MXPA99001339A - Procedimiento de obtención de eritropoyetina humana recombinante y eritropoyetina obtenida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención y purificación de la Eritropoyetina (EPO) humana recombinante mediante la aplicación de técnicas de cultivo en fibra hueca y de purificación por cromatografía empleando una resina de quelatos metálicos. Más particularmente se relaciona con el procedimiento de obtención de una molécula pura con un patrón de glicosilación apropiado referido de acuerdo con su actividad biológica, su caracterización bioquímica y su perfil farmacocinético, lo que permite su uso en la terapéutica de diferentes enfermedades, relacionadas con la eritropoyesis.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ERITROPOYETINA HUMANA RECOMBINANTE Y ERITROPOYETINA OBTENIDA. Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un procedimiento de obtención y purificación de la Eritropoyetina (EPO) humana recombinante mediante la aplicación de técnicas de cultivo en fibra hueca y de purificación por cromatografía empleando una resina de quelatos metálicos. Más particularmente se relaciona con un procedimiento para la obtención de una molécula pura con un patrón de glicosilación apropiado, referido de acuerdo con su actividad biológica, su caracterización bioquímica y su perfil farmacocinético, lo que permite su uso en la terapéutica de diferentes enfermedades, relacionadas con la eritropoyesis . Antecedentes de la Invención La Eritropoyetina (EPO) es una molécula glicoproteica estimulante de la eritropoyesis en la medula ósea y es producida de forma natural en los riñones . Su indicación terapéutica fundamental es como antianémico y ha demostrado su utilidad en el tratamiento diferentes patologías tales como insuficiencia renal crónica, pacientes oncológicos con tratamientos quimioterapéuticos y Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) . Su acción terapéutica específica es estimular la división y diferenciación de los glóbulos rojos a nivel de la médula ósea. Hasta hace pocos años la disponibilidad de esta hormona se encontraba limitada por las fuentes naturales y los métodos de obtención de la misma. Miyake y colaboradores (J. Bio. Chem., 1977, No. 252, pág. 5558) describieron un método de purificación de la EPO a partir de orina de pacientes con anemia aplástica con buenos resultados pero insuficientes cantidades para su uso terapéutico. La Eritropoyetina humana recombinante obtenida por ingeniería genética a través de su identificación, clonaje y expresión en diferentes líneas celulares ha sido descrita anteriormente (Patente US 4703008) y su obtención a gran escala ha sido sólo posible mediante la tecnología de ADN recombinante, gracias a la cual se han logrado cantidades suficientes para su aplicación en la práctica clínica. La EPO ha sido considerada como uno de los productos de la Biotecnología que ha revolucionado esta industria. Esta molécula que contiene 165 aminoácidos y posee un peso molecular entre 32. 000 y 40 000 daltons es producida por células superiores en las cuales el gen de la Eritropoyetina humana ha sido transfectado. El producto contiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la de la Eritropoyetina natural, lo cual fue demostrado por Davis y colaboradores (Davis J.M, 1987, Biochem., No. 26, pág. 2633) a través de estudios de dicroismo circular y espectroscopia de fluorescencia, posteriormente (Imai N., 1990, J. Biochem, No. 107, pág.352) compararon desde el punto de vista físico, químico y biológico las propiedades de ambas moléculas, la recombinante obtenida del sobrenadante del cultivo de células CHO (Chínese Hámster Ovary) y la natural obtenida de orina de paciente y se concluyó que poseían las mismas propiedades .

A nivel celular esta proteína actúa como una hormona polipeptídica sobre los receptores de las células precursoras eritroides, que pueden presentar más de un sitio receptor con diferente afinidad. Sawada y colaboradores (Sawada K, 1990, J. Cell. Physiol., No. 142, pág. 219) estudiaron la interacción de la Eritropoyetina recombinante marcada con I 125 en células progenitoras y en eritrocitos maduros evidenciándose su afinidad por las primeras y su falta de unión (menos del 15 %) en las segundas. Su mecanismo de acción involucra la presencia de un segundo mensajero o, alternativamente, la internalización de la molécula, lo cual ocurre sólo en incubaciones a altas temperaturas . Otros estudios con relación a la internalización (Spivak J. L., 1986, Int. J. Cell. Cloning, 4, No. 1, pág. 39) demostraron que la misma ocurría y para ello utilizaron una Eritropoyetina biosintéticamente marcada con S35/cisteína. La actividad biológica de las proteínas, así como otras propiedades, dependen de su estructura (secuencia de aminoácidos y modificaciones post-traduccionales) y en esta molécula en particular se ha observado que la eliminación de los carbohidratos (N-glicosilación) presentes en las posiciones Asn 28, Asn 38 y Asn 83 elimina totalmente la actividad biológica "in vivo", no así la actividad biológica "in vitro" . Este fenómeno se explica por el hecho de que la molécula desglicosilada es rápidamente eliminada por el organismo a través de receptores presentes en el hígado . Este fenómeno puede ser reproducido si se trata a la molécula con exoglicosidasas específicas para el ácido siálico lo cual demuestra que dentro de los residuos de carbohidratos presentes en la molécula estos últimos juegan el papel fundamental . Por otra parte se ha observado que los carbohidratos presentes en la posición Ser 128 (0-glicosilación) son irrelevantes para el mantenimiento de la actividad biológica "in vivo" de la molécula. Las preparaciones de EPO altamente purificadas están compuestas por una mezcla de diferentes glicoformas que pueden ser separadas por isoelectroenfoque y cromatoenfoque (Solicitud de Patente WO 91-05867) . Con relación a los métodos de purificación desarrollados tanto para la hormona nativa como la recombinante, el estado del arte muestra que se han descrito sistemas de purificación, entre los que se encuentra el consistente en una cromatografía líquida en fase reversa (Patente US 1577195) pero tiene la desventaja que admite sólo pequeñas cantidades de medio y un costo muy alto no escalable a nivel industrial.

Otros métodos de purificación descritos incluyen resinas unidas a lectinas para que se enlace la EPO a las mismas (Solicitud de Patente EP 359463; Rudzki et al, 1978, Hematológica, vol 63, pág. 4) y aunque se obtienen buenos niveles de actividad específica, ésta fue sólo medida por técnicas "in vitro", por lo que no se puede identificar si este método separa las isoformas activas de las no activas para la actividad biológica "in vivo" . Así mismo se ha reportado el uso de anticuerpos monoclonales específicos en columnas de afinidad y el empleo de hidroxilapatita, para la purificación de esta molécula.

Los estudios realizados por Mac Dougall y colaboradores (Mac Dougall J. , 1989, Contrib. Nephrol . , No. 76, pág. 112) confirmaron que después de la administración intravenosa, la Eritropoyetina se distribuye en un volumen comparable al volumen plasmático . La concentración plasmática decae monoexponencialmente con una vida media de 4 horas . La disponibilidad de la Eritropoyetina administrada peritonealmente en el fluido dialítico fue de 3/8 % pero se incrementaba inyectando la droga en la cavidad peritoneal "seca". La administración subcutánea tuvo un pico de concentración sérica a las 18 horas, con un 5-10% de la misma dosis intravenosa. No obstante se obtienen los mismos resultados en elevación de hematocrito.

Los estudios farmacocinéticos con las diferentes moléculas de EPO obtenidas hasta el momento han evidenciado las siguientes características: las propiedades farmacocinéticas de la EPO en diferentes grupos poblacionales (voluntarios sanos, pacientes con Insuficiencia Renal Crónica (IRC) y en recién nacidos pretérminos) son similares.

Las diferentes vías de administración: endovenosa (EV) , subcutánea (SC) e intraperitoneal (IP) , tanto en su etos sanos como en pacientes sí demostraron diferencias en los parámetros de disposición de la molécula. Después de la aplicación EV aumentan rápidamente las concentraciones plasmáticas, sin embargo descienden en el plazo de 48 horas por debajo de los valores iniciales de EPO endógena.

Después de la aplicación SC, los niveles plasmáticos debido a la absorción y eliminación más lentas, son al principio notablemente más bajos, sin embargo a partir de las primeras 24 horas, dichos valores son más elevados que después de la administración EV y en el caso de la aplicación SC continuada se debe contar con una acumulación y la formación de una meseta plasmática más alta. (Diana F, 1989, Drugs, No. 38, pág. 863; Jensen J.D., 1994, Drug. Invest., No. 8, pág. 278).

La EPO es rápidamente distribuida a través del compartimento plasmático y el volumen de distribución promedio calculado oscila entre 3,3 y 5,5% del peso corporal . La mayor parte de la molécula es captada por el hígado y riñones, aunque la captación específica ocurre principalmente a nivel de la médula ósea. La curva de aclaramiento plasmático (CL) , es bifásica: aclaramiento rápido inicial y eliminación lenta. Con dosis altas el aclaramiento plasmático parece monofásico, probablemente debido a que las grandes dosis pueden enmascarar la fase de distribución. La vida media de eliminación (T12Beta) es aproximadamente de 2-11 horas (Hans N. , 1989, Contrib. Nephrol., No. 76, pág. 108).

Aunque la EPO fue purificada por primera vez utilizando orina de pacientes con anemia aplástica, la excreción renal representa solamente una pequeña parte de la eliminación total . Menos del 10% es excretada sin modificar y la disminución de la función renal afecta la velocidad de eliminación en muy poca extensión. La mayor parte de la hormona es degradada a una velocidad que depende de los grupos glucosídicos, el ácido siálico que conforma el 30% de esta porción representa el componente crítico para el sostén de la actividad in vivo. Los estudios farmacocinéticos han demostrado un aumento significativo en la velocidad de eliminación de las formas asiálicas. Esta eliminación se produce en el hígado por reconocimiento de los residuos de galactosa expuestos en la molécula carente de siálico, con la subsecuente internalización por endocitosis para ser digerida en los lisosomas. Sin embargo hay una porción de asialoeritropoyetina que escapa de la captación hepática y la degradación, posiblemente por no ser reconocida por los receptores hepáticos por la conformación de sus cadenas glucosídicas . Aún permanece sin explicación el hecho de cómo la molécula con siálico abandona el compartimento intravascular sin que las células endoteliales interactúen con el siálico, ante esta situación se han planteado como alternativas dos hechos : la hormona sintetizada in vivo no contiene suficiente siálico o no expone suficientemente sus receptores, ambas situaciones favorecen el transporte hacia sus células dianas (Leonard I.Z. 1990, Ed. Marcel Dekker, NY, USA, ) Sumario de la Invención La novedad de la presente invención consiste en proporcionar un método de obtención y purificación de la Eritropoyetina (EPO) humana recombinante aplicando técnicas de cultivo en fibra hueca y de purificación por cromatografía empleando una resina de quelatos metálicos, a partir del cual se obtiene una molécula que se caracteriza por poseer una alta actividad específica y características biológicas y farmacocinéticas, que permiten su empleo terapéutico, y que la distinguen de aquellas Eritropoyetinas previamente descritas en el estado del arte. Entre estas características farmacocinéticas se encuentran el proporcionar un aclaramiento sanguíneo y presentar un volumen de distribución menores, así como un mayor tiempo de residencia media en compartimento periférico, que los conocidos para las Eritropoyetinas descritas anteriormente. Descripción Detallada de la Invención CULTIVO DE CÉLULAS Y FERMENTACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE ERITROPOYETINA. La EPO recombinante es producida por ingeniería genética, expresada en células de ovario de Hámster chino (CHO) . Se obtiene por la introducción de los plásmidos pKG-Xho-EPO- Hind conteniendo el gen de la eritropoyetina humana y pSV2 DHFR, clonado en células CHO DHFR. El producto final es una línea celular que produce aproximadamente 10 unidades de EPO/litro de cultivo en 24 horas . Las células crecen en medio DMEM F12 u otro equivalente suplementado con 5 % de Suero Fetal Bovino, 26 mM Bicarbonato de Sodio, 15 mM de Hepes, 6 mM de Glutamina, 1 mM de Piruvato de Sodio y 10"5 M de 2-Mercaptoetanol.

Esta línea celular es morfológicamente alargada cuando el cultivo es anclado, alcanzando el grado máximo de alargamiento al llegar a la confluencia. En cambio es morfológicamente redondeada cuando se encuentra en suspensión. La siembra de los frascos se realiza a una concentración que garantiza una buena cooperación celular y buen crecimiento. El tiempo de duplicación es aproximadamente de 16 horas. El cultivo se lleva a cabo en frascos T y luego en frascos Rollers. Concentración en cultivo estacionario de la molécula expresada. Esta línea produce Eritropoyetina según kit de ELISA a una concentración entre 12 ?g/ml y 15 ?g/ml en cultivo estacionario a los siete días. Elaboración del inoculo . El medio de crecimiento empleado para la preparación del inoculo puede ser DMEM-F12 u otro medio equivalente con 5 % de suero fetal bovino, suplementado con 26 mM de bicarbonato de sodio, 15 mM de HEPES, 6 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 10" M de 2-mercaptoetanol . Para la producción del inoculo se descongela un ámpula que contenga entre 8 y 10 x 10 células, se siembran frascos de 175 cm2 a una concentración aproximada de 0.2 x 10 células/ml y 4 pozos testigos de la descongelación a una concentración de 2 x 105 células/ml en 1 ml de volumen final, determinándose la viabilidad que debe ser mayor que el 80 %.

De estos pozos se recoge el sobrenadante a los 7 días. Se le determina la concentración de EPO por ELISA la cual tiene que dar un valor superior al 70 % del valor con que fue liberado el banco del cual procede el ámpula descongelada.

Para inocular un fermentador la cantidad de células aproximadas es de 1000 a 1500 x 10 células, a partir de los frascos que se siembran en el momento de la descongelación. Primero se comienza la expansión en frascos 175 cm2 y posteriormente se pasa a frascos Roller. Además en el momento de la inoculación se resiembran células de la misma descongelación, para lograr una reinoculación con la misma cantidad de células a los 7 días de haber realizado la inoculación. Esto conformaría, un total entre 2000 y 3000 x 10 células en cada fermentador. El tiempo de doblaje de las células es de 16 horas y alcanza una densidad normal en la fase exponencial de 2 x 10s células/ml en cultivo estacionario .

Proceso de fermentación. El cultivo en biorreactores se puede realizar en los Acusyst-Jr o en los P3X. Este consiste de cartuchos de fibra hueca, en serie en el caso del P3X, que se alimentan por su espacio extracapilar con medio DMEM-F12 con 5 % de suero fetal bovino y con el medio basal sin suero por el espacio intracapilar. El mismo posee un cartucho intercambiador de gases que posibilita mantener los niveles de oxígeno disuelto a los niveles necesarios para el cultivo. Las células se inoculan en el espacio extracapilar del cartucho, donde se le crean las condiciones para el crecimiento. Luego de realizar la reinoculación se comienza a cosechar en días alternos el medio del espacio extracapilar enriquecido en eritropoyetina. El cultivo se termina en un período entre 45 y 60 días de corrida para garantizar la calidad de la molécula. Para conocer el comportamiento de la corrida y ajustar los parámetros, se realizan determinaciones que deben mantenerse en correspondencia con los valores siguientes: • Amonio < 2 mM • Glutamina > 2 mM Lactato < 3 mM • Glucosa > 5 mM Durante la corrida se toman muestras para evaluar la contaminación microbiana del cultivo. De cada cosecha se toman muestras para evaluar la concentración de EPO por ELISA PURIFICACIÓN DE LA ERITROPOYETINA. Este proceso permite la purificación de EPO en dos pasos cromatográficos básicamente, a partir de un material de gran complej idad y con una gran cantidad de proteínas contaminantes ya que el mismo contiene 5 % de suero fetal bovino. Posteriormente se realiza un paso adicional para la obtención de las isoformas de interés. ler Paso: Cromatografía de Afinidad en Blue Sepharosa Fast Flow: El sobrenadante es aplicado directamente a la columna de Blue Sepharosa (previamente equilibrada en el buffer de aplicación) a una concentración entre 0.2 mg y 0.3 mg de EPO/mL de gel en buffer Tris-HCl 20 mM, 1 % de Tween 20, pH entre 7.3 y 7.75. Posteriormente se realiza un lavado con buffer Tris-HCl 20 mM, NaCl 400 mM, 1 % de Tween 20, pH entre 7.3 y 7.75 y finalmente se eluye la EPO con buffer Tris-HCl 20 M, NaCl 2.5 M, pH 7.5. Con este paso se logra eliminar principalmente la albúmina presente en el sobrenadante (la cual constituye el contaminante mayoritario del mismo) , así como otras proteínas contaminantes que se encuentran en una menor proporción que ésta. La albúmina no interactúa con la columna y sale en la fracción no retenida mientras que el lavado contribuye a la eliminación de los otros contaminantes . También . se logra eliminar una fracción de EPO que no presenta actividad cuando se ensaya in vivo, lo cual permita suponer que las isoformas presentes en esta fracción tienen un bajo contenido de ácido siálico y tiene un bajo nivel de actividad biológica in vivo. 2do Paso: Cromatografía de Afinidad en Quelatos Metálicos: La Cromatografía de Afinidad por Quelatos Metálicos generalmente involucra la modificación genética de la proteína de interés mediante la adición de una secuencia de nucleótidos que codifica para varios aminoácidos histidina (Poli - Histidina) , responsables de la interacción con el complejo metálico (quelato) sobre la columna. Esto se hace con el objetivo de lograr una buena separación entre la proteína de interés (la cual debido a esta modificación presenta una gran afinidad por el gel) y los contaminantes.

En la presente invención se elimina este paso puesto que, para la mezcla de las proteínas presentes y en las condiciones cromatográficas utilizadas, se logra una elución diferenciada entre la molécula de interés y los contaminantes . Este paso cromatográfico se realiza empleando el ion Cu +. La columna es cargada con el mismo en presencia de agua destilada, siguiendo el siguiente procedimiento: Se lava el gel pasándole de 3 a 4 volúmenes de columna con agua destilada. Se activa el gel con volúmenes de columna (entre 2 y 3) de CuS04 0.1 M y de nuevo se lava el gel pasándole 5 volúmenes de columna con agua destilada. La columna se encuentra equilibrada cuando la señal de conductividad haya subido y se estabilice, en ningún caso el volumen a pasar debe ser inferior a 5 volúmenes de columnas .

Posteriormente se equilibra la columna con buffer Na2HP04 20 mM, NaCl 500 mM, pH entre 7.1 y 7.3 y se aplica la muestra (previamente equilibrada en este mismo buffer) . Finalmente se eluye la EPO con Na2HP04 20 mM, NaCl 500 mM, pH entre 3.8 y 4.2. Al terminarse de aplicar la muestra se sigue aplicando la solución anterior hasta que la señal llegue a la línea base, la muestra se aplica a una velocidad entre 30 cm/h y 60 cm/h. La columna es regenerada con EDTA 50 mM, NaCl 0.5 M y se elimina luego el EDTA con una solución de NaCl 0.5 M (ésto produce la elución del ion Cu2+ unido a la columna) .

Con este paso se logra la eliminación de los contaminantes aún presentes luego del 1er paso cromatográfico. Al aplicar la muestra todas las proteínas presentes en la misma interactúan con el gel por lo que en la fracción no unida no se observa la presencia de ninguna de ellas. Sin embargo se logra la elución selectiva de EPO y contaminantes, ya estos últimos interactúan con el gel más fuertemente que la EPO, quedando retenidas en la columna luego de la elución. Estos contaminantes son eliminados de la columna cuando se regenera la misma La EPO obtenida luego de este paso cromatográfico se encuentra libre de contaminantes y está constituida por una mezcla de glicoformas con diferente contenido de ácido siálico. 3er paso: Cromatografía de Intercambio Iónico en SP Sepharosa. Con este paso se logra la separación de las isoformas presentes en la muestra de EPO en dos fracciones: una constituida por las isoformas acidas (mayor contenido de ácido siálico y por tanto mayor actividad biológica) y otra constituida por las isoformas básicas con un menor contenido de ácido siálico. La muestra (previamente equilibrada en el buffer de aplicación) es aplicada a la columna empleando buffer Tris- HC1 20 mM, pH entre 6.35 y 6.5. Se recoge el pico de absorbancia que comienza a salir en el pass de aplicación. La fracción colectada en esta aplicación (la no unida) es la acida y por tanto la de nuestro interés donde se debe encontrar las isoformas activas de la EPO. La fracción básica se obtiene al regenerar la columna con NaCl 3M. El proceso de purificación que se realiza se muestra a continuación: Paso Lecho Purificación Blue Sepharosa 6 Fast Flow Purificación Chelating Sepharosa Fast Flow Captación de los iones Chelating Sepharosa Fast Flow Purificación SP Sepharosa Fast Flow EJEMPLOS DE REALIZACIÓN: EJEMPLO 1. CULTIVO DE CÉLULAS Y FERMENTACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE ERITROPOYETINA. La EPO recombinante se produjo por ingeniería genética, en células de ovario de Hámster chino (CHO) . Se obtuvo por la introducción de los plásmidos pKG-Xho EPO-Hind conteniendo el gen de la eritropoyetina humana y pSV2 DHFR, clonado en células CHO DHFR- . El producto final fue una línea celular que produjo 107 unidades de EPO/litro de cultivo en 24 horas. Las células crecieron en medio DMEM F12 suplementado con 5 % de Suero Fetal Bovino, 26 mM Bicarbonato de Sodio, 15 mM de Hepes, 6 mM de Glutamina, 1 mM de Piruvato de Sodio y 10"5 M de 2 -Mercaptoetanol La siembra de los frascos se realizó a una concentración que garantizó una buena cooperación celular y buen crecimiento. El tiempo de duplicación fue de 16 horas. El cultivo se llevó a cabo en frascos T y luego en frascos Rollers . Esta línea produjo Eritropoyetina a una concentración de 20 ?g/ml en cultivo estacionario a los siete días. Elaboración del inoculo El medio de crecimiento empleado para la preparación del inoculo fue DMEM-F12 con 5 % de suero fetal bovino, suplementado con 26 mM de bicarbonato de sodio, 15 mM de HEPES, 6 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 10-5 M de 2-mercaptoetanol . Para la producción del inoculo se descongeló un ámpula que contenía 10 x 10 células, se sembraron frascos de 175 cm2 a una concentración de 0.2 x 10s células/ml y 4 pozos testigos de la descongelación a una concentración de 2 x 105 células/ml en 1 ml de volumen final, determinándose la viabilidad que fue mayor que el 80 %. De estos pozos se recogió el sobrenadante a los 7 días. Se le determinó la concentración de EPO por ELISA la cual fue de un valor superior al 70 % del valor con que fue liberado el banco del cual procede el ámpula descongelada.

Para inocular un fermentador, la cantidad de células fue de 1500 x 106, a partir de los frascos que se sembraron en el momento de la descongelación. Primero se expandió en frascos de 175 cm2 y posteriormente se pasó a frascos Roller. Además en el momento de la inoculación se resembraron células de la misma descongelación, para lograr una reinoculación con la misma cantidad de células a los 7 días de haber realizado la inoculación. Esto conformó, un total de 3000 x 10 células en cada fermentador. Proceso de fermentación Se realizó en un Acusyst-Jr que se alimentó por su espacio extracapilar con medio DMEM-F12 con 5 % de suero fetal bovino y con el medio basal sin suero por el espacio intracapilar Las células se inocularon en el espacio extracapilar del cartucho, donde se le crearon las condiciones para el crecimiento. Luego de realizar la reinoculación se comenzó a cosechar en días alternos el medio del espacio extracapilar enriquecido en eritropoyetina . La duración de las corridas fue de 45 días en total . EJEMPLO 2. PURIFICACIÓN DE ERITROPOYETINA . ler Paso: Cromatografía de Afinidad en Blue Sepharosa Fast Flow: El sobrenadante (SN) se aplicó directamente a la columna de Blue Sepharosa (previamente equilibrada en el buffer de aplicación) a razón de 0.2 mg de EPO / mL de gel en buffer Tris-HCl 20 mM, 1 % de Tween 20, pH 7.5. Posteriormente se realizó un lavado con buffer Tris-HCl 20 mM, NaCl 400 mM, l % de Tween 20, pH 7.5, se eluyó la EPO con buffer Tris-HCl 20 mM, NaCl 2.5 M, pH 7.5. La velocidad empleada fue de 60 cm/h hasta que la señal de absorbancia llegó a la línea base, recogiéndose el pico que salió para su posterior procesamiento. ( Figura 1) . 2do Paso: Cromatografía de Afinidad en Quelatos Metálicos: La columna fue cargada con el ion metálico Cu2+ en presencia de agua destilada, siguiendo el siguiente procedimiento: Se lavó el gel pasándole 3 volúmenes de columna con agua destilada. Se cargó el gel con 2 volúmenes de columna de CuS04 0.1 M y de nuevo se lavó el gel pasándole 5 volúmenes de columna con agua destilada. Posteriormente se equilibró la columna con buffer Na2HP04 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7.2 y se aplicó la muestra (previamente equilibrada en este mismo buffer) . Finalmente se eluyó la EPO con Na2HP04 20 mM, NaCl 500 mM, pH 3,5. (Figura 2) . 3er paso: Cromatografía de Intercambio Iónico en SP Sepharosa . Con este paso se logró la separación de las isoformas presentes en la muestra de EPO, las básicas y las acidas.

La muestra (previamente equilibrada en el buffer de aplicación) se aplicó a la columna empleando buffer Tris-HCl 20 mM, pH 6.35. Se recogió el pico de absorbancia que salió en el pass de aplicación. La fracción colectada en esta aplicación (la no unida) fue la acida y por tanto la de nuestro interés, donde se encontraron las isoformas activas de la EPO (Figura 3) . EJEMPLO 3. CARACTERIZACIÓN DE LA MOLÉCULA DE ERITROPOYETINA OBTENIDA POR EL MÉTODO DESCRITO, a) - Actividad biológica o potencia de la EPO. Este método (Cotes et al 1961 Nature 191, 1065) permitió estimar la actividad de las preparaciones por el efecto de la estimulación de la incorporación de Hierro 59 ( 9-Fe) en las células rojas de la sangre de ratones que se hicieron policitémicos mediante la exposición a presión atmosférica reducida. Esta técnica nos permitió evaluar la potencia biológica de la eritropoyetina obtenida por el sistema de purificación descrito. En diferentes pasos de la purificación se obtuvieron los siguientes resultados : b) - Análisis de R-Huepo Por Western Biot: La preparación se consideró que corresponde con la molécula de EPO por el criterio de Western Biot ya que el producto reaccionó con anti-cuerpo/anti-producto, mostrando una banda al peso molecular 34 kda, correcto con el reconocimiento inmunológico correspondiente a la misma.

En la Figura 4 se observa el patrón de reconocimiento inmunológico. c) - Determinación de la Pureza por FPLC y Fase Reversa La pureza de la molécula fue de 99.9 % en tres preparaciones obtenidas por el método descrito. En la Figura 5 se observa el perfil cromatográfico donde se puede apreciar el grado de pureza de la molécula por ambos métodos . d) - Patrón de isoformas por punto isoeléctrico Este resultado nos confirma la capacidad del método descrito de separar isoformas activas y no activas, por el patrón de focalización en isoformas acidas y básicas El patrón de focalización isoeléctrica de la EPO obtenida por el método descrito se observa en la Figura 6. e) - Contenido de ácido siálico El contenido de ácido siálico en las preparaciones obtenidas por el método descrito se relaciona a continuación, expresado como moles de ácido siálico por mol de proteína: 13,40 Moles/Mol, 13,42 Moles/Mol, 15,30 Moles/Mol . EJEMPLO 4. CARACTERIZACIÓN FARMACOCINÉTICA DE LA ERITROPOYETINA. Se estudió el comportamiento farmacocinético de la Eritropoyetina humana recombinante en pacientes con Insuficiencia Renal Crónica. Se evaluaron las concentraciones séricas de la molécula en los tiempos: 0, 0.25, 0.75, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24 horas. Los perfiles farmacocinéticos de cada sujeto se ajustaron a una modelación exponencial utilizando las bases del análisis compartimental . Se obtuvo un modelo mamilar bicompartimental . A partir de este análisis se determinaron los parámetros farmacocinéticos característicos: tiempo de vida media alfa (t XÁ Alfa) ; Tiempo de vida media Betat ( beta) ; Área bajo la curva (AUC) ; Área bajo la curva momento cero ( AUMC) ; Aclaramiento sanguíneo (Cl) ; Volumen de distribución del comportamiento central (Vc) ; Volumen de distribución del estado estacionario (Vss) y Tiempo de residencia media en comportamiento periférico (MRT) . Los valores promedios de estos parámetros se relacionan a continuación. • t alfa (h) : 1.87 ' • t beta (h) : 15.4 • AUC (UI.h/L) : 8262.82 AUMC(UI.h2/L) : 146953.2 • Cl (L/h) : 0.36 • Vc (L) : 3.05 • Vss (L) : 6.45 MRTp (h) : 9.37 La figura No. 7 muestra un ejemplo de perfil farmacocinético . EJEMPLO 5. OBTENCIÓN DE UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE CONTIENE ERITROPOYETINA. Se obtuvo una composición farmacéutica para el tratamiento de la anemia que contiene eritropoyetina humana recombinante, en cantidades de 4000 Ul/mL y como excipiente contiene 2,5 mg de albúmina humana, 5,8 mg de citrato de sodio, 0,069 mg de ácido cítrico y lmL de agua para inyección. EJEMPLO 6. EVALUACIÓN DEL EFECTO TERAPÉUTICO DE LA COMPOSICIÓN QUE CONTIENE ERITROPOYETIN . El efecto terapéutico de la eritropoyetina humana recombinante fue evaluado en 23 pacientes donde se obtuvo un incremento de hematocrito de 24 a 33 puntos en 13 semanas de tratamiento, rectificando la anemia el 100% de los casos y disminuyendo a cero la necesidad de transfusiones, durante el tiempo del ensayo clínico. (Ver Figura 8 a y b) . El promedio de dosis necesaria para elevar hematocrito a 30 fue de 60,8 Ul/kg de peso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS. Figura 1. Cromatografía de Afinidad en Cibacrón Blue Sepharosa de sobrenadante de Eritropoyetina humana recombinante .

Figura 2 Cromatografía de Afinidad en Quelatos Metálicos . Figura 3. Cromatografía de Intercambio Iónico en SP-Sepharosa. Figura 4. Patrón de reconocimiento inmunológico por Western- Biot de la molécula de EPO obtenida. Línea No. 1 Patrón de peso molecular Líneas No.2, 3, 4 Preparación final de eritropoietina . Figura 5: Análisis de pureza por Cromatografía de Gel Filtración. Análisis a ?= 214 nm , Velocidad de Flujo de 0.5 mL/min. Columna Superosa-12 HR Figura 6. Patrón de focalización isoeléctrica Isoformas activas, (preparado final). - Línea 1 : Marcadores de pl, Líneas No. 2, 3, 4 : Preparación final de EPO isoforrmas entre pH 3-4. Figura 7. Perfil farmacocinético de un paciente en estudio. Figura 8. Resultados clínicos del efecto terapéutico de la eritropoyetina. a)- Incremento del promedio global de hematocrito. b) - índice de transfusiones promedio pre y post tratamiento con EPO.

Claims (4)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como una novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Método de obtención de Eritropoyetina humana recombinante, caracterizado porque comprende los siguientes pasos : a) - Cultivo de las células de ovario de Hámster
2. (CHO) en biorreactores de fibra hueca, empleando una concentración de inoculo entre 1000 a 1500 x 10s células a partir de células previamente expandidas y posteriormente cultivadas en frascos Roller; b) - Reinoculación de los biorreactores empleando la misma cantidad inicial de células al cabo de los 7 días de haberse realizado primera la inoculación; c) - Incubación de los cultivos obtenidos a partir del paso (b) durante aproximadamente 16 horas, hasta alcanzarse una densidad normal en la fase exponencial de 2 x 10s células/ml en cultivo estacionario; d) - Cosecha del sobrenadante enriquecido en Eritropoyetina de los cultivos del paso c) en días alternos, hasta completar el ciclo dentro de un período entre 45 y 60 días de corrida; y e) - Purificación de la Eritropoyetina obtenida a partir del sobrenadante de dichos cultivos. 2. Método de obtención de Eritropoyetina humana recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (e) de la purificación de la Eritropoyetina comprende las siguientes operaciones: i)- Cromatografía de Afinidad del sobrenadante obtenido en una columna de Blue Sepharosa Fast Flow a una concentración entre 0.2 mg y 0.3 mg de EPO/ml . ii) - Cromatografía de Afinidad en Quelatos Metálicos de la fracción obtenida, empleando ion Cu + iii) -Cromatografía de Intercambio Iónico en SP Sepharosa empleando buffer Tris-HCl 20 mM, pH entre 6.35 y 6.5
3. 3. Eritropoyetina humana recombinante obtenida según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque presenta un 98% de pureza, una actividad biológica de 160 Ul/mg, isoformas activas en un rango de punto isoeléctrico de 3 a 4 y un perfil farmacocinético con un aclaramiento sanguíneo menor que 0,36 litros/hora, un volumen de distribución menor que 6,45 litros y un tiempo de residencia media en comportamiento periférico mayor de 9,37 horas.
4. 4. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene una cantidad efectiva de la Eritropoyetina humana recombinante obtenida según las reivindicaciones anteriores y un excipiente o vehículo adecuado.