JPH04502331A - エリスロポエチンイソフォーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 これは、引例として本明細書に含まれる１９８９年１０月１３日出願の米国出願 番号４２１，４４４の一部継続出願である。本発明は、エリスロボエチンイソフ ォーム又はその混合物、特定のイソフオーム又はその混合物の調製法、かかるイ ソフオーム又はその混合物から成る医薬用組成物、及びかかるイソフオーム及び 組成物を用いた治療法に関する。

発明の背景 エリスロボエチンは、赤血球前駆細胞から赤血球への成熟過程に係わる糖蛋白ホ ルモンである。これは、循環赤血球のレベルの調節に必須である。自然界に存在 するエリスロボエチンは胎児期の肝臓及び成人の腎臓により生産され、血液中を 循環して骨髄に於る赤血球生産を刺激する。腎不全の結果、腎臓のエリスロポエ チン生産の減少によりほとんど常に貧血になる。エリスロボエチンをコードした 遺伝子で形質転換した宿主細胞の蛋白質生成物の発現を含む遺伝子工学技術によ り生産された組み換えエリスロボエチンは、慢性腎不全の結果起こる貧血の治療 に用いる場合効果的であることが見いだされている。

近年までエリスロボエチンの入手は非常に限定されていた。

この蛋白質は、ヒトの尿に存在するが、排出量が非常に少ないことからこれを実 際的な治療用エリスロポエチン源とすることはできない。再生不良性貧血患者は 、健常人と比較して高水準の尿中エリスロボエチン量を示すが、この尿の供給が 限定されていることから、やはり実質的にかかる源とすることはできない、　１ ．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、、２５２，５５５！１（１９７７年）に於て、ｌ＋ Ｙｓｋｅ等によりヒト尿性エリスロボエチンの精製が、再生不良性貧血患者由来 の尿を出発物質として用いて行われた。

エリスロポエチンをコードした遺伝子の同定、クローニング及び発現は、米国特 許第４．７０３．００８号（ＬｉＩｌ）に記載されている。

例えば、組み換えエリスロポエチンブラスミドを含む哺乳動物細胞の成長を支持 した細胞培地からの組み換えエリスロボエチンの分離精製についての記載は、米 国特許第４．６１ｉ７．０１６号（Ｌｓｉ等）に含まれる。組み換えプラスミド 上にエリスロポエチン遺伝子を含む哺乳動物宿主細胞に於る、生物学的に活性な 組み換えエリスロボエチンの発現及び回収は、初めて治療に十分な量のエリスロ ボエチンを使用可能にした。更に、遺伝子配列の知識及び、より大量の精製され た蛋白質の使用可能性は、この蛋白質の作用様式についての理解を深めた。

蛋白質の生物学的活性は、その構造による。詳しくは、蛋白質の一次構造（即ち 、そのアミノ酸配列）は、合成中及び合成後のポリペプチドによる二次（例えば アルファへリックス又はベータシート）及び三次（三次折りたたみ構造全体）構 造形成の情報を提供する。突然変異の誘導又は化学もしくは酵素処理による適切 な二次及び三次構造の破壊は、生物学的活性の減少をもたらす。

原核生物に於て、蛋白質の生物学的活性は、前述の構造により太き（支配される 。原核細胞からの蛋白質と異なって、真核細胞により生成される多数の細胞表面 及び分泌蛋白質は、−又はそれ以上のオリゴサツカリド残基によって修飾されて いる。

この修飾は、グリコシレージョンと称し、蛋白質の物理特性に劇的に影響し、蛋 白質の安定性、分泌及び細胞上局在性に於ても重要である。適切なグリコシレー ジョンは、生物学的活性に必須である。事実、真核生物由来の遺伝子が、細胞内 蛋白質グリコシレージタンプロセスを欠いたバクテリア（例えば大腸菌）に於て 発現した場合、グリコシレージョンの欠乏により活性がないか又はほとんどない 蛋白質を生じる。

グリコシレージョンは、ポリペプチド骨格の特定の位置で起き、通常二つの型、 即ち、〇−結合オリゴサッカリドがセリン又はスレオニン残基と結合する型とＮ −結合オリゴサツカリドが、配列＾ｔｎ−Ｘ−５ｅｔ／丁ｈｔ　（ここでＸはプ ロリンを除くアミノ酸を表す）の一部であるアスパラギン残基と結合する型があ る。各型に於て見いだされたＮ−結合及び〇−結合オリゴサッカリドの構造及び 糖残基は、異なっている。通常両者に見いだされる糖の一種は、ドアセチルノイ ラミン酸（以下、シアル酸と称する）である。シアル酸は、通常ト結合及び〇− 結合オリゴサッカリド両者の末端残基であり、その負の電荷により糖蛋白質に酸 の特性を与えることができる。

ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列１−１６５を有する組み換えエリスロポエ チン（ＶＲ乳動物細胞内で発現）及びヒト尿由来のエリスロボエチンの両者は、 糖蛋白質の全分子量の約４０％から成る三ケ所のＮ〜結合及び−ケ所のＯ−結合 オリゴサッカリド鎖を含む。ト結合グリコシレージョンは２４．３８及び８３の 位置に存在するアスパラギン残基で起こり、一方〇−結合グリコシレーションは １２６の位置に存在するセリン残基で起こる（Ｌｓｉ等）。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２１ｉ１，３１１６　ｆ１９１１６年）　；　Ｂ＋ｏｗｄ ７等＾ｒｃｈ、　Ｗｉｎｃｈｅｓ。

Ｂ１６ｔｔｌＴ島、２６５，３２９　（１９１１１１年））。オリゴサツカリド 鎖は、末端シアル酸残基で修飾されていることが示されている。全シアル酸残基 を除去するためのグリコモル化工リスロボエチンの酵素処理は、インビボ活性の 損失を結果として生じさせるが、インビトロ活性には影響しない（Ｌｏｖ７等Ｎ ｓｆｇｒｅ　１８５．　ＩＨ（１９８０年）；Ｇｏｌｌｙｓ＊ｓｅｒ等Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｂｅｔ　２４９．　４２０２　（１９７４年））。この性質は、肝ア シアログリコプロティン結合蛋白質との相互作用により循環系からアシアロエリ スロボエチンが速やかに除去されることにより説明される（Ｍｏｒｒｅｌ１等Ｊ 、　８ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　２４３゜１５５　（１９６８年）；　Ｂｒ１ｇ５ 等、　Ａｓ、Ｊ、ＰＪｔｉｏｌ、２２７．１３８５　（１９７４年）；＾５ｈｖ ｅｌ１等Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｔＹｗｏｌ、５０．　２８７　（１９７８年）） 。

このように、エリスロポエチンはシアル化され、肝結合蛋白質による結合を避け た場合のみインビボ生物学的活性を有する。

エリスロボエチンのオリゴサツカリド鎖に於る他の成分の役割は明らかではない 。非グリコジル化工すスロボエチンは、グリコジル化型に比較してインビボ活性 が非常に減少するが、インビトロ活性は保持することが示されてきた（Ｄｏｔｄ ＊１等Ｅｎｄｏｅｒｉｎ＋＋ｌｏｇ！　１１６．　２２９３　（１９８５年）； 前記Ｌｉｎ特許）。だが、他方の研究によると、グリコシレージョン部位に存在 するアスパラギン又はセリン残基の突然変異によるト結合又は〇−結合オリゴサ ッカリド鎖の単−又は同時除去は、哺乳動物細胞に於て生産される変化したエリ スロポエチンのインビトロ活性を著しく減少させる（Ｄｕｋｅ等Ｊ、１ｌｉｏ１ ．Ｃｋｅｍ、２６３．　１７５１Ｇ　（１９１１８年））。

エリスロボエチンの如き糖蛋白質は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）の如き技術を用 いて異なった荷電体に分離させることができる。

多数の研究音速が、未精製及び部分精製したエリスロポエチン調製物のＩＥＦ研 究について報告している（ＬＩＩｋｏｖｓｋ７等；１．Ｂｉ。

ｃｈｅｗ　５０．　９０９　（１９７２年）　；　５ｈｅｌｌｏｎ等Ｂ＋ｏｃｈ ｅｍ、　Ｍｅｄ　１２．　４５（１９７５年）　；Ｆｓｂｒ等Ｂｉｏｃｂｅｔ　 Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ｒｅ＠、　Ｃｏ１．９８．　９３０（１９８１年））。エリ スロポエチン活性を有する多くて３又は４個のフラクションがこれらの研究のＩ ＥＦにより分類されたが、いずれも炭水化物含有量に関しては特徴づけられてい ない。さらに、フラクションの等電点とその生物学的活性との間には何ら関連付 けがなされなかった。

前述のＭ＋Ｂｋｅ等により研究されたヒト尿由来の尿性エリスロポエチンの精製 中、１１及びＩＩＩ＾と命名されたヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー の二個のエリスロポエチンフラクシ習ンは、同じ比活性を有することが報告され た。後のフラクション１１及びＩｌｌ＾の炭水化物分析は、フラクション１１が 、フラクションＩＩＩ＾より平均シアル酸含有量が多いことを示した（前述のＤ ｏｒｄ＊Ｉ等）。

本発明の目的は、限定されたシアル酸含有量及び生物学的活性を有するエリスロ ボエチンの単離したイソフオームを提供することである。かかる分子を含む医薬 用組成物は、治療効果を本発明は、エリスロポエチンイソフォームに関する。精 製したエリスロポエチンを調製用等電点電気泳動に供し、ゲルから単一のイソフ オームを溶出させる段階から成るエリスロポエチンイソフォームの製法も又提供 される。エリスロポエチンイソフォームを含む医薬的に許容可能な組成物も提供 される。本発明は、又、これらの組成物の治療学的に許容可能な量を投与して網 状赤血球及び赤血球の生産を増加させることから成る哺乳動物に於るヘマトクリ ットレベルの増加法に関する。

本発明は、エリスロポエチンを含む物質をイオン交換クロマトグラフィーに供す ることから成る、分子当り所定数より多い又は少ないシアル酸を有するエリスロ ポエチン分子の混合物の製法に関する。又、本発明は、エリスロボエチンを含む 物質を等電点クロマトグラフィーに供することから成る、分子当り所定数より多 い又は少ないシアル酸を有するエリスロボエチン分子の混合物の製法を包含する 。

本発明は、又、（＾ｓｗ”Ｊ　Ｅｒａ　；　［＾ｓ＊”５．５ｅｒ１２７）ＥＰ Ｏ；　（Ｔｈｒ１２５　、　Ｅ、０．及び［Ｐｒｏ”　、Ｔｂｒ”５ＩＥＰＯの ように、ヒトエリスロポエチンより数の多い炭水化物鎖結合部位を有するヒトエ リスロポエチンの類似体も包含する。

図面の簡単な説明 図１は、分離した組み換えエリスロボエチンイソフォームの分析用等電点電気泳 動ゲルを示す。ゲルレーン！−１１は、レーンｌのより非酸性（高ｐｌ）からレ ーン１１に於るより酸性（低ｐｌ）までのイソフす−ムを示す。イソフォームド １４の混合物を含む精製した組み換えエリスロボエチンも、ゲルの左右両端のレ ーンに示される。

図２は、エリスロポエチンボリペプチドの−ｇ当りのユニットとして表される各 イソフオームのインビボ比活性と、エリスロポエチンイソフォーム当りのシアル 酸の数の相関関係を示す。

図２＾に於る各エリスロボエチンイソフォーム濃度は、ブラッドフォード蛋白質 アッセイにより決定し、２Ｂに於る濃度は２８０　ｕ＋の吸収により決定し、２ Ｃに於る濃度はＩＩＩ＾により決定した。

図３は、条件の異なる陰イオン交換クロマトグラフィーにより調製した組み換え エリスロボエチンイソフォームの限定した混合物の分析用等電点電気泳動ゲルを 示す。１−６のゲルレーンは、それぞれ、１５１１ＧＭ酢酸１１４、？、　ｌ５ ０ｍＭ酢酸（非緩衝）。

２００ｍＭ酢酸ｐＨ４，７、２５０１Ｍ酢酸ｐＨ４，７，３００−関酢酸ｐｇ４ ．ｙ又は３００１Ｍ酢酸（非緩衝）でＱ−セファロース高速フローカラムを洗浄 した後高塩濃度溶出液で溶出したエリスロポエチンイソフォームを表す。ＤＥＡ Ｅ−アガロースクロマトグラフィーをＱ−セファロースクロマトグラフィーに代 えることを除いては前述のＬＩｉ等の実施例２に記載された手法を用いて得たイ ソフオームの混合物を含む精製した組み換えエリスロポエチンも、ゲルの左端レ ーンに示される。

図４は、Ｑ−セファロースカラムにかけた細胞ならし培地をｐＨ減少及びイオン 強度増加勾配に供することにより達成した８ないし１２個のエリスロポエチンイ ソフォームの分離を示す。フラクション２からフラクション４０までの偶数番号 の７ラクシタンを分析用等電点電気泳動に供した。ＤＥＡＥ−アガロースクロマ トグラフィーをＱ−セファロースクロマトグラフィーに代えるこきを除いては前 述のＬｓｉ等の実施例２に記載された手法を用いて得たイソフオームの混合物を 含む精製した組み換えエリスロ寸エチンも、ゲルの左端レーンに示される。

図５は、ヒトエリスロボエチンのアミノ酸配列を示す。四角は、炭水化物鎖が結 合するアスパラギン残基を示し、星印は、炭水化物で修飾されるスレオニン及び セリン残基を示す。実施例６の類似体に於て提供された追加グリコシレージコン 部位はアスパラギン、セリン及びスレオニンへの突然変異により示さ図６Ａ、　 ６Ｂ、及び６Ｃは、ヒトエリスロポエチン類似体の構築及び分析用のプラスミド 生成に用いた一連のクローニングステップを示す。これらの類似体は、図５に示 すように追加グリコシレージョン部位を提供する変化したアミノ酸を有する。

図７は、ヒト配列エリスロボエチン及びエリスロボエチン類似体のＣＯ８細胞上 澄液のウェスタンプロット分析を示す。類似体の［Ａｕ’　、Ｓｅｒ”］、　Ｅ ＰＯ，［Ａｓａ”］　ＥＰＯ，［＾ｔａ１２５，５ｅｔ１２７ＩＥＮ及び［Ｐｒ ｏ”’　、　Ｔｈｒ”　］　ＥＰＯは、実施例６に記載した通りに構築される。

追加炭水化物鎖を含まない類似体の（、、ｏ１２５　、　Ｔｈ、１２７と　ＩＥ ＰＯ，［Ａｓａ”’　、Ｓｅｒ”　ＩＥＰＯ及（Ｆ　Ｔｈｔ１２５，５ｅｔ１２ ７］ＥＰＯヲ比１２で　のために示す。

ｆ　図８は、ヒト配列エリスロポエチン及びエリスロポエチン類似体のむＯ８細 胞上澄液のトグリヵナーゼ処理後のウェスタン１　プロット分析を示す。類似体 の［Ｔｂ＋”’　ＩＥＰＯ及び［Ｐｔｏ１２’　、Ｔｈｒ１２５、、．０は、実 施例６に記載した通りに構築した。類似体の＊　（ＶＩｌ”　ＩＥＰＯ，［Ｐｒ ｏ”’　］ＥＰＯ，［Ｐｔｏ”　ＩＥＰＯ，［ＴＴｈｒ”７ＩＥＰＯ。

よ、　＋２５　１２７ ［Ｐｒｏ　、Ｓｃｒ　］ＩＥＰＯび［Ｔｈｒ”’　、　Ｓ＠ｒ”’　ｉ　ＥＰＯ を比較のためざ　に示す。

図９は、］ｒｂ、［２５）突然変異を含むエリスロボエチンｃＤＮ＾でｆ　トラ ンスフェクトしたＣＩＯ細胞の成長を支持した細胞培地を。−！　セファロース 及びｃ４逆相クロマトグラフィーにかけることにょ／　り得たプール２．３及び ４の等電点電気泳動ゲルを示す。インフオームの混合物を含む精製した組み換え エリスロポエチンは、Ｉ　ＤＥＡＥ−アガロースクロマトグラフィーをＱ−セフ ァロースクロマス　トゲラフイーに代えたことを除いては前述のＬｓｉ等の実施 例２０・　に記載した手法により得られ、これも、やはりゲルの左右のし島　− ンに示される。

発明の詳細な説明 本発明によれば、エリスロボエチンイソフォームが提供される。等電点電気泳動 （ＩＥＦ）は、電荷に基づいて蛋白質を分離する。ｐＨ勾配及び電場に供した場 合、蛋白質は実効電荷を持たない位置に移動しそこにとどまる。これが、蛋白質 の等電点（ｐｌ）である。ＩＥＦ上に観察されるそれぞれ明確なバンドは、特定 のｐｌ、従って同じ全電荷を有する分子を表し、これをイソフオームと称する。

ここで使用する用語「エリスロボエチンイソフォーム」とは、単一のｐｌ及び同 じアミノ酸配列を有するエリスロポエチン調製物を指す。

好ましい態様に於るエリスロボエチンは、非ヒト真核性宿主細胞の中にトランス フェクトされた外来性ＤＮＡ配列の発現の生成物である。即ち、好ましい態様に 於るエリスロボエチンは、組み換えエリスロボエチンである。組み換えエリスロ ポエチンは、嘗照により本明細書に含めた共通所有のＬｉｌ米国特許第４、７ｆ １３．００８号に記載の手法により有利に生産される。組み換えエリスロポエチ ンは、参照により本明細書に含めた共通所有のＬｓｉ等の米国特許第４．６６７ 、０１６号の実施例２に記載の通常の手法、又はＤＥ＾トアガロ−スクロマトグ ラフィーをＱ−セファロースクロマトグラフィーに代えることを除いては実施例 ２に記載の手法により有利に精製される。Ｑ−セファロースカラム変法に於て、 カラムを中性のｐＨにするために用いる緩衝液において２５ｍＭ　Ｎ５ＣＩから ５５ｍＭ　Ｎ５ＣＩに代え、カラムからエリスロポエチンを溶出させるために用 いる緩衝液において７５ｄ’　Ｎ５Ｃ１から１４０蒙Ｍ　Ｎ＊ＣＩに代える。こ の物質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析 すると、単一種（即ち、バンド）として移動する。精製エリスロポエチンをＩＥ Ｆに供すると、糖蛋白質の異なる電荷型が存在することを示す複数のバンドが現 れる。

尿由来のヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有する組み換えエリスロポエチ ンの別々のインフオームは、ｌから１４のシアル酸を有するエリスロポエチン分 子に対応し、精製した組み換えエリスロボエチンに存在する各インフオームは、 イソフオームが所有するシアル酸の数に従ったインビボ活性を有することを見い だした。ここで使用した用語「エリスロポエチン」とは、天然に存在するエリス ａポエチン、即ち尿由来のヒトエリスロボエチン、及び骨髄細胞に網状赤血球及 び赤血球の生産を増加させるインビボの生物学的特質を有するのに十分に、天然 に存在するエリスロボエチンのアミノ酸配列及びグリコシレージョンに類似する 天然に存在しないポリペプチドを含むものとする。

エリスロポエチンの粗調製物は、多数のイソフオームを有す′るが、例えば前述 のＬ婁ｉ等の特許の実施例２のように精製した物質は、ＩＥＦにより分析した場 合主に６個のイソフオームを含む。さらに、実施例４に記載のクロマトグラフィ ーの手法を用いて、少なくとも１個の他の高酸度イソフオームが検出されている 。（ＩＥＦゲル上でシアル酸１４個以上の位置に移動するこの高酸性型は、シア リダーゼ消化に対する電荷の抵抗性により示されるようにシアル酸の他の負の電 荷を含むことができる）。

これらのイソフオームは、シアル酸含有量により相互に異なる。

実施例に示すように、これは、調製用ＩＥＦによりイソフオームの１０個を分離 し、そのうち５個についてシアル酸含有量を決定することにより証明される。シ アル酸含有量を分析したイソフオームについて、５個のイソフオームは９．１０ ．１１．１２又は１３個のシアル酸残基のいずれかを含むことを見いだした。

イソフオーム５から１１（ここで、各イソフオームはエリスロポエチン分子当り のシアル酸の数により命名した）のエリスロボエチン分子当りのシアル酸残基の 数と、エリスロポエチンの相対インビボ比活性の間には相関関係がある。イソフ オーム１１から１４は、はぼ同じ相対インビボ比活性を有する。イソフオーム５ から１４は、低酸素赤血球増加症マウスバイオアッセイ法によりインビボ活性を 分析し、存在する各イソフオームの量は、ブラッドフォード蛋白質分析、２！１ ０　ｎｍに於る吸収又はエリスロポエチンに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）により決定した。

Ｕ／＋ｅｌとして表されるＲ１人測定値（Ｅｇｒｉｅ等１ｗ１ｏｎｏｂｉｏｌＢ ７１７Ｌ２１３、（１９８６年）は、２１２．７７０υ／ｍｇエリスロポエチン ポリペプチド（ＲＩＡにより決定された精製エリスロボエチンの平均比活性）で 除することによってＩ［エリスロポエチンボリペプチド／１として表される単離 したイソフオーム又はイソフオーム混合物の蛋白質濃度を与える。実施例に示す ように、相対インビボ比活性はイソフオーム５からイソフオーム１１まで段階的 に増加している（表２参照）。

ここで言うインビボ比活性とは、相対インビボ比活性の測定値をいい、絶対イン ビボ比活性の測定値ではない。この出願の目的として、比活性は、同じ分析法、 同じ内部標準を含む同じ条件、同じ型の動物、比活性を計算するために使用する 同じ分析データ、蛋白質含有量を決定するための同じ分析法を用いて分析したイ ソフオームの相対活性を比較するためにのみ使用する。イソフオームについて報 告されるインビボ比活性はどれも、そのイソフオームの個有値又は絶対値を表す ものではない。

本発明は、エリスロボエチンイソフォームを提供する。本発明により得られるエ リスロボエチンの特定のイソフオーム及びその性質は、出発物質の源により変化 する。例えば、尿由来のヒトエリスロボエチンのイソフオームは、組み換えエリ スロポエチンのイソフオームと異なる。本発明は、好ましい態様唇こ於て、エリ スロポエチン分子当り特定の数（即ち、Ｏより大き〇一定の数）のシアル酸（当 該数は１−１４から成る群から選択される）を有するエリスロボエチンイソフォ ームに関する。有利な当該数は、９．１０．１１．１２．　Ｈ又は１４である。

他の態様に於て、当該数は１４を超え、有利には１Ｇ−２３である。

本発明は、２種又はそれ以上のエリスロボエチンイソフォームを含む組成物を提 供する。一つの態様に於て、この組成物は、エリスロボエチン分子当り所定数以 上のシアル酸、例えばエリスロボエチン分子当り１１個を超えるシアル酸又は分 子当り！２個を超えるシアル酸を有するイソフオームの混合物、例えばイソフオ ーム１２．１３及び１４の混合物を含む。他の態様に於て、この組成物は、エリ スロボエチン分子当り所定の数のシアル酸、例えば分子当り１２個未満であるが ８個を超えるシアル酸を有するイソフオームの混合物、例えばイソフオーム９． ｌＯ及び１１の混合物を含む。本発明はまたイソフオームの相対量が同じ又は異 なイソフオーム９．１０及び１１の混合物は、ｌ：ｌ：Ｉ、　２：３＋１又は２ ０：２０：ｌのように割合を変えることができる。

この組成物は、４種未満のイソフオームの混合物、例えばイソフオームＩＩ、！ ２及び１３の混合物又は１２及び１４の混合物又は７及び１３の混合物を含むこ とが有利である。

エリスロボエチンイソフオームの混合物を製造するために、本発明は、選択する エリスロボエチンイソフォームを同時に単離する方法も提供する。これらの方法 は、調製用等電点電気泳動のような技法による個々のイソフオームの単離、又は イオン交換クロマトグラフィー又は等電点クロマトグラフィーのような技法によ る分子当り所定数のシアル酸（例えば１１超）を有するイソフオーム混合物の調 製を含む。これらの全ての技法は、その基本として電荷による蛋白質の分離を有 する。

通常、イオン交換クロマトグラフィー及び等電点クロマトグラフィーは、一部又 は全部のエリスロポエチンイソフォームの樹脂への結合を可能にする条件下で、 粗ヒトエリスロボエチン（細胞ならし培地）又は精製した物質のいずれかを樹脂 のカラムにかけることを含む。粗エリスロボエチン調製物については、約ｐＨ’ ｌでこの蛋白質をカラムに供することが好ましく、精製した調製物については、 ｐＨ７から約ｐＨ４でこの蛋白質をカラムに供することができる。約ｐＨ４の緩 衝液でカラムを洗浄した後、イオン交換カラムに結合しとどまったこれらのエリ スロボエチンイソフォームを、緩衝液の塩濃度及びｐＨを増加させることにより 又は約ｐｉ（４でイオン強度増加及びｐ）１減少勾配に供することにより溶出さ せる。等電点クロマトグラフィーではｐＨ減少勾配又は高塩濃度でカラムを洗浄 することによりカラムからインフオームを溶出させる。

本発明の一つの態様は、分子当り所定数以上、例えば１０超のシアル酸を有する エリスロポエチンイソフォームを選択的に合成する哺乳動物（例えばチャイニー ズハムスター卵巣卵、ＣＨＯ）宿主細胞に関する。エリスロポエチン分子は、分 子のシアル酸含有量を制限することのできるＮ−結合又は〇−結合オリゴサッヵ リド構造を有する。例えばテトラアンテナ（四分枝）ト結合オリゴサツカリドは 、最も普通に４ケ所のシアル酸結合可能部位を提供し、一方、アスパラギン結合 部位に於てテトラアンテナ型と置換することができる二分枝及び三分枝オリゴサ ツカリド鎖は、通常、多くて２又は３ケ所のシアル酸結合部位を有する。

〇−結合オリゴサッカリドは、通常２ケ所のシアル酸結合部位を提供する。この ように、エリスロボエチン分子は、３個の１結合オリゴサツカリドが全てテトラ アンテナである場合、シアル酸残基計１４個を有することができる。組み換えエ リスロポエチンにテトラアンテナ鎖を選択的に付加することができ、それによっ てシアル酸結合部位の数を最大限にすることができる細胞を得るために哺乳動物 培養細胞を選抜する。

尿性エリスロポエチンのト結合オリゴサツカリドは、ガラクトースにＣ２，３及 びＣ２，６結合両者のシアル酸を含む（Ｔｓｋｚｗｃｈｉ等Ｊ、８ｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、２６３．３５５７（１９１１１１年））。典型的には、Ｃ２゜３結合の シアル酸はマンノースα１，６分枝上のガラクトースに）　付加し、Ｃ２，６結 合のシアル酸はマンノースα１，３分枝上のガラクトースに付加する。これらの シアル酸を付加する酵素（β−ガラクトシドα２，３シアリルトランスフエラー ゼ及びβ−ガラクトシドα２．６シアリルトランスフエラーゼ）は、それぞれマ ンノースα１，６及びマンノースα１．３分枝にシアル酸を付加させるのに最も 効果的である。

ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｆｉｔ（ＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣卵 （Ｃ００）細胞は、組み換えエリスロポエチンを含む組み換え糖蛋白質の生産に 通常宿主細胞として用いられる。これらの細胞は、酵素β−ガラクトシドα２， ６シアリルトランスフエラーゼを発現しないことから、これらの細胞内で生産さ れる糖蛋白質のＮ−結合オリゴサツカリドにＣ２，６結合のシアル酸を付加しな い。（Ｉｌｕｌ■ｅ＋ｓ等Ｅａｒ、］、Ｂｉｏｃｈｅｓ、１５６．６５１　（１ ９８６年）　ＨＴＪｋｓ＊ｃｈｉ等Ｊ、Ｃｈｒｏｍ畠１ｏＨｒ、４００．　２０ ７　（１９８７年））。従ってＣ（１０細胞で生産される組み換えエリスロポエ チンには、ガラクトースに２．６結合したシアル酸が欠けている（前述のＳ＊１ ｔｋｉ等（１９１１７年）；前述のＴｔｋｅＩＩｃｈｉ等（１９１１７年））。

本発明の他の態様に於て、イソフオームを生産するために用いられるエリスロポ エチンは、機能的β−ガラクトシドα２．６シアリルトランスフエラーゼ遺伝子 で形質転換（トランスフェクション）シ、ガラクトースにＣ２，６結合したシア ル酸を組み込むＣＩ（０細胞内で生成する。改変したＣＨＯ細胞又は他の哺乳動 物宿主細胞を作成する技法の開示については、参照により本明細書に含めるＬｔ ｅ等１．　８ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　２６４．　Ｈ８４ｇ　（１９！１９年）を 参照。

ヒトエリスロポエチンの類似体も又本発明に含まれる。ここで使用した「ヒトエ リスロボエチンの類似体」とは、ヒトエリスロボエチンのアミノ酸配列が１個以 上変化しシアル酸結合部位の数が増加したエリスロボエチンを称する。類似体は 、グリコシレージョンに有用である部位に変える、アミノ酸残基の付加、欠落又 は置換を含む部位特異的突然変異により生じる。このような類似体は、ヒトエリ スロボエチンよりも多数の炭水化物鎖を有する。

生物学的活性が増加した類似体は、エリスロポエチン分子のシアル酸含有量を増 加させることにより構築される。ヒトエリスロボエチンで見いだされたシアル酸 よりも多くのシアル酸を有する類似体は、生物学的活性に必要な二次又は三次構 造を乱さないグリコシレージョン部位を付加することにより生じる。

有利には、ヒトエリスロボエチンの類似体は、Ｎ−グリコシレージラン又はＯ− グリコシレージョンのための１．２又は３個の追加部位を有する。例えば、６９ の位置のロイシンを、アスパラギンに置換しトグリコシレーシタンのための四番 目の部位として供する配列＾ｓ＊−Ｌｅｗ−３ｅｒを生じさせる。このような変 化は、通常、分子当り４個までの追加シアル酸を提供することができる。追加Ｎ −又はＯ−グリコシレージョン部位を生じさせる他の変化の例としては、１２５ 及び＋２７の位置のアラニンをそれぞれアスパラギン及びセリンに、１２５の位 置のアラニンをスレオニンに、＋２４及び１２５の位置のアラニンをそれぞれプ ロリン及びスレオニンに変える例が挙げられる。本発明が、グリコシレージジン のための追加部位を有するヒトエリスロボエチンの他の多くの類似体を含むこと は当業者に明白である。

治療学上効果的な量の特定のイソフオーム又はイソフオームの混合物、及びエリ スロボエチン治療に於て有用な希釈剤、アジュバント及び／又は担体を含む医薬 用組成物も本発明に含まれる。ここで使用した「治療学上効果的な量」とは、所 定の条件及び投与計画で治療の効果を提供する量をいう。エリスロボエチンイソ フォームの投与は、非経口的経路によるのが好ましい。特定の経路の選択は、治 療する状態による。エリスロポエチンイソフォームの投与は、好ましくはヒト血 清アルブミンのような適切な担体、緩衝塩溶液のような適切な希釈液及び／又は 適切なアジュバントを含む剤形として行う。必要用量は、患者のへマドクリット を上昇させるのに十分な量であり、それは治療を受ける患者の重症度、用いる投 与法等により変わる。

本発明の実施例を以下により具体的に示すが、これらの実施例に限定されるもの ではない。実施例のインビボバイオアッセイに於て用いたエリスロポエチン標準 は、部分的に精製した尿性エリスロボエチン標準に対して標準化した組み換えエ リスロポエチン標準である。このように、相対インビボ比活性のみを測定する。

又、用いたエリスロポエチン標準が存在する国際規格と直接相関しないことから 、インビボ比活性は、“０７ｍ　Ｉ”。

Ｕ／−ｇ”、及び“Ｕ／Ａ　”で表し、“ＩＵ／−ビ、”１０／曽Ｃ及び′ＩＵ ／＾　”とはしない。

実施例１：組み換えエリスロボエチンイソフォームの単離組み換えエリスロポエ チンは前述のＬｉ１１に記載された通りに製造する。−回目及び三回目のイソフ オーム単離の出発物質として用いた組み換えエリスロポエチンは、前述のＬｓｉ 等の実施例２に記載の手順により精製した。二回目及び三回目のイソフオーム単 離の出発物質は、前述のＬ鳳ｉ等の、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーの変 法により精製した。これらの調製物は、尿由来のヒトエリスロポエチンと同じア ミノ酸配列を有する組み換えエリスロボエチンのイソフオーム混合物を含み、主 にイソフオーム９−１４を含む。四回目のイソフオーム調製の出発物質は、Ｌｌ ｌ等の実施例２に於て陰イオン交換カラムの洗液、５ＭＭ酢酸／ｌｄグリシン／ ６Ｍ尿素により溶出した物質である。このフラクシッン（画分）は、９個以下の シアル酸を有するイソフオームを含み、Ｌｚｉ等の実施例２に記載されている通 りに調製用等電点電気泳動の使用に先立ちゲル濾過クロマトグラフィーによりさ らに精製した。六回目のイソフオーム調製に於て、４から１３個のシアル酸残基 を有する組み換えエリスロボエチンの精製した調製物を出発物質として用いた。

この物質は、出発物質に存在するほとんどのイソフオームを保持できるイオン交 換カラム（ｐＨ８，４の塩化ナトリウム勾配での組み換えエリスロポエチンの溶 出、及び酢酸／尿素洗浄の省略）への改変を除いてはＬｓｉ等の実施例２に従っ て精製した。

個々のイソフオーム６種類の調製を、実質的にエルケービー社の指示書番号１９ ８に従って、顆粒化ゲルペッド（ウルトロデックス（旧１ｒｏｄｅｘ）　、エル ケービー社）に於る調製用等電点電気泳動により行った。ファルマライト（Ｐｈ ｘｒ■１１７１ｇ）　（ファルマシア社）２．５−５アンフオライト（ファルマ シア社）を用い、ゲルペッドは５Ｍの尿素を含む。

一回目の調製に於て、６．ｂｌの２０＋ａＭクエン酸ナトリウム／１０ｈＭ塩化 ナトリウムｐＨ７，０に溶解させた約２０１１の組み換えエリスロポエチンをゲ ルに供し、８ワツトで約１６時間フォーカスした。等電点電気泳動後、ゲル中の イソフオームバンドをゲルペッドの紙接触プリントにより可視化した。プリント した後、固定液（４０％メタノール／１０％酢酸／１０％ＴＣＡ／３．５％スル ホサルチル酸）に３回（室温でそれぞれ約１０分）浸漬することにより固定し、 ４０％メタノール／１０％酢酸（３０−６０℃）に−回（約１０分）供し、分離 したイソフオームを可視化するために、６０℃の０．１２５％クマシーブルーＲ −２５０／４０％メタノール／１０％酢酸中で１５分間染色した後、７．５％メ タノール／１０％酢酸中で脱色した。イソフオームを含む顆粒化ゲルペッド部分 （樹脂の約５０％）を取り出し、水を加え（約１６ｍ１）　、スラリーを５．５ ×２４．５インチのトレイに注ぎ、全重量が約４０ｇになるまで蒸発濃縮した。

この調製物を再度フォーカスし、ゲルペッドの接触プリントを前述の通りに作製 した。６個の識別可能なイソフオームのそれぞれを含むゲル部分をゲルペッドか ら取り出した。

ゲルからイソフオームを溶出させるために、１０ｍＭｔ−リス−１１ＣＩｐＨ７ ，０１５ｍ１Ｊ　Ｃｈ＊ｐｔを含む溶液を各イソフオームに加え、スラリー状に した。このスラリーを小カラムに移し、トリス−ＣｈＪｐ＊緩衝液で洗浄した。

この通過液を集め、２０％エタノール／１０■Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，０で 平衡化したＶ７ｄｇｃ　Ｃ４逆相樹脂を充填した小カラム（開口型）にそれぞれ 供した。このカラムは、２０％エタノール／１０■關トリス〜）ＩＣＩ、　ｐｉ （７，０，３５％エタノール／１Ｏ１ｌｌＩトリス−１１ｃＩ、ｐＨ７，０及び ６５％エタノール／１０醜闘トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，０を用いて段階的に展開 した。６５％エタノール／１ｅｄ）リスで溶出したフラクションを、ＩｈＭｈリ ス−１１ｃＩ、　ｐｉｔ　７．０を用いてｌ：１に希釈し、濃縮に供した後、セ ントリコン（Ｃｅｎｔ目ｃｏｎ）〜１０（アミコン社）微量濃縮器を用いてＩｈ Ｍ　トリス−）ＩＣＩ、　ｐＨ７，０にバッファー交換した。この調製物の分析 用等電点電気泳動を、５Ｍの尿素を含むポリアクリルアミドゲル中で、セルパラ イト（Ｓｅｔマ＊ｌ７１ｅ）〜５アンホリン（セルバ社）を用いて、本質的に、 ニルケイビー社の指示書番号２５０に記載されている通りに行った。

二回目の調製に於て、６．５１の脱イオン水に溶解させた約２６ａｌｌの組み換 えエリスロポエチンをゲルに供し、２．５ワツトで３５分及び１０ワツトで約１ ７時間フォーカスした。ゲルペッド中に観察することができるフォーカスした蛋 白質のバンドをｔｉの異なったプールとして取り出した。各プールを脱イオン水 で約７．５１　１にし、その結果できた各プールの上澄液２０ｍ１を前述の通り にＭ　分析用等電点電気泳動に供した。各プールに５−１の１．５Ｍ）リス−Ｈ Ｃｌ、　ｐＨ８，８を加え、スラリーをそれぞれ小カラムに移し、液相を通過さ せた。樹脂を約３倍容量の０．５Ｍ）リス−ＩＣＩ、ｐｎ　７で洗浄し、洗液を 通過液と合わせた。この溶出液を濃縮し、１万Ｏダルトン分子量濾別用アミコン 使い捨て限外濾過装置を用いてＦ　２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１００５Ｍ塩 化ナトリウムｐＨ７，０にバッファー交換した。しかる後、この濃縮液（約０． ５ｍ１）を０．２２ミクロンカットオフの酢酸セルロースフィルターを通過させ た。

分析用等電点電気泳動に基づいて、５個のプールが単一のイソフオーム１０．　 ＩＩ、　１２．１３及び１４を主に含むことが判明した。

ｒ　３回目の調製に於て、２１．８ｍｌの蒸留水に溶解させた約３０ｍＨの組み 換えエリスロポエチンをゲルに供し、２ワツトで２５分間、１０ワツトで２０時 間及び１５ワツトで１５分間フォーカスした。個々５　のイソフオームに対応す る蛋白質のバンドを肉眼的に観察し、５　ゲルペッドから取り出した。ゲルから 分離したイソフオームにｌ　蒸留水を加えてスラリーを生じさせ、その結果でき た上澄液を分析用等電点電気泳動により分析した。各スラリーに等容量の１Ｍト リス−）ＩＣＩ、　ｐＨ７，２を加え、懸濁液をそれぞれ小カラムに移し、この カラムに液相を通過させてイソフオームを溶出させた。

各通過液を濃縮し、１万ダルトン分子量カットオフのアミコン使い捨て限外濾過 装置を用いて２ｈＭクエン酸ナトリウム／１０［１ｍＭ塩化ナトリウムｐＦＩ７ ．０にバッファー交換した。分析用等電点電気泳動ゲルにより、単一のイソフオ ーム９．　＋０．１１．１２．１３及び１４を主に含むプールが得られたことが 示された。

四回口のイソフオーム調製に於て、イソフオーム３−９を含むエリスロボエチン （前述の通りに調製）を出発物質として用いた。調製用等電点電気泳動を本質的 に前述の調製１３の通りに行うに先だって、等電点の低い出発物質のためにより 適切なアンホライトレンジを得るためにロトフォ−（Ｒｏｔｅｌｏｒ　、バイオ ラッド社、リッチモンド、カルフォルニア）液相等電点電気泳動セル中でアンホ ライト（ファルマライト２．５−５）を前分画した。前分画は、６．７ｍｌのフ ァルマライト２．５−５を１５ｇの尿素と混合し、精製した水を加えて５０１容 量にすることにより行った。

この混合液は、ロトフオー中でｌθフラット１℃で５時間半、陽極液及び陰極液 としてそれぞれ０．１Ｍ燐酸及び（１，１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて分画した 。４．５から約６の測定ｐｔ＋を有するアンホライトフラクションをフラットペ ッド等電点電気泳動に用いた。

セントリエリューター（Ｃｅｎｌｒｉｅ１ｗｌｅｒｑアミコン社、デンバー、マ サチューセッツ）及び１０．　ＯＧＯ＆ｆｌカットオフのセントリコン（アミコ ン社）を用い、以下のパラメーター、即ち、０．１８トリス緩衝液ｐＨ８，８， １Ｏ［１ポル、ト、　２５−３０　ｍＡ、３時間で、イソフオームからアンホラ イトを取り除いた。しかる後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア）を用い てゲル濾過によりイソフオームを０．１Ｍ塩化ナトリウムに一バッファー交換し た。この結果できた５個のプールの分析用等電点電気泳動は、イソフオーム４． ５゜６．７及び８を含むことを示した。イソフオーム４はいくつかのバンドに分 かれたが、これは分解を受けたことを示唆している。

二回目のイソフオーム調製は、フラットベッド等電点電気泳動の手法にプレフォ ーカシングステップを加えることにより改変した。この改変に於ては、電気泳動 前にアンホライト／尿素／ゲルの混合物に蛋白質を加えず、ゲルペッドのｐＨ勾 配の形成の後に等電点電気泳動装置に加える。７５分間のプレフォーカシング（ １５００ボルド一時間）後、カソード側から２．２５−４．２５ｃ曽のゲルペッ ド部分を取り出し、エリスロポエチン溶液と混合し、ゲルペッドにもどした。等 電点電気泳動後、イソフオーム１０゜１１、１２．１３及び！４をゲルベッドか ら溶出させ、セントリコーン−１０（アミコン社）を用いて限外濾過によりアン ホライトから分離した。

プレフォーカシング改変は、イソフオーム調製物の紫外線吸収特性を出発組み換 えエリスロボエチンのそれに、より類似させようとして考案した。スペクトル特 性に於るこの改良は、単離したイソフオームの２８０及び２６０　ｎｓに於る吸 収の比率に見いだすことができる。調製物２及び３　（プレフォーカスなし）の イソフオームの２６０ｎ■の吸収に対する２８０　ｎｍの吸収の平均比率（＾２ ８ｏ／＾２６ｏ）は、１．３６±０．１１であり、一方、調製物５及び６　（プ レフォーカスあり）の＾２８ｏ／＾２６０の平均比率は１．６８±０．２０であ る。イソフオーム１１４を計算から除外した場合、調製物２＆３及び５＆６の平 均Ａ２８ｏ／＾２６Ｇ比率は、それぞれ１．３９±０．１１及び１．７４±０． ０９である。（イソフオーム１４は、その存在が最も少量であり、そのためアン ホライト成分による痕跡量のコンタミネーションによって干渉されやすいこと、 又はフラットベッド等電点電気泳動操作に於て電極に最も近接していることから 最も不規則なスペクトルを有する。）Ｌｌ等の実施例２（前述したように隘イオ ン交換樹脂としてＱ−セファロースを用いることにより改変）に従って調製した 組み換えエリスロボエチンの平均Ａ２ｇ０　／＾２６０比率は１，９１±０．０ ４である。

前述したように、イソフオーム調製物＃６の出発物質は、イソフオーム４−１３ を含む組み換えエリスロボエチン調製物であった。

アンホライトは四回口の調製と同様にロトフォー装置内でプレフォーカスした。

３．７から４．８の測定ｐＨを有するアンホライト分画をフラットベッド等電点 電気泳動に用いた。フラットベッドは＃５と同様にプレフォーカスし、限外濾過 （セントリコーン−１０）して担体としてのアンホライトを取り除いた後、イソ フオーム９．１０．１１．１２及び１３を得た。

実施例１に記載した通りに単離したイソフオーム及び前述のＬｉｉ等の手法に従 って精製したエリスロポエチン（イソフオーム９から１４の混合物）は、０．１ ０−０．　Ｉｓ　Ｍの塩化ナトリウムにバッファー交換し、Ｊｏｗｒｄｉｔｎ等 、　１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ−、２４６，４３０（１９７１年）の方法を改変し てシアル酸含有量を分析した。シアル酸残基は、ＯＪＳＭの硫酸を用い８０℃で ３０分間の加水分解により糖蛋白質から切断し、分析に先立ち、水酸化ナトリウ ムでこの溶液を中和した。存在するエリスロボエチン蛋白質の量を算定するため に、標準としてヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有する組み換えエリスロ ポエチンを用いて、ブラッドフォード蛋白質アッセイ（Ｂｒ＊ｄｌｏｒｄ＾ｎ＊ Ｉ、Ｂｉｏｃｂｎ、７２．　２４１１　（１９７６年）を、バイオラッド社の分 析試薬を用い、同社の微量分析法に従って行った。エリスロポエチンのモル当り のシアル酸のモルとして表した結果を表１に示す。イソフオームは、分子当りの シアル酸の数に従って命名し、低酸性（イソフオーム９）から高酸性（イソフオ ーム１３）までの範囲であった。イソフオーム９−１３は図１のゲルレーン６− １０に示される。イソフオームＩ４の量は、正確にシアル酸含有量を測定するの に不十分である。このイソフオームのシアル酸含有量は、他のイソフオームとの 相対的なＩＥＦゲル上の移動により推定した。イソフオーム５−８（調製物＃４ ）のシアル酸含有量は、測定しなかったが、同様にＩＥＦゲル上の移動により推 定した。

表　１ エリスロポエチン　モル　シアル酸／ イソフオーム　モル　エリス口ボエチンイソ７ォーム１３　１２．９±０．５ イソフオーム１２　１１．８±０．２ イソフオーム１１　１１．０±０．２ イソフオーム１０　９．８±０．３ イソフオーム　９　８．９±０．６ イソフオ一ム混合物（９−１４）　１１．３±（１，２実施例３：組み換えエリ スロポエチンイソフォームの活性実施例１に記載した通りに単離したイソフオー ムは、２８０　ａｍに於る吸収、ブラッドフォード蛋白質アッセイ及びエリスロ ポエチンのＲ１＾により分析し、存在する組み換えエリスロポエチンの量を決定 した。低酸素赤血球増加症マウスバイオアッセイ（ＣｏｌｅＩ等Ｎ５ｌｉｒｅ　 １９１．１０６５（１９６１年））を用いて、相対インビボ生物学的活性を決定 した。エリスロポエチンのラジオイミュノアッセイを用いたエリスロボエチン蛋 白質の定量は、一部のイソフオームが高い相対インビボ比活性を有するという結 果を生じた。なぜならば、多数のシアル酸を含むイソフオームの見かけの減少し た免疫反応性は、エリスロポエチン濃度の過小評価をもたらし、従って最も負に 荷電したインフオームの相対インビボ比活性の過大評価をもたらしたからである 。Ｕ／ｗｌで表したマウスバイオアッセイの測定値を対応する蛋白質濃度で除し て、Ｕ／−ｇエリスロボエチンペプチドで表したインビボ比活性をだした。これ らの比活性を表２に示す。

表２に於て、“ｎ”は比活性値に寄与する独立したイソフオーム調製物の数を表 す。はとんどの場合、各イソフオーム調製物に於て数回のインビボ分析をおこな った。同じインビボデータが３個のカラム全ての比活性計算に寄与し、υ／ｖｇ エリスロボエチンポリペプチドは、２８０　ｎｉの吸収、ラジオイムノアッセイ 又はブラッドフォード蛋白質アッセイの結果により決定した。

イソフオーム９−１４を含む精製した組み換えエリスロボエチンをブラッドフォ ード蛋白質アッセイの標準として用いた。“ｎ”はブラッドフォード蛋白質アッ セイによる計算では、ブラッドフォードアッセイを行った時点でいくつかの調製 物は利用不能になったので、少なくなっている。

前述のＬＩｉ等の手法により精製した、イソフオーム９から１４の混合物を含む エリスロポエチンを、ＲＩＡ及びインビボ分析の標準として用いた。

Ｕ／■「エリスロボエチンポリペプチドとして表される相対比活性は、０．８ｆ ｌ？ｍ（エリスロボエチンボリペプチド／＾２８０を掛けることによりＵ／＾２ ８０に変換することができる。変換係数は、エリスロポエチンの吸光定数（１， ３４５ｍｇ／＾２８ｏ）にエリスロボエチン糖蛋白質の蛋白質含有量（約６０重 量％、Ｄ１マ１１等Ｂｉｏｃｈｅ■１ｓｌｒ７２６．　２６３３　ｆ［９８７年 ））を掛けることによりめる。こうしてめ、Ｉｇエリスロポエチンポリペプチド ／Ａ２８θ　（すなわち、１１４５ｍｇエリスロポエチン／＾２．、　ｘ［１， ６０ｍｇポリペプチド／―μリスロポエチン＝０．８０？　Ｉｇｇポリペプチド ／＾２８ｏ）を得る。

さらに、０７ｍ（エリスロボエチンボリペプチドとして表される比活性に、ファ クター、０．６０　ａｇポリペプチド／嘗ｇエリスロポエチン糖蛋白質を掛けて 、Ｕ／ｓｌエリスロボエチン糖蛋白質として表される比活性をだすことができる 。

ら得た細胞ならし培地を濃縮し、ＩＯｗＭ）リス、　ｐＨ７，２で透析濾過した 。蛋白質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォード微量 蛋白質アッセイにより決定した。４０ｍ１の全蛋白質を含んだ１９．６ｍｌの溶 液に２０・μ關になるようにＣｌＳＯ４を加え、０．４５ミクロンカットオフの フィルターで濾過し、前もってｌ０５Ｍ　ｌ−リス、ｐＨ６，８から７．０を用 いて４℃で平衡化したＱ−セファロースファーストフロー（ファルマシア社）を 充填したベッドボリューム４１（高さ１．０５ｃｍ、直径２．２ｃ■）のカラム に供した。試料供試後、カラム容量の２倍容量の同じ緩衝液でカラムを洗浄した 。カラムの流速は約１１／分である。この手法を用いて６個のカラムを別々に準 備し、限定したエリスロボエチンイソフォーム混合物を選出した。

カラムは、カラム容量の６から９倍の以下の成分からなる低ｐＨ１１１７液、即 チ、カラム＃１は、１５ｈＭ酢酸、１ｍＭクリシン、　２０ＭＭ　ＣｌｌＳＯ４ ，６Ｍ尿素、　Ｎ＊０１（テｐＨ４，７＋＝調調整；カラムク２．２００ＷＩＭ 酢１１．　１ｍＭグＩＪ　シン、　２０ＭＭ　ＣａＳＯ４，６Ｍ　尿素、　Ｎｘ ＯＨテｐＨ４，７ニ調整；カラＬ１３は、２５Ｇｄ酢酸、ｂＭグ’）シン、　２ ０／ＩＺＭＣｗＳＯ４，６Ｍ　尿Ｌ　Ｎ＊ＯＨテｐＨ４，７１ｍ調整；　カラム Ｎハ、３０ｈＭ酢酸、　ＩｅＭ　’；ｆ　’）　シン、　２０　ｕＭ　ＣａＳＯ ４，６Ｍ尿素、　Ｎ＊ＯＨテｐＨ４，７に調整；カラム参５は、１５０■關酢酸 、１−Ｍグリシン、　２０μ闘ＣｌＳＯ４，６Ｍ尿素；カラム＃６は、３１１ｆ ｌ會Ｍ酢酸、１纜証グリシン。

２０ＭＭ　ＣｌｌＳＯ４、６Ｍ尿素で洗浄した。カラムのｐＨは、各カラムをカ ラム容量の８から１１倍＋７）ｌｅｄ　トリス−ＩＣ１，５５ｍＭ　Ｎ５Ｃｌ　 、　２０ＭＭ　ＣａＳＯ４，ｐＨ７の緩衝液で洗浄することにより約ｐＨ７に増 加させた。限定したエリスロポエチンイソフォーム混合物は、１０ｓＭ）リス− ＨＣｌ、　１４０５Ｍ　Ｎ５Ｃｌ、　２０ＭＭ　ＣｓＳＯ４，ｐＨ７，０テ洗浄 すルコとによりカラムから溶出させた。

各カラムから溶出させたインフオームのプールを濃縮しアミコンセントリコーン −１０微量濃縮装置を用いて溶媒を水で置換した。これらの濃縮プールの分析用 等電点電気泳動の結果を図３に示す。ゲルレーン１６は、それぞれカラム１−６ から溶出させた限定したエリスロボエチンイソフォーム混合物を表す。図３の右 端のゲルレーンに示される°イソフオーム混合物”は、前述した通りにＱ−セフ ァロースカラムに供した細胞培地を表す。

コノカラムを５ｓＭ　１ｔＨｔ、　ＩｍＭ　り’）　シン、　２０ＭＭ　Ｃ冒Ｓ ０４及び６Ｍ尿素を含む溶液で洗浄し、エリスロポエチンイソフォーム混合物を 、前述の手法を用いてカラムから溶出させた。分析用等電点電気泳動に先立ち、 この溶出したイソフオーム混合物をさらに前述のＬｌｉ等の手法により精製した 。

実施例５：Ｑ−セファロースの低９Ｈ勾配を用いた組み換えエリスロポエチンイ ソフォームの分画 他の手法に於ては、エリスロボエチンイソフォームはｐＨが減少しイオン強度が 増加する勾配を用いて分離する。濃縮した透析濾過エリスロボエチン含有培地を 、約４ｈｇの全蛋白質／１ゲルの割合でＱ−セファロースカラムに供した。しか る後、カラムを、カラム容量の約２倍のｌ（ｌｅＭ）リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，０ で、次にカラム容量の約１０倍の２ｓＭ酢酸／ｌ■Ｍグリシン看ＯμＭ　ＣｌＳ Ｏ４７６Ｍ尿素（ｐＨ約４．８）で洗浄し、混入蛋白質及び約７未満のシアル酸 残基を有するエリスロボエチンイソフォームを取り除いた。

約８個から約１２個のシアル酸を含むイソフオームを、約２ｓＭ酢酸／６Ｍ尿素 ／ｌｓＭグリシン／２０μＭ　ＣｌＳＯ４から始まって４０＋１Ｍ酢酸／６Ｍ尿 素／１ｍＭグリシン／２０μＭ　ＣｌＳＯ４（ｐ’約４）までの勾配を用いてカ ラムから溶出させた。勾配の全容量はカラム容量の約４０倍であり、カラム容量 とほぼ同量の各フラクション（分画）を、集めたフラクションを長時間低ｐｎに さらすのを避けるためｐＨを６−８．５の範囲にするのに十分な量のトリス緩衝 液を含む容器に集めた。フラクションの一部を分析用等電点電気泳動に供し分離 をモニターした。図４は、この手法により達成することができるイソフオーム８ −１１の分離を示す。勾配を終えた時点でカラムに結合したままのインフオーム ＋２−１４をｌ１１ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　１４０＋ｅＭ　ＮｔＣＩ、　２０ ＭＭ　Ｃａ５Ｏ，４（ｐＨ７，０）から成る緩衝液で洗浄することにより溶出し た。し１等の実施例２に記載したように、逆相クロマトグラフィー、続いてゲル 濾過クロマトグラフィーにより、混入蛋白質をイソフオーム（勾配中に分離又は 塩化ナトリウム溶液により溶出）から除去した。

実施例６：追加グリコシレージタン部位を有するヒトエリスロポエチンの類似体 Ａ、ヒトエリスロボエチン類似体の構築エリスロポエチンのアミノ酸配列の既存 及び計画の炭水化物結合部位を図５に示し、これらの追加グリコシレージョン部 位作出の手法を、図６＾−Ｃ及び以下に示した。

以下のオリゴヌクレオチドブライマーを、インビトロ突然変異用に合成した。

［Ａｓｎ４．　５ｅｒ６１　ＥＰＯ：　５＋　ＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡＡｃＣＴＣ ［ＴＧτＧ八Ｃ入へＣＣＧ＾　３１［Ａｓｎ６９１　ＥＰＯ：　５’　ＧＧＧＣ ＣＴＧＧＣＣ〜［（ＪＧＴＣＧＧＡＡＧ　３　’（＾５ｎｉ２４］　ＥＰＯ：　 ５’　ＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧ＾τＷＧＣＣ丁ｃｘｃｃ丁ＧＣ３’［Ａｓｎ１２５ ．　Ｓｃｒ１２７１　ＥＰＯ：　５’　ＣＡＧＡＴＧＣＧムムＣτＣＡ工Ω工Ｇ ＣＴＣＣ入Ｃ３’【Ａｓｎ１６３．　５＠３−１６５１　ＥＰＯ：　５’　ＡＧ ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＩムエＧＧＧムＧＣ＾Ｇ＾丁Ｇ＾ＣＣＡＧＧ丁Ｇ３’［Ｔｈ ｒ１２５１　ＥＰＯ：　Ｓ’　丁ＣＣＡＧ＾τａｃａＢ、ｃｃτＣＡＧＣＴＧＣ ＴＣ３１１ｐｒ６１２４．　丁ｈｒ１２５］　ＥＰＯ：　Ｓ’　ＣＣτｃｃ＾Ｇ ＾τＣＣＧＡＣ（：ＴＣＡＧＣＴＧＣ３雷下線を引いたコドンは、かっこで示し たアミノ酸が野生型のアミノ酸と置き変わった不適正部分を示す。

［Ａｓａ’　、　５ｅｒ６１ＥＰＯは、Ａｓｎ　４にＮ−グリコシレージョン部 位を付加させるために構築した。［＾ｓａ９．Ｓｅａ”　ＩＥＰＯは、Ａｓｎ９ にＮ−グリコシレージョン部位を付加させるために構築した。

（Ａｓｎ６９１　ＥＰＯは、Ａｓｎ６９にＮ−グリコシレージタン部位を付加さ せるために構築した。［Ａｓｎ１２５．　Ｓｅａ”　ＩＥＰＯは、ＡＧｎ　１２ ５にＮ−グリコシレージタン部位を付加させるために構築した。［Ｔｈ「１２５ ］　ＥＰＯ及びｌＰ＋ｏ１２’　、Ｔｈｅ”　ＩＥＰＯは、Ｔ）＋＋　１２５に ０−グリコシレージタン部位を付加させるために構築した。

以下のオリゴヌクレオチドブライマーを、インビトロ突然変異用辷合成した。

［Ａｓｎ６９．　Ｔｈｒ７１］　ＥＰＯ：　５＋　ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣ Ｃ？’ＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣ３曾［Ａｓｎ１２５．　Ｔｈｒ１２７］　Ｅ ＰＯ：　５’　ＣＡＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＣＡＡ慕ＣＴＣＣＡＣ３’［Ｔｈｒ１ ２５．　Ｔｈｒ１２６］　ＥＰＯ：　５’　ＣＣＡＧＡＴＧＣＧ瓦ス瓦３ＧＣＴ ＧＣＴＣＣＡ　３’ＩＰ＋ｏ１２’　、　Ｔｈｒ１２５．　Ｔｈｒ”　、　Ｔｈ ｅ”’　］　ＩＥＰＯ：［Ｐｒｏ１２’　、Ｔｈｒ１２５］ＥＰ（ｌ　ｃＤＮ＾ から開始して、オリゴヌクレオチドブライマー５′＾ＧＡＴＣＣＧＡＣＣムＣ， ＱＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣ３’を用いてＩＰ＋ｏ１２’　、Ｔｈｔ１２５．Ｔｈｅ ”　ＩＥＰＯを作出した。しかる後、オリゴヌクレオチドプライマー５’　ＴＧ ＣＴＣＣＡＣＴＣ□＾Ｃ＾＾ＴＣＡＣＴＧ　３’　を用い＜　［Ｐｒｏ”　、　 Ｔｈｅ１２５．７ｂ＋””　、　Ｔｈｅ”　］　ＥＰＯを作出した。

なｐＢ９３２２の誘　［Ａｓｎ　、　Ｔｈｅ　Ｉ　ＥＰＯ及び［Ｓ　ｅ　ｔ　” 、＾５ｒＩ６９．　Ｔｈｒ”］　ＥＰＯはＡｓｎ　６９にトグリコシレーシタン 部位を付加させ、この部位のトグリコシレーシ３ンを促進するために構築した。

（＾■１２５、Ｔｈｅ”７１ＥＰＯ，［Ａｓｎ”５．Ｔｈｅ”７．Ｔｌｕ”’　 ＩＥＰＯ，［Ｐｒｏ１２４．Ａｓｎ１２５、、．１２７　、　Ｅ、０及び［Ｐ、 、１２４　、Ａｓｎ１２５．Ｔｔｕ１２７ＩＥＰＯはＡｓｎ１２５にＮ−グリコ シレージラン部位を付加させ、この部位のトグリコシレーシランを増加させるた めに構築した。［Ｔｈｒ”５．　Ｔｈｔ１２６　、Ｅ、０．及び［Ｐｒｏ”　、 　Ｔｈ「１２５．　Ｔｈｅ”　、　５ｅａ１３’　］　ＥＰＯはＴｈｒ１２５に ０−グリコシレージョン部位を付加させ、この部位のグリコシレージジンを増加 させるために構築した。

インビトロ突然変異用エリスロポエチンＤＮＡの材料は、ｐＥｃ８中のヒトエリ スロポエチンｃＤＮ＾クローン、プラスミドｌＩａＨ（Ｌｒｗ等Ｐｒｏｃ　Ｎｔ ｌｌ、　＾ｃｔｄ、Ｓｃｉ、８３．６９２０　（１９８６年））である。

ＨＩＩ３から誘導されたプラスミドＤＮＡは、Ｂｔ！Ｅｌｆ及び［１ｇ＋１１制 限酵素で切断し、その結果できたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動 に供し、ジェネクリーン（ＧｅＩ＋ｅＣＩｅ＊ｎ　、　丁Ｍ）キット及び製造元 （１１１０１０１社）から供された手法を用いて８１Ｇ塩基対（ｂｐ）エリスロ ボエチン［１８＾フラグメントをゲルから分離した。プラスミドｐＢＲ１ｔｌａ ＥＰＯは前述のＬｉｎ特許に記載があるよう導体に挿入したＢｕｅＨｌフラグメ ントのようなエリスロボイエチンゲノム遺伝子を含む。ｐＢＲ（）ｌｕＥＰｏは 又ＢｓｔＥＩｌ及びＢ１１１＋で消化し、６５１７　ｂｐベクターフラグメント を回収した。この２個のフラグメントの連結によってＩＧＴＩを得た。ｐＥｃ− １を構築するために、ｐＤｓＶＬ（Ｌｉｎ特許に記載があり、又図５Ｂに示す） をｌ１ｇ＠Ｈ１で切断し、エリスロポエチンｃＤＮ＾を含むＩＧＴＩから単離し た２、８キロベース（ｋｂ）　Ｂｕｎ旧フラグメントをこれに連結した。

インビトロ突然変異用一本鎖ＤＮ＾を作出するために、ｐＥｃ−１をＢ　ｔｍ旧 及び１１１１１で切断し、８２０　ｂｐエリスロポエチンｃＤＮ＾フラグメント を単離した。これを■ｔ３■ｐ１８のＢ１１旧サイトに連結しｍｕ−ＥＣ−１を 作出した。Ｋｍｎｋｅ１等Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ＩＩＥ■７ｓｏ１．　１５４゜３ ６７　（１９８７年）及びＭｅｓｓｉＢ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｔ７ｓ ｏ１．１０１．２０（１９８３年）により記載されている通りに、５Ｈ−ＥＣ− １に感染させた大腸菌Ｒ２ｌ０３２株の上澄液から一本鎖ＤＮＡを回収した。イ ンビトロ突然変異のために、約１μｇの一本鎖ＤＮＡ及び１．ｉｊ　ｐｏｏｌｅ の前述の合成プライマーの１種を６１の緩衝液（２５０ｓＭ）リスｐＨ１，８， ５ｏｄ旬Ｃ＋２及び５０５Ｍジチオスレイトール）と混合した。

鋳型にプライマーをアニーリングをするために、反応容量を水で１０μｍに調整 し、この混合液を６５℃で５分間加熱した後室温まで冷却した。鎖延長反応のた めに、ｄＴＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄｃＴＰ及び＾ＴＰ　（全てｌＯ μＭ）の各２．５１を加え、引き続き１μｍ（１ユニツト）大腸菌ＤＮＡポリメ ラーゼ（フレノウフラグメント）及び１μｍ　（１ユニツト）のＴ４　ＤＮ＾リ ガーゼを加えた。しかる後、この混合液を１４℃で一晩保温し、前述のＭξ５ｚ ｉＢのように大腸菌ＪＭ　１０９　（Ｙｕｉｔｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等Ｇｅｎｅ　 ３３．　１Ｇ３　（１９８５年））を形質転換するために用いた。

ディファレンシャル（ｄ百ｆｅ＋ｅｎｌｉ＊Ｉ）ハイブリダイゼーション法によ る突然変異クローンを同定するために、普通寒天培地上のプラークをシーンスク リーンフィルターにューイングランドヌクレアー社）に移した。このフィルター を加熱灯で乾燥させた後、１％ＳＯ３を含む６０℃の６ＸＳＳＣ中で１時間保温 した。

ハイブリダイゼーションのために、前記のオリゴヌクレオチドプライマー（ｇ　 ｐＨ１ｅｓ）にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ３２Ｐ標識＾ＴＰで末端標 識し、フィルターと共に、［＾、、１２４　、突然変異については３７℃で、［ ＾■’　、Ｓｅｒ’　］突突然具については５５℃で、［Ｔｈｒ　］及び［Ｐ＋ ｏ”　、Ｔｈｅ１２５］突然変異にツイテは６５℃で、及び［Ａｓｎ　、Ｓｅｒ ］及び［＾■１６３　、　Ｓ、、１６５　、突然変異については７０℃で６ｘＳ ＳＣ、０，５％　ＳＯ３及びｌｏＯ＋Ｂ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で一晩保温した 。翌日、フィルターを室温にて６ＸＳＳＣを用いて３回洗浄し、オートラジオグ ラフィーに供した。必要に応じて、この後、本来のエリスロボエチンｃＤＮ＾配 列を有するプラークにハイブリダイセージランがほとんど又は全く検出されなく なるまで、温度を上げてフィルターを６ｘｓｓｃで洗浄した。これらの条件下で 陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示すクローンを同定し、ＩＭ　１０９ に再感染させて純粋なりローンを単離した。ジデオキシチェインターミネーショ ン配列分析は、アスパラギン、セリン、スレオニン及びプロリン残基への突然変 異が存在することを示した。［＾ｓｎ’　、　Ｓｅ＋’　］、　［Ａ■’　。

Ｓｅｒ”］、　［Ａｓｎ”］、　［Ａｓｎ１２’　］、　［Ａｓａ”５］、　［ Ｓｅ＋１２７］、　［Ａｔａ”　。

Ｓｓｔ　］、　［Ｔｈｒ　］及び［、、，１２４１丁り、１２５　、の変化を担 持する二重鎖−Ｎ　ＥＣ−Ｉ　ＤＮＡは、煮沸法（Ｈｏｌｍｅｓ等Ａｎｔ１．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ　１１７゜＋９３　（１９８１年）により　ＩＭ　＋０９形質転換 細胞から回収した。このＤＮＡをＢｚｌＥＩＩ及びＸｈｏｌｌで切断し、！１１ ０　ｂｐｘリスロポイエチンＤＮＡフラグメントを単離した。ｐＥｃ−１は、Ｂ ｔｌｌｌで切断し次に８１１１で部分切断し、その結果できたフラグメントの５ ′末端を、細菌アルカリホスファターゼを用いて１θ−關トリス、ｐＨ８中で６ ０℃で６０分間脱リン酸した。８１０　ｂｐ　Ｂｓ１Ｈ１−ＢＨＩＩＩフラグメ ントを欠いた７　ｋｂベクターフラグメントを分離し、上記のエリスロポエチン フラグメントに連結した。この結果できたプラスミド（ｐａｃ−ｘと命名、ここ でＸは個々の突然変異を表す）は、示した位置で変更したアミノ酸残基を有する ヒトエリスロボエチンを含む。

ヒトエリスロポエチン配列及び［＾ｓｎ’　、　Ｓｅｒ’　］、　１Ａｓｎ’　 、　Ｓｅｒ”］、　［Ａ＋Ｉｌ］、　［Ａｓｎ１２’　］、　［Ａｓｎ１２５． ５ｅ−２７］、　［Ａｓｎ”　、　Ｓｅｒ”５］。

［Ｔｈｒ　］　及び［Ｐｒｏ１２’　、Ｔｈｅ１２５］　ｘリスロポエチンｃＤ Ｎ＾クロ−ンに対応する類似体のｃＤＮ＾ＤＮＡンは、エレクトロポレーション によりＣＯ５−１細胞（＾ＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェク トした。ＣＯ３−１細胞は、半集密的皿から回収し、培地（５％牛脂児血清及び １％Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（アービンサイエンティ フィク社）を含むダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｏｏ）の改変必須培地）で洗浄し、 ４ＸｌＯ’　ｃｅｌｌ＋／ｍｌの密度で再懸濁させた。１１の細胞を、エレクト ロポレーションキュベツト（バイオラッド社）に移し、１００から２００μｇの 担体ＤＮＡ及びエリスロボエチン類似体をコードした２から２０ｕｔのプラスミ ドＤＮＡの存在下、バイオラッドシーンパルサー（Ｂｉｏ−ＬｄＧｅｎｅ　Ｐｗ ｌｔｅｒ　、　ＴＭ）を用いて、２５マイクロフアラツド及び１６００ボルトで エレクトロボレーシランした。エレクトロポレーションした細胞を、組織培養皿 （直径６ｈａ）当り　２Ｘ　１０’個で５−１の培地中に接種した。接種の２か ら４時間後、５１の新鮮な培地で置き換えた。エレクトロポレーションの３から ５日後、ならしくｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　）培地を集めた。

Ｂ、エリスロポエチン類似体の活性分析前述のＥｇ＋ｉｅ等の手法に従ってＩＩ ＩＡを行った。エリスロポエチン類似体のインビボ生物学的活性は、低酸素赤血 球増加症マウスバイオアッセイ（ＣｏｌｅＩ等、前述）により測定した。

インビトロエリスロボエチン活性は、ｌＩＣ０マｅ等１．Ｃｅ１ｌ　Ｐｂｙｓｉ ｏｆ、　８３．　３０９−３２０　（１９７４年）により記載されている赤芽球 コロニー形成分析法を改変して測定した。ヒト骨髄細胞由来の単核化細胞を、フ ィコール／バク−クッション（Ｉｉｃｏｌｌ−ｐ＊ｑｗｅ　ＣＤｈｉｏｎ）上で 部分精製した後、ブレーティングに先立ち吸着性細胞を除くためにｌ５ｃｏマｅ の培地中で洗浄した。培養培地は、０．９％メチルセルロースを含むが、牛血清 アルブミンは含まなかった。

培養の８から１０日後、赤芽球コロニーを計数した。

セクション＾に記載したように、ＣＯ３細胞にトランスフェクトし発現したエリ スロポエチン類似体は、Ｒ１＾及び赤芽球コロニー形アッセイにより、未精製の ＣＯ５細胞上澄液中で分析した。

ヒト由来配列のエリスロポエチンは、前記の分析により決定したＲ１＾活性に比 するインビトロ活性を有した。類似体の１＾、、６９］ＥＩ’Ｏ，［＾■、　Ｓ ｅｒ　］　ＥＰＯ，［ＴＩＩＩ　］　ＥＰＯ，及び［Ｐｒｏ１２’　、　Ｔｂ＋ １２５　、Ｅ、０は、ＩＩＩＡ活性に比するインビトロ活性を示し、（セクショ ンＣで決定するように）追加炭水化物鎖を有することを証明した。これらの類似 体は、エリスロボエチン類似体をコードしているｃＤＮＡクローンをＣＨＯ細胞 にトランスフェクトし、エリスロボエチン類似体を精製し、精製類似体のインビ ボ生物学的活性を測定することにより更に分析した。

Ｃ，ウェスタンプロット分析 セフシラン＾に記載した通りにエリスロポエチン類似体ｃＤＮＡでトランスフェ クトしたＣＯ５細胞から得た５−２００を含む一定量の上澄液を、ウサギ抗エリ スロボエチンポリクローナル抗体を用いて室温で一晩免疫沈降させた。リン酸緩 衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させたプロティンＡ−セファロースｌ：ｌの２０〜８ ０μｍを免疫沈降物に加え、室温で１時間保温した。この試料を遠心し、ＰＢＳ で洗浄し、特に指示する場合は、ペレットを１グリカナーゼで処理しト結合炭水 化物鎖を除去した。この試料を１５％ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 により分析し、ニトロセルロースに移して、マウス抗エリスロポエチンモノクロ ーナル抗体］　の混合物を用いて、Ｂｏｒｎｅｌｌｅ等＾ｎｓ１．　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１１２．　１９５−２０３（１９８１年）及びＥｌｌｉｏ１等Ｇｅｎｅ　 ７９．　１６７−１８［１（１９８９年）に記載されている通りにウェスタン分 析に供した。このような抗体ノーツとして９Ｇ８＾がＥｌｌｉｏｊ等（１９８９ 年）　Ｂｌ＋＋ｏｄ　ｙｔｓｗｐｐ、ｉ、　＾。

１２２８に記載されている。

（＾Ｉｎ　ＩＥＰＯ及び［Ａｓａ”　、　Ｓｅｒ”　）ＥＰＯｃＤＮ＾でトラン スフェクトしたＣＯ５細胞上澄液の分析は、ヒト由来配列のエリスロボエチンと 比較して蛋白質のサイズが増加していることを示した。

このサイズの増加は、追加ト結合炭水化物鎖を示唆している（図７　）　、　［ Ｔｈｒ　ＩＥＰＯ，及び、、、、１２４　、丁ｈｒ１２５ＩＥＰＯｃＤＮ＾でト ランスフェクトしたＣＯ３細胞から得た上澄液のトグリカナーゼを用いた処理は 、ヒト由来配列のエリスロポエチンと比較して蛋白質のサイズが増加しているこ とを示した。このサイズの増加は、追加〇−結合炭水化物鎖を示唆している（図 ８）。

Ｄ、エリスロポエチン類似体イソフオームの単離エリスロボエチン類似体（Ｔｈ ｒ”５ＩＥＰＯは、セクション＾の記載通りに構築した。［Ｔｈｒ１２５］突然 変異を担持する８１０　ｂｐのエリスロボエチンｃＤＮ＾フラグメントは、［Ｔ ｈ、＋２５　、突然変異を含むプラスミドｐＥＣをＢｓ１ＨＩ及びＢｇｌｌｌで 切断することにより単離し、ｐＤＳα２の誘導体であるｐＤＥｃΔにこのフラグ メントを連結した。ｐＤＳα２は、参照により本明細書に含めた共通所有の米国 特許出願番号５０１．９（１４に記載されている。ｐＤＥＣΔは、以下の段階に よりｐＤｓα２から誘導した：（１）　ｐＤｓ　ａ２の旧ｎｄｌ１１部位は、Ｒ ｉｎｄｌｌｌでｐＤｓ　ａ２　ＤＮＡを切断し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フ レノウフラグメント）及びｄＮＴＰｓで旧ｎｄｌｌｌ付着末端を処理し、プラン トエンド化したベクターに再連結することによって欠落させた。この結果できた プラスミドがｐＤＳα２ΔＨである。

（２）ρＤＳα２ΔＨをＳＪＩ＋で切断し、これを、スプライスシグナルの３　 ′末端に付加した５ｚｌｌリンカ−を含むＳＶ４０スプライスシグナルを有する 合成オリゴヌクレオチドに連結した。合成オリゴヌクレオチドは、以下の配列を 有した。

へへＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＭＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣ入ＡＣＡＡＧＣ ＴＧＧＴＣＧへＣＣ３’この結果できたプラスミドがＩ＋＋＋５α２ΔＨスプラ イスである。

（３）ｐＤＳα２ΔＨスプライスは、５ｔｌｌで切断し、ＴＪ　ＤＮＡポリメラ ーゼ及びｄＮＴＰｓで付着末端を処理することによりプラントエンド化した。Ｈ Ｏｂｐ、Ｂ！ｍＨＩ−Ｂｇｌｌｌ　ヒトエリスロボエチンｃＤＮＡフラグメント は、同じ方法によりプラントエンド化し、プラスミドに連結した。この結果でき たプラスミドがｐＤＥＣである。

（４＞ｐＤＥＣは、Ｋｐｎｌ及びＰｖｕｌｌで切断し、リョクトゥ（ｓｕｎｇｂ ｅｕ）ヌクレアーゼで付着末端を処理することによりプラントエンド化した。切 り出したにｐｎｌＰマａｌｌフラグメントを欠落させるために再連結し、この結 果できたプラスミドが９０ＥＣΔである。

［Ｔｂ＋１２５］　エリスロボエチンｃＤＮ＾を含むプラスミドｐＤＥＣΔをＤ ）ＩＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＣＩ（Ｏ細胞でならした培 地７７０１を１万ダルトン分子量カットオフのメンブレンを用いて濃縮し、１（ ｌ　ｄ　トリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，６で最終容量３４１になるまで透析濾過 した。濃縮液の一部（１７ｍｌ）を、同じ緩衝液で平衡化したＱ−セファロース ファーストフローカラム（５−１ベツドボ’Ｊニーム）ｌ：供し、１０　ｍＷ　 トリＸ−１１ＣＩ　、　ｐＨｇ、　６中＜７）　０−２５０　ａ＋Ｍ　ＮｌＣｌ の直線勾配によって溶出させた。カラムフラクションの一部を、未処理で又はＮ −グリヵナーゼで切断して、５Ｏ５−Ｐ＾ＧＥ又はＩＥＦで分析し、プール（２ ，３及び４と命名）をフラクシタンの炭水化物及び／又はイソフオームの組成に 基づいて集めた。各プールヲヒ’ｌり（Ｖｔｄｓｃ）　Ｃ４カラム（２１４Ｔｐ Ｈ２０３０；直径ｌ　ｃｍ　；　１．８−２．５　ｍｌベッドボリューム；　（ １，３４ｍ１７分）に供し、１０１Ｍトリス−＋１ＣＩ、ｐＦＩ　７．０に溶解 させた２０％エタノールのカラム容量の２倍量で洗浄した。このカラムを２０− ９４％エタノールのｌＯ霞關トリス−１１ｃＩ、ｐＨ７，０の直線勾配で溶出し た。プールを集め、ＩＯｓＭ）　！Ｊ　ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，０テ希釈し、Ｑ− セフ　７０−７．７　ｙ　−ストフローカラムに供した。ｌＯ會關トリス−ＨＣ ｌ、　ｐＨ７，０で洗浄した後、試料を２０　ｓＭクエン酸ナトリウム、２５０ 　ｓＭＮ畠Ｃ１，ｐｔｔ　７．０で溶出させた。精製した。Ｔｈ、Ｉ２５　、プ ールをＩＥＦにより分析し、図９に示した。ＥＰＯ＠似体は、前述（Ｃｏ１ｇ寝 等、前述）したようにインビボ生物学的活性を分析した。

以上に、本発明をその好ましい実施態様を用いて説明したが、これらの態様に限 定されるものではない。添付のクレームの精神及び範囲に包含される変形物及び 等価物は本願発明に含まれるものであり、クレームの範囲はこのような変形物の 及び等価物を全て含むように最も広い解釈によるべきである。

インヒ゛爪　υ／Ｍ（＞　Ｔ：　、／ｚ７．チドｒ／ ＠　錫　蛎 インし′才、ＵＡＧ　、ｔ１ノＲフォトｌ￥１５ ０　口 ↓ 口 ＮＳ ０口 Ｓ 口 ｒ′−） 一−−−＾−ＩＭｌｂ”＋＋ｉ、。

口　８ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エリスロポエチンイソフォーム。 ２．イソフォームが、ヒト以外の真核宿主細胞中での外来性ＤＮＡ配列の発現生 成物である請求項１に記載のエリスロポエチンイソフォーム。 ３．イソフォームが、１−１６５又は１−１６６のヒトエリスロポエチンアミノ 酸配列を有するエリスロポエチンからなる請求項１に記載のエリスロポエチンイ ソフォーム。 ４．エリスロポエチン１分子当り１〜１４から選ばれる特定数のシアル酸を有す る請求項１に記載のエリスロポエチンイソフォーム。 ５．エリスロポエチン１分子当り１４個を超えるシアル酸を有する請求項１に記 載のエリスロポエチンイソフォーム。 ６．エリスロポエチン１分子当り１４個のシアル酸を有する請求項１に記載のエ リスロポエチンイソフォーム。 ７．エリスロポエチン１分子当り１３個のシアル酸を有する請求項１に記載のエ リスロポエチンイソフォーム。 ８．エリスロポエチン１分子当り１０個のシアル酸を有する請求項１に記載のエ リスロポエチンイソフォーム。 ９．真核宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項２に記載のエリスロポエチンイソフ ォーム。 １０．治療学的に有効な量の請求項１に記載のエリスロポエチンイソフォームと 、医薬的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体を含む医薬用組成物。 １１．４種未満のエリスロポエチンイソフォームの混合物を含む組成物。 １２．エリスロポエチン１分子当り１２個未満のシアル酸を有するエリスロポエ チンイソフォームの混合物を含む組成物。 １３．エリスロポエチン１分子当り９，１０及び１１個のシアル酸を有するエリ スロポエチンイソフォームの混合物を含む請求項１２に記載の組成物。 １４．エリスロポエチン１分子当り１１個を超えるシアル酸を有するエリスロポ エチンイソフォームの混合物を含む組成物。 １５．エリスロポエチン１分子当り１３〜１４個のシアル酸を有するエリスロポ エチンイソフォームの混合物を含む請求項１４に記載の組成物。 １６．エリスロポエチン１分子当り特定数のシアル酸を有するエリスロポエチン 分子から本質的に成るエリスロポエチン。 １７．エリスロポエチン１分子当り１〜１４から選ばれる特定数のシアル酸を有 するエリスロポエチン分子から本質的に成るエリスロポエチン。 １８．エリスロポエチン１分子当り１４を超えるシアル酸を有するエリスロポエ チン分子を含むエリスロポエチン。 １９．エリスロポエチン１分子当り１４個のシアル酸を有する請求項１６に記載 のエリスロポエチン。 ２０．エリスロポエチン１分子当り１３個のシアル酸を有する請求項１６に記載 のエリスロポエチン。 ２１．エリスロポエチン１分子当り１０個のシアル酸を有する請求項１６に記載 のエリスロポエチン。 ２２．分子が、ヒト以外の真核宿主細胞中での外来性ＤＮＡ配列の発現生成物で ある請求項１６に記載のエリスロポエチン。 ２３．エリスロポエチンが、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有する請求 項１５に記載のエリスロポエチン。 ２４．治療学上有効な量の請求項１５に記載のエリスロポエチンと、医薬的に許 容可能な希釈剤、アジュバント又は担体を含む医薬用組成物。 ２５．エリスロポエチン１分子当り４個未満の特定数のシアル酸を有するエリス ロポエチン分子の混合物を含む組成物。 ２６．エリスロポエチン１分子当り１２個未満のシアル酸を有するエリスロポエ チン分子の混合物を含む組成物。 ２７．エリスロポエチン１分子当り１１個を超えるシアル酸を有するエリスロポ エチン分子の混合物を含む組成物。 ２８．エリスロポエチン１分子当り１３〜１４個のシアル酸を有するエリスロポ エチンイソフォームの混合物を含む請求項２７に記載の組成物。 ２９．精製したエリスロポエチンを調製用等電点電気泳動に供し、単一のイソフ ォームを当該泳動ゲルより溶出させることから成るエリスロポエチンイソフォー ムの製法。 ３０．エリスロポエチンを含有する物質をイオン交換クロマトグラフィーに供す ることから成る、エリスロポエチン１分子当りのシアル酸が所定数を超えるエリ スロポイエチン分子の混合物の製法。 ３１．エリスロポエチンを含有する物質を等電点クロマトグラフィーに供するこ とから成る、エリスロポエチン１分子当りのシアル酸が所定数を超えるエリスロ ポイエチン分子の混合物の製法。 ３２．治療学上有効な量の請求項２６に記載の組成物を投与することから成る、 哺乳動物のヘマトクリットレベル増加法。 ３３．［Ａｓｎ６９］ＥＰＯ；［Ａｓｎ１２５，Ｓｅｒ１２７］ＥＰＯ；［Ｔｈ ｒ１２５］ＥＰＯ及び［Ｐｒｏ１２４，Ｔｈｒ１２５］ＥＰＯからなる群より選 ばれるヒトエリスロポエチン類似体。 ３１．［Ａｓｎ６９］ＥＰＯ；［Ａｓｎ１２５，Ｓｅｒ１２７］ＥＰＯ；［Ｔｈ ｒ１２５］ＥＰＯ及び［Ｐｒｏ１２４，Ｔｈｒ１２５］ＥＰＯからなる群より選 ばれるヒトエリスロポエチン類似体をコードするＤＮＡ配列から本質的に成る精 製単離したＤＮＡ配列。