DE69029370T3

DE69029370T3 - Erythropoietin-Isoformen

Info

Publication number: DE69029370T3
Application number: DE69029370T
Authority: DE
Inventors: Thomas Wayne Moorpark Strickland; Thomas Edward Bethesda Byrne; Steven George Thousand Oaks Elliott
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2010-10-13
Also published as: AU646822B2; ES2139764T3; CN1063796C; CZ291515B6; GR3032089T3; DE69033301D1; IL95971A0; PT95586A; NO912281D0; NZ235676A; JPH04502331A; CN1051936A; CZ291488B6; EP0668351A1; IL125175A; EP0428267A3; SK497290A3; JP3073905B2; JP2983629B2; ZA908166B

Description

Dies ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der U.S.-Anmeldung Ser. No. 421,444, eingereicht am 13. Oktober 1989, die durch Bezugnahme mit einbezogen ist. Die vorliegende Erfindung betrifft Erythropoietin-Isoformen oder Mischungen derselben, Verfahren zur Herstellung spezifischer Isoformen oder Mischungen derselben, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Isoformen oder Mischungen derselben umfassen und Behandlungsverfahren unter Verwendung solcher Isoformen und Zusammensetzungen.
Hintergrund der Erfindung
Erythropoietin ist ein Glykoprotein-Hormon, das an der Reifung erythroider Vorläuferzellen zu Erythrocyten beteiligt ist. Es ist wesentlich bei der Regulierung der Gehalte an roten Blutzellen im Kreislauf. Natürlich auftretendes Erythropoietin wird von der Leber während des fötalen Lebens und von der Niere von Erwachsenen produziert und zirkuliert im Blut und stimuliert die Produktion von roten Blutzellen im Knochenmark. Anämie ist nahezu ausnahmslos eine Folge von Nierenversagen aufgrund verringerter Produktion von Erythropoietin von der Niere. Rekombinantes Erythropoietin, das durch gentechnologische Techniken hergestellt wird, die die Expression eines Proteinproduktes aus einer Wirtszelle, die mit dem Gen, das Erythropoietin codiert, transformiert worden ist, einschließt, hat sich als wirksam erwiesen, wenn es bei der Behandlung von Anämie eingesetzt wird, die von chronischem Nierenversagen herrührt.
Bis vor kurzem ist die Verfügbarkeit von Erythropoietin sehr begrenzt gewesen. Obgleich das Protein im menschlichen Urin vorkommt, sind die ausgeschiedenen Gehalte zu niedrig, um dies zu einer praktischen Quelle für Erythropoietin für therapeutische Verwendung zu machen. Patienten, die an aplastischer Anämie leiden, zeigen erhöhte Gehalte an Urin-Erythropoietin relativ zu gesunden Personen, aber begrenzte Vorräte an diesem Urin machen auch solch eine Quelle unpraktisch. Die Reinigung von Erythropoietin aus menschlichem Urin von Miyake et al. in J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), verwendete als Ausgangsmaterial Urin von Personen mit aplastischer Anämie.
Die Identifizierung, Klonierung und Expression von Genen, die Erythropoietin codieren, sind beschrieben in U.S. Patent 4,703,008 (Lin). Eine Beschreibung der Reinigung von rekombinantem Erythropoietin aus Zellmedium, welches das Wachstum von Säugetierzellen unterstützte, die z.B. rekombinante Erythropoietin-Plasmide enthielten, ist enthalten in U.S. Patent 4,667,016 (Lai et al.). Die Expression und Gewinnung von biologisch aktivem rekombinanten Erythropoietin aus Säugetierzellwirten, die das Erythropoietin-Gen auf rekombinanten Plasmiden enthalten, hat zum ersten Mal Mengen von Erythropoietin, die für therapeutische Anwendungen geeignet sind, verfügbar gemacht. Zusätzlich hat die Kenntnis der Gensequenz und die Verfügbarkeit größerer Mengen von gereinigtem Protein zu einem besseren Verständnis des Wirkungsmodus dieses Proteins geführt.
Die biologische Aktivität eines Proteins hängt von seiner Struktur ab. Insbesondere liefert die primäre Struktur eines Proteins (d.h. seine Aminosäuresequenz) Information, die die Bildung von sekundären (d.h. α-Helix oder β-Faltblatt) und tertiären (insgesamt dreidimensionale Faltung) Strukturen durch ein Polypeptid während oder nach seiner Synthese ermöglicht. Das Aufbrechen von richtigen sekundären und tertiären Strukturen durch die Einführung von Mutationen und dadurch chemische oder enzymatische Behandlungen kann zu einer Verringerung der biologischen Aktivität führen.
In prokaryontischen Organismen werden die biologischen Aktivitäten von Proteinen weitgehend durch die oben beschriebenen Strukturen bestimmt. Im Gegensatz zu Proteinen aus prokaryontischen Zellen sind viele Zelloberflächen- und Sekretionsproteine, die von eukaryontischen Zellen produziert werden, mit einer oder mehreren Oligosaccharid-Gruppen modifiziert. Diese Modifikation, bezeichnet als Glykosylierung, kann die physikalischen Eigenschaften von Proteinen dramatisch beeinflussen und kann auch für die Proteinstabilität, Sekretion und subzelluläre Lokalisierung wichtig sein. Richtige Glykosylierung kann für die biologische Aktivität wesentlich sein. Tatsächlich liefern einige Gene aus eukaryontischen Organismen, wenn sie in Bakterien (z.B. E. coli) exprimiert werden, denen Zellprozesse für Glykosylierungsproteine fehlen, Proteine, die wegen ihres Mangels an Glykosylierung mit geringer oder keiner Aktivität gewonnen werden.
Glykosylierung tritt an spezifischen Stellen entlang der Polypeptid-Rückgratkette auf und weist üblicherweise zwei Typen auf: O-verknüpfte Oligosaccharide sind an Serin- oder Threonin-Reste gebunden, während N-verknüpfte Oligosaccharide an Asparagin-Reste gebunden sind, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, in der X jede Aminosäure mit Ausnahme von Prolin sein kann. Die Strukturen von N-verknüpften und O-verknüpften Oligosacchariden und die Zuckerreste, die in jedem Typ anzutreffen sind, sind unterschiedlich. Ein Zuckertyp, der üblicherweise bei beiden anzutreffen ist, ist N-Acetylneuraminsäure (im weiteren als Sialinsäure bezeichnet). Sialinsäure ist üblicherweise der terminale Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und kann wegen ihrer negativen Ladung dem Glykoprotein saure Eigenschaften verleihen.
Sowohl aus menschlichem Urin gewonnenes Erythropoietin als auch rekombinantes Erythropoietin (exprimiert in Säugetierzellen) mit der Aminosäuresequenz 1–165 von Human-Erythropoietin enthalten drei N-verknüpfte und eine O-verknüpfte Oligosaccharid-Ketten, die zusammen etwa 40% des gesamten Molekulargewichts des Glykoproteins ausmachen. N-verknüpfte Glykosylierung tritt an Asparagin-Resten auf, die an den Positionen 24, 38 und 83 angeordnet sind, während O-verknüpfte Glykosylierung an einem Serin-Rest auftritt, der an Position 126 angeordnet ist (Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Es ist gezeigt worden, daß die Oligosaccharid-Ketten mit terminalen Sialinsäure-Resten modifiziert sind. Enzymatische Behandlung von glykosylierten Erythropoietin, um alle Sialinsäure-Reste zu entfernen, führt zu einem Verlust an in-vivo-Aktivität, beeinflußt aber nicht die in-vitro-Aktivität (Lowy et al. Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al. J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Dieses Verhalten ist erklärt worden durch die schnelle Ausscheidung von Asialo-Erythropoietin aus dem Kreislauf durch Wechselwirkung mit dem Asialoglykoprotein-Bindungsprotein der Leber (Morrell et al. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs, et al. Am. J. Physiol. 227, 1385 (1974); Ashwell et al. Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Somit besitzt Erythropoietin nur biologische in-vivo-Aktivität, wenn es sialyliert ist, um seine Bindung durch das Leber-Bindungsprotein zu verhindern.
Die Rolle der anderen Komponenten in den Oligosaccharid-Ketten von Erythropoietin ist nicht gut definiert. Es ist gezeigt worden, daß nicht glykolysiertes Erythropoietin stark verringerte in-vivo-Aktivität besitzt, verglichen mit der glykosylierten Form, aber in-vitro-Aktivität beibehält (Dordal et al. Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin-Patent, aaO.). In einer anderen Studie verringert die Entfernung von N-verknüpften oder O-verknüpften Oligosaccharid-Ketten alleine oder zusammen durch Mutagenese von Asparagin- oder Serin-Resten, die Glykosylierungsstellen sind, die in-vitro-Aktivität des veränderten Erythropoietins, das in Säugetierzellen produziert wird, stark (Dube et al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).
Glykoproteine, wie etwa Erythropoietin, können unter Verwendung von Techniken wie etwa isolelektrischer Fokussierung (IEF) in verschiedene geladene Formen aufgetrennt werden. Mehrere Gruppen haben über IEF-Studien an rohen und teilweise gereinigten Erythropoietin-Zubereitungen berichtet (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al. Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Höchstens drei oder vier Fraktionen mit Erythropoietin-Aktivität wurden in diesen Studien durch IEF unterschieden und keine wurden im Hinblick auf den Kohlehydratgehalt charakterisiert. Zusätzlich wurde keine Korrelation zwischen den isoelektrischen Punkten der Fraktionen und ihrer biologischen Aktivität hergestellt.
Während der Reinigung von Urin-Erythropoietin aus menschlichem Urin, diskutiert in Miyake et al. aaO., wurde über zwei Erythropoietin-Fraktionen aus Hydroxylapatit-Chromatographie, bezeichnet mit II und IIIA, berichtet, daß sie dieselbe spezifische Aktivität besäßen. Eine anschließende Kohlehydrat-Analyse der Fraktionen II und IIIA zeigte, daß Fraktion II einen höheren mittleren Sialinsäure-Gehalt als Fraktion IIIA aufwies (Dordal et. al. aaO.).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, abgetrennte und isolierte Isoformen von Erythropoietin mit einem definierten Sialinsäure-Gehalt und biologischer Aktivität zur Verfügung zu stellen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Moleküle enthalten, würden therapeutischen Nutzen besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Erythropoietin-Isoformen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zur Herstellung einer Erythropoietin-Isoform, welches die Schritte umfaßt, daß gereinigtes Erythropoietin einer präparativen isoelektrischen Fokussierung unterzogen und eine einzige Isoform aus dem Gel eluiert wird. Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, die Erythropoietin-Isoformen umfassen, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zur Erhöhung von Hämatokritgehalten in Säugetieren, welche umfassen, daß eine therapeutisch annehmbare Menge dieser Zusammensetzungen verabreicht wird, um die Produktion von Reticulocyten und roten Blutzellen zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Erythropoietin-Molekülen mit mehr als oder alternativ weniger als einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, welches umfaßt, daß Material, das Erythropoietin enthält, einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen wird. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt ist ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Erythropoietin-Molekülen mit mehr als oder alternativ weniger als einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, welches umfaßt, daß ein Material, das Erythropoietin enthält, einer Chromatofokussierung unterzogen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel der getrennten rekombinanten Erythropoietin-Isoformen. Gelspuren 1–11 zeigen Isoformen, die im Bereich von weniger sauer (höherer pI) in Spur 1 bis saurer (niedrigerer pI) in Spur 11 liegen. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung der Isoformen 9–14 enthält, ist ebenfalls in der ganz linken und der ganz rechten Spur des Gels gezeigt.
2 zeigt die Beziehung zwischen der Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Isoform und der spezifischen in-vivo-Aktivität jeder Isoform, ausgedrückt als Einheiten pro mg Erythropoietin-Polypeptid. In 2A wurde die Konzentration jeder Erythropoietin-Isoform mit dem Bradford-Proteintest bestimmt; in 2B wurde die Konzentration durch Extinktion bei 280 nm bestimmt, in 2C wurde die Konzentration durch RIA bestimmt.
3 zeigt ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel definierter Mischungen rekombinanter Erythropoietin-Isoformen, hergestellt mit Anionenaustauschchromatographie unter verschiedenen Bedingungen. Die Gelspuren 1–6 stellen entsprechend Erythropoietin-Isoformen dar, die in einer Waschung mit hohem Salzgehalt eluiert worden sind, nach dem Waschen der Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule mit 150 mM Essigsäure, pH 4,7, 150 mM Essigsäure (ungepuffert), 200 mM Essigsäure, pH 4,7, 250 mM Essigsäure, pH 4,7, 300 mM Essigsäure, pH 4,7 oder 300 mM Essigsäure (ungepuffert). Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung von Isoformen enthält, wie erhalten unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 2 von Lai et al., aaO., beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß die DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt wird, ist auch in der ganz linken Spur des Gels dargestellt.
4 zeigt die Trennung der Erythropoietin-Isoformen 8 bis 12, die erreicht wurde, indem zellkonditioniertes Medium, das auf eine Säule aus Q-Sepharose aufgebracht worden war, einem Gradienten mit abnehmendem pH und ansteigender Ionenstärke unterzogen wurde. Aliquote von Fraktionen mit gerader Nummer von Fraktion 2 bis Fraktion 40 wurden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung von Isoformen enthielt, die unter Verwendung von Verfahren erhalten wurden, die in Beispiel 2 von Lai et al., aaO., beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt ist, ist auch in der ganz linken Spur des Gels dargestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung gestellt. Isoelektrische Fokussierung (IEF) trennt Proteine auf Ladungsbasis. Wenn sie in einen pH-Gradienten gegeben und einem elektrischen Feld unterworfen werden, werden Proteine zu dem Punkt wandern, an dem sie keine Nettoladung besitzen, und dort bleiben. Dieses ist der isoelektrische Punkt (pI) des Proteins. Jede einzelne Bande, die auf IEF beobachtet wird, stellt Moleküle dar, die einen bestimmten pI besitzen und daher dieselbe Gesamtladung, und wird als eine Isoform bezeichnet. Der Begriff "Erythropoietin-Isoform", wie er hierin verwendet wird, betrifft Erythropoietin-Zubereitungen mit einem einzigen pI und mit derselben Aminosäuresequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Erythropoietin das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz, die in eine nicht-menschliche eukaryontische Wirtszelle transfiziert worden ist, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform ist das Erythropoietin "rekombinantes Erythropoietin". Rekombinantes Erythropoietin wird vorteilhafterweise gemäß den Verfahren hergestellt, das im im gemeinsamen Eigentum befindlichen U.S. Patent 4,703,008 (Lin) beschrieben ist, das hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird. Rekombinantes Erythropoietin wird vorteilhafterweise gemäß den allgemeinen Verfahren gereinigt, die in Beispiel 2 des im gemeinschaftlichen Besitz befindlichen U.S. Patentes 4,667,016 (Lai et al.) beschrieben sind, das hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird, oder alternativ gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, wobei DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt ist. In der Modifikation mit der Q-Sepharose-Säule ersetzen 55 mM NaCl 25 mM NaCl in der Pufferlösung, die verwendet wird, um die Säure auf neutralen pH zu bringen, und 140 mM NaCl ersetzen 75 mM NaCl in der Pufferlösung, die verwendet wird, um Erythropoietin aus der Säule zu eluieren. Dieses Material wandert, wenn es durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wird, als eine einzige Spezies (d.h. Bande). Wenn gereinigtes Erythropoietin einer IEF unterzogen wird, sind multiple Banden im Gel sichtbar, was darauf hinweist, daß verschiedene geladene Formen des Glykoproteins vorliegen.
Es ist festgestellt worden, daß diskrete Isoformen von rekombinantem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz von aus Urin gewonnenem Human-Erythropoietin Erythropoietin-Molekülen mit von 1–14 Sialinsäuren entsprechen und jede Isoform, die im gereinigten rekombinanten Erythropoietin vorliegt, eine in-vivo-Aktivität besitzt, die in Beziehung zur Anzahl von Sialinsäuren steht, die die Isoform besitzt. Der Begriff "Erythropoietin", wie hierin verwendet, schließt natürlich vorkommendes Erythropoietin, aus Urin gewonnenes Human-Erythropoietin sowie nicht natürlich vorkommende Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz und Glykosylierung, die ausreichend duplikativ zu derjenigen von natürlich vorkommendem Erythropoietin ist, um es zu ermöglichen, daß sie die biologischen in-vivo-Eigenschaften besitzen, durch die Knochenmarkzellen veranlaßt werden, die Produktion von Reticulocyten und roten Blutzellen zu erhöhen, ein.
Rohzubereitungen von Erythropoietin besitzen viele Isoformen, aber Material, das z.B. gereinigt ist wie im Patent von Lai et al., aaO., Beispiel 2, enthält überwiegend sechs Isoformen, wenn es durch IEF analysiert wird. Zusätzlich ist wenigstens eine zusätzliche Isoform mit höherer Azidität unter Verwendung der chromatographischen Verfahren, die in Beispiel 4 beschrieben sind, nachgewiesen worden. (Diese saurere Form, die auf einem IEF-Gel bei > 14 Sialinsäuren wandert, kann nicht auf Sialinsäure beruhende negative Ladungen enthalten, wie durch die Beständigkeit eines Teils der Ladung gegenüber einer Sialidase-Verdauung gezeigt worden ist). Diese Isoformen unterscheiden sich voneinander durch den Sialinsäure-Gehalt. Wie in den Beispielen dargestellt, wird dies dadurch belegt, daß 10 dieser Isoformen durch präparative IEF isoliert und der Sialinsäuregehalt von fünf von diesen bestimmt wurde. Bei den auf Sialinsäure-Gehalt untersuchten Isoformen ist festgestellt worden, daß die fünf Isoformen entweder 9, 10, 11, 12 oder 13 Sialinsäure-Reste enthielten.
Es gibt eine Beziehung zwischen der relativen spezifischen in-vivo-Aktivität von Erythropoietin und der Anzahl von Sialinsäure-Resten pro Erythropoietin-Molekül aus den Isoformen 5 bis 11 (jede Isoform wird hierin durch die Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül bezeichnet). Die Isoformen 11 bis 14 besitzen ungefähr dieselbe relative spezifische in-vivo-Aktivität. Die Isoformen 5–14 werden auf in-vivo-Aktivität mit dem Bioassay basierend auf exhypoxischen polyzythämischen Mäusen getestet und die Menge jeder vorhandenen Isoform wird mit dem Bradford-Proteintest, der Absorption bei 280 nm oder durch einen Radioimmunassay (RIA) auf Erythropoietin bestimmt. RIA-Bestimmungen (Egrie et al. Immunobiology 172, 213, (1986)), ausgedrückt als Einheiten/ml, werden durch 212.770 Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid die mittlere spezifische Aktivität von gereinigtem Erythropoietin, wie bestimmt durch RIA, geteilt, um Proteinkonzentrationen von isolierten Isoformen oder Isoform-Mischungen zu ergeben, ausgedrückt als mg Erythropoietin-Polypeptid/ml. Wie in den Beispielen gezeigt, steigen die relativen spezifischen in-vivo-Aktivitäten schrittweise von Isoform 5 bis Isoform 11 (siehe Tabelle 2).
Die spezifischen in-vivo-Aktivitäten, auf die hierin Bezug genommen wird, sind Messungen relativer spezifischer in-vivo-Aktivitäten und sind nicht Messungen absoluter spezifischer in-vivo-Aktivitäten. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden die spezifischen Aktivitäten nur verwendet, um relative Aktivitäten von Isoformen zu vergleichen, die unter Verwendung desselben Tests getestet worden sind, unter Verwendung derselben Bedingungen, einschließlich desselben internen Standards, derselben Tierart, wobei dieselbe Analyse der Daten verwendet wurde, um spezifische Aktivität zu berichten, desselben Tests zur Bestimmung des Protein-Gehaltes. Es ist nicht beabsichtigt, daß jeder spezifische in-vivo-Aktivitätswert, der für irgendeine Isoform berichtet worden ist, einen inhärenten oder absoluten Wert für diese Isoform darstellt.
Die vorliegende Erfindung stellt Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung. Die spezifischen Isoformen von Erythropoietin, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, und ihre Eigenschaften können in Abhängigkeit von der Quelle des Ausgangsmaterials variieren. Zum Beispiel sind die Isoformen von aus Urin gewonnenem Human-Erythropoietin verschieden von den Isoformen von rekombinantem Erythropoietin. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Erythropoietin-Isoform mit einer spezifischen Anzahl (d.h. einer feststehenden Zahl von mehr als 0) von Sialinsäure pro Erythropoietin-Molekül, wobei besagte Anzahl ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 1 bis 14 besteht. Vorteilhafterweise ist besagte Anzahl 9, 10, 11, 12, 13 oder 14. In einer anderen Ausführungsform ist die Anzahl größer als 14, vorteilhafterweise 16–23.
Diese Erfindung stellt auch Zusammensetzungen zur Verfügung, die zwei oder mehr Erythropoietin-Isoformen umfassen. In einer Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen eine Mischung von Isoformen mit mehr als einer vorbestimmten Anzahl von Sia linsäuren pro Erythropoietin-Molekül, z.B. mehr als 11 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül oder mehr als 12 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, z.B. eine Mischung der Isoformen 12, 13 und 14. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen Mischungen von Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, z.B. weniger als 12, aber mehr als 8 Sialinsäuren pro Molekül, wie z.B. in einer Mischung der Isoformen 9, 10 und 11. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung, in denen die relativen Mengen der Isoformen identisch oder verschieden sind. Zum Beispiel könnte eine Mischung der Isoformen 9, 10 und 11 die Isoformen in einer Vielzahl von Verhältnissen vorliegen haben, wie etwa 1:1:1, 2:3:1 oder 20:20:1.
Vorteilhafterweise umfassen die Zusammensetzungen Mischungen von weniger als vier Isoformen, z.B. eine Mischung der Isoformen 11, 12 und 13 oder eine Mischung von 12 und 14 oder eine Mischung von 7 und 13.
Um Mischungen von Erythropoietin-Isoformen herzustellen, stellt diese Erfindung auch Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung ausgewählter Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung. Diese Verfahren schließen die Isolierung einzelner Isoformen durch Techniken wie präparative isoelektrische Fokussierung oder Herstellung von Mischungen von Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül (z.B. mehr als 11) mit Techniken wie Ionenaustauschchromatographie oder Chromatofokussierung ein. Alle diese Techniken besitzen als ihre Grundlage die Trennung von Proteinen entsprechend der Ladung.
Im allgemeinen umfassen die Ionenaustauschchromatographie und Chromatofokussierung das Aufbringen von entweder rohem Human-Erythropoietin (zellkonditionierte Medien) oder gereinigtem Material auf ein Säulenharz unter Bedingungen, die Bindung eines Teils oder der Gesamtheit der Erythropoietin-Isoformen an das Harz ermöglichen. Für rohe Erythropoietin-Zubereitungen ist es bevorzugt, das Protein auf die Säule bei etwa pH 7 aufzubringen, während für gereinigte Zubereitungen das Protein auf die Säule bei pH 7 bis hinunter zu etwa pH 4 aufgebracht werden kann. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer bei etwa pH 4 werden diejenigen Erythropoietin-Isoformen, die an die Ionenaustauschsäule gebunden bleiben, durch Anheben des pHS und der Salzkonzentration des Puffers oder durch Anwenden eines Gradienten mit abnehmendem pH und Ansteigen der Ionenstärke auf etwa pH 4 eluiert. Für die Chromatofokussierung werden die Isoformen aus der Säule durch einen Gradienten mit abnehmendem pH oder durch Waschen der Säule mit einer hohen Salzkonzentration eluiert.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Säugetier (z.B. China Hamster Ovary, CHO)-Wirtszellen, die Erythropoietin-Isoformen mit mehr als einer spezifischen Anzahl, z.B. mehr als 10, Sialinsäuren pro Molekül bevorzugt synthetisieren. Erythropoietin-Moleküle besitzen N-verknüpfte oder O-verknüpfte Oligosaccharid-Strukturen, die den Sialinsäure-Gehalt des Moleküls beschränken können. Zum Beispiel stellen tetraantennäre (vierarmige) N-verknüpfte Oligosaccharide gewöhnlicherweise vier mögliche Stellen für Sialinsäure-Bindung bereit, während bi- und triantennäre Oligosaccharid-Ketten, die die tetraantennäre Form an Asparagin-verknüpften Stellen ersetzen können, üblicherweise nur höchstens zwei oder drei gebundene Sialinsäuren aufweisen. O-verknüpfte Oligosaccharide stellen üblicherweise zwei Stellen für Sialinsäure-Bindung bereit. So können Erythropoietin-Moleküle insgesamt 14 Sialinsäure-Reste unterbringen, vorausgesetzt, daß alle drei N-verknüpften Oligosaccharide tetraanntenär sind. Säugetierzellkulturen werden auf diejenigen Zellen gescreent, die bevorzugt tetraantennäre Ketten zu rekombinantem Erythropoietin hinzufügen, wodurch die Anzahl von Stellen für Sialinsäure-Bindung maximiert wird.
Die N-verknüpften Oligosaccharide von Urin-Erythropoietin enthalten Sialinsäure in sowohl einer α-2,3- als auch einer α-2,6-Bindung an Galactose (Takeuchi et al. J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Typischerweise wird die Sialinsäure in der α-2,3-Bindung zu Galactose auf dem Mannose-α-1,6-Zweig hinzugefügt und die Sialinsäure in der α-2,6-Bindung wird zu Galactose auf dem Mannose-α-1,3-Zweig hinzugefügt. Die Enzyme, die diese Sialinsäuren hinzufügen (β-Galactosid-α-2,3-Sialyltransferase und β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase) sind am effizientesten im Hinzufügen von Sialinsäure an den Mannose-α-1,6- bzw. den Mannose-α-1,3-Zweig.
Dihydrofolatreduktase(DHFR)defiziente Chinese Hamster Ovary(CHO)-Zellen sind eine üblicherweise verwendete Wirtszelle für die Produktion von rekombinanten Glykoproteinen, einschließlich rekombinantem Erythropoietin. Diese Zellen exprimieren nicht das Enzym β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase und fügen daher nicht Sialinsäure in der α-2,6-Bindung zu N-verknüpften Oligosacchariden von Glykoproteinen, die in diesen Zellen produziert werden, hinzu. (Mutsaers et al. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al. J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). Folglich fehlt rekombinantem Erythropoietin, das in CHO-Zellen produziert worden ist, Sialinsäure in der 2,6-Bindung an Galactose (Sasaki et al. (1987), aaO.; Takeuchi et al. (1987), aaO.). In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Erythropoietin, das verwendet wird, um die Isoformen zu produzieren, in CHO-Zellen hergestellt, die mit einem funktionalen Gen für β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase transfiziert sind, um den Einbau von Sialinsäure in die α-2,6-Bindung an Galactose zu bewirken. Siehe Lee et al. J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989), die hierdurch durch Bezugnahme mit einbezogen wird, für eine Offenbarung von Techniken zur Herstellung modifizierter CHO-Zellen oder anderer Säugetierwirtszellen.
Ebenfalls offenbart sind bestimmte Analoge von Human-Erythropoietin. Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Analog von Human-Erythropoietin" Erythropoietin mit einer oder mehreren Veränderungen in der Aminosäuresequenz von Human-Erythropoietin, die zu einem Anstieg in der Anzahl von Stellen für Sialinsäure-Bindung führen. Analoge werden durch ortsgerichtete Mutagenese mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten erzeugt, die Stellen verändern, die für Glykosylierung verfügbar sind. Solche Analoge besitzen eine größere Anzahl von Kohlehydratketten als Human-Erythropoietin.
Analoge, die zu erhöhter biologischer Aktivität führen, werden durch Erhöhung des Sialinsäure-Gehaltes des Erythropoietin-Moleküls konstruiert. Analoge mit Gehalten an Sialinsäure, die größer sind als derjenige, der in Human-Erythropoietin anzutreffen ist, werden erzeugt, indem Glykosylierungsstellen hinzugefügt werden, die die sekundäre oder tertiäre Konformation nicht stören, die für die biologische Aktivität erforderlich ist. Vorteilhafterweise besitzt das Analog von Human-Erythropoietin 1, 2 oder 3 zusätzliche Stellen für N-Glykosylierung oder O-Glykosylierung. Zum Beispiel wird ein Leucin an Position 69 durch ein Asparagin ersetzt, um die Sequenz Asn-Leu-Ser zu liefern, die als eine vierte Stelle für N-Glykosylierung dient. Solch eine Veränderung kann üblicherweise bis zu vier zusätzliche Sialinsäuren pro Molekül bereitstellen. Beispiele für andere Veränderungen, die zusätzliche N- oder O-Glykosylierungsstellen erzeugen, sind Alanine an den Positionen 125 und 127 zu Asparagin bzw. Serin, Alanin an Position 125 zu Threonin und Alanine an den Positionen 124 und 125 zu Prolin bzw. Threonin. Wie von den Fachleuten auf diesem Gebiet anerkannt werden wird, schließt die Offenbarung viele andere Analoge von Human-Erythropoietin mit zusätzlichen Stellen für die Glykosylierung ein.
Ebenfalls umfaßt von der Erfindung sind pharmazeutische Zusam mensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge einer spezifischen Isoform oder Mischung von Isoformen zusammen mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel umfassen, die in der Erythropoietin-Therapie nützlich sind. Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge, die für einen vorgegeben Zustand und ein Verabreichungsschema eine therapeutische Wirkung erzielt. Die Verabreichung von Erythropoietin-Isoformen erfolgt vorzugsweise über parenterale Wege. Der spezifische ausgewählte Weg wird von dem zu behandelnden Zustand abhängen. Die Verabreichung von Erythropoietin-Isoformen wird vorzugsweise als Teil einer Formulierung vorgenommen, die ein geeignetes Trägermittel, wie etwa Humanserumalbumin, ein geeignetes Verdünnungsmittel, wie etwa eine gepufferte Kochsalzlösung und/oder ein geeignetes Adjuvans enthält. Die erforderliche Dosis wird bei Mengen liegen, die ausreichend sind, um den Hämatokrit von Patienten anzuheben, und wird in Abhängigkeit von der Schwere des zu behandelnden Zustandes, dem verwendeten Verabreichungsverfahren und dergleichen variieren.
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, sollen aber nicht als den Schutzumfang derselben beschränkend angesehen werden. Der in den in-vivo-Bioassays, die in den Beispielen eingesetzt werden, verwendete Erythropoietin-Standard ist ein rekombinanter Erythropoietin-Standard, der gegen einen teilweise gereinigten Urin-Erythropoietin-Standard standardisiert wurde. So werden nur relative spezifische in-vivo-Aktivitäten gemessen. Auch werden die spezifischen in-vivo-Aktivitäten in "Einheiten/ml", "Einheiten/mg" und "Einheiten/A₂₈₀" und nicht als "IU/ml", IU/mg" und "IU/A₂₈₀" ausgedrückt, weil der eingesetzte Erythropoietin-Standard nicht direkt mit irgendeinem existierenden internationalen Standard korreliert worden ist.
Beispiel 1: Isolierung von rekombinanten Erythropoietin-Isoformen
Rekombinantes Erythropoietin wird hergestellt, wie beschrieben in Lin, aaO. Rekombinantes Erythropoietin, das als Ausgangsmaterial für die erste und die dritte Isoform-Isolierung verwendet wird, wird gemäß dem Verfahren gereinigt, das in Beispiel 2 des in gemeinschaftlichen Besitz befindlichen Patents von Lai et al., aaO., beschrieben ist. Ausgangsmaterial für die zweite und die fünfte Isoform-Isolierung wird gemäß Lai et al. aaO., unter Verwendung der Modifikation der Q-Sepharose-Chromatographie, gereinigt. Diese Zubereitungen enthalten eine Mischung in Isoformen von rekombinantem Erythropoietin mit derselben Aminosäuresequenz wie aus Urin gewonnenes Human-Erythropoietin und enthalten überwiegend die Isoformen 9 bis 14. Ausgangsmaterial für die vierte Isoform-Zubereitung ist das Material, das während des Waschens der Anionenaustauschsäule in Beispiel 2 von Lai et al. während der Waschung mit 5 mM Essigsäure/1 mM Glycin/6 M Harnstoff eluiert. Diese Fraktion enthält Isoformen mit weniger als oder genau 9 Sialinsäuren und wurde durch Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt, wie in Beispiel 2 von Lai et al. beschrieben ist, vor der Verwendung im präparativen isoelektrischen Fokussierungsverfahren. Die sechste Isoform-Zubereitung verwendete als ihr Ausgangsmaterial eine gereinigte Zubereitung von rekombinantem Erythropoietin mit von 4 bis 13 Sialinsäure-Resten. Dieses Material wurde nach Beispiel 2 von Lai et al. gereinigt, mit der Ausnahme einer Modifikation an der Ionenaustauschsäule (Elution des rekombinanten Erythropoietins mit einem Natriumchlorid-Gradienten bei pH 8,4 und Weglassen der Essigsäure/Harnstoff-Waschung), was zur Retention des Großteils der Isoformen, die im Ausgangsmaterial vorhanden sind, führt.
Sechs verschiedene Zubereitungen von einzelnen Isoformen werden durch präparative isoelektrische Fokussierung in einem granulierten Gelbett (Ultrodex, LKB) durchgeführt, im wesentlichen wie nach LKB Application Note 198. Pharmalyte(Pharmacia)-2.5-5-Ampholyte (Pharmacia) werden verwendet und das Gelbett enthält 5 M Harnstoff.
In der ersten Zubereitung werden ungefähr 20 mg rekombinantes Erythropoietin in 6,8 ml 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0, auf das Gel aufgebracht und bei 8 Watt für ungefähr 16 Stunden fokussiert. Nach der isoelektrischen Fokussierung werden die Isoform-Banden im Gel durch einen Papierkontaktabdruck des Gelbettes sichtbar gemacht. Der Abdruck wird durchgeführt und dann durch Eintauchen in drei Wechselbäder (ungefähr jeweils 10 Minuten, Raumtemperatur) mit Fixierlösung (40% Methanol/10% Essigsäure/10% TCA/3,5% Sulfosalicylsäure) fixiert, einem Wechselbad (ungefähr 10 Minuten) aus 40% Methanol/10% Essigsäure (30–60°C) unterworfen, für 15 Minuten bei 60°C in 0,125% Coomassie-Blau R-250/40% Methanol/10% Essigsäure angefärbt und dann in 7,5% Methanol/10% Essigsäure entfärbt, um die getrennten Isoformen sichtbar zu machen. Die Region des granulierten Gelbettes, die die Isoformen enthält (–50% des Harzes) wird entfernt, Wasser wird zugegeben (–16 ml) und die Aufschlämmung wird in eine 5,5 × 24,5 Inch große Schale gegossen und zu –40 g Nettogewicht eingedampft. Diese Zubereitung wird ein zweites Mal fokussiert und ein Kontaktabdruck des Gelbettes wird angefertigt wie zuvor. Der Teil des Gels, der jede der sechs sichtbaren Isoformen enthält, wird aus dem Gelbett entfernt.
Um die Isoformen aus dem Gel zu eluieren, wird eine Lösung, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps enthält, zu jeder Isoform zugegeben, um eine Aufschlämmung zu erzeugen. Die Aufschlämmungen werden in kleine Säulen gegeben und mit dem Tris-Chaps-Puffer gewaschen. Die Durchflußmengen werden gesammelt und getrennt auf kleine Säulen aufgebracht (offene Säulenkonfiguration), die Vydac-C4-Umkehrphasenharz enthalten, das äquilibriert ist in 20% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Die Säulen werden schrittweise mit 20% Ethanol/10 mM Tris-HCl, ph 7,0 35% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, und 65 5 Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, entwickelt. Die Fraktion, die bei 65% Ethanol/10 mM Tris eluiert, wird 1:1 mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, verdünnt und einer Konzentration unterzogen und anschließend puffergetauscht zu 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, unter Verwendung eines Mikrokonzentrators Centricon-10 (Amicon). Analytische isoelektrische Fokussierung dieser Zubereitung wird im wesentlichen so durchgeführt, wie beschrieben in der LKB Technical Note 250, unter Verwendung von Servalyte-3-5-Ampholinen (Serva) in einem Polyacrylamidgel, das 5 M Harnstoff enthält.
In einer zweiten Zubereitung werden ungefähr 26 mg rekombinantes Erythropoietin in 6,5 ml entionisiertem Wasser auf das Gel aufgebracht und bei 2,5 Watt für 35 Minuten und 10 Watt für ungefähr 17 Stunden fokussiert. Die Banden des fokussierten Proteins, die im Gelbett sichtbar sind, werden als 11 verschiedene Pools entfernt. Jeder Pool wird mit entionisiertem Wasser auf etwa 7,5 ml gebracht und 20 ml von jedem der resultierenden Pool-Überstände werden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen, wie oben beschrieben. Zu jedem der Pools werden 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 zugegeben und die Aufschlämmungen werden jede in kleine Säulen gegeben und die flüssige Phase hindurchfließen gelassen. Das Harz wird mit ungefähr drei Volumenteile 0,5 M Tris-HCl, pH 7, gewaschen und die Spüllösung wird mit der Durchflußmenge vereinigt. Die Eluenten werden konzentriert und zu 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0, unter Verwendung von Einweg-Ultrafiltrationseinheiten von Amicon mit einem Molekulargewichtsschnitt von 10.000 Dalton puffergetauscht. Die konzentrierten Lösungen (ungefähr 0,5 ml), werden dann durch einen Celluloseacetat-Filter mit einem Schnitt von 0,22 Mikron hindurchgegeben. Auf der Basis analytischer isoelektrischer Fokussierung werden fünf Pools gefunden, die überwiegend die einzelnen Iso formen 10, 11, 12, 13 und 14 enthalten.
In einer dritten Zubereitung werden ungefähr 30 mg rekombinantes Erythropoietin in 21,8 ml destilliertem Wasser auf das Gel aufgebracht und bei 2 Watt für 25 Minuten, 10 Watt für 20 Stunden und 15 Watt für 15 Minuten fokussiert. Proteinbanden, die einzelnen Isoformen entsprechen, werden visuell beobachtet und aus dem Gelbett entfernt. Destilliertes Wasser wird zu den gelisolierten Isoformen zugegeben, um eine Aufschlämmung zu erzeugen, und die resultierenden Überstände werden durch analytische isoelektrische Fokussierung analysiert. Ein gleiches jedem der Pools werden 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, zugegeben gegeben, die Suspensionen werden in getrennte kleine Säulen gegeben und die flüssige Phase läßt man durch die Säule hindurchfließen, um die Isoformen zu eluieren. Jede Durchflußmenge wird konzentriert und zu 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0, unter Verwendung von Einweg-Ultrafiltrationseinheiten von Amicon mit einem Molekulargewichtsschnitt von 10.000 Dalton puffergetauscht. Ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel zeigte, daß Pools erhalten wurden, die überwiegend die einzelnen Isoformen 9, 10, 11, 12, 13 und 14 enthielten.
Eine vierte Isoform-Zubereitung verwendete als ihr Ausgangsmaterial Erythropoietin, das die Isoformen 3–9 enthielt (hergestellt wie oben beschrieben). Vor der präparativen isoelektrischen Fokussierung, die im wesentlichen durchgeführt wurde, wie für die Zubereitung 1–3 oben beschrieben, wurden die Ampholyte (Pharmalyte 2.5–5) in einer isoelektrischen Rotofor-Fokussierungszelle für Flüssigphase (Bio-Rad, Richmond, CA) vorfraktioniert, um einen für die niedrigeren isoelektrischen Punkte des Ausgangsmaterials geeigneteren Ampholytbereich zu liefern. Die Vorfraktionierung wurde durchgeführt, indem 6,7 ml Pharmalyte 2.5–5 mit 15 g Harnstoff vermischt und gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um das Volumen auf 50 ml zu brin gen. Diese Mischung wurde im Rotofor bei 10 Watt, 1°C, für 5 1/2 Stunden unter Verwendung von 0,1 M Phosphorsäure und 0,1 M Natriumhydroxid als dem Anolyten bzw. Katholyten fraktioniert. Die Ampholyt-Fraktionen mit gemessenen pHs von zwischen 4,5 und ungefähr 6 wurden bei der isoelektrischen Flachbett-Fokussierung verwendet.
Ampholyte wurden von den Isoformen unter Verwendung eines Centrieluters (Amicon, Danvers, MA) und eines Centricons mit einem Schnitt von MG 10.000 (Amicon) unter Verwendung der folgenden Parameter abgetrennt: 0,18 Tris-Puffer pH 8,8, 100 Volt, 25–30 mA, für 3 Stunden. Die Isoformen wurden dann in 0,1 M Natriumchlorid durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex-G-25(Pharmacia)-Puffer getauscht. Analytische isoelektrische Fokussierung der fünf resultierenden Pools zeigte, daß sie die Isoformen 4, 5, 6, 7 und 8 enthielten. Isoform 4 lief als mehrere Banden, was anzeigte, daß sie in gewissem Umfang einen Abbau durchlaufen hatte.
Die fünfte Isoform-Zubereitung wurde durch die Hinzufügung eines Vorfokussierungsschrittes zum isoelektrischen Flachbett-Fokussierungsverfahren modifiziert. In dieser Modifikation wurde das Protein nicht zur Ampholyt/Harnstoff/Gel-Mischung vor der Elektrophorese zugegeben, sondern wurde zum isoelektrischen Fokussierungsapparat im Anschluß an die Erzeugung des pH-Gradienten im Gelbett zugegeben. Im Anschluß an eine Vorfokussierung für 75 Minuten (1.500 Volt-Std.) wurde der Abschnitt des Gelbettes von 2,25–4,25 cm von der Kathode entfernt, mit der Erythropoietin-Lösung vermischt und zum Gelbett zurückgegeben. Im Anschluß an die isoelektrische Fokussierung wurden die Isoformen 10, 11, 12, 13 und 14 aus dem Gelbett eluiert und von den Ampholyten durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centricon-10(Amicon)-Einheiten abgetrennt.
Die Vorfokussierungs-Modifikation wurde vorgenommen, um die Ultraviolettabsorptionseigenschaften der Isoform-Zubereitungen ähnlicher zu denjenigen des rekombinanten Erythropoietin-Ausgangsmaterials zu machen. Diese Verbesserung der spektralen Eigenschaften kann im Verhältnis der Extinktion bei 280 und 260 nm für die isolierten Isoformen gesehen werden. Das mittlere Verhältnis der Extinktion bei 280 nm zu der bei 260 nm (A280/A260) für Isoformen aus den Zubereitungen 2 und 3 (nicht-vorfokussiert) beträgt 1,36 ± 0,11, während das mittlere A280/A260-Verhältnis für die Zubereitungen 5 und 6 (vorfokussiert) 1,68 ± 0,20 beträgt. Wenn die Isoform 14 von der Berechnung ausgenommen wird, betragen die mittleren A280/A260-Verhältnisse 1,39 ± 0,11 und 1,74 ± 0,09 für die Zubereitungen 2 und 3 bzw. 5 und 6. (Isoform 14 könnte das atypischste Spektrum besitzen, weil es in den geringsten Mengen vorliegt, und unterliegt somit stärker Interferenzen durch Spurenverunreinigungen durch Ampholyt-Bestandteile, oder weil es während des isoelektrischen Flachbett-Fokussierungsverfahrens am nächsten zur Elektrode liegt). Das mittlere A280/A260-Verhältnis für rekombinantes Erythropoietin, hergestellt gemäß Beispiel 2 von Lai et al. (modifiziert wie zuvor beschrieben durch Verwendung von Q-Sepharose als dem Anionenaustauschharz), beträgt 1,91 ± 0,04.
Wie oben beschrieben, war das Ausgangsmaterial für Isoform-Zubereitung 6 eine rekombinante Erythropoietin-Zubereitung, die Isoformen 4–13 enthielt. Die Ampholyte wurden im Rotofor-Apparat vorfokussiert wie für die vierte Zubereitung. Ampholyt-Fraktionen mit gemessenen pH von zwischen 3,7 und 4,8 wurden für die isoelektrische Flachbett-Fokussierung verwendet. Das Flachbett wurde vorfokussiert wie in Lauf 5 und die Isoformen 9, 10, 11, 12 und 13 wurden nach Ultrafiltration (Centricon-10), um Träger-Ampholyte zu entfernen, erhalten.
Beispiel 2: Sialinsäure-Gehalt von rekombinanten Erythropoietin-Isoformen

Die Isoformen, die isoliert wurden, wie beschrieben in Beispiel 1, und Erythropoietin, das gereinigt wurde gemäß Verfahren, die bei Lai et al., aaO., beschrieben sind (Mischung der Isoformen 9 bis 14), werden in 0,10–0,15 M Natriumchlorid puffergetauscht und mit einer Modifikation des Verfahrens von Jourdian et al. J. Biol. Chem. 246, 430 (1971), auf Sialinsäure-Gehalt analysiert. Die Sialinsäure-Reste werden von den Glykoproteinen durch Hydrolyse mit 0,35 M Schwefelsäure bei 80°C für 30 Minuten abgespalten und die Lösungen werden vor der Analyse mit Natriumhydroxid neutralisiert. Um die Menge an vorhandenem Erythropoietin-Protein abzuschätzen, wird ein Bradford-Proteintest (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) unter Verwendung von rekombinantem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz von Human-Erythropoietin als Standard unter Verwendung der Testreagenzien und des Mikromethodenverfahrens, geliefert von Bio-Rad, durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Mole Sialinsäure pro Mol Erythropoietin, sind in Tabelle 1 dargestellt. Isoformen werden entsprechend der Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül bezeichnet und liegen im Bereich von am wenigsten sauer (Isoform 9) bis am meisten sauer (Isoform 13). Die Isoformen 9–13 sind in den Gelspuren 6–10 von 1 gezeigt. Die Mengen an Isoform 14, sind ungenügend, um den Sialinsäure-Gehalt genau zu messen. Der Sialinsäure-Gehalt dieser Isoform wird aus ihrer Wanderung auf IEF-Gelen relativ zu anderen Isoformen geschlossen. Der Sialinsäure-Gehalt der Isoformen 5–8 (Zubereitung 4) ist nicht gemessen worden, wird aber in ähnlicher Weise auf ihrer Wanderung aus IEF-Gelen geschlossen. TABELLE 1

ERYTHROPOIETIN-ISOFORM	MOLE SIALINSÄURE/MOL ERYTHROPOIETIN
Isoform 13	12,9 ± 0,5
Isoform 12	11,8 ± 0,2
Isoform 11	11,0 ± 0,2
Isoform 10	9,8 ± 0,3
Isoform 9	8,9 ± 0,6
Isoform-Mischung (9–14)	11,3 ± 0,2

Beispiel 3: Aktivität rekombinanter Erythropoietin-Isoformen
Die Isoformen, die isoliert worden sind, wie beschrieben in Beispiel 1, werden durch Extinktion bei 280 nm, durch den Bradford-Proteintest und durch RIA auf Erythropoietin untersucht, um die Menge an vorhandenem rekombinanten Erythropoietin zu bestimmen. Der Bioassay basierend auf exhypoxischen polyzythämischen Mäusen (Cotes et al. Nature 191, 1065 (1961)) wird verwendet, um die relative biologische in-vivo-Aktivität zu bestimmen. Quantifizierung der Menge an vorhandenem Erythropoietin-Protein unter Verwendung eines Radioimmunassays auf Erythropoietin ergab Ergebnisse mit höherer relativer spezifischer in-vivo-Aktivität für bestimmte Isoformen wegen einer scheinbaren verringerten Immunreaktivität von Isoformen, die große Mengen an Sialinsäure enthielten, was zu einer Unterschätzung der Erythropoietin-Konzentration und somit einer Überschätzung der relativen spezifischen in-vivo-Aktivität für die meisten negativen Isoformen führte. Mäuse-Bioassay-Bestimmungen, ausgedrückt als Einheiten/ml, werden durch die entsprechenden Proteinkonzentrationen geteilt, um spezifische in-vivo-Aktivitäten zu ergeben, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid. Diese spezifischen Aktivitäten sind in Tabelle 2 dargestellt.
In Tabelle 2 ist "n" die Anzahl unabhängiger Isoform-Zubereitungen, die zum spezifischen Aktivitätswert beitragen. In den meisten Fällen wurden mehrere in-vivo-Tests an jeder Isoform-Zubereitung durchgeführt. Dieselben in-vivo-Daten tragen zu den Berechnungen der spezifischen Aktivität für alle drei Spalten bei, Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid wurden durch die Extinktion bei 280 nm, aus Radioimmunassay-Potenzen und aus Bradford-Proteintestergebnissen bestimmt. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das die Isoformen 9–14 enthielt, wurde als der Standard im Bradford-Proteintest verwendet. "n" kann kleiner sein für die Berechnung, die unter Verwendung des Bradford-Proteintestes durchgeführt wird, da einige Zubereitungen zu dem Zeitpunkt, zu dem die Bradford-Tests durchgeführt wurden, nicht mehr verfügbar waren.
Erythropoietin, das gemäß den Verfahren gereinigt worden ist, die bei Lai et al., aaO., beschrieben sind, und das eine Mischung der Isoformen 9 bis 14 enthält, wird als ein Standard für die RIAs und in-vivo-Tests verwendet.
Die relativen spezifischen Aktivitäten, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid, können in Einheiten/A₂₈₀ durch Multiplikation mit 0,807 mg Erythropoietin-Polypeptid/A₂₈₀ umgewandelt werden. Die Umwandlungsfaktor ist gewonnen durch Multiplikation des Extinktionskoeffizienten von Erythropoietin (1,345 mg/A₂₈₀) mit dem Proteingehalt des Erythropoietin-Glykoproteins (etwa 60 Gew.-%, Davis et al. Biochemistry 26, 2633 (1987)), um mg Erythropoietin-Polypeptid/A₂₈₀ zu erhalten (d.h., 1,345 mg Erythropoietin/A₂₈₀ × 0,60 mg Polypeptid/mg Erythropoietin = 0,807 mg Polypeptid/A₂₈₀). Zusätzlich können spezifische Aktivitäten, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid, mit dem Faktor 0,60 mg Polypeptid/mg Erythropoietin-Glykoprotein multipliziert werden, um spezifische Aktivitäten zu ergeben, die als Einheiten/mg Erythropoietin-Glykoprotein ausgedrückt sind.
Die Daten in Tabelle 2 sind in den 2A, 2B und 2C auch graphisch dargestellt. Diese Daten zeigen, daß die relative in-vivo-Aktivität von Erythropoietin als eine Funktion des Sialinsäure-Gehaltes bis zu Isoform 11 ansteigt. Die Isoformen 11–14 besitzen im wesentlichen dieselbe relative in-vivo-Bioaktivität. (Dies ist besonders offensichtlich, wenn die Konzentration von Isoform 14 unter Verwendung des Bradford-Testwertes ausgedrückt wird. Der Bradford-Wert könnte wegen der allgemein niedrigen Gehalte, die erhalten wurden, und der resultierenden Schwierigkeit bei der Bestimmung durch A₂₈₀ und der offensichtlichsten verringerten Reaktivität im RIA von sehr negativen Formen, die zuvor diskutiert worden ist, für Isoform 14 genauer sein). Die größere relative spezifische in-vivo-Aktivität von Erythropoietin-Isoformen mit mehr Sialinsäure beruht höchstwahrscheinlich auf einer längeren Zirkulationshalbwertszeit dieser Formen. Die Isoformen 9 und 13 wurden mit radioaktivem Iod (¹²⁵I) markiert und ihre Ausscheidungsrate in Ratten wurde bestimmt. Die Halbwertszeit im Kreislauf war signifikant länger für Isoform 13 als für Isoform 9.
Beispiel 4: Selektion von rekombinanten Erythropoietin-Isoform-Mischungen durch O-Sepharose-Chromatographie
Zellkonditionierte Medien aus der Herstellung von rekombinantem Erythropoietin gemäß den Verfahren, die bei Lin, aaO., beschrieben sind, werden konzentriert und gegen 10 mM Tris, pH 7,2, diafiltriert. Die Proteinkonzentration wird mit dem Bradford-Mikroproteintest unter Verwendung von Rinderserumalbumim als einem Standard bestimmt. 19,6 ml der Lösung, die 40 mg Gesamtprotein enthalten, werden 20 μM in CuSO₄ gemacht, durch einen Filter mit einem Schnitt von 0,45 Mikron filtriert und auf eine Säule mit einem Bettvolumen von 4 ml (1,05 cm Höhe × 2,2 cm Durchmesser) geladen, die mit Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt ist, das mit 10 mM Tris, pH 6,8 bis 7,0 bei 4°C äquilibriert worden ist. Nach Aufbringen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumina desselben Puffers gewaschen. Der Säulendurchfluß beträgt etwa 1 ml/min. Sechs separate Säulen werden unter Verwendung dieses Verfahrens aufgebaut, um definierte Erythropoietin-Isoform-Mischungen zu selektionieren.
Die Säulen werden mit 6 bis 9 Säulenvolumina eines Puffers mit niedrigem pH gewaschen, bestehend aus: Säule #1, 150 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #2, 200 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #3, 250 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #4, 300 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #5, 150 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM Cu SO₄, 6 M Harnstoff; Säule #6, 300 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff. Der pH der Säulen wird auf ungefähr pH 7 angehoben, indem jede mit 8 bis 11 Säulenvolumina 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7, gewaschen wird. Die definierten Erythropoietin-Isoform-Mischungen werden aus den Säulen durch Waschen mit 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7,0, eluiert.
Die eluierten Isoform-Pools aus jeder Säule werden konzentriert und unter Verwendung eines Mikrokonzentrators Amicon Centricon-10 in Wasser lösungsmittelgetauscht. Die Ergebnisse der analytischen isoelektrischen Fokussierung dieser konzentrierten Pools sind in 3 dargestellt. Die Gelspuren 1–6 stellen definierte Erythropoietin-Isoform-Mischungen dar, die aus Säule 1, 5, 2, 3, 4 bzw. 6 eluiert worden sind. Die "Isoform-Mischung", die in der ganz linken Gelspur von 3 gezeigt ist, stellt ein Zellmedium dar, das auf eine Q-Sepharose-Säule aufgebracht ist, wie oben beschrieben, wobei die Säule mit 5 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harn stoff gewaschen ist und die Erythropoietin-Isoform-Mischung aus der Säule unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren eluiert ist. Diese eluierte Mischung von Isoformen wird vor der analytischen isoelektrischen Fokussierung weiter gereinigt gemäß den Verfahren, die bei Lai et al., aaO., beschrieben sind.
Beispiel 5: Fraktionierung rekombinanter Erythropoietin-Isoformen unter Verwendung eines Gradienten mit niedrigem pH auf O-Sepharose
In einem anderen Verfahren werden Erythropoietin-Isoformen unter Verwendung eines Gradienten mit abnehmendem pH und ansteigender Ionenstärke getrennt. Das konzentrierte, diafiltrierte, Erythropoietin enthaltende Medium wird auf eine Säule aus Q-Sepharose in einem Verhältnis von ungefähr 40 mg Gesamtprotein/ml Gel geladen. Die Säule wird anschließend mit ungefähr zwei Säulenvolumina 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, und anschließend ungefähr 10 Säulenvolumina 2 mM Essigsäure/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄/6 M Harnstoff (pH ungefähr 4,8) gewaschen, um verunreinigende Proteine und Erythropoietin-Isoformen, die weniger als ungefähr 7 Sialinsäure-Reste enthalten, zu entfernen. Isoformen, die ungefähr 8 bis ungefähr 12 Sialinsäuren enthalten, werden aus der Säule unter Verwendung eines Gradienten eluiert, der bei ungefähr 2 mM Essigsäure in 6 M Harnstoff/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄ beginnt und bis zu 40 mM Essigsäure/6 M Harnstoff/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄ (pH ungefähr 4) läuft. Das Gesamtvolumen des Gradienten beträgt ungefähr 40 Säulenvolumina und Fraktionen von ungefähr jeweils einem Säulenvolumen werden in Behälter hinein gesammelt, die ein Volumen Tris-Puffer enthalten, ws ausreichend ist, um den pH im Bereich von 6–8,5 zu bringen, um eine Langzeitwirkung des niedrigen pHs auf die gesammelten Fraktionen zu vermeiden. Aliquote der Fraktionen werden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen, um die Trennung zu überwachen. 4 zeigt die Tren nung der Isoformen 8–11, die mit diesem Verfahren erreicht werden kann. Die Isoformen 12–14, die am Ende des Gradienten an die Säule gebunden zurückbleiben, werden durch Waschen mit einem Puffer eluiert, der aus 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μM CuSO₄ (pH 7,0) besteht. Die Isoformen (während des Gradienten getrennt oder mit der Natriumchlorid-Lösung eluiert) werden von verunreinigenden Proteinen durch Umkehrphasenchromatographie befreit, gefolgt von Gelfiltrationschromatographie, wie beschrieben in Beispiel 2 von Lai et al.

Claims

Eine isolierte biologisch aktive Erythropoietin-Isoform, mit einem einzigen isoelektrischen Punkt und mit einer spezifischen Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, wobei besagte Anzahl ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 1 bis 14 besteht.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, wobei besagte Isoform das Produkt des Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einer nicht-menschlichen eukaryontischen Wirtszelle ist.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, wobei besagte Isoform Erythropoietin umfaßt, das die Aminosäuresequenz von 1–165- oder 1–166-Human-Erythropoietin aufweist.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, mit 14 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, mit 13 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, mit 10 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Eine Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 2, wobei besagte eukaryontische Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutische wirksame Menge an besagter Erythropoietin-Isoform von Anspruch 1 und ein pharmazeutische annehmbares Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Trägermittel umfaßt.
Eine Zusammensetzung, die im wesentlichen aus zwei oder drei Erythropoietin-Isoformen nach Anspruch 1 besteht.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 9, die im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit weniger als 12 Sialinsäuren pro Molekül besteht.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 10, die im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit 9, 10 und 11 Sialinsäuren pro Molekül besteht.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 9, die im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit mehr als 11 Sialinsäuren pro Molekül besteht.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 12, die im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit 13 und 14 Sialinsäuren pro Molekül besteht.
Erythropoietin, das im wesentlichen aus biologisch aktiven Erythropoietin-Molekülen mit einer identischen Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül besteht, wobei besagte Anzahl ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 1 bis 14 besteht.
Erythropoietin nach Anspruch 14, mit 14 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Erythropoietin nach Anspruch 14, mit 13 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Erythropoietin nach Anspruch 14, mit 10 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül.
Erythropoietin nach Anspruch 14, wobei besagtes Molekül das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einer nicht-menschlichen eukaryontischen Wirtszelle ist.
Erythropoietin nach Anspruch 13, wobei besagtes Erythropoietin die Aminosäuresequenz von Human-Erythropoietin aufweist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutische wirksame Menge an Erythropoietin von Anspruch 14 und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Trägermittel umfaßt.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Erythropoietin-Isoform nach Anspruch 1, welches die Schritte umfaßt, daß ein gereinigtes Erythropoietin präparativer isoelektrischer Fokussierung unterzogen wird und eine einzelne Isoform aus dem Gel eluiert wird.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Erythropoietin-Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, wobei besagte Anzahl größer als 11 ist, welches umfaßt, daß Material, welches Erythropoietin enthält, einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen wird.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Erythropoietin-Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, wobei besagte Anzahl größer als 11 ist, welches umfaßt, daß ein Material, das Erythropoietin enthält, einer Chromatofokussierung unterzogen wird.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der Hämatokritgehalte in einem Verfahren zur Erhöhung der Hämatokritgehalte in Säugetieren.
Ein Verfahren zum Erhalten einer Erythropoietin-Zusammensetzung mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, welches umfaßt, daß eine Mischung aus zwei oder mehr Erythropoietin-Isoformen nach Anspruch 1 hergestellt wird, wobei besagte Mischung im wesentlichen aus wenigstens zwei Isoformen mit weniger als 12 Sialinsäuren pro Molekül besteht oder wobei besagte Mischung im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit 9, 10 und 11 Sialinsäuren pro Molekül besteht oder wobei besagte Mischung im wesentlichen aus wenigstens zwei Isoformen mit mehr als 11 Sialinsäuren pro Molekül besteht oder wobei besagte Mischung im wesentlichen aus Erythropoietin-Isoformen mit 13 und 14 Sialinsäuren pro Molekül besteht.