BR112021005968A2 - Eritropoietina humana modificada - Google Patents

Abstract

eritropoietina humana modificada. trata-se de uma eritropoietina humana modificada com meia-vida plasmática aumentada, com atividade eritropoiética inferior a 0,5% em relação a uma eritropoietina nativa, que mantém a capacidade neuroprotetora e neuroplástica, que compreende a mutação de pelo menos um dos sítios de ligação ao receptor homodimérico ou heterodimérico por meio da incorporação de sítios de consenso para n-glicosilação.

Description

“ERITROPOIETINA HUMANA MODIFICADA” Campo da Tecnologia

[001] Esta invenção descreve moléculas de eritropoietina modificadas com capacidade neuroplástica e neuroprotetora úteis para o tratamento de doenças do sistema nervoso central, tais como acidentes vasculares cerebrais, neurotrauma, neuroinflamação e neurodegeneração. Estado da Técnica

[002] A eritropoietina (EPO) faz parte da superfamília de citocinas do tipo I, que é caracterizada por sua importante atividade pleiotrópica [1]. Essa citocina é um dos principais reguladores da eritropoiese, que age sinergicamente com outras moléculas para promover a proliferação, diferenciação e sobrevivência de progenitores de células da linhagem eritroide e manter a massa de eritrócitos circulantes [2].

[003] A EPO humana (hEPO) é uma proteína altamente glicosilada, em que a massa molecular varia de 30 a 39 kDa. A mesma apresenta três sítios de N-glicosilação de consenso e um sítio de O-glicosilação [3] que pode ocorrer com um grau total de ocupação. As cadeias de açúcares são compostas por sequências variáveis de monossacarídeos e uma quantidade variável de ácido siálico (SA) [4, 5]. Os carboidratos ligados a N podem conter dois, três ou quatro ramificações, sendo que cada uma termina com uma molécula SA carregada negativamente. Por sua vez, o carboidrato ligado ao sítio de O-glicosilação pode conter até duas moléculas SA

[6].

[004] A glicosilação, especialmente o terminal SA de N-glicanos, é fundamental para a atividade biológica in vivo da EPO, porém não para a ligação ao receptor in vitro [7, 8]. É por isso que as moléculas de EPO com menor teor glicosídico têm alta afinidade para o receptor da EPO (EPOR); entretanto, sua atividade in vivo é diminuída por um aumento em sua depuração plasmática [8]. O grau de glicosilação dessas citocinas afeta sua eficiência de produção, afinidade pelo receptor, meia-vida plasmática, secreção e estabilidade proteica [5, 9].

[005] Desde a clonagem do gene hEPO em 1985, o conhecimento sobre a biologia das citocinas mudou dramaticamente. Um dos primeiros avanços foi a constatação de uma nova ação biológica da molécula, que ampliou sua capacidade eritropoiética e incluiu diversos processos fisiológicos importantes. Alguns dos mais importantes são a angiogênese, regulação da resistência vascular e — o mais importante — a proteção celular [10, 11]. Embora a atividade mais importante da eritropoietina seja a hematopoiese, a presença de EPO e seu receptor em vários tecidos e células não eritropoiéticas confirmaram a hipótese, acima mencionada, de que a EPO tem múltiplas funções, e uma das mais importantes é a função citoprotetora nas células do sistema nervoso central, coração, rins, sistema gastrointestinal, trato reprodutivo e endotélio [12], que promove a proliferação celular, angiogênese e inibe a apoptose celular [13]. Essas constatações ampliaram as expectativas de uso clínico para o tratamento de outras patologias, como ataques cardíacos, ataques cerebrovasculares e muitos outros relacionados à neuroproteção [14].

[006] A neuroproteção pode ser definida como uma abordagem para a manutenção e restauração das interações celulares no cérebro, que resulta em proteção máxima das funções neuronais [15]. O objetivo da neuroproteção é prevenir a perda neuronal patológica em doenças do sistema nervoso central, como acidentes vasculares cerebrais, neurotrauma, neuroinflamação e neurodegeneração.

[007] As doenças neurodegenerativas são um conjunto de patologias que afetam o sistema nervoso e causam distúrbios cognitivos, de comportamento e alterações no sistema de regulação do corpo. As mesmas são caracterizadas por sua cronicidade e evolução progressiva. Essas patologias incluem doenças como a doença de Parkinson, diferentes tipos de demências, doença de Alzheimer, esclerose múltipla e doença de Huntington, entre outras, que constituem em um problema do ponto de vista médico, de saúde, social e econômico que todos os países devem enfrentar [16]. No entanto, à medida que a população mundial envelhece, o impacto dos distúrbios neurológicos será maior nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. A carga dos distúrbios neurológicos está atingindo proporções significativas em países em que a porcentagem de pessoas com mais de 65 anos aumenta. Considerando, exclusivamente, a doença de Alzheimer, as estatísticas indicam que aproximadamente 44 milhões de pessoas vivem com demência em todo o mundo, número que se estima que aumente para 115 milhões no ano de 2050. É por isso que essa patologia é considerada uma epidemia global [17-19]. Por isso, inúmeros grupos de pesquisa em todo o mundo estão empenhados na busca de tratamentos que proporcionem a cura para o controle desse tipo de patologias neurodegenerativas.

[008] O esforço conjunto de vários grupos de pesquisa tem permitido que avanços de pesquisa forneçam novos e promissores antecedentes sobre a origem do problema e deem esperança de detectá-los em estágios iniciais, bem como definir formas mais específicas de atacá-los. No entanto, mesmo esses esforços não identificaram nenhum bioterapêutico que possa curar tais patologias. Nesse sentido, o mercado farmacêutico só oferece medicamentos indicados para retardar o avanço dessas doenças, uma vez detectados, mas seus benefícios muitas vezes são imperceptíveis, por isso é necessário desenvolver novos tratamentos. O sucesso no enfrentamento do problema de saúde que as doenças neurodegenerativas representam hoje dependerá, entre outros aspectos, da realização de uma terapia que gere benefícios e efeitos duradouros ao influenciar favoravelmente a etiologia ou patogênese subjacente e prevenir ou retardar o aparecimento da doença ou a deterioração clínica gradual de uma maneira segura, bem-sucedida e eficaz. Mas, por sua vez, será necessário chegar a uma tecnologia eficiente e acessível a grandes populações. O principal objetivo da indústria farmacêutica nos últimos anos tem sido encontrar compostos capazes de atacar pontos-chave comuns no desenvolvimento de muitas doenças do sistema nervoso central - como apoptose, estresse oxidativo, inflamação, disfunção metabólica ou neuroplasticidade comprometida.

[009] Nesta área de pesquisa, a EPO desempenha um papel muito importante devido à sua capacidade de desenvolver uma ampla gama de respostas celulares no cérebro,

que estão diretamente relacionadas à proteção e ao reparo de danos celulares [20]. A EPO pode induzir a neuroproteção através de mecanismos anti-inflamatórios, antioxidantes, antineurotóxicos, angiogênicos, neurotróficos, regenerativos e antiapoptóticos.

[010] Diante disso, outro avanço extremamente importante no estudo da EPO tem sido a identificação de dois sítios moleculares diferentes associados às suas atividades biológicas eritropoiéticas e citoprotetoras. Essas duas atividades são conferidas através da ligação da citocina a dois sistemas receptores diferentes; o receptor homodimérico (EPOR)2, responsável pela atividade eritropoiética e o receptor heterodimérico EPOR-pCR, relacionado à atividade citoprotetora [21]. Essas constatações foram extremamente importantes, pois forneceram as informações necessárias para entender as vias pelas quais a EPO desenvolve suas atividades biológicas e, assim, permitir a modulação seletiva de sua resposta eritropoiética ou citoprotetora, com o objetivo de evitar ou pelo menos diminuir os efeitos colaterais associados ao uso de agentes não seletivos, como EPO ou análogos de EPO.

[011] Nesse sentido, embora a EPO seja considerada uma droga segura e bem tolerada no tratamento da anemia, quando a EPO se destina a ser usada como agente citoprotetor em pacientes com ataques cerebrovasculares ou ataques cardíacos, ou seja, como agente neuroprotetor em pacientes que não sofrem de anemia, seus efeitos hematológicos devem ser considerados como efeitos colaterais, uma vez que pode causar policitemia, hipertensão e fenômenos pró-trombóticos [22-25]. É por isso que o desenvolvimento de análogos da EPO que modulam seletivamente seu papel eritropoiético e citoprotetor é altamente relevante [14]. Seguindo este propósito, várias estratégias têm sido projetadas para cancelar a atividade eritropoiética da citocina, mantendo seu potencial neuroprotetor, através da aplicação de modificações químicas na molécula ou da manipulação do teor glicosídico.

[012] Com relação às estratégias que empregam modificações químicas na molécula de EPO, foi avaliada a carbamilação de sete resíduos de lisina, que geram resíduos de homocitrulina [26]. No entanto, esta metodologia gera mudanças conformacionais na proteína que afetam sua função. Com base nesses resultados, diferentes grupos de trabalho modificaram completamente o hEPO recombinante (rhEPO) por carbamilação, obtendo uma nova molécula, denominada CEPO, que retém sua atividade citoprotetora, mas carece da atividade eritropoiética [26-28]. No entanto, doses altas e numerosas são necessárias para obter o objetivo desejado e manter sua eficácia terapêutica.

[013] Por outro lado, modificações foram feitas na rhEPO manipulando-se seu teor de ácido siálico (SA). Em 2003, Erbayraktar et al [29] eliminaram completamente os resíduos de SA presentes nas extremidades das cadeias glicosídicas da EPO, gerando assim o chamado Asialo EPO. Esta nova variante de EPO mostrou alta atividade in vitro. No entanto, sua atividade neuroprotetora in vivo foi comparável à obtida com rhEPO.

[014] Por outro lado, e com o objetivo de aumentar a meia-vida circulante da citocina estimuladora da eritropoiese, Egrie e Brown [6] desenvolveram uma proteína que estimula a eritropoiese : NESP, que é derivado de hEPO e exibe dois sítios de N-glicosilação adicionais. Esta modificação levou a um aumento de três vezes na meia-vida no plasma e sua potência hematopoiética in vivo.

[015] No que diz respeito à manipulação do teor glucídico, os inventores do presente pedido obtiveram uma variante de rhEPO com características semelhantes à EPO cerebral (rhNEPO), que é uma combinação de isoformas menos ácidas de rhEPO. Esta variante apresentou uma atividade neuroprotetora equivalente à da rhEPO e exibiu menos de 4% da atividade hematopoiética [30]. No entanto, a rápida depuração plasmática da rhNEPO é uma desvantagem ao propor esta molécula como candidata ao tratamento de doenças neurológicas crônicas que requerem que a concentração plasmática seja sustentada a tempo e adequada para exercer sua ação biológica. Além do mais, tendo em vista que a combinação de glicoformas retém sua atividade eritropoiética in vitro, a administração de doses altas e frequentes para atingir o objetivo traz o risco de produzir efeitos hematológicos, considerados efeitos colaterais adversos.

[016] Além disso, o estado da técnica mostra muitos outros esforços na obtenção de moléculas de eritropoietina ou peptídeos derivados dela que apresentam atividade neuroprotetora e ausência de atividade eritropoiética. Nesse sentido, a patente US nº 2015119325 descreve uma asialoeritropoietina (asialo-rhEPO) produzida em plantas. Os Pedidos de Patente US nº 2009170759, US nº 2003130197, nº MXPA02011727 e US nº 2003130197 descrevem peptídeos que se ligam ao receptor da EPO para o tratamento de doenças que envolvem o sistema nervoso central.

[017] O documento nº W02004043382 descreve uma variante do polipeptídeo de eritropoietina humana que contém uma sequência de aminoácidos com uma diferença de aminoácidos em duas ou mais regiões de modificação de EPO diferentes e uma atividade de eritropoietina aumentada. A invenção tem como objetivo uma variante humana do polipeptídeo de eritropoietina que contém uma sequência de aminoácidos de eritropoietina humana tendo uma diferença de aminoácidos em duas ou mais regiões de modificação de EPO diferentes e uma atividade eritropoietina moderada relacionada à sua capacidade citoprotetora.

[018] A Patente US nº 2011008363 descreve diferentes variantes de EPO em que 1 a 10 aminoácidos foram deletados no terminal C da proteína. Estas são variantes de massa molecular inferior com atividade eritropoiética reduzida e ação neuroprotetora preservada.

[019] O Pedido US nº 2007027068 descreve peptídeos EPO glicopeguilados. Um dos peptídeos mutados da EPO compreende a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°.: 73) e tem pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em Arg <139> para Ala <139>, Arg <143> para Ala <143> e Lys <154> para Ala <154>.

[020] O pedido nº ES2457398 (T3) refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma variante de EPO.

[021] O Pedido PCT nº W02005025606 (Al) descreve uma EPO modificada que incorpora oligossacarídeos de modo que aumente a atividade eritropoiética e mantenha sua atividade citoprotetora.

[022] Da mesma forma, o pedido nº W02006127910 descreve EPO com glicosilações para aumentar a produção de glóbulos vermelhos. No entanto, é mencionado no mesmo que também é útil para o tratamento de doenças neurodegenerativas, uma vez que exerce uma função citoprotetora.

[023] O pedido depositado na Argentina (nº AR055654) descreve uma eritropoietina recombinante para o tratamento de doenças neurodegenerativas. A descrição detalha os aminoácidos que podem ser modificados para adicionar sítios de glicosilação, e a modificação dos seguintes resíduos é enfatizada: 87,

[024] 88, 90 // 30, 32, 87, 88, 90 // 24, 87, 88, 90 // 38, 87, 88, 90 // 83, 87, 88, 90. Ela tem como objetivo incorporar glicanos de modo que aumente a meia-vida circulante para aumentar a atividade eritropoiética. O mesmo objetivo é apresentado nas modificações introduzidas na patente nº WO9505465 que descreve variantes de eritropoietina que têm sítios de glicosilação adicionais. Alguns dos sítios mencionados na patente são: 25, 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136, 138.

[025] Além disso, as seguintes substituições são mencionadas: Asn<30>Thr<32> EPO; Asn<51>Thr<53> EPO; Asn<57>Thr<59> EPO; Asn<69>EPO; Asn<69>Thr<71> EPO; Ser<68>Asn<69>Thr<71> EPO; Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO; Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO; Ser<87>Asn<88>Gly<89>Thr<90> EPO; Ser<87>Asn<88>Thr<90>Thr<92> EPO;

Ser<87>Asn<88>Thr<90>Ala<l 62> EPO; Asn<69>Thr<72>Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO; Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO; Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO; Ser<87>Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO; Asn<136>Thr<138> EPO; Asn<138>Thr<140> EPO; Thr<125> EPO; e Pro<124>Thr<125> Epo.

[026] O documento nº W02005103076 descreve variantes de EPO com um número par de resíduos de cisteína, preferencialmente não mais do que quatro resíduos de cisteína, ou mais preferencialmente não mais do que dois resíduos de cisteína. Preferencialmente, os resíduos de cisteína devem estar nas posições 7, 29, 33 e 161, ainda mais preferencialmente nas posições 7 e 161. As variantes adicionais fornecidas por este pedido incluem qualquer mutação por adição em uma ou mais das seguintes posições: 6, 29, 33, 45, 47, 48, 49, 61, 64, 74, 88, 92, 107, 109, 133, 135, 154, 157, e 158.

[027] O pedido US nº2011003744 descreve uma formulação de eritropoietina que compreende esta proteína conjugada com polietilenoglicol ou proteína conjugada com polietilenoamina através dos resíduos glicosídicos modificados enzimaticamente de modo que aumente as propriedades hematopoiéticas.

[028] O documento nº MXPA05000063 descreve uma citocina recombinante protetora de tecido que não possui pelo menos um dos efeitos da eritropoietina na medula óssea; a citocina recombinante protetora de tecido não teria atividade eritropoiética; mais preferencialmente, a citocina recombinante protetora de tecido carece de todos os efeitos da eritropoietina na medula óssea.

Na descrição, é mencionado que alterações podem ser feitas em um ou mais aminoácidos, ou deleções ou adições ao EPO.

Em uma modalidade preferencial, a citocina recombinante protetora de tecido tem uma ou mais modificações em uma ou mais das seguintes regiões: VLQRY (aminoácidos 11-15 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 1) e/ou TKVNFYAW (aminoácidos 44-51 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 2) e/ou SGLRSLTTL (aminoácidos 100-108 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 3) e/ou SNFLRG (aminoácidos 146-151 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 4). Outras mutações podem ser fornecidas em aminoácidos 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156, e 161 de SEQ ID N°: 10. Estas outras mutações podem ser únicas ou adicionais a pelo menos uma mutação em pelo menos uma das regiões mencionadas anteriormente.

Em certas modalidades, as mudanças em um ou mais aminoácidos de TKVNFYAW (aminoácidos 44-51 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 2) resulta em uma molécula de eritropoietina modificada com função parcial, isto é, com menos atividade eritropoiética do que rhEPO.

Em outras modalidades, as mudanças em um ou mais aminoácidos de SGLRSLTTL (aminoácidos 100-108 de eritropoietina humana nativa, SEQ ID N°: 3), há até mesmo modificações no teor de ácido siálico ou moléculas sem glicanos ou modificações em carboidratos, como oxidação, redução ou variantes com modificações químicas, como nitração, acilação, succinilação, biotinilação, iodação e carbamilação.

Não há referência à adição de novos glicanos nos sítios responsáveis pela atividade eritropoiética com o objetivo de reduzi-la ou bloqueá-la.

[029] É possível observar que os esforços descritos no estado da técnica desenvolvido até agora não produziram resultados bem-sucedidos na obtenção de uma eritropoietina que mostra atividade neuroprotetora e ausência de atividade eritropoiética. Esta invenção apresenta novas muteínas de hEPO que demonstraram efeitos neuroprotetores e neurotróficos. Essas muteínas foram obtidas por um processo original que modifica a molécula de hEPO por meio da geração de novos sítios de consenso para N- glicosilação na região molecular de hEPO responsável por sua ligação a receptores homo e heterodiméricos. Inesperadamente, as novas muteínas de hEPO carecem de atividade eritropoiética, mas sua atividade neuroprotetora/neuroplástica é inalterada, ou mesmo melhorada e, por sua vez, apresentam melhorias em suas propriedades farmacocinéticas. As modificações do EPO original são mínimas, o que permite manter uma grande semelhança com a estrutura da proteína natural. Breve Descrição da Invenção

[030] Esta invenção descreve uma eritropoietina humana modificada com ausência ou redução de sua atividade eritropoiética, preferencialmente com até 0,5% da atividade eritropoiética em relação à eritropoietina humana, meia-vida plasmática mais longa, que mantém sua capacidade neuroprotetora e neuroplástica. A ligação a pelo menos um dos receptores homo ou heterodiméricos desta eritropoietina humana modificada é parcial ou completamente cancelada. Esta invalidação compreende a mutação de um dos sítios de ligação para receptores homo ou heterodiméricos pela incorporação de sítios de consenso para N-glicosilação.

[031] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Tyrl5Asn e Leul7Thr, e que compreende SEQ ID N° 2.

[032] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Lys45Asn e Asn47Thr, e que compreende SEQ ID N° 4.

[033] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações:

[034] Glu62Asn e Trp64Thr, e que compreende SEQ ID N° 8.

[035] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Gln65Asn e Leu67Thr, e que compreende SEQ ID N° 10.

[036] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Glu72Asn e Val74Thr, e que compreende SEQ ID N° 12.

[037] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Arg76Asn e Gln78Thr, e que compreende SEQ ID N° 14.

[038] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Ala98Asn e SerlOOThr, e que compreende SEQ ID N° 16.

[039] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Serl04Asn, e que compreende SEQ ID N°

18.

[040] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Thrl06Asn e Leul08Thr, e que compreende SEQ ID N° 20.

[041] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Leul49Thr, e que compreende SEQ ID N°

22.

[042] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a eritropoietina humana modificada tem as seguintes mutações: Glyl51Asn e Leul53Thr, e que compreende SEQ ID N° 24.

[043] A eritropoietina humana modificada desta invenção tem uma atividade eritropoiética de até 1% em relação à eritropoietina humana. Preferencialmente, tem até 0,5% de atividade eritropoiética em relação à eritropoietina humana. Mais preferencialmente, tem até 0,2% de atividade eritropoiética em relação à eritropoietina humana.

[044] Por outro lado, esta invenção descreve ácidos nucleicos que compreendem as sequências de nucleotídeos da eritropoietina desta invenção. Além disso, as sequências de DNA que codificam cada uma das muteínas descritas e geradas são delineadas. Estas sequências de DNA são SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ

ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21, e SEQ ID N° 23. Em uma modalidade alternativa desta invenção, esses ácidos nucleicos são vetores para a transformação de células ou são vetores de expressão ou vetores lentivirais.

[045] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

1.

[046] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

3.

[047] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°7.

[048] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

9.

[049] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

11.

[050] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

13.

[051] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

15.

[052] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

17.

[053] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

19.

[054] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

21.

[055] Em uma modalidade preferencial desta invenção, a sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana modificada desta invenção é SEQ ID N°

23.

[056] Além disso, esta invenção descreve células geneticamente modificadas com qualquer uma das sequências de DNA selecionadas do conjunto compreendido por SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23; em que esta célula geneticamente modificada é capaz de expressar a eritropoietina modificada desta invenção. Em uma modalidade preferencial, esta célula geneticamente modificada é uma célula vegetal, ou uma célula animal ou qualquer célula hospedeira que permita a adição de N-glicanos. Preferencialmente, esta célula é derivada de uma linhagem celular animal. Preferencialmente, esta linhagem celular é selecionada a partir do conjunto compreendido por CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21 e HeLa.

[057] Por outro lado, esta invenção descreve um processo para obter eritropoietina humana modificada compreendendo as seguintes etapas:

[058] a. Fornecer as sequências de ácidos nucleicos que codificam a dita eritropoietina humana modificada;

[059] b. Construir pelo menos um vetor de cotransfecção de células de empacotamento;

[060] c. Cotransfectar as células de empacotamento que produzem as ditas partículas lentivirais que contêm essa sequência de ácidos nucleicos que codifica a eritropoietina humana modificada;

[061] d. Colher essas partículas lentivirais produzidas pelas células de empacotamento da etapa c;

[062] e. Transduzir células capazes de expressar e dobrar a eritropoietina humana modificada com as ditas partículas lentivirais da etapa d;

[063] f. Selecionar as células na etapa e que incluem a sequência de ácidos nucleicos que codifica a dita eritropoietina humana modificada;

[064] g. Cultivar as células da etapa f de modo que as mesmas expressem a dita eritropoietina humana modificada; e

[065] h. Isolar e purificar a dita eritropoietina humana modificada.

[066] Em que na dita etapa a, em que compreende SEQ ID N° 1 as sequências de ácidos nucleicos são selecionadas a partir do conjunto que compreende SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21, e SEQ ID N° 23.

[067] Em que a etapa b inclui um vetor que permite a entrada da partícula lentiviral na célula, um vetor que codifica uma proteína de matriz, capsídeo, protease, transcriptase reversa e integrase; um vetor de transferência, que compreende a sequência de eritropoietina humana modificada; e um vetor que induz a exportação nuclear do dito vetor de transferência.

[068] Em que a dita etapa e as ditas células são selecionadas a partir do conjunto que compreende CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21 e HeLa.

[069] Em que a dita etapa h é uma purificação por imunoafinidade que inclui um anticorpo anti-rhEPO e um eluente.

[070] Em que o dito eluente é selecionado a partir do grupo que compreende glicina, ácido acético-NaCl, sais de acetato, ácido cítrico, sais de fosfato, etanol, álcool isopropílico, dioxano, etilenoglicol, Tris-HCl e misturas dos mesmos. Preferencialmente, esse eluente é selecionado a partir do grupo que compreende a glicina e o ácido acético-NaCl. Mais preferencialmente, o eluente é selecionado a partir do grupo que compreende a glicina a 0,1 M (pH = 2); glicina a 0,15 M (pH = 2,5) e ácido acético a 0,2 M, NaCl a 0,15 M (pH = 3). Breve Descrição das Figuras

[071] Figura 1. Esquema da sequência de etapas para obter as 12 muteínas de hEPO por meio de mutagênese sítio-dirigida.

[072] Figura 2. Análise dos fragmentos obtidos em cada uma das reações de PCR em gel de agarose, a- Fragmentos obtidos na PCR1. b- Fragmentos obtidos de PCR2.

[073] Figura 3. Análise em silício da antigenicidade potencial de muteínas de hEPO e da molécula não modificada usando o banco de dados IEDB.

[074] Figura 4. Western Blot confirmando a inserção dos novos sítios de N-glicosilação.

[075] Figura 5. Capacidade de eluição da molécula de rhEPO ou de suas muteínas avaliada pela técnica de sanduíche ELISA.

[076] ■ Protocolo A (capacidade de eluição após o complexo Ag-Ac ser formado).

[077] ■ Protocolo B (grau de preservação da capacidade de ligação às moléculas de interesse após o tratamento de mAb com diferentes eluentes).

[078] Figura 6. Purificação de muteína Mut 104 de hEPO através de cromatografia de imunoafinidade (IAC) usando mAb 2B2.

[079] A- Cromatograma completo obtido durante a purificação de hEPO muteína Mut 104.

[080] B- Ampliação da zona de eluição do cromatograma A.

[081] Figura 7. Avaliação da purificação de muteína Mut 104 por cromatografia de imunoafinidade (IAC) usando glicina 0,15 M (pH 2,5) como solução eluente. Amostras: 1- Sementeira, 2- Fluxo contínuo, 3- Lavagem 1, 4-

Lavagem 2, 5- Lavagem 3, 6- Mistura de frações de eluição, 7- padrão rhEPO (Zelltek S.A.).

[082] Figura 8. Análise de pureza em eluatos obtidos após cromatografia de imunoafinidade (IAC) de muteínas de hEPO. Amostras: 1- Marcador de massa molecular, 2- rhEPO padrão (Zelltek S.A.), 3- Eluate Mut 45 47, 4- Eluate Mut 104, 5- Eluate Mut 151_153.

[083] Figura 9. Determinação de massas moleculares aparentes de muteínas de hEPO. MM: Marcador de massa molecular.

[084] Figura 10. IEF de muteínas de hEPO purificadas por cromatografia de imunoafinidade (IAC). Amostras: 1- Mut 45 47, 2- Mut 104, padrão 3-rhEPO (Zelltek S.A).

[085] Figura 11. Eletroferogramas ECZ obtidos para rhEPO e suas muteínas. A: Mut 45 47; B: Mut 104; C: rhEPO. O termo "Pico" corresponde a cada pico atribuído no eletroferograma ECZ, e "Área" (%) representa a porcentagem de cada isoforma, calculada integrando-se a área sob a curva de cada pico.

[086] Figura 12-a-. Comparação da atividade biológica eritropoiética específica avaliada in vitro para muteínas de hEPO.

[087] Figura 12-b-. Avaliação da atividade eritropoiética in vivo para muteínas de hEPO. A atividade eritropoiética in vivo de muteínas de hEPO (Mut) foi avaliada em camundongos normocitêmicos (n = 4), que foram tratados com a mesma massa de rhEPO ou mut de hEPO, conforme apropriado, ou com PBS como controle. Após o tratamento, a porcentagem de reticulócitos foi quantificada para cada tratamento. *** p < 0,001 e ns (não significativo) representam o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós-teste ANOVA de Tukey (n = 4).

[088] Figura 13. Atividade cito/neuroprotetora de rhEPO e Mut 104, usando culturas de células de origem neuronal SH-SY5Y. CSTP: controle da adição de estaurosporina (STP), Ccel: controle celular (sem a adição de STP ou muteínas). * p £ 0,05 e ** p £ 0,01 representam o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós-teste ANOVA de Dunnet (n = 3).

[089] Figura 14. Diagrama representativo do desenvolvimento neuronal em culturas primárias de neurônios do hipocampo.

[090] Figura 15. Avaliação da formação de neuritos através de células N2a murinas, (a) Imagens representativas de cada um dos grupos analisados. (b) Representação gráfica obtida a partir da avaliação dos seguintes parâmetros dos neuritos: comprimento médio, extensão do neurito mais longo e número médio de neuritos por neurônio. * p £ 0,05 e ** p £ 0,01 representam o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós-teste ANOVA de Bonferroni (n = 3).

[091] Figura 16. Avaliação da densidade de filopódios usando culturas primárias de neurônios do hipocampo de embriões de ratos. * p £ 0,05 e ** p £ 0,01 representam o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós-teste ANOVA de Bonferroni (n = 3).

[092] Figura 17. Avaliação da formação de sinapses usando culturas primárias de neurônios do hipocampo de embriões de ratos. * p £ 0,05 *** p < 0,001 representa o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós- teste ANOVA de Bonferroni (n = 3).

[093] Figura 18. Avaliação da atividade biológica neuroprotetora de muteínas de hEPO em culturas neurais primárias de 11 dias de cultura in vitro (DIV). A atividade neuroprotetora in vitro de muteínas hEPO (Mut) foi avaliada em culturas primárias de neurônios do hipocampo de ratos Sprague-Dawley de 11 DIV. As culturas foram tratadas com massa igual de rhEPO ou muteínas, conforme apropriado, ou com PBS como controle. Em seguida, a apoptose foi induzida por incubação com estaurosporina (STP). Uma imunofluorescência foi realizada com reagentes Hoescht e Phalloidin-FITC para analisar a porcentagem de núcleos apoptóticos. *** p < 0,001, ** p £ 0,01 e ns (não significativo) representam o grau de significância estatística após o teste ANOVA e pós-teste ANOVA de Bonferroni. Descrição Detalhada da Invenção

[094] Como já foi mencionado no estado da técnica, o objetivo foi tentar desenhar diferentes estratégias para diminuir a atividade eritropoiética da citocina, mantendo seu potencial neuroprotetor e neurotrófico, que se basearam na aplicação de modificações químicas na molécula ou a manipulação de seu teor glicosídico. No entanto, o estado da técnica não descreveu o uso da glicosilação como mecanismo de bloqueio da porção molecular envolvida na interação que é responsável pela eritropoiese.

[095] Portanto, esta invenção fornece uma nova eritropoietina modificada que resolve os problemas mencionados no estado da técnica atingindo-se simultaneamente:

[096] • Uma inibição da função hematopoiética do hEPO em pacientes que requerem tratamento relacionada à neuroproteção e em que a eritropoiese se torna um efeito adverso.

[097] • Uma extensão da meia-vida de hEPO de modo que melhore a atividade biológica in vivo e diminuir o número de doses a serem administradas.

[098] Assim, esta invenção inclui o uso de muteínas hiperglicosiladas derivadas de hEPO para a preparação de uma composição farmacêutica destinada à prevenção ou tratamento de uma doença ou predisposição genética para sofrer tal doença, na qual a neuroplasticidade e/ou neuroproteção têm um efeito benéfico. Esta invenção pode ser administrada a pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amiotrófica (ALS), entre outras; a pacientes com doenças dos neurônios motores, como doença de Huntington, atrofias espinocerebelares, doença de Creutzfeld-Jakob, entre outras; doenças incapacitantes, como depressão ou esquizofrenia; doenças do desenvolvimento, como síndrome de Down, bem como pessoas que sofreram danos no tecido nervoso devido a acidentes cerebrovasculares ou trauma cranioencefálico.

[099] O termo "muteína" neste documento refere-se a uma proteína que foi modificada por uma mutação direcionada ao local que inclui a substituição de 1 ou 2 de seus resíduos de aminoácidos de modo que introduza um consenso e um sítio potencial para N-glicosilação.

[100] A geração ou adição de sítios de consenso para N-glicosilação inclui a mutação de um aminoácido em um sítio ou região da molécula de interesse. Para uma célula realizar a adição de glicanos, é necessário que um sítio Asn-Xaa- Ser/Thr esteja presente, em que Xaa pode ser qualquer aminoácido diferente de Pro. Para isso, se um resíduo Asn estiver presente no sítio em que um sítio de N- glicosilação deseja ser adicionado, o aminoácido na posição +2 (em relação a Asn) é mutado para Thr, que tem maior eficiência comparado a Ser de modo que o resíduo Asn seja ocupado por glicanos. De forma diferente, se o sítio a ser modificado possui um aminoácido na posição +2 evidenciando a presença de Ser ou Thr, este aminoácido é mutado para Asn. Ou seja, há mudanças conservadoras em todos os momentos.

[101] Esta invenção descreve uma eritropoietina humana que tem uma modificação da estrutura do aminoácido que permite as seguintes realizações:

[102] i. Preservação de resíduos de aminoácidos que constituem sítios essenciais para a conformação molecular ou para o desenvolvimento da atividade neuroprotetora/neuroplástica.

[103] ii. Modificação dos aminoácidos proposta na abolição da atividade hematopoiética.

[104] iii. Geração de sítios de consenso para N-glicosilação.

[105] 12 muteínas de hEPO foram construídas. Nessas muteínas, a modificação de 1 ou 2 aminoácidos foi realizada para incorporar sítios de consenso para N- glicosilação a fim de abolir a atividade hematopoiética,

preservar a atividade neuroprotetora/neuroplástica e obter mutantes com meia-vida plasmática superior.

[106] Os ensaios realizados para obter as moléculas desta invenção são detalhados abaixo. Esses ensaios têm como objetivo exemplificar a aplicação e devem ser entendidos em seu sentido mais amplo, sem limitar o escopo de proteção desta invenção.

1. Projeto e Obtenção de Muteínas Derivadas de hEPO que Abolem a Atividade Eritropoiética e Preservam a Ação Neuroprotetora/Neuroplástica.

[107] Projetamos 26 oligonucleotídeos: 2 deles para amplificar as novas sequências completas de EPO, e os 24 restantes (oligonucleotídeos direto e reverso) para introduzir as 12 mutações pontuais.

[108] De acordo com a descrição fornecida nesta invenção, as modificações devem ser interpretadas como a substituição de um aminoácido em uma determinada posição por outro aminoácido na mesma posição. Portanto, e tomando a Mutação 1 (Lys45 Asn45) + (Asn47 Thr47) como exemplo, deve ser interpretada como a mudança do resíduo de lisina na posição 45 para o resíduo de asparagina na dita posição e a mudança de asparagina na posição 47 para treonina.

[109] A estratégia implementada para gerar muteínas de hEPO por mutagênese sítio-dirigida está resumida no esquema mostrado na Figura 1.

[110] Usando DNA de hEPO como molde, oligonucleotídeos para cada mutante e oligonucleotídeos pMATEPOF e PMATEPOR que se ligam complementarmente às extremidades da sequência de hEPO, uma primeira PCR foi realizada para introduzir cada uma das mutações acima mencionadas. Foram obtidos 24 fragmentos, correspondentes às 12 muteínas de hEPO. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos das ditas 12 muteínas hEPO sintetizadas (muteínas) são: Muteína 15-17 (Tyr15 Asn15) + (Leu17 Thr17)

[111] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 15-17 (SEQ ID N° 1) Sequência de Aminoácidos de Muteína 15-17 (SEQ ID N° 2) Muteína 45-47 (Lys45 Ansn45) + (Asn47 Thr47)

[112] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 45-47 (SEQ ID N° 3)

Sequência de Aminoácidos de Muteína 45-47 (SEQ ID N° 4) Muteína 49 (Tyr49 Thr49)

[113] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 49 (SEP ID N° 5) Sequência de Aminoácidos de Muteína 49 (SEQ ID N° 6)

Muteína 62-64 (Glu62 Asn62) + (Trp64 Thr64)

[114] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 62-64 (SEQ ID N° 7) Sequência de Aminoácidos de Muteína 62-64 (SEQ ID N° 8) Muteína 65-67 (Gln65 Asn65) + (Leu67 Thr67)

[115] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 65-67 (SEP ID N° 9)

Sequência de Aminoácidos de Muteína 65-67 (SEP ID N° 10) Muteína 72-74 (Glu72 Asn72) + (Val74 Thr74)

[116] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 72-74 (SEP ID N° 11) Sequência de Aminoácidos de Muteína 72-74 (SEP ID N° 12)

Muteína 76-78 (Arg76 Asn76) + (Gln78 Thr78)

[117] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 76-78 (SEP ID N° 13) Sequência de Aminoácidos de Muteína 76-78 (SEP ID N° 14) Muteína 98-100 (Ala98 Asn98) +(Ser1OO Thr1OO)

[118] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 98-100 (SEP ID N° 15)

Sequência de Aminoácidos de Muteína 98-100 (SEP ID N° 16) Muteína 104 (Serl04 Asnl04)

[119] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 104 (SEP ID N° 17) Sequência de Aminoácidos de Muteína 104 (SEP ID N° 18)

Muteína 106-108 (Thrl06 Asn106) + Leu108 Thr108)

[120] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 106-108 (SEQ ID N° 19) Sequência de Aminoácidos de Muteína 106-108 (SEQ ID N° 20) Muteína 149 (Leul49 Thrl49)

[121] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 149 (SEQ ID N° 21)

Sequência de Aminoácidos de Muteína 149 (SEQ ID N° 22) Muteína 151-153 (Glyl51 snl51) + (Leul53 Thrl53)

[122] Iniciadores eram: Sequência de Nucleotídeos de Muteína 151-153 (SEQ ID N° 23) Sequência de Aminoácidos de Muteína 151-153 (SEQ ID N° 24)

Sequencia de EPO Humana Sequência de Nucleotídeos de EPO Humana (SEQ ID N° 25) Sequência de Aminoácidos de EPO Humana (SEQ ID N° 26)

[123] Estes são mostrados na Figura 2a. Esses fragmentos foram usados como modelo para realizar uma segunda PCR, desta vez usando apenas os oligonucleotídeos que se ligam às extremidades de hEPO, de modo que obtenha a sequência dos 12 mutantes (Figura 2b). Após as reações de PCR, os produtos correspondentes às 12 muteínas de hEPO foram digeridos com as enzimas de restrição Xbal/Sall, que flanqueiam a molécula de hEPO, para serem clonados no vetor pLV-PLK, digerido com as mesmas enzimas de restrição. Bactérias TOP DEZ foram transformadas e selecionadas por ampicilina. 3-4 colônias de cada muteína de hEPO foram amplificadas em meio líquido para realizar mini preparações de DNA de plasmídeo. Em seguida, confirmamos a presença do inserto por digestão com enzimas de restrição dos sítios presentes na sequência de hEPO e ausentes na sequência do vetor. Por fim, as mini-preparações de DNA de plasmídeo foram sequenciadas para confirmar a inserção das mutações realizadas na molécula de hEPO.

2. Análise em Silício de Antigenicidade Potencial de Muteínas de hEPO

[124] O banco de dados do Banco de dados de Epítopos Imunológicos e Recursos de Análise (Immune Epitope Database and Analysis Resources - IEDB) foi usado para realizar uma análise em silício para comparar a potencial antigenicidade das muteínas hEPO e a potencial antigenicidade da molécula não modificada. Para todos eles, uma predição de epítopos T —reconhecidos no Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe II (Major Histocompatibility Complex - MHC II) - foi realizada analisando os 8 alelos mais representativos em todo o mundo (HUMAN, HLA-DR: DRB1*01.01, DRB1*03.01, DRB1*04.01, DRB1*07.01, DRB1*08.01, DRB1*11.01, DRB1*13.01, DRB1*15.01). Uma pontuação de antigenicidade foi obtida para cada variante de hEPO, e cada uma foi comparada com a pontuação obtida para hEPO. O grau de antigenicidade potencial para cada um deles é esquematicamente resumido na Figura 3. Assim, foram observadas duas muteínas com o mesmo grau de antigenicidade que hEPO (Mut98 100, Mutl51 153), duas muteínas potencialmente mais antigênicas (Mut72 74 e Mut62 64) e, finalmente, 8 muteínas potencialmente menos antigênicas (Mut45 47, Mut49, Mutl5 17, Mut65 67, Mutl49, Mut76 78,

Mutl04 e Mutl06 108), e estes dois últimos eram os que apresentavam menos antigenicidade.

3. Obtenção de Linhagens Celulares que Produzem as Muteínas Mencionadas

[125] Partículas lentivirais foram montadas para, subsequentemente, transduzir células CHO.K1. Por esta razão, células HEK 293 T/17 (células de empacotamento) foram co-transfectadas com 4 vetores para gerar as partículas lentivirais correspondentes para cada uma das 12 muteínas. Os 4 vetores utilizados foram: pREV (que induz a exportação nuclear do vetor de transferência e seu empacotamento), pVSVG (que codifica a proteína G do envelope VSV, necessária para a entrada da partícula viral na célula, com amplo tropismo), pMDL (que codifica proteínas de matriz e capsídeo - capazes de empacotar o vetor de expressão - protease, transcriptase reversa e integrase - necessárias para clivagem de elementos estruturais e para integração no genoma celular) e o vetor de transferência pLV-PLK-Mut X em que todos os genes virais foram removidos e substituídos pelos genes de interesse correspondentes às muteínas de hEPO desta invenção. Dois dias após a transfecção de células HEK 293T/17, os sobrenadantes de cada uma das células contendo partículas lentivirais mut X foram colhidos, que foram usados para transduzir células CHO.K1. As 12 linhagens CHO.K1 mut X hEPO foram obtidas. Após 72 horas, os sobrenadantes foram colhidos e preservados para posterior caracterização. Da mesma forma, a fim de gerar linhagens de células recombinantes estáveis, elas foram pressionadas com quantidades crescentes de antibiótico de puromicina, de modo que selecione aquelas células que incorporaram o transgene. Linhagens celulares pressionadas foram amplificadas e criopreservadas em uma mistura criogênica (90% (v/v) de FBS, 10% (v/v) DMSO) e armazenadas em tanques de nitrogênio líquido.

[126] Inicialmente, através da técnica Sanduiche ELISA e anticorpos específicos para a molécula de hEPO, a concentração foi determinada utilizando a cultura de linhagens obtidas por transdução. Um anticorpo monoclonal foi usado como captura e anticorpos policlonais de coelho foram usados para detecção (ambos os tipos de anticorpos foram desenvolvidos em nosso laboratório). As concentrações obtidas (apresentadas na Tabela I) foram consideradas adequadas para a continuidade dos estudos.

[127] Além disso, os sobrenadantes da cultura foram analisados pela técnica de Western Blot, usando anticorpos policlonais para detectar todas as muteínas de hEPO. Essa metodologia permitiu visualizar que as muteínas apresentaram maior massa molecular quando comparadas à hEPO não modificada, o que coincide com a inserção de novos sítios de N-glicosilação na estrutura molecular (Figura 4) -

[128] Da mesma forma, uma análise de focagem isoelétrica e, em seguida, uma análise de Western Blot foram realizadas para estudar o número de glicoisoformas em cada uma das muteínas de hEPO expressas em CHO. Sobrenadantes de cultura de células K1. O número de isoformas obtido em 11 das 12 muteínas avaliadas foi maior do que o do hEPO não modificado. A faixa de isoformas variou de 8 a 16 isoformas em comparação com as 7 isoformas que foram observadas no sobrenadante de cultura do hEPO não modificado.

[129] A presente invenção fornece muteínas de hEPO que têm pouca ou nenhuma atividade eritropoiética para evitar os efeitos colaterais produzidos pela citocina quando usada como um potencial candidato neuroprotetor/neuroplástico.

Por esse motivo, foi estudada a atividade in vitro citada, utilizando células TF-1 cuja proliferação depende da presença de hEPO.

A fim de medir a atividade eritropoiética, a proliferação dessas células foi avaliada após 96 horas de estimulação com um padrão de hEPO com uma atividade biológica bem conhecida.

Todas as muteínas de hEPO desenvolvidas exibiram com sucesso reduzida ou nenhuma atividade eritropoiética em comparação com o padrão comercial de hEPO e a molécula de hEPO não modificada, exceto para Mut49 que manteve sua atividade eritropoiética.

Os resultados estão sumarizados na Tabela I.

Muteína Concentração nº de Atividade (pg/ml) isoformes eritropoiética {in vitro) (%> rhEPO - 7 100 Mut15_17 2,7 8 NDA Mut45_47 12,6 12-13 0,17 Mut49 6,4 14 100 Mut62_64 17,2 10 0,17 Mut65_67 32,0 12 0,49 Mut72_74 23,3 14 0,42 Mut76_78 51,0 5-6 NDA Mut98_100 19,0 13 0,08 Mut104 15,9 16 NDA Mut106_108 16,5 12 NDA Mut149 24,3 10 0,07 Mut151_153 3,7 9 NDA

NDA: atividade não detectável; rhEPO: eritropoietina humana recombinante; Mut: muteína.

[130] Tabela I : Caracterização de muteínas de hEPO. Quantificação da concentração em sobrenadantes de cultura por sanduíche ELISA, avaliação do número de isoformas medidas por focagem isoelétrica e determinação da atividade biológica in vitro expressa como uma porcentagem em relação à molécula não modificada.

[131] A presente invenção fornece muteínas de hEPO contendo sítios suscetíveis à N-glicosilação em posições que não abolem a atividade biológica citoprotetora, mas abolem a atividade hematopoiética. Eles foram expressos em CHO. Sobrenadantes de cultura de células K1 e subsequentemente caracterizados. Todos eles apresentaram maior grau de glicosilação, atingindo o objetivo de incluir um sítio adicional para N-glicosilação que permita aumentar sua meia-vida plasmática. Da mesma forma, foi constatado que as modificações feitas na molécula afetaram a atividade biológica hematopoiética, cancelando-a na maioria das muteínas ou diminuindo drasticamente nas demais.

4. Purificação de Muteínas Derivadas de hEPO por Cromatografia de Imunoafinidade

[132] Um procedimento de purificação para as muteínas da presente invenção é apresentado abaixo. Para uma melhor compreensão deste procedimento, as seguintes muteínas são apresentadas como um exemplo: Mut 45 47, Mut 104, Mut 151 153, através de um esquema de purificação de imunoafinidade (IA). Inicialmente, simulamos um processo equivalente ao que ocorre em uma matriz de IA com o objetivo de estabelecer a condição mais favorável para eluir cada uma das muteínas hEPO hiperglicosiladas capturadas por um anticorpo monoclonal anti-rhEPO desenvolvido para esse fim em nosso laboratório (Protocolo A). Com base no acima, os ensaios de sanduíche ELISA foram realizados para quantificar a proporção de derivados de hEPO que permaneceram ligados ao mAb 2B2 após o complexo antígeno-anticorpo ter sido submetido a cada condição de eluição. Da mesma forma, avaliamos o efeito de cada solução de eluente no anticorpo, a fim de determinar se eles afetariam a capacidade de se ligar a muteínas de hEPO em vista dos futuros procedimentos de reutilização de matrizes IA (Protocolo B).

[133] A capacidade de eluente das seguintes soluções foi avaliada:

1. Glicina 0,1 M pH 2

2. Glicina 0,15 M pH 2,5

3. Ácido acético 0,2 M, NaCl 0,15 M pH 2,5

4. Glicina 0,15 M pH 3

5. Ácido Cítrico 0,1 M pH 3

6. Ácido acético 0,2 M, NaCl 0,15 M pH 3

7. Glicina 0,15 M pH 3,5

8. Acetato de sódio 0,1 M pH 4

9. Acetato de sódio 0,1 M / Dioxano 10% (v/v) pH 4

10. Acetato de sódio 0,1 M pH 5

11. Fosfato de sódio 0,1 M pH 6

12. Álcool isopropílico 40% (v/v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7

13. PBS pH 7

14. Etanol 40% (v/v) em PBS pH 7

15. Dioxano 10% (v/v) em PBS pH 7

16. Etilenoglicol 40% (v/v) em PBS pH 7

17. Tris/HCl 0,1 M pH 8

18. Glicina 0,1 M pH 9

19. Glicina 0,1 M pH 10

20. Glicina 0,1 M pH 11

21. Fosfato de sódio 0,1 M pH 11

22. Fosfato de sódio 0,1 M pH 11,7

[134] Os valores de absorbância obtidos para o complexo antígeno-anticorpo tratado com PBS foram considerados como controle, assumindo 100% de formação do complexo antígeno-anticorpo; ou seja, sem dessorção de rhEPO ou suas muteínas. Para o Protocolo B, os valores de absorbância obtidos para o anticorpo tratado com PBS (antes da formação do complexo Ag-Ac) foram considerados como controle da preservação da capacidade de ligação do anticorpo às moléculas em estudo. Portanto, os resultados obtidos para o restante das soluções testadas foram expressos em relação aos controles avaliados com PBS (Figura 5).

[135] Em todos os casos observou-se que a condição estabelecida pela Glicina 0,1 M pH 2 apresentou a maior capacidade de dessorção do antígeno quando comparada às demais soluções. No entanto, a capacidade de formação do complexo mencionado acima foi reduzida consideravelmente após o tratamento prévio com ele. Portanto, o uso de tal eluente em cromatografia de imunoafinidade não é conveniente, pois afetaria a reutilização da matriz cromatográfica.

[136] Por outro lado, este ensaio permitiu a seleção de duas soluções de eluentes como candidatas a serem utilizadas em cromatografia de imunoafinidade (IAC): glicina 0,15 M pH 2,5 e ácido acético 0,2 M, NaCl 0,15 M pH 3. Ambas as soluções foram capazes de dissociar complexos Ag-Ac,

removendo a proteína de interesse (Tabela II) e, além disso, não afetaram a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno após tratamento prévio com eles. Solução Eluição (%) Mut Mut Mut 45 47 104 151 153 (2) 86 84 80 (6) 80 81 70 (2) Glicina 0,15 M pH 2,5 (6) Ácido acético 0,2 M NaCl 0,15 M pH 3

[137] Tabela II. Eluição de muteínas de hEPO considerando as soluções de eluentes selecionadas.

[138] O 2B2 mAb usado em resinas IA foi previamente purificado por cromatografia de afinidade em proteína A e dialisado contra uma solução de carbonato. Em seguida, a resina CNBr-Sepharose4B ativada foi acoplada. O grau de acoplamento foi calculado medindo-se a concentração de imunoglobulinas na solução antes e após a reação de imobilização, resultando em 96%. Assim, a capacidade teórica era rhEPO 481 pg por ml de gel.

[139] A Figura 6 mostra um perfil cromatográfico exemplificativo da purificação de muteína Mut 104, usando a solução eluente de glicina 0,15 M pH 2,5.

[140] A técnica sanduíche ELISA foi utilizada para avaliar em cada procedimento cromatográfico a presença da variante hEPO nas diferentes frações (fluxo contínuo, lavagens, eluição) a fim de calcular os parâmetros que permitem analisar o desempenho do processo.

[141] Os resultados obtidos para as purificações são mostrados na Tabela III.

Em condições dinâmicas, foram observadas algumas diferenças quanto à eficiência na recuperação da proteína de interesse quando comparada às condições estáticas avaliadas em placas.

A eluição com a solução de pH 2,5 resultou em melhores recuperações para as muteínas Mut 104 e Mut 151 153, quando comparada à solução de pH 3 (54% versus 19%, e 55% versus 21%, respectivamente), enquanto para o Mut 45 Na variante 47, maior recuperação foi obtida ao eluir com a solução de pH 3 (49% versus 34%). Soluçãode Amostr ThEPO PT Recuperaçã eluente/Fraçã AE FP a (ug/nl1 (ug/ml) o (%) o Sol.

I Carga 18 433 0,04 1 100 < pH Mut Eluição 8,9 17,7 0,5 12,1 49 3) 45_47 Sol.

Carga 17,3 611,8 0,03 1 100 II < pH Eluição 5,9 5,7 1,04 37 34 2,5) Sol.

I Carga 23 315 0,07 1 100 (pH 3) Eluição 14,4 21 0,69 10 19 Mut Sol.

Carga 20 245 0,08 1 100 104 II (pH 2,5) Eluição 13,2 3,6 3,71 46 54 Sol.

I Carga 3,2 510,4 0,01 1 100 (pH 3) Eluição 3,5 6,4 0,56 B9,1 21 Mut 131_15 Sol. 0,00 3 Carga 1,7 491,5 1 100 II (pH 4 2,5) Eluição 3,9 14 0,31 89,7 55

Sol.

I: Ácido acético 0,2 M, NaCl 0,15 M pH 3,0 e Sol.

II: glicina 0,15 M pH 2,5

[142] Tabela III : Parâmetros de purificação por cromatografia de imunoafinidade (IAC) de muteínas de hEPO.

[143] Ao analisar os diferentes estágios do processo cromatográfico de muteína Mut 104 por SDS-PAGE seguido de coloração com corante Coomassie Brilliant Blue (Figura 7), pode-se observar que a maioria dos contaminantes presentes na amostra não foram retidos e faziam parte de fluxo contínuo e lavagens. Portanto, um alto grau de pureza foi obtido como é observado na faixa 6 da figura mencionada.

[144] Embora o IAC não tenha apresentado alta recuperação da proteína de interesse, foi o método mais adequado para purificação de muteínas de hEPO, pois possibilitou sua purificação 37 a 90 vezes em relação à amostra inicial, com alto grau de pureza e em uma única etapa cromatográfica.

[145] A avaliação da pureza dos eluatos correspondentes a cada muteína de hEPO foi realizada por densitometria de banda (Figura 8).

[146] Antes da corrida eletroforética, as amostras foram concentradas 75 a 80 vezes, usando cartuchos de diafiltração com um ponto de corte de 10kDa. A pureza obtida foi acima de 89% para todas as muteínas (Tabela IV), que são valores característicos para um procedimento de purificação IA. Muteínas Mut Mut 45_47 Mut 104 151_153 Pureza (%) 92 96 89 Tabela IV. Grau de pureza dos eluatos obtidos de cada cromatografia de imunoafinidade (IAC)

[147] O resultado do IAC foi um alto grau de pureza de muteínas de hEPO, que foi considerado adequado para uso nos seguintes testes. Assim, o IAC foi estabelecido como um método apropriado, simples e prático para purificação de muteínas de hEPO da presente invenção.

5. Caracterização Físico-Química de hEPO_Muteínas

5.1. Determinação de Massas Moleculares Aparentes das Diferentes Muteínas de hEPO.

[148] A Figura 9 mostra um Western Blot das muteínas que foram purificadas por meio de cromatografia de imunoafinidade (IAC). Foi usado para calcular as massas moleculares de tais muteínas usando marcadores de massa molecular conhecidos.

[149] A determinação das massas moleculares aparentes das muteínas hiperglicosiladas de hEPO foi realizada pela interpolação das distâncias de migração da frente anterior e posterior da banda correspondente a cada variante na curva de variação da distância migrada por cada marcador, de acordo com o log de sua massa molecular. As massas moleculares aparentes calculadas para cada variante estão sumarizadas abaixo: *Mut 45_47 : 34-66 kDa *Mut 104: 29-66 kDa *Mut 151_153 : 35-45 kDa *rhEPO : 31-43 kDa

[150] Esta determinação confirmou o sucesso da incorporação de um sítio adicional de N-glicosilação na molécula de hEPO, porque as muteínas exibiram em massa molecular média maior do que a massa molecular do hEPO não modificado.

5.2. Determinação do Perfil Isoforma pelo IEF

[151] A fim de avaliar o grau de heterogeneidade das muteínas de hEPO devido à glicosilação e, em particular, o teor de resíduos de ácido siálico, as amostras foram avaliadas por IEF para determinar as isoformas com diferentes pi que compõem cada variante hiperglicosilada de hEPO.

[152] A Figura 10 mostra a detecção de 13 isoformas que constituem a variante Mut 45 47, 14 isoformas para a variante Mut 104 e 6 isoformas para a rhEPO padrão. Vale ressaltar que o padrão rhEPO é o hormônio produzido como bioterapêutico destinado a favorecer a eritropoiese, em que prevalecem as isoformas mais ácidas da molécula de hEPO, obtidas após um processo de purificação desenvolvido em 4 etapas cromatográficas. Adicionalmente, pode-se observar que as muteínas Mut 45 47 e Mut 104 contêm 5 a 7 isoformas mais ácidas do que isoformas rhEPO, refletindo um maior teor de ácido siálico nessas moléculas.

[153] Os dados obtidos na determinação das massas moleculares aparentes em conjunto com os dados do IEF confirmam que as muteínas geradas apresentam um maior grau de glicosilação quando comparadas com rhEPO.

5.3. Análise do Perfil de Isoforma por Meio de Eletroforese de Zona Capilar (CZE) de Muteínas de hEPO Purificadas por IAC

[154] CZE também foi usado para a determinação de isoformas para cada variante de hEPO que é considerada um exemplo de aplicação. O processamento foi realizado para amostras obtidas a partir de purificações IAC de muteínas hEPO diafiltradas com água e concentradas a aproximadamente 1 mg/ml.

[155] CZE fornece informações quantitativas sobre as diferentes isoformas observadas. Assim, usando os dados CZE, uma isoforma foi atribuída a cada pico observado para cada variante de hEPO. Para muteínas Mut 45 47 e Mut 104 de 1 a 11, e para rhEPO padrão de 1 a 7; isoforma 1 foi a isoforma que mais migrou ao longo da zona capilar (Figura 11). Em seguida, as porcentagens de cada isoforma foram calculadas integrando a área sob a curva de cada pico.

[156] Ao comparar as mobilidades eletroforéticas das isoformas de cada variante a rhEPO, foi constatado que as isoformas desta última coincidem com as isoformas 1 a 7 de Mut 45 47 e com as isoformas 3 a 9 de Mut 104, o que mostra que Mut 45 47 apresenta 4 isoformas mais ácidas em comparação com rhEPO, enquanto Mut 104 apresenta 2 isoformas menos ácidas e 2 isoformas mais ácidas em comparação com rhEPO.

[157] Ao avaliar as razões de cada isoforma, foi mostrado que rhEPO tem uma razão mais alta de isoformas 3, 4 e 5, enquanto Mut 45 47 mostra uma razão mais alta de isoformas 6, 7, 8 e 9, e Mut 104 mostra uma maior proporção de isoformas 4, 5, 6 e 7. Isso confirma mais uma vez a heterogeneidade de cada variante de hEPO com respeito ao grau de glicosilação de rhEPO devido ao maior teor de isoformas mais ácidas e sua maior razão.

[158] Ao observar o eletroferograma de cada variante de hEPO, a presença de dois picos adicionais (mais duas isoformas) pode ser visualizada em ambos os casos, um na frente do pico 1 e outro na frente do pico 11, que não puderam ser resolvidos com precisão. Isso se deve à baixa proporção de tais isoformas na amostra, que é inferior ao limite de detecção do sistema. Isso explica a diferença no número de isoformas detectadas por IEF e CZE.

5.4.a. Caracterização da Atividade Biológica Eritropoiética In Vitro de Muteínas

[159] Foi realizada a caracterização biológica das muteínas hEPO purificadas e projetadas. Para isso, ensaios de proliferação in vitro foram realizados utilizando culturas de linhagem de células UT-7 para avaliar a atividade biológica eritropoiética das muteínas que foram tomadas como exemplos de aplicação para mostrar a modalidade desta invenção (AF), desde a sobrevivência e proliferação dessas linhagens celulares dependem da existência de hEPO no meio de crescimento. Ao contrário do ensaio que usa a linhagem celular TF-1, em que o ensaio que usa a linhagem celular UT- 7 é caracterizado por uma resposta de maior sensibilidade, por isso foi selecionado para esta etapa do trabalho.

[160] Os sobrenadantes de cultura de todas as muteínas expressas a partir de suas respectivas linhagens de células de produção e as três muteínas purificadas por IAC consideradas como exemplos foram analisados. A proliferação desenvolvida por essas moléculas foi comparada à proliferação desenvolvida por um padrão rhEPO.

[161] As muteínas de hEPO que foram consideradas como exemplos de aplicação (exceto para Mut 49) exibiram baixa ou nenhuma capacidade de estimular a proliferação celular quando testadas nas mesmas concentrações que o padrão de rhEPO (Figura 12-a-). Afim de calcular uma atividade eritropoiética específica (SEA)

avaliada in vitro, trabalhamos com maiores concentrações das muteínas, ou seja, aquelas presentes em sobrenadantes de cultura puros. Assim, as muteínas Mut 104 e Mut 151 153 mostraram perda completa da atividade biológica eritropoiética, enquanto Mut 45 47, Mut 62 64 e Mut 98 100 mostraram atividade eritropoiética muito baixa (SEAmut 45 47 = 0,2 UI/pg, SEAmut 62 64 = 0,2 UI/pg e SEAmut 98 100 = 0,1 UI/pg, quando comparado a SEA = 120 UI/pg para rhEPO). Pelo contrário, considerou-se que Mut 49 manteve tal atividade (SEA = 216 UI/pg). Embora tenha ocorrido um aumento na SEA Mut 49, isso pode ser devido à zona da curva que foi utilizada para determinar tal parâmetro, visto que a inclinação da zona de resposta linear da curva Mut 49 foi marcada diferentemente daquela do padrão. Assim, a modificação feita para a obtenção dessa muteína não foi considerada eficiente para inibir sua atividade eritropoiética.

[162] Além disso, a atividade biológica cito/neuroprotetora in vitro das muteínas de rhEPO purificadas foi analisada como um exemplo de aplicação da presente invenção. Uma avaliação foi realizada para estudar a atividade cito/neuroprotetora, a capacidade da rhEPO e suas muteínas em proteger as células neuronais SH-SY5Y do efeito apoptótico/citotóxico gerado pela estaurosporina (STP). Assim, o ensaio de cito/neuroproteção consistiu em proteger as células neuronais adicionando rhEPO ou suas muteínas 12h antes da indução do dano celular causado por STP. Após o tempo de indução de dano celular, a viabilidade das culturas foi avaliada pela determinação de células metabolicamente ativas.

[163] Neste ensaio, tanto rhEPO quanto Mut 104 purificado - considerado como um exemplo de aplicação da invenção - foram usados nas mesmas concentrações (Fig. 13).

[164] Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por meio do teste ANOVA, seguido do teste de Dunnett, a fim de comparar cada uma das amostras com o CSTP. A porcentagem de citotoxicidade obtida para o CSTP foi considerada 100% citotoxicidade e, consequentemente, os valores de citotoxicidade determinados para cada uma das amostras foram calculados em relação ao CSTP.

[165] Como é mostrado na Figura 13, rhEPO foi capaz de reduzir a citotoxicidade induzida por STP em 45% (p <0,05), enquanto Mut 104 mostrou uma diminuição significativa na citotoxicidade causada por STP, reduzindo- a em 65% com um grau de significância de 99% (p <0,01).

5.4.b. Caracterização da Atividade Biológica Eritropoiética In Vivo de Muteínas.

[166] As muteínas utilizadas como um exemplo de aplicação têm pouca ou nenhuma atividade biológica in vitro. Por sua vez, a glicosilação extensa confere propriedades farmacocinéticas necessárias para aumentar o tempo de residência no sangue. Essas características permitiriam às moléculas melhorar a baixa capacidade de interação com o receptor e demonstrar atividade eritropoiética.

[167] Para avaliar tal atividade in vivo, camundongos normocitêmicos foram injetados com rhEPO como padrão ou com cada uma das três muteínas usadas nos exemplos anteriores, ou com PBS como controle negativo. Em todos os casos correspondentes à inoculação de proteína, uma massa de proteína equivalente a 80 IU de rhEPO foi usada. O sangue foi coletado 96h após a inoculação e a citometria de fluxo foi usada para determinar o teor percentual de reticulócitos identificados com laranja de tiazol.

[168] A Figura 12-b- mostra uma resposta significativamente diferente (p < 0,001) de cada muteína e o controle negativo em relação a rhEPO. Além disso, não foram observadas diferenças significativas ao comparar a resposta de reticulócitos gerada por cada muteína com o controle negativo. Ambos os tipos de análise confirmam a perda esperada de atividade eritropoiética das muteínas como resultado da abordagem de N-glicoengenharia por hiperglicosilação.

5.5. Efeito de Muteínas Hiperglicosiladas de hEPO na Plasticidade Neuronal Estrutural

5.5.1. Desenvolvimento Neuronal (Diferenciação) e Plasticidade Estrutural

[169] A plasticidade neuronal estrutural engloba os processos pelos quais o desenvolvimento e/ou diferenciação neuronal são estimulados ou favorecidos. Nesse sentido, agentes químicos ou compostos que promovem a formação de neuritos e/ou crescimento axonal, o desenvolvimento de filopódios/espinhos dendríticos e/ou aumentam o número de sinapses serão considerados como compostos neurotróficos. Culturas primárias de neurônios e linhagens de células neuronais têm sido amplamente utilizadas para o estudo in vitro de tais processos.

[170] Os estágios de desenvolvimento neuronal em culturas primárias de neurônios do hipocampo são descritos na Figura 14. Essas etapas foram devidamente caracterizadas no trabalho de Dotti et al. (1998) [31] onde é descrito que, após serem semeados, os neurônios desenvolvem lamelas com as quais aderem ao substrato (0 DIV, dias de cultivo in vitro). Então, durante os primeiros dois dias (1-2 DIV), neuritos imaturos se desenvolvem como extensões imaturos se desenvolvem como extensões da membrana plasmática. Em 2-3 DIV, um desses neuritos se estende além do resto e se diferencia para formar o axônio, que tem em sua extremidade uma estrutura triangular conhecida como cone de crescimento axonal. Posteriormente, os neuritos se ramificam formando os neuritos secundários (3-4 DIV). Projeções citoplasmáticas finas são desenvolvidas sobre esses neuritos que contêm filamentos de actina reticulados conhecidos como filopódios (4-5 DIV). Filopódios podem então levar a espinhos dendríticos que são os sítios preferenciais onde ocorrem as sinapses (7-21 DIV).

[171] Esta parte do estudo avaliou a ação neurotrófica de diferentes muteínas hiperglicosiladas de hEPO da invenção em diferentes estágios de desenvolvimento neuronal.

5.5.2. Formação de Neuritos

[172] Para determinar se as muteínas da presente invenção produziram um efeito neuritogênico (aumento no número e comprimento de neuritos por neurônio), a linha de células neuronais N2a (neuroblastoma de camundongo) foi usada. As células (50.000) foram semeadas em vidros em placas de cultura (24 poços) e mantidas em meio completo DMEM, suplementado com 20% (V/V) de soro fetal bovino (FBS) que inibe a diferenciação neuronal e gentamicina como antibiótico. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por um meio sem FBS suplementado com diferentes concentrações (50 e 300ng/ml) de rhEPO, ou as muteínas por 3 horas para induzir a neuritogênese [32]. Após esse tempo, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% (PFA) com sacarose 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4ºC por 10 minutos e permeabilizadas com 0,1% (V/V) de Triton X-100 em PBS por 2 minutos. As células fixas foram então bloqueadas com 3% (P/V) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por 1 a 2h com anticorpo monoclonal IgG anti-alfa- tubulina de camundongo em 1% (P/V) BSA (1:1000, Sigma) para marcar neurites por 16h a 4ºC. No dia seguinte, após 3 lavagens com PBS, foi incubado com faloidina conjugada com rodamina para marcar os filamentos de actina (1:1000, Invitrogen) e com anticorpos de cabra anti-camundongo conjugados com Alexa 488 (1:1000, Invitrogen) por 1h à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS frio por 5 minutos, os vidros foram montados com Fluorsave (Calbiochem).

[173] Para quantificar a neuritogênese, as imagens foram adquiridas com um microscópio de epifluorescência Nikon TE2000 (Nikon). A quantificação foi realizada contando o número de neuritos e seu comprimento médio (extensão de neuritos) e o comprimento do neurito mais longo (crescimento axonal) em pelo menos 30 neurônios por condição usando o plug-in NeuroJ do software Image J (NIH). As imagens representativas foram então processadas com Adobe Photoshop, e a análise estatística foi realizada com o software GraphPadPrism 5.

[174] A Figura 15-a- mostra imagens representativas de cada um dos grupos estudados. A análise estatística de cada uma das medições é detalhada à direita. As muteínas da presente invenção têm um efeito neurogênico dependente da dose significativo que se manifesta por um aumento no número de neuritos por neurônio, a extensão dos neuritos e o crescimento axonal. Esses efeitos são comparáveis, dando valores semelhantes aos obtidos para rhEPO. Em outras palavras, as muteínas da presente invenção mostraram um efeito neurotrófico semelhante ao observado para rhEPO na linhagem de células N2a.

5. 5. 3. Densidade de Filopódios

[175] Filopódios e espinhos dendríticos são protuberâncias de membrana enriquecidas com filamentos de actina que emergem da neurito/dendrito e atuam como compartimentos pós-sinápticos que são muito abundantes nas sinapses excitatoriais do sistema nervoso central. A morfologia dos espinhos é variável e são classificadas de acordo com sua estrutura diferencial. É aceito que os espinhos dendríticos podem mudar seu formato/estrutura durante o desenvolvimento neuronal, favorecendo a plasticidade neuronal [33]. Nesse sentido, certas doenças neurodegenerativas têm sido relacionadas a mudanças no formato e no número de espinhos dendríticos (tanto no aumento quanto na diminuição). Na síndrome de Down, por exemplo, foi determinado que a quantidade de espinhos está severamente reduzida [34]. Em contraste, espinhos são encontrados em maior quantidade nos transtornos do espectro do autismo [35].

[176] Portanto, a capacidade de induzir a plasticidade neuronal foi determinada promovendo-se a formação de filopódios das muteínas hiperglicosiladas da presente invenção. Usamos culturas primárias de neurônios do hipocampo expostos a diferentes concentrações (50 e 300 ng / ml) de rhEPO, ou de muteínas Mut 104, Mut 45-47 e Mut 151- 153 por 4 dias (4 DIV).

[177] Culturas neuronais foram preparadas a partir de hipocampo de embriões de rato (E19), conforme descrito anteriormente [36]. Resumidamente, o tecido foi tratado com tripsina-EDTA (0,25% (P/V)) a 37ºC por 15 minutos. Uma solução de células completamente dispersas foi preparada em Meio Neurobasal (NB, Invitrogen) suplementado com 2 mM de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina (PEN), 100pg/ml de estreptomicina (Strp) e 10% (V/V) de soro de cavalo. Um número de 20.000 a 30.000 células foram semeadas em placas de cultura de 24 poços previamente tratadas com 0,1 mg/ml de bromidrato de poli-L-lisina (Sigma) e 20mg/ml de laminina (Invitrogen). Após 2h, o meio foi alterado para um meio definido (NB com 1g/1 de ovalbumina; N2 e B27 que são suplementos isentos de soro da Invitrogen) e adicionado com diferentes concentrações (50 e 300 ng/ml) de rhEPO ou muteínas da presente invenção e mantida por 4 DIV. As células foram fixadas com 4% (P/V) de PFA 4% (P/V) de sacarose em PBS a 4ºC por 10 minutos. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 0,1% (V/V) Triton X-100 em PBS por 2 minutos. As células fixadas foram então bloqueadas com 3% (P/V) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por 1 a 2h e incubadas por 16h a 4ºC com anticorpo monoclonal IgG anti- alfa-tubulina de camundongo em 1% (P/V) BSA (1:1000, Sigma) para marcar neuritos. No dia seguinte, após três lavagens com PBS, foi incubado com faloidina conjugada com rodamina para identificar os filamentos de actina (1:1000, Invitrogen) e com o anticorpo secundário de cabra anti-

camundongo conjugado com Alexa 488 (1:1000, Invitrogen) por 1h em temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS frio por 5 minutos, os vidros foram montados com Fluorsave (Calbiochem).

[178] Para quantificar a formação de filópodes, as imagens foram adquiridas com um microscópio de epifluorescência Nikon E600 (Nikon). A quantificação foi realizada contando-se o número de filópodes (protrusões ricas em actina que se projetam a partir da membrana de neurito) presentes em 20pm de neurito a uma distância menor que 50pm a partir do soma neuronal (3 neuritos/neurônio em pelo menos 30 neurônios). As imagens representativas foram então processadas com Adobe Photoshop, e a análise estatística foi realizada com o software GraphPadPrism 5.

[179] A Figura 16 (painel à esquerda) mostra imagens representativas da densidade de filopódios, enquanto o painel à direita detalha a análise estatística para cada um dos grupos. Nota-se que as muteínas da presente invenção induzem significativamente, dependendo da dose, a formação de filopódios quando comparados com os neurônios de controle (PBS). Surpreendentemente, esses efeitos ainda são superiores aos observados para neurônios tratados com rhEPO. Em resumo, as muteínas da presente invenção mostraram um efeito neurotrófico em culturas primárias de neurônios do hipocampo que foi superior ao observado para rhEPO.

5. 5. 3. Sinapses

[180] A sinapse é definida como as relações especializadas de contiguidade (união) de membranas entre dois neurônios. Essa união (conhecida como fenda sináptica) facilita a condução do impulso elétrico e a passagem de substâncias de uma (pré-sináptica) e da outra (pós- sináptica). Diferentes técnicas foram desenvolvidas para quantificar o número de sinapses. Assim, uma definição aceita de sinapse é a co-ocorrência de agrupamentos de proteínas exclusivamente de um compartimento pré-sináptico com agrupamentos de proteínas exclusivamente de um compartimento pós-sináptico.

[181] Continuando com o estudo do efeito neurotrófico das muteínas da presente invenção, sua capacidade de induzir sinapses neuronais foi avaliada.

[182] Para isso, um ensaio de imunodetecção foi realizado em uma cultura neuronal primária 15 DIV em que a formação de sinapses é detectada pela sobreposição de um marcador pré e pós-sináptico.

[183] Em breve, os neurônios (15.000/poço) foram tratados com diferentes concentrações (50 e 300ng/ml) de muteínas de hEPO, ou com rhEPO, ou com PBS por 15 DIV. Em seguida, foram fixados com uma solução de 90% (V/V) de metanol e 10% (V/V) MES (100mM MES pH 6,9, 1mM EGTA, 1mM MgC12) a 4ºC por 10 minutos. Em seguida, foram lavados três vezes com PBS filtrado com Tween 20 (0,1% (V/V)) por 5 minutos. O bloqueio foi realizado com uma solução de FBS com Triton X-100 (10% FBS (V/V), Triton X-100 0,1% (V/V) em PBS) por 1h em temperatura ambiente, e então foram incubados com uma solução de 3% (P/V) BSA também em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente. Ambas as soluções de bloqueio foram previamente centrifugadas por 10 minutos em velocidade máxima. Em seguida, foram incubados 12 a 16h à 4ºC com o anticorpo primário anti-NMDA-Rl de camundongo (marcador pós- sináptico da Synaptic Systems) e o anticorpo anti-

sinaptofisina de coelho (marcador pré-sináptico da Synaptic Systems). Ambos os anticorpos foram preparados em uma solução de PBS-BSA a 1% (P/V) e centrifugados por 10 minutos em velocidade máxima. Depois de lavar três vezes com PBS, eles foram bloqueados novamente com 3% (P/V) BSA centrifugado por 10 minutos e com a solução de 10% (V/V) FBS, Triton X-100 0,1% (V/V) PBS para 1h à temperatura ambiente. Eles foram então incubados com os anticorpos anti-camundongo secundários conjugados com Alexa 647 e anticorpos anti- coelho conjugados com Alexa 568 preparados em 1% (P/V) de BSA e centrifugados 10 minutos na velocidade máxima (ambos da Molecular Probes). Em seguida, eles foram montados com Fluorsave.

[184] As fotos foram tiradas com um microscópio confocal Olympus FV1000 associado a um microscópio invertido Olympus 1X81. As imagens foram processadas sequencialmente com o software FluoView (versão

3.3, Olympus; objetiva 60X; AN 1,42; resolução de 0,066 pm/pixel), obedecendo aos critérios de Nyquist.

[185] A formação da sinapse foi medida como pontos de co-localização no dendrito 25 pm entre o marcador pré-sináptico e o marcador pós-sináptico, em aproximadamente 10 a 20 neurônios por condição usando 3 segmentos por neurônio. Esses pontos de co-localização foram determinados usando o analisador Puncta, um plug-in Image J (versão 1.28u)

[37].

[186] A Figura 17 mostra uma foto representativa de cada uma das condições testadas e sua quantificação correspondente. Como no caso da neuritogênese e indução de filopódios, observamos que as muteínas induzem significativamente a formação de novas sinapses na cultura neuronal. Este efeito é semelhante ao observado para rhEPO.

[187] Considerando os dados acima mencionados, há fortes evidências experimentais que mostram que as novas muteínas hEPO hiperglicosiladas da presente invenção têm um efeito facilitador da plasticidade neuronal em diferentes estágios de desenvolvimento/diferenciação neuronal (desde a formação de neuritos até a formação de sinapses). Além do mais, esses efeitos são comparáveis aos observados para a EPO e, em alguns casos particulares, os efeitos (formação de filopódios) são ainda maiores. Estes efeitos técnicos inovadores e surpreendentes e as características técnicas inovadoras da presente invenção tornam as muteínas da presente invenção ideais para uso em tratamentos onde a plasticidade neuronal é diminuída ou há uma predisposição genética para tal diminuição.

5.6.b. Estudo da Atividade Biológica Neuroprotetora de Muteínas rhEPO em Culturas Primárias de Neurônios de Hipocampo de Ratos.

[188] A avaliação do efeito antiapoptótico de muteínas de hEPO em culturas primárias de neurônios do hipocampo, nos permite estudar o efeito que esses compostos têm em células cujo metabolismo não é alterado como nas linhagens celulares estabelecidas. Por esse motivo, constitui um modelo interessante, pois é mais realisticamente semelhante ao que aconteceria in vivo no cérebro.

[189] A atividade neuroprotetora de hEPO e das eritropoietinas modificadas da presente invenção foi avaliada como a capacidade de tais moléculas de proteger as células neuronais da estimulação apoptótica induzida por tratamento com estaurosporina.

[190] Para avaliar tal atividade in vitro, foram obtidas culturas primárias de neurônios do hipocampo de ratos Sprague-Dawley. 11 culturas de DIV foram pré- tratadas por 24h com 400ng/ml de muteínas de hEPO da presente invenção ou com 400ng/ml de rhEPO geralmente usado para o tratamento de recuperação de hematopoiese. Após esse tempo, as células foram expostas a 30nM de STP por 24h na presença das moléculas e, por fim, foram fixadas e coloridas com fluorocromo Hoechst e com Phalloidin-FITC.

[191] A Figura 18 mostra que o tratamento com as diferentes moléculas reduziu significativamente a apoptose (**p < 0,01; ***p < 0,001) quando comparado ao controle de morte celular (células tratadas apenas com STP), atingindo valores de apoptose semelhantes ao controle celular sem STP. Além disso, a maioria das moléculas desta invenção mostraram um efeito que era superior ao da rhEPO em termos de proteção de culturas primárias de neurônios do hipocampo do efeito de STP.

[192] Os resultados também correspondem aos obtidos no estudo da atividade neuroprotetora das muteínas em culturas neuronais SH-SY5Y. Portanto, a adição de um sítio de glicosilação extra para obter as moléculas da presente invenção, permitiu bloquear sua atividade biológica hematopoiética sem modificar aquela relacionada à neuroproteção. Referências Bibliográficas

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Eritropoietina humana modificada com atividade eritropoiética inferior a 0,5% em relação a uma eritropoietina nativa, que mantém sua capacidade neuroprotetora e neuroplástica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação de um sítio de ligação a um receptor homodimérico ou heterodimérico por meio da adição de sítios de consenso para glicosilação, sendo que tal mutação é selecionada a partir do conjunto que compreende: a. Lys45Asn e Asn47Thr; b. Tyrl5Asn e Leul7Thr; c. Serl04Asn; d. Ala98Asn e SerlOOThr; e. Thrl06Asn e Leul08Thr; f. Leul49Thr; g. Glyl51Asn e Leul53Thr; h. Arg76Asn e Gln78Thr; i. Glu72Asn e Val74Thr; j · Glu62Asn e Trp64Thr; e k. Gln65Asn e Leu67Thr.

   2. Eritropoietina humana modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tais sítios de ligação ao receptor são selecionados a partir do conjunto de aminoácidos compreendidos pelas posições: 45 a 47, 15 a 17, 104, 98 a 100, 106 a 108, 149, 151 a 153, 76 a 78, 72 a 74, 62 a 64, 65 a 67 e combinações dos mesmos.

   3. Eritropoietina humana modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mesma tem uma atividade eritropoiética de até 0,2% em relação a uma eritropoietina humana.

   4. Eritropoietina humana modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que não tem atividade eritropoiética.

   65. Eritropoietina humana modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 1l, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23.

   6. Eritropoietina humana modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22 e SEQ ID N° 24.

   7. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 1l, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23.

   8. Vetor de transformação caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N°

   23.

   9. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N°

   23.

   10. Vetor lentiviral caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N°

   23.

   11. Célula geneticamente modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 1l, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23.

   12. Célula geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende uma linhagem celular animal ou vegetal ou qualquer célula hospedeira que permita a adição de N-glicanos.

   13. Célula geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende uma linhagem celular animal.

   14. Célula geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato que é selecionada a partir do conjunto que compreende CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21 e HeLa.

   15. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da eritropoietina humana modificada conforme definido na reivindicação 1.

   16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da eritropoietina humana modificada, conforme definido na reivindicação 1, para o tratamento de patologias selecionadas a partir do conjunto que compreende a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doenças dos neurônios motores, doença de Huntington, atrofias espinocerebelares, doença de Creutzffeld-Jakob, doenças incapacitantes, tais como depressão ou esquizofrenia, doenças de desenvolvimento, tal como síndrome de Down, danos ao tecido nervoso provenientes de acidentes cerebrovasculares e trauma cranioencefálico.

   17. Uso da eritropoietina humana modificada, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se destina ao tratamento de patologias selecionadas a partir do conjunto que compreende a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doenças dos neurônios motores, doença de Huntington, atrofias espinocerebelares, doença de Creutzfeld-Jakob, doenças incapacitantes, tais como depressão ou esquizofrenia, doenças de desenvolvimento, tal como a síndrome de Down, danos ao tecido nervoso provenientes de acidentes cerebrovasculares e trauma cranioencefálico.

   18. Processo para obter a eritropoietina humana modificada, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   a. Fornecer as sequências de ácidos nucleicos que codificam a eritropoietina humana modificada; b. Construir pelo menos um vetor de cotransfecção de células de empacotamento; c. Cotransfectar as ditas células de empacotamento que produzem as ditas partículas lentivirais que contêm essa sequência de ácidos nucleicos que codifica a eritropoietina humana modificada; d. Colher as ditas partículas lentivirais produzidas pelas células de empacotamento da etapa c; e. Transduzir células capazes de expressar e dobrar a eritropoietina humana modificada com as ditas partículas lentivirais da etapa d; f. Selecionar as células na etapa e que incluem a sequência de ácidos nucleicos que codifica a dita eritropoietina humana modificada; g. Cultivar as células da etapa f de modo que as mesmas expressem a dita eritropoietina humana modificada; e h. Isolar e purificar a dita eritropoietina humana modificada.

   19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que, na dita etapa a, as sequências de ácidos nucleicos são selecionadas a partir do conjunto que compreende: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 1l, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23.

   20. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita etapa b inclui um vetor que permite a entrada da partícula lentiviral na célula, um vetor que codifica uma proteína de matriz, capsídeo,

   protease, transcriptase reversa e integrase; um vetor de transferência, que compreende a sequência de eritropoietina humana modificada; e um vetor que induz a exportação nuclear do dito vetor de transferência.

   21. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita etapa e as ditas células são selecionadas a partir do conjunto que compreende CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21 e HeLa.

   22. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita etapa h é uma purificação por imunoafinidade que inclui um anticorpo anti- rhEPO e um eluente.

   23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito eluente é selecionado a partir do grupo que compreende glicina, ácido acético- NaCl, sais de acetato, ácido cítrico, sais de fosfato, etanol, álcool isopropílico, dioxano, etilenoglicol, Tris- HCl e misturas dos mesmos.

   24. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito eluente é selecionado a partir do grupo que compreende a glicina e o ácido acético- NaCl.

   25. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito eluente é selecionado a partir do grupo que compreende a glicina a 0,1 M (pH = 2); glicina a 0,15 M (pH = 2,5) e ácido acético a 0,2 M, NaCl a 0,15 M (pH = 3).