TR201808117T4 - ACE2 polipeptidi. - Google Patents
ACE2 polipeptidi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201808117T4 TR201808117T4 TR2018/08117T TR201808117T TR201808117T4 TR 201808117 T4 TR201808117 T4 TR 201808117T4 TR 2018/08117 T TR2018/08117 T TR 2018/08117T TR 201808117 T TR201808117 T TR 201808117T TR 201808117 T4 TR201808117 T4 TR 201808117T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- ace2
- kda
- ace2 polypeptide
- use according
- recombinant
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 6
- 208000030761 polycystic kidney disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 5
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010020852 Hypertonia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 claims description 2
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 claims description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 abstract 1
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 191
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 167
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 166
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 14
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 14
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 9
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- -1 Zn2+ ions Chemical class 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108700038111 alunacedase alfa Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- PVHLMTREZMEJCG-GDTLVBQBSA-N Ile(5)-angiotensin II (1-7) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 PVHLMTREZMEJCG-GDTLVBQBSA-N 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 3
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 2
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 2
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 2
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 2
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001972 liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N Ala-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 102400000347 Angiotensin 1-7 Human genes 0.000 description 1
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000018746 Apelin Human genes 0.000 description 1
- 108010052412 Apelin Proteins 0.000 description 1
- UHFUZWSZQKMDSX-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UHFUZWSZQKMDSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- MWQXFDIQXIXPMS-UNQGMJICSA-N Phe-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O MWQXFDIQXIXPMS-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710166307 Protein lines Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- WPMWEFXCIYCJSA-UHFFFAOYSA-N Tetraethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCO WPMWEFXCIYCJSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 235000001484 Trigonella foenum graecum Nutrition 0.000 description 1
- 244000250129 Trigonella foenum graecum Species 0.000 description 1
- ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 101150054399 ace2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 108010021281 angiotensin I (1-7) Proteins 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- BWVPHIKGXQBZPV-QKFDDRBGSA-N apelin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=2NC=NC=2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=2NC=NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(O)=O)CCC1 BWVPHIKGXQBZPV-QKFDDRBGSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
- C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, rekombinant ACE2 polipeptidiyle ilgili olup, bu ACE2 polipeptidi, dimer formunda bulunur. Dimer, glikozile edilmiş momonerlerden spesifik olarak oluşturulmuştur ve daha uzun yarılanma ömrüne sahip farmasötik ürünler üretmek için kullanılır.
Description
TARIFNAMEACE2 POLIPEPTIDIMevcut bulus, rekombinant proteinlerin üretimi sahasiyla ilgilidir.
Anjiyotensin Dönüstürücü Enzim (ACE2), Renin-Anjiyotensin-
Sisteminin anahtar enziinlerinden biridir. Karboksipeptidaz olarak
membrana baglanirken, reseptör olarak özellikle basta akciger, böbrek
ve kalp hücrelerinde, fakat bunlarin yani sira endotelyal hücrelerde
eksprese edilir ve farkli peptid substratlarini yarar. Anjiyotensin 1-7
(Ang 1-7) olarak yarilan anjiyotensin Il (Ang 11); Anjiyotensin l-9
olarak yarilan anjiyotensin I olup, bunlarin yani sira apelin ve
bradikinin de sayilabilir. Ang II ve Ang l-7, Renin-Anjiyotensin-
Sisteminin antagonistleridirler. ACE2, peptid oranlarini kontrol etmek
suretiyle, damar kalinliginin ve endotelyal geçirgenligin
düzenlenmesinde belirleyici bir rol oynar ve bu durumda
organizinanin hoineostazini etkiler. ACE2 ekspresyonu, digerleri
yaninda sitokinlerle kontrol edilir ve çesitli enflamatuvar hastaliklarda
düsüs göstererek, akabinde ACE27nin en öiieinli substratlarindan biri
olan Ang ll°nin patolojik olarak çogalmasina yol açar.ACE2, bir akut akciger hastaliginin iki ayri formu olan ve akcigerde
ACE2 ekspresyonu asagi ayarlamasinin eslik ettigi ARDS veya ALI
hastaliklarinin tedavisine yarar. Bu tedavide, hastaya sistemik olarak
uygulanan ve yükselmis Ang II konsantrasyonunu düsürmek ve
baglantili olarak Ang 1-7 üretinek üzere kisa zainan içindeorganizinanin tamaminda yararlanima sunulan rekombinant çözünürinsan ACE2'si kullanilir. Bu yükselmis Ang II konsantrasyonlarinin
negatif etkilerini telafi eder. Bunun için, uygun farmakolojik profile
sahip bir ürünün elde buluiimasi arzu edilmektedir: Bu paralelde
uygun bir maddenin karakterize edici özellikleri, organizma içinde iyi
bir dagilim, farmakolojik olarak makul bir yarilanma ömrü ve düsük
bir immünojenisitedir. Urün bilhassa enzimatik olarak aktif, iyi
çözüiiür ve çözelti içinde stabil olmali ve yüksek bir saflikta
yinelebilir sekilde üretilebilmeli ve ekonomik olarak kullanima
suiiulabilmelidir.Tipnis ve arkadaslari (J Biol Chem. 275 (43) (2000): 33238-43)
ACE2”nin (burada ayrica ACEH olarak da adlandirilmaktadir)
izolasyonunu ve onun CDNA izolasyonunu tarif etmislerdir. CHO-
hücrelerinde üretim yoluyla, 120 kDa molekül kütlesine sahip olan bir
glikozile protein-monomeri elde edilmistir. Deglikozilasyondan sonra
bu protein 85 kDa kütleye sahiptir.Donoghue (Circ Res. 87 (5) (2000): 1-9), çözünür ACETnin CHO-
hücrelerindeki ekSpresyonunu tarif etmekte olup, bu molekül tam
glikolize degildir ve yaklasik 90 kDa düzeyinde bir molekül
agirligiyla karakterize edilmistir. Bu doküman, ayrica, farkli ACE2-
sekanslariiiin ve Anti-ACE2 antikorlarinin sekans karsilastirinalariyla
da ilgilidir.WO 2004/023270 A2 dokümani, ACE2-m0nomerlerinin Sf9 böcek
hücrelerinde ekspresyonundan sonra ACE2°nin kristalize edilmesiyle
ilgilidir. Burada, proteinin kütle spektroskopisi analiziyle tayin edilen
molekül agirligi 89,6 kDa olarak verilmistir.Warner ve arkadaslari (J. Biol. Chem. 280 (47) 2005: 39353-39362),
ACE2 ve ACE'nin CHO-hücrelerinde ve MDCKII-hücrelerindekiekspresyonuiiu tarif etmektedirler.Etkili bir enzim sübstitüsyon terapisinin terapötik uygulamasi, yüksek
saflikta farmakolojik etkili bir ürünün ekonomik ve yinelebilir bir
sekilde üretilmesine imkân veren bir üretim prosesini gerektirir.
ACE2,nin çözünür olan ekstraselüler bölümü 7 adet N-glikozilasyon
yeri içerir. Glikozile-olmayan ACE2, zayif çözünürlüge sahiptir,
agregasyona meyleder, daha fazla immünojeniktir ve daha kisa
yarilanma süresine sahiptir. Molekül ayrica daha küçük bir
hidrodinamik çapa sahip olup, bu durum özellikle saflastirmayi
olumsuz etkiler. Bundan dolayi, mevcut bulusun hedeflerinden biri,
uygun bir in vivo yarilanma ömrüne sahip, yüksek derecede aktif bir
ACE2”nin kullanima sunulmasidir. Bu hedefe, istemlerin konusuyla
ulasilacaktir.Mevcut bulus, dimer olarak mevcut olan rekombinant ACE2
polipeptidiyle ilgilidir. Tercihen bulusa uygun ACE2 polipeptidi
glikozile edilmis olup, buradaki bir ACE2 polipeptid monomerinin
glikosil gruplari tercihen toplamda en az 10, 11, 12, 13, 14, 15 veya en
az 16 sialik asit rezidüsüne, tercihen en az 14 sialik asit rezidüsüne
sahiptirler ve ACE2 polipeptidi dimer formunda bulunur. Ayni
sekilde, mevcut bulus, bir ACE2 monomerini, bunun içerisinde
belirtilen glikozilasyonlarla, molekül agirliklariyla ve diger
spesifiklestirmelerle birlikte kapsar.Dimer tercihen bir homo-dimer olup, içerdigi monomer birimleri
özellikle özdes bir sekansa ve glikozilasyona sahiptir. Dimerin
monomer birimleri genellikle non-kovalent baglidirlar. Bir
monomerin dogrudan veya denatüre edici adimlar yoluyla dimerden
kolaylikla elde edilebilmesi mümkündür. Burada bahsi geçen tümtercihli glikozilasyonlar, dimer koinpleksinin tek veya her ikimonomeri dahil olinak üzere, hem diiner hem de monoiner için
geçerlidir. Diiner 'Özellikle tercihen iki çinko iyonu içerir.Sialik asit rezidüleriyle kastedilen, özellikle N-asetilnöraminik asit
tipli (NeuSAc) rezidüler, bilhassa da N- veya O-glikozilasyonlaridir.
Prensip olarak bir terapötik ajanin stabilitesi, onun yarilanma ömrü ve
dolayisiyla etkililigi açisindan 'Önemli bir kriterdir.Rekombinant insan ACE2, bugüne degin sadece monomer olarak
tanimlanmis olup, islevselligi, kristal yapisi ve yüksek derecede
spesifik bir inhibitörle etkilesimi bakimindan da literatürde monomer
formunda tarif edilmistir.Bu bakimdan örnegin Towler ve arkadaslari (J Biol Chein 279(l7),
2004: 17996-18007), Vickers ve arkadaslarina (J Biol Chem 277(17),
2002: 14838-14843) atifla ACE2°nin Sf9 böcek hücrelerinde
ekspresyonunu tarif etmis olup, buradaki ACE2 molekülleri, son
saflastirma basamagi olarak uygulanan koruyucu boyut dislama
kroinatografisi islemi ardindan inonomerler formunda elde
edilmislerdir. Bir monomerin molekül kütlesi 89,6 kDa olarak
ölçülmüstür.Keza ticari yollardan temin edilebilen ACE2 de monomer formunda
bulunur (R&D Systems mainülü, Katalog No. 933-ZN, Lot Numarasi
FIU035071) ve ekspresyon sistemi olarak CHO hücrelerinin yerine
NSO hücrelerinin kullanilmasi disinda aynen Tipnis ve arkadaslarinca
(2000, yukarida) bahsedilen prosesle üretilir. Hem indirgen hem de
indirgen-olmayan sartlar altinda 120 kDa molekül agirligina sahip
monomerler tarif edilmistir.D0n0ghue ve arkadaslarina göre (Circ Res 87, 2000: el-e9) CHO
hücrelerinde eksprese edilen ACE2 inonomerleri sekresyon sonrasinda90 kDa düzeyinde bir molekül agirligi göstermislerdir.Burada sayilan tüm dokümanlar ve yayinlar referans yoluyla
tarifnameye dahil edilmistir.Açiklanan terapötik ajanin stabilizasyonu için, gerek üretim teknigi,
gerekse farmakolojik açidan ACE2 inonoinerlerine kiyasla her
halükarda daha avantajli stabil ACE2 dimerlerinin elde edilinesiyle
sonuçlanan bir proses gelistirilmistir.Dimerlestirine asagidaki avantajlari getirmektedir:O Fizyolojik çözeltiler içinde daha iyi bir çözünürlük ve
biyoyararlaniin: ACE2 kompleksi içerisinde disari dogru
yönlendirilmis, asiri yüklü yan zincirler sayesinde, dimer, ayni
sekilde yüklü çözeltiler (örnegin fizyolojik enfüzyon çözeltileri,
serum, tuz çözeltileri) içerisinde, ayni sekilde hidrofob yapilari
disari dogru temsil etmesi gereken monomerden daha iyi
çözünebilir.0 Agregat olusumunun olmamasi: ACE2 diineri, diinere baskaca
ACE2 moleküllerinin eklenmedigi stabil kompleksler olusturur.0 Daha az proteaz saldirisi: Münferit protein parçalari ve bu
sirada büyük olasilikla C-terminal parçasi dimerin içine
yönlendirildikten sonra, bu C-terminali bozunmaya ugrainaz.0 Daha uzun yarilaiima ömrü: Daha düsük immünojenisite, daha
iyi çözünürlük ve proteolitik bozunmaya karsi daha düsükyatkinlik özellikleri sayesinde, proteinin yarilanma ömrü uzar.Daha kolay protein saflastirma: ACE2 dimerinin hidrodinamik çapi,
yapisindan ve ayirt edici bir solvatizasyon kilifindan dolayi,
hesaplanandan daha büyüktür. Bu nedenle ACEZ dimerleri, ömeginSerum Albümin (67 kDa) gibi, protein ekspresyonundan kaynaklanansafsizliklardan boyut ayirma kolonlari kullanilarak mükemmel birsekilde ayrilabilir.Rekombinant ACE2 polipeptidi, tercihen muhtemel N-glikozilasyon
konumlarinin en az % 80°inde glikozile edilmistir ve % 10°un
üzerinde (toplam ACE2 kütlesinin %”si) veya % lliin, % 12”nin, %
13°ün, % 14”ün üzerinde, tercihen % 15”in veya % 16°nm, % `17”nin,
% 18°in, % 19°un üzerinde, 'Özellikle % ZOinin veya % 21°in, %
22,nin, % 23”ün, % 24°ün veya % 25”in üzerinde seker içerigine
sahiptir.Yüksek derecede saf ve enzimatik olarak aktif, kuvvetli ölçüde
kompleks glikozile ACE2”nin yinelebilir sekilde üretilebilmesine
imkân veren bir üretim prosesi gelistirilmistir. Bu ürün, yüksek seker
içerigiyle (> % 20 kütle) ve kompleks, kuvvetli dallanmis, kismen
negatif yüklü seker yapilariyla karakterizedir. Bunlar ürünün
çözünürlügü, biyoyararlanimi, enzimatik aktivitesi ve farmakolojik
özellikleri üzerinde olumlu etki gösterirler. Uygun bir ekspresyon
yapisinin, uygun bir ekspresyon konakçisinin, optimize edilmis bir
ayirma stratejisinin seçilmesi; hücre metabolizmasina uyarlanmis bir
vasatin kullanilmasi ve eslikçi klon analizinin ve klon seçiminin
itinayla yapilmasi suretiyle, arzu edilen ürünü salgilayan bir hücre
hatti üretmek mümkün olmustur.ACE2 'Önceden Sf9 böcek hücrelerinde ve N80 fare hücrelerinde
eksprese edilmistir. Materyal en basta in vitro deneylerde
kullanilmistir. ACE2”nin CHO hücrelerinde geçici ekspresyonuna
iliskin soiiuçlar da mevcuttur. Bugüne degin prosese uyumluüretkenlikte bir hücre hatti henüz üretilmemistir. Buna ek olarak, ürünözellikleri bakimindan, özellikle N-glikozilasyonla ilgili olarak uygun
bir klon seçimi de henüz yapilmis degildir.Bir proteinin çözünürlügü, sadece onun aminoasit sekansi tarafindan
degil, ayni zamanda onun katlanmasi ve ayrica post-translasyonel
modifikasyonlari tarafindan da tayin edilir. Bir proteinin
çözünürlügünü önemli ölçüde artiran ve onun farmakolojik profilini
etkileyen faktörlerin basinda yüklü seker yapilari gelir. Bu bakimdan
örnegin EPO için, kompleks dallanmis glikoz yapilarinin varliginin bu
proteinin yarilanma ömrünü olumlu etkiledigi gösterilebilmistir.
Rekombinant ACE2 ekspresyonu için prensip olarak çesitli
ekspresyon sistemleri kullanilabilmekte olup, bu kapsamda, N-
glikozilasyon konumlarindaki prosesleme eksikliginden dolayi
prokaryot konakçi hücrelerin test edilmesine devam edilmemistir.
Basarili ökaryontik ACE2 ekspresyonu zaten Sf9 hasere hücreleri ve
N80 fare hücreleri içerisinde gerçeklesinistir.Glikozile edilmis N-glikozilasyon konumlarinin tercihen en az % 70”i,
birbirinden bagimsiz olarak asagidaki 1-8 formülleri arasindan seçilenbir yapiya sahip olup: burada anlamlarini tasir.%3? 53(Formül 1) (_ Formül 2) 1 Formül 3) (Formül 4)**SE E? L?(Formül 5) .Formül 6) .Formül 7) 'Formül 81
GlcNAc - Fuc A
Man . Xyl
Gal O NeuSAc .Muhteinel N-glikozilasyon konumlarinin tercihen tümü glikozile
edilmistir.Glikozile edilmis N-glikozilasyon konuinlarinin tercihen en az % 80°i,
tercihen en az % 90°i, özellikle de % 100°ü,1-8 formüllerinden birinin
yapisina sahiptir.Dimerin bir ACE2 monomer birimi tercihen en az 90 kDa, tercihen en
az 92 kDa, özellikle tercihen en az 94 kDa, bilhassa en az 96 kDa,
özel olarak tercih edilen durumda en az 98 kDa, en fazla tercih edilen
durumda en az 100 kDa, 100,5 kDa, 101 kDa, 101,5 kDa, hatta en az
102 kDa molekül agirligina sahiptir. Bir mutlak molekül kütlesi - yani
hidrat kilifsiz peptidin molekül kütlesi - peptid haritalama yoluyla
belirlenebilir. Daha yüksek glikozile edilmis formlarin en az 103 kDa,
104 kDa, 105 kDa, 106 kDa, 107 kDa veya 108 kDa molekül
kütlelerine sahip olmalari da mümkündür.Hidrat kiliflari gibi baska faktörlerden etkilenen molekül kütlesi
tayinleri - örnegin kromatografiler veya sulu sistemler içinde
uygulanan jel elektroferezleri - daha yüksek sonuçlar da verebilir.
Bulusun baska yapilarinda dimerin ACE2 inonoiner birimi, jel
elektrofereziyle yapilan tayinde en az 101 kDa veya en az 102 kDa,
tercihen en az 105 kDa, özellikle tercihen en az 109 kD, bilhassa en az
113 kDa, özel olarak tercih edilen durumda en az 117 kDa, en fazla
tercih edilen durumda en az 1 19 kDa ölçüsünde bir görünür molekülagirligina sahiptir.Diger bulus yapilarinda, monomerin molekül agirligi (görünür veya
mutlak) maksimum 102 kDa, 103 kDa, 104 kDa, 108 kDa, 110 kDa,
112 kDa, 116 kDa, 120 kDa, 125 kDa, 130 kDa, 135 kDa veya 140
kDa°d1r. Daha yüksek molekül agirliklari, ACE2'nin modifikasyonlari,
örnegin PEG'leine vasitasiyla mümkündür.Tercihen monomer (dimer olusturmayan) en az 82 kDa, tercihen en az
86 kDa, özellikle tercihen en az 90 kDa, bilhassa en az 94 kDa, 'Özel
olarak tercih edilen durumda en az 98 kDa, en fazla tercih edilen
durumda en az 101 kDa ye da maksimuin 102 kDa, 103 kDa, 104
kDa, 108 kDa, 110 kDa veya maksimum 112 kDa ölçüsünde bir
molekül agirligina sahiptir. Bu molekül agirliklari örnegin peptid-
haritalama yöntemleriyle tespit edilebilir.ACE2 polipeptidi tercihen hiçbir transmembran domain içermez.
Bundan dolayi çözünür bir ACE2°dir. Bu durumda özellikle tercih
edilen yapilar, polipeptid zincirleri 18-740 aminoasitlerinden veya
onlarin enzimatik olarak aktif fragmanlarindan olusan çözünür ACE2
polipeptidlerini kapsar. Bir diger polipeptid, SEK. KIM. NO: 1'in 18-
615 aminoasitlerinden olusur.Birçok terapötik uygulamada insan ACE2 (SEK. KIM. No:1) tercih
edilmesine ragmen, örnegin fare, siçan, hamster, domuz, priinat veya
sigir gibi baska memelilerin AC E2”leri de kullanilabilir.ACE2, çesitli türlerdeki Ang II substrati özdesligi temelinde tüm
memeli hayvanlarda bulunan evrensel bir enziindir. Bu nedenle
proteinin yabanci organizmalarda kullanilabilmesi de prensipte
mümkündür. Böylece, bulusa uygun proteinle, ACEZ'nin mensesinden
bagimsiz olarak, ömegin insanlar, fareler, siçanlar, hamsterler,domuzlar, primatlar veya sigirlar tedavi edilebilir . Ancak tercih edilen10uygulama sekillerinde, ACE2”nin mensei ile tedavi edilen
organizmanin mensei aynidir.Tercihen ACEZ polipeptidinin SEK.KIM.NO:l'in Ser740'ina (örnegin
C terminal ucuna) karsilik gelen bir serin (veya C terminal ucundaki
amino asit) O-glikozile edilir.Tercihen, glikolize edilmis N-glikozilasyon konumlarinin en az %70'i,
tercihen en az %80'i, özellikle en az %90'1, en çok tercihen %lOO'i'i
sialik asit içerir, tercihen N-glikolizasyon konumlari
SEK.KIM.NO:l'in Asn53'üne, Asn90'1na, Asn103'üne, Asn322'sine,
Asn432'sine, Asn546'sina, Asn690'ina uygun sekilde siyalize edilirler.
Bulusun `Özel yapilarinda, SEK.KIM:NO:l'in Asn53'üne karsilik gelen
bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir. Bir ACE2
preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az % 50”si, % 60°1, % 70°i,
% 80°i, % 90°1, % 95'i, % 99,u veya % 100°ü m0n0-, di-, tri- veya
tetra-siyalize edilmistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK. KIMNO: l sekansinin Asn90'1na
karsilik gelen bir aSparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize
edilmistir. Bir ACE2 preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %
50°si, % 60°i, % 70”i, % 80°i, % 90°i, % 95°i, % 99°u veya % 100”ü
m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK. KIM. NO: 1 sekansinm Asn103'üne
karsilik gelen bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize
edilmistir. Bir ACEZ preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %
50°si, % 60°i, % 70°i, % 80”i, % 90°i, % 95°i, % 99°u veya % 100°ü
mon0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK.KIM. NO: 1 sekansinin Asn322'sine
karsilik gelen bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalizeedilmistir. Bir ACEZ preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %ll50°si, % 60°1, % 70°i, % 80”i, % 90”1, % 95°i, % 99°u veya % 100°`û
mon0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Bulusun özel yapilarinda, SEK.KIM. NO: 1 sekansinin Asn432°sine
karsilik gelen bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize
edilmistir. Bir ACE2 preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %
50°si, % 60,1, % 703i, % 80°i, % 90›i, % 95°i, % 99°u veya % 100°ü
m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilinistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK.KIM. NO: 1 sekansinin AsnS46'sina
karsilik gelen bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize
edilmistir. Bir ACE2 preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %
50”si, % 60”1, % 703i, % 80,i, % 90”1, % 95”i, % 99”u veya % 100W]
m0no-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK. KIM.NO: 1 sekansmin Asn690'ma
karsilik gelen bir asparagin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize
edilmistir. Bir ACE2 preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az %
50”si, % 60”1, % 703i, % 80”i, % 90”1, % 95°i, % 99”u veya % 100,1]
m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Bulusun 'Özel yapilarinda, SEK.KIM. NO: 1 sekansinm Ser740°ina
karsilik gelen bir serin m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.
Bir ACE2 preparatinda tercihen bu aminoasitlerin en az % 50°si, %
60°1, % 70”i, % 80°i, % 90°1, % 95”i, % 993u veya % 100”ü m0no-, di-,
tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Tercihen, glikolize edilmis N-glikozilasyon konumlarinin en az
%30'u, tercihen en az %40'1, özellikle en az %55'i, en çok tercihen en
az %70'i en az iki sialik asit içerir. Bulusun özel yapilarinda, SEK.
KIM.NO: 1 sekansinin Ser740°ina karsilik gelen bir serin m0n0-, di-,tri- veya tetra-siyalize edilmistir. Bir ACE2 preparatinda tercihen bu12aminoasitlerin en az % 50°si, % 60°1, % 70”i, % 80°i, % 90°i, % 95°i,% 99”u veya % 100,11 m0n0-, di-, tri- veya tetra-siyalize edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansinin Asn53'üne karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansinm Asn90'1na karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya Sie uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansmin Asn103'üne karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya Sie uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansinin Asn322'sine karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansinin Asn432'sine karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8›e uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekansinin Asn546'sina karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya Sie uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Tercihen SEK.KIM.NO:l sekaiisinin Asn690'ina karsilik gelen bir
asparagin, tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikanla N-glikozile edilmistir.Bir diger özelliginde, mevcut bulus, burada tanimlanan bir polipeptidi
(ACE2 monomerlerini veya diinerlerini ya da dimerlerin monomer
birimlerini) kapsayan rekombinant ACE2 polipeptidleriiiin birpreparatiyla ilgili olup, burada jel elektroforeziyle belirlendigi üzere13100 kDa'nun veya 101 kDa'nun altinda, tercihen 104 kDa'nun altinda,
özellikle tercihen 108 kDa'nun altinda, Özellikle de 112 kDa'nun
altinda, bilhassa tercihen 117 kDa'nun altinda, en çok tercihen 119
kDa'nun altinda bir görünür molekül agirligina sahip ACE2
polipeptidlerinin içerik orani %20'nin altinda, tercihen %10'un altinda,
özellikle tercihen %5'in altinda, en çok tercihen %l'in altindadir,
'Özellikle de %0 civarindadir, ve ayrica bunlar için tüin
kombinasyonlar geçerlidir. Örnegin 100 kDa'nun altindaki ACE2
polipeptidlerinin içerik oraiii %0 civarinda olabilir, 100 kDa'nun
altindaki ACE2 polipeptidleri tarafindan %20'nin altinda bir içerik
oraninda teinsil edilebilir. Içerik orani tüm ilgili ACE2 formlarina
iliskindir ve bunun için örnegin dogal jel elektroforeziyle belirlenir.
Buna analog olarak, mol kütlesi ölçüsü olarak, peptid haritasi
vasitasiyla saptanabilen inutlak mol kütlesi islev görebilir. Böylece
tercihen 86 kDa'nun veya 89 kDa'nun altinda, tercihen 92 kDa'nun
altinda, `Özellikle tercihen 94 kDa'nun altinda, 'Özellikle de 97 kDa'nun
altinda, bilhassa tercihen 100 kDa'nun altinda, en çok tercihen 101
kDa'nun altinda bir molekül agirligina sahip ACE2 polipeptidlerinin
içerik orani %20'nin altinda, tercihen %10'un altinda, özellikle
tercihen %5'in altinda, en çok tercihen %l'in altindadir, 'Özellikle de
%0 civarindadir, ve ayrica bunlar için tüm kombinasyonlar geçerlidir.
Örnegin 86 kDa'nun altindaki ACE2 polipeptidlerinin içerik orani %0
civarinda olabilir, 97 kDa'nun altindaki ACE2 polipeptidleri
tarafindan %20'nin altinda bir içerik oraninda temsil edilebilir.
Transmembran domainleri içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik
oranlari tercihen % 20”nin altinda, tercihen % 10”un altinda, 'Özellikle
tercihen % 5'in altinda, en tercih edilen durumda % 1'in altinda, 'Özelolarak % 0 seviyesinde bulunur.14Tercihen AC E2 multimerlerinin içerik orani % 20'nin altinda, tercihen
% 10°un altinda, 'Özellikle tercihen % 5 ”in altinda, en tercih edilen
durumda % l°in altinda, 'Özel olarak % O seviyesinde bulunur. ACE2
multimerleriyle kastedilen, 3 veya daha fazla sayida ACE2 polipeptidi
içeren komplekslerdir. Ayrica tercihen ACE2 dinierlerinin bir
preparatinda ACE2 monomerleriiiiii içerik orani % 20°nin altinda,
tercihen % 10”un altinda, 'Özellikle tercihen % 5,in altinda, en tercih
edilen duruinda % 1”in altinda, özel olarak % 0 seviyesinde bulunur.
Ayrica tercihen ACE2 monomerlerinin bir preparatinda ACE2
dimerlerinin içerik orani % 20°nin altinda, tercihen % lO°un altinda,
`Özellikle tercihen % 5'in altinda, en tercih edilen duruinda % lsin
altinda, özel olarak % 0 seviyesinde bulunur.Tercihen ACE2 moleküllerindeki ACE2 dimerlerinin içerik orani en
az % 10, % 20, % 30, % 40, %50, %60, %70, %80, %90, %95 veya en
az %99 seviyesindedir. Diger yapilarda, kombinasyon haliiide veya
bagimsiz olarak, ACE2 moleküllerindeki ACE2 monomerlerinin
içerik orani en az % 10, % 20, % 30, % 40, %50, %60, %70, %80,
%90, %95 veya en az %99 seviyesindedir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansiniii Asn53'üne uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik oraiii
% 60°in üzerinde, tercihen % 70”in üzerinde, özellikle tercihen 0/0
80”in üzerinde, 'Özel olarak tercih edilen durumda % 90°in üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99°un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8°e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: 1 sekansinin Asn90'ina uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani% 60”in üzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, özellikle tercihen %1580°in üzerinde, özel olarak tercih edilen durumda % 90°1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99”un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansinin Asn103'üne uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani
% 60”in üzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, 'özellikle tercihen %
80”in üzerinde, 'Özel olarak tercih edilen durumda % 9O°1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99°un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8°e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansmin Asn322'sine uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani
% 60°1n `uzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, `Özellikle tercihen %
80°in üzerinde, özel olarak tercih edilen durumda % 90”1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99”un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansinin Asn432'sine uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani
% 60°in üzerinde, tercihen % 70”in üzerinde, özellikle tercihen 0/0
80”in üzerinde, 'Özel olarak tercih edilen durumda % 90°in üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99°un üzerindedir, bilhassa 0/o 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8°e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: 1 sekansinin Asn546'sina uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani% 60”in üzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, özellikle tercihen %1680°in üzerinde, özel olarak tercih edilen durumda % 90°1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99”un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansinin Asn546's1na uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani
% 60”in üzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, 'özellikle tercihen %
80”in üzerinde, 'Özel olarak tercih edilen durumda % 9O°1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99°un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8°e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIMNO: l sekansinin Asn690'ina uygun bir N-
glikozile edilmis asparagin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani
% 60°1n `uzerinde, tercihen % 70,in üzerinde, `Özellikle tercihen %
80°in üzerinde, özel olarak tercih edilen durumda % 90”1n üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99”un üzerindedir, bilhassa % 100
seviyesindedir ve tercihen Formül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veya 8”e uygun
yapilardan birine sahip bir glikan içerir.Tercihen SEK. KIM.NO: l sekansinin Ser740'ina uygun bir 0-
glikozile edilmis serin içeren ACE2 polipeptidlerinin içerik orani %
60°1n üzerinde, tercihen % 70°in `uzerinde, özellikle tercihen % 80°in
üzerinde, 'Özel olarak tercih edilen durumda % 90,111 üzerinde, en
tercih edilen durumda % 99°un üzerindedir, bilhassa 0/o 100
seviyesindedir.Tercihen ACE2 polipeptidinin veya preparatin kkat katalitik aktivitesi,
Ang l-7 (Anjiyotensin l-7) dönüsümü bazinda en az 4/ s, tercihen en
az 5/ s, bilhassa tercihen en az 6/ s, `özellikle tercihen en az 7/ s, entercih edilen durumda en az 7,6 /s düzeyindedir. Ang l-7, ACE217tarafindan Angll”den (Anjiyotensin ll) dönüsüm yoluyla olusturulur.
Molekülün dönüsümü örneklerde tarif edildigi gibi kolayca test
edilebilir. ACE2”nin bu dönüsümünü veya katalitik aktivitesini, baska
analiz verilerinden de ekstrapole edebilinek de mümkündür. Katalitik
aktivite, örnegin WO 2008/046125 A dokümaninda tarif edilen
sekilde ölçülebilir.Bir diger özelliginde, inevcut bulus açiklamasi, ayrica, rekombinant
ACE2 polipeptidlerinin veya bir rekombinant ACE2 preparatinin
hazirlanmasina yönelik bir yöntemle ilgili olup, bu yöntem, ACE2
kodlayan bir polinükleotidin, tercihen transmembran domain
içermeyen bir ACE2 kodlayan bir polinükleotidin ökaryot hücrelerin
içine dahil edilmesi, ACE2 polipeptidinin burada eksprese edilmesi ve
eksprese edilen ACE2*nin özellikle dimerik formda toplanmasi
adimlarini içerir. Bunun akabinde, burada tarif edilen gibi, özellikle
yüksek molekül agirlikli, bulusa uygun bir ACE2 polipetidini üretmek
için kullanilacak hücreler seçilebilir.ACE2 polipeptidini kodlayan polinükleotidin tercihen bir vektör
üzerinde buluninasi öngörülmüstür.Tercihen ACE2 ekspresyonu bir markerle, tercihen de DHF R
kullanilarak seçilir. Marker tercihen vektör üzerinde buluiiur.
Tercihen vektör, eksprese edilen ACE2 mRNA°si için (veya onu
kodlayan) bir IRES içerir.Tercihen ökaryot hücre olarak CHO hücreleri kullanilir.Mevcut bulus, ayrica, böyle bir yöntemle elde edilebilen bir
rekombinant ACE2 polipeptidiyle veya rekombinaiit ACE2
polipeptidlerinden olusan bir preparatla da ilgilidir.Bir baska özelliginde, açiklama, ACE2 kodlayici bir polinükleotidlestabil olarak transfekte edilmis olan bir hücre hattini (veya hücreyi),18tercihen, özellikle yukarida tanimlanan gibi bir ACEZ°yi eksprese
eden CHO hücre hattini (veya hücresini) temin eder. Hücre hatti,
örnegin dimerlerin en az 102 kDa molekül agirligina sahip monomer
birimlerinden üretilmesi gibi, yukarida belirtilen tercihli özellikleri
temelinde seçilebilir.Tercihen hücre en az 10 pg/hücre/gün, tercihen en az 15 pg/hücre/gün,
özellikle tercihen en az 20 pg/hücre/gün düzeyinde bir ACE2
üretkenligine sahiptir.ACE2 ekspresyonu tercihen yeterli miktarda an+ iyonlarinin
varliginda gerçeklestirilir. Tercihen en az 0,5 mikromolar, özellikle 5
mikroinolara kadar varan miktarda Zn2+ kullanilir; fermentasyon
islemi özellikle 2,5-3,5 mikromolar Zn2+ varliginda icra edilebilir.
Zn2+ konsantrasyonu örnegin eksprese edilen hücrelerin besin
ortaminda en az 0,5 uM, 0,75 uM, 1,0 uM, 1,25 uM, 1,5 HM, 1,75
pM, 2,0 uM, 2,25 uM veya en az 2,5 HM oder 3,0 uM olabilir. Diger
islem adimlari tercihen ayni sekilde Zn2+ iyonlari varliginda atilir.Bir diger özelliginde, mevcut bulus, bulusa uygun ACE2 ürünlerinin
ilaçlariyla veya farmasötik preparatlariyla ilgilidir. Ozellikle yüksek
kan basincinin; konjestif, akut veya kronik kalp yetmezligi gibi kalp
yetmezliklerinin; miyokart enfarktüsün veya aterosklerozun; böbrek
çalismazliginm veya yetmezliginin, polisistik böbrek hastaliginin
(PKD) veya kronik obstrüktif akciger hastaligi, zatürre, astim, kronik
bronsit, akciger anfizemi, sistik fibroz, interstisyal akciger hastaligi,
pulmoner hipertoni, akciger embolisi, akciger sarkaidozu, tüberküloz,
akciger ödemi, ALI, ARDS veya akciger kanseri gibi akciger
hastaliklarinin tedavisinde veya önlenmesinde kullanilan ilaçlarla veyafarmasötik preparatlarla ilgilidir. ACE2inin genel tedavi19endikasyoiilari örnegin WO 2004/000367 A dokümaninda belirtilmis
olup, bulusa uygun ACE2 ürünü de bu endikasyonlar için uygundur.
Bulusa göre, ACE2 proteini içeren bir farmasötik bilesim veya ilaç
kullanima sunulabilir. Bu gibi bilesimler, ilaveten tamponlar, tonisite
bilesenleri veya farmasötik olarak uygun tasiyicilarla birlikte
kendilerinin farmasötik olarak uygun tuzlarini da kapsayabilir.
Farmasötik tasiyici maddeler, bilesiinin uyumlulugunu artirmaya
yararlar ve etkeii maddelerin daha iyi bir çözünürlük ve ayrica daha
iyi bir biyoyararlanim profili göstermelerine imkân verirler. Bu gibi
tasiyicilara örnek olarak, emülgatörler, kivamlastiricilar, redoks
bilesenleri, nisastalar, alkol çözeltileri, polietilenglikol veya lipitler
sayilabilir. Uygun bir farmasötik tasiyicinin seçimi esasen uygulama
sekline baglidir.Oral uygulama için, sivi veya kati tasiyicilar kullanilabilirken,
enjeksiyonlar için nihai bilesimin sivi formda olmasi gerekir.Bulusta açiklanan ACE2 bilesimi tercihen tampon maddeleri veya
tonik maddeler içerir. Tampon vasitasiyla ilacin pH-degeri fizyolojik
sartlara ayarlanabilir ve ayrica pH dalgalanmalari zayiflatilabilir veya
tamponlanabilir. Böyle bir tampon örnegi fosfat tamponudur. Tonik
maddeler ozmolariteyi ayarlamaya yararlar ve örnegin NaCl veya KC]
gibi inorganik tuzlari veya örnegin gliserin veya karbonhidratlar gibi
non-iyonik maddeleri içerebilirler.Tercihen bulusta açiklanan, kullanilacak bilesim veya ilaç, sistemik,
topik, oral veya intranazal uygulamaya veya enhalasyon preparati
olarak uygulamaya uygun bir formda hazirlanir. Mevcut patent hakki
bildiriminin bilesiniinin bu uygulama sekilleri, hizli olan ve karmasik
olmayan bir aliini mümkün kilarlar. ACE2 bilesimi oral uygulamaiçin belirlendigi sürece, bilesim tercihen mide suyuna dirençli bir20formülasyon veya kapsül içerisinde öngörülür. Oral uygulama
durumunda, kati veya sivi ilaçlarin örnegin dogrudan veya
çözündürülerek ya da sulandirilarak alinmasi mümkündür.Bulusa uygun olarak kullanilacak ilaç, tercihen intravenöz,
intraarteriyel, intramüsküler, intravasküler, intraperitonal veya
subkutan uygulamaya müsait bir formda hazirlanir. Bunun için
'Örnegin en jeksiyonlar veya transfûzyonlar elverislidir. Dogrudan kan
yoluna yapilan uygulamalar, ilaç etken maddesinin tüm vücuda
dagilmasi ve hedef dokuya hizla ulasmasi avantajini saglar.Mevcut bulus asagidaki sekiller ve örnekler üzerinden daha ayrintili
olarak açiklanacaktir, fakat bulusun bunlarla sinirlandirilmadigi da not
edilmelidir.Sekiller:Sekil 1: ACE2 Ekspresyon ve seleksiyon kaseti;Sekil 2: Uretim klonu tarihçesinin ACE2 için spesifik Western Blot
analizi;Sekil 3: ACE2 monomerinin SDS-PAGE analizi;Sekil 4: Klon seçimi;Sekil 5: LC-MS glikozilasyon analizi;Sekil 6: ACE2 için preparatif boyut separasyonu;Sekil 7: ACE2°nin 3 türdeki farmakokinetigi;Sekil 8: Ang 1-7 ve Ang II kantifikasyonuna iliskin kalibrasyon
egrileri; Peptidler, belirtilen konsantrasyon araliginda Waters Cl8 u
bondapak RP, 2,1x300mm, 10um, 125Â kolonlarinda RP-HPLC
yoluyla ayrilmislardir.Sekil 9: N-terminal peptidin MS/MS-spektrumu. Not: Q ve K ayni
kütleye sahiptir.Sekil 10: ACE2 sekansi ve N-glikozilasyon tahmini;21Sekil '11: 103 (A), konum 432 (B), konum 546 (C), konum 690 (E)
glikozilasyon konumlari için ayrintili spektrum;(D), Stelle 90 (E).Sekil 12: C-terminal O-glikozile edilmis peptidin spektrumu. Yapisal
atamalar geçici mahiyette siniflandirilmalidir.
Sekil 13: LC-MS serbest birakilmis glikanlar.Sekil 14: ACE2 dimer yapisinin dogal PAGE (solda, protein bantlari
gümüs boyama yoluyla görüntülenmistir) ve SEC (sagda, ayirma
islemi % 10 asetonitri] içinde pH 7.0”da 220 mM Na-fosfat varliginda
bir Zorbax G-450 kolonunda yapilmistir; kromatograin 214 nm7de
kaydedilmistir) yoluyla tayini.Sekil 15: ACE2 dimerinin boyut dislaina kromatografisi
kromatogrami (Retansiyon 8,55 dak, 8,93 dak). Standart: Tiroglobülin
(670 kDa, 7,43 dak), Gama-globülin (158 kDa), Ovalbümin (43 kDa,
,08 dak), Miyoglobülin (17 kDa, 11,08 dak), Vitamin B-12 (1,3
kDa, 12,71 dak).Sekil 16: Korteksten (A), beyinden (B) ve bir ACE2-dimeri
ekspresyon klonundan (C) alinan hücre ekstrelerinin ACE2-spesifik
Western Blot analizi. D°de bir saf ACE2 diineri gösterilmistir.Sekil 17: ACE2 monoiner formunun analitik SEC-HPLC
kromatogrami. Çevrim sartlari: Kolon: Zorbax GF250, Tampon: 220
n1M NagH-PO4 + % 10 CH3CN, pH 8.0,da l ml/dak. akis hizinda.
Sekil 18: ACE2-dimerlerinin (A) ve ACE2 monomerlerinin (B)
PAGE analizi; proteinler (a) gümüs boyama ve (b) ACE2 için spesifik
Western-blot yoluyla teshis edilmistir.Sekil 19: ACE2 monomerleri için ACE2 dimerlerine kiyasla
enziinatik aktivite tayini.Sabit baslangiç konsantrasyonunda floresanisaretli kumarin-APK-DNP ve dört farkli konsantrasyonda enzim22kullanilmis ve her durumda elde edilen floresan egrileri
karsilastirilmistir.Sekil 20: ACE2 dimer uygulamasi (2,5 mg/kg, mavi kolonlar) veya
ACE2 monoiner form uygulamasindan (2,5 ing/kg, gri kolonlar) 24 ve48 saat sonra 'Ölçüleri ACE2 serum aktivitesiÖrnekler:Ornek 1: Yüksek derecede glikozile edilmis ACE diinerlerinin w
Insan ACE2 sekansinin (SEK. KIM. NO:l) çözünür parçasi, ACE2geninin daha kuvvetli ekspresyonunu saglamak amaciyla amplifiye
edilebilir bir DHFR seleksiyon markerinin önceden eklenmis oldugu
bir ekspresyon vektörüne klonlanmistir. Bunun için ACE2 ve DFHR
kodlayici genlerin arasina, ACE2 ve DHFR°nin ayni mRNA üzerinde
bi-sistronik olarak okunmasina olanak veren bir zayiflatilmis IRES
eklenmistir. ACE2 ekspresyon ve seleksiyon kaseti Sekil l”de grafik
olarak gösterilmistir. Her iki protein ayni promotörün kontrolü altinda
eksprese edildikten sonra, MTX antagonisti kullanilarak yapilari
DHFR seleksiyonu yoluyla ACE2 ekspresyonu kararli bir sekilde
yükseltilebilir. Bu strateji sayesinde, bir ürünün istikrarli kalitede
yüksek verimle elde edilmesini saglayan, alabildigine stabil
ekspresyon hücre hatlari elde edilebilir. Bu ayrica, belirli bir hedef
proteinin rekombinant ekspresyonu için daha az uygun olan hücre
hatlarinda da makul ürün titrelerinin elde edilebilmesine olanak verir.Bu vektör CHOdhfr hücrelerine transfekte edilmistir, ve sürekli
artirilan MTX basinci altinda ACE2 genlerinin kopya sayisi amplifiye
edilmistir. Birden çok seleksiyon ve alt-klonlama çevrimindeuygulanan intraselüler FACS analizi ve protein-kimyasal ve enzimatik23analizler yoluyla optimal ürün özelliklerine sahip en iyi ürünler
seçilmistir: En uygun klonun seçimi için, en basta, 3 farkli substratla
ölçülen spesifik enzim aktivitesi, ürün homojenligi, selüler üretkenlik
faktörlerinin yani sira, seker koinpleksitesi de dikkate alinmistir. Sekil
2°de, üretiin hücre hatlarinin saptanmasi için kullanilan ayri kolonlara
ait ardisik kültür üst fazlariniii özet Western Blot analizi gösterilmistir.
Münferit klonlarin ürün özellikleri, ekspresyon ürünlerinin seker
oraninin sagdan sola dogru artmasi temelinde farklilik göstermekte
olup, bu artis belirgin bir kütle artisinda yansimaktadir. Bu noktaya
yüksek derecede glikolize edici klonlarin spesifik olarak seleksiyonu
yoluyla ulasilmistir. Son kertede, en yüksek molekül agirligina sahip
ekspresyon ürününü içeren klon (klon 589), üretim hücre hattinin
( lB4) saptaiiniasinda kullanilmistir.Enziinatik olarak yüksek ölçüde aktif ve kompleks N-glikozile ACEZ
eksprese edeii 6 kolonla devani etme karari alinmistir. Çözünür ACEZ
83 kDa molekül agirligina sahipken, denatüre edici SDS-PAGE
analizinde seker yapisina bagli olarak 120 kDa'ya kadar varan bir
agirlikta görünen klonlar seçilir. Sekil 3'te, mevcut üretim prosesiyle
üretilen bir ACEZ (Kulvar B), NSO°da üretilen bir ACEZ standardiyla
(Kulvar A) karsilastirmali olarak gösterilmistir. Bulusa uygun ACEZ
polipeptidi 7 burada monoiner olarak analiz edilmistir 7 homojen ve
yüksek derecede glikozile edilmis olinasindan dolayi yaklasik 120
kDa°da tekil bantlar halinde görünürken, referans malzeme 83 kDa ilâ
120 kDa araligindaki bantlara sahiptir ve bu da çok heterojen bir
glikozilasyon profiline isaret etmektedir.On seçili klonlar daha sonra proteinsiz üreme vasatina (polimun)
transfer edilmistir. Piyasadan temin edilebilen bu vasatin kimyasalyapisi taniinlanmistir, serumsuzdur, hayvansal proteinler içermez ve
24glikoproteinlerin CHO içinde rekombinant ekspresyonu için optimize
edilmistir. Fermantasyon 2,5-3,5 uM Zn2+ konsantrasyonunda
gerçeklestirilmistir. 6 klonun tamami kültür içinde tutulmus ve üretim
prosesine uygunluklari açisindan test edilmistir. Bu baglamda bilhassa
üreme hizlari kaydedilmis ve kültür üst fazlarindaki ürün ve metabolit
miktarlari incelenmistir (Sekil 4). Keza yine ekspresyon ürünleri ve
klonlar da kesin olarak analiz edilmistir. Tüm klonlar yüksek derecede
aktif ACE2 ekSprese etmis ve 20-30 pg/hücre/gün seviyesinde
üretkenlik degerleri göstermistir. Buna ek olarak, yine ayni sekilde
seker yapilari ve bunlarin heterojenlikleri de analiz edilmistir. Son
kertede 1B4 klonu seçilmistir. Bu klon, tüm üretim seyri boyunca
homojen bir seker yapisi göstermistir. 7 adet N-glikozilasyon
konumunun tamami islenmis olup, bu konumlar, terminal sialik asitler
içeren en az tek-, hatta bazilari üç-dalli kompleks glikozilasyon
profilleri sergilemistir.Bu klon temelinde bir master hücre bankasi hazirlanarak test edilmis
ve sonrasinda GMP-uyumlu bir saflastirma prosesi ve akabinde bir
GMP üretim prosesi olusturulmustur.SEKKIM. NO: 1 (ACE2 protein sekansi; otolog sinyal sekansi (altiçizilmistir) atilmak üzere konakçi hücre tarafindan yarilmistir).MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNM NINAGDKWSAFLKEQSTLAQMYP
LQEI QN __VKLQLQALQQAG SSVLS EDKSKRLNTI LNTMSTIYSTG KVCN PDN PQECLL-E PG LN EIMARSLDY N
ERLWAWESWRSEVGKQLRFLYEEYVVLKNEMARANHYE DYGDYWRGDYEVVGVDGYDY SRGQJEDVEHTE
ElKPLYEl iL IAW'RAKU4NAVPSYISPIGCLPAI |LLGDIVWGRl'WTNLYSLWP?GQKPNIDVTDAMVDQAWDA
QRIFK=AFKFFVSVGI DIxll'iflTQGFVilFN SMI TDPGNVQKAVC-l DTAWDI GkC-I'ZFRII MCI'KVTMDDFI TAH H FM
GHIQYDMAYAAQPFL_RNGANEGFH EAVGEIMSLSAATPKHUGIGLSPC FQEDNETEINFLLKQALTIVGTLP= 25TYM LE KWRWMVF KGEI PKDQWM KKWW EM KREIVGVVE 3VPH DETYCDPASLFHVSN DYS FI RYYTPÜLYQFQ
f'QEALCQAAKI iEGPL› lKCDISNSTEAGQ (LFNMLRLSKSEDWTLAthi/GAKN V1\lVRPLLf\Y`EPLlTWL (DQ
NKNSP'VGWS I DWSPYAUQSIKVKlSLKSALGUKÃYtwhm:MYLP'RE-SVAYAM (QYI'LKVKNQMILI'UU:DVR
VANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDA:RLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSACE2°nin dimerlesmesine bagli olarak, hidrofobik protein
birimlerinin tamami kompleksin içine yönlendirilirlerken, N-bagli
seker zincirleri gibi yüklü rezidüler disariya dogru çikinti yaparlar ve
ayni sekilde yüklü fizyolojik ortam içinde molekül yapisini
çözünürlestirirler.Tamamen N-glikozile edilmis bir ACEZ'nin ekspresyonuyla
gerçeklesen bu diinerlesme an+ iyonlarinin varliginda teSpit
edilmistir. Bu durumda dimer kompleksi, elektrostatik olarak birbirine
baglanmis olan ve fizyolojik çözeltiler içinde dahi artik birbirinden
ayrilmayan 2 özdes alt birimden meydana gelir. Bu noktada, her
ACE2 inolekülü üzerinde kuvvetlice yüklenmis 14 sialik asit yapisi ve
dimerde 28 sialik asit yapisi içeren bir glikoproteinin sekresyonu
gerçeklesir. Her durumda komplekse 2 Zn2+ iyonu entegre olur ve
onun yapisini stabilize eder. Seker zincirlerinin kuvvetli yükü
molekülü fizyolojik sulu çözeltiler içinde çözünür hale getirir ve ilgili
yüklü protein domainlerini disariya çikmaya zorlar. Uretim prosesi,
nihai üründe sadece ACE2 dimerleri bulunacak sekilde tasarlanmistir.
Bunu saglamak için, ACE2”nin üretimi sirasinda proseste yeterli
miktarda Zn2+ iyonlarinin bulunmasi (tercihen 1,5-5 mikromolar
Zn2+ kullanilir; özellikle de fermantasyon 2,5-3,5 uM
Zn2+ konsantrasyonunda gerçeklestirilebilir) temin edilir ve ardindan
müteakip islem adimlari Zn2+ iyonlarinin varliginda icra edilir.
Saflastirma islemi, bir anyon degisim adimi, bir amonyum sülfatçökeltimi, bir HIC adimi, bir katyon degisim adimi ve yüksek26çözünürlüklü bir baska anyon degisim adimi uygulanarak yapilmistir.
Prosesteki tüm vasatlar fosfatla tamponlanmis olup, sodyum klorür
içerir. Nihai numune tamponu, enjeksiyonluk fizyolojik glisinçözeltisidir.Örnek 2: Ürün Ozellikleri Yüksek derecede glikozile edilmis, kompleks ACE2 monomeri veya
dinieriii monomer birimleri, kovalent bagli seker yapilarindaii dolayi,
aminoasit sekaiisiiia karsilik gelen molekül agirligindan belirgin
ölçüde daha yüksek bir molekül agirligina sahiptir. Bu bakimdan,
örnegin peptid haritalama yoluyla molekül kütlesi 102 kDa olarak
ölçülmüsken, glikozile-edilmemis ACE2 sadece 83 kDa molekül
agirligina sahiptir. Buna uygun olarak, seker içerigi % 23 oraiiindadir
ve ileride tarif edilen ürün özellikleri açisindan büyük önem tasir.
SDS-PAGE analiziiide inceleneii moiiomer biriini, ugradigi kuvvetli
hidratasyondan dolayi, referans standarda kiyasla yaklasik 120 kDa
(Sekil 3) seviyesinde görüiiniektedir.Meinbrana-bagli dogal ACE2 eksprese edilmemis, sadece ACE2°nin
çözünür kismi eksprese ediliiiistir. Eksik membran doniainlerinden
dolayi bu tamamen glikolize edilir.ACE2; kompleks, yüksek derecede siyalizlenmis ve dolayisiyla
kuvvetli negatif yüklü seker yapilariiidan dolayi, glikozile edilmemis
veya tainaiiieii glikolize edilmemis ACE2”ye kiyasla belirgin olarak
daha kuvvetli bir çözünürlüge sahiptir. Bu sayede, 15 nig/ml°ye kadar
varaii konsantrasyonda tamponlu protein formülasyonlari sorunsuz bir
sekilde üretilebilir.Urün ayrica çözelti içinde stabil davranir ve uzun bir saklamaperiyodu boyunca etkinligini kaybetmedigi gibi, stabil dimerlesine27haricinde bozunma veya agregatlasma egiliini de göstermez. Buna
mukabil deglikolize ACE2, düsük bir konsantrasyon araliginda bile
bozunmaya ugrar. Bu nokta, bir preparatif deglikozilasyon
forinülasyonunda PNGaseF yoluyla tespit edilmistir. Burada ACE2
için hesaplanan teorik stabilite indeksi 41,2 olarak ölçülmüs olup, bu
deger proteini instabil sinifina sokmaktadir ve bu hesaplamada seker
yapilari dikkate alinmamistir. Ancak formülasyonlarin çözelti içinde
aylarca stabil davraninasi görünüse göre yüksek seker içeriginden ileri
gelmektedir. ACE2”nin daha iyi çözüiiür hale getirilmesi, ayrica bu
formülasyonun sadece ACE2 dimerlerinden (veya suni olarak
monomerlerine ayirma sonrasinda monomerlerden) olusmasina yol
açarken, glikozile edilmeyen ACE2 multimerlesme ve agregatlasma
egilimi gösterir.Ayrica yüklü seker rezidülerini yüksek oranda içermesinden dolayi,
mevcut ACE2 preparatinin hidrodinamik çapi, çözünürlesine kilifi da
kuvvetli ölçüde büyür. Bu duruin, ACE2”nin boyut separasyon
kolonlarinda preparatif olarak saflastirilmasinda yararli olabilir, ki
burada sadece dimer forinunda bulunan protein, hesaplanan 83 kDa
molekül agirligina kiyasla 250 kDa görünür molekül agirliginda
ortaya çikar. Bir preparatif ACE2 saflastirma isleminin kroinatogrami
Sekil 6°da verilmistir. ACE2 (birinci resiin) 69 dakika retansiyon
zamaniyla elüe olur. Bu, tiroglobülin (birinci resimde 58 dakikada,
670 kDa) ile gama-globülin (birinci resimde 74 dakikada, 158 kDa)
arasinda bir görünür molekül agirligina tekabül eder. Bu denli yüksek
bir molekül agirliklari araliginda kültür üst fazlarinda neredeyse hiç
kontaininasyon meydana gelmez ve neticede çok basit bir separasyonadimiiida yüksek derecede saf bir ürün ayrilabilir.28Örnek 3: Farmakoloiik Urün Ozellikleri Bulusa uygun ACE2 preparati, fizyolojik tampon içinde stabil, yüksek
derecede saf ve konsantre protein çözeltisi formunda bulunur ve ilave
bir stabilizasyona gerek olmadan saklanabilir ve uygulanabilir.
Tampon olarak ömegin fosfat tainponu kullanilir.ACE2, çözelti içinde inonomer veya diiner formunda stabildir ve
yüksek seker içeriginden dolayi agregatlasma göstermez. Buna ek
olarak, ACE2 preparati tam enzimatik aktivite gösterir.ACE2, çözünürlügünden dolayi bolus formunda intravenöz
uygulanabilir. Ayni nedenden ötürü, uygulama sonrasinda sistemik
olarak derhal biyoyararlaniin gösterir.ACE2; yüksek, kuvvetli dallanmis ve kompleks seker içeriginden
dolayi çok yavas bozuninaya ugrar. Buna bagli olarak en az 10,5
saatlik uzun bir yarilanma ömrüne sahip olup, yarilanina ömrü, basta
Rezus Makakus maymunlari olmak üzere çesitli hayvan türlerinde
ölçülmüstür. Sekil 7”de, intravenöz yoldan verilen ACE2 için 3 farkli
türde ölçülen yarilanina ömürleri gösterilmistir.Ayrica yüksek sialik asit içerigine bagli olarak, ACE2sye karsi
nötrlestirici immün cevabi gelistirilemez. Aksi bir durum, sadece
ACE2°nin ekzojen uygulamasini etkisizlestirmekle kalinayacak, ayni
zamanda hücrelerde bulunan otolog ACE2”yi de nötralize
edebilecektir.Dolayisiyla tarif edilen ACE2 formülasyonu, tüm baglantili ürün
özellikleriyle birlikte, rhACE2°yle etkili bir tedavinin uygulanmasinaolanak verir.29Örnek 4: Spesifik ACE2 aktivitesinin tayini ACE2 preparatlarinin spesifik aktivitesi, Ang II dönüsümünün (Asp-
Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) ölçümü yoluyla tayin edilmistir. Tüm
ölçümler, 100 ul hacimli alikotlarda üçlü tayin seklinde yapilmistir.
Enzimatik reaksiyon, 50 mM MES, 300 mM NaCl, IOuM ZnC12 ve %
0,01 Brij-30 içinde 80 uM Aiig II içeren pH 6.5 ”lik bir çözeltiye 250
ng/ml ACE2 eklenerek baslatilmistir. Numuneler 'Özenle karistirilmis
ve 37°C°de tam olarak 18 dakika boyunca inkübe edilmistir. 100 mM
EDTA ilavesiyle enziinatik reaksiyon durdurulmustur. Analiz edilecek
çözeltiler, % 0,08 H3PO4 içiiide % 10 ile % 60 arasinda bir dogrusal
CH3CN gradyani kullanilarak RP-HPLC (Waters C18 uBondapak,
2,1X300mm, 10um, 125Ä) yöntemiyle l ml/dak. akis hizinda 20
dakika boyunca ayrilmistir. Daha sonra kromatogramlarda, hem Aiig
II hem Ang 1-7 pikleri tespit edilerek entegre edilmistir. Peptid
konsantrasyonlari, Sekil Side gösterilen uygun kalibrasyon egrileri
yardiiniyla belirlenmistir. Daha sonra, enzimatik dönüsüm ve Spesifik
enzim aktivitesi tayin edilmistir.ACE2 ürününün aktivitesi yukarida tarif edilen sekilde belirleninistir.
Pik entegrasyonu soiiuçlari ve hesaplanan enzim degerleri Tablo l”degösterilmistir.
30Tablo 1: Enzim degerleri ve reaksiyon sartlari. Uçlü tayinlerinortalama degeri verilmistir. Enzimatik Reaktivite Pik alani Dönüsüm Reaksîyon süresi A CE2 Kons. kkat Spesifik Aktivite mAU.dak umolml'i dak ng.ml`] s` umolmgl. dak'1
Ang 1117149890 62,1 18 250 8,0±0,3 4,7±0,2
Ang 1-74720141 23,1 18 250 8,8±0,2 5,2±0,1 ACE2 preparatinin Ang II dönüsümü temelinde ölçülen katalitik
aktivitesi (kkat) 8,0±0,3/s; Ang l-7 dönüsümü temelinde ölçülen
aktivitesi 8,8±0,2 seviyesindedir.Bu iki deger de birbiriyle tutarli olup, Vickers ve arkadaslari
tarafindan yayimlanan (J Biol Chein. 277 (17) (2002): 14838-43) 3,5/s
düzeyindeki katalitik ACE2 aktivitesinden belirgin olarak yüksektir.
Reaksiyon sartlari aynidir. Bizim preparatimizin % 240 daha yüksek
bir aktivite göstermesinin nedeni post-translasyonel modifikasyonlar
ve burada özellikle N-glikozilasyon olsa gerektir, zira Vickers°in
kullandigi materyalde glikozilasyon olgusu belirgin ölçüde daha az
belirgindir. Buradaki materyal böcek hücrelerinde eksprese edilmis
olup, ayni aminoasit sekansina sahip olmasina ragmen, çok daha
düsük bir oranda ve dallanma derecesinde glikozile edilmistir. Buna
ek olarak, R&D systems (Kat no. 933-ZN) tarafindan piyasaya sürülen
ve ayni sekilde 2,0±0,l /8 olmak üzere belirgin ölçüde daha düsük
kkat aktivitesine sahip olan bir ACE2 preparati da test edilmistir.Bulusa uygun preparatin önemli bir özelligi, özellikle post-31translasyonel modifikasyonlar sayesinde bilhassa yüksek oranlara
çikan enzimatik aktivitesidir.Örnek 5: Rekombinant ACE2”nin glikoproteomik analizi CHO°da eksprese edilerek saflastirilmis ACEZ numuneleri iki yolla
analiz edilmistir:Ilk olarak, SDS-PAGE ve S-alkilasyonu kullanilarak triptik peptidler
üretilmis ve LC-ESI-MS (ve MS-MS) yoluyla analiz edilmistir.
Bunun sonucunda N-terminal peptid ve birçok dahili peptid
bulunmustur. Potansiyel olarak glikozile edilmis yedi adet konumun
besi, glikan yapilari içeren N-glikozile formda bulunmus olup, söz
konusu glikan yapilari, esas olarak, fukoz ve çesitli miktarlarda sialik
asit ihtiva eden iki-dalli glikanlar içermektedir. C-terminal peptid O-
glikozile olmus gibi görünmektedir.Ikinci olarak, indirgenmis serbest N-glikanlar Karbon-LC-ESI-MS
yoluyla analiz edilmistir. Fukoz içeren iki-dali, di-siyalize glikan için,
fukozun (11,6 çekirdegine ye sialik asitin &2,3 çekirdegine bagli
oldugu gösterilmistir. Mono veya di-siyalize, iki-dalli glikanlara
ilaveten, kaydadeger miktarda üç-dalli oligosakkarit de bulunmustur.
Glikozile edilmis kabaca ACEZ kütlesi 101-102 kDa düzeyinde
tahmin edilmistir, yani yaklasik % 17 oraninda karbonhidrattanolusmaktadir.SDS-PAGE yoluyla ayrilmis hBChE°nin proteolitik sindirimi
ACEZ alikotlari SDS-PAGE analizine tabi tutulmus, boyadan arindirilmis, karbamidometillenmis, sekanslama kalitesinde tripsinle
sindirilmis ve jel parçalarindan tarif edilen sekilde ekstrakte edilmistir.
Ekstraktlar bir Speed Vac yogunlastirma cihazinda kurutulmus vemüteakip LC-MS analizinden önce, % 0,1 formik asit içeren suyla32sulandirilmistir. Oligosakkarit analizi için, peptidler PNGase F ile
sindirilinis ve glikanlar C 18 SPE-kartuslari kullanilaraksaflastirilmistir.Triptik peptidlerin ve glikopeptidlerin MS-analizi Kütle spektrometrisi analizi, bir standart elektrosprey birimiyle, bir
Cap-LC sistemiyle (Waters Micromass) ve lO-portlu çözücü-
degistirme-modülüyle (Rheodyne) donatilmis Q-TOF Ultiina Global
(Waters Micromass) cihazinda, kisaca tarif edilen sekilde [Kolarich
2006] yapilmistir. Numuneler, ilk önce, çözücü olarak su kullanilarak
bir Aquasil C18 ön-kolonunda (30 X 0,32 mm, Therino Electron)
yakalanmistir. Biobasic C18-kolonu (100 x 0,18 mm, Thermo
Electron) olan analiz kolonu, çözücü degisiminden önce % 5
asetonitrilde tutulmus ve sonra 2 ul/dak. akis hiziyla % 5 ile % 50
asetonitril araliginda bir dogrusal gradyan tatbik edilmistir. Tüm
elüsyon vasatlari % 0,1 formik asit içerinektedir.Numuneler MS ve ayrica MS-MS-teknigiyle analiz edilmistir. Veri
analizi, MassLynx 4.0 SP4 programiyla (Waters Micromass)
yapilmistir.AC E2”nin serbest N-glikanlarinin analizi Borhidrürle indirgenen glikanlar, bir gözenekli grafit karbon
kolonunda ayrilmis ve kütle spektrometrisi yoluyla teshis edilmistir.
N-terminal ve C-terminal ucu bulunmaya çalisilmistir. Protein içerirOrnek 6: Glikozilasyon analizi ACE2”nin protein sekansi, onun
molekül agirligi, tüm glikozilasyon konumlarinin yeri ve baglanan
sekerin yapisi burada tayin edilmistir. Numune; triptik sindirme, S-alkilasyonu ve LC-ESl-MS teknigiyle analiz edilmistir.33Glikozile edilmis ürünün protein kütlesi 102 kDa olarak saptanmis
olup, seker içerigi toplam kütlenin % 23 ,üne tekabül etmektedir.1 N-terminal ucu ve sekansin dahilindeki tüm peptidlerin varligi
burada teyit edilmistir (sekans bilgisine bakiniz).1 Varsayilan 7 N-glikozilasyon konumunun hepsi (53, 90, 103, 322,
432, 546 ve 690 konumlari) gerçekten de iki-dalli, kompleks, sialik
asit-içeren fukosillenmis seker yapilari içermektedir (Sekil 13).1 C-terminal peptid O-glikozile edilmistir.Bu seker rezidüleri ayrildiktan ve indirgendikten sonra, karbon LC-
ESI-MS yoluyla yapi tayinine tabi tutulmustur. Iki-dalli yapilarin her
biri, a2,3-bagli iki sialik asit ve bir 0tl,6-bagli fukoz içermektedir.
Düsük miktarlarda olsa da, üç-dalli yapilara da rastlanmistir (Sekil
11).Kullanilan seleksiyon stratejisi, tamamen glikozile olinus ve sialik asitiçeren bir ekspresyon ürününün elde edilebilmesiiie olanak vermistir.Yöntem:Numune hazirlamaACEZ; SDS-PAGE vasitasiyla ayrilmis, boyadan arindirilmis,
alkillenmis ve tripsinle sindirilmistir (Kolarich ve arkadaslari,
Proteomics 6 (2006): 3369-3380). Jel ekstraktlari kurutulmus ve LC-
MS analizinden önce % 0,1 formik asit içinde çözündürülmüstür.
Seker analizi için, peptidler, PNGase-F yoluyla sindirilmis ve C18
SPE kolonuyla satlastirilmistir.MS-analizi
Tüm kütle spektroskopi analizleri, bir standart elektrosprey birimiyleve bir Cap-LC sistemiyle (Waters Micromass) donatilmis Q-TOF34Ultima Global (Waters Micromass) cihaziyla yapilmistir (Kolarich
2006).Numuneler, bir Aquasil Cl8 'Ön-kolonunda (30 X 0.32 mm, Thermo
Electron) su içinde zenginlestirilmistir. Ayirma kolonu olarak,
asetonitril gradyani uygulanan bir Cl8 kolonu (100 X 0.18 mm,
Thermo Electron) kullanilmistir. Numuneler MS ve MS-MS modundaanaliz edilmistir.
Serbest glikanlarin analizi
Borhidrürle indirgenen glikanlar bir gözenekli grafit kolonda ayrilmisve kütleleri yoluyla karakterize edilmistir.Örnek 7: rhACE2”nin dimerlestirilmesi Ornek 1”e göre hazirlanan ACEZ diiner formunda elde edilmis ve bu
örnekte, dimerleri ayirmadan oldugu gibi analiz edilmistir. Denatüre
edici analizlerin aksine, dogal islem sayesinde dimerin yapisi korunur
(Sekil 3). ACE2”nin dimerlesmesine bagli olarak, hidrofobik protein
birimlerinin tamami kompleksin içine yönlendirilirlerken, N-bagli
seker zincirleri gibi yüklü rezidüler disariya dogru çikinti yaparlar ve
ayni sekilde yüklü fizyolojik ortam içinde molekül yapisini
çözünürlestirirler. Tamamen N-glikozile edilmis bir ACE2°nin
ekspresyonuyla gerçeklesen bu diinerlesme Zn2+ iyonlarinin varliginda
tespit edilmistir. Bu durumda dimer kompleksi, elektrostatik olarak
birbirine baglanmis olan ve fizyolojik çözeltiler içinde dahi artik
birbirinden ayrilmayan 2 özdes alt birimden meydana gelir.
Bu noktada, her ACEZ moleküli'i üzerinde kuvvetlice yüklenmis 14
sialik asit yapisi ve diinerde 28 sialik asit yapisi içeren birglikoproteinin sekresyonu gerçeklesir. Her durumda komplekse 235Zn2+iyonu entegre olur ve onun yapisini stabilize eder. Seker
zincirlerinin kuvvetli yükü molekülü fizyolojik sulu çözeltiler içinde
çözünür hale getirir ve ilgili yüklü protein domainlerini disariya
çikmaya zorlar. Uretim prosesi, nihai üründe sadece ACE2 dimerleri
bulunacak sekilde tasarlanmistir.Buiiu saglamak için, rACE2›nin üretimi sirasiiida proseste yeterli
miktarda Zn2+ iyonlarinin bulunmasi (tercihen 1,5-5 mikromolar
Zn2+ kullanilir; özellikle de fermantasyon 2,5-3,5 uM
Zn2+ konsantrasyonunda gerçeklestirilebilir) temin edilir ve ardindan
müteakip isleni adimlari Zn2+ iyonlarinin varligiiida icra edilir.Sekil 14 ve 15,te, ACE2 kompleksiniii diinerlesinesi farkli
yöntemlerle kanitlanmistir. Dogal poli-akrilamid-jel-elektroferezinde,
protein, gümüs boyama isleminden sonra yaklasik 250 kDa boyutlu
tekil baiitlar halinde teshis edilmistir.
Keza 220 mM pH 7,0 Na-fosfat tampoiiu içinde % 10 asetonitril
varliginda Zorbax G-450 kolonunda uygulanan boyut separasyon
kromatografisinde de, ürün, yaklasik 250 kDa molekül agirligina
tekabül eden bir retansiyon zamaninda ayri bir pik olarak belirmistir.
Her iki durumda da dikkate deger nokta, sadece dinierlesmis proteinin
teshis edilebilmis olmasidir. Dolayisiyla ne moiioiner yapilari ne deyüksek molekül agirlikli agregatlar teshis edilebilmis degildir.Ornek 8: ACE2 dimerleri - Membrana-bagli ACE2 ile arasindaki far_klarACE2, tüm yüksek türlerin agirlikli olarak böbrek, kalp, akciger ve
karaciger hücrelerinde reniii an jiyotensin sisteminin 'Önemli bir eiizimi
olarak eksprese edilir. Membraiia-bagli ACE2, membranin çift lipidtabakasi içinde dogal olarak diger membraii proteiiileriyle kusatilir ve36bu proteinler ACE2°yi aktif konformasyonda stabilize eder ve ayni
sekilde ACE27nin ekstraselüler domainlerini proteolitik bozunmaya
karsi korur. Çözünür ACE2°nin farmakolojik özelliklerini gelistirmek
ve bilhassa çözünür proteinin aktivitesini ve stabilitesini artirinak için,
her durumda sadece stabil ACE2 dimer yapilarinin elde edilmesini
saglayan bir ekspresyon ve üretim stratejisi seçilmistir. Dinierlesmede
belirleyici ölçüde sorumlu olan faktör, özellikle proteinin C-terminal
domaini ve onun post-translasyonel modifikasyonlaridir. ACE2 dimer
yapisinin kendine has `Özelliklerini vurgulamak amaciyla, membrana-
bagli ACE2°nin yapisi dogal PAGE ve ACE2-spesifik Westernblot
teknigiyle analiz edilmistir (Sekil 16). A ve B kulvarlarinda hücre
ekstraktlari (korteks ve beyin) ve C kulvarinda, Ornek l”e uygun
olarak üretilmis ACE2 dimerleriiiin bir üretim klonu için bir hücre
ekstrakti gösterilmistir. Burada membraiia-bagli ürün, her ne kadar
sadece ekstraselüler parçadan olusuyorsa da, Ornek l°e göre üretilmis
ekspresyon ürününe (C ve D) göre belirgin olarak daha düsük bir
molekül agirligina sahiptir. Bu durum, membrana-bagli ACE2”nin
monomer formunda bulundugunu göstermektedir. Buna mukabil
ekspresyon ürünü, ürüne farmakolojik avantajlar kazandiran
dimerlerden olusmaktadir. D kulvarinda, nihai olarak saflastirilinis
ürün analiz edilmistir. Bu ürün yaklasik olarak sadece 240 kDamolekül agirliginda tek bir baiida sahiptir.Ornek 9:ACE2 diinerlerinin iyilestirilmis farinakolojik özellikleriAPN 01, sadece ACE2 dimer yapilarindan olusan bir fizyolojik ACE2
protein formülasyonunun adidir. Burada, her durumda iki ACE2
monomeri birbirine non-kovalent baglarla baglanmis komplekslerolusturur. Buradaki moleküler-biyolojik yapilar, ekspresyon hücre37hatlari, fermantasyon prosesi, saflastirma adimi ve saklaiiia ve
uygulama tainponu, nihai üründe sadece stabil ACE2 diinerleri
bulunacak sekilde seçilmis ve tasarlanmistirlar. Dimer daha büyük
kompleksler halinde agregatlasmadigi gibi, fizyolojik sartlar altinda
monomerlere de ayrilmaz.Sekil 15”te (Analitik SEC-HPLC Kromatogrami: APN 01 ile bir boyut
separasyon standardi arasinda karsilastirma (Bio-RAD GF-standardi,
mavi egri). Çevrim sartlari: Koloii: Zorbax GF250, Tampon: 220 mM
Na2HPO4 + % 10 CH3CN, pH 8.0, akis hizi 1 ml/dak). APN 01 8,6
dakikada tek bir pik formunda elüe olmaktadir ve bu pik retansiyon
zainani itibariyle tiroglobülin (680 kDa, Retansiyon zainani 7,4
dakika) ve bovin gama-globülin (158 kDa, Retansiyon zamani 8,9
dakika) arasinda bir yerde durmaktadir. Bu koinpleks için hesaplanan
inolekül kütlesi yaklasik 214 kDa'dur. Bu kütle, her biri 102 kDa
agirliginda olmasi beklenen iki ACE2 biriminin molekül agirligina
asagi yukari uygundur.Karsilastirma için referans materyal olarak, CHO hücrelerinde ACE2
monomerleri hazirlaninis ve bunlar da ayni sekilde SEÇ-HPLC
yoluyla analiz edilmistir. Buna iliskin kromatogram Sekil 17°de
gösterilmistir. Monoiner forinu. 9,0 dakika retansiyon zamaninda elüe
olmustur ve bu, 110 kDa civarinda bir molekül agirligina karsilik
gelmektedir. Her iki ürün ayrica PAGE yoluyla karsilastirilinistir
(bakiniz Sekil 18a). APN 01 (A) yaklasik 240 kDa molekül
agirliginda bir protein bandi gösterirken, monomer formu (B) yaklasik
100 kDa”da görünmektedir. Her iki ürünün kimligi, Sekil l8b”de
görüldügü gibi, ACE2-spesifik Westemblot yoluyla dogrulamistir.38Her iki ürün, floresan-isaretli substrat kullanilarak yapilan aktivite
testinde ölçüldügü üzere özdes spesifik enzim aktivitesi
göstermektedir.Sekil l9°da görüldügü üzere, monomer ve dimer formunun ayni enzim
konsantrasyonuna ait egriler üstüste binmistir.Iki ürünün farmakolojik özelliklerini karsilastirmak amaciyla, her iki
preparat B1-6 farelere intraperitonal yoldan 2,5 ing/kg dozlu bolus
enjeksiyonuyla uygulanmis ve serum numunelerindeki ACE2 enzim
aktivitesi 24 ve 48 saat sonra ölçülmüstür (bakiniz Sekil 20). Protein
konsantrasyonu, tüm hayvanlarin 100 ul fizyolojik protein çözeltisi
almalarini saglayacak sekilde ayarlanmistir. Her durumda 7 hayvan
APN 01 ile (ACE2-dinleri) ve 5 hayvan ACE2 monomeriyle tedavi
edilmistir. ACE2 uygulamasindan önce serum numunelerinin
hiçbirinde ACE2 aktivitesi ölçüleniezken, uygulama sonrasinda her
durumda sistemik ACE2 aktivitesi ölçülebilmistir. Uygulamadan 24
henüz saat sonra iki grup arasinda anlamli bir fark ortaya çikmistir (t-
testi, p<0,001): ACE2 diineriyle tedavi edilen hayvanlarda 0,9 tig/ml
ACE2 konsantrasyonuna karsilik gelen bir aktivite ölçülürken, ACE2
monomeri verilen grupta sadece 0,2 tig/ml konsantrasyonuna karsilik
gelen bir aktivite tespit edilebilmistir. 48 saat sonra, ACE2
homodimeri verilen grupta hâlâ 0,2 tig/ml düzeyinde aktivite tespit
edilirken, inonomer verilen grupta artik sistemik ACE2 aktivitesi
teshis edilememistir. Bu veriler, ACE2 diiner formunun belirginfarmakolojik avantajlar sundugunu göstermektedir.
39SEKANS LISTESI<110> Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungs
GmbH<120> ACE2 polipeptidi
<130> R 61652<140>BILINMEYEN
<141>2008-06-12<150> AT A 913/2007
<151> 2007-06-12<150> EP 084500529
<151> 2008-04-08<160> 1
Patentln versiyonu 3.5<210>1
<211> 740
<212> PRT<213> homo sapiens<400> 1
Met1AlaA811A511Ala65GlnLeuSer'IhrGluSerGlnHisTy:50GlyMetGinLysGiy130ProSaz:SerGiu35Asn2`SPTyrAlaArg115LysGlySerThr20Ali:ThrLysProLeu100LeuVaiLeuSerIleGiuÄsn'frpLeu85GinAsnCysAsuTIPGluAspIleSer70GlnGinThrASI]GluLanGluLeuThr55AlaGluASKIIlePro135IleLeuGln?be40GluPheIleGlyLeu120AspMet40LeuAla25Ty:GluLeuGlnSer105AsnASI]AlaSa::
LysGinAsnLysAsn90Se:ThrProAsnLeuThrSerValGiu75LeuVaiMetGinSerVaJ.PheSerGln60GlnThrLeuSerGlu140LeuAlaLeuLeu45AsnSerValSerThr125CysAspVaiAspAlaMetThrLysGlu110IleLeuTyrThr15Ly'sSe:ÄsnLeuIeu95AspTyr:benAsnAla.PheTrpAsnAla80GlnLysSerLeuGlu
145ArgArgAlaAsp225BisSEI'ArgProGin
305LysPheTyr385HisLevProASRAs n210ValPIC›PheASYA290ArgÂsnAsnGlyLeu370A1:GluTrpHis195GlyGluTy:IleTr;`275IleIleüet 'ValAsp355ThrAlaAlaAlaTyr180TyrValHisValGly260ThrAspPheGin340PheAlaGlnValTrp165GluGluAspThrArg245CysAsnVaiLysGln325LysArgHisProGly
405150GluGluAspGlyPhe230AlaLeuLeuThrAla.IleHisPhe390GluSerTyr'I'yrTyr215GluLysProTy:Asp295AlaVaiLeuGiu375LeuIle41'HpValGly200AspGluLeuAlaSer280AlaGluCysMet360Me t.LeuMetArgVal185AspTyrIleMetHis265LeuMetLysHis345CysGlyArgSerSer170TyrSerLysAS“250LeuThrValPheÃsn330ProThrHisAsnLeu
410LysI'I'PArgPro235AlaLeuValAspPhe315rh::LysIle4-.;ly
395Ser'JalASDArgGly220LeuTy::Gly?roGln300VaiMetAla'falGln380AlaAlaGlyGluGly205GlnTyrProAspPhe285AlaSer':rpi?hr
365TyrAsnAla.LysMet190AspLeuGluSerMet270Gly'TIPVa iAsp350MetAspGluThrGln175AlaIyrIleHisTy:255'IFPGlnAspGlyAsp335ieuAspMet.GlyPro
415160ArgGluGluben240IleGlyLysAlaLeu320GlyAspAlaPhe400Lys
HisGluThrVE65LysTyrIleLc-uSer545GlyLys131:::AspLysLeuTh:450CysM9Cys5309.3“LysAST!Trp'Ir-p
610(n
0
HLeuVaiLysGlu
435PrcGluAspTy::515GlnSer;SerMetLeu595SerAlaPheLysSex`
420IlePheIH
i›-i
imIlePro500TytAlaThrGluASD580LysPIOLeuM9IleAsuThr"U
"1
0Va;485AlaThrAlaGluPro565Va;AspTyrGlySer6456111GiyPheTyrSerArgLysAla
550TIPArgGlnAlaASP630SerMetLeuLeuMet455ValLeuThr:His535GlyThrProAsnAsp615LysVal11342LeuLeu
440ValPheLan520GluGlnLys600GinAlaAlaLeuSer
425Ly sGluHis505I'yi'GlyLy sAlaLGU585&snSerTy rryrOi'U
05:!'
m 0Pro613Pro493Val.6131ProLe]1.9.157)115.1SerIleGl'iAla65)GlyAspAlaTrpbir'`i ~<
Ln I'JIValSerPheLEE.Gli.'TyrPheLyâ 'Trp
635MetGli.:PheLeuArglt'
"C
'IIProGlnHis540ASRPhe`lalGluGinIh:
445'Irplâ'HisAspPheS25LysMetV'aiGluGly605Arc;AspGlnI`-59Giu
430IleMetHI
"iAspTy:510GlnCysLeuValPrc590TrpIleA311Ty.:AspValGlu4195SerGluAspGly575LeuSerSerGluPhe
655ASI!GlyPheThrPheAlaIleLeu560AlaPheThrMat.
64 0LeuVa”.AlaLysArg705SerProAsnAsu690MetLeuProLeu675ValSerGluValLys Pro ArgSer Asp IleArg Ser Arg
710Phe Leu Gly
725Ser
740IleIle695IleIle43Ser680ProASRGlnPhe AsnArg ThrAsp AlaPro Thr
730Phe Phe Val Thr
685Glu Val Glu Lys
700Phe Arg Leu Asn
715Leu Gly Pro ProAla ProAla IleAsp Asn
720Asn Gln
73544TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste,
yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin bir
kismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarin derlenmesine büyük
önem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedirve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari:. WO 2004023270 A2 [0006] . AT 9132007 A [0128]
. WO 2008046125 A [0065] . EP 08450052 A [0128]
. WO 2004000367 A [0075]Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:° TIPNIS et al. J Biol Chem., 2000, ' VICKERS et al. J Biol Chem, 2002,
vol. 275 (43), 33238-43 [0004] vol. 277 (17),]4838-14843 [0013]o DONOGl-IUE. Circ Res., 2000, vol. 0 DONOGHUE et al. Circ Res, 2000,
87 (5), 1-9 [0005] vol. 87, el-e9 [0015]- WARNER et al. J, Biol. Chem., ° VICKERS et al. J Biol Chem., 2002,
2005, vol. 280 (47),39353-39362 vol. 277 (17), 14838-43 [0106][0007] ' KOLARICH et al. Proteomics, 2006,. TOWLER et al. .I Biol Chem, 2004, vol. 6, 3369-3380 [01 isi
vol. 279 (17),17996-18007 [0013]
Claims (12)
1. Yüksek kan basincinin, kalp yetmezliklerinin, miyokart enfarktüsün veya aterosklerozun, böbrek çalismazliginin veya yetmezliginin, polisistik böbrek hastaliginin (PKD) veya akciger hastaliklarinin tedavisinde veya önlenmesinde kullanim için, rekombinant, glikozile edilinis, çözünür, insan inenseli, dimerik olarak bulunan, enzimatik olarak aktif bir ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 dimeri, birbirine non-kovalent baglarla baglanmis iki ACE2 inonomer biriini içerir.
2. Istein l'e uygun kullanim için, rekoinbinant ACE2 polipeptidi olup, burada kalp yetmezligi kon jestif, akut veya kronik kalp yetmezligidir, veya burada akciger hastaliklari kronik obstr'i'iktif akciger hastaligi, zatürre, astim, kronik bronsit, akciger anfizemi, sistik fibroz, interstisyal akciger hastaligi, pulmoner hipertoni, akciger embolisi, akciger sarkaidozu, tüberküloz, akciger ödemi, ALI, ARDS veya akciger kanseridir.
3. Istein Z'ye uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada tedavi edilecek veya 'Önlenecek hastalik ALI veya ARDS'dir.
4. Istem Z'ye uygun kullaniin için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada tedavi edilecek veya önlenecek hastalik pulmoner hipertonidir.
5. 1'den 3'e kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptidi bir homo-dimerdir.
6. 1'den 5'e kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptidi iki çinko iyonu içerir.
7. 1'den 6'ya kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptidi bir transmembran domain içermez.
8. 1'den 7'ye kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptid zinciri, SEK.KIM.NO: 1'i veya bunun enzimatik olarak aktif fragmanlarini içerir.
9. 1'den 7'ye kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptid zinciri, SEK.KIM.NO: 1 sekansinin amino asitleri 18-740'dan olusur.
10. 1'den 9'a kadar olan istemlerden herhangi birine uygun kullanim için, rekombinant ACE2 polipeptidi olup, burada ACE2 polipeptidi, içerigine sahiptir.
11. 1'den 9'a kadar olan isteinlerden birinde oldugu gibi taniinlanan bir rekoinbinant ACE2 polipeptidini kapsayan, yüksek kan basincinin, kalp yetmezliklerinin, miyokart enfarktüsün veya aterosklerozun, böbrek çalismazliginin veya yetmezliginin, polisistik böbrek hastaliginin (PKD) veya akciger hastaliklarinin tedavisi veya önlenmesi için preparat olup, burada ACE2 diinerlerinin ACE2 moleküllerindeki içerik orani en az %80'dir.
12. Istem ll'e uygun kullanim için preparat olup, burada tedavi edilecek veya önlenecek akciger hastaligi ALI, ARDS veya pulmoner hipertonidir.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0091307A AT505262A1 (de) | 2007-06-12 | 2007-06-12 | Rekombinantes ace2 polypeptid |
| EP08450052A EP2108695A1 (de) | 2008-04-08 | 2008-04-08 | Ace2 Polypeptid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201808117T4 true TR201808117T4 (tr) | 2018-07-23 |
Family
ID=39720296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/08117T TR201808117T4 (tr) | 2007-06-12 | 2008-06-12 | ACE2 polipeptidi. |
Country Status (35)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8586319B2 (tr) |
| EP (3) | EP3375872A1 (tr) |
| JP (1) | JP5731193B2 (tr) |
| KR (2) | KR20160054045A (tr) |
| CN (2) | CN101796183A (tr) |
| AT (1) | AT505262A1 (tr) |
| AU (1) | AU2008261591B2 (tr) |
| BR (1) | BRPI0813942B8 (tr) |
| CA (1) | CA2692854C (tr) |
| CO (1) | CO6270265A2 (tr) |
| CR (1) | CR11213A (tr) |
| CY (2) | CY1116873T1 (tr) |
| DK (2) | DK2543724T3 (tr) |
| DO (1) | DOP2009000282A (tr) |
| EA (1) | EA027399B1 (tr) |
| EG (1) | EG27095A (tr) |
| ES (2) | ES2670938T3 (tr) |
| HK (2) | HK1255493A1 (tr) |
| HR (2) | HRP20151120T1 (tr) |
| HU (2) | HUE037877T2 (tr) |
| IL (1) | IL202653B (tr) |
| LT (1) | LT2543724T (tr) |
| MA (1) | MA31472B1 (tr) |
| MX (1) | MX2009013472A (tr) |
| MY (1) | MY180672A (tr) |
| NO (1) | NO2543724T3 (tr) |
| NZ (1) | NZ581704A (tr) |
| PL (2) | PL2155871T3 (tr) |
| PT (2) | PT2543724T (tr) |
| RS (2) | RS54340B1 (tr) |
| SI (2) | SI2543724T1 (tr) |
| TR (1) | TR201808117T4 (tr) |
| UA (1) | UA106869C2 (tr) |
| WO (1) | WO2008151347A1 (tr) |
| ZA (1) | ZA200908751B (tr) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US9458444B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-10-04 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8048849B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US20150038413A1 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US10351615B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-07-16 | Opko Biologics Ltd. | Methods of treatment with long-acting growth hormone |
| AT505262A1 (de) * | 2007-06-12 | 2008-12-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Rekombinantes ace2 polypeptid |
| EP2077119A1 (de) * | 2007-12-21 | 2009-07-08 | Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. | Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen |
| AT506632A1 (de) * | 2008-04-09 | 2009-10-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Behandlung von tumorerkrankungen |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| MY167814A (en) | 2012-04-19 | 2018-09-26 | Opko Biologics Ltd | Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same |
| CA2876099A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof |
| BR122020018510B1 (pt) | 2012-11-20 | 2023-03-14 | Opko Biologics Ltd | Método para aumentar incrementalmente o tamanho hidrodinâmico de um fator de coagulação ativado viia |
| ES2732282T3 (es) * | 2013-01-14 | 2019-11-21 | Apeiron Biologics Ag | Polipéptidos de ECA2 modificados |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| ES2893616T3 (es) | 2015-06-19 | 2022-02-09 | Opko Biologics Ltd | Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para la producción de los mismos |
| AU2017296352A1 (en) | 2016-07-11 | 2019-02-21 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factor VII and methods of producing same |
| US11518788B2 (en) * | 2020-07-10 | 2022-12-06 | Avirus, Inc. | Methods and compositions for treating and preventing viral infection |
| WO2021190980A1 (en) | 2020-03-22 | 2021-09-30 | Quadrucept Bio Limited | Multimers for viral strain evolution |
| EP3884957A1 (en) | 2020-03-26 | 2021-09-29 | The University of British Columbia | Methods for treatment of virus and methods for screening of anti-virus reagent using organoids |
| WO2021217120A2 (en) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Administrators Of The Tulane Educational Fund | Compositions and methods for preventing or reducing the effects of infections by coronaviruses that bind the extracellular domain of the ace2 receptor |
| CN113667016A (zh) * | 2020-05-15 | 2021-11-19 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 一种构建冠状病毒抗体的平台 |
| WO2021247675A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Coronavirus-binding agents and uses thereof |
| DE102020207224A1 (de) | 2020-06-09 | 2021-12-09 | Christoph Karle | Protein oder Peptid, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Coronaviren, insbesondere SARS-CoV-2-Viren, hervorgerufenen Infektion oder Infektionskrankheit und/oder einer Folgekrankheit davon |
| EP4171603A1 (en) * | 2020-06-25 | 2023-05-03 | Gliknik Inc. | Ace2-fc fusion proteins and methods of use |
| WO2022008642A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-13 | Apeiron Biologics Ag | Treatment of sars-cov-2 infection with a combination of targets |
| US20220025071A1 (en) * | 2020-07-10 | 2022-01-27 | Biomolecular Holdings Llc | Tetrahedral antibodies |
| CN116710560A (zh) * | 2020-08-21 | 2023-09-05 | 西湖大学 | 工程化ace2寡聚物及其用途 |
| CN112280764A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-01-29 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种新冠重组ace2蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法 |
| EP4011387A1 (en) | 2020-12-11 | 2022-06-15 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Superior neutralization of sars-cov-2 by deglycosylated human angiotensin converting enzyme 2 |
| WO2022159433A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-28 | Singh Biotechnology, Llc | Therapeutics directed against coronavirus |
| WO2022184659A1 (en) | 2021-03-01 | 2022-09-09 | Quadrucept Bio Limited | Antibody domains & multimers |
| WO2022207918A1 (en) | 2021-04-02 | 2022-10-06 | Apeiron Biologics Ag | COVID-19 Therapy |
| WO2023023424A1 (en) * | 2021-08-19 | 2023-02-23 | Phenom Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of sars cov-2 |
| CN113897346A (zh) * | 2021-09-16 | 2022-01-07 | 四川大学 | 能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6989363B1 (en) * | 1997-12-11 | 2006-01-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Angiotensin converting enzyme homolog and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| US6610497B1 (en) | 1997-12-11 | 2003-08-26 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Angiotensin converting enzyme homolog and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| US6194556B1 (en) * | 1997-12-11 | 2001-02-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Angiotensin converting enzyme homolog and therapeutic and diagnostic uses therfor |
| PT2332582E (pt) * | 2002-06-19 | 2014-01-28 | Apeiron Biologics Ag | Activação de ace2 para o tratamento de doença cardíaca, pulmonar e renal e de hipertensão |
| WO2004023270A2 (en) | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Crystal structure of angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase |
| EP1723962A1 (en) * | 2005-05-19 | 2006-11-22 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Use of inhibitors of the renin-angiotensin system for the treatment of lung injuries |
| AT504443B1 (de) * | 2006-10-19 | 2008-11-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 |
| AT505262A1 (de) * | 2007-06-12 | 2008-12-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Rekombinantes ace2 polypeptid |
| EP2108695A1 (de) * | 2008-04-08 | 2009-10-14 | Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. | Ace2 Polypeptid |
| AT506258A1 (de) * | 2007-12-18 | 2009-07-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Behandlung inflammatorischer krankheiten |
| AT506632A1 (de) * | 2008-04-09 | 2009-10-15 | Apeiron Biolog Forschungs Und | Behandlung von tumorerkrankungen |
-
2007
- 2007-06-12 AT AT0091307A patent/AT505262A1/de not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-06-12 EP EP18161541.0A patent/EP3375872A1/de not_active Withdrawn
- 2008-06-12 MX MX2009013472A patent/MX2009013472A/es active IP Right Grant
- 2008-06-12 BR BRPI0813942A patent/BRPI0813942B8/pt active IP Right Grant
- 2008-06-12 CN CN200880100650A patent/CN101796183A/zh active Pending
- 2008-06-12 UA UAA200912888A patent/UA106869C2/uk unknown
- 2008-06-12 KR KR1020167011786A patent/KR20160054045A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-06-12 EP EP12165189.7A patent/EP2543724B1/de active Active
- 2008-06-12 PL PL08756821T patent/PL2155871T3/pl unknown
- 2008-06-12 CA CA2692854A patent/CA2692854C/en active Active
- 2008-06-12 PT PT121651897T patent/PT2543724T/pt unknown
- 2008-06-12 ES ES12165189.7T patent/ES2670938T3/es active Active
- 2008-06-12 RS RS20150709A patent/RS54340B1/en unknown
- 2008-06-12 SI SI200831961T patent/SI2543724T1/en unknown
- 2008-06-12 TR TR2018/08117T patent/TR201808117T4/tr unknown
- 2008-06-12 ES ES08756821.8T patent/ES2550390T3/es active Active
- 2008-06-12 HU HUE12165189A patent/HUE037877T2/hu unknown
- 2008-06-12 WO PCT/AT2008/000211 patent/WO2008151347A1/de active Application Filing
- 2008-06-12 NO NO12165189A patent/NO2543724T3/no unknown
- 2008-06-12 CN CN201410412672.3A patent/CN104450654A/zh active Pending
- 2008-06-12 JP JP2010511445A patent/JP5731193B2/ja active Active
- 2008-06-12 MY MYPI20095316A patent/MY180672A/en unknown
- 2008-06-12 NZ NZ581704A patent/NZ581704A/en unknown
- 2008-06-12 AU AU2008261591A patent/AU2008261591B2/en active Active
- 2008-06-12 SI SI200831514T patent/SI2155871T1/sl unknown
- 2008-06-12 US US12/664,641 patent/US8586319B2/en active Active
- 2008-06-12 PL PL12165189T patent/PL2543724T3/pl unknown
- 2008-06-12 DK DK12165189.7T patent/DK2543724T3/en active
- 2008-06-12 HU HUE08756821A patent/HUE028012T2/en unknown
- 2008-06-12 KR KR1020097027569A patent/KR101682240B1/ko active IP Right Grant
- 2008-06-12 DK DK08756821.8T patent/DK2155871T3/en active
- 2008-06-12 PT PT87568218T patent/PT2155871E/pt unknown
- 2008-06-12 LT LTEP12165189.7T patent/LT2543724T/lt unknown
- 2008-06-12 RS RS20180677A patent/RS57292B1/sr unknown
- 2008-06-12 EA EA201000002A patent/EA027399B1/ru unknown
- 2008-06-12 EP EP08756821.8A patent/EP2155871B1/de active Active
-
2009
- 2009-01-01 ZA ZA200908751A patent/ZA200908751B/xx unknown
- 2009-12-10 IL IL202653A patent/IL202653B/en active IP Right Grant
- 2009-12-10 EG EG2009121812A patent/EG27095A/xx active
- 2009-12-11 DO DO2009000282A patent/DOP2009000282A/es unknown
- 2009-12-30 MA MA32464A patent/MA31472B1/fr unknown
-
2010
- 2010-01-08 CO CO10001879A patent/CO6270265A2/es not_active Application Discontinuation
- 2010-01-12 CR CR11213A patent/CR11213A/es unknown
- 2010-04-28 HK HK18114676.2A patent/HK1255493A1/zh unknown
- 2010-04-28 HK HK10104145.4A patent/HK1136602A1/xx unknown
-
2013
- 2013-09-13 US US14/026,887 patent/US20140099297A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-10-23 HR HRP20151120TT patent/HRP20151120T1/hr unknown
- 2015-10-26 CY CY20151100955T patent/CY1116873T1/el unknown
-
2017
- 2017-12-06 US US15/833,243 patent/US10716833B2/en active Active
-
2018
- 2018-05-23 CY CY20181100549T patent/CY1120426T1/el unknown
- 2018-05-30 HR HRP20180856TT patent/HRP20180856T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201808117T4 (tr) | ACE2 polipeptidi. | |
| JP2011519264A5 (tr) | ||
| EP4159749A2 (en) | A method for producing fc-containing molecule with remodeled sugar chain | |
| US20240116995A1 (en) | Mutant fgf-21 peptide pegylated conjugates and uses thereof | |
| MX2011000847A (es) | Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. | |
| JP2018535964A (ja) | 線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ）１アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置 | |
| Meng et al. | Clinical application of polysialylated deoxyribonuclease and erythropoietin | |
| US20240115502A1 (en) | Liposomes and its use for enzyme delivery | |
| AU2017219470A1 (en) | Cell lines for producing recombinant glycoproteins with di-antennary n-glycans, methods using the same, and recombinant glycoproteins | |
| WO2023035014A2 (en) | Fibroblast growth factor 23 modulating compounds | |
| TW202311529A (zh) | β-己糖胺酶變體之組合物及其用途 | |
| AU2022356491A1 (en) | Recombinant glycan binding proteins and its use | |
| León et al. | Purification process development for HER1 extracellular domain as a potential therapeutic vaccine |