FI105688B - Menetelmä biologisesti aktiivisten erytropoietiini-isoformien tai näiden seosten valmistamiseksi - Google Patents

Description

105638

Menetelmä biologisesti aktiivisten erytropoietiini-isofor-mien tai näiden seosten valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisten 5 erytropoietiini-isoformien tai näiden seosten valmistamiseksi, joissa isoformeissa on 1 - 14 siaalihappoaryhmää erytropoietiinimolekyyliä kohti. Tässä kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät näitä isoforme-ja tai niiden seoksia, ja hoitomenetelmiä, joissa käyte-10 tään näitä isoformeja ja koostumuksia.

Keksinnön tausta

Erytropoietiini on glykoproteiinihormoni, joka osallistuu punasolujen kantasolujen kypsymiseen erytrosyy-teiksi. Se on välttämätön verenkierrossa olevien punasolu-15 jen määrän säätelyssä. Luonnossa esiintyvä erytropoietiini valmistetaan maksassa sikiövaiheen aikana ja munuaisissa aikuisilla, ja se kiertää veressä ja stimuloi punasolujen muodostumista luuytimessä. Anemia johtuu miltei poikkeuksetta munuaisten häiriöstä. johtuen vähentyneestä erytro-20 poietiinin tuotannosta munuaisista. Rekombinantti-eryt- ropoietiinin, joka on tuotettu geenitekniikalla, käsittäen proteiinituotteen ilmentämisen erytropoietiinia koodaaval-.·, ; la geenillä transformoidussa isäntäsolussa, on todettu

• M

olevan tehokas käytettynä kroonisesta munuaishäiriöstä • · t ] 1. 25 johtuvan anemian hoidossa.

• · · 1· Viime aikoihin saakka on erytropoietiinin saatavuus · · · « ollut hyvin rajoitettua. Vaikka proteiinia on ihmisen 105688 2 252, 5558 (1977), käytettiin lähtöaineena aplastista anemiaa sairastavien yksilöiden virtsaa.

Erytropoietiinia koodaavien geenien tunnistus, kloonaus ja ilmentäminen on kuvattu Lin'ille myönnetys-5 sä US-patentissa 4 703 008. Kuvaus rekombinantti-erytro-poietiinin puhdistuksesta ravintoalustasta, jolla pidettiin yllä rekombinantti-erytropoietiiniplasmideja sisältäviä nisäkäs-isäntäsoluja, on sisällytetty Lai'lie et ai. myönnettyyn US-patenttiin 4 667 016. Biologisesti aktiivi-10 sen rekombinantti-erytropoietiinin ilmentäminen ja talteenotto erytropoietiinigeenin rekombinanttiplasmi-deissa sisältävistä nisäkäs-isäntäsoluista on ensimmäistä kertaa tehnyt saatavissa olevaksi sellaiset määrät erytropoietiinia, jotka soveltuvat terapeuttiseen käyttöön. 15 Lisäksi geenisekvenssin tunteminen ja puhdistetun pro teiinin suurempien määrien saatavuus on johtanut tämän proteiinin toimintatavan parempaan ymmärtämykseen.

Proteiinin biologinen aktiivisuus riippuu sen rakenteesta. Erityisesti proteiinin primaarirakenne 20 (i.e. sen aminohapposekvenssi) tarjoaa informaatiota, joka sallii sekundaari- (se on α-heliksin tai β-levyn) ja ter-tiaari- (kolmiulotteisen kokonaislaskostumisen) rakentei- * · t ,·. : den muodostumisen polypeptidin synteesin aikana ja sen • « jälkeen. Oikean sekundaari- ja tertiaarirakenteen hajoami- • · « ’ 25 nen mutaatioiden tuottamisessa tai kemiallisissa tai ent- * · · '· "j symaattisissa käsittelyissä voi johtaa biologisen aktiivi suuden vähenemiseen.

• M

·.· · Prokaryoottisissa organismeissa proteiinien biolo gista aktiivisuutta säädellään suurelta osin yllä kuvaili 30 tuilla rakenteilla. Toisin kuin prokaryoottisten solujen proteiinit, monia eukaryoottisten solujen pinta- ja erit- • · · tyviä proteiineja modifioidaan yhdellä tai useammalla · oligosakkaridiryhmällä. Tämä modifikaatio, jota kutsutaan I · '··' glykosylaatioksi, voi dramaattisesti vaikuttaa proteiinien *:··: 35 fysikaalisiin ominaisuuksiin, ja voi myös olla tärkeä pro- • 4 105688 3 teiinien stabiilisuudelle, eritykselle ja solunsisäiselle lokalisaatiolle. Oikea glykosylaatio voi olla olennainen ; biologiselle aktiivisuudelle. Itse asiassa kun jotkin gee nit eukaryoottisista soluista ilmennetään bakteereissa 5 (esim. E. colissa), joilta puuttuu solun toiminnot proteiinien glykosylaatioon, ne tuottavat proteiineja, jotka saadaan aktiivisuudeltaan vähäisinä tai ilman aktiivisuutta glykosylaation puuttumisen vuoksi.

Glykosylaatio tapahtuu spesifisissä paikoissa po-10 lypeptidin rangassa ja sitä on yleensä kahta tyyppiä: O-sidotut oligosakkaridit kiinnitetään seriini tai treo-niinijäännöksiin, kun taas N-sidotut oligosakkaridit kiinnitetään aspärägiinijäännöksiin, kun ne ovat osana sekvenssiä Asn-X-Ser/Thr, jossa X voi olla mikä tahansa 15 aminohappo paitsi proliini. N-sidottujen ja O-sidottujen oligosakkaridien rakenteet ja sokerijäännökset, jotka eri tyypeissä esiintyvät, ovat erilaiset. Yksi tyyppi sokerista, joka esiintyy yleisesti kummassakin, on N-asetyylineu-ramiinihappo (jota tästä lähtien kutsutaan siaalihapoksi). 20 Siaalihappo on yleensä terminaalinen jäännös sekä sidotuissa että O-sidotuissa oligosakkarideissa ja negatiivi-sen varauksensa vuoksi se voi antaa happaman ominaisuuden .·. ; glykoproteiinille.

« · ·

Sekä ihmisen virtsasta peräisin oleva erytro- » · · *. 25 poietiini että rekombinanttierytropoietiini (ilmennetty • · · * j nisäkässoluissa), jolla on ihmisen erytropoietiinin amino happosekvenssi 1 - 165, sisältävät kolme N-sidottua ja • · · · yhden O-sidotun oligosakkaridiketjun, jotka käsittävät yhdessä noin 40 % glykoproteiinin kokonaismolekyylipainos- 3 0 ta. N-sidottu glykosylaatio tapahtuu asparagiinijäännök- - sissä, jotka sijaitsevat asemissa 24, 38 ja 83, kun taas ·♦· O-sidottu glykosylaatio tapahtuu seriini jäännöksissä, jot-ka sijaitsevat asemassa 126 (Lai et ai. J. Biol. Chem.

• · 261, 3116 (1986); Broudy et ai.. Arch. Biochem. Biophys.

·:*·: 35 265, 329 (1988)) . Oligosakkaridiketjujen on osoitettu ole- MIM -------- • a 105688 4 van modifioituja terminaalisilla siaalihappojäännöksillä. Glykosyloidun erytropoietiinin entsymaattinen käsittely kaikkien siaalihappojäännösten poistamiseksi johtaa aktiivisuuden vähenemiseen in vivo, mutta ei vaikuta aktiivi-5 suuteen in vitro (Lowy et ai., Nature 185, 102 (1960);

Goldwasser et ai., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Tätä käyttäytymistä on selitetty nopealla asialoerytropoietii-nin poistumisella kierrosta vuorovaikutuksella maksan asialoglykoproteiinia sitovan proteiinin kanssa (Morrell 10 et ai., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et ai.,

Am. J. Physiol. 227, 1385 (1974); Ashwell et ai., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Siten erytropoietiinilla on aktiivisuutta in vivo vain kun se on sialyloitu välttämään sen sitoutumista maksan sitovaan proteiiniin.

15 Muiden osatekijöiden osuutta erytropoietiinin oli- gosakkaridiketjuissa ei ole määritelty hyvin. On osoitettu, että glykosyloimattomalla erytropoietiinilla on suuresti vähentynyt aktiivisuus in vivo, verrattuna glykosy-loituun muotoon, mutta että se säilyttää aktiivisuuden 20 in vitro (Dordal et ai., Endocrinology 116, 2293 (1985);

Lin, patentti supra). Toisisssa tutkimuksissa kuitenkin N-sidottujen tai O-sidottujen oligosakkaridiket jujen .·. ; poistaminen erikseen tai yhdessä, asparagiini- tai serii- • · · nijäännösten, jotka ovat glykosylaatiopaikkoja, mutage- • · · 25 neesillä, vähentää jyrkästi nisäkässoluissa tuotetun • t · • · φ • · muunnetun erytropoietiinin aktiivisuutta in vitro (Dube et ai., J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).

·»· • ♦ ♦ *.* · Glykoprotennit, kuten erytropoietiini, voidaan erotella erilaisiin varattuihin muotoihin käyttäen teknii-! : 30 koita, kuten isoelektristä fokusointia (IEF). Useat tahot ·***; ovat raportoineet puhdistamattomien ja osittain puhdistet- • · · .♦* tujen erytropoietiinivalmisteiden IEF-tutkimuksista (Lu- *... kowsky et ai., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et ai. , • · ';·* Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et ai., Biochem. Bio- 35 phys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Enintään kolme tai neljä « · 105688 5 erytropoietiiniaktiivisuutta omaavaa fraktiota havaittiin IEF:llä näissä tutkimuksissa, ja mitään niistä ei karakterisoitu hiilihydraattisisällön suhteen. Myöskään korrelaatiota fraktioiden isoelektristen pisteiden ja biologisen 5 aktiivisuuden välillä ei tehty.

Virtsan erytropoietiinin puhdistuksen aikana ihmisen virtsasta, kuten ovat kuvanneet Miyake et ai., supra. kahdella erytropoietiinifraktiolla hydroksyyliapatiitti-kromatografiästä, nimetty II ja IIIA, raportoitiin olevan 10 sama spesifinen aktiivisuus. Seuraava fraktioiden II ja IIIA hiilihydraattianalyysi osoitti, että fraktiolla II on suurempi keskimääräinen siaalihappopitoisuus kuin fraktiolla IIIA (Dordal et ai. suora).

Tämän keksinnön tarkoitus on tuottaa erillisiä ja 15 eristettyjä erytropoietiinin isoformeja, joilla on määrätty siaalihappopitoisuus ja biologinen aktiivisuus. Tällaisia molekyylejä sisältävillä farmaseuttisilla koostumuksilla olisi terapeuttista hyötykäyttöä.

Yhteenveto keksinnöstä 20 Keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisten erytropoietiini-isoformien tai näiden seosten valmistami- ;·. seksi, joissa isoformeissa on 1 - 14 siaalihapporyhmää • « · · erytropoietiinimolekyyliä kohti. Keksinnön mukaiselle me- • · · .* netelmälle on tunnusomaista, että (a) puhdistettu erytro- • · ’ 25 poietiini saatetaan preparatiiviseen isoelektnseen fo- • · · *· *| kusointiin ja yksittäinen isoformi, jolla on yksi ainoa * ' isoelektrinen piste, eluoidaan geelistä, tai (b) erytro- • · · V * poietiinia sisältävä materiaali saatetaan ioninvaihtokro- matografiaan tai kromatofokusointiin, ja isoformien seos : **: 30 otetaan talteen.

··· . ·***· Keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa erytropoi- ··♦ — etiinimolekyylien seoksia, joilla molekyyleillä on ennalta • · - määrättyä suurempi määrä, tai vaihtoehtoisesti pienempi » · määrä siaalihappoa molekyyliä kohti.

'·«·· ......

i · < « * I I • « 6 105688

Kuvataan myös farmaseuttisesti hyväksyttäviä, erytropoietiinin isoformeja sisältäviä koostumuksia. Lisäksi kuvataan menetelmiä hematokriittitasojen nostamiseksi nisäkkäillä, mikä käsittää terapeuttisesti hyväksyttä-5 vän määrän annon näitä koostumuksia, lisäämään retiku-losyyttien ja punasolujen tuotantoa.

Lyhyt kuvaus kuvioiden sisällöstä

Kuvio 1 esittää erillisten rekombinanttierytro-poietiini-isoformien analyyttisen isoelektrisen fokusoin-10 tigeelin. Geelin kaistat 1-11 esittävät isoformeja vähemmän happamasta (korkeampi pl) kaistassa 1, happamampaan (alempi pl) kaistassa 11. Puhdistettu rekombinanttieryt-ropoietiini, joka sisältää isoformien 9-14 seoksen, on myös esitetty geelissä äärivasemmalla ja -oikealla.

15 Kuvio 2 esittää yhteyden siaalihapon määrän välillä erytropoietiini-isoformia kohden ja jokaisen isoformin spesifisen aktiivisuuden in vivo. ilmaistuna yksikköinä per mg erytropoietiinipolypeptidiä. Kuviossa 2A jokaisen erytropoietiini-isoformin konsentraatio määritettiin 20 Bradfordin proteiinimääritysmenetelmällä; kuviossa 2B kon sentraatio määritettiin absorbanssilla 280 nm:ssä, kuvios-sa 2C konsentraatio määritettiin RIA:lla.

* · · .·, ; Kuvio 3 esittää analyyttisen isoelektrisen foku- * · i 'ly sointigeelin rekombinanttierytropoietiini-isoformien mää- • · · .* *. 25 rätyille seoksille, jotka on valmistettu anioninvaihto- • · · * Ί kromatografiällä eri olosuhteissa. Geelikaistat 1 - 6 edustavat vastaavasti erytropoietiini-isoformeja, jotka on ·«( • · · V * eluoitu korkeissa suolapitoisuuksissa sen jälkeen kun on pesty Q-Sepharose-nopeavirtauspylväässä 150 mM etikkaha-30 polla, pH 4,7, 150 mM etikkahapolla (puskuroimaton) , ·***: 200 mM etikkahapolla, pH 4,7, 250 mM etikkahapolla, »·« pH 4,7, 300 mM etikkahapolla, pH 4,7, tai 300 mM etikka- * · · hapolla (puskuroimaton) . Puhdistettu rekombinanttierytro- • · ’···’ poietiini, joka sisältää seoksen isoformeja, saatu *:··: 35 käyttäen menettelytapoja, jotka on kuvattu Lain et ai., * « · 105688 7 supra. esimerkissä 2, paitsi että DEAE-agaroosikromato-grafia on korvattu Q-Sepharose-kromatografiällä, on myös esitetty geelin vasemmassa äärilaidassa.

Kuvio 4 esittää erytropoietiini-isoformien 8-12 5 erottelun, joka on saatu aikaan saattamalla Q-Sepharose-pylvääseen annosteltu säädetty solujen ravintoalusta laskevan pH:n gradienttiin ja lisäämällä ionivahvuutta. Näytteet parillisin lmhiin numeroiduista fraktioista, fraktiosta 2 fraktioon 40, saatettiin analyyttiseen isoelekt-10 riseen fokusointiin..,. Puhdistettu rekombinanttierytropoi- etiini, joka sisälsi seoksen isoformeja, jotka oli saatu Lain et ai. suora kuvaaman esimerkin 2 mukaisilla menetelmillä, paitsi että DEÄE-ägaroosikromatografia on korvattu Q-Sepharosekromatografiällä, on myös esitetty geelin va-15 semman äärilaidan kaistassa.

Kuvio 5 esittää ihmisen erytropoietiinin aminohapposekvenssin. Neliöt . osoittavat asparagiinijäännöksiä, joihin hiilihydraattiketjut ovat kiinnittyneet, ja tähdet osoittavat hiilihydraatilla modifioituja treoniini- ja 20 seriinijäännöksiä, jotka on kuvattu tästä jakamalla erotetussa hakemuksessa FI 964648.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus » * .·, ; Keksinnön mukaisesti valmistetaan siis erytro- • « /•y poietiini-isoformeja. Isoelektrinen fokusointi (IEF) • · « - ;-----t.

25 erottelee proteiinit varauksen perusteella. Asetettuna • » * • *j pH-gradienttiin ja__saatettuna sähköiseen kenttään, proteiinit liikkuvat kohtaan, jossa niillä ei ole net- ··· *· • · · ...

* tovarausta, ja pysyvät siinä. Tama on proteiinin iso elektrinen piste (pl). Jokainen IEF:ssä havaittu erillinen '...· 30 vyöhyke edustaa molekyylejä, joilla on tietty pl ja siksi ; ·***: sama kokonaisvaraus, ja jota nimitetään isoformiksi. Mää- ··« ---------- ./ ritelmä "erytropöietilni-isoformi" käytettynä tässä viit- • · · --------- f -taa erytropoietiinivalmisteisiin, joilla on yksi pl ja *·;·’ sama aminohapposekvenssi.

• « i i < · « - ·· 105688 8

Edullisessa suoritusmuodossa erytropoietiini on ei-ihmisalkuperää olevaan eukaryootti-isäntäsoluun transfek-toidun eksogeenisen DNA:n ilmentymisen tuote, mikä tarkoittaa, että edullisessa suoritusmuodossa erytropoietiini 5 on "rekombinantti-erytropoietiini". Rekombinantti-erytropoietiini tuotetaan edullisesti niiden menetelmien mukaan, jotka on kuvattu US-patentissa 4 703 008, Lin et ai., mikä esitetään tässä viitteenä. Rekombinantti-erytropoietiini puhdistetaan edullisesti yleisten menettelytapojen mukaan, 10 jotka on kuvattu yleisesti US-patentin 4 667 016, Lai et ai., esimerkissä 2, mikä esitetään tässä viitteenä, tai vaihtoehtoisesti menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 2, missä DEAE-agaroosikromatografia on korvattu Q-Sepharo-se-kromatografiällä. Q-Sepharose-pylväsmodifikaatiossa 55 15 mM NaCl korvaa 25 mM NaCl:n puskuriliuoksessa, jota käytetään saattamaan pylväs neutraaliin pH-arvoon, ja 140 mM NaCl korvaa 75 mM NaCl:n puskuriliuoksessa, jota käytetään eluoimaan erytropoietiini pylväästä. Tämä materiaali, analysoituna natriumdodekyyli sulfaatt ipolyakryy 1iamidigee- 20 lielektroforeesilla, liikkuu yhtenä lajina (se on vyöhykkeenä) . Kun puhdistettu erytropoietiini saatetaan IEF:iin, 'j'. saadaan näkyviin suuri joukko vyöhykkeitä, mikä osoittaa, .·, ; että glykoproteiinin eri varauksen omaavia muotoja on läs- • · • · „ • . na.

< I ( • · * : \ 25 On havaittu, että rekombinantti-erytropoietiinin « · « '· eri isoformit, joilla on virtsasta saadun ihmisen erytro- ’ poietiinin aminohapposekvenssi, vastaavat erytropoietiini- ·*·* *.· · molekyylejä, joissa on 1 - 14 siaalihappoa, ja puhdiste tussa rekombinantti-erytropoietiinissa olevalla jokaisella lj“i 3 0 isoformilla on aktiivisuus in vivo, joka on yhteydessä ·"'· isoformin sisältämien siaalihappojen määrään. Määritelmä • · * "erytropoietiini" tässä käytettynä käsittää luonnossa * * * esiintyvän erytropoietiinin, virtsasta eristetyn ihmisen ’···’ erytropoietiinin, sekä luonnossa esiintymättömät polypep- ':*·: 35 tidit, joilla on riittävästi samanlainen aminohapposek- « « i 105688 9 venssi ja glykosylaatio luonnossa esiintyvään erytro-poietiiniin nähden saamaan niille biologiset ominaisuudet in vivo aiheuttamaan luuydinsolujen retikulosyyttien ja punasolujen tuoton lisääntymisen.

5 Erytropoietiinin raakavalmisteet sisältävät monia isoformeja, mutta materiaali, joka on puhdistettu esimerkiksi kuten Lain et__al, patentissa, supra, esimerkki 2, sisältää pääasiassa kuutta isoformia IEF:llä analysoituna. Lisäksi vähintään yksi happamampi isoformi lisää, on ha-10 vaittu käyttämällä esimerkissä 4 kuvattuja menettelytapoja. (Tämä happamampi muoto, joka liikkuu > 14 siaalihapon kohdassa IEF-geelissä, voi sisältää siaalihaposta riippumattomia negatiivisia varauksia, kuten osoitetaan joidenkin näiden varauksien resistenssillä siaalidaasilla pilk-15 komiselle). Isoformit eroavat toisistaan siaalihappopitoi-suuden osalta. Kuten esimerkeissä on esitetty, tämä osoitetaan eristämällä 10 _ näistä isoformeista valmistavalla IEF:llä ja määrittämällä siaalihappopitoisuus viidestä niistä. Niistä isoformeista, joista analysoidaan siaali-20 happopitoisuus, havaitaan, että viisi isoformia sisälsivät joko 9, 10, 11, 12 tai 13 siaalihappojäännöstä.

... On olemassa yhteys erytropoietiinin suhteellisen • · *·* ' spesifisen aktiivisuuden in vivo välillä ja siaalihappo- | * * .....

• *: jäännösten määrän välillä erytropoietnnimolekyyliä kohti • · ·.·,· 25 isoformeissa 5-11 (jokainen isoformi on nimitetty tässä • · !/·· siaalihappoj en lukumäärän perusteella erytropoietiinimole- *:**: kyyllä kohti) . Isoformeilla 11 - 14 on suunnilleen sama suhteellinen aktiivisuus in vivo. Isoformit 5-14 analy- m soidaan aktiivisuuden in vivo suhteen exhypoksisten poly- .··♦, 30 syteemisten hiirten bioanalyysillä ja jokaisen läsnäolevan • · .....

^1! isoformin määrä määritetään Bradfordin proteiinimääritys- T menetelmällä, absorbanssissa 280 nm tai radioimmunoanalyy- • · - · *·· sillä (RIA) erytropoietiinin suhteen. RIA-määritykset (Egrie et ai. Immunobiology 172, 213 (1986)), ilmaistuina 35 yksikköinä/ml, jaetaan 212 770 yksiköllä/mg erytropoietii- • · « • · 105688 10 nipolypeptidiä, keskimääräinen spesifinen puhdistetun erytropoietiinin aktiivisuus määritettynä RIA:lla, jolloin saadaan eristettyjen isoformien tai isoformiseosten prote-iinikonsentraatiot ilmaistuna mg erytropoietiinipolypepti-5 diä/ml. Kuten esimerkeissä on esitetty, suhteelliset in vivo -spesifiset aktiivisuudet lisääntyvät vaiheittain isoformista 5 isoformiin 11 (katso taulukko 2).

In vivo -spesifiset aktiivisuudet, joihin tässä viitataan, ovat suhteellisten in vivo -spesifisisten ak-10 tiivisuuksien määrityksiä eivätkä absoluuttisten in vivo -spesifisten aktiivisuuksien määrityksiä. Tämän julkaisun tarkoituksia varten spesifisiä aktiivisuuksia käytetään vain vertaamaan isoformien suhteellisia aktiivisuuksia, jotka on määritetty käyttämällä samaa määritysmenetelmää, 15 käyttämällä samoja olosuhteita, jotka käsittävät saman sisäisen standardin, samaa eläintyyppiä, samaa tulosten analyysiä, jota on käytetty spesifisen aktiivisuuden laskemiseen, ja samaa määritysmenetelmää proteiinipitoisuuden määrittämiseen. Ei ole tarkoitus, että mikään esitetty 20 in vivo -spesifinen aktiivisuusarvo millekään isoformille edustaisi luontaista tai absoluuttista arvoa tälle isofor-mille.

• · ' Tämä keksintö tarjoaa menetelmän erytropoietiini- • i l. ·: isoformien valmistamiseksi. Erytropoietiinin spesifiset • ·,·, 25 isoformit, jotka on valmistettu tämän keksinnön mukaises- • « • <*·· ti, ja niiden ominaisuudet, voivat vaihdella riippuen läh- ·:··· tömateriaalista. Esimerkiksi virtsasta saadun ihmisen ·'·*; erytropoietiinin isoformit ovat erilaisia kuin rekom- binantti-erytropoietiinin isoformit. Keksinnön edullinen .···. 30 suoritusmuoto koskee erytropoietiini-isoformin valmistus- · ‘.V. ta, jolla isoformilla on spesifinen määrä (se on täsmälli- *;* nen määrä, suurempi kuin 0) siaalihappojäännöksiä erytro- • · • *·· poietiinimolekyyliä kohti, mainitun määrän ollessa valittu joukosta, joka käsittää 1-14. Edullisesti mainittu määrä ' . 35 on 9, 10, 11, 12, 13 tai 14.

f t « · 105688 11 Tämä keksintö tarjoaa myöskin menetelmän, jolla voidaan valmistaa koostumuksia, jotka käsittävät kaksi tai useampaa erytropoietiini-isoformia. Yhdessä suoritusmuodossa valmistettavat koostumukset käsittävät seoksen iso-5 formeja, joilla on suurempi kuin ennalta määrätty määrä siaalihappoja erytropoietiinimolekyyliä kohti, esim. suurempi määrä kuin 11 siaalihappoa erytropoietiinimolekyyliä kohti, tai suurempi määrä kuin 12 siaalihappoa molekyyliä kohti, esim. seos isoformeista 12, 13 ja 14. Toisessa suo-10 ritusmuodossa valmistettavat koostumukset käsittävät iso-formien seokset, joilla on ennalta määrätty määrä siaalihappoja erytropoietiinimolekyyliä kohti, esim. vähemmän kuin 12, mutta enemmän kuin 8 siaalihappoa molekyyliä kohti, kuten esimerkiksi seoksessa isoformeista 9, 10 ja 11.

15 Keksintö tarjoaa myös menetelmän, jolla voidaan valmistaa erytropoietiini-isoformien koostumukset, joissa isoformien suhteelliset määrät ovat samat tai eri määrät. Esimerkiksi isoformien 9, 10 ja 11 seoksessa voisi olla isoformeja erilaisissa suhteellisissä osuuksissa, kuten 1:1:1, 2:3:1 20 tai 20:20:1.

Edullisesti valmistettavat koostumukset käsittävät ... vähemmän kuin neljän isoformin seokset, esimerkiksi seok- « · ; f sen isoformeista 11, 12 ja 13, tai seoksen isoformeista 12 l ' 1 • : ja 14, tai seoksen isoformeista 7 ja 13.

\V 25 Erytropoietiini-isoformien seosten tuottamiseksi

« I

*.*·· tämä keksintö tarjoaa myös menetelmät valittujen erytro- "··: poietiini-isoformien eristämiseksi samanaikaisesti. Nämä menetelmät käsittävät yksittäisten isoformien eristämisen menetelmillä, kuten valmistava isoelektrinen fokusointi 30 tai isoformien seosten valmistamisen, joilla on ennalta • · .....

,···# määrätty määrä siaalihappoja molekyyliä kohti (esimerkiksi * enemmän kuin 11) tekniikoilla, kuten ioninvaihtokromato-• · .......

ί ’· grafia tai kromatofokusointi. Kaikkien näiden tekniikoiden • · « perustana on proteiinien erottelu varauksen mukaan.

« t ............

12 105688

Yleisesti ioninvaihtokromatografia ja kromatofo-kusointi käsittävät joko ihmisen raa'an erytropoietiinin tai puhdistetun materiaalin annostelun pylväshartsiin olosuhteissa, jotka sallivat jonkin tai kaikkien erytro-5 poietiini-isoformien sitoutumisen hartsiin. Raakoja eryt-ropoietiinivalmisteita varten on edullista annostella proteiini pylvääseen pH:ssa noin 7, kun taas puhdistettuja valmisteita varten proteiini voidaan annostella pylvääseen pH:ssa noin 7 - 4. Kun pylväs on pesty puskurilla noin 10 pH:ssa 4, ne erytropoietiini-isoformit, jotka jäävät sitoutuneiksi ioninvaihtopylvääseen, eluoidaan nostamalla puskurin pH:ta ja suolakonsentraatiota tai käyttämällä alenevaa pH-gradienttia ja nostamalla ionivahvuutta noin pH 4:ssä. Kromatofokusointia varten isoformit eluoidaan 15 pylväästä alenevalla pH-gradientilla tai pesemällä pylväs korkeassa suolakonsentraatiossa.

Eräs keksinnön suoritusmuoto koskee nisäkäs (esim. kiinanhamsterin munasarja, CHO) -isäntäsoluja, jotka edullisesti syntetoivat erytropoietiini-isoformeja, joilla on 20 suurempi kuin spesifinen määrä, esim. suurempi kuin 10 siaalihappoa molekyyliä kohti. Erytropoietiinimolekyyleil- ... lä on N-sidotut tai O-sidotut oligosakkaridirakenteet, · ; t jotka voivat rajoittaa molekyylin siaalihappopitoisuutta.

'· " Esimerkiksi tetra-antennaariset (nelihaaraiset) N-sidotut t · 25 oligosakkaridit yleisimmin tarjoavat neljä mahdollista • · paikkaa siaalihapon kiinnittymiselle, kun taas bi- ja ’"*! triantennaarisilla oligosakkaridiketjuilla, jotka voivat korvata tetra-antennaariset muodot asparagiiniin sitoutu- mispaikoissa, on yleisesti korkeintaan kaksi tai kolme .*··. 30 kiinnittynyttä siaalihappoa. O-sidotut oligosakkaridit • · .···. tarjoavat yleisesti kaksi paikkaa siaalihapon sitoutumi- m selle. Täten erytropoietiinimolekyylit voivat olla varus- ·· : '· tettuja yhteensä 14 siaalihappojäännöksellä, edellyttäen * · että kaikki kolme N-sidottua oligosakkaridia ovat tetra- ....: 35 antennaarisia. Nisäkässoluviljelmät seulotaan niiden solu- • · · 105688 13 jen löytämiseksi, jotka edullisesti lisäävät tetra-anten-naariset ketjut rekombinantti-erytropoietiiniin, maksimoiden siten siaalihapon kiinnittymispaikkojen määrän.

Virtsan erytropoietiinin N-sidotut oligosakkaridit 5 sisältävät siaalihappoa sekä a-2,3- että a-2,6-sidoksissa galaktoosiin (Takeuchi et ai. J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Tavallisesti Jpiaalihappo a-2,3-sidoksessa liitetään galaktoosiin mannoosin a-1,6-haarassa ja siaalihappo a-2,6-sidoksessa liitetään galaktoosiin mannoosin 10 a-l,3-haarassa. Entsyymit, jotka lisäävät näitä siaalihap-poja (P-galaktosidi-a-2,3-sialyylitransferääsi ja P-galaktosidi-a-2,6-sialyylitransferaasi) ovat kaikkein tehokkaimpia lisäämään siaalihapon mannoosin a-l,6 - ja vastaavasti mannoosin Jt-1,3 -haaroihin.

15 Dihydrofolaattireduktaasin osalta vajavaisia (DHFR) kiinanhamsterin munasarja (CHO) -soluja käytetään yleisesti isäntäsoluina rekombinanttiglykoproteiinien tuottamiseksi, mukaanluettuna rekombinantti-erytropoietiini. Nämä solut eivät ilmennä entsyymiä P-galaktosidaasi-a-2,6-sia-20 lyylitransferaasi eivätkä siksi lisää siaalihappoa a-2,6-sidokseen näiden solujen tuottamien glykoproteiinien ... N-sidottuihin oligosakkarideihin. (Mutsaers et ai.

• « ' Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986) ; Takeuchi et ai.

* __________________ ’· " J. Chromatogr. 400, ”207 (1987). Niin muodoin CHO-soluissa • · 25 tuotetusta rekombinantti-erytropoietiinista puuttuu siaa- • · ·/·· lihappo 2,6-sidoksesta galaktoosiin (Sasaki et ai. (1987), ·:**: suora; Takeuchi et ai, (1987), supra) . Toisessa tämän kek- sinnön mukaisessa suoritusmuodossa isoformien tuottamiseen käytetty erytropoietiini tehdään CHO-soluissa, jotka on .···. 30 transf ektoitu funktionaalisella P-galaktosidi a-2,6-sia- • · - ----------- - - y/.' lyylitransferaasigeenillä, jotta aikaansaadaan siaalihapon ”* liittäminen a-2,6-sidoksessa galaktoosiin. Katso Lee « • *·· et ai. J. Biol. Chem. 2 64, 13848 (1989), joka esitetään · · tässä viitteenä, julkaisuna tekniikoista modifioitujen 35 CHO-solujen tai muiden nisäkäsisäntäsolujen luomiseksi.

• · f · 14 105688

Keksintöä voidaan soveltaa myös tiettyihin ihmisen erytropoietiinin analogeihin. Tässä käytettynä termi "ihmisen erytropoietiinin analogi" viittaa erytropoi-etiiniin, jossa on yksi tai useampi muutos ihmisen erytro-5 poietiinin aminohapposekvenssissä, mikä johtaa siaalihapon kiinnittymispaikkojen lisääntymiseen. Analogit tuotetaan paikkaspesifisellä mutageneesillä, ja niissä on aminohap-pojäännösten lisäyksiä, deleetioita tai substituutioita, jotka muuttavat glykosylaatiota varten olevia paikkoja.

10 Tällaisilla analogeilla on suurempi määrä hiilihydraatti-ketjuja kuin ihmisen erytropoietiinilla.

Analogit, jotka johtavat lisääntyneeseen biologiseen aktiivisuuteen, konstruoidaan lisäämällä erytropoi-etiinimolekyylin siaalihappomäärää. Analogit, joiden siaa-15 lihappotaso on korkeampi kuin ihmisen erytropoietiinissa havaittu luodaan lisäämällä glykosylaatiokohtia, jotka eivät häiritse biologista aktiivisuutta varten vaadittavaa sekundaari- tai tertiaarirakennetta. Edullisesti ihmisen erytropoietiinin analogilla on 1, 2 tai 3 lisäpaikkaa 20 N-glykosylaatiota tai O-glykosylaatiota varten. Esimerkiksi leusiini asemassa 69 korvataan asparagiinilla, jotta ... saadaan sekvenssi Asn-Leu-Ser, joka tarjoaa neljännen pai- · « 1 1 I , kan N-glykosylaatiolle. Tällainen muutos voi tavallisesti < t · "« ” tarjota jopa neljä ylimääräistä siaalihappoa molekyyliä • v · ‘.V 25 kohti. Esimerkkejä muista muutoksista, jotka luovat lisää • · ·.**: N-tai O-glykosylaatiopaikkoja, ovat alaniinien muutokset asemissa 125 ja 127 asparagiiniksi ja vastaavasti serii- : Γ: niksi, alaniinin asemassa 125 treoniiniksi ja alaniinien asemissa 124 ja 125 proliiniksi ja vastaavasti treoniinik- .**·. 30 si. Kuten alan asiantuntijat ymmärtävät keksintöä voidaan • · · .··. soveltaa monien muiden ihmisen erytropoietiinin analogien *·1 osalta, joilla on lisäpaikkoja glykosylaatiolle.

: '· Keksinnön käyttösovelluksiin kuuluvat myös far- • · « maseuttiset koostumukset, jotka käsittävät terapeuttisesti 35 tehokkaan määrän spesifistä isoformia tai isoformien seos- • 1 « 15 105688 ta yhdessä erytropoietiiniterapiassa käyttökelpoisen sopivan laimentimen, apuaineen ja/tai kantajan kanssa. Tässä käytettynä "terapeuttisesti tehokas määrä" tarkoittaa sitä määrää, joka tarjoaa terapeuttisen vaikutuksen määrätyssä 5 tilassa ja anto-ohjelmassa. Erytropoietiini-isoformien anto tapahtuu mieluiten parenteraalisia reittejä. Valittu spesifinen reitti riippuu hoidettavasta tilasta. Erytropoietiini-isoformien anto tehdään mieluiten osana formu-laatiota, joka käsittää sopivan kantajan, kuten ihmisen 10 seerumialbumiinin, sopivan laimennusaineen, kuten pusku roidun suolaliuoksen, ja/tai sopivan apuaineen. Tarvittava annos on määrissä, jotka ovat sopivia nostamaan potilaitten hematokriittia ja vaihtelee riippuen hoidettavan tilan vakavuudesta, antomenetelmästä ynnä muusta.

15 Seuraavat esimerkit tarjotaan valaisemaan keksintöä täydellisemmin, mutta niiden ei ole tarkoitus tulkita rajoittavan keksinnön piiriä. Esimerkeissä kuvatuissa in vivo biomäärityksissä käytetty erytropoietiinistandardi on rekombinanttierytropoietiinistandardi, joka standardi-20 soitiin osittain puhdistettua virtsan erytropoietiinistan-dardia vastaan. Siten määritetään vain suhteellisia in vi- ... vo -spesifisiä aktiivisuuksia. In vivo -spesifiset aktii- · ’ visuudet ilmaistaan "yksikköinä/ml", "yksikköinä/mg" ja '· "· "yksikköinä/A2eo", eivätkä "IU/ml", "IU/mg" ja "IU/A280", • « :.V 25 koska käytetty erytropoietiinistandardi ei suoraan korre- • · loi minkään olemassaolevan kansainvälisen standardin *:**: kanssa. -7------ '

Esimerkki 1

Rekombinantti-erytropoietiini-isofonnien eristämi- .···. 30 nen • ·

Rekombinantti-erytropoietiini tuotetaan kuten on kuvattu Lin'in julkaisussa, suora. Ensimmäiseen ja koi- • · : *·· manteen isoformieristystä varten lähtöaineena käytettävä ·*» rekombinantti-erytropoietiini puhdistetaan Lain et ai. 35 patentin, suora, esimerkissä 2 kuvatun menetelmän mukai- • · • · 105688 16 sesti. Lähtöaine toista ja viidettä isoformieristystä varten puhdistetaan Lain et ai. suora mukaisesti käyttäen modifikaatiota Q-Sepharose-kromatografia. Nämä valmisteet sisältävät rekombinantti-erytropoietiinin, jolla on sama 5 sekvenssi kuin virtsasta saadulla ihmisen erytropoi-etiinilla, isoformien seoksen ja sisältävät pääasiassa isoformeja 9 - 14. Lähtömateriaali neljättä isoformival-mistusta varten on materiaali, joka eluoituu Lain et ai. esimerkin 2 anioninvaihtopylvään 5 mM etikkahappo/1 mM 10 glysiini/6 M ureapesun aikana. Tämä fraktio sisältää isoformeja, joilla on 9 tai vähemmän siaalihappoa ja se puhdistetaan edelleen geelisuodatuskromatografiällä, kuten Lain et ai. esimerkissä 2 on kuvattu, ennen käyttöä valmistavassa isoelektrisessä fokusointiprosessissa. Kuuden-15 nessa isoformivalmistuksessa käytettiin lähtöaineena puhdistettua rekombinantti-erytropoietiinivalmistetta, jossa on 4 - 13 siaalihappojäännöstä. Tämä materiaali puhdistettiin Lain et ai. esimerkin 2 mukaisesti, paitsi ioninvaih-topylvään modifikaatiota (rekombinantti-erytropoietiinin 20 eluutio natriumkloridigradientilla pHtssa 8,4 ja etikka-happo/ureapesun puuttuminen), mikä johtaa suurimman osan lähtömateriaalissa olevien isoformien pidättymiseen pyi- • · • I i ' väässä.

« · • · a "· '· Kuusi yksittäisten isoformien eri valmistetta saa- · 25 tetaan isoelektriseen fokusointiin raegeelikerroksessa • ·.**: (granulated gel bed) (Ultrodex, LKB) , olennaisesti kuten *:*: LKB Application Note 198:ssa on esitetty. Käytetään Phar- malyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyyttejä, ja geelitäyte si-sältää 5 M ureaa.

.···. 30 Ensimmäisessä valmistustavassa noin 20 mg rekombi- • · nantti-erytropoietiinia 6,8 ml: ssa 20 mM natriumsitraat- "" ti/100 mM natriumkloridia, pH 7,0, annostellaan geeliin ja • · : *· fokusoidaan 8 watilla noin 16 tuntia. Isoelektrisen foku- soinnin jälkeen isoformivyöhykkeet geelissä visualisoidaan 35 geelikerroksen paperikontaktikopiolla. Kopio kehitetään ja • · • · 17 105688 fiksoidaan liottamalla 3 kertaa (noin 10 minuuttia joka kerta, huoneenlämpötilassa) fiksausliuoksessa (40 % me-tanoli/10 % etikkahappo/10 % TCA/3,5 % sulfosalisyylihap-po), josta vaihdetaan yhteen kertaan (noin 10 minuuttia) 5 40 % metanolia/10 % etikkahappoliuoksessa (30 - 60 °C) , värjätään 15 minuuttia 60 °C:ssa 0,125 % Coomassie-Blue R-250/40 % metanoli/10 % etikkahappo -liuoksessa, ja huuhdellaan väri 7,5 % metanoli/10 % etikkahapossa, jotta saadaan visualisoitua erilliset isoformit. Isoformit 10 sisältävä raegeelikerroksen alue (noin 50 % hartsista) poistetaan, lisätään vettä (noin 16 ml) ja liete kaadetaan 14 x 62 cm astiaan ja haihdutetaan noin 40 g nettopainoon. Tämä valmiste fokusoidaan toisen kerran ja geelikerroksen kontaktikopio tehdään kuten aiemmin. Geelin alue, joka 15 sisältää kunkin kuudesta erottuvasta isoformista, poistetaan geelikerrokse.sta.

Isoformien eluoimiseksi geelistä lisätään liuos, joka sisältää 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps jokaiseen isoformiin muodostamaan liete. Lietteet laitetaan pieniin 20 pylväisiin ja pestään Tris-Chaps -puskurilla. Läpivir- tausfraktiot kerätään ja laitetaan erikseen pieniin pyl-... väisiin (avoin pylväsrakenne) , jotka sisältävät Vydac C4 • f · | . -käänteisfaasihartsia, joka on tasapainotettu 20 % • i · etanoli/10 mM Tris-HCl: 11a, pH 7,0. Pylväät kehitetään \{.· 25 vaiheittain 20 % etanoli/10 mM Tris-HCl: 11a, pH 7,0, 35 % * · ·

etanoli/10 mM Tris-HCl: 11a, pH 7,0 ja 65 % etanoli/10 mM

’:**ί Tris-HCl: 11a, pH 7,0 . Fraktio, joka eluoituu 65 %

: etanoli/10 mM Tris:lla laimennetaan 1:1 10 mM

Tris/HCl:11a, pH 7,0, ja konsentroidaan, ja sen jälkeen .*··. 3 0 puskuri vaihdetaan 10 mM Tris-HCl :ksi, pH 7,0, käyttäen • · · . .···. Centricon-10 (Amicon) mikrokonsentraattoria. Tämän valmis- ”* teen analyyttinen isoelektrinen fokusointi toteutetaan * · - : ·· olennaisesti kuten LKB:n teknisessä selityksessä 250 on M| · — ------- kuvattu, käyttäen Servalyte 3-5 amfoliinejä (Serva) poly-35 akryyliamidigeelissä, joka sisältää 5 M ureaa.

• · • · 105688 18

Toisessa valmistustavassa noin 26 mg rekombinant-tierytropoietiinia 6,5 ml:ssa deionisoitua vettä lisätään geeliin ja fokusoidaan 2,5 watilla 35 minuuttia ja 10 wa-tilla noin 17 tuntia. Fokusoidun proteiinin vyöhykkeet, 5 jotka näkyvät geelikerroksessa, poistetaan 11 erillisenä poolina. Jokainen pooli saatetaan 7,5 ml:ksi deionisoidul-la vedellä ja 20 ml kutakin seurauksena saatua poolisuper-natanttia saatetaan isoelektriseen fokusointiin, kuten edellä on kuvattu. Jokaiseen pooliin lisätään 5 ml 1,5 M 10 Tris-HCl:a, pH 8,8, ja kukin liete laitetaan pieneen pylvääseen, ja nestefaasin annetaan valua läpi. Hartsi pestään noin kolmella tilavuudella 0,5 M Tris-HCl:a, pH 7 ja huuhteluliuos yhdistetään läpivirranneeseen liuokseen. Eluointiaineet konsentroidaan ja puskuri vaihdetaan 20 mM 15 natriumsitraatti/100 mM natriumkloridiin, pH 7,0, käyttäen Amicon kertakäyttöisiä ultrasuodatusvälineitä, joissa on 10 000 daltonin molekyylipainon cutoff-suodatin. Konsentroidut liuokset (noin 0,5 ml) saatetaan sitten 0,22 mikronin cutoffin selluloosa-asetaattisuodattimen lä-20 pi. Analyyttisen isoelektrisen fokusoinnin perusteella viiden poolin havaitaan sisältävän pääasiassa yksittäiset ... isoformit 10, 11, 12, 13 ja 14.

• · · · , Kolmannessa valmistustavassa noin 30 mg rekombi- « · « ' nantti-erytropoietiinia 21,8 ml:ssa tislattua vettä laite- • « « **.* 25 taan geeliin ja fokusoidaan 2 watilla 25 minuuttia, * · 10 watilla 20 tuntia ja 15 watilla 15 minuuttia. Yksit-’**’! täisiä isoformeja vastaavat proteiinivyöhykkeet havaitaan visuaalisesti ja poistetaan geelikerroksesta. Lisätään tislattua vettä geelistä eristettyihin isoformeihin, jotta 3 0 saadaan aikaan liete, ja saadut supernatant it analysoidaan ··· .···. analyyttisellä isoelektrisellä fokusoinnilla. Sama määrä [·* Tris-HCl:a, pH 7,2, lisätään jokaiseen lietteeseen, sus- ϊ ** pensiot laitetaan erillisiin pieniin pylväisiin ja nestefaasin annetaan virrata pylvään läpi isoformien 35 eluoimiseksi. Jokainen läpivirrannut fraktio konsentroi- • • · 19 105688 daan ja puskuri vaihdetaan 20 mM natriumsitraatti/100 mM natriumkloridiin, pH 7,0, käyttäen Amicon kertakäyttöisiä ultrasuodatusvälineitä, joissa on 10 000 daltonin molekyy-lipainon cutoff-suodatin. Analyyttinen isoelektrinen fo-5 kusointigeeli osoitti, että saadut poolit sisälsivät pääasiassa yksittäiset isoformit 9, 10, 11, 12, 13 ja 14.

Neljännessä isoformivalmistustavassa käytettiin lähtömateriaalina erytropoietiinia, joka sisälsi isoformit 3-9 (valmistettu kuten edellä on kuvattu). Ennen valmis-10 tavaa isoelektristä fokusointia, joka toteutettiin olennaisesti kuten valmistustavoissa 1-3 yllä on esitetty, amfolyytit (Pharmalyte 2,5-5) esifraktioitiin Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA) nestefaasi-isoelektrisessä foku-sointiyksikössä, jotta saatiin lähtömateriaalin alhaisem-15 mille isoelektrisille pisteille paremmin sopiva amfolyyt-tialue. Esifraktiointi. suoritettiin sekoittamalla 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 15 g:n ureaa kanssa ja lisäämällä puh distettua vettä tilavuuden saattamiseksi 50 ml:ksi. Tämä seos fraktioitiin Rotoforissa 10 watilla, 1 °C:ssa, 20 5 % tuntia käyttäen 0,1 M fosforihappoa anolyyttinä ja 0,1 M natriumhydroksidia vastaavasti katolyyttinä.

... Amfolyyttifraktioita, joilla oli määritetyt pH:t 4,5 ja * * * I # noin 6 välillä, käytettiin flat-bed isoelektriseen foku- > · · *· *· sointiin.

• « « · 25 Amfolyytit poistettiin isoformeista käyttäen Cent- • · ·.'·· rieluteria (Amicon, Danvers, MA) ja 10 000 MW cutoff ’·**· Centriconia (Amicon) käyttäen seuraavia parametrejä: ϊ[Γί 0,18 Tris-puskuri, pH 8,8, 100 volttia, 25 - 30 mA, 3 tuntia. Isoformeille suoritettiin sitten puskurinvaihto .·*·, 30 0,1 M natriumkloridiin geelisuodatuksella käyttäen M« _ _ - .···, Sephadex G-25:tä (Pharmacia) . Viiden saadun poolin ana- ”* lyyttinen isoelektrinen fokusointi osoitti niiden sisäl- - : *·· tävän isoformit 4, 5, 6, 7 ja 8. Isoformi 4 kulki useana • « · *...· vyöhykkeenä, osoittaen että se saattoi olla jonkin verran ....: 35 pilkkoutunutta.

• · • · 20 105688

Viidettä isoformivalmistustapaa modifioitiin lisäämällä esifokusointivaihe flat-bed -isoelektriseen foku-sointimenettelyyn. Tässä modifikaatiossa proteiinia ei lisätty amfolyytti/urea/geeliseokseen ennen elektroforeesia, 5 vaan se lisättiin isoelektrinen fokusointi -laitteeseen geelikerroksen pH-gradientin muodostuksen jälkeen. 75 minuutin esifokusoinnin (1 500 volttituntia) jälkeen geeli-kerroksen vyöhyke 2,25 - 4,25 cm katodista poistettiin, sekoitettiin erytropoietiiniliuokseen ja lisättiin takai-10 sin geelikerrokseen. Isoelektrisen fokusoinnin jälkeen isoformit 10, 11, 12, 13 ja 14 eluoitiin geelikerroksesta ja erotettiin amfolyytistä ultrasuodatuksella käyttäen Centricon-10 (Amicon) -välineitä.

Esifokusointimodifikaatio suoritettiin, jotta saa- 15 tiin isoformivalmisteiden ultraviolettiabsorbans- siominaisuudet enemmän samanlaisiksi kuin lähtöaineena käytetyn rekombinantti-erytropoietiinin. Tämä parannus spektrin ominaispiirteisiin voidaan nähdä eristettyjen isoformien absorbanssisuhteella 280 ja 260 nm:ssa.

20 Keskimääräinen absorbanssisuhde 280 nm:ssa verrattuna 260 nm:ssa (A280/A260) valmistustapojen 2 ja 3 mukaisille iso- ... formeille (esifokusoimattomat) on 1,36 ± 0,11, kun keski- • » i 1 i * # määräinen A280/A260 -suhde valmistustapojen 5 ja 6 mukai- * · « '· 1· sille isoformeille (esifokusoidut) on 1,68 ± 0,20. Kun • · • · · 25 isoformi 14 jätetään laskuista pois, keskimääräiset * 9 A280/A260 -suhteet ovat 1,39 ± 0,11 ja 1,74 ± 0,09 vai-’·1'! mistustapojen 2 ja 3 ja vastaavasti 5 ja 6 mukaisille :]Γ: isoformeille. (Isoformi 14:llä voi olla mitä epätyypil lisin spektri, koska se esiintyy hyvin pieninä määrinä, ja .1··. 30 on siten alttiimpi vähäisten amfolyyttikomponenttikonta-

Ml ,···. minaatioiden aiheuttamille häiriöille, tai koska se on lähinnä elektrodia flat-bed -isoelektrisen fokusointime- • · : **· netelmän aikana) . Keskimääräinen A280/A260 -suhde Lain et • · · ai. esimerkin 2 mukaisesti valmistetulle rekombinantti-35 erytropoietiinille (modifioitu kuten aiemmin on kuvattu • · t 21 105688 käyttäen Q-Sepharosea anioninvaihtohartsina) on 1,91 ± 0,04.

Kuten edellä on kuvattu, lähtömateriaali isoformi-valmisteelle 6 oli rekombinantti-erytropoietiinivalmiste, 5 joka käsitti isoformit 4-13. Amfolyytit esifokusoitiin Rotofor-laitteessa kuten neljännessä valmistustavassa. Amfolyyttifraktioita, joilla oli määritetyt pH:t välillä 3,7 ja 4,8, käytettiin flat-bed -isoelektriseen fokusointiin. Flat-bed esifokusoitiin kuten valmistustavassa 5 ja 10 isoformit 9, 10, 11, 12 ja 13 saatiin ultrasuodatuksen jälkeen (Centricon-10) , jotta kantaja-amfolyytit saatiin poistettua.

Esimerkki 2

Rekombinantti-erytropoietiini-isofonnien siaali- 15 happomäärä

Esimerkin 1 mukaisesti eristettyjen isoformien ja erytropoietiinin, joka oli puhdistettu Lain et ai., suora kuvaamien menetelmien mukaisesti (seos isoformeista 9 - 14) puskuri vaihdetaan 0,10 - 0,15 M natriumkloridiin ja 20 analysoidaan siaalihappomäärän suhteen Jourdianin et ai.

J. Biol. Chem. 246, 430 (1971) mukaisen menetelmän modi- ... fikaatiolla. Siaalihappojäännökset pilkotaan glykopro- ; t telineistä hydrolyysillä 0,35 M rikkihapolla 80 °C:ssa • « · • 30 minuutin ajan ja liuokset neutraloidaan natriumhydrok- '·*.* 25 sidilla ennen analyysiä. Läsnä olevan erytropoietiinipro- « · ·.**: teiinin määrän arvioimiseksi tehdään Bradfordin proteii- *!**: nimääritys (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) käyttäen standardina rekombinantti-erytropoietiinia, jolla 9 on ihmisen erytropoietiinin aminohapposekvenssi, käyttäen .···, 30 määritysreagensseja ja mikro-menetelmä -menettelytapaa, - ,···, jota Bio-Rad toimittaa. Tulokset ilmaistuna mooleina siaa- • _ _____ ”* lihappoa moolia erytropoietiinia kohti, on esitetty tau- • · : *·· lukossa 1. Isoformit on nimetty siaalihappojen määrän mu- * · » \mm' kaan molekyyliä kohti, ja sarja on vähiten happamasta 35 (isoformi 9) happamimpaan (isoformi 13) . Isoformit 9-13 « · • · 105688 22 on esitetty kuvion 1 geelivyöhykkeissä 6-10. Isoformin 14 määrät ovat riittämättömät siaalihappomäärän mittaamiseen tarkasti. Tämän isoformin siaalihappomäärä on päätelty sen kulkeutumisesta IEF-geeleissä verrattuna toisiin 5 isoformeihin. Isoformien 5-8 siaalihappomäärää (valmis tustapa 4) ei ole määritetty, mutta se on samoin päätelty niiden kulkeutumisen mukaan IEF-geeleissä.

Taulukko 1 10 erytropoietiini- moolia siaalihappoa/ isoformi mooli erytropoietiinia isoformi 13 12,9 ±0,5 15 isoformi 12 11,8 ±0,2 isoformi 11 11,0 ±0,2 isoformi 10 9,8 ± 0,3 isoformi 9 8,9 ± 0,6 isoformiseos 11,3 ± 0,2 20 (9 - 14) ... Esimerkki 3

φ III

, Rekombinantti-erytropoietiini-isoformien aktiivi- f · « • '· suus • · • 1 · *·1.' 25 Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla eristetyt isoformit · analysoidaan läsnäolevan rekombinantti-erytropoietiinin ”**! määrän määrittämiseksi absorbanssilla 280 nmrssa, Bradfor- 5151: din proteiinimäärityksellä ja RIA:lla erytropoietiinin suhteen. Exhypoksisten polysyteemisten hiirten bioanalyy-.**·. 30 siä (Cotes et ai. Nature 191, 1065 (1961)) käytetään mää- • Φ · ,···. rittämään suhteellinen biologinen aktiivisuus in vivo.

Läsnäolevan erytropoietiiniproteiinin määrän kvantitointi : '·1 käyttäen radioimmunoanalyysiä erytropoietiinille antoi tu- • · · ·...· lokset suuremmasta suhteellisesta spesifisestä aktiivisuu- « 35 desta in vivo tietyille isoformeille, suuren siaalihappo- • · i f 23 105688 määrän sisältävien isoformien ilmeisen vähentyneen immu-noreaktiivisuuden vuoksi, mikä johti erytropoietiinikon-sentraation aliarviointiin ja siten suhteellisen spesifisen aktiivisuuden in vivo yliarviointiin kaikkein negatii-5 visimmille isoformeille. Hiirten bioanalyysimääritykset, ilmaistuina yksikköä/ml, on jaettu vastaavilla proteiini-konsentraatioilla, jotta saadaan spesifiset aktiivisuudet in vivo ilmaistuina yksikköä/mg erytropoietiinipolypepti-diä. Nämä spesifiset aktiivisuudet esitetään taulukossa 10 2.

Taulukossa 2 "n" on yksittäisten isoformivalmisteiden määrä, jotka myötävaikuttavat spesifiseen aktiivisuus-arvoon. Useimmissa tapauksissa tehtiin monta analyysiä in vivo kullekin isoformivalmisteelle. Samat tulokset 15 in vivo vaikuttavat, spesifisen aktiivisuuden arvioihin kaikissa kolmessa sarakkeessa. yksikköä/mg erytropoietii-nipolypeptidiä määritettiin absorbanssilla 280 nm:ssa, radioimmunoanalyyseistä ja Bradfordin proteiinimäärityksen tuloksista. Bradfordin proteiinimäärityksessä käytettiin 20 standardina puhdistettua rekombinantti-erytropoietiinia, joka sisälsi isoformit 9 - 14. "n" voi olla vähemmän las-kelmissä, jotka on tehty Bradfordin proteiinimääritystä

I I I

! , käyttäen, koska joitain valmisteita ei ollut enää käytet- l / tävissä, kun Bradfordin määritykset tehtiin.

« « 25 Lain et ai. supra kuvaamien menetelmien mukaisesti • · · ’ ' ---------- *. *ϊ puhdistettua erytropoietiinia, joka sisälsi isoformit 9 - '·’*· 14, käytettiin standardina RIA-määrityksille ja ana- ··· V· lyyseille in vivo.

Suhteelliset___spesifiset aktiivisuudet ilmaistuna 3 0 yksikköä/mg erytropoietiinipolypeptidiä voidaan muuntaa .**·. yksiköiksi/A280 kertomalla 0,807 mg:11a erytropoietiinipo- ··· lypeptidiä/A280 . Konversiotekijä johdetaan kertomalla eryt- • · · ” ropoietiinin ekstinktiokerroin (1,345 mg/A280) erytropoie-

Ml t · ....

tiiniglykoproteiinin proteiinimäärällä (noin 60 % painos-35 ta, Davis et ai. Biochemistry 26, 2633 (1987)), jotta saa- f • · 24 105688 daan mg erytropoietiinipolypeptidiä/A280 (se on 1,345 mg erytropoietiinipolypeptidiä/A280 x 0,60 mg polypeptidiä/mg erytropoietiinia = 0,807 mg polypeptidiä/A280) . Lisäksi spesifiset aktiivisuudet ilmaistuna yksikköä/mg erytro-5 poietiinipolypeptidiä voidaan kertoa tekijällä 0,60 mg polypeptidiä/mg erytropoietiiniglykoproteiinia, jotta saadaan spesifiset aktiivisuudet ilmaistuna yksikköä/mg erytropoietiiniglykoproteiinia .

< 4 « « I « « · • · « · · * «· f · «

' « I

« « · • · « · • · · • 1« • · • · ·«· • · * • · · «· · * · • · ··· ··· • · ··· • · f I * lii « » • · « I « « • t * • · 105688 25

q (NLniD'TfniNr-ti-HrH

,_i o o o o o o ^ o o o o o o -Η σιΜίΟΓ-ιΟνΟΟΟΟ jj vvv».».vOO o q. inotNtNi-icriin^rvo jrr in *r .r co <n σ> ^ v x n m rs +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 7? ^ oooooo yt; ooooooooo ^ ™ r^cvtr-srt^voooo “ -..^....^ocoin σ'<. vor-r-i-ii-tn - «. ..

By comcoinr~f-ii-i<Nin K nnrgcgrH^vo^xri O “ _ > ς-j CNinin’TmfNIrHr-li-l 'd o o o ' o o oooooo '7 ["inr-minoooo *. - - - - r-ooo h< r~ eri i-i ^ .-h m σ Φ n m <r Ό m « ^ a·— .t co i-h >< « +1+1 +1 +1 +1 ^ % +1+1 +1 +1 O tn o o o o o Q* ·· ooooooooo ο oor~<roonoooo DOO .. „ * .. » ιο co rn co S (N m oo oo m o ^ ^ ~ - ^ <C ΟίΛιΛιηΓ'^ΟΟΟΟΟ

P -- (\|CS|CS|<\|i-l03r~inrH

III

• I mmmmmmmmm^m^^— ——mmm— - i ... i - .

• · I «

« « cj CM *T <T »““< »—< «—l »-H

a I · I f • « ™"· 1 11 • · · * · • ·

•HI O O O

.;·. T3 o ^ o o o o o

• · · -HJ-lWOCOlOr-tO OOO

4-1 o I I—1 v ^ «. σι o o o 0, 41 % o to <-< - äo co r- (DG-h co ro m .-i - - - ... Dj-h h ro m «h :: ;ro +t +i +1 +i +1 1 ··· -π i-ι :nj +1 +1 +t m nog o o o o o

• : &IH-H OOOOO OOO

... in d Ί Ό N O OOO

• ilki. NNO

ρΐι.^σιη-ιηο^αο • · <* co οι oo o Γ' co oo m vo co

*,,, ς, C- 4J N Π (M N H W> VT H

• « • · f .. *.: ή • · Ig^ronjiHOcnoon-m OH i—1 1—1 i—1 I—1 t—1 ·...: m o

· H VH

105688 26

Taulukon 2 tulokset on esitetty myös graafisesti kuvioissa 2A, 2B ja 2C. Nämä tulokset osoittavat, että erytropoietiinin suhteellinen aktiivisuus in vivo lisääntyy siaalihappomäärän funktiona aina isoformiin 11 saakka.

5 Isoformeilla 11 - 14 on olennaisesti sama suhteellinen bioaktiivisuus in vivo. (Tämä on ilmeisintä, kun isoformin 14 konsentraatio ilmaistaan käyttäen Bradfordin määrityksen arvoja. Bradfordin arvo voi olla täsmällisempi isoformin 14 saatujen yleisesti pienten määrien vuoksi, ja siitä 10 seuranneen vaikeuden vuoksi määrittää A280 , ja hyvin negatiivisten muotojen ilmeisen vähentyneen reaktiivisuuden RIArssa johdosta, kuten aiemmin on mainittu). Enemmän si-aalihappoa sisältävien erytropoietiini-isoformien suurempi suhteellinen spesifinen aktiivisuus in vivo johtuu mitä 15 ilmeisimmin näiden muotojen pitemmästä puoliintumisajasta kierrossa. Isoformit 9 ja 13 leimattiin radioaktiivisella jodilla (125I) ja niiden poistumistaso rotissa määritettiin. Puoliintumisaika kierrossa oli selvästi pitempi isoformil-le 13 kuin isoformille 9.

20 Esimerkki 4

Rekombinantti-erytropoietiini-isoformiseosten se- • lektio Q-Sepharose-kromatografiällä f i · . Säädetty solujen ravintoalusta rekombinantti-eryt- « · · * ,· ropoietiinin tuotosta Lin'in et ai., supra. kuvaamien me- • · · ’·*·* 25 netelmien mukaisesti konsentroidaan ja diasuodatetaan vas- « « • · · *. *t ten 10 mM Tris, pH 7,2. Proteiinikonsentraatio määritetään ***** Bradfordin mikroproteiinimäärityksellä käyttäen naudan ··· ί seerumialbumiinia standardina. 19,6 ml liuosta, joka sisältää 40 mg kokonaisproteiinia saatetaan 20 /xM:ksi Cu- .***. 30 S04:n osalta, suodatetaan 0,45 mikronin cutoff-suodattimen ·♦· .**·. läpi ja ladataan 4 ml kerrostilavuuden (1,05 cm korkeus x 2,2 cm läpimitta) pylvääseen, joka on pakattu Q-Sepharose • · • " Fast Flow'lla (Pharmacia), tasapainotettu 10 mM Trisrllä, · · pH 6,8 - 7,0, 4 °C:ssa. Näytteen laiton jälkeen pylväs ♦ ·...: 35 pestään kahdella pylvästilavuudella samaa puskuria. Pyi- * · 105688 27 vään virtausnopeus on noin 1 ml/min. Kuusi erillistä pylvästä valmistetaan käyttäen tätä menetelmää valikoimaan määrätyt erytropoietiini-isoformiseokset.

Pylväät pestään 6-9 pylvästilavuudella matalan 5 pH:n omaavalla puskurilla, joka sisältää: pylväs nro 1, 150 mM etikkahappoa, 1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M ureaa, säädetty pH 4,7:ään NaOH:lla; pylväs nro 2, 200 mM etikkahappoa, 1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M ureaa,

säädetty pH 4,7:ään NaOHrlla; pylväs nro 3, 250 mM

10 etikkahappoa, 1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M ureaa, säädetty pH 4,7:ään NaOH:lla; pylväs nro 4, 300 mM

etikkahappoa, 1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M ureaa, säädetty pH 4,7:ään; pylväs nro 5, 150 mM etikkahappoa,

1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M ureaa; pylväs nro 6, 15 300 mM etikkahappoa, 1 mM glysiiniä, 20 μΜ CuS04, 6 M

ureaa. Pylväiden pH nostetaan noin seitsemään pesemällä kukin 8-11 pylvään tilavuudella 10 mM Tris-HCl:a, 55 mM NaCl, 2 0 μΜ CuS04, pH "7. Määrätyt erytropoietiini-iso-formiseokset eluoidaan pylväistä pesemällä 10 mM Tris-20 HC1 :11a, 140 mM NaCl:lla, 20 μΜ CuS04:lla, pH 7,0.

Eluoidut isoformipoolit kustakin pylväästä kon- • sentroidaan ja liuotin vaihdetaan veteen käyttämällä • « · . Amicon-Centricon-10 -mikrokonsentraattoria. Tulokset näi- ai • a « ; / den konsentroitujen poolien analyyttisestä isoelektrisestä • at 25 fokusoinnista on esitetty kuviossa 3. Geelikaistat 1-6 • ta _·”-------- *· " edustavat määrättyjä erytropoietiini-isoformiseoksia, jotka on eluoitu vastaavasti pylväistä 1-6. Kuvion 3 oi- • · ______ i kean äärilaidan kaistassa esitetty "isoformiseos" edustaa solujen kasvualustaa, joka annostellaan Q-Sepharose-pyl-

30 vääseen, kuten edellä on kuvattu, pylväs pestään 5 mM

• · · ----- ·

.··. etikkahapolla, 1 mM glysiinillä, 20 μΜ CuS04:llä, 6 M

• · · urealla, ja erytropoietiini-isoformiseos eluoidaan pyi- • t . · ” väästä käyttäen yllä kuvattuja menettelytapoja. Tämä elu- * » · ____________ ·...· oitu isoformien seos puhdistetaan edelleen Lain et ai., • · • · · · v • · 28 105688 supra. kuvaamien menetelmien mukaisesti ennen analyyttistä isoelektristä fokusointia.

Esimerkki 5

Rekombinantti-erytropoietiini-isofonnien frakti- 5 ointi käyttäen alhaisen pH:n gradienttia Q-Sepharosessa

Toisessa menettelytavassa erytropoietiini-isoformit erotellaan käyttäen alenevan pH:n gradienttia ja lisäämällä ionivahvuutta. Konsentroitu diasuodatettu erytropoi-etiiniä sisältävä ravintoalusta ladataan Q-Sepharose-pyl-10 vääseen suhteessa noin 40 mg kokonaisproteiinia/ml geeliä. Pylväs pestään sitten noin kahdella pylvään tilavuudella 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,0 ja sitten noin 10 pylvään tilavuudella 2 mM etikkahappoa/1 mM glysiiniä/20 μΜ CuS04/6 M ureaa (pH noin 4,8) kontaminoivien proteiinien ja sellais-15 ten erytropoietiini-isoformien poistamiseksi, jotka sisältävät vähemmän kuin 7 siaalihappojäännöstä. Isoformit, jotka sisältävät noin 8-12 siaalihappoa eluoidaan pylväästä käyttäen gradienttia, joka alkaa noin 2 mM etikka-haposta 6 M urea/1 mM glysiini/20 μΜ CuS04:ssa ja päättyen 20 40 mM etikkahappoon/6 M urea/l mM glysiini/20 μΜ CuS04 (pH

noin 4) . Gradientin kokonaistilavuus on noin 40 pylvään ·;·( tilavuutta ja noin yhden pylvään tilavuuden suuruiset « « « ! , fraktiot kerätään kukin astioihin, jotka sisältävät Tris- < « r • «t ) t' puskuria määrän, joka on riittävä saattamaan pH-arvon alu- • ♦ » 25 eelle 6 - 8,5, jotta vältetään kerättyjen fraktioiden ai- • · · *ί tistus matalalle pH: lie. Näytteitä fraktioista saatetaan analyyttiseen isoelektriseen fokusointiin erottelun seu- ·♦· ί.ϊ ' raamiseksi. Kuvio 4 esittää isoformien 8-11 erottelun, joka voidaan saavuttaa tällä menettelytavalla. Isoformit ;**’· 30 12-14, jotka jäävät sitoutuneiksi pylvääseen gradientin ·«· .···. lopussa, eluoidaan pesemällä puskurilla, joka sisältää 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuS04 (pH 7) . Isoformit • ♦ • " (erottuneet gradientin aikana tai eluoituneet natriumklor- * t · idiliuoksella) vapautetaan kontaminoivista proteiineista 35 käänteisfaasikromatografiällä, jota seuraa geelifiltraa-tiokromatografia, kuten Lain et ai. esimerkissä 2 on ku- • « vattu.

Claims (12)

105688

1. Menetelmä biologisesti aktiivisten erytropoi-etiini-isoformien tai näiden seosten valmistamiseksi, 5 joissa isoformeissa on 1 - 14 siaalihappoaryhmää erytro-poietiinimolekyyliä kohti, tunnettu siitä, että (a) puhdistettu erytropoietiini saatetaan preparatiiviseen isoelektriseen fokusointiin ja yksittäinen isoformi, jolla on yksi ainoa isoelektrinen piste, eluoidaan geelistä, tai 10 (b) erytropoietiinia sisältävä materiaali saatetaan ionin- vaihtokromatografiaan tai kromatofokusointiin, ja isofor-mien seos otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1(a) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erytropoietiini-isoformi on 15 tuotettu eksogeenisen DNA-sekvenssin ilmentämisellä ei-ih-misalkuperää olevassa eukaryoottisessa isäntäsolussa.

3. Patenttivaatimuksen 1(a) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erytropoietiini-isoformi käsittää erytropoietiinin, jolla on ihmisen erytropoietiinin 20 aminohapposekvenssi 1-165 tai 1 - 166.

4. Patenttivaatimuksen 1(a) mukainen menetelmä, ·;·, tunnettu siitä, että isoformilla on 14 siaalihap- . poryhmää erytropoietiinimolekyyliä kohti. • · i — -

5. Patenttivaatimuksen 1(a) mukainen menetelmä, • « · 25 tunnettu siitä, että erytropoietiini-isoformilla • 1 · ---------- - *· 1j on 13 siaalihapporyhmää erytropoietiinimolekyyliä kohti. c «

6. Patenttivaatimuksen 1(a) mukainen menetelmä, • · · ·.·· tunnettu siitä, että erytropoietiini-isoformilla on 10 siaalihapporyhmää erytropoietiinimolekyyliä kohti. 3 0

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, • li --------- tunnettu siitä, että eukaryoottinen isäntäsolu on CHO-solu. ____________

• · " 8. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, '··’ tunnettu siitä, että seos sisältää vähemmän kuin 35 neljä erytropoietiini-isoformia. 105688

9. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos sisältää erytropoietii-ni-isoformeja, joissa on vähemmän kuin 12 siaalihappoa erytropoietiinimolekyyliä kohden.

10. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos sisältää erytropoietii-ni-isoformeja, joissa on 9, 10 ja 11 siaalihappoa erytropoietiinimolekyyliä kohden.

11. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että seos sisältää erytropoietii- ni-isoformeja, joissa on enemmän kuin 11 siaalihappoa erytropoietiinimolekyyliä kohden.

12. Patenttivaatimuksen 1(b) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos sisältää erytropoietii- 15 ni-isoformeja, joissa on 13 - 14 siaalihappoa erytropoietiinimolekyyliä kohden. • · · • · * • · • · • · e t * • • « · • * • * M* • · · • · • · · • · • · « «f > · « « 105688