CN1051936A

CN1051936A - 红细胞生成素异构体

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Publication number: CN1051936A
Application number: CN90109447A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·韦恩·斯特里克兰; 托马斯·爱德华·伯恩; 史蒂文·乔治·埃利奥特
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 1991-06-05
Anticipated expiration: 2005-10-12
Also published as: AU646822B2; ES2139764T3; CN1063796C; CZ291515B6; GR3032089T3; DE69033301D1; IL95971A0; PT95586A; NO912281D0; NZ235676A; JPH04502331A; CZ291488B6; EP0668351A1; IL125175A; EP0428267A3; SK497290A3; JP3073905B2; JP2983629B2; ZA908166B; NO912281L

Abstract

本发明公开了一种每个红细胞生成素分子具有特定数唾液酸的红细胞生成素异构体。本发明也公开了这些异构体的混合物，含有这些异构体或异构体混合物的药用组合物，以及获得该红细胞生成素异构体的方法。

Description

本申请是1989.10.13日申请的美国专利申请421444的部分后续申请，在此列入该专利申请作为参考。本发明涉及红细胞生成素异构体或其混合物和特异异构体或其混合物的制备方法，以及含有这种异构体或其混合物的药物组合物和利用这种异构体和组合物的治疗方法。

红细胞生成素是一种糖蛋白激素，包含在红细胞系祖代细胞进入红血球的成熟过程中。在循环中血红细胞浓度的调节是十分重要的。天然产生的红细胞生成素是通过胎儿存活期的肝和通过成人的肾而产生的，并且在血液中循环，刺激在骨髓中产生血红细胞。由于肾的红细胞生成素的产生减少，则肾衰竭的后果将不可避免地是贫血症。已经发现，通过基因工程技术，包括由用编码红细胞生成素基因转换的宿主细胞的蛋白质产物表达来产生的重组体红细胞生成素，在用于处置由慢性肾衰竭引起的贫血症是有效的。

到目前为止，制取红细胞生成素的能力是十分有限。虽然人尿中存在蛋白质，但是排泄量太低，无法将其作为用于治疗目的的红细胞生成素的可利用资源。患有发育不全的贫血症的患者，具有的尿红细胞生成素水平高于健康人，但这种尿的提供量是很有限的，作为资源是不实际的。在J.Biol.Chem.，252，5558（1977）中Miyake等人介绍了人尿红细胞生成素的纯化方法，作为原料，使用了发育不全贫血症患者的尿。

在美国专利US4703008中，Lin描述了鉴定，克隆和表达编码红细胞生成素基因的方法。例如，在美国专利US4667016中Lai等人提出了从支持含重组红细胞生成素质粒的哺乳动物细胞生长的细胞培养基中纯化重组红细胞生成素的方法。由在重组质粒上含有红细胞生成素基因的哺乳动物细胞宿主的表达和回收生物活性的重组红细胞生成素，首次获得适用于治疗应用的红细胞生成素的量。另外，基因顺序知识以及制得更大量的纯化蛋白导致了更详细地了解该蛋白作用方式。

蛋白的生物活性取决于其结构。尤其是，蛋白的一级结构（即，其氨基酸顺序）提供信息，在其合成过程和合成后，通过多肽能够形成二级（如α-螺旋线形或β-片形）以及三级（完全三维叠合）结构。通过引入突变或通过化学或酶处理来分裂适宜的二级和三级结构，这可能造成生物活性的降低。

在原核生物的生物体中，通过上述结构大大地抑制了蛋白的生物活性。与原核生物细胞的蛋白不同，由真核生物细胞产生的许多细胞表面和分泌蛋白可以用一种或多种寡糖基团改性。这种改性是指糖基化，它可以显著地影响蛋白的物理特性，而且对蛋白的稳定性、分泌作用、及亚细胞的定位也可能是很重要的。合适的糖基化对生物活性可能是必要的。事实上，真核生物的生物体的某些基因，如果在缺少糖基化蛋白的细胞过程的细菌中表达时（如E.coli），则产生的蛋白由于缺乏糖基化作用而具有少量或没有活性。

糖基化作用发生在沿多肽主链的特定位点上，通常有两种类型：当主链是顺序Asn-X-Ser/Thr的部分时，其中X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，则O-连接的寡糖连接到丝氨酸或苏氨酸残基上，而N-连接的寡糖连接到天门冬酰胺残基上。发现在每一类型中，N-连接和O-连接的寡糖的结构和糖残基不同。在两种类型中通常发现的一种类型糖是N-乙酰神经氨酸（下文称为唾液酸）。唾液酸往往是N-连接和O-连接的寡糖两者的末端残基，通过其负电荷，使糖蛋白具有酸性。

人尿制取的红细胞生成素和具有人的红细胞生成素氨基酸顺序1～165的重组红细胞生成素（在哺乳动物细胞中表达）都含有三个N-连接和一个O-连接的寡糖链，它们一共含有糖蛋白总分子量的约40%。N-连接的糖基化发生在位于24、38和83位置的天门冬酰胺残基上，而O-连接的糖基化发生在位于126位置的丝氨酸残基上（Lai等人，J.Biol.Chem.261，3116（1986）;Broudy等人，Arch.Biochem.Biophys.，265，329，（1988））。已经表明，寡糖链可以用末端唾液酸残基改性。糖基化红细胞生成素的酶处理除去所有唾液酸残基，造成体内活性损失但是并不影响体外活性（Lowy等人，Nature，185，102（1960）;Goldwasser等人，J.Biol.Chem.249，4202（1974））。这种现象可以借助于在与肝的结合蛋白的唾液糖蛋白（asialoglycoprotein）的相互作用时，从循环中迅速清除唾液红细胞生成素来解释（Morrell等人，J.Biol.Chem.243，155（1968）;Briggs等人，Am.J.Physiol.227，1385（1974）;Ashwell等人，Methods Enzymol.50，287（1978））。因此，只有当红细胞生成素经唾液酸化以避免其与肝的结合蛋白相结合时，红细胞生成素才具有体内生物活性。

红细胞生成素的寡糖链的其它组成的作用还没有很好确定。已经表明，非糖基化的红细胞生成素与糖基化形式相比较，其体内活性大大降低。但是仍然保持体外活性（Dordal等人，Endocrinology 116，2293（1985）;Lin专利，同上）。然而，在另一项研究中，通过糖基化位点的天门冬酰胺或丝氨酸残基的突变，可以单独或一起除去N-连接或O-连接的寡糖链，这样就明显地降低了由哺乳动物细胞所产生的改性的红细胞生成素的体外活性（Dube等人，J.Biol.Chem.263，17516（1988））。

使用某些技术，如等电点聚焦（IEF）可以将糖蛋白如红细胞生成素分成不同的电荷形式。有人已经报导了有关粗制和部分纯化的红细胞生成素制剂的IEF研究（Lukowsky等人，J.Biochem 50，909（1972）;Shelton等人，Biochem.Med.12，45（1975）;Fuhr等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.98，930（1981））。多数情况下，在这些研究中通过IEF可以辨别三或四个具有红细胞生成素活性的片段，并且都没有进行碳水化合物含量的鉴定。另外，也没有进行片段等电点与其生物活性之间的相互关系。

在Miyake等人（同上）的报导中，讨论了在从人尿中纯化尿红细胞生成素的过程中，由羟基磷灰石色谱得到的标记为Ⅱ和ⅢA的二个红细胞生成素片段具有相同的特异活性。对片段Ⅱ和ⅢA以后的碳水化合物分析表明，片段Ⅱ的平均唾液酸含量大于片段ⅢA（Dordal等人，同上）。

本发明的目的在于提供具有确定的唾液酸含量和生物活性的红细胞生成素的所分离和离析的异构体。含有该分子的药物组合物有利于治疗。

本发明涉及红细胞生成素异构体。本发明还提供了一种制备红细胞生成素异构体的方法，该方法包括将纯化的红细胞生成素进行制备的等电点聚焦，并从凝胶中洗脱单独的异构体。本发明也提供了含有红细胞生成素异构体的可药用组合物。本发明还涉及提高哺乳动物血细胞比容程度的方法，包括给药可治疗量的这些组合物以提高网织红细胞和血红细胞的生产。

本发明涉及一种制备具有大于或小于每分子定数的唾液酸的红细胞生成素分子混合物的方法，该方法包括将含有红细胞生成素的材料进行离子交换色谱。本发明还包括一种制备具有大于或小于每分子予定数的唾液酸的红细胞生成素分子的混合物的方法，该方法包括将含有红细胞生成素的材料进行色谱聚焦。

本发明也包括人红细胞生成素的类似物，它比人红细胞生成素具有更多的碳水化合物链连接的位点数，如〔Asn⁶⁹〕EPO;〔Asn¹²⁵、Ser¹²⁷〕EPO;〔Thr¹²⁵〕EPO;和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO。

图1所示为分离重组红细胞生成素异构体的分析等电点聚焦凝胶。凝胶道1～11表明异构体在道1的较低酸性（较高pⅠ）到道11的较高酸性（较低pⅠ）范围之内变化。含有异构体9～14的混合物的纯化重组红细胞生成素也示于凝胶的最左和右的道中。

图2所示为每个红细胞生成素异构体中的唾液酸数与每个异构体（以每毫克红细胞生成素多肽的单位数表示）的体内特异活性之间的关系。在图2A中，每种红细胞生成素异构体的浓度由Bradford蛋白分析法测定;在图2B中，浓度通过在280nm的吸收度测定;在图2C中，浓度通过RIA测定。

图3所示为在不同条件下，通过阴离子交换色谱而制备的重组红细胞生成素异构体的确定的混合物的分析等电点聚焦凝胶。凝胶道1～6分别代表用150mM乙酸（PH4.7），150mM乙酸（未缓冲的），200mM乙酸（PH4.7），250mM乙酸（PH4.7），300mM乙酸（pH4.7）或300mM乙酸（未缓冲的）洗涤Q-琼脂糖快速流动柱后的高盐洗液洗脱的红细胞生成素异构体。按上文中Lai等人的实施例2所述方法（除了其中用Q-琼脂糖色谱替代DEAE-琼脂糖色谱以外）所制得的含有异构体混合物的纯化的重组红细胞生成素也示于凝胶的最左道。

图4所示为通过将细胞有条件的培养基加到Q-琼脂糖柱上以进行降低pH和增高离子强度的梯度淋洗而得的红细胞生成素异构体8到12的分离。将第2到第40馏分之间的偶数部分都进行分析等电点聚焦。按上文中Lai等人的实施例2所述方法除了用Q-琼脂糖色谱替代DEAE-琼脂糖色谱以外，而制得的含有异构体混合物的纯化的重组红细胞生成素也示于凝胶的最左道。

图5所示为人红细胞生成素氨基酸顺序。方块表示天门冬酰胺残基，上面连接碳水化合物链，星号表示用碳水化合物改性的苏氨酸和丝氨酸残基。实施例6的类似物中所提供的附加糖基化位点通过突变为天门冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸而表明。

图6A、6B和6C所示为系列克隆步骤，用于产生构建用质粒和人红细胞生成素类似物的分析。这些类似物具有图5所示变异的氨基酸，它提供附加的糖基化位点。

图7所示为人顺序红细胞生成素和所示的红细胞生成素类似物的COS细胞上清液的Western印迹分析。类似物〔Asn⁹，Ser¹¹〕EPO，〔Asn⁶⁹〕EPO，〔Asn¹²⁵、Ser¹²⁷〕EPO，和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO是按实施例6所述方法构建的。不含附加碳水化合物链的类似物〔Pro¹²⁵、Thr¹²⁷〕EPO，〔Asn¹²⁶、Ser¹²⁸〕EPO和〔Thr¹²⁵、Ser¹²⁷〕EPO用于对比而列出的。

图8所示为用N-聚糖酶处理后人顺序红细胞生成素和所示的红细胞生成素类似物的COS细胞上清液的Western印迹分析。类似物〔Thr¹²⁵〕EPO和〔Pro¹²⁴、Thr¹²⁵〕EPO是按实施例6所述方法构建的。类似物〔Val¹²⁶〕EPO，〔Pro¹²⁴〕EPO，〔Pro¹²⁵〕EPO，〔Thr¹²⁷〕EPO，〔Pro¹²⁵、Ser¹²⁷〕EPO和〔Thr¹²⁵、Ser¹²⁷〕用于对比而示出。

图9所示为通过细胞培养基的Q-琼脂糖和C4反相色谱所获得的池2、3和4的等电点聚焦凝胶，该细胞培养基支持用含有〔Thr¹²⁵〕突变的红细胞生成素cDNA转染的CHO细胞的生长。按上文中Lai等人的实施例2所述方法（除了用Q-琼脂糖色谱替代DEAE-琼脂糖色谱）制得的含有异构体混合物的纯化重组红细胞生成素也示于凝胶的左道和右道中。

按照本发明提供了红细胞生成素异构体。等电点聚焦（IEF）是根据电荷而分离蛋白。当将它放入pH梯度液，并受到电场作用时，蛋白会迁移到某一点，在该点它们不带净电荷并保留在那儿。这就是蛋白的等电点（PI）。在IEF上观测到的每个区分带都代表具有特定pI的分子，因而有相同的总电荷并称为异构体。本文中的术语“红细胞生成素异构体”是指具有单一pI和具有同样氨基酸顺序的红细胞生成素制剂。

在优选实施方案中，红细胞生成素是已经转染入非人真核生物宿主细胞的外源DNA顺序表达的产物，即，在优选实施方案中，红细胞生成素是“重组红细胞生成素”。重组红细胞生成素有利于按照共同所有的Lin的美国专利US4703008（在此引入作为参考）所述方法而生产的。重组红细胞生成素有利于按照共同所有的Lai等人的美国专利US 4667016（在此引入作为参考）中实施例2所述的一般方法而纯化，或者按实施例2所述方法但用Q-琼脂糖色谱代替DEAE-琼脂糖色谱而进行纯化。在Q-琼脂糖柱的改变方案中，用55mM NaCl代替用于使柱呈中性pH的缓冲液中的25mM NaCl，用140mM NaCl代替用于从柱上洗脱红细胞生成素的缓冲液中的75mM NaCl。当采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，该材料以单一形式（即带）迁移。在对纯化的红细胞生成素进行IEF时，在凝胶上出现多带，这说明存在不同电荷形式的糖蛋白。

发现具有尿源人红细胞生成素氨基酸顺序的重组红细胞生成素的分立的异构体，相当于具有1～14唾液酸的红细胞生成素分子，并且每种呈纯化的重组红细胞生成素的异构体都具有体内活性，该活性与异构体所具有唾液酸数有关。这里所用的术语“红细胞生成素”包括天然产生的红细胞生成素、尿源人红细胞生成素，以及非天然产生的、具有氨基酸顺序和足以双倍于天然产生的红细胞生成素的糖基化，以使之具有引起骨髓细胞增加产生网织红细胞和血红细胞的体内生物性质的多肽。

红细胞生成素的粗制制剂具有许多异构体，但是按上文Lai等人专利的实施例2方法纯化的材料，用IEF分析时，主要含有六种异构体。此外，至少有一种有较高酸性的另外异构体，按实施例4所述的色谱法已检测出（这种在IEF凝胶上在大于14唾液酸处迁移的较高酸性的形式含有非唾液酸负电荷，正如某些电荷对唾液酸酶消化的抗体所示）。这些异构体因唾液酸含量而彼此有所区别。正如实施例所示，通过制备的IEF分离出这些异构体中的10个，并检测其中五个的唾液酸含量来证实。在用于分析唾液酸含量的异构体中，发现五个异构体分别含有9.10.11.12或13个唾液酸残基。

在红细胞生成素的相对体内特异活性与由5到11异构体（这里所指的每个异构体是用每个红细胞生成素分子的唾液酸数来表示）中每个红细胞生成素分子中的唾液酸残基数之间存在一个关系。异构体11～14具有基本相同的相对体内特异活性。通过过缺氧红细胞增多鼠的生物分析（exhypoxic polycythemic mouse bioassay）检测异构体5-14的体内活性，并通过Bradford蛋白分析、280nm的吸收度或者通过放射免疫测定（RIA）对红细胞生成素进行每个异构体的含量测定。RIA测定（Egrie等人，Immunobiology 172，213（1986）），以单位/ml表示，除以212770单位/mg红细胞生成素多肽，用RIA测定的纯化红细胞生成素的平均特异活性以红细胞生成素多肽毫克数/ml表示来给出离析的异构体或异构体混合物的蛋白浓度。如实施例所示，从异构体5到异构体11，异构体的相对体内特异活性逐步增加（见表2）。

这里所述的体内特异活性是相对的体内特异活性的测量值，并不是绝对的体内特异活性测量值。从本申请的目的出发，特异活性仅用于比较异构体的相对活性，异构体的测定采用相同测定方法，采用相同条件包括相同的内标，相同种类的动物，具有用于计算特异活性的相同数据分析，测定蛋白含量的相同分析方法。本发明并不想以所报导的任何异构体的任何体内特异活性值来代表该异构体的固有或绝对值。

本发明提供了红细胞生成素异构体。按照本发明获得的红细胞生成素特异性异构体，以及其特性，可以根据起始材料源的不同而变化。例如，从尿中获得的人红细胞生成素的异构体是不同于重组红细胞生成素异构体。在优选实施方案中，本发明涉及每个红细胞生成素分子具有一定数的唾液酸（即大于0的固定值）的红细胞生成素异构体，该所述的数选自1-14。优选的数为9、10、11、12、13或14。在另一实施方案中，该数大于14，优选的为16～23。

本发明还提供了含有两种或多种红细胞生成素异构体的组合物。在一实施方案中，组合物所含有的异构体混合物中每个红细胞生成素分子具有大于予定数的唾液酸，如每个红细胞生成素分子的唾液酸数大于11，或每分子的唾液酸大于12，例如异构体12、13和14的混合物。在另一实施方案中，组合物含有的异构体混合物中每个红细胞生成素分子具有予定数的唾液酸，如每分子的唾液酸数小于12，但大于8，如异构体9、10和11的混合物。本发明还提供了红细胞生成素异构体的组成，其中异构体的相对量相同或不同。如异构体9、10和11的混合物可以有各种不同比例的异构体，如1∶1∶1，2∶3∶1或20∶20∶1。

最好的是，组合物含有低于4个异构体的混合物，如异构体11、12和13的混合物，或12和14的混合物或7和13的混合物。

为了生产红细胞生成素异构体混合物，本发明还提供了同时离析出所选择的红细胞生成素异构体的方法。这些方法包括通过制备等电点聚焦技术分离单个异构体或通过如离子交换色谱或色谱聚焦技术制备每分子具有予定数（如大于11）的唾液酸的异构体混合物。所有这些技术都以按电荷分离蛋白作为基础。

通常，离子交换色谱和色谱聚焦包括将任何粗制的人红细胞生成素（细胞有条件的培养基）或纯化的材料加到柱的树脂上，其条件是要使一些或全部红细胞异构体结合到树脂上。对于粗制红细胞生成素制剂，最好将蛋白加到约PH7的柱上，而对于纯化的制剂，可将蛋白加到PH7到约PH4的柱上。在用约PH4的缓冲液洗涤后，将那些仍然结合在离子交换柱上的红细胞生成素异构体，通过增加PH和盐浓度的缓冲液或通过加入约PH4的降低PH和增加离子强度的梯度液洗脱。对于色谱聚焦，则异构体通过降低PH的梯度液而从柱上洗脱或通过用高浓度盐洗柱而洗脱。

本发明的一个具体方案涉及哺乳动物（如，中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary），CHO）宿主细胞，它最好合成具有大于特定数（即大于每分子10个唾液酸）的红细胞生成素异构体。红细胞生成素分子具有N-连接或O-连接的寡糖结构，该结构可以限定分子中的唾液酸含量。例如，四触角（四支链）（tetraantennary）N-连接的寡糖通常提供4个可能的连接唾液酸位点，而二和三触角寡糖链，可以在天门冬酰胺连接位点上替代四触角形式，通常最多只有2或3个连接的唾液酸。O-连接的寡糖通常提供2个唾液酸连接位点。因此，红细胞生成素分子可以容纳总数为14的唾液酸残基，所提供的全部3个N-连接寡糖都是四触角的。对这些细胞进行哺乳动物细胞培养基的筛选，以便优选地将四触角链加到重组红细胞生成素上，因而使唾液酸连接位点数达到最多。

尿红细胞生成素的N-连接寡糖含有呈α2，3和α2，6键合到半乳糖的两种唾液酸（Takeuchi等人，J.Biol.Chem.263，3657（1988））。一般呈α2，3键合的唾液酸在甘露糖α1，6支链上加到半乳糖，而呈α2，6键合的唾液酸在甘露糖α1，3支链上加到半乳糖。加有这些唾液酸的酶（β-半乳糖α2，3唾液酸转移酶和β-半乳糖α2，6唾液酸转移酶）在分别将唾液酸加到甘露糖α1，6和甘露糖α1，3支链上是非常有效的。

缺少二氢叶酸还原酶的中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary）（CHO）细胞通常用作生产包括重组红细胞生成素的重组糖蛋白的宿主细胞。这些细胞没有表达酶β-半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶，所以没有将呈α2，6键合的唾液酸加到这些细胞中所产生的糖蛋白的N-连接的寡糖上。（Mutsaers等人，Eur.J.Biochem.156，651（1986）;Takeuchi等人，J.Chromatogr.400，207（1987））。因此，在CHO细胞中产生的重组红细胞生成素缺少呈α2，6键合到半乳糖的唾液酸（Sasaki等人，（1987）同上，Takeuchi等人（1987）同上）。在本发明的另一实施方案中，用于生产异构体的红细胞生成素是在CHO细胞中制造的，用官能的β-半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶基因转染CHO细胞以得到呈α2，6键合唾液酸结合到半乳糖上。见Lee等人（J.Biol.Chem.264，13848（1989））该文引入作为参考，以公开产生改性CHO细胞或其它哺乳动物宿主细胞的技术。

本发明还包括人红细胞生成素的某些类似物。这里所用的词组“人红细胞生成素的类似物”是指在人红细胞生成素的氨基酸顺序中有一个或多个变化的红细胞生成素，这种变化导致使唾液酸连接位点数的增加。通过具有附加、删除或替代氨基酸残基的位点导向的诱变基因而产生类似物，这就改变位点以便于糖基化。这种类似物具有比人红细胞生成素更多的碳水化合物链。

由于红细胞生成素分子中的唾液酸含量增加，构建了导致生物活性增加的类似物。通过加入糖基化位点，产生唾液酸含量大于人红细胞生成素中所测得的唾液酸含量的类似物，这并不影响对生物活性必要的第二或第三构型。最好人红细胞生成素类似物具有1、2或3个N-糖基化或O-糖基化的附加位点。例如，在69位置的亮氨酸以天门冬酰胺取代，得到顺序Asn-Leu-Ser，它可以作为N-糖基化的第四位点。这种变化通常使每个分子提供四个以下的附加唾液酸。产生附加N-或O-糖基化位点的其它变化实例是在125位置和127位置的丙氨酸分别变成天门冬酰胺和丝氨酸，在125位置的丙氨酸变成苏氨酸，以及在124和125位置的丙氨酸分别变成脯氨酸和苏氨酸。正如本领域专业人员所理解的，本发明包括具有糖基化附加位点的人红细胞生成素的许多其它类似物。

本发明还包括由治疗有效量的特定异构体或异构体与适宜的稀释剂，辅助剂和/或在红细胞生成素治疗中有用的载体的混合物所组成的药用组合物。这里所说的“治疗有效量”是指对给定条件和给药方案来说，具有治疗效果的量。红细胞生成素异构体的给药最好通过非肠道途径。特定途径的选择取决于要处理的条件。红细胞生成素异构体的给药最好制成部分制剂含有适宜载体，如人血清白蛋白，适宜稀释剂，如缓冲生理盐水溶液、和/或适宜的辅助剂。所要求的剂量是应足以提高病人的血细胞比容。并且按照要处理条件的严格性、给药方法以及类似事项而变化。

下面所提供的实施例将更全面地说明本发明，但不能认为是对本发明范围的限定。在实施例的体内生物分析所用的红细胞生成素标准是重组红细胞生成素的标准，该标准是对部分纯化的尿源红细胞生成素标准进行了标定。因此只能测得相对的体内特异活性。因为所用的红细胞生成素标准没有直接对任何现有的国际标准进行校正，所以体内特异活性是用“单位/毫升”、“单位/毫克”和“单位/A280”表示，而不用“IU/ml”“IU/mg”和“IU/A280”表示。

实施例1：重组红细胞生成素异构体的分离

按照Lin（同上）所述生产重组红细胞生成素。按照共同所有的Lai等人（同上）的实施例2所述的方法纯化在第一和第三异构体分离中用作起始材料的重组红细胞生成素。按照Lai等人（同上）所述的使用Q-琼脂色谱改变的方法纯化第二和第五异构体分离中的起始材料。这些制剂含有与尿源人红细胞生成素同样氨基酸顺序的重组红细胞生成素异构体的混合物，并且主要含有异构体9到14。第四异构体制剂的起始材料是按Lai等人实施例2方法用5mM乙酸/1mM甘氨酸/6M尿素洗涤离子交换柱时所洗脱的材料。该馏分含有小于或等于9个唾液酸的异构体，并且在用于制备的等电点聚焦步骤之前按照Lai等人实施例2中所述的凝胶过滤色谱法将该馏分再进一步纯化。具有4～13唾液酸残基的重组红细胞生成素的纯化制剂通常作为第六异构体制剂的起始材料。该材料按照Lai等人实施例2所述方法，除了对离子交换柱进行了修改（在PH8.4用氯化钠梯度液洗脱重组红细胞生成素而不用乙酸/尿素洗涤）以外，而进行纯化，该离子交换柱导致原始材料中存在的大部分异构体的滞留。

基本按照LKB Application Note 198的方法，在粒状凝胶床（Ultrodex，LKB）中对单个异构体的六种不同制剂进行制备等电点聚焦。使用Pharmalyte（Pharmacia）2.5～5两性电解质（Pharmacia），而且凝胶床含有5M尿素。

在第一制剂中，将在PH7.0的6.8ml 20mM柠檬酸钠/100mM氯化钠中的约20mg重组红细胞生成素加到凝胶上，并在8瓦聚焦约16小时。在等电点聚焦后，通过凝胶床的纸触印迹观察凝胶上的异构体带。制成印迹，然后通过将它浸渍在更换三次（每次约10分钟，室温）的固定溶液（40%甲醇/10%乙酸/10%TCA/3.5%磺酸水杨酸）中而固定，再进行一次40%甲醇/10%乙酸（30～60℃）的溶液更换（约10分钟）的浸渍，在0.125%考马斯兰（Coomassie Blue）R-250/40%甲醇/10%乙酸中于60℃染色15分钟，然后在7.5%甲醇/10%乙酸中退色，以观测所分离的异构体。取出含有异构体的粒状凝胶床区（约50%树脂），加水（约16ml），然后将浆料注入5.5×24.5英寸的盘中，蒸发至净重约40克。该制剂进行第二次聚焦并按上述方法制成凝胶触印。从凝胶床上取出含有六种可辨异构体中的每一个凝胶部分。

为了从凝胶中洗脱异构体，将含有10mM Tris-HCl.PH7.0/5mM Chaps的溶液加到每个异构体中以生成浆料。将浆料放入小柱并用Tris-Chaps缓冲液洗涤。收集流出液并分别加到用20%乙醇/10mM Tris-HCl，PH7.0平衡过的，含有Vydac C4反相树脂的小柱上（敞口柱构型）。用20%乙醇/

0mM Tris-HCl，PH7.0，35%乙醇/10mM Tris-HCl，PH7.0和65%乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展开该柱。经65%乙醇/10mM Tris洗脱的馏分，按1∶1用PH7.0 10mM Tris-HCl稀释，并浓缩，然后使用Centricon-10（Amicon）微浓缩器将缓冲液换成10mM Tris-HCl，PH7.0。该制剂的分析等电点聚焦基本上按照LKB technical note 250所述方法，使用Servalyte 3-5两性电解质（Serva），在含有5M尿素的聚丙烯酰胺凝胶中进行。

在第二制剂中，将在6.5ml去离子水中的约26mg重组红细胞生成素加到凝胶上，并在2.5瓦聚焦35分钟，在10瓦聚焦约17小时。在凝胶床上所见到的聚焦蛋白带按照11个不同池取出。每个池都加入7.5ml去离子水，然后按上述方法，对各池中的20ml上清液进行分析等电点聚焦。向每个池中加入5ml 1.5M Tris-HCl，PH8.8并将浆料分别装入小柱，使液相流过。用约3体积的0.5M Tris-HCl，PH7洗涤树脂，洗涤液与流出液合并。用具有10000道尔顿分子量的分离膜（cutoff）的Amicon一次性超滤（disposable ultrafiltration）装置将洗脱液浓缩并将缓冲液换成20mM柠檬酸钠/100mM氯化钠，PH7.0。然后使浓缩的溶液（约0.5ml）通过0.22微米分离膜的醋酸纤维素过滤器。根据分析等电点聚焦，有5个池中分别主要含有单一异构体10、11、12、13和14。

在第三制剂中，将在21.8ml蒸馏水中的约30mg重组红细胞生成素加到凝胶上，在2瓦聚焦25分钟，10瓦20小时，15瓦15小时。观测到相当于各单个异构体蛋白质带，并且从凝胶上移出。将蒸馏水加入凝胶-分离异构体中得到一种浆料，并通过分析等电点聚焦分析所得的上清液。将等体积的PH7.2 1M Tris-HCl加到各浆料中，将悬浮液装入分开的小柱，使液相流经小柱，以洗脱异构体。用具有10000道尔顿分子量的分离膜的Amicon一次性超滤装置浓缩各流出液并将缓冲液换成20mM柠檬酸钠/100mM氯化钠，PH7.0。分析等电点聚焦凝胶表明所得池中主要含有单一的异构体9、10、11、12、13和14。

用作起始材料红细胞生成素的第四异构体制剂含有异构体3-9（按上述方法制备）。在基本按照上文制剂1-3所述进行制备等电点聚焦之前，在Rotofor（Bio-Rad，Richmond.CA）液相等电点聚焦室中予分馏两性电介质（Pharmalyte 2.5-5）以产生一种两性电介质范围更适合于起始材料的较低等电点。通过用与15克尿素混合的6.7ml Pharmalyte 2.5-5进行予分馏，并加入纯化水使体积达到50ml。用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠分别作为阳极电解液和阴极电解液，在Rotofor室内在10瓦，1℃条件下分馏该混合物5.5小时。具有测量PH4.5～约6之间的两性电介质馏分用于平板等电点聚焦。

使用Centrieluter（Amicon，Danvers，MA）和10000MW分离膜Centricon（Amicon）从异构体中除去两性电介质，所用参数如下：PH8.8，0.18Tris缓冲液100伏，25～30mA，3小时。通过采用Sephadex G-25（Pharmacia）的凝胶过滤，将异构体的缓冲液换成0.1M氯化钠。五个所得的池的分析等电点聚焦表明它们含有异构体4、5、6、7和8。异构体4具有几个带，这说明它可能已经有些降解。

第五异构体制剂，是通过在平板等电点聚焦过程中加入予聚焦步骤而进行改变。在该改变中，将蛋白不是在电泳前加入两性电解质/尿素/凝胶混合物中，而是按照凝胶床的pH梯度液后加到等电点聚焦装置中。在予聚焦75分钟（1500伏-小时）后，将距阴极2.25-4.25cm的部分凝胶床移出，与红细胞生成素溶液混合，并加回到凝胶床中。在等电点聚焦之后，将异构体10、11、12、13和14从凝胶上洗脱，并用Centricon-10（Amicon）装置进行超滤而从两性电解质中分离。

进行予聚焦改变方案以使异构体制剂的紫外吸收度特征更类似于起始重组红细胞生成素。在光谱特征中这种改进可以从分离的异构体在280和260nm的吸收度的比率中看到。对于制剂2和3的异构体（未予聚焦），在280nm处吸收度与260nm吸收度的平均比率（A280/A260）为1.36±0.11，而对于制剂5和6（予聚焦）的A280/A260平均比率为1.68±0.20。在将异构体＃14从计算中删去，则对于制剂2和3，以及制剂5和6，的平均A280/A260比率分别为1.39±0.11和1.74±0.090（异构体14的光谱极不正常，因为它的含量极小，因而更易于因两性电解质组份的痕量污染而受到干扰，或者因为在平板等电点聚焦过程中它距电极最近）。按照Lai等人实施例2所述的方法（如前所述改变，采用O-琼脂糖作为阴离子交换树脂）制备的重组红细胞生成素的平均A280/A260比率为1.91±0.04。

如上所述，异构体制剂＃6的起始材料是含有异构体4～13的重组红细胞生成素制剂。按第四制剂方法在Rotofor装置中对两性电解质进行予聚焦。将具有测量的PH在3.7～4.8之间的两性电解质馏分用于平板等电点聚焦。按实验＃5对平板床进行予聚焦，在进行超过滤（Centricon 10）除去载体两性电解质后得到异构体9、10、11、12和13。

实施例2：重组红细胞生成素异构体的唾液酸含量

将按实施例1所述方法分离的异构体和按Lai等人（同上）所述方法纯化的红细胞生成素（异构体9～14的混合物）缓冲液改变为在0.10～0.15M氯化钠中，并根据Jourdian等人（J.Biol.Chem.214，430（1971））的方法的改变方案分析唾液酸含量。通过用0.35M硫酸在80℃水解30分钟，将唾液酸残基从糖蛋白上分裂，并在分析前将溶液用氢氧化钠中和。为了确定所存在的红细胞生成素蛋白的量，使用Bio-Rad提供的分析试剂和微量法步骤，以具有人红细胞生成素氨基酸顺序的重组红细胞生成素作为标准，进行Bradford蛋白分析（Bradford，Anal.Biochem.72，248.（1976））。其结果示于表1，以每摩尔红细胞生成素的唾液酸摩尔数表示。按照每分子中的唾液酸数来标记异构体，其范围从最低酸的（异构体9）到最高酸的（异构体13）。异构体9-13示于图1的凝胶道6-10。异构体14的量不足以准确地测量其唾液酸含量。该异构体的唾液酸含量是通过它在IEF凝胶上相对于其它异构体的迁移来推算的。没有测量异构体5-8（制剂4）的唾液酸含量，但是同样可以从其在IEF凝胶上的迁移来推算的。

表1

红细胞生成素异构体唾液酸的摩尔数/红细胞生成素的摩尔数

异构体13 12.9±0.5

异构体12 11.8±0.2

异构体11 11.0±0.2

异构体10 9.8±0.3

异构体9 8.9±0.6

异构体混合物 11.3±0.2

（9-14）

实施例3.重组红细胞生成素异构体的活性

按实施例1所述方法分离的异构体，通过在280nm处的吸收度、Bradford蛋白分析和对红细胞生成素的RIA方法来测定重组红细胞生成素的存在量。用过缺氧红细胞增多症老鼠的生物分析法（Cotes等人，Nature，191，1065（1961））测定相对的体内生物活性。对所生成的红细胞生成素，使用放射免疫法定量测定所存在的红细胞生成素蛋白质的含量，结果对某些异构体具有较高的相对体内特异活性，由于含有大量唾液酸的异构体的免疫反应活性明显地降低，导致低估红细胞生成素的浓度，因而就高估了最负性异构体的相对体内的特异活性。鼠生物分析测定，以单位/毫升表示，除以相应的蛋白浓度，得到以单位/毫克红细胞生成素多肽表示的体内特异活性。这些特异活性示于表2。

在表2中，“n”是单独异构体制剂的数目，它与特异活性值有关。在大多数情况，在每种异构体制剂上进行几种体内分析。对于所有三栏的特异活性计算是用同样的体内数据，通过280nm处的吸收度、由放射免疫测定效力或由Bradford蛋白分析结果来测定单位/mg红细胞生成素多肽。在Bradford蛋白分析中，含有异构体9～14的纯化的重组红细胞生成素用作标准。“n”可能低于用Bradford蛋白分析的计算结果，因为在进行Bradford分析时，有些制剂已没有了。

按Lai等人（同上）所述方法纯化的和含有异构体9～14的混合物的红细胞生成素用作RIA和体内分析的标准。

通过乘以0.807mg红细胞生成素多肽/A280可以将以单位/mg红细胞生成素多肽所表示的相对特异活性转换为单位/A280。转换因子是可以通过将红细胞生成素的消光系数（1.345mg/A280）乘以红细胞生成素糖蛋白的蛋白含量（约60%重量，Davis等人，Biochemistry 26，2633（1987）），以得到mg红细胞生成素多肽/A280而导出来的（即，1.345mg红细胞生成素/A280×0.60mg多肽/mg红细胞生成素＝0.807mg多肽/A280）。另外，可将以单位/mg红细胞生成素多肽表示的特异活性乘以转换因子0.60mg多肽/mg红细胞生成素糖蛋白，得到以单位/mg红细胞生成素糖蛋白表示的特异活性。

表2中的数据还在图2A、2B和2C中用图示来达。这些数据表明红细胞生成素的相对体内活性是作为唾液酸含量的函数而增加直到异构体11。异构体11～14具有基本上相同的相对体内生物活性。（当异构体14的浓度用Bradford分析值表示时，这是最明显的。Bradford值可能对异构体14较为准确，因为所得的量通常较低，用A280测定很困难，并且在前面所讨论的最负形式的RIA中最明显地降低反应性）。具有较多唾液酸的红细胞生成素异构体的较大的相对体内特异活性是极相似的，这由于这些形式的循环半衰期较长之故。异构体9和13用放射性碘（¹²⁵I）标记，并测定它们在小鼠中的清除率。异构体13的循环半衰期明显地长于异构体9。

实施例4：通过Q-琼脂糖色谱选择重组红细胞生成素异构体混合物

将按照Lin（同上）所述的方法生产的重组红细胞生成素中的细胞有条件培养基浓缩并对10mM Tris，PH7.2进行透析过滤（diafiltered）。以牛血清白蛋白为标准，通过Bradford微蛋白分析法测定蛋白浓度。将含40mg总蛋白的19.6ml溶液制成有20μM CuSO₄的溶液，然后经0.45微米分离膜过滤器过滤，并装在一个4ml床体积的、用QSepharose Fast Flow（Pharmacia）装填的柱（1.05cm高×2.2cm直径）上，该柱已用10mM Tris（PH6.8～7.0）在4℃平衡过。在样品加入后，用2个柱体积的同样缓冲液淋洗柱子。柱流速约为1ml/分钟。安装6个单独的柱，利用该方法以选择限定的红细胞生成素异构体混合物。

用6到9个柱体积的低PH缓冲液淋洗柱子，该缓冲液包括：柱＃1，150mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，用NaOH调至PH4.7的6M尿素;柱＃2，200mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，用NaOH调至PH4.7的6M尿素;柱＃3，250mM乙酸、1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，用NaOH调至PH4.7的6M尿素;柱＃4，300mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，用NaOH调至PH4.7的6M尿素;柱＃5，150mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，6M尿素;柱＃6，300mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO₄，6M尿素。通过用8至11柱体积的10mM Tris-HCl，55mM NaCl，20μM CuSO₄，PH7淋洗每个柱而使柱的PH增至约PH7。通过用10mM Tris-HCl，140mM NaCl，20μM CuSO₄，PH7.0将确定的红细胞生成素异构体混合物由柱上洗脱。

使用Amicon Centricon-10微浓缩器，将从各柱洗脱的异构体收集液浓缩，并将溶剂改为水。这些浓缩收集液的分析等电点聚焦结果示于图3。凝胶道1-6分别代表从柱1-6上洗脱的确定的红细胞生成素异构体混合物。在图3最右边的凝胶道中所示的“异构体混合物”代表如上所述的加到Q-琼脂糖柱上的细胞培养基，用5mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO₄、6M尿素淋洗柱子，并按上述方法将红细胞生成素异构体混合物从柱上洗脱。在进行分析等电点聚焦前，按照Lai等人（同上）所述方法对洗脱的异构体混合物作进一步纯化。

实施例5：使用低PH梯度液在Q-琼脂糖上进行重组红细胞生成素异构体的分馏

在另一种方法中，使用降低PH和增加离子强度的梯度液分离红细胞生成素异构体。按约40mg总蛋白/ml凝胶的比例，将含有培养基的浓缩透析过滤后的红细胞生成素装到Q-琼脂糖柱上。将柱用约2个柱体积的10mM Tris HCl（PH7.0）淋洗，然后用约10柱体积的2mM乙酸/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄/6M尿素（PH约为4.8）淋洗，以除去污染的蛋白和含有少于7个唾液酸残基的红细胞生成素异构体。使用由在6M尿素/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄中的2mM乙酸开始到40mM乙酸/6M尿素/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄（约PH4）的梯度液从柱上洗脱含有约8到约12唾液酸的异构体。梯度液的总体积约为40柱体积。将每个约1柱体积的馏分收集在装有1体积足以使PH达到6～8.5范围的Tris缓冲液的容器中，以避免所收集的馏分长时间处于低PH中。对等分的馏分进行分析等电点聚焦，以监测分离。图4表明，可以通过这种方法实现异构体8-11的分离。将梯度液淋洗结束时仍结合在柱上的异构体12-14通过用由10mM Tris-HCl、140mM NaCl，20μM CuSO₄（PH7.0）组成的缓冲液洗涤而洗脱。根据Lai等人的实施例2中所述，通过反相色谱，接着用凝胶过滤色谱使异构体（经梯度液分离的或由NaCl溶液洗脱的）没有污染的蛋白质。

实施例6：具有附加糖基化位点的人红细胞生成素的类似物

A.人红细胞生成素类似物的构建

在红细胞生成素氨基酸顺序中已有的和设想的碳水化合物连接位点的位置示于图5。生成这些附加糖基化位点的方法概括在图6A-C并描述于下文。

合成下面的寡核苷酸引物，以用于体外诱变：

[Asn⁴，Ser⁶]EPO：5′CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3′

[Asn⁹，Ser¹¹]EPO：5′ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3′

[Asn⁶⁹]EPO：5′GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3′

[Asn¹²⁴]EPO：5′TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3′

[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO：5′CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3′

[Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵]EPO：5′AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3′

[Thr¹²⁵]EPO：5′TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3′

[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO：5′CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3′

下面划线的密码子表示失配区，其中括号内所示的氨基酸可取代任何类型的氨基酸。

构建〔Asn⁴，Ser⁶〕EPO，使得在Asn 4处加上一个N-糖基化位点。构建〔Asn⁹，Ser¹¹〕EPO，使得在Asn9处加上一个N-糖基化位点。构建〔Asn⁶⁹〕EPO，使得在Asn69处加上一个N-糖基化位点。构建〔Asn¹²⁵、Ser¹²⁷〕EPO，使得在Asn125处加上一个N-糖基化位点。构建〔Thr¹²⁵〕EPO和〔Pro¹²⁴、Thr¹²⁵〕EPO，使得在Thr125处加上一个O-糖基化位点。

合成下面的寡核苷酸引物，用于体外诱变：

[Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO：5′GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′

[Ser⁶⁸，Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO：

5′CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′

[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO：5′CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3′

[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷，Thr¹³¹]EPO：

5′ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3′

[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO：

5′CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3′

[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO：

5′CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3′

[Thr¹²⁵，Thr¹²⁶]EPO：5′CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3′

[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶，Thr¹³¹]EPO：

从〔Pro¹²⁴、Thr¹²⁵〕EPO cDNA开始，寡核苷酸引物5′AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3′用于产生〔Pro¹²⁴、Thr¹²⁵、Thr¹²⁶〕EPO。寡核苷酸引物5′TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3′用于产生〔Pro¹²⁴、Thr¹²⁵、Thr¹²⁶、Thr¹³¹〕EPO。

构建〔Asn⁶⁹，Thr⁷¹〕EPO和〔Ser⁶⁸，Asn⁶⁹，Thr⁷¹〕EPO，以在Asn⁶⁹处加上一个N-糖基化位点，并增加在该位点的N-糖基化作用。构建〔Asn¹²⁵，Thr¹²⁷〕EPO、〔Asn¹²⁵，Thr¹²⁷，Thr¹³¹〕EPO、〔Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕EPO和〔Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Thr¹²⁷〕EPO，以在Asn125处加上一个N-糖基化位点，并增加在该位点的糖基化作用。构建〔Thr¹²⁵，Thr¹²⁶〕EPO和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶，Ser¹³¹〕EPO，以在Thr125处加上一个O-糖基化位点，并增加在该位点的糖基化作用。

用于体外诱变的红细胞生成素DNA源是质粒Hu13-一种在pUC8中的人红细胞生成素cDNA克隆（Law等人，Proc.Natl.Acad.Sci 83，6920（1986））。用BstEⅡ和BglⅡ限制性酶对从Hu13衍生的质粒DNA进行消化，对所得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，使用由厂商（BIO101，Inc.）提供的GeneClean^TM合和方法从凝胶中分离810碱基对（bp）红细胞生成素DNA片段。按在共同所有的Lin专利（同上）中所述，质粒pBRgHuEPO含有作为插入pBR322衍生物中的BamHⅠ片段的红细胞生成素基因组的基因。pBRgHuEPO也用BstEⅡ和BglⅡ消化，并回收6517bp载体片段。连结两种片段结果为IGTl。为了构建pEC-1，用BamHⅠ消化pDSVL（如在共同所有的Lin专利中所述（同上）并示于图5B），并将从含有红细胞生成素cDNA的IGTl中分离的2.8千碱基（Kb）BamHⅠ片段连接进去。

为了生成用于体外诱变的单链DNA，将pEC-1用BamHⅠ和BglⅡ进行消化，并分离820bp红细胞生成素cDNA片段。将它连结进m13mp18的BamHⅠ位点中，生成m13-EC-1。按照Kunkel等人（Methods in Enzymol，154，367（1987））和Messing（Methods in Enzymol.101，20（1983））所述方法通过m13-EC-1传染的大肠杆菌（E.coli）菌株RZ1032的上清液中回收单链DNA。为进行体外诱变，将约1μg单链DNA和0.2pmole按上述一种合成的引物与6ml缓冲液（250mMTris PH7.8，50mM MgCl₂和50mM二硫苏糖醇）混合。为了使引物退火（annealing）为模板，用水将反应体积调到10μl，将混合物加热至65℃5分钟，然后冷却至室温。为延长反应，加入各2.5ml的dTTP、dATP、dGTP、dCTP和ATP（均为10μM），然后再加入1μl（1单位）的大肠杆菌DNA聚合酶（Klenow片段）和1μl（1单位）的T4DNA连接酶。然后将混合物在14℃保温过夜，并按所述（Messing同上文）用于转换大肠杆菌JM109（Yanisch-Perron等人，Gene 33，103（1985））。

为通过差式杂化来鉴定突变克隆，将营养琼脂上的斑转入基因筛选滤器（New England Nuclear）中。将滤器在热灯下干燥，然后在含有1%SDS的6x SSC中在60℃保温1小时。为了进行杂化，用T4多核苷酸激活酶和γ-³²P-标记的ATP对上述寡核苷酸引物（8pmole）进行末端标记并用滤器在6X SSC、0.5%SDS和100mg/ml鲑精子（salmonsperm）DNA培养过夜，其中对〔Asn¹²⁴〕突变的培养温度为37℃，对〔Asn⁴，Ser⁶〕突变为55℃，对〔Thr¹²⁵〕和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕突变为65℃，对〔Asn⁹，Ser¹¹〕和〔Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵〕突变为70℃。第二天，在室温下用6X SSC将滤器洗涤三次，并进行放射自显影法。如果需要，可在升高的温度下用6X SSC洗涤滤器，直到对具有各种类型红细胞生成素cDNA顺序的斑中可检出少量杂化或没有杂化。在这些条件下，鉴定出具有阳性杂化信号的克隆，并再转染入JM109内，以分离纯化的克隆。双脱氧（Dideoxy）链末端顺序分析表明，对天冬酰氨、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基有突变存在。

通过煮沸法（Holmes等人，Anal.Biochem，117，193（1981））从JM109转染细胞中回收载带〔Asn⁴，Ser⁶〕，〔Asn⁹，Ser¹¹〕，〔Asn⁶⁹〕，〔Asn¹²⁴〕，〔Asn¹²⁵〕，〔Ser¹²⁷〕，〔Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵〕〔Thr¹²⁵〕和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕改变的双链m13EC-1DNAs。用BstEⅡ和XhoⅡ消化DNAs并分离810bp红细胞生成素DNA片段。用BstEⅡ消化pEC-1，接着用BglⅡ进行部分消化，并在60℃在10mM Tris，PH8中用细菌碱性磷酸酶将所得片段的5′末端脱磷酸60分钟。分离缺少810bp BstEⅡ-BglⅡ片段的7kb载体片段并连接到上述红细胞生成素片段中。所得质粒（指定的pEC-X，其中X鉴别特定突变）在所示位置上含有具有改变氨基酸残基的人红细胞生成素。

通过电击穿，将人红细胞生成素顺序的cDNA克隆和相当于〔Asn⁴，Ser⁶〕，〔Asn⁹，Ser¹¹〕，〔Asn⁶⁹〕，〔Asn¹²⁴〕，〔Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕，〔Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵〕，〔Thr¹²⁵〕和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕红细胞生成素cDNA克隆的类似物转入COS-1细胞（ATCC No CRL-1650）中。COS-1细胞由半汇合盘（semi-confluent dishes）得到，用培养基（含有5%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺/青霉素/链霉素（Irvine Scientific）的DDulbecco改性基本培养基）洗涤，并按4×10⁶细胞/ml重新悬浮。将1ml细胞转入一电击穿杯（Bio-Rad）中，在100～200μg载体DNA和2～20μg编码红细胞生成素类似物的质粒DNA存在下，在25微法拉和1600伏的条件下，用Bio-Rad Gene Pulser^TM进行电击穿。将电击穿的细胞按每60mm组织培养皿，在5ml培养基中平铺2×10⁶细胞。平铺2～4小时后，用5ml新鲜的培养基代替原培养基。在电击穿3-5天后收集有条件的培养基。

B.红细胞生成素类似物活性的分析

按照Egrie等人（同上）所述进行放射免疫分析。通过过缺氧红细胞增多症鼠的生物分析（Cotes等人同上）测定红细胞生成素类似物的体内生物活性。

按照Iscove等人（J.Cell Physiol.83，309～320（1974））所述方法，加以修改，通过红细胞系菌落形成测定法测定体外红细胞生成素的活性。在ficoll-paque缓冲垫层上将人骨髓细胞的单核细胞进行部分纯化，并在平铺之前在Iscove培养基中洗涤，以除去粘连的细胞。培养基含有0.9%甲基纤维素，并不含有任何牛血清白蛋白。在培养8～10天后，计算红细胞系菌落。

在粗制的COS上清液中，通过RIA和通过红细胞系菌落形成测定，对按节A部分所述的在COS细胞中转染和表达的红细胞生成素类似物进行分析。人顺序红细胞生成素具有一种可与由前面所述的分析法所测定的RIA-活性相比较的体外活性。类似物〔Asn⁶⁹〕EPO、〔Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕EPO，〔Thr¹²⁵〕EPO和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO具有一种可与RIA活性相比较的体外活性，并且证实具有附加的碳水化合物链（如在C部分中所测定的）。将这些类似物，通过编码红细胞生成素类似物的cDNA克隆转染入CHO细胞中，纯化红细胞生成素类似物并测量已纯化类似物的体内生物活性而作进一步的分析。

C.Western印迹分析

将按A部分中所述，用红细胞生成素类似物cDNA转染COS细胞的含5～20单位的一定体积量的上清液，在室温下，使用兔抗红细胞生成素的多克隆抗体进行免疫沉淀过夜。将20～80μl1∶1的蛋白A-琼脂糖的磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS）加入免疫沉淀中，并在室温培养1小时。离心样品，用PBS洗涤，并指出，要用N-聚糖酶处理沉淀，以除去N-连接的碳水化合物链。通过15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析样品，将样品转到硝基纤维素，并按照所述方法（Burnette等人，Anal.Biochem，112，195～203（1981）;Elliot等人，Gene 79;167～180（1989）），使用鼠抗红细胞生成素单克隆抗体的混合物进行Western分析。一种这样的抗体，9G8A，描述于Elliot等人的文献（（1989）Blood 74，Supp.1，A，1228）中。

用〔Asn⁶⁹〕EPO和〔Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕EPO cDNA转染的COS细胞上清液的分析表明，与人顺序红细胞生成素相比较，蛋白质尺寸增加。这种增加的尺寸说明有附加的N-连接碳水化合链（图7）。使用N-聚糖酶处理用〔Thr¹²⁵〕EPO和〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO cDNA转染的COS细胞的上清液表明，与人顺序红细胞生成素相比较，蛋白尺寸增加。这种增加的尺寸表明有附加的O-连接碳水化合物链（图8）。

D.红细胞生成素类似物异构体的分离

按A部分所述构建红细胞生成素类似物〔Thr¹²⁵〕EPO。通过使用BstEⅡ和BglⅡ裂解含有〔Thr¹²⁵〕突变体的质粒pEC而分离载有〔Thr¹²⁵〕突变体的810bp红细胞生成素cDNA片段，并将片段连接到pDEC△-一种pDS_α2的衍生物。在共同所有的美国专利申请501904中对pDS_α2进行了一般性的描述，该专利引入本文作为参改。通过下面的步骤从pDS_α2得到pDEC△。

（1）通过用HindⅢ消化pDS_α2 DNA，用大肠杆菌DNA聚合酶（Klenow片段）和dNTPs处理HindⅢ结合末端，并重新连接钝端载体，而消除pDS_α2的HindⅢ位点。所得质粒是pDS_α2△H。

（2）用SalⅠ消化pD_α2△H，并用一个联接到连接信号的3′端上的SalⅠ连接子，将具有SV40连接信号的合成寡核苷酸与之连接。合成的寡核苷酸具有以下顺序：

5′TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3′

所产生的质粒是pDS_α2△H连接臂。

（3）用SalⅠ消化pDS_α2△H连接臂，并通过用T4 DNA聚合酶和dNTP处理结合端以纯化末端。用同样的方法使820bp BamHⅠ-BglⅡ人红细胞生成素cDNA片段钝化末端，并与质粒连接。所得质粒是pDEC。

（4）用KpnⅠ和PvuⅡ消化pDEC，通过用绿豆核酸酶处理结合端而钝化末端。将该质粒重新连接以消除在质粒pDEC△中所得到的已切除的KpnⅠ-pvuⅡ片段。

将含有〔Thr¹²⁵〕红细胞生成素cDNA的质粒pDEC△转染入缺乏DHFR的CHO细胞中。用10000道尔顿分子量的分离膜将770ml CHO细胞有条件的培养基浓缩，并在10mM Tris-HCl（PH8.6）中进行透析过滤，直到最终体积为34ml。将17ml等分量的浓缩液装到Q-琼脂糖快速流动柱（柱床体积为5ml）上，该柱用相同的缓冲液平衡过，并用在10mM Tris-HCl（PH8.6）中的0～250mM NaCl的线性梯度液洗脱。不管没有处理的或用N-聚糖酶消化的等分柱馏分都通过SDS-PAGE或IEF进行分析，以馏分中的异构体和/或碳水化合物组分作为基础制备池（Pool）（标为2，3和4）。将每个池加到一个Vydac C4柱（214TPB2030;1cm直径;柱床体积1.8～2.5ml;0.34ml/分）并用2柱体积在10mM Tris-HCl（PH7.0）中的20%乙醇洗涤。用20～94%乙醇、10mM Tris（PH7.0）的线性梯度液洗脱柱子。收集流出液，用10mM Tris-HCl（PH7.0）稀释，并装到Q-琼脂糖快速流动柱中。接着，在10mM Tris-HCl（PH7.0）中洗涤后，用20mM柠檬酸钠、250mM NaCl（PH7.0）洗脱样品。通过IEF分析纯化的〔Thr¹²⁵〕池，结果示于图9中。如上所述（Cotes等人，同上）对EPO类似物进行体内生物活性的分析。

当描述本发明时，其中认为是其优选方案，但是它并不限于所公开的方案，正相反，本发明包括权利要求书的精神和范围内所包括的各种改变和等同物，权利要求的范围是按照最宽的解释，以便包括全部这类改变和等同物。

Claims

1、一种红细胞生成素异构体。

2、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，其中所说的异构体是在非人的真核宿主细胞中表达外源DNA顺序的产物。

3、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，其中所说异构体包含具有1-165或1～166人红细胞生成素氨基酸顺序的红细胞生成素。

4、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，每个红细胞生成素分子具有特定数的唾液酸，所说的数选自1～14。

5、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，每个红细胞生成素分子具有大于14的唾液酸。

6、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，每个红细胞生成素分子具有14个唾液酸。

7、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，每个红细胞生成素分子具有13个唾液酸。

8、按照权利要求1的红细胞生成素异构体，每个红细胞生成素分子具有10个唾液酸。

9、按照权利要求2的红细胞生成素异构体，其中所说的真核宿主细胞为CHO细胞。

10、一种可药用的组合物，包括一种治疗有效量的权利要求1所说的红细胞生成素异构体和药物上可用的稀释剂、辅助剂或载体。

11、一种组合物，含有4种以下的红细胞生成素异构体的混合物。

12、一种组合物，包括每个红细胞生成素分子具有小于12个唾液酸的红细胞生成素异构体的混合物。

13、按照权利要求12的一种组合物，该组合物含有每个红细胞生成素分子具有9、10和11唾液酸的红细胞生成素异构体的混合物。

14、一种组合物，含有每个红细胞生成素分子具有大于11唾液酸的红细胞生成素异构体的混合物。

15、按照权利要求14的组合物，该组合物含有每个红细胞生成素分子具有13-14唾液酸的红细胞生成素异构体的混合物。

16、红细胞生成素，基本上由每个红细胞生成素分子具有特定数唾液酸的红细胞生成素分子所构成。

17、红细胞生成素，基本上由每个红细胞生成素分子具有特定数唾液酸的红细胞生成素分子所构成，该数选自1～14。

18、红细胞生成素，含有每个红细胞生成素分子具有大于14唾液酸的红细胞生成素分子。

19、按照权利要求16的红细胞生成素，每个红细胞生成素分子具有14个唾液酸。

20、按照权利要求16的红细胞生成素，每个红细胞生成素分子具有13个唾液酸。

21、按照权利要求16的红细胞生成素，每个红细胞生成素分子具有10个唾液酸。

22、按照权利要求16的红细胞生成素，其中所说的分子是在非人真核宿主细胞中外源DNA顺序表达的产物。

23、按照权利要求15的红细胞生成素，其中所说的红细胞生成素具有人红细胞生成素氨基酸顺序。

24、一种可药用的组合物，包括一种治疗有效量的权利要求15的红细胞生成素和药物上可用的稀释剂，辅助剂或载体。

25、一种组合物，含有每个红细胞生成素分子具有低于4个特定数的唾液酸的红细胞生成素分子的混合物。

26、一种组合物，含有每个红细胞生成素分子具有少于12个唾液酸的红细胞生成素分子的混合物。

27、一种组合物，含有每个红细胞生成素分子具有大于11个唾液酸的红细胞生成素分子的混合物。

28、一种组合物，含有每个红细胞生成素分子具有13～14个唾液酸的红细胞生成素异构体的混合物。

29、制备红细胞生成素异构体的方法，包括下列步骤：

将纯化的红细胞生成素进行制备等电点聚焦，

从凝胶上洗脱单独的异构体。

30、一种制备每个红细胞生成素分子具有高于予定数唾液酸的红细胞生成素分子的混合物的方法，包括将含有红细胞生成素的材料进行离子交换色谱。

31、一种制备每个红细胞生成素分子具有高于予定数唾液酸红细胞生成素分子的混合物的方法，包括将含有红细胞生成素的材料进行色谱聚焦。

32、一种增加哺乳动物血细胞比容水平的方法，包括给药治疗有效量的权利要求26的组合物。

33、一种人红细胞生成素的类似物，选自以下一组：

〔Asn⁶⁹〕EPO;

〔Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕EPO;

〔Thr¹²⁵〕EPO;和

〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO。

34、一种纯化和分离的DNA顺序，该顺序基本上由编码人红细胞生成素类似物的DNA顺序构成，该类似物选自以下一组：

〔Asn⁶⁹〕EPO;

〔Asn¹²⁵，Ser¹²⁷〕EPO;

〔Thr¹²⁵〕EPO;和

〔Pro¹²⁴，Thr¹²⁵〕EPO。