BRPI0813942B1 - Polipeptídeo da enzima conversora de angiotensina 2 (ace2) recombinante, preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo, processo para a produção do mesmo e usos terapêuticos dos ditos polipeptídeo, preparação e composição - Google Patents

Abstract

polipeptídeo da enzima conversora de angiotensina 2 (ace2) recombinante, preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo, processo para a produção do mesmo e usos terapêuticos dos ditos polipeptídeo, preparação e composição a presente invenção refere-se a um polipeptídeo da ace2 recombinante, seu processo de preparação e seu uso, assim como preparações compreendendo tal polipeptídeo e composições farmacêuticas, sendo que o polipeptídeo da ace2 está presente como dímero. o dímero é formado em especial a partir de monômeros glicosilados e empregado para preparação de produtos farmacêuticos com meia-vida prolongada.

Description

“POLIPEPTIDEO DA ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA 2 (ACE2) RECOMBINANTE, PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O MESMO, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DO MESMO E USOS TERAPÊUTICOS DOS DITOS POLIPEPTÍDEO, PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO” [001] A presente invenção refere-se ao campo da produção de proteínas recombinantes.

[002] Enzima conversora de angiotensina 2 (angiotensin-converting enzyme ACE2) representa uma enzima-chave do sistema renina-angiotensina. Como carboxipeptidase é ancorada em membranas, como receptor sobretudo em células do pulmão, dos rins e do coração, mas também expressa em células endoteliais e dissocia diversos substratos de peptídeo. Representantes de substratos proeminentes são angiotensina II (Ang II), que é dissociada em angiotensina 1-7 (ang 1-7), angiotensina-I que é dissociada em angiotensina 1-9, mas igualmente em apelina e bradiquinina. Ang II e Ang 1-7 são antagonistas do sistema renina-angiotensina. ACE2, por meio da regulação das proporções de peptídeo, é grande responsável pela regulação da espessura dos vasos bem como pela permeabilidade do endotélio e, assim, influencia a homeostase do organismo. A expressão de ACE2 é, entre outros, regulada por citocina e é reduzida em diversas enfermidades inflamatórias, o que em consequência leva ao enriquecimento patológico de Ang II, um dos mais importantes substratos de ACE2.

[003] ACE2 serve para o tratamento da Síndrome da Angústia Respiratória Aguda (acute respiratory distress syndrome - ARDS) ou lesão pulmonar aguda (acute lung injury -ALI), duas formas de uma doença pulmonar aguda, com a qual aparece no pulmão uma expressão ACE2 regulada para baixa. Para esta terapia é usado ACE2 recombinante humano solúvel, o qual é aplicado sistemicamente e dentro de pouco tempo está à disposição de todo o organismo para estruturar uma concentração elevada de Ang II e assim produzir Ang 1 -7. Isto compensa a atuação negativa de elevadas concentrações de Ang II. Para isto é desejável ter em mãos um produto que

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 24/64

2/34 apresente um perfil farmacológico apropriado: em consequência uma substância apropriada caracteriza-se por uma boa distribuição no organismo, uma sensata meia-vida farmacológica bem como por uma pequena imunogenicidade. Em particular o produto precisa ser enzimaticamente ativo, bem solúvel bem como também ser estável em solução e deve ser reproduzível com elevada pureza e economicamente viável.

[004] Tipnis et al. (J. Biol. Chem. 275 (43) (2000): 33238-43) descreve o isolamento de ACE2 (aqui ainda denominado ACEH) e seu isolamento cDNA. Pela produção em células CHO foi obtido um monômero de proteína glicosilado com massa molar de 120 kDa. Depois de ser desglicosilada, esta proteína apresentou uma massa de 85 kDa.

[005] Donoghue (Circ Res. 87 (5) (2000): 1-9) descreve a expressão de ACE2 solúvel em células CHO, que não foi totalmente glicosilado e que foi caracterizado com uma massa molar de cerca de 90 kDa. Esse documento refere-se, no mais, a comparações de sequências de diversas sequências ACE2 e anticorpos anti-ACE2.

[006] WO 2004/023270 A2 refere-se à cristalização de ACE2 segundo a expressão de monômeros ACE2 em células Sf9 de insetos. A massa molar da proteína foi definida aqui com 89,6 kDa após análise de espectrometria de massa.

[007] A conversão terapêutica de uma terapia de substituição de enzimas eficiente exige um processo de preparação que represente de modo econômico e reproduzível um produto farmacológico eficiente, de elevada pureza. O corte solúvel extracelular de ACE2 contém 7 posições de N-glicosilação. ACE-2 não glicolisado apresenta difícil solubilidade, tende à agregação, é altamente imunogênico e apresenta meia-vida mais curta. Além disso, apresenta um diâmetro hidrodinâmico menor o qual, sobretudo, influencia negativamente a purificação. É, pois, objetivo da presente invenção prover um ACE2 altamente ativo com uma boa meia-vida in vivo. Este objetivo é alcançado pelos objetos das reivindicações.

[008] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo da ACE2 recombinante,

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 25/64

3/34 o qual está presente como dímero. O polipeptídeo da ACE2 recombinante é de preferência glicosilado, sendo que os grupos glico de um monômero polipeptídeo da ACE2 apresentam em soma pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou pelo menos 16 resíduos do ácido siálico, de preferência pelo menos 14 resíduos do ácido siálico e sendo que o polipeptídeo da ACE2 está presente como dímero. A presente invenção abrange igualmente um monômero da ACE2 com as glicosilações, pesos moleculares e outras especificações aqui mencionadas. O dímero é, de preferência, um homodímero, suas unidades monômeras apresentam em especial uma sequência idêntica e glicosilação. Via de regra, as unidades monômeras do dímero estão ligadas de modo não-covalente. Um monômero pode ser obtido do dímero, sem mais, diretamente ou por etapas desnaturadas. Todas as glicosilações preferidas aqui mencionadas referem-se tanto ao dímero quanto ao monômero, inclusive um ou ambos os monômeros do complexo do dímero. O dímero contém de modo particularmente preferido dois íons de zinco.

[009] Sob resíduos do ácido siálico são entendidos, em particular, resíduos do tipo ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), especialmente em N- ou O-glicosilações.

[010] A estabilidade de um agente terapêutico é, em princípio, um critério muito importante para sua meia-vida e, assim, de sua eficácia.

[011] ACE2 humano recombinante foi, até o momento, identificado exclusivamente como monômero e como tal também descrito na literatura em relação a sua funcionalidade, sua estrutura de cristal bem como em relação a sua interação com um inibidor altamente específico.

[012] Assim, por exemplo, Towler et al. (J. Biol. Chem. 279 (17), 2004: 1799618007) com referência a Vickers e al. (J. Biol Chem 277(17), 2002: 14838-14843) descreve a expressão de ACE2 em células Sf9 de insetos que foram obtidas como monômeros por cuidadosa cromatografia de exclusão por tamanho como última etapa da purificação. A massa molar de um monômero perfez 89,6 kDa.

[013] ACE2 obtenível no comércio apresenta-se igualmente na forma

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 26/64

4/34 monômera (de R&D Systems, número de catálogo 933-ZN, lote número FIU035071) preparado segundo o processo mencionado em Tipnis et al. (2000, acima), com a diferença de que como sistema de expressão são empregadas células NSO no lugar de CHO. São descritos monômeros que, tanto sob condições redutoras e não redutoras, apresentam um peso molar de 120 kDa.

[014] Segundo Donoghue et al. (Circ Res 87, 2000: e1 -e9), monômeros ACE2 foram expressos em células CHO, que após separação apresentaram um peso molecular de 90 kDa.

[015] Todos os documentos e publicações aqui citados são aqui incorporados por referência.

[016] Para estabilização do agente terapêutico de acordo com a invenção, foi desenvolvido de acordo com a invenção um processo que conduz exclusivamente a dímeros ACE2 estáveis, que apresentam tanto vantagens técnicas de produção quanto farmacológicas em comparação com monômeros ACE2.

[017] A dimerização produz as seguintes vantagens:

• melhor solubilidade e biodisponibilidade em soluções fisiológicas: o dímero mostra elevada solubilidade e maior meia-vida in vivo e disponibilidade.

• Nenhuma formação de agregações: o dímero ACE2 forma complexos estáveis sem aglomeração de outras moléculas ACE2 ao dímero.

• Reduzido ataque de protease: depois que cortes individuais de proteína e com isso toda probabilidade de a parte terminal C terem sido dirigidas para o interior do dímero, esta terminação C não é decomposta.

• Meia vida aumentada: em virtude da reduzida imunogenicidade, da melhor solubilidade e da reduzida suscetibilidade à decomposição proteolítica, a meia-vida da proteína é aumentada.

• Purificação de proteína facilitada: o diâmetro hidrodinâmico do dímero ACE2 em virtude de sua estrutura e uma cápsula de solvatação cunhada, é maior que o

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 27/64

5/34 calculado. Por isso, os dímeros ACE2 podem ser separados de modo excelente das impurezas clássicas da expressão da proteína como, por exemplo, soro de albumina (67 kDa) por colunas de separação por tamanho.

[018] O polipeptídeo recombinante ACE2 é de preferência glicosilado em pelo menos 80% das posições de N-glicosilação possíveis e apresenta uma fração de açúcar superior a 10% (% em peso do ACE2 total) ou 11 %, 12%, 13%, 14%, de preferência superior a 15% ou 16%, 17%, 18%, 19%, particularmente superior a 20% ou 21 %, 22%, 23%, 24% ou 25%.

[019] Foi desenvolvido um processo de produção que representa um ACE2 reproduzível, fortemente glicosilado de modo complexo, de elevada pureza e enzimaticamente ativo. O produto distingue-se por seu elevado teor de açúcar (>20 % em peso) e pelas estruturas de açúcar complexas, fortemente ramificadas, parcialmente carregadas negativamente. Estas agem de modo positivo sobre a solubilidade, a biodisponibilidade, a atividade enzimática bem como sobre as propriedades farmacológicas do produto. Pela escolha de um constructo de expressão apropriada, de um hospedeiro de expressão apropriado, uma estratégia otimizada de seleção, por um meio ajustado para o metabolismo celular bem como por minuciosa análise de clonagem e seleção paralela, foi possível preparar uma linha de células que separa o produto desejado.

[020] ACE2 já foi expressa em células Sf9 de insetos e células NSO de ratos. O material foi utilizado sobretudo em testes in vitro. Há também resultados sobre expressão transiente de ACE2 em células CHO. Até agora ainda não foi produzida nenhuma linha de células com produtividade apta ao processo. Além disso, ainda não foi efetuada nenhuma seleção de clone correspondente com respeito a propriedades de produtos, em especial com relação a N-glicosilação.

[021] A solubilidade de uma proteína é determinada não só por sua sequência de aminoácidos, mas também por sua convolução assim como por modificações

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 28/64

6/34 pós-translacionais. São, sobretudo, estruturas de açúcar carregadas que aumentam normativamente a solubilidade de uma proteína e influenciam seu perfil farmacológico. Assim foi possível indicar para EPO que a presença de estruturas glico ramificadas complexas influencia positivamente a meia-vida dessas proteínas.

[022] Em princípio, são adequadas para expressão recombinante de ACE2 diferentes sistemas de expressão, sendo que células hospedeiras procariônticas não foram mais testadas em virtude da falta de processamento de posições de N-glicosilação.

[023] De preferência, pelo menos 70% das posições de N-glicosilação glicolisadas apresentam uma estrutura, independentemente uma da outra, escolhida das

Fórmula 5	Fórmula 6	Fórmula 7	Fórmula 8
sendo que G Ic N	A c □	F u c	Δ
M a π	O	X y 1
G 3 1	O	N e u	5 Ac O

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 29/64

7/34 [024] De preferência, todas as posições de N-glicosilação possíveis são glicosiladas.

[025] De preferência pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, particularmente 100% das posições de N-glicoslação glicosiladas apresentam uma estrutura das fórmulas 1-8.

[026] Uma unidade monômera ACE2 do dímero apresenta, de preferência, um peso molecular de pelo menos 90 kDa, de preferência pelo menos 92 kDa, particularmente preferido de pelo menos 94 kDa, em particular preferido de pelo menos 96 kDa, especialmente preferido pelo menos 98 kDa, de modo mais preferido pelo menos 100 kDa, 100,5 kDa, 101 kDa, 101,5 kDa ou também pelo menos 102 kDa. Uma massa molar absoluta - portanto do peptídeo em si sem cápsula de hidrato - pode ser determinada por mapa de peptídeos. Formas glicosiladas superiores podem apresentar também massas molares de pelo menos 103 kDa, 104 kDa, 105 kDa, 106 kDa, 107 kDa ou pelo menos 108 kDa.

[027] Determinações de massa molar que são influenciadas por outros fatores, como cápsula de hidrato - como por exemplo cromatografias ou eletroforeses em gel em sistemas aquosos - também podem levar a maiores resultados. Em outras formas de execução uma unidade monômera ACE2 do dímero tem um peso molecular aparente de pelo menos 101 kDa ou pelo menos 102 kDa, de preferência pelo menos 105 kDa, particularmente preferido pelo menos 109 kDa, muito particularmente preferido pelo menos 113 kDa, especialmente preferido pelo menos 117 kDa, de modo mais preferido pelo menos 119 kDa, como determinado por eletroforese em gel.

[028] Em outras formas de execução o peso molecular do monômero (aparente ou absoluto) é no máximo de 102 kDa, 103 kDa, 104 kDa, 108 kDa, 110 kDa, 112 kDa, 116 kDa, 120 kDa, 125 kDa, 130 kDa, 135 kDa ou 140 kDa. Pesos moleculares superiores são possíveis por meio de modificações de ACE2, por exemplo, Peguilação.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 30/64

8/34 [029] De preferência o monômero (que não forma nenhum dímero) tem um peso molecular de pelo menos 82 kDa, de preferência pelo menos 86 kDa, particularmente preferido pelo menos 90 kDa, em particular pelo menos 94 kDa, especialmente preferido pelo menos 98 kDa, de modo mais preferido pelo menos 101 kDa e no máximo 102 kDa, 103 kDa, 104 kDa, 108 kDa, 110 kDa ou no máximo 112 kDa. Estes pesos moleculares podem ser determinados, por exemplo, pelo método de mapas de peptídeos.

[030] O polipeptídeo da ACE2 de preferência não apresenta nenhum domínio de transmembrana. Trata-se, pois, de um ACE2 solúvel. Formas de execução particularmente preferidas abrangem polipeptídeos da ACE2 solúveis, cuja cadeia de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 18-740 ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos. Um outro polipeptídeo consiste nos aminoácidos 18-615 da sequência ID NO: 1.

[031] Embora ACE2 humano (SEQ ID NO: 1) seja preferido para maioria dos usos terapêuticos, ACE2 de outros mamíferos como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsteres, porcos, primatas ou bovinos, também pode ser usado. ACE2 é uma enzima universal em todos os mamíferos com o substrato Ang II idêntico em diferentes espécies. Por isso, em princípio, também é empregável em organismos estranhos. Assim, com a proteína de acordo com a presente invenção, independentemente da origem do ACE2, podem ser tratados, por exemplo, seres humanos, camundongos, ratos, hamsteres, porcos, primatas ou bovinos. Em formas preferidas de execução, no entanto, a origem do ACE2 e o organismo tratado são iguais.

[032] Uma serina correspondente a Ser740 da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, da terminação C) (ou aminoácido terminal-C) do polipeptídeo da ACE2 é de preferência O-glicosilada.

[033] De preferência pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, particularmente pelo menos 90%, de modo mais preferido pelo menos 100% das posições

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 31/64

9/34 de N-glicosilação glicosiladas apresentam ácido siálico, de preferência as posições de N-glicosilação são sialilizadas de acordo com Asn53, Asn90, Asn103, Asn322, Asn432, Asn546, Asn690 da SEQ ID NO: 1.

[034] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn53 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[035] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn90 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[036] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn103 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[037] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn322 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[038] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn432 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[039] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn546 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 32/64

10/34 [040] Em execuções especiais uma asparagina correspondente a Asn690 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[041] Em execuções especiais uma serina correspondente a Ser740 da SEQ ID NO:1 é sialilizada uma, duas, três ou quatro vezes. Em uma preparação ACE2, de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados uma, duas, três ou quatro vezes.

[042] De preferência pelo menos 30%, de preferência pelo menos 40%, particularmente pelo menos 55%, de modo mais preferido pelo menos 70% das posições de N-glicosilação glicosiladas apresentam pelo menos dois ácidos siálicos. Em uma preparação ACE2 de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% destes aminoácidos são sialilizados desta maneira.

[043] De preferência uma asparagina correspondente a Asn53 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[044] De preferência uma asparagina correspondente a Asn90 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[045] De preferência uma asparagina correspondente a Asn103 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[046] De preferência uma asparagina correspondente a Asn322 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[047] De preferência uma asparagina correspondente a Asn432 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 33/64

11/34 fórmula 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[048] De preferência uma asparagina correspondente a Asn546 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[049] De preferência uma asparagina correspondente a Asn690 da SEQ ID NO: 1 é N-glicosilada, de preferência com um glicano de estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[050] Em outro aspecto a presente invenção refere-se a uma preparação de polipeptídeos recombinantes ACE2 abrangendo um polipeptídeo tal como definido aqui (monômero ou dímero ACE2 ou unidades monômeras dos dímeros), sendo que a fração de polipeptídeos ACE2 com um peso molecular aparente, como determinável por eletroforese em gel inferior a 100 kDa ou inferior a 101 kDa, de preferência inferior a 104 kDa, de modo especialmente preferido inferior a 108 kD, particularmente inferior a 112 kDa, particularmente preferido inferior a 117 kDa, de modo mais preferido inferior a 119 kDa, situa-se abaixo de 20%, de preferência abaixo de 10%, particularmente preferido abaixo de 5%, ainda mais preferido abaixo de 1%, em especial a 0%, bem como todas as combinações para isso. Por exemplo, polipeptídeos ACE2 de menos de 100 kDa podem estar presentes em 0%; de polipeptídeos ACE2 de menos de 100 kDa podem ser substituídos menos de 20%. A fração refere-se a todas as formas ACE2 relacionadas e é para isso determinada, por exemplo, por eletroforese em gel nativa.

[051] De modo análogo, como medida de massa molar pode servir a massa molar absoluta que pode ser determinada por mapa peptídico. Assim, de preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com peso molecular inferior a 86 kDa, ou inferior a 89 kDa, de preferência inferior a 92 kDa, especialmente preferido inferior a 94 kDa, particularmente inferior a 97 kDa, de modo particularmente preferido inferior a 100 kDa, mais preferido inferior 101 kDa, é inferior a 20%, de preferência inferior a 10%,

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 34/64

12/34 particularmente preferido inferior a 5%, mais preferido inferior a 1%, em especial 0%, bem como todas as combinações para a mesma. Por exemplo, polipeptídeos ACE2 de menos de 86 kDa podem estar presentes até 0%; de polipeptídeos ACE2 inferiores a 97 kDa, podem ser substituídos menos que 20%.

[052] De preferência a fração de polipeptídeos ACE2 com domínios de transmembrana é inferior a 20%, de preferência inferior a 10%, particularmente preferido inferior a 5%, de modo mais preferido inferior a 1%, em especial é 0%.

[053] De preferência a fração de multímeros ACE2 é inferior a 20%, de preferência inferior a 10%, particularmente preferido inferior a 5%, de modo mais preferido inferior a 1%, em especial é 0%. Sob multímeros ACE2 entende-se complexos com 3 ou mais polipeptídeos ACE2. Em uma preparação de dímeros ACE2, além disso, de preferência a fração de monômeros ACE2 é inferior a 20%, de preferência inferior a 10%, particularmente preferido inferior a 5%, de modo mais preferido inferior a 1%, em especial 0%. Em uma preparação de monômeros ACE2, além disso, de preferência a fração de dímeros ACE2 é inferior a 20%, de preferência inferior a 10%, particularmente preferido inferior a 5%, de modo mais preferido inferior a 1%, em especial 0%.

[054] De preferência, a fração de dímeros ACE2 em moléculas ACE2 é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou pelo menos 99%. Em outras formas de execução, em combinação com isto ou independente disto, a fração de monômeros ACE2 em moléculas ACE2 pode ser de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou pelo menos 99%.

[055] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn53 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1,2, 3, 4, 5, 6, 7

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 35/64

13/34 ou 8.

[056] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn90 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[057] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn103 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[058] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn322 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[059] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn432 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[060] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn546 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 36/64

14/34 maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[061] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com asparagina N-glicosilada correspondente a Asn690 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%, e de preferência com um glicano das estruturas de acordo com a fórmula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[062] De preferência, a fração de polipeptídeos ACE2 com serina O-glicosilada correspondente a Ser740 da SEQ ID NO:1 é maior que 60%, de preferência maior que 70%, particularmente preferido maior que 80%, especialmente preferido maior que 90%, de modo mais preferido maior que 99%, em particular 100%.

[063] De preferência, a atividade catalítica do polipeptídeo da ACE2 ou da preparação kkat é de pelo menos 4/s, de preferência pelo menos 5/s, particularmente preferido pelo menos 6/s, especialmente preferido pelo menos 7/s, de modo mais preferido pelo menos 7,6 /s, em relação à conversão da Ang 1-7 (angiotensina 1-7). Ang 1-7 é formada por ACE2 a partir de AnglI (angiotensina II). A conversão pode ser testada de modo simples, como descrito nos exemplos. Esta conversão ou a atividade catalítica de ACE2 pode ser extrapolada também de outros dados de ensaio. A atividade pode ser medida, por exemplo, como descrito na patente WO 2008/046125.

[064] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de polipeptídeos ACE2 recombinantes ou a uma preparação de ACE2 recombinantes abrangendo as etapas da incorporação de um polinucleotídio codificante da ACE2, de preferência de um polinucleotídeo codificante da ACE2 sem domínios de transmembrana, em células eucarióticas, expressão do polipeptídeo da ACE2

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 37/64

15/34 e reunião do ACE2 expresso, particularmente na forma dímera. Depois disso, as células podem ser classificadas para produzir, como aqui descrito, um polipeptídeo da ACE2 de acordo com a invenção, particularmente com elevado peso molecular.

[065] De preferência o polinucleotídio codificante ACE2 está previsto em um vetor.

[066] De preferência a expressão ACE2 é selecionada com um marcador, de preferência DHFR. De preferência o marcador está presente no vetor.

[067] De preferência o vetor apresenta uma IRES para a mRNA ACE2 expressa (ou codifica para isso).

[068] As células eucarióticas são, de preferência, células CHO.

[069] A presente invenção refere-se também a polipeptídeos ACE2 recombinantes ou a uma preparação de polipeptídeos ACE2recombinantes obtenível por um processo desse tipo.

[070] Em outro aspecto, a invenção fornece uma linha de células (ou célula) eucarióticas estável transferidas com um polinucleotídio ACE2 codificante, de preferência linha de células (ou célula) CHO que expressa a ACE2, particularmente como acima definido. A linha de células pode ser selecionada para as propriedades desejadas, como acima indicado, por exemplo, para produção de dímeros a partir de unidades monômeras com peso molecular de pelo menos 102 kDa.

[071] A célula apresenta de preferência uma produtividade ACE2 de pelo menos 10 pg/célula/dia, de preferência pelo menos 15 pg/célula/dia, particularmente preferido de pelo menos 20 pg/célula/dia.

[072] A expressão da ACE2 ocorre de preferência em presença de suficientes íons Zn²⁺. São empregados de preferência pelo menos 0,5 micromolar, particularmente até 5 micromolares, de Zn^-2+, em particular a fermentação pode ser realizada a 2,5 - 3,5 micromolares Zn²⁺. A concentração de Zn²⁺ por exemplo no nutriente das células expressas pode ser de pelo menos 0,5 pM, 0,75 pM, 1,0 pM, 1,25 pM, 1,5 pM,

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 38/64

16/34

1,75 μΜ, 2,0 μΜ, 2,25 μΜ ou pelo menos 2,5 μΜ ou 3,0 μΜ. Outras etapas de tratamento são levadas a efeito, de preferência, igualmente em presença de íons Zn²⁺.

[073] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a medicamentos ou preparações farmacêuticas do produto ACE2 de acordo com a invenção. Principalmente para o tratamento ou prevenção de hipertensão, insuficiência cardíaca como insuficiência cardíaca congestiva, aguda ou crônica, infarto do miocárdio ou arterosclerose, insuficiência ou falência renal, rins com cistos (doença de rins policísticos PKD) ou doenças pulmonares como doença obstrutiva pulmonar crônica, pneumonia, asma, bronquite crônica, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertonia pulmonar, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, edema pulmonar, ALI, ARDS ou câncer pulmonar. Indicações de ACE2 gerais para tratamento são mencionadas, por exemplo, na patente WO 2004/000367 A, para as quais o produto ACE2 de acordo com a invenção também é apropriado.

[074] De acordo com a invenção pode ser provida uma composição farmacêutica ou medicamento abrangendo a proteína ACE2. Composições deste tipo podem abranger sais farmaceuticamente apropriados propriamente, além de tampões, componentes tônicos ou veículos farmacêuticos apropriados. Substâncias-veículo farmacêuticas servem para melhorar a compatibilidade da composição e possibilitam melhor solubilidade bem como melhor biodisponibilidade das substâncias ativas. Exemplos para estas são emulsificadores, espessantes, componentes redox, amidos, soluções alcoólicas, polietilenoglicol ou lipídios. A escolha de um veículo farmaceuticamente apropriado dependendo fortemente do tipo de administração. Para administração oral podem ser usados veículos líquidos ou sólidos, para administração por injeção são necessárias composições finais líquidas.

[075] A composição ACE2 de acordo com a invenção abrange de preferência substâncias tampão ou substâncias tônicas. O valor pH do medicamento pode ser ajustado com tampões para condições fisiológicas, e oscilações de pH ainda podem

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 39/64

17/34 ser atenuadas ou tamponadas. Como exemplo pode ser citado o tampão de fosfato. Substâncias tônicas são adequadas para ajustar a osmolaridade e podem abranger substâncias iônicas como por exemplo sais inorgânicos, como NaCl ou KCl, ou também substâncias não-iônicas como por exemplo glicerina ou hidrato de carbono.

[076] De preferência a composição ou o medicamento a ser empregado de acordo com a invenção é produzido de modo adequado para administração sistêmica, tópica, oral ou intranasal ou como substância de inalação. Estas formas de administração da composição da presente invenção possibilita uma absorção rápida e descomplicada. Desde que a composição ACE2 seja determinada para administração oral, ela é apresentada de preferência em uma formulação ou encapsulamento resistente ao suco gástrico. Para administração oral, medicamentos sólidos ou líquidos por exemplo podem ser tomados diretamente ou de forma dissolvida ou diluída.

[077] O medicamento a ser empregado de acordo com a invenção é preparado de preferência de modo adequado para administração intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intravascular, intraperitonial ou subcutânea. Para esta finalidade são adequadas, por exemplo, injeções e transfusões. Administrações diretamente na corrente sanguínea têm a vantagem que as substâncias ativas do medicamento são dispersas por todo o corpo e chegam rapidamente aos tecidos-alvo.

[078] A presente invenção é melhor elucidada por meio das figuras e exemplos que seguem sem, no entanto, ser por eles limitada.

[079] Figuras:

[080] Figura 1: cassete de expressão e de seleção ACE2 [081] Figura 2: análise Western Blot específica da história da produção de clone ACE2 [082] Figura 3: análise SDS-PAGE do monômero ACE2 [083] Figura 4: Escolha do clone [084] Figura 5: análise de glicosilação LC-MS

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 40/64

18/34 [085] Figura 6: Seleção preparatória por tamanho de ACE2 [086] Figura 7: Farmacocinética de ACE2 em 3 espécies [087] Figura 8: Curvas de calibração para quantificação de Ang 1-7 e Ang II. Os peptídeos foram separados na faixa de concentração indicada com RP-HPLC em Waters C18 pBondapak RP, 2, 1x300 mm, 10 pm, coluna 125 Á.

[088] Figura 9: Espectro MS/MS do peptídeo N-terminal. Observação: Q e K têm a mesma massa.

[089] Figura 10: Sequência de ACE2 e previsão de N-glicosilação [090] Figura 11: Espectro desintegrado para posições de glicosilação 103 (A), posição 432 (B), posição 546 (C), posição 690 (D), posição 90 (E).

[091] Figura 12: Espectro do peptídeo O-glicosilado C-terminal. A disposição estrutural precisa ser classificada como título de experiência.

[092] Figura 13: Glicano liberado LC-MS.

[093] Figura 14: Determinação da estrutura dímera ACE2 mediante PAGE nativo (esquerda, bandas de proteína foram visualizadas por coloração prata) e SEC (direita, separação em uma coluna Zorbax G-450 em presença de fosfato de Na a 220 mM a pH 7,0 em 10% de acetonitrila, a cromatografia foi efetuada em 214 nm.

[094] Figura 15: Cromatograma de uma cromatografia de exclusão por tamanho do dímero ACE2 (retenção 8,55 min, 8,93 min). Padrão: tireoglobulina (670 kDa, 7,43 min), gamaglobulina (158 kDa), ovalbumina (43 kDa, 10,08 min), mioglobulina 17 kDa, 11,08 min), vitamina B-12 (1,3 kDa, 12,71 min).

[095] Figura 16: análise Western Blot específica ACE2 de extratos de células de córtex (A), cérebro (B) e um clone de expressão do dímero ACE2 (C). Em D foi aplicado um dímero ACE2 puro.

[096] Figura 17: Cromatografia SEC-HPLC analítica da forma monômera ACE2. Condições de curso: coluna: Zorbax GF250, tampão: Na2H-PO4 a 220 mM + 10% CH3CN, pH 8,0 com 1 ml/min

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 41/64

19/34 [097] Figura 18: Análise PAGE de dímero ACE2 (A) e monômeros ACE2 (B), proteínas foram comprovadas mediante coloração prata (a) e ACE2 por Western-blot específico (b).

[098] Figura 19: Determinação da atividade enzimática de monômeros ACE2 em comparação com dímeros ACE2. Sob concentração inicial constante do substrato de marcação fluorescente foram utilizados cumarina-APK-DNP e quatro diferentes concentrações de enzima, e as respectivas curvas de fluorescência foram comparadas.

[099] Figura 20: Atividade do soro ACE2 medida 24 e 48 horas após a adição do dímero ACE2 (2,5 mg/kg, colunas azuis) ou adição da forma monômero ACE2 (2,5 mg/kg, colunas cinzas).

Exemplos:

Exemplo 1: Expressão de dímero-ACE altamente glicosilado [0100] O segmento solúvel da sequência ACE2 humana (SEQ ID NO:1) foi clonado em um vetor de expressão, no qual fora anteriormente introduzido o marcador de seleção amplificável DHFR, a fim de chegar a uma expressão mais elevada do gene ACE2. Para isto foi introduzido entre o gene codificante para ACE2 e DFHR uma IRES atenuada a qual possibilita a leitura bicistrônica de ACE2 e DHFR no mesmo mRNA. O cassete de expressão e de seleção ACE2 é representado graficamente na figura 1. Depois que ambas as proteínas são expressas sob controle do mesmo promotor, a expressão ACE2 consequente pode ser aumentada através da seleção DHFR com uso do antagonista MTX. Por meio desta estratégia é possível obter linhas de células de expressão particularmente estáveis que fornecem grande rendimento de um produto de qualidade constante. Isto também possibilita obter produtos-título razoáveis também em linhas de células, os quais possivelmente serão menos apropriados para a expressão recombinante de uma determinada proteína alvo.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 42/64

20/34 [0101] Este vetor foi transferido em células CHOdhfr e o número de cópias do gene ACE2 foi amplificado sob pressão MTX continuamente em elevação. Através de várias rodadas de seleção e de subclonagens foram selecionados os melhores produtores, por meio de análises FACS intracelulares e análises químicas de proteínas bem como análises enzimáticas em relação a ótimas propriedades do produto: para a escolha do clone mais apropriado, sobretudo a atividade enzimática específica que foi medida com três substratos, foram considerados a homogeneidade do produto, a produtividade celular mas também a complexidade do açúcar. Na figura 2 é representada uma análise recapitulativa Western Blot dos sucessivos sobrenadantes da cultura dos clones individuais, que foram utilizados para estabelecer a linha de células de produção. As características de produto dos clones individuais diferenciam-se aqui pelo fato de que a fração de açúcar dos produtos de expressão aumenta da direita para a esquerda, o que pode ser reconhecido por pelo visível aumento de massa. Isto foi obtido por seleção específica de clones altamente glicosilados. Finalmente, foi utilizado um clone (clone 5B9) que apresentou o produto de expressão com o mais elevado peso molecular, para estabelecer a linha de células de produção (1B4).

[0102] Foi decidido continuar com 6 clones que exprimiram ACE2 N-glicosado altamente ativo enzimaticamente e complexo. Enquanto ACE2 solúvel apresenta um peso molecular de 83 kDa, são escolhidos clones que surgiram em SDS-PAGE desnaturante, condicionados por sua estrutura de açúcar, na faixa de até 120 kDa. A figura 3 mostra um ACE2 (Lane B) preparado pelo presente processo de produção em comparação com um padrão ACE2 preparado em NSO (Lane A). Enquanto o polipeptídeo da ACE2 de acordo com a invenção - aqui analisado como monômero - é homogêneo, altamente glicosilado e em virtude disso aparece como banda única com cerca de 120 kDa, o material de referência apresenta bandas de 83 kDa até cerca de 120 kDa, o que indica uma glicosilação muito heterogênea.

[0103] Os clones preliminares, no mais, foram convertidos para meios de

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 43/64

21/34 crescimentos isentos de proteína (Polymun). Este meio obtido no comércio é quimicamente definido, isento de soro, isento de proteínas animais e otimizado em CHO para a expressão recombinante de glicoproteínas. A fermentação foi efetuada a 2,5 3,5 pm Zn²⁺. Todos os 6 clones foram mantidos em cultura e controlados em relação à sua aptidão para o processo de produção. Em particular foram traçadas taxas de crescimento bem como foram analisados os sobrenadantes no decurso do produto e metabólitos (figura 4). Por outro lado, os produtos de expressão bem como os clones foram rigorosamente analisados. Todos os clones expressaram ACE2 altamente ativos e apresentaram produtividades por volta de 20 - 30 pg/célula/dia. Além disso, foram analisadas igualmente as estruturas de açúcar e sua heterogeneidade. Por último, foi escolhido o clone 1B4. Ele apresentou durante o decurso total da produção uma estrutura de açúcar homogênea. Todos os 7 pontos de N-glicosilação haviam sido processados, sendo que estes apresentaram pelo menos uma complexa glicosilação bi-, outras vezes também tri-antenária com ácidos siálicos terminais.

[0104] Com base nestes clones foi preparado e testado um banco de células master, bem como um processo GMP útil de purificação e em outra sequência, um processo GMP de produção.

[0105] SEQ ID NO: 1 (sequência de proteínas ACE2, a sequência autóloga de sinal (sublinhado) é dissociada pela célula hospedeira para remoção por eclusa):

MSSSSSWLLLSLVAVTAA

QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWR GDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQ PFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTL ALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 44/64

22/34 [0106] Condicionadas pela dimerização de ACE2, todas as unidades de proteínas hidrófobas são dirigidas para o centro do complexo, sendo que os resíduos carregados, como cadeias de açúcar N-ligadas viram para fora e solvatizam a estrutura em meio igualmente fisiologicamente carregado. Esta dimerização por expressão de uma ACE2 totalmente N-glicosilada foi determinada em presença de Zn²⁺. O complexo dímero consiste, aqui, em duas subunidades idênticas que estão eletrostaticamente ligadas e também não se separam mais em soluções fisiológicas. Isto leva à secreção de uma glicoproteína com, de cada vez, 14 estruturas de ácido siálico fortemente carregadas em cada molécula ACE2 bem como 28 estruturas do ácido siálico no dímero. De cada vez são embutidos no complexo 2 íons Zn²⁺ e estabilizam sua estrutura. A pesada carga das cadeias de açúcar solvatiza a molécula em soluções fisiológicas aquosas e força para fora os domínios de proteínas carregados afins. O processo de produção foi estruturado de modo tal que no produto final estão presentes exclusivamente dímeros ACE2.

[0107] Isto é possibilitado pelo fato de que na geração do ACE2 estão presentes suficientes íons-Zn²⁺ (de preferência são empregados 1,5 - 5 micromolares Zn²⁺, particularmente a fermentação pode ser feita a 2,5 - 3,5 uM Zn²⁺) e a seguir as demais etapas de tratamento podem ser processadas em presença de íons Zn²⁺.

[0108] A purificação foi efetuada utilizando uma etapa de permuta de ânions, uma precipitação de sulfato de amônio, uma etapa HIC, uma etapa de permuta de cátions bem como de outra etapa de permuta de ânions altamente solúveis. Todos os meios no processo estavam tamponados com fosfato e continham cloreto de sódio. O tampão final de ensaio é uma solução fisiológica de glicina para injeção.

Exemplo 2: Propriedades do produto [0109] Monômero ACE2 complexo, altamente glicosilado ou unidades monômeras do dímero, em virtude das estruturas de açúcar covalentemente ligadas, apresentam um peso molecular nitidamente mais elevado do que aquele correspondente

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 45/64

23/34 à sequência do aminoácido. Assim, com mapa peptídico, foi medida uma massa molar de 102 kDa enquanto a do ACE2 não glicosilado é apenas de 83 kDa. A fração de açúcar situa-se correspondentemente em 23% e é de fundamental significado para as demais propriedades de produto descritas. Em virtude de forte hidratação a unidade monômera aparece na SDS-PAGE com cerca de 120 kDa (figura 3) em comparação ao padrão de referência.

[0110] Não foi expressado o ACE2 natural ligado por membranas, mas unicamente a fração solúvel de ACE2. Em virtude da ausência de domínios de membranas ele é totalmente glicosilado.

[0111] Em virtude das estruturas de açúcar complexas, altamente sialilizadas e, portanto, fortemente carregadas negativamente, o ACE2 apresenta uma solubilidade nitidamente superior em comparação com ACE2 não glicosilado ou não totalmente glicosilado. Com isso, formulações de proteínas fisiologicamente tamponadas de até 15 mg/ml podem ser preparadas sem problemas.

[0112] Além disso, o produto também permanece estável em solução e no decorrer de maior espaço de tempo de armazenamento não perde nem atividade, nem tende à decomposição ou à agregação, independentemente da dimerização estável. ACE2 desglicosilado, pelo contrário, já precipita na faixa de baixas concentrações. Foi possível mostrar isto em uma preparação de desglicosilação preparativa por intermédio de PNGaseF. O índice de estabilidade teórico calculado para ACE2 é de 41,2 e classifica a proteína como instável, sendo que neste cálculo não foram consideradas as estruturas de açúcar. No entanto, depois que as formulações se mantêm estáveis em solução durante alguns meses, isto é obviamente atribuído à elevada fração de açúcar. A melhor solvatação de ACE2 conduz ainda para o fato de que esta formulação consiste exclusivamente de dímeros ACE2 (ou após separação artificial para o monômero, exclusivamente de monômeros) enquanto ACE2 não glicosilado tende a multimerização e a agregação.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 46/64

24/34 [0113] Em virtude da elevada fração de resíduos de açúcar carregados, o diâmetro hidrodinâmico ainda aumenta fortemente a cobertura de solvatação da preparação ACE2 presente. Este fato pode ser usado para a purificação preparativa de ACE2 em grandes colunas de separação por tamanho onde a proteína presente aqui exclusivamente como dímero aparece com um peso molecular aparente de 250 kDa em comparação com o 83 kDa calculado. Uma cromatografia de uma purificação preparativa de ACE2 é mostrada na figura 6. ACE2 (primeira ilustração) elui com um tempo de retenção de 69 minutos. Isto corresponde a um peso molecular aparente entre o da tiroglobulina (primeira ilustração com 58 minutos, 670 kDa) e gama-globulina (primeira ilustração com 74 minutos, 158 kDa). Nesta faixa de elevados pesos moleculares, em sobrenadantes de cultura praticamente não ocorrem contaminações de modo que um produto de elevada pureza pode ser separado em uma etapa de separação muito simples.

Exemplo 3: Propriedades farmacológicas do produto [0114] A preparação de ACE2 de acordo com a invenção está presente como solução de proteína estável, de elevada pureza e concentrada, em tamponamento fisiológico e pode ser armazenada e administrada sem nova estabilização. Empregase, por exemplo, um tampão de fosfato.

[0115] ACE2 como monômero ou dímero é estável em solução e, em virtude da elevada fração de açúcar, não apresenta agregação. Além disso, a preparação ACE2 apresenta atividade enzimática completa.

[0116] ACE2, em virtude de sua solubilidade, pode ser administrado em Bolus intravenoso. A biodisponibilidade é sistemicamente garantida imediatamente após a administração, pelo mesmo motivo.

[0117] ACE2 é decomposto de forma lenta em virtude da fração de açúcar elevada, fortemente ramificada e complexa. Daí resulta uma meia-vida longa, de pelo menos 10,5 horas, que foi medida em diversas espécies, sobretudo também em

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 47/64

25/34 macacos Rhesus. A figura 7 mostra a meia-vida medida de ACE2 aplicada i.v. em 3 espécies.

[0118] A elevada fração de ácido siálico exige ainda que não ocorra resposta imunológica neutralizante contra ACE2. Esta seria contra-produtiva não só para administração exógena de ACE2, mas também poderia neutralizar ACE2 autólogo em posição celular.

[0119] A formulação ACE2 descrita junto com todas as propriedades presentes do produto possibilita, pois, primeiro uma terapia eficiente com rhACE2.

Exemplo 4: Determinação da atividade específica ACE2 [0120] A atividade específica de preparações ACE2 foi determinada pela medição da conversão de Ang II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Todas as mensurações foram efetuadas como determinações triplas em um volume de preparado de 100 pl. A reação enzimática foi iniciada pela adição de 250 ng/ml ACE2 a uma solução de 80 pM Ang II em MES a 50 mM, NaCl a 300 mM, 10 pM ZnCl2 e 0,01% Brij-30 a pH 6,5. As amostras foram cuidadosamente misturadas e incubadas durante exatamente 18 minutos a 37°C. A reação enzimática foi interrompida pela adição de EDTA a 100 mM. Para análise, as soluções foram separadas usando RP-HPLC (Waters C18 pBondapak, 2,1 x 300 mm, 10 pm, 125 Á) com emprego de um gradiente linear de 10 até 60% CH3CN em 0,08% H3PO4 durante 20 minutos com taxa de escoamento de 1 ml/min Posteriormente, tanto picos de Ang II como também Ang 1-7 foram reconhecidos nas cromatografias e integrados. As concentrações de peptídeo foram apuradas a partir das respectivas curvas de calibração representadas na figura 8. A seguir foi determinada a conversão enzimática e também a atividade enzimática especifica.

[0121] A atividade do produto ACE2 foi determinada como descrito acima. Na tabela 1 são representados, de cada vez, os resultados da integração do Pico bem como os dados calculados das enzimas.

Tabela 1: Dados das enzimas e condições reacionais. São indicados os

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 48/64

26/34 valores médios de determinações triplas.

REATIVIDADE ENZIMATICA
	Superfície do Pico	Conversão	Tem po de reação	Con c. AC E2	Atividade catalítica (KKA T)	Atividade específica
mAU.min		pmol.	min	ng.	S-1	pmol.
		ml-1		ml-1		mg-1.
						min-1
Ang II
17149890		62,1	18	250	8,0 ±	4,7 ±
					0,3	0,2
Ang 1-7
4720141		23,1	18	250	8,8 ±	5,2 ±
					0,2	0,1

REATIVIDADE ENZIMATICA

Superfície do Pico	Conversão	Tem po de reação	Con c. AC E2	Atividade catalítica (KKA T)	Atividade específica
mAU.	pmol.	min	ng.	S-1	pmol.
min	ml-1		ml-1		mg-1.
					min -1
Ang II
17149	62,1	18	250	8,0 ±	4,7 ±
890				0,3	0,2

Ang 1-7

47201 23,1 18 250 8,8 ± 5,2 ±

0,2 0,1 [0122] A preparação ACE2 apresenta uma atividade catalítica (kkat) de 8,0 ± 0,3 /s medida com auxílio da conversão Ang II e 8,8 ± 0,2 /s em relação com a conversão Ang 1-7. Ambos os valores estão conformes e são nitidamente mais elevados que os indicados por Vickers et al., (J. Biol. Chem. 277 (17) (2002): 14838-43), onde

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 49/64

27/34 foi publicada uma atividade catalítica ACE2 de 3,5 /s. As condições reacionais foram idênticas. A origem dos 240% de atividade superior de nossa preparação poderiam ser modificações pós-translacionais e aqui, sobretudo, a N-glicosilação que no material empregado por Vickers estava nitidamente menos manifesta. Este material foi expresso em células de insetos e apresentou a mesma sequência do aminoácido, no entanto, estava glicosilado em uma fração e grau de ramificação nitidamente menor. Foi também examinada uma preparação ACE2 obtenível no comércio de R&G Systems (cat. 933-ZN), que apresentou igualmente uma atividade kkat nitidamente menor de 2,0 ± 0,1/s. Uma propriedade essencial da preparação de acordo com a invenção é a atividade enzimática particularmente elevada a qual, sobretudo, é possibilitada por modificações pós-translacionais.

Exemplo 5: análise glicoproteômica de ACE2 recombinante.

[0123] A amostra de ACE2 purificada, expressa em CHO, foi analisada de duas maneiras:

[0124] Primeiro, peptídeos trípticos foram produzidos segundo SDS-PAGE e S-alquilação e analisados com LC-ESI-MS (e MS-MS). O peptídeo N-terminal e vários peptídeos internos foram encontrados. Cinco das sete posições de N-glicosilação em potencial foram encontradas em forma glicosilada com estruturas de glicano, que continham principalmente glicanos di-antenários com fucose e diversas quantidades de ácido siálico. O peptídeo C-terminal parece ser O-glicosilado.

[0125] Segundo, foram analisados N-glicanos reduzidos por meio de carbono LC-ESI-MS. Para o glicano di-antenário, di-sializado com fucose foi possível mostrar que a fucose está α1,6-ligada com o núcleo e a2,3-ligada com o ácido siálico. Adicionalmente aos glicanos di-antenários mono- ou di-sializados foi encontrada uma quantidade considerável de oligossacarídeos tri-antenários. Uma avaliação bruta da massa do ACE2 glicosilado fornece 101 - 102 kDa, isto é, consistindo de aproximadamente 17% de hidrato de carbono.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 50/64

28/34 [0126] Decomposição proteolítica de hBChE separado por meio de SDSPAGE [0127] Alíquotas de ACE2 foram submetidas a um SDS-PAGE, descoloradas, carbamidometiladas, digeridas com tripsina de qualidade sequenciada e extraídas de pedaços de gel, como descrito. Os extratos foram levados à secura em um concentrador Speed Vac e reconstruídos com água contendo 0,1% de ácido fórmico, antes da subsequente análise LC-MS. Para a análise de oligossacarídeo, os peptídeos foram digeridos com PNGase F e os glicanos foram purificados mediante uso de pontas-SPE C18.

Análise MS de peptídeos trípticos e glicopeptídeos.

[0128] A análise espectrométrica de massa foi efetuada em um equipamento Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass) equipado com uma unidade de eletroatomização padrão, um sistema Cap-LC (Waters Micromass) e um módulo de troca de solvente 10-Port (Rheodyne), como rapidamente descrito [Kolarich 2006]. As amostras foram primeiramente coletadas em uma pré-coluna Aquasil-C18 (30 x 0,32 mm, Thermo Electron) utilizando água como solvente. A coluna de análise, uma coluna Biobasic-C18 (100 x 0,18 mm, Thermo Elektron) foi mantida em 5% de acetonitrila antes da permuta de solvente e, a seguir, foi colocado um gradiente linear de 5 até 50% de acetonitrila com uma taxa de fluxo de 2 pl/min Todos os agentes de eluição continham 0,1% de ácido fórmico.

[0129] As amostras foram analisadas no tipo MS e também tipo MS-MS. A análise dos dados foi feita com sofware MassLynx 4.0 SP4 (Waters Micromass).

Análise de N-glicanos de ACE2 livres [0130] Glicanos reduzidos com hidrato de boro foram separados em uma coluna porosa de carbono grafítico e comprovados por meio de espectrometria de massa.

Exemplo 6: análise de glicosilação

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 51/64

29/34 [0131 ] A sequência de proteína de ACE2, seu peso molecular, posição de todas as posições de glicosilação bem como a estrutura dos açúcares ligados foi determinada aqui. A amostra foi analisada com decomposição tríptica, S-alquilação e análise LC-ESI-MS.

• A massa proteica obtida do produto glicosilado é de 102 kDa, sendo que a fração de açúcar corresponde a 23% da massa total.

• A terminação N bem como a presença de todos os peptídeos da sequência interna foi aqui confirmado (vide informação sobre sequências).

• Todas as 7 posições de glicosilação postuladas (posições 53, 90, 103, 322, 432, 546 e 690) continham efetivamente estruturas de açúcar di-antenárias, fucosiladas de modo complexo contendo ácido siálico (figura 13).

• O peptídeo C-terminal era O-glicosilado.

[0132] A estrutura destes resíduos de açúcar foi determinada por carbono-LCESI-MS após sua dissociação e redução. Todas as estruturas di-antenárias continham em cada caso dois ácidos siálicos a2,3-ligados e uma fucose α1,6-ligada. Pequenas quantidades de estruturas triantenárias foram igualmente encontradas (fig. 11). A estratégia de seleção utilizada possibilitou chegar a um produto-expressão completamente glicosilado e contendo ácido siálico.

Métodica:

Preparação das Amostras:

[0133] ACE2 foi separado com SDS-PAGE, descolorado, alquilado e digerido com tripsina. (Kolarich e tal., Proteomics 6 (2006): 3369-3380). Extratos de gel foram secados e dissolvidos antes da análise LC-MS em 0,1% de ácido fórmico. Para a análise de açúcar, os peptídeos foram digeridos com PNGase-F e purificados mediante uso de pequenas colunas C18 SPE.

Análise MS:

[0134] Todas as análises de espectroscopia de massa foram efetuadas com

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 52/64

30/34

Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass) com uma unidade de eletrospray padrão e um sistema Cap-LC (Waters Micromass) (Kolarich 2006).

[0135] As amostras foram enriquecidas de água em uma pré coluna Aquasil C18 (30 x 0,32 mm, Thermo Electron). Como coluna de separação foi utilizada uma coluna C18 (100 x 0,18 mm, Thermo Electron) mediante emprego de um gradiente de acetonitrila. As amostras foram medidas no modo em MS e em MSMS.

Análise dos N-glicanos Livres:

[0136] Glicanos reduzidos com hidreto de boro foram separados em uma coluna porosa de grafite e caracterizados pela sua massa.

Exemplo 7: dimerização de rhACE2 [0137] ACE2 preparado de acordo com o exemplo 1 é obtido como dímero e, neste exemplo, analisado como tal, sem separar os dímeros. O dímero é mantido através de tratamento nativo ao contrário das análises desnaturantes (figura 3). Condicionado pela dimerização de ACE2, todas as unidades de proteína hidrófobas são direcionadas para o interior do complexo, sendo que os resíduos carregados se dirigem para fora como as cadeias de açúcar N-ligadas e solvatizam a estrutura em meios igualmente fisiologicamente carregados. Esta dimerização por expressão de um ACE2 totalmente N-glicosilado foi determinada em presença de Zn²⁺. O complexo dímero consiste aqui de duas subunidades idênticas que estão ligadas eletrostaticamente entre si e que não podem mais ser separadas em soluções fisiológicas. Isto leva a secreção de uma glicoproteína com, de cada vez, 14 estruturas de ácido siálico fortemente carregadas em cada molécula ACE2 bem como 28 estruturas de ácido siálico no dímero. São embutidos no complexo de cada vez 2 átomos Zn²⁺ que estabilizam sua estrutura. A forte carga das cadeias de açúcar solvatiza a molécula em soluções fisiológicas aquosas e força os correspondentes domínios de proteína para fora. O processo de produção foi estabelecido de modo que no produto final esteja presente exclusivamente dímeros ACE2.

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 53/64

31/34 [0138] Isto é possibilitado pelo fato de que na geração do rACE2 estão presentes suficientes íons Zn²⁺ (de preferência são empregados 1,5 - 5 micromolares Zn²⁺, a fermentação pode ocorrer particularmente com 2,5 - 3,5 uM Zn²⁺) e a seguir as outras etapas de tratamento são efetuadas em presença de íons Zn²⁺.

[0139] Nas figuras 14 e 15 foi demonstrada a dimerização do complexo ACE2 com métodos diferenciados. Na eletroforese em gel nativa de poli-acrilamida, a proteína foi demonstrada após coloração prata como única banda de tamanho de cerca 250 kDa. Com auxílio de cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Zorbax G-450 na presença de 10% de acetonitrila em tampão a 220 mM fosfato de Na sob pH 7,0, o produto o produto igualmente como único Peak com um tempo de retenção correspondente a um peso molecular de cerca de 250 kDa. É digno de menção o fato de que em ambos os casos pode ser comprovada exclusivamente proteína dimerisada. Nem estruturas monômeras, nem agregados altamente moleculares puderam ser comprovados.

Exemplo 8: dímeros ACE2 - diferenças em ACE2 em posição de membranas [0140] ACE2 é expresso como proteína de transmembrana em todas as espécies mais elevadas, sobretudo células renais, células cardíacas, células pulmonares e células hepáticas como enzima essencial do sistema renina angiotensina. ACE2 ancorado em membranas envolve-se naturalmente na camada lipídica dupla membraniforme com outras proteínas de membranas que estabilizam ACE2 em uma conformação ativa e protegem igualmente os domínios extracelulares de ACE2 antes da decomposição proteolítica. A fim de aumentar as propriedades farmacológicas de ACE2 solúvel e em especial a atividade e estabilidade da proteína solúvel, foi escolhida uma estratégia de expressão e de produção que conduz exclusivamente a uma estrutura dímera ACE2 estável. Os domínios C-terminais da proteína e suas modificações pós-translacionais, são, sobretudo, em grande parte responsáveis pela dimerização. A fim de ressaltar a peculiaridade da estrutura dímera ACE2, a estrutura do

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 54/64

32/34

ACE2 em posição de membrana foi analisada com PAGE nativo e ACE2 específico com Western blot (figura 16). Nos traços A e B são aplicados extratos celulares (córtex e cérebro) bem como no traço C um extrato celular de um clone de produção para dímeros ACE2, produzido de acordo com o exemplo 1. O produto em posição de membrana apresenta aqui um peso molecular nitidamente menor em comparação com o produto de expressão segundo exemplo 1 (C e D), embora o primeiro consista somente da parte extracelular. Isto aponta para o fato de que ACE2 em posição de membrana está presente como monômero. O produto de expressão, pelo contrário, consiste em dímeros que conferem vantagens farmacológicas ao produto. No traço D foi analisado o produto final purificado. Este apresenta mais uma única banda do peso molecular de cerca de 240 kDa.

Exemplo 9: propriedades farmacológicas aperfeiçoadas dos dímeros ACE2 [0141] APN 01 é a denominação de uma formulação de proteína ACE2 fisiológica que consiste exclusivamente de estruturas dímeras ACE2. Dois monômeros ACE2 em cada caso formam aqui complexos ligados entre si de forma não-covalente. Os constructos (Konstrukte), as linhas de células de expressão, o processo de fermentação, a purificação e o tampão para armazenamento e aplicação são de tal modo selecionados ou concebidos que no produto final estão presentes exclusivamente dímeros ACE2 estáveis. O dímero não agrega nem para complexos maiores nem dissocia sob condições fisiológicas para monômeros.

[0142] Na figura 15 (cronograma analítico SEC-HPLC: APN 01 em comparação com um padrão de classificação por tamanho (Bio-RAD GF-padrão, curva azul). Condições de funcionamento: coluna: Zorbax GF250, tampão: Na2HPO4 a 220 nM + 10% CH3CN, pH 8,0 a 1 ml/min). APN 01 elui em forma de único pico em 8,6 minutos, que em virtude de seu tempo de retenção se encontra entre tiroglobulina (680 kDa, tempo de retenção 7,4 min) e gama-globulina bovina (158 kDa, tempo de retenção 8,9 minutos). A massa molecular calculada deste complexo importa em aproximadamente

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 55/64

33/34

214 kDa. Isto corresponde aproximadamente ao peso molecular esperado de duas unidades ACE2, de cada vez de 102 kDa.

[0143] Para fins de comparação, como material de referência foram preparados monômeros ACE2 em células CHO, as quais foram igualmente analisadas com SEC-HPLC. A correspondente cromatografia está representada na figura 17. A forma monômera elui com tempo de retenção de 9,0 minutos, o que corresponde a um peso molecular por volta de 110 kDa. Ambos os produtos foram ainda comparados com PAGE (vide figura 18a). Enquanto APN 01 (A) apresenta uma banda de proteína com peso molecular de cerca. de 240 kDa, a forma monômera (B) aparece com cerca de 100 kDa. A identidade de ambos os produtos foi confirmada mediante Western blot específico ACE2, como pode ser visto na figura 18b.

[0144] Ambos os produtos mostram uma atividade enzimática específica idêntica medida por um teste de atividade com uso de um substrato fluorescente. Como pode ser visto na figura 19, as curvas da mesma concentração de enzimas encontramse sobrepostas na forma monômera e na forma dímera.

[0145] A fim comparar as propriedades farmacológicas de ambos os produtos as duas preparações foram administradas em injeções de 2,5 mg/kg em camundongos Bl-6 via intraperitoneal bolus e a atividade enzimática ACE2 foi medida em amostras de soro após 24 e 48 horas (vide figura 20). A concentração de proteínas foi ajustada de tal modo que todos os animais receberam, de cada vez, 100 pl de uma solução fisiológica de proteínas. 7 animais foram tratados, de cada vez, com APN 01 (dímero ACE2) e 5 animais com monômero ACE2. Enquanto antes da administração de ACE2 não foi possível medir qualquer atividade ACE2 na amostra de soro, após a administração em todos os casos foi possível medir atividade sistêmica ACE2. Já após 24 horas após a aplicação, ambos os grupos diferiam de modo significativo (teste t, p<0,001): enquanto nos animais tratados com dímero ACE2 foi medida uma atividade correspondente a uma concentração ACE2 de 0,9 pg/ml, no grupo que recebeu

Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 56/64

34/34 monômero ACE2 só pôde ser encontrada uma atividade correspondente a uma concentração de 0,2 pg/ml. Após 48 horas foram encontrados no grupo que recebeu homodímero ACE2, ainda 0,2 pg/ml de atividade, enquanto no grupo que continha o monômero, não foi possível comprovar qualquer atividade sistêmica ACE2. Estes dados mostram uma nítida vantagem farmacológica da forma dímera de ACE2.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipeptideo da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que está presente como um dímero, em que a cadeia de polipeptideo da ACE2 consiste nos aminoácidos 18 a 740 da SEQ ID NO:1 ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos.
2. 2. Polipeptideo da ACE2 recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que está presente como um homodímero.
3. 3. Polipeptideo da ACE2 recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dímero é um dímero não ligado covalentemente.
4. 4. Polipeptideo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é glicosilado em pelo menos 80% dos sítios de N-glicosilação possíveis e apresenta uma proporção de açúcar maior que 10% (% em peso, em relação à molécula da ACE2 total).
5. 5. Polipeptideo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 70% dos sítios de N-glicosilação glicosilados apresentam uma estrutura, independentemente uns dos outros, selecionados a partir das fórmulas 1 a 8:

   Fórmula 1

   Fórmula 2

   Fórmula 3

   Fórmula 4

   Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 58/64

   2/5

   Fórmula 5

   Fórmula 6

   Fórmula 7

   Fórmula 8, em que:

   G lc N
6. 6. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que todos os sítios de N-glicosilação possíveis são glicosilados.
7. 7. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 80% dos sítios de N-glicosilação glicosilados apresentam uma estrutura com as fórmulas 1 a 8.
8. 8. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que uma unidade monomérica da ACE2 do dímero apresenta um peso molecular de pelo menos 90 kDa.
9. 9. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que uma serina correspondente à Ser740 da SEQ ID NO: 1 é O-glicosilada.
10. 10. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 70% dos sítios de N-glicosilação glicosilados apresentam ácidos siálicos.
11. 11. Polipeptídeo da ACE2 recombinante, de acordo com qualquer uma das

    Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 59/64

    3/5 reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 30% dos sítios de N-glicosilação glicosilados apresentam pelo menos dois ácidos siálicos.
12. 12. Preparação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende polipeptídeos da ACE2 recombinantes, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a fração de dímeros da ACE2 é pelo menos 80% das moléculas da ACE2 presentes.
13. 13. Preparação, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a fração de polipeptídeos ACE2 com domínios transmembrana é inferior a 20%.
14. 14. Preparação, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a fração de multímeros da ACE2 é inferior a 20%.
15. 15. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a proporção de monômeros da ACE2 é inferior a 10% das moléculas da ACE2 presentes.
16. 16. Processo para a produção de polipeptídeos da ACE2 recombinantes, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de introdução de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da ACE2 em células eucarióticas, expressão do polipeptídeo da ACE2 e coleta da ACE2 expressa em forma dimérica, em que a expressão do polipeptídeo da ACE2 ocorre na presença de pelo menos 0,5 micromolar até 5 micromolar de Zn²⁺.
17. 17. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo da ACE2 recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
18. 18. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma preparação do polipeptídeo da ACE2 recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 15.

    Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 60/64

    4/5
19. 19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, CARACTERIZADA pelo fato de que é apropriadamente preparada para administração sistêmica, tópica, oral ou intranasal ou como uma preparação inalada.
20. 20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que é apropriadamente preparada para administração sistêmica.
21. 21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que é para administração intravenosa.
22. 22. Uso de um polipeptídeo da ACE2 recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar hipertensão, tal como insuficiência cardíaca congestiva, aguda ou crônica, infarto do miocárdio ou aterosclerose, insuficiência ou falência renal, rins policísticos, doença de rins policísticos (PKD), ou doenças pulmonares como doença pulmonar obstrutiva crônica, pneumonia, asma, bronquite crônica, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, edema pulmonar, lesão pulmonar aguda (ALI), síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) ou câncer de pulmão.
23. 23. Uso de uma preparação como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar hipertensão, insuficiência cardíaca como insuficiência cardíaca congestiva, aguda ou crônica, infarto do miocárdio ou aterosclerose, insuficiência ou falência renal, rins policísticos, PKD, ou doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica, pneumonia, asma, bronquite crônica, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, edema pulmonar, ALI, ARDS ou câncer de pulmão.
24. 24. Uso de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação

    Petição 870190063006, de 05/07/2019, pág. 61/64

    5/5 de um medicamento para tratar hipertensão, insuficiência cardíaca como insuficiência cardíaca congestiva, aguda ou crônica, infarto do miocárdio ou aterosclerose, insuficiência ou falência renal, rins policísticos, PKD, ou doenças pulmonares como doença pulmonar obstrutiva crônica, pneumonia, asma, bronquite crônica, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, edema pulmonar, ALI, ARDS ou câncer de pulmão.