페론-β 제제에 대하여 기술하고 있다. Cetus Corp.의 또다른 특허 출원(제WO 89/05 158호)은 평균 분자량이 190-1600 달톤인 글리세린 또는 폴리에틸렌 글리코폴리머를 pH 2-4에서 안정화제로 사용하는 인터페론-β 제제에 대하여 기술하고 있다. 언급된 적절한 완충액 성분은 글리신, 포스포르산 및 시트르산이다.

유럽 특허 출원 제EP 0 217 645호(Cetus Corp.)는 pH 7-8의 매질에 용해시키고 계면활성제로서 소듐 라우레이트를 가하여 안정화시킨 IL-2 또는 인터페론-β를 함유하는 약제학적 제제에 대하여 기술하고 있다. 또한, 이들 제제를 안정화시키기 위하여 SDS가 추가의 이온성 계면활성제로서 필요하다.

유럽 특허 제EP 0 270 799호(Cetus Oncology Corp.)는 안정화제로서 비이온성 폴리머 세제를 포함하는 비활성 수성 부형제 매질내의 글리코실화되지 않은 재조합 인터페론-β 제제에 대하여 기술하고 있다.

유럽 특허 출원 제EP 0 529 300호(Rentschler Biotechnologie GmbH)는 농도 30 또는 70 MU/ml의 재조합 IFN-β, 소듐 클로라이드 및 이미다졸 완충액 또는 소듐 포스페이트 완충액을 포함하고 pH가 7.5인(실시예 3) 액체 인터페론-β 제제에 대하여 기술하고 있다. 이들 제제는 25℃의 저장온도에서 4주동안 생물학적 활성이 안정하다. 그러나 이들 제제의 단점은 사용되는 인터페론-β의 농도가 실제로 적용하기에는 너무 높다(30 MU/ml 이상)는 것이다. 또한 제EP-A-0 529 300호에는 인간 혈청 알부민의 부가로 인해 인터페론-β의 안정성이 감소되는 것에 대한 언급이 없다. 대조적으로 인간 혈청 알부민의 부가가 바람직한 것으로 기술되어 있다.

인터페론-β 제제 외에, 인터페론-α의 약제학적 제형 또한 기술되어 있다. 유럽 특허 명세서 제0 082 481호(Schering Corp.)는 글리신 및 포스페이트 완충액 외에 인간 혈청 알부민을 포함하는 동결 건조를 위한 수성 제제에 대하여 기술하고 있다. 알라닌은 추가의 선택저인 성분으로 언급되어 있다. 재구성후 용액의 pH는 7.0-7.4이다. Schering Corp.의 또다른 특허 출원(제WO 96/11018호)은 킬레이트제(NaEDTA 또는 시트르산), 계면활성제(Polysorbat 80), 등장화제(소듐 클로라이드) 및 pH 4.5-7.1의 메틸파라벤, 프로필파라벤, m-크레졸 또는 페놀과 같은 적절한 보존제를 포함하는 인터페론-α의 안정한 수성 용액을 제시하고 있다. 생물학적 활성(W.P. Protzman이 J. Clinical Microbiology, 1985, 22, pp.596-599에 기술한 바와 같은 바이러스의 세포변성 효과(CPE)를 저해하는 표준 방법)과 관련하여, 개시된 상기 수성 제제는 25℃에서 6달동안 안정한 것으로 밝혀졌다(생물학적 활성은 초기 활성의 90%가 넘음). 그러나 동시에 수행된 HPLC에 의하여 단백질 함량을 측정하였더니 25℃에서 6달 후 20.2(표3) 또는 32.5%(표4)의 함량 손실을 나타냈다.

제EP-A-0 736 303호(Hoffman-LaRoche AG)는 인터페론-α외에 비이온성 세제, pH를 4.5-5.5로 세팅시키기 위한 완충제, 벤질 알콜 및 적절할 경우 등장제를 포함하는 수성 인터페론-α 조성물을 개시하고 있다. HPLC에 의한 측정은 18 MU 인터페론-α2a의 출발 농도 및 25℃에서 3달동안 저장한후 84.5%의 잔류 농도를 나타내는 반면 이 수치는 안정화제 벤질 알콜을 생략할 경우 62.8%로 떨어진다.

제EP-A-0 641 567호(Ciba Geigy AG)는 하이브리드 인터페론-α 및 안정화제로서 pH 3.0 및 5.0의 완충액을 포함하는 약제학적 조성물에 대하여 기술하고 있다.

미국 특허 제5,358,708호(Schering Corp.)는 안정화제로서 메티오닌, 히스티딘 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수성 인터페론-α 제제에 대하여 기술하고 있다. 40℃에서 2주간 인터페론-α 용액을 저장한후 활성 성분 함량이 20% 감소하는 것으로 나타났다.

전술한 인터페론 제제는 예를들어 혈액 공급자에 의한 바이러스 감염으로부터의 안전성이 매우 요구되므로 단백질을 안정화시키기 위한 인간 혈청 알부민의 부가가 없어야 하는 까닭에 현재로서는 단점을 가진다. 또한, 다수의 상기 제제는 아미노산의 부가 및/또는 동결-건조를 필요로한다. 그러나 동결건조된 제품은 제조하기 복잡하기 때문에 고가이고 재구성할 필요가 있어 추가의 경로를 요하는데 이러한 추가 경로는 특히 운동력이 제한되어 있는 환자들이 종종 수행하기 어렵다. 일련의 제제들은 5.0 이하의 비생리학적인 pH 값을 가진다. 이러한 수치가 완전히 이상한 것은 아니나(S. Sweetana 및 N.J. Aders의 Journal of Pharmaceutical Sciences and Technology, 1996, 50:330-342를 참조하시오) 근육내 또는 피하 투약의 경우 고통스러운 자극을 예상하여야 한다. Sweetana 및 Akers에 따르면 Polysorbat 80과 같은 계면활성제의 사용을 허용할 수 있으나 특히 신생아 및 아동에게 이러한 문제의 여지가 있는 보조물의 사용이 야기하는 일련의 부작용을 기술하였다. Attwood 및 Florence(Surfactant Systems, their Chemistry, Pharmacy and Biology, Chapman and Hall; 런던 1983)에서 이러한 계면활성제의 독성에 대한 재검토를 볼 수 있다. Polysorbat 80의 약리학적 특성을 R.K.Varma등이 재검토하였다(Arzneim.-Forsch./Drug Res. 35, 1985, 804-808).

전술한 단점을 기초로 할때, 최적의 인터페론-β 제제는 다음 특성을 가져야한다:

- 저장시 생물학적 활성을 보유할 것,

- 저장시 활성 성분 분자의 분자 무결성을 보유할 것,

- 고가의 동결-건조 및 추가의 재구성을 하지 않는 액상 제제일 것.

- 계면활성제(세제) 또는 인간 혈청 알부민과 같은 위협성 보조제이 없을 것,

- pH가 중성 내지 약산의 범위일 것.

모든 조건을 본 발명은 만족시키고 있는데 이것은 이어지는 단락에서 상세히 기술한다.

놀랍게도 바람직하지 않은 것으로 공지된 선행기술의 보조제에 의존하지 않고도 5-8, 바람직하게는 pH 5.5-8 범위의 생리학적 pH에서 장기간 액상 제제의 인터페론-β의 분자 무결성을 확보하는 조성물을 발견하였다.

따라서 본 발명의 제1 측면은 활성 성분으로서 25MU/ml 이하 농도의 인간 인터페론-β 및 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 pH를 세팅하는 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민이 존재하지 않으며 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 나타내는 액상 약제학적 제제이다.

본 발명의 제2 측면은 활성 성분으로서 인간 인터페론-β 및 6-7.2의 pH를 세팅하는 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민을 함유하지 않으며 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 나타내는 액상 약제학적 제제이다.

본 발명의 제3 측면은 활성 성분으로서 인간 IFN-β, 5-8, 바람직하게는 5.5-8의 pH를 세팅하는 완충제, 및 하나 이상의 아미노산을 포함하고 25℃에서 3달간 저장후 초기 활성의 80% 이상의 생물학적 활성(시험관내)의 장기간 안정성을 나타내는 액상 약제학적 제제가다.

액상 약제학적 제제의 장기간 안정성은 25℃에서 측정하였다. 한편으로는 가속화된 분해 반응을 일으키기 위하여, 다른 한편으로는 불필요한 고온으로 야기되는 인위구조를 피하기 위하여 25℃의 온도를 선택하였다. 인터페론-β의 안정성을 측정하는 적당한 분석 방법은 J. Geigert(J. Parent. Sci. Technol. 43 (1989), 220-224) 또는 M. C. Manning, K. Patel 및 R. T. Borchardt(Pharm. Res. 6 (1989), 903-918)에서 알아낼 수 있다.

각 경우 선택된 저장 기간후 생물학적 활성은 바이러스의 세포변화 효과를 저해하는 표준 방법으로 측정하였다. 사용되는 테스트 방법의 상세한 설명은 Stewart, W.E. II(1981):The Interferon System(제2 증보판), Springer-Verlag:뉴욕, 비엔나; Grossberg, S.E.등(1984), Assay of Interferons. In:Came, P. E., Carter W. A.(eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag:베를린, 하이델베르크, 뉴욕, 동경, pp.23-43에서 찾아볼 수 있다. 25℃에서 6달간 저장한 후 본 발명 제제는 초기 활성의 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 생물학적 활성을 가진다.

예를들어 37℃에서와 같은 고온에서 저장할 경우에도 본 발명 제제는 놀랍게도 장기간 높은 안정성의 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어 37℃에서 한달간 저장한 후 초기 활성의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 생물학적 활성이 발견된다.

본 발명 액체 약제학적 제제는 바람직하게는 인간 혈청 알부민이 없고 특히 바람직하게는 활성 성분은 차치하고 특히 인간 또는 동물 폴리펩티드, 특히 혈청 단백질이 없다. 본 발명 액상 약제학적 제제는 계면활성제, 특히 이온성 계면활성제 및/또는 비이온성 계면활성제가 없는 것이 더 바람직하다.

본 발명의 제제는 활성성분으로서 인터페론-β, 즉 천연 인간 인터페론-β의 생물학적 및/또는 면역학적 특성을 나타내고, 자연적으로 발생하는 또는 재조합 인터페론-β일 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 제제는 바람직하게는 글리코실화된 인터페론-β, 특히 바람직하게는 CHO 세포로부터 얻는 재조합 인터페론-β를 포함한다. 가장 바람직하게 사용되는 인터페론-β 종은 예를들어 BIC 8622(ECACC 87 04 03 01)에서 얻을 수 있는, 예를들어 제EP-B-0 287 075호 및 제EP-A-0 529 300호에 기술된 것들이다.

바람직하게는 활성성분은 25MU/ml 이하의 농도로 본 발명 제제내 존재한다. 그러나, 1-25MU/ml의 투약량이 바람직하고 3-20MU/ml가 특히 바람직하며 3-10MU/ml가 가장 바람직하다. 이 범위의 투약량은 고온에서 안정성이 특히 양호하며 추가로 희석시키지 않고도 즉시 사용할 수 있게 한다.

본 발명 액상 약제학적 제제의 또다른 바람직한 특징은 25℃에서 3달간, 바람직하게는 6달간 저장후에도 화학적인 무결성을 보인다는 것, 즉 펩티드 분해, 산화 및 탈글리코실화에 안정하다는 것이다. 화학적 무결성은 펩티드 맵핑, 웨스턴 블롯 및 글리코실화 분석에 의하여 측정한다. 제제화 후 인터페론-β가 선택된 저장 조건에서 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 화학적 무결성을 보유하는 조성물이 본 발명 목적에서 화학적으로 안정한 것이다.

본 발명 액상 약제학적 제제의 또다른 바람직한 특징은 25℃에서 3달간, 바람직하게는 6달간 저장한 후의 물리적 무결성이다. 이 경우 물리적 무결성은 420nm에서 투과도를 측정하고 용액을 육안으로 관찰하여 측정한다. 선택된 저장 조건에서 투과도가 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상이고 육안 관찰시 혼탁함이 관찰되지 않는 용액이 물리적으로 안정한 것이다.

본 발명은 놀랍게도 저장시 생물학적, 화학적 및 물리적으로 안정하고 예를들어 인간 혈청 알부민 또는 계면활성제와 같은 바람직하지 않은 성분이 없는 인터페론-β 제제의 제공을 가능하게 한다. 본 발명의 제제는 활성성분 외에 바람직하게는 10 mmol/l - 1 mol/l, 특히 바람직하게는 20 mmol/l - 200 mmol/l, 예를들어 대략 50 mmol/l - 100 mmol/l의 농도로 존재하고 제제의 pH를 5-8, 바람직하게는 5.5-8 이상, 더 바람직하게는 6-7.4 범위로 유지하는 역할을 하는 완충제를 포함한다. 6-7.2의 pH 범위가 특히 바람직하고 6.2-6.8의 pH 범위가 가장 바람직한데 이 범위에서 분자 무결성이 유지되면서 특히 높은 안정성이 얻어지기 때문이다. 완충액은 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예를들어 보레이트, 숙시네이트, L-말레이트, TRIS, 살리실레이트, 글리실글리신, 트리에탄올아민, 이소시트레이트, 말레에이트, 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충액 또는 이들의 혼합물에서 선택된다. 바람직하게는 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충액 또는 이들의 혼합물이 사용되며 포스페이트/시트레이트 완충액이 특히 바람직하다.

본 발명 제제는 활성성분 및 완충액 외에 기타 생리학적으로 허용가능한 보조제, 예를들어 혈액 또는 조직의 삼투압에 삼투압을 맞추기 위한 보조제, 예를들어 비환원당, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨 또는 글리세린과 같은 당알콜을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 알라닌, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 및/또는 메티오닌과 같은 하나 이상의 아미노산을 본 발명의 제제에 가하여 화학적 안정성을 증가시킬 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서 메티오닌이 바람직하다. 메티오닌 농도는 바람직하게는 0.1-4 mmol/l 범위이다. 특히 2mmol/l의 농도가 바람직하다. 또한, 본 제제는 예를 들어 안과학적 목적에서 점도 증대용의 증량제를 포함할 수 있을 것이다. 적당한 증량제의 예로는 안과학적으로 적절한 중합체, 예를들어 Carbopol, 메틸셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈 등이 있다.

또한, 본 발명 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 안과학적인 목적에서 예를 들어 티오메르살레이트를 0.001-0.004% w/v의 양으로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 기술한 바와 같은 액체 인터페론-β-함유 제제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 이들 약제학적 제제는 경구, 비경구 또는 안과학적인 적용에 특히 적절하다. 본 제제는 바람직하게는 1-25MU IFN-β의 단위 투여량으로 존재한다. 본 발명은 또한 본 발명의 제제 및 적절할 경우 필요한 기타의 약제학적 제제 보조제를 제조하여 적절한 제형으로 제제화하는, 상기 약제학적 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제제는 약제학적으로 허용가능한 고무 스탑퍼가 장착된 적당한 살균 및 소독된 유리 바이알(가수분해류 1)내에 저장할 수 있다.

또한, 본 발명의 제제는 즉시 사용 가능한(ready-to-use) 주사기 또는 자기-주사 시스템용 캡슐내에 패킹하여 사용할 수 있다. 이것은 바람직하지 않으나 당업자에 공지된 기타의 보조제를 가하여 동결-건조시키고 재구성후 액체 형태로 사용할 수 있다.

적당한 보존제를 사용하여 여러번 사용하는 액상 제제, 점안액 및 한방울씩 경구 투약하는 용액을 제조할 수 있다.

적절한 제형을 제조하는데 추가적으로 필요한 보조제는 당업자에 공지되어 있다.

최종적으로 본 발명은 인간 혈청 알부민이 없고 하나 이상의 아미노산을 함유하는 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 활성성분으로서 인간 인터페론-β 및 pH를 5-8, 바람직하게는 5.5-8로 세팅하기 위한 완충제를 포함하는 액상 제제의 유효기간을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 유효기간의 개선은 상기 나타낸 바와 같은 생물학적 활성(시험관내), 화학적 무결성 및/또는 물리적 무결성의 개선된 장기간 안정성과 관련된다.

본 발명을 다음 실시예에 의해 더욱 설명하고자 한다.

CHO 세포로부터 얻은 인터페론-β를 하기 모든 실시예에 사용하였다.

1. 25℃에서의 액체 인터페론-β제제의 장-기간 안정성

하기 제제들을 테스트하였다.

제제 1 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트 pH 5.0

제제 2 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민, 2 mmol/l의 메티오닌, 50 mg/ml의 글리세린

제제 3 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 50 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

제제 4 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 2 mmol/l의 메티오닌

제제 5 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0

제제 17 : 70 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 6.5

상기 제제를 약 10 내지 15 MU/ml (즉, 10 내지 15×10⁶ IU/ml)의 함량으로 희석시켰다.

제제 17(상기 참조)을 제외하고는, 상기 제제를 상업상 이용가능한 클로로부틸 고무 마개를 사용하여 밀봉되는 가수분해 등급 1의 유리 바이알(DIN 2R 유리 바이알)에 지시된 기간동안 25℃로 저장하였다. Stewart, W.E.II(1981): 인터페론 시스템 (제2판, 증보판) Springer-Verlag: 비엔나, 뉴욕; Grossberg, S.E. 등(1984)의 인터페론의 분석. In: Came, P.E., Carter W.A. (eds.) 인터페론 및 이들의 출원, Springer-Verlag; 베를린, 하이델베르그, 뉴욕, 도꾜, pp. 23-43에 기술된 바와 같이, (in vitro) 생물학적 활성을 측정하였다.

삭제

상기의 결과는 표 1 내지 5에 나타내었다. " % (ref.) " 는 지시된 기간동안 -20℃에서 저장되었던 참조 시료의 생물학적 활성을 기준으로 하는 생물학적 활성을 나타내는 것이다. " %(0mo) " 는 0 달에서의 초기값을 기준으로 하는 생물학상 활성도의 % 함량이다.

상기 표를 통해 알 수 있는 바와 같이, 인간 혈청 알부민(제제 1, 3, 4, 5)을 함유하지 않는 제제는 인간 혈청 알부민(제제 2)을 포함하는 제제보다 놀랍게도 더 우수한 안정성을 갖는다.

제제 17(상기 참조)에 있어서, 인간 혈청 알부민이 배제된 인터페론 용액은 무균 조건하에 6 MU/0.5 ml의 활성도를 나타내었다. 무색의 깨끗한 용액을 연이어 여과-살균하고, 0.5-ml의 분액을 예비-살균된 일회용 주사기에 가득채워 밀봉하였다. 상기 즉시 사용가능한 주사기를 25℃에 저장하고, 투명도, pH 및 생물학상 활성도를 측정하였다. 다음과 같은 결과가 얻어졌다:

2. 37℃에서의 액체 IFN-β제제의 장기간 안정성

예비용 주사기 내의 하기 제제를 테스트하였다:

제제 6 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0, 2 mmol/l의 메티오닌

제제 7 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 5.0, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

제제 8 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 5.0, 18 mg/ml의 글리세린, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민, 2 mmol/l의 메티오닌

제제 9 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 6.0, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol의 메티오닌

제제 10 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, pH 6.5, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌

상기 제제들을 0.5ml 당 3MU의 투약 농도(dosage strength; 투약 농도 3), 0.5ml 당 6MU의 투약 농도(투약 농도6) 및 12 MU/ml (투약 농도 12)로 측정하였다.

상기 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6의 결과로 알 수 있는 바와 같이, 놀랍게도 인간 혈청 알부민이 배제된 본 발명에 따른 제제가 37℃에서 개선된 안정성을 갖는 것으로 나타났다.

3. 25℃에서의 화학적 안정도

IFN-β의 액상 제제의 화학적 안정성을 평가하기 위하여, 7개의 뱃치를 제제화하고, 25℃하에 저장하였다. 3달과 6달이 경과된 후, 상기 단백질을 Lys-C 맵핑(mapping)과 완전한 탄수화물의 분석에 으해 분석하였다. 메티오닌 설폭사이드 및 탈시알릴화(desialylation)의 형성을 특히 주의깊게 검사하였다.

제제 10(상기 참조)과 더불어, 다음과 같은 제제들을 테스트하였다:

제제 11 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트, 2 mmol/l의 메틸오닌 pH 7.0 내지 7.2

제제 12 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 50 mmol/l의 소듐 포스페이트 pH 7.0 내지 7.2

제제 13 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 5.0 내지 5.2

제제 14 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 18 mg/ml의 글리세린, pH 5.0 내지 5.2

제제 15 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민(의약 등급), 18 mg/ml의 글리세린, 2 mmol/l의 메티오닌, pH 5.0 내지 5.2

제제 16 : 50 mmol/l의 소듐 시트레이트, 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민(의약 등급), 18 mg/ml의 글리세린, pH 5.0 내지 5.2(비교)

모든 뱃치에 있어서, INF-β함량은 10 내지 11 MU/ml이었다.

테스트 절차

상기 분석을 수행하기 위해서는 상기 시료를 농축시켜야 한다. 더욱이, 뱃치 15 및 16의 경우에 있어서는 인간 혈청 알부민을 제거하여야 한다. 이것이 상기 뱃치들을 항- β크로마토그래피 컬럼에 통과시킨 이유이다. 뱃치 당 초기 체적은 32ml이었다. 0.4mol/l의 Na₂HPO₃ (2.1ml) 및 0.4mol/l의 Na₃PO₄(2.1ml)를 가하여 항-β크로마토그래피를 수행하기에 앞서, 뱃치 13 내지 16을 중화시켰다.

인터페론-β(BO2 세파로즈(sepharose) 6B, 셀테크(celltech)와 가교결합됨)에 대한 모노클로날 항체에 인터페론-β를 면역흡착(immunoadsorption)시키기 위해, C10 크로마토그래피 칼럼 (Pharmacia)을 5ml의 BO2 세파로즈로 채우고, 각각 5-10 겔 체적의 PBS, 0.1 mol/l의 소듐 포스페이트 pH 2.0 및 PBS/l mol/l 로 선형 유속 1.0 cm/min하에 3번 세척하였다.

약 32 ml의 인터페론/HSA-함유 용액을 0.5 cm/분의 선형 유속으로 적용하였다.

OD가 기저선(baseline)까지 떨어질 때 까지, 1 cm/분의 선형 유속으로 10 겔 체적의 PBS/1 mol/1 KCl을 사용하여 세척하였다 1 cm/분의 선형 유속으로 약 1 - 2 겔 체적의 0.1 mol/l 소듐 포스페이트 pH 2.0를 사용하여 용출을 수행하였다. 인터페론-β는 고순도의 단일 피크로서 얻어졌다. 이 용리액이 이후의 단백질 분석을 위해 적절하다.

분석 절차

1. Lys-C 맵핑

아크로모백터(AP) 효소 엔도프로티나제 Lys-C를 사용하여, 인터페론-β를 Lysin의 C-말단부의 환원조건 하에서 분리시켜 12개의 펩티드를 얻는다.

항-β크로마토그래피로부터 얻은 50㎕의 용리액(12.5-50㎍의 인터페론-β)을 Eppendorf 반응 용기에 담고, 이에 5㎕의 2mol/l의 TRIS를 가하였다. Wako 엔도프로티나제를 1:10의 효소/기질 비율로 가하였다 (50mol/l의 TRIS/HCl, pH 9.0 중의 엔도프로테이나제 Lys-C 용액). 상기 용액을 혼합하고 30℃하에 2시간 동안 배양하였다. 이후, 5㎕의 0.1mol/l DTT를 상기 뱃치에 가하였다.

다이오드 어레이 검출기가 장착된 HPLC 시스템 HP 1090M 시리즈 상에서, 214mm에서 역-상 칼럼(Vydac C18, 300Å, 5㎛, 2.1mm)을 이용하여 펩티드를 분리하였으며, 이를 위해서 A: 0.1% (v/v) TFA 및 B: 0.1% (v/v) TFA/70% (v/v) 아세토니트릴의 경사도를 사용하였다. 상기 펩티드를 이들의 머무름 시간의 순서에 따라 연속적으로 번호를 매겼는데, 그 순서는 다음과 같다 :

참고문헌:

Utsumi와 그의 동료 (1989) : 4개의 상이한 포유류-세포로 유도된 재조합 인간 인터페론-β1의 특성화. Eur. J. Biochem. 181, 545-553.

Utsumi와 그의 동료 (1988) : 섬유아세포 인간 인터페론-β1의 구조 특성화. J. 인터페론 Res. 8, 375-384.

Allen, G. (1981) : 생화학 및 분자 생물학에 있어서의 실험실 기술. 단백질 및 펩티드의 서열화. Elsevier Verlag.

Castagnola와 그의 동료 (1988) : 단백질 서열 측정에서의 HPLC. J. 크로마토그래피 440, 213-251.

(OX)로 표시된 펩티드에 있어서, 아미노산 메티오닌은 메티오닌 설폭사이드의 형태이다. 정량에 있어서는(quantification) 온전한 펩티드 및 산화된 펩티드의 총 면적에 대한 산화된 펩티드의 피크 면적의 비율을 측정하는 것에 근거한다. 산화된 메티오닌의 비율은 신선한 인터페론- β 제제에 있어서 매우 낮다. 그러나, 상기 비율은 저장 조건(완충용액, pH, 온도 등)에 의존하여 저장하는 동안 철저하게 다소 증가된다. 이러한 변화는 인터페론-β 분자의 불안정성의 원인으로 작용하거나 in-vitro 특성에 상당한 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않다.

따라서, 산화된 펩티드 AP4(OX), AP6(OX), AP8(OX) 및 AP10(OX)의 비율은 액상 제제 내 인터페론-β 분자의 화학적 무결성을 평가하기 위한 중요한 평가기준이다.

2. 탄수화물의 측정법

제 1 단계에 있어서, 올리고당을 폴리펩티드로부터 분리하고 탈염화하였다.

약 0.7ml의 항-β크로마토그래피 용리액을 투석 관(직경 6mm, 시그마 번호 D-9277) 내에서 천천히 교반시키면서 500ml의 투석 완충용액(0.05mol/l 소듐 포스페이트, 0.10mol/l NaCl, pH 7.25)에 대해서 실온하에 16 - 20 시간동안 투석하였다. 그후, 상기 관의 한쪽 말단부를 절단하여 개방하고, 상기 내용물을 Eppendorf 반응 용기 안에 밀어 넣었다. 투석 후, 상기 시료의 체적은 1ml이었다.

20㎕ 의 Tween 20 (10% 농도) 및 15㎕의 N-글리코시다제 F 용액 (Boehringer Mannheim)을 상기 투석된 시료에 피펫을 이용하여 가했다. 이 혼합물을 37℃하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양을 종료한 후, 상기 혼합물을 10,000rpm으로 10분동안 원심분리하고, 0.45㎛의 여과기를 통하여 여과한 다음, 연속하여 크로마토그래피를 수행하고 등용매 경사(isocratic gradient)(용리액 A: 증류수)를 갖는 탈염 칼럼(HR 10/10 Pharmacia 번호. 17-0591-01)을 사용하여 1.0ml/분의 유속으로 분획하였다. 유리된 올리고당은 206nm에서 검출되었다.

제 2 단계에서는, 유리된 올리고당을 이온 교환기로 시알산 잔기의 수함수로 분리하였다.

상기 탈염된 칼럼의 용리액 내 함유된 올리고당(약 2mㅣ)을 음이온 교환기 (Morro Q HR 5/5, Pharmacia 번호. 17-0546-01)에 결합시켰다. 상기 아시알로(asialo) 형태는 용리액 내에 존재한다. 약간의 NaCl 경사에 의해, 모노시알로, 디시알로 및 트리시알로 형성물은 다음과 같은 순서대로 하나씩 분리되어 명백하게용출되었다.

용리액 A : Milli-Q 수

용리액 B : 0.10 mol/l NaCl

유속 : 0.75 ml/분

크로마토그래피 시간 : 26분 (재발생을 포함하여 36분)

검출 : UV 206nm

상기 각각의 올리고당 분류물은 UV 검출기로 206nm에서 검출되었다. 각각의 피크 면적을 모두 합하여 상기의 정량 계산을 수행하였다.

상기 올리고당 분류물 모노시알로, 디시알로 및 트리시알로를, 상술한 바와 같이 연속적으로 탈염화 칼럼에 통과시켰다.

제 3 단계에 있어, 상기 하전된 올리고당을 산성 pH 조건하에 말단 시알산 잔기를 가수분해로 제거함으로써 중성 올리고당으로 개질하였다.

최종적으로, 15㎕의 Milli Q 수와 약 15㎕의 각각의 올리고당 분획을 마이크로-테스트 관에 넣고, 30㎕의 10mmol/l H₂SO₄를 가하였다. 이후, 상기 혼합물을 80℃하에서 90분 동안 가열하였다.

이후, 상기 뱃치를 5000rpm에서 1분 동안 원심분리시키고, 작은병에 피펫으로 담았다. 중성인 상기 탄수화물은 음이온-교환기 칼럼(CarboPac PAI(4×250mm) P/N 35391, Dionex) 상에서 알카리 pH에서 약 음이온에 결합한다. 다음의 용리액 경사로 용리를 수행하였다:

용리액 A : NaOH 0.16 mol/l

용리액 B : NaOH 0.16 mol/l 소듐 아세테이트 0.10 mol/l

용리액 C ; NaOH 0.16 mol/l 소듐 아세테이트 0.75 mol/l

유속 : 1.0 ml/분

크로마토그래피 시간 : 50 분

검출기 : PAD

상기 올리고당을 측정하기 위해 PAD(펄스파 암페로메트릭 검출기; pulsed amperometric detection)를 사용하였다. 상기 올리고당 분자는 전기화학적으로 산화되었으며, 그리하여 생성된 전류를 측정하였다. PAD는 고감도로서 구별되며, 따라서 ng 범위 내의 검출도 별 어려움이 없었다. 검출기(mV) 내의 출력 신호는 탄수화물의 양에 대하여 정비례한다. 상기 피크 면적을 합하여 정량(quantification)을 수행하였다.

상기 탈글리코실화 및 분석을 하는 중간에, 상기 시료들을 -20℃에서 중간 저장시켰다.

참고문헌 :

Townsend (1998) : 올리고당의 고-성능 음이온-교환 크로마토그래피. 분석화학 174, 459-470.

결과

1. Lys-C 맵핑

뱃치 11 내지 16의 Lys-C 맵핑은 상기 펩티드의 머무름 시간 및 정량 측정과 관련하여 초기값과 아무런 차이를 나타내지 않았다.

액체 저장 동안의 메티오닌 설폭사이드 함량의 측정의 결과는 하기 표 7(3달 동안의 저장) 및 8 (6달 동안의 저장)과 같이 나타났다.

상기 표 7은 메티오닌-함유 뱃치 13 및 15가 메티오닌을 함유하지 않는 뱃치와 비교하여 3달 동안의 저장에 있어 더 낮은 메티오닌 설폭사이드 함량을 갖는 것으로 나타났다. 6달 동안 저장시킨 후, 뱃치 11, 13 및 15 내에 가해진 메티오닌의 영향은 더욱 명백하다. 메티오닌 설폭사이드 함량에 있어서 아주 작은 증가가 상기 뱃치들에서 검출될 수 있었다. 메티오닌이 배제된 뱃치들에 있어서, 메티오닌 설폭사이드 함량이 약간 더 증가되었지만, 산화된 메티오닌의 전체 함량은 모두가 전체 메티오닌 함량의 10% 미만이었다.

2. 탄수화물의 측정

3 또는 6달 동안 저장한 후의 탄수화물 측정의 결과는 표 9a, 9b, 10a, 10b, 11a 및 11b에 나타내었다.

인터페론-β-1a는 아미노산 체인에 정의된 서열의 단당류(monosaccharides)로 구성되는 탄수화물 구조를 갖는다. 분지의 형태에 따라, 이 구조들은 2분지형(biantennary)(2개의 가지), 3분지형(triantennary)(3개의 가지) 및 4분지형(tetraantennary)(4개의 가지)으로 명명된다.

상기 탄수화물 구조는 단당류 만노오스, 푸코오스, N-아세틸글루코스아민, 갈락토오스 및 시알산으로 구성된다.

이중에서, 시알산은 여러 측면에 있어 특이점을 갖는다:

- 그것은 하전된 기(카복실기)를 갖는 유일한 단당류이다.

- 그것은 항상 탄수화물 체인의 말단에 존재한다.

- 그것은 나머지 단당류보다 더 용이하게 효소작용으로 또는 가수분해로서 제거될 수 있다.

- 중성 탄수화물 체인의 구조는 상당히 일정한 반면, 시알산 부분은 그중에서도 특히 세포 배양 및 인터페론의 정제에 따라 상당히 다양해진다.

참고문헌 :

Kagawa 및 그의 동료. J. Biol. Chem. 263 (1998), 17508-17515; EP-A-0 529 300.

3달 동안의 저장(표 9a) 또는 6달 동안의 저장(표 9b) 후에 시알로 형태 (각각의 시알로 구조의 %)를 조사하였다. 말단 시알산을 함유하지 않는 탄수화물 구조는 아실알로로 명명된다. 말단 시알산을 한 개 함유하는 탄수화물 구조는 모노시알로로 명명된다. 말단 시알산을 두개 함유하는 탄수화물 구조는 디시알로로 명명된다. 말단 시알산을 세 개 함유하는 탄수화물 구조는 트리시알로로 명명된다.

더욱이, 상기 분지도(antennarity; 각각의 분지형의 함량 %)를 3달 동안 저장(표 10a) 및 6달 동안 저장(표 10b)한 후에 측정하였다. 한개의 분지를 가져 두개의 말단 갈락토스를 갖는 탄수화물 구조는 2분지형으로 명명된다. 이는 0 내지 2개의 말단 시알산을 가질 수 있다. 2개의 분지를 가져 3개의 말단 갈락토스를 갖는 탄수화물 구조는 3분지형으로 명명된다. 이는 0 내지 3개의 말단 시알산을 가질 수 있다.

또한, 3달 동안의 저장(표 11a) 및 6달 동안의 저장(표 11b) 후 시알릴화의 정도(시알산이 갖는 말단 갈락토스 잔기가 차지하는 함량%)를 조사하였다.

상기 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, pH 5에서의 저장은 미약하지만 재생가능한 탈시알화를 일으킬 수 있다. pH 7에서의 저장은 시알릴화의 정도에 영향을 주지 않는다.

뱃치 15 및 16에 관하여 기술된 아푸코(afuco) 함량은 아마도 상기 가해진 인간 혈청 알부민으로부터 얻은 외래 단백질에서 기인한 것인데, 이는 항-β크로마토그래피에 의해 정량적으로 제거되지 않는다.

상기 분지형에 관하여, 액체 저장은 측정가능한 결과가 얻어지지 않았다.

SEQUENCE LISTING <110> Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH <120> Liquid Interferon-β Formulations <130> 17150 <140> <141> <150> 97116562.6 <151> 1997-09-23 <150> PCT/EP98/06065 <151> 1998-09-23 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Val Leu Glu Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Xaa Ser Ser Leu His Leu Lys 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Arg Xaa Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Xaa Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 1 5 10 15 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 20 25 30 <210> 13 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Xaa Leu Gln Asn Ile Phe Ala 1 5 10 15 Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val 20 25 30 Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 35 40 45 <210> 14 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala 1 5 10 15 Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val 20 25 30 Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 35 40 45

Claims

제제가 0.3-5 중량%의 임의의 산성 아미노산, 아르기닌 또는 글리신을 포함하지 않을 조건으로, 활성성분으로서 농도 10 MU/ml 이하의 인간 인터페론-β 및 pH를 5-8로 세팅시키기 위한 완충제를 포함하고, 인간 혈청 알부민을 함유하지 않으며, 25℃에서 3달간 저장후 시험관내 생물학적 활성이 초기 활성의 80% 이상인 장기간 안정성을 나타내는 액상 제제.
제1항에 있어서, pH를 6-7.2로 세팅시키기 위한 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 제제.
삭제
제1항에 있어서, 글리코실화된 인터페론-β를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제2항에 있어서, 인터페론-β가 CHO 세포들에서 유래하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 10 mmol/l - 1 mol/l 농도의 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 완충제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제7항에 있어서, 포스페이트/시트레이트 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 및 제4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 6-7.2인 것을 특징으로 하는 제제.
삭제
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 활성성분을 제외하고 인간 또는 동물 폴리펩티드를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서 6달간 저장후 화학적 무결성을 보이는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서 6달간 저장후 물리적 무결성을 보이는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
삭제
삭제
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투압 조절용 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 점도 증가를 위한 점증제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 액상 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제21항에 있어서, 경구, 비경구 또는 안과학적으로 투여하는 약제학적 제제.
제21항에 있어서, 1-25 MU의 단위 투여형인 약제학적 제제.
제21항의 제제 및 적절할 경우 필요한 기타 약제학적 제제 보조제를 적절한 제형으로 제제화하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제를 제조하는 방법.
삭제
삭제
제15항에 있어서, 메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.