DE102020207224A1

DE102020207224A1 - Protein oder Peptid, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Coronaviren, insbesondere SARS-CoV-2-Viren, hervorgerufenen Infektion oder Infektionskrankheit und/oder einer Folgekrankheit davon

Info

Publication number: DE102020207224A1
Application number: DE102020207224.8A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2021-12-09
Also published as: WO2021250061A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Protein oder Peptid, aufweisend- einen ersten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer ektopen Domäne von ACE2 oder einer Teilsequenz davon entspricht, und- einen zweiten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder D oder einer Teilsequenz davon entspricht oder einen zweiten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder einer Teilsequenz davon entspricht, und einen dritten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D oder einer Teilsequenz davon entspricht.Ferner betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, einen Expressionsvektor, eine Wirtszelle, ein Konjugat sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung.

Description

ANWENDUNGSGEBIET UND STAND DER TECHNIK
Die Erfindung betrifft ein Protein oder Peptid, ein Konjugat, welches ein Nanopartikel und das Protein oder Peptid aufweist, sowie eine das Protein oder Peptid oder das Konjugat aufweisende pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere zur Anwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Viren, insbesondere Coronaviren, bevorzugt SARS-CoV-2, hervorgerufenen Infektion und/oder Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, und/oder einer Folgeerkrankung davon.
Coronaviren, auch als Coronaviridae bezeichnet, sind umhüllte Einzelstrang-Viren. Die 120 nm bis 160 nm großen Viruspartikel (Virionen) besitzen eine Virushülle, in die mehrere verschiedenartige Membranproteine eingelagert sind. Das charakteristische Aussehen der Coronaviren liegt an vielen etwa 20 nm nach außen vorragenden, keulenförmigen Strukturen an der Oberfläche, den Spikes genannten Peplomeren. Sie bestehen jeweils aus den Untereinheiten S1 und S2. Die S1-Untereinheit trägt die Rezeptor-Bindungs-Domäne (RBD), mit der das Virus an eine Zelle andocken kann. Die S2-Untereinheit bewirkt die Verschmelzung von Virushülle und Zellmembran und mithin eine Internalisierung der Viruspartikel in eine Zelle (sogenannte Wirtszelle).
In geringen Mengen ist auf der Außenseite das kleinere Envelope-Protein (E-Protein, 9 bis 12 kDa) vorhanden, lediglich beim HCoV-OC43 (Humanes Coronavirus OC43) und den Coronaviren der Gruppe 2 (Gattung Betacoronavirus) findet sich zusätzlich das Hämagglutin-Esterase-Protein (HE-Protein, 65 kDa). Das ebenfalls in der Membranhülle verankerte M-Protein (Matrix-Protein, 23 bis 35 kDa) ist dagegen nach innen gerichtet und stellt ein Matrix-Protein auf der Innenseite der Virushülle dar. Im Inneren der Hülle befindet sich ein vermutlich ikosaedrisches Kapsid, das einen helikalen Nukleoproteinkomplex enthält. Dieser besteht aus dem Nukleoprotein N (50 bis 60 kDa), das mit dem Strang einer einzelsträngigen RNA von positiver Polarität komplexiert ist. Bestimmte Aminosäurereste des N-Proteins interagieren mit dem Matrix-Protein M, so dass das Kapsid mit der Membraninnenseite assoziiert ist.
Das einzelsträngige RNA-Genom der Coronaviren ist etwa 26.000 bis 32.000 Nukleotide (nt) lang, womit Coronaviren die längsten Genome aller bekannten RNA-Viren besitzen.
Die Vertreter der Coronaviren verursachen bei verschiedenen Wirbeltieren wie Säugetieren, Vögeln und Fischen sehr unterschiedliche Erkrankungen. Beim Menschen verursachen beispielsweise die Coronaviren 229E, HKU1, OC43 und NL63 zwischen 10 % und 30 % der grippalen Infekte der oberen Atemwege, wobei die Krankheiten in der Regel einen milden Verlauf haben. Daneben gab es in der Vergangenheit jedoch auch schwere Krankheitsverläufe. Beispielsweise wurden im Jahr 2002 in Südchina 8.096 Menschen mit SARS-CoV infiziert, wovon 774 starben, was einer Mortalitätsrate von 9,6 % entspricht. Im Jahr 2012 infizierten sich nachweislich 2.494 Menschen in 28 verschiedenen Ländern mit MERS-CoV, wovon 858 starben, was einer Mortalitätsrate von 34,4 % entspricht.
Ende Dezember 2019 wurde ein neues Coronavirus identifiziert, das von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) mittlerweile als SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrom Coronavirus 2, „Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus 2“) bezeichnet wird.
SARS-CoV-2 ruft eine als COVID-19 bezeichnete Atemwegserkrankung, insbesondere Lungenerkrankung, hervor. Die Viruserkrankung wurde erstmals Ende des Jahres 2019 in Wuhan beschrieben. Im Januar 2020 entwickelte sich die Viruserkrankung in der Volksrepublik China zur Epidemie und breitete sich von dort schließlich weltweit zur COVID-19-Pandemie aus. Die Viruserkrankung verbreitet sich hauptsächlich durch Tröpfcheninfektion.
Die Krankheitsverläufe sind unspezifisch, vielfältig und variieren stark. Neben symptomlosen Infektionen werden überwiegend milde bis moderate Verläufe beobachtet, jedoch auch schwere Verläufe mit beidseitigen Lungenentzündungen bis hin zu Lungenversagen und Tod. Neben einer Schädigung der Lunge sind auch krankhafte Prozesse der Leber, des zentralen Nervensystems und des Herzens beobachtet worden.
Besonders ältere Menschen sowie Menschen mit Vorerkrankungen, wie beispielsweise Diabetes und/oder Bluthochdruck, haben ein erhöhtes Risiko, an COVID-19 zu erkranken.
Um in eine Wirtszelle eindringen zu können, interagieren die Spikes von SARS-CoV-2 mit dem transmembranären Rezeptor ACE2 (Angiotensin-konvertierendes Enzym 2). ACE2 existiert dabei nicht nur an menschlichen Geweben, sondern auch bei anderen Säugetieren. Während die S1-Untereinheit von SARS-CoV-2 die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) zur Bindung an den ACE2-Rezeptor bildet, ist die aus einem Fusionspeptid (FP), Hepatrepeat 1 (HR1), Hepatrepeat 2 (HR2), einer Transmembrandomäne (TM) sowie einer zytoplasmatischen Fusionsdomäne (CP) bestehende S2-Untereinheit für die virale Zellfusion sowie den Zelleintritt in Alveolarepithelzellen des Typs II (Pneumozyten des Typs II) der Lungenbläschen zuständig. Während des viralen Infektionsprozesses aktivieren zelleigene Proteasen das Spike-Protein S durch Spaltung in seine beiden Untereinheiten S1 und S2. Im Falle von SARS-CoV-2 handelt es sich bei den Proteasen um die transmembranäre Serinprotease 2 sowie die Trypsin-ähnliche Protease der Atemwege (HAT). Die Endozytose des Virus ist dabei abhängig von Cathepsin L (CPL), einer pH-abhängigen, in Endosomen vorkommenden Cysteinprotease. Die Abschnürung der Vesikel ist abhängig von Dynamin.
Aktuell wird intensiv an Wirkstoffen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von COVID-19 geforscht. Hierbei werden sowohl bereits etablierte Arzneistoffe, wie beispielsweise der Malaria-Wirkstoff Hydroxychloroquin und der Ebola-Wirkstoff Remdesivir, als auch neu entwickelte Wirkstoffe auf ihre therapeutische Wirksamkeit gegenüber SARS-CoV-2 getestet. Ein therapeutischer Durchbruch steht derzeit noch aus.
Demnach besteht weiterhin ein großer Bedarf an alternativen Wirkstoffen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Infektionen und/oder Infektionskrankheiten, insbesondere von durch Coronaviren, insbesondere SARS-CoV-2, hervorgerufenen Infektionen und/oder Infektionskrankheiten, und/oder etwaiger Folgeerkrankungen davon.
AUFGABE UND LÖSUNG
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, einen Wirkstoff bereitzustellen, welcher insbesondere für eine Vorbeugung und/oder Behandlung von Infektionen und/oder Infektionskrankheiten, insbesondere von durch Coronaviren, insbesondere SARS-CoV-2, hervorgerufenen Infektionen und/oder Infektionskrankheiten und/oder Folgeerkrankungen davon geeignet ist. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein entsprechendes Konjugat sowie eine entsprechende pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen. Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Protein oder Peptid gemäß unabhängigem Anspruch 1, ein Konjugat gemäß Anspruch 14, eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 sowie durch weitere in der allgemeinen Beschreibung offenbarte Erfindungsaspekte. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche sowie der allgemeinen Beschreibung. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Protein oder Peptid, insbesondere Polypeptid.
Bei dem Protein oder Peptid kann es sich um ein chemisch hergestelltes, d.h. um ein mittels chemischer Synthese- und/oder Labortechniken hergestelltes, Protein oder Peptid um ein rekombinantes, d.h. um ein biotechnologisch und/oder molekularbiologisch hergestelltes, Protein oder Peptid handeln.
Das Protein oder Peptid weist einen ersten Protein- oder Peptidabschnitt auf. Der erste Protein-oder Peptidabschnitt weist eine Aminosäuresequenz auf, die der Aminosäuresequenz einer ektopen Domäne (sogenannte Ektodomäne) von ACE2 (Angiotensin-konvertierendes Enzym 2) oder einer Teilsequenz davon entspricht. Alternativ besteht der erste Protein- oder Peptidabschnitt aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer ektopen Domäne von ACE2 (Angiotensin-konvertierendes Enzym 2) oder einer Teilsequenz davon entspricht.
Ferner kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid neben dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt einen zweiten Protein- oder Peptidabschnitt aufweist. Der zweite Protein- oder Peptidabschnitt weist eine Aminosäuresequenz auf, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder D oder einer Teilsequenz davon entspricht. Alternativ besteht der zweite Protein- oder Peptidabschnitt aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder D oder einer Teilsequenz davon entspricht.
Ferner kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid neben dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt einen dritten Protein- oder Peptidabschnitt aufweist. Der dritte Protein- oder Peptidabschnitt weist eine Aminosäuresequenz auf, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D oder einer Teilsequenz davon entspricht. Alternativ besteht der dritte Protein- oder Peptidabschnitt aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D oder einer Teilsequenz davon entspricht.
Bevorzugt handelt es sich bei dem oben genannten ACE2 um humanes ACE2. Weiter bevorzugt handelt es sich bei dem oben genannten Surfactant-Protein A um humanes Surfactant-Protein A. Weiter bevorzugt handelt es sich bei dem oben genannten Surfactant-Protein D um humanes Surfactant-Protein D.
Unter dem Ausdruck „Teilsequenz“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Teilsequenz einer Aminosäuresequenz verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Surfactant“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine von Alveolarepithelzellen des Typs II (Pneumozyten des Typs II) in der Lunge produzierte und auf die Oberfläche des alveolären Epithels sezernierte oberflächenaktive Zusammensetzung verstanden werden. Den größten Anteil der Zusammensetzung stellen dabei Lipide dar. Daneben weist die Zusammensetzung Proteine, unter anderem Surfactant-Proteine, insbesondere die vorgenannten Proteine Surfactant-Protein A und Surfactant-Protein D, auf.
Die Erfindung zeichnet sich insbesondere durch nachfolgende Vorteile aus:

- Die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts beinhaltet mit besonderem Vorteil das Bindungsmotiv bzw. -sequenz für SARS-CoV-2. Dadurch ist das Protein oder Peptid in der Lage, im Sinne einer kompetitiven Antagonisierung eine Bindung des Virus an seine Wirtszellen, insbesondere an menschliche Alveolarepithelzellen des Typs II, und mithin eine Internalisierung des Virus in seine Wirtszellen, insbesondere in menschliche Alveolarepithelzellen des Typs II, zu reduzieren oder sogar vollständig zu verhindern. Dadurch ist vorteilhafterweise eine Prophylaxe und/oder Behandlung, insbesondere symptomatische Behandlung, insbesondere von durch SARS-CoV-2 hervorgerufene Infektionen und/oder Infektionskrankheiten und/oder Folgeerkrankungen davon erzielbar.
- Die Verwendung eines vollständigen ACE2-Moleküls oder eines ACE2-Dimers, wie beispielsweise in der EP 2 543 724 A2 beschrieben, ist somit vorteilhafterweise entbehrlich.
- Entspricht die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts dem Surfactant-Protein A oder einer Teilsequenz davon, ist das erfindungsgemäße Protein oder Peptid ferner in der Lage, eine Approximation von Makrophagen, insbesondere Alveolarmakrophagen, an SARS-CoV-2-Viruspartikel, die an den ersten Protein- oder Peptidabschnitt des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids gebunden sind, zu bewirken. Dadurch ist mit besonderem Vorteil eine immunogene Virusneutralisation erzielbar.
- Entspricht die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts dem Surfactant-Protein D oder einer Teilsequenz davon, ist das erfindungsgemäße Protein oder Peptid ferner ebenfalls in der Lage, über eine Approximation von Makrophagen, insbesondere Alveolarmakrophagen, an SARS-CoV-2-Viruspartikel, die an den ersten Protein- oder Peptidabschnitt des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids gebunden sind, eine immunogene Virusneutralisation zu bewirken. In diesem Fall kommt als weiterer Vorteil hinzu, dass über die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts eine weitere Bindungsstelle für Viruspartikel von SARS-CoV-2 geschaffen wird. Dadurch kann eine Virusabsättigung durch das erfindungsgemäße Protein oder Peptid zusätzlich optimiert und das Risiko, dass Viruspartikel, insbesondere von SARS-CoV-2, Wirtszellen, insbesondere Alveolarepithelzellen des Typs II, befallen, zusätzlich reduziert oder sogar vollständig vermieden werden. Ferner ist hierdurch vorteilhafterweise eine Unterstützung der Phagozytose von gebundenen Virus-Partikeln realisierbar.
- Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch die im vorherigen Absatz beschriebene Virusabsättigung durch das erfindungsgemäße Protein oder Peptid eine aktive Agonisierung des transmebranären ACE2-Rezeptors reduziert oder sogar vollständig vermieden werden kann. Dadurch kann das Risiko, dass sich durch Aktivierung nachfolgender Signaltransduktionskaskaden weitreichende Schäden, wie beispielsweise Schädigungen an den Blutgefäßen, und damit assozierte pathogene Prozesse, wie beispielsweise Blutgerinnungstörungen, manifestieren, ebenfalls reduziert oder sogar vollständig eliminiert werden.
- Weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz des Surfactant-Proteins A entspricht, sowie eine Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz des Surfactant-Proteins D entspricht, auf, können die in den beiden vorherigen Absätzen beschriebenen positiven Effekte vorteilhafterweise kombiniert werden.
- Wie oben erwähnt, ist mit dem Protein oder Peptid eine Virusneutralisierung, insbesondere spezifische Virusneutralisierung, erzielbar. Eine hierauf basierende Behandlung hat gegenüber einer viruziden Behandlung den Vorteil, dass sie deutlich nebenwirkungsärmer oder nahezu nebenwirkungsfrei ist. Dadurch, dass insbesondere eine Virusabtötung nicht stattfindet, sondern die aktive virale Oberfläche durch Bindung an das Protein oder Peptid überwiegend bedeckt wird, wodurch wiederum eine virale Zellinvasion gehemmt oder verhindert wird, ist der Körper eines Patienten trotz abgeschwächter viraler Krankheitsaktivität in der Lage, Antikörper gegen das Virus und mithin eine entsprechende Immunität zu entwickeln.
- Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts und/oder dritten Protein- oder Peptidabschnitts generell eine Affinität des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids zu einem Surfactant eines Patienten hergestellt werden kann. Denn sowohl das Surfactant-Protein A als auch das Surfactant-Protein D sind Bestandteil des Surfactants. Dadurch kann mit besonderem Vorteil einem Kollaps von Alveolen eines Patienten entgegengetreten werden.

Bevorzugt ist das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz der zytoplasmatischen Kette von ACE2 entspricht. Dadurch kann vorteilhafterweise vermieden werden, dass unerwünschte sogenannte Second-Messenger-Prozesse in Wirtszellen, insbesondere in Alveolarepithelzellen des Typs II, initiiert werden.
Weiter bevorzugt ist das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz der transmembranären Domäne von ACE2 oder einer Teilsequenz davon entspricht. Dadurch kann mit besonderem Vorteil eine Integration des Proteins oder Peptids in eine Membran von Wirtszellen, insbesondere Alveolarepithelzellen des Typs II, und mithin eine Vergrößerung der zellulären Bindungsoberfläche für das Virus und somit eine Infektionsaugmentierung verhindert werden.
Weiter bevorzugt weist die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Teilsequenz davon auf oder weiter bevorzugt besteht die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einer Teilsequenz davon. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 entspricht den Aminosäureresten 31 bis 353 der ektopen Domäne von ACE2.
Ferner weist das Protein oder Peptid bevorzugt eine Anzahl von protektiven Aminosäuresequenzen, d.h. eine oder mehrere protektive Aminosäuresequenzen, auf. Die Anzahl protektiver Aminosäuresequenzen bewirkt vorteilhafterweise, dass sich die Aminosäuresequenzen des ersten und zweiten Protein- oder Peptidabschnittes räumlich korrekt entfalten und somit ihre Funktionen (insbesondere Virusbindung sowie Makrophagenapproximation) ohne Beeinträchtigungen ausüben können. Ferner kann die Anzahl protektiver Aminosäuresequenzen vorteilhafterweise zu einer verringerten Oxidationsanfälligkeit des Proteins oder Peptids beitragen.
Weist das Protein oder Peptid mehrere protektive Aminosäuresequenzen auf, können diese gleich oder unterschiedlich sein. Bevorzugt weist das Protein oder Peptid mehrere, insbesondere 2, unterschiedliche protektive Aminosäuresequenzen auf.
Grundsätzlich kann das Protein oder Peptid eine vor, insbesondere unmittelbar vor, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete protektive Aminosäuresequenz mit 1 bis 30 Aminosäureresten, insbesondere 5 bis 20 Aminosäureresten, bevorzugt 7 bis 15 Aminosäureresten, insbesondere 10 Aminosäureresten, und/oder eine nach, insbesondere unmittelbar nach, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete protektive Aminosäuresequenz mit 1 bis 352 Aminosäureresten, insbesondere 5 bis 250 Aminosäureresten, bevorzugt 7 bis 50 Aminosäureresten, insbesondere 10 Aminosäureresten, aufweisen oder aus einer entsprechenden Anzahl von Aminosäureresten bestehen.
Insbesondere kann das Protein oder Peptid, bevorzugt vor, insbesondere unmittelbar vor, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt eine protektive Aminosäuresequenz, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2, und/oder, bevorzugt nach, insbesondere unmittelbar nach, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt eine protektive Aminosäuresequenz, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:3, aufweisen.
Vorzugsweise weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine protektive Aminosäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID NO:2, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine protektive Aminosäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID NO:3, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, auf.
Weiter bevorzugt weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine zwischen dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete protektive Aminosäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID NO:3, auf.
Besonders bevorzugt weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine erste protektive Aminosäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID NO:2, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine zweite protektive Aminosäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID NO:3, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, auf. Vorzugsweise ist die zweite protektive Aminosäuresequenz zwischen dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder eine Teilsequenz davon auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder einer Teilsequenz davon. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 entspricht den Aminosäureresten 21 bis 363 der ektopen Domäne von ACE2.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder eine Teilsequenz davon auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder einer Teilsequenz davon. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 entspricht der Aminosäuresequenz des Surfactant-Proteins A.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts oder die Aminosäuresequenz des dritten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder eine Teilsequenz davon auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts oder die Aminosäuresequenz des dritten Protein- oder Peptidabschnitts aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder einer Teilsequenz davon. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 entspricht der Aminosäuresequenz des Surfactant-Proteins D.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist der zweite Protein- oder Peptidabschnitt in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids hinter dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist der dritte Protein- oder Peptidabschnitt in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids vor oder hinter dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz ist, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 5, entspricht. Dies kann im Falle einer beabsichtigten zellzulären Internalisierung des Proteins oder Peptids von Vorteil sein.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz ist, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 6, entspricht. Dies kann ebenfalls im Falle einer beabsichtigten zellzulären Internalisierung des Proteins oder Peptids von Vorteil sein.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 5, entspricht, und frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 6, entspricht, ist. Dies kann ebenso im Falle einer beabsichtigten zellzulären Internalisierung des Proteins oder Peptids von Vorteil sein.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid ferner eine Anzahl von pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen, d.h. eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz oder mehrere pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenzen, auf. Insbesondere kann das Protein oder Peptid pro Molekül wenigstens zwei, vorzugsweise nur zwei, pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenzen aufweisen.
Weist das Protein oder Peptid mehrere pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenzen auf, können diese gleich oder unterschiedlich sein. Bevorzugt weist das Protein oder Peptid mehrere, beispielsweise 2, gleiche pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenzen auf.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine zwischen dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz auf.
Bevorzugt weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, auf.
Weiter bevorzugt weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine zwischen dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und einer Linkereinheit des Proteins oder Peptids angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz auf. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Linkereinheit wird auf die noch folgende Beschreibung Bezug genommen.
Besonders bevorzugt weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine erste pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine zweite pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, auf. Vorzugsweise ist die zweite pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz zwischen dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und einer Linkereinheit des Proteins oder Peptids angeordnet oder ausgebildet. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Linkereinheit wird ebenfalls auf die noch folgende Beschreibung Bezug genommen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine zwischen dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz auf.
Alternativ kann das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine zwischen dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz aufweisen.
Ferner kann das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, aufweisen.
Ferner kann das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine zwischen dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt und einer Linkereinheit des Proteins oder Peptids angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz aufweisen. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Linkereinheit wird ebenso auf die noch folgende Beschreibung Bezug genommen.
Insbesondere kann das Protein oder Peptid in Richtung des C-Terminus eine erste pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die vor, insbesondere unmittelbar vor, dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, und eine zweite pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz, die nach, insbesondere unmittelbar nach, dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet oder ausgebildet ist, aufweisen. Vorzugsweise ist die zweite pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz zwischen dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt und einer Linkereinheit des Proteins oder Peptids angeordnet oder ausgebildet. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Linkereinheit wird ebenfalls auf die noch folgende Beschreibung Bezug genommen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid ferner eine zwischen dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz und eine zwischen dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz auf.
Vorzugsweise weist/weisen die pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz/pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen basische Aminosäurereste auf oder vorzugsweise besteht/bestehen die pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz/pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen aus basischen Aminosäureresten. Die basischen Aminosäurereste sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Histidinreste, Lysinreste, Argininreste und Kombinationen davon. Durch eine entsprechende pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz bzw. durch entsprechende pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenzen kann der pH-Wert in einem Extrazellularraum erhöht werden. Dies erschwert mit besonderem Vorteil die bevorzugt bei einem niedrigen pH-Wert ablaufende Internalisierung von Coronavirus-Partikeln, insbesondere von SARS-CoV-2-Partikeln. Ein weiterer Vorteil ist, dass aufgrund der Hydrophilie der vorgenannten basischen Aminosäurereste eine Integration des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids in eine Zellmembran, insbesondere von Alveolarepithelzellen des Typs II, erschwert oder vollständig vermieden wird. Dadurch kann vorteilhafterweise eine unerwünschte Bindung von Viruspartikeln an Wirtszellen und mithin eine Infektionsaugmentierung verhindert werden.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenz/bei den pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen um eine repetitive Aminosäuresequenz/repetitive Aminosäuresequenzen, insbesondere mit oder aus Wiederholungseinheiten aus Histidinresten und/oder Lysinresten und/oder Argininresten, vorzugsweise mit oder aus Wiederholungseinheiten aus Histidinresten, Lysinresten und Argininresten. Vorzugsweise sind die Histidinreste, Lysinreste und Argininreste in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids hintereinander, insbesondere unmittelbar hintereinander, angeordnet oder ausgebildet.
Grundsätzlich kann/können die pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz/pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen 1 bis 100 Aminosäurereste, insbesondere 10 bis 50 Aminosäurereste, bevorzugt 20 bis 40, insbesondere 30, Aminosäurereste, aufweisen oder aus einer entsprechenden Anzahl von Aminosäureresten bestehen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist die pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz/weisen die pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen (jeweils) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht die pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz/bestehen die pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen (jeweils) aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid ferner eine Linkereinheit, insbesondere eine in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids hinter, insbesondere unmittelbar hinter, dem zweiten oder dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete oder ausgebildete Linker-Einheit auf.
Bei der Linker-Einheit kann es sich insbesondere um eine Peptidlinkereinheit, d.h. um eine Peptidbindungen aufweisende Linkereinheit, handeln.
Die Linkereinheit kann eine Anzahl von Cysteinresten, d.h. einen Cysteinrest oder mehrere Cysteinreste, insbesondere 1 Cysteinrest bis 5 Cysteinreste, aufweisen oder aus einer Anzahl von Cysteinresten, d.h. einem Cysteinrest oder mehreren Cysteinresten, insbesondere 1 Cysteinrest bis 5 Cysteinresten, bestehen. Alternativ oder in Kombination kann die Linkereinheit eine Anzahl von Glutathionresten, d.h. einen Glutathionrest oder mehrere Glutathionreste, aufweisen oder aus einer Anzahl von Glutathionresten, d.h. einem Glutathionrest oder mehreren Glutathionresten, bestehen. Alternativ oder in Kombination kann die Linkereinheit Glutathion-S-Transferase aufweisen oder aus Glutathion-S-Transferase bestehen. Alternativ oder in Kombination kann die Linkereinheit eine Anzahl von Penicillaminresten, d.h. einen Penicillaminrest oder mehrere Penicillaminreste, aufweisen oder aus einer Anzahl von Penicillaminresten, d.h. einem Penicillaminrest oder mehreren Penicillaminresten, bestehen. Alternativ oder in Kombination kann die Linkereinheit das Peptid SpyTag aufweisen oder aus dem Peptid SpyTag bestehen. Alternativ oder in Kombination kann die Linkereinheit das Protein SpyCatcher aufweisen oder aus dem Protein SpyCatcher bestehen.
Bevorzugt weist die Linkereinheit eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 auf oder bevorzugt besteht die Linkereinheit aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10.
Alternativ bevorzugt weist die Linkereinheit eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 11 auf oder alternativ bevorzugt besteht die Linkereinheit aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 11. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 11 entspricht der Aminosäuresequenz von Glutathion-S-Transferase.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Protein oder Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15.
Ferner kann es bevorzugt sein, dass das Protein oder Peptid aus dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt oder zusätzlich, d.h. neben dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt, aus dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und/oder dem dritten Protein- und/oder Peptidabschnitt und/oder einer oder mehreren protektiven Aminosäuresequenzen und/oder einer oder mehreren pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen und/oder einer Linker-Einheit besteht. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des ersten Protein- oder Peptidabschnitts und/oder des zweiten ersten Protein- oder Peptidabschnitts und/oder des dritten Protein- oder Peptidabschnitts und/oder der protektiven Aminosäuresequenz(en) und/oder der pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenz(en) wird vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Protein oder Peptid um ein Protein oder Peptid zur Anwendung bei der Prophylaxe, d.h. Vorbeugung, und/oder Behandlung einer durch Viren, bevorzugt durch Coronaviren, besonders bevorzugt durch SARS-CoV-2, und/oder einer durch Bakterien hervorgerufenen Infektion und/oder Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, und/oder einer Folgeerkrankung davon.
Bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, kann es sich um eine akute oder chronische Atemwegserkrankung handeln. Vorzugsweise ist die Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenentzündung (Pneumonie), akute Bronchitis, Erkältung, Grippe, Mandelentzündung, Kehlkopfentzündung (Laryngitis), Nebenhöhlenentzündung (Sinusitis), Asthma bronchiale, chronische Bronchitis und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD).
Bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Lungenentzündung.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Viruspneumonie, d.h. um eine virale, d.h. durch Viren hervorgerufene, Lungenentzündung.
Höchst bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um COVID-19, d.h. um eine durch SARS-CoV-2 hervorgerufene Atemwegserkrankung, insbesondere Lungenentzündung.
Die Folgeerkrankung ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonale Hypertonie, akutes Organversagen wie akutes Lungenversagen (ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome) oder akutes Nierenversagen, Lungenfibrose, Thrombosen, Thrombembolien, Blutgefäßschädigungen, Blutgerinnungsstörungen und entzündliche Erkrankungen wie PIMS (Paediatric Inflammatory Multisystem Syndrome) oder Kawasaki-Syndrom.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, insbesondere eine DNA-Sequenz. Die Nukleinsäure, insbesondere DNA-Sequenz, codiert für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15.
Bevorzugt codiert die Nukleinsäure, insbesondere DNA-Sequenz, für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Nukleinsäure, insbesondere der vorgenannten Aminosäuresequenzen, wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die im Rahmen des ersten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die vorgenannten Aminosäuresequenzen beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Nukleinsäure gemäß zweitem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor.
Der Expressionsvektor weist eine Nukleinsäure, insbesondere DNA-Sequenz, gemäß zweitem Erfindungsaspekt auf.
Bevorzugt weist der Expressionsvektor eine Nukleinsäure, insbesondere DNA-Sequenz, auf, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15 codiert.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Expressionsvektors, insbesondere der vorgenannten Nukleinsäure und Aminosäuresequenzen, wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die im Rahmen des ersten und zweiten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die vorgenannte Nukleinsäure sowie die vorgenannten Aminosäuresequenzen beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für den Expressionsvektor gemäß drittem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle.
Die Wirtszelle enthält eine Nukleinsäure, insbesondere DNA-Sequenz, gemäß zweitem Erfindungsaspekt und/oder einen Expressionsvektor gemäß drittem Erfindungsaspekt.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Wirtszelle, insbesondere der vorgenannten Nukleinsäure sowie des vorgenannten Expressionsvektors, wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die im Rahmen des ersten, zweiten und dritten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die vorgenannte Nukleinsäure sowie den vorgenannten Expressionsvektor beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Wirtszelle gemäß viertem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Konjugat, insbesondere Biokonjugat, welches ein Nanopartikel und ein Protein oder Peptid gemäß erstem Erfindungsaspekt aufweist oder aus einem Nanopartikel und einem Protein oder Peptid gemäß erstem Erfindungsaspekt besteht. Das Konjugat gemäß fünftem Erfindungsaspekt kann im Sinne der vorliegenden Erfindung auch als Nanopartikel-Protein-Konjugat oder Nanopartikel-Peptid-Konjugat bezeichnet werden.
Unter dem Ausdruck „Nanopartikel“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Partikel verstanden werden, dessen Abmessungen, insbesondere dessen Durchmesser, bevorzugt mittlerer Durchmesser, in einem Bereich von 1 nm bis 120 nm liegt. Unter dem Ausdruck „Durchmesser“ soll in diesem Zusammenhang im Falle eines kugelförmigen Nanopartikels der Kugeldurchmesser, d.h. der doppelte Radius der Kugel, verstanden werden. Im Falle eines nicht kugelförmigen Nanopartikels soll unter dem Ausdruck „Durchmesser“ der größtmögliche Abstand verstanden werden, den zwei Punkte entlang einer Umfangslinie des Nanopartikels zueinander einnehmen können.
Die Verwendung eines Nanopartikels als Konjugationspartner hat insbesondere den Vorteil, dass sich hierdurch im Körper eines Patienten eine Verdichtung des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids und insbesondere von optionalen medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen, insbesondere Virostatika, an einem Behandlungssitus, beispielsweise der Lunge eines Patienten, realisieren lassen.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Transport von medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen, insbesondere in die Lungenbläschen eines Patienten, durch die Verwendung eines Nanopartikels erleichtert werden kann.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass das erfindungsgemäße Konjugat durch das Nanopartikel leichter abgehustet werden kann.
Vorzugsweise ist der erste Protein- oder Peptidabschnitt des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids auf der Oberfläche des Nanopartikels zentrifugal, d.h. von der Oberfläche des Nanopartikels wegweisend, ausgerichtet oder orientiert. Eine solche Ausrichtung bzw. Orientierung wird insbesondere durch im erfindungsgemäßen Protein oder Peptid enthaltene positiv geladene Aminosäurereste, insbesondere Lysin- und/oder Argininreste, begünstigt.
Dadurch kommt es zu einer gegenseitigen Abstoßung von Molekülen des erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids auf der Oberfläche des Nanopartikels, wobei der erste Protein- oder Peptidabschnitt eines jeweiligen Protein- oder Peptidmoleküls zentrifugal ausgerichtet wird. Dadurch werden die für die Virusbindung verantwortlichen Aminosäuresequenzen für eine Ligandisierung mit insbesondere SARS-CoV-2-Partikeln präpariert. Dies bewirkt vorteilhafterweise eine Optimierung der Virusbindung und mithin eine Verbesserung der virostatischen Eigenschaften des Konjugats.
Bevorzugt weist das Konjugat einen Kern-Hülle-Aufbau oder eine Kern-Hülle-Struktur auf. Der Kern weist vorzugsweise das Nanopartikel auf oder besteht vorzugsweise aus dem Nanopartikel. Die Hülle weist vorzugsweise das erfindungsgemäße Protein oder Peptid auf oder besteht vorzugsweise aus dem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid.
Weiter bevorzugt ist das Protein oder Peptid dabei über eine Linkereinheit mit dem Nanopartikel oder der Oberfläche des Nanopartikels verbunden. Beispielsweise kann das Protein oder Peptid über eine Glutathion-S-Transferase-Glutathion-Bindung oder über eine SpyTag-SpyCatcher-Bindung mit dem Nanopartikel oder der Oberfläche des Nanopartikels verbunden sein. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Linkereinheit wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die insoweit im Rahmen des ersten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Linkereinheit beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für das Konjugat gemäß fünftem Erfindungsaspekt.
Bevorzugt ist das Protein oder Peptid kovalent mit dem Nanopartikel oder einer Oberfläche des Nanopartikels verbunden.
Alternativ oder in Kombination kann das Protein oder Peptid bevorzugt nichtkovalent, beispielsweise durch Van-der-Waals-Kräfte, mit dem Nanopartikel oder einer Oberfläche des Nanopartikels verbunden sein.
Insbesondere bevorzugt ist das Protein oder Peptid durch Physisorption und/oder Chemisorption an einer Oberfläche des Nanopartikels gebunden.
Grundsätzlich kann das Nanopartikel eine eckenlose, insbesondere kugelförmige, ovale oder elliptische, oder eine polyederförmige, beispielsweise würfel-, quader-, prismen-, pyramiden- oder spatenförmige, Form oder Gestalt besitzen.
Ferner kann das Nanopartikel einen Durchmesser, insbesondere mittleren Durchmesser, von 40 nm bis 120 nm, insbesondere 60 nm bis 120 nm, vorzugsweise 80 nm bis 120 nm, aufweisen. Die in diesem Absatz offenbarten Durchmesser, insbesondere mittleren Durchmesser, haben den Vorteil, dass das Nanopartikel und mithin das Konjugat einschließlich etwaiger daran gebundener Virus-Partikel nicht in eine Zelle, insbesondere Alveolarepithelzelle des Typs II, internalisiert werden kann.
Alternativ kann das Nanopartikel einen Durchmesser, insbesondere mittleren Durchmesser, von 1 nm bis 40 nm, insbesondere 1 nm bis 30 nm, vorzugsweise 5 nm bis 20 nm, aufweisen. Durch die in diesem Absatz offenbarten Durchmesser, insbesondere mittleren Durchmesser, kann eine Internalisierung des Nanopartikels und mithin des Konjugats in eine Zelle, insbesondere Alveolarepithelzelle des Typs II, stattfinden. Eine solche Internalisierung des Konjugats kann abhängig von der Natur des Nanopartikels unter therapeutischen Gesichtspunkten vorteilhaft sein. Handelt es sich bei dem Nanopartikel beispielsweise um ein Silbernanopartikel, können bei einer Zellinvasion auf der Oberfläche des Silbernanopartikels chemische Veränderungen, beispielsweise Silberoxid-Radikale, auftreten, die nicht nur für die Zelle, sondern auch für das Virus toxisch wirken. Eine derartige Intoxikation betrifft vorteilhafterweise nur solche Zellen, die ohnehin schon in besonderer Weise durch Viren aufgesättigt sind und deren Apoptose eine weitere Virusreplikation in diesen Zellen verhindert. Durch eine nichtkovalente Bindung zwischen dem Nanopartikel und dem Protein oder Peptid lässt sich die toxische Wirkung vorteilhafterweise zusätzlich erhöhen, da in diesem Fall die konjugierten Silbernanopartikel im intrazellulären Raum der Zelle einer vermehrten Oxidation ausgesetzt werden, wodurch es zu einer verstärkten Freisetzung von Silberoxid-Radikalen und damit zu einer vermehrten Apoptose der Zelle, insbesondere einer Alveolarepithelzelle des Typs II, kommt.
Wie bereits erwähnt, kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, wenn das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 5, entspricht, und/oder frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 6, entspricht, ist. Dies kann insbesondere dann von Vorteil sein, wenn eine Internalisierung des Konjugats in Wirtszellen, insbesondere in Alveolarepithelzellen des Typs II, beabsichtigt ist.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Nanopartikel um ein antimikrobiell wirksames, insbesondere bakteriostatisches und/oder virostatisches, Nanopartikel.
Unter dem Ausdruck „antimikrobiell wirksames Nanopartikel“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Nanopartikel verstanden werden, das in der Lage ist, die Vermehrungsfähigkeit und/oder Infektiosität von Mikroorganismen einschließlich von Viren zu reduzieren oder sie abzutöten bzw. zu inaktivieren.
Unter dem Ausdruck „bakteriostatisches Nanopartikel“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Nanopartikel verstanden werden, das in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Vermehrung von Bakterien zu hemmen.
Unter dem Ausdruck „virostatisches Nanopartikel“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Nanopartikel verstanden werden, das in der Lage ist, die Vermehrung von Viren zu hemmen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung weist das Nanopartikel ein Metall auf oder in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besteht das Nanopartikel aus Metall. Das Metall ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Zink und Kombinationen, insbesondere Legierungen, von wenigstens zwei der vorgenannten Metalle.
Erfindungsgemäß kann ein Silber- oder Goldnanopartikel, d.h. ein aus Silber oder Gold bestehendes Nanopartikel, besonders bevorzugt sein. Die Verwendung eines Silbernanopartikels hat generell den Vorteil, dass es sich vergleichsweise leicht mit einem Protein oder Peptid konjugieren lässt. Zudem ist es in der Lage, zelltoxisch (über Radikalbildung) und mithin virostatisch zu wirken. Die Verwendung eines Goldnanopartikels hat den Vorteil, dass es aufgrund seiner chemischen Inertheit weniger in der Lage ist, zelltoxische Prozesse zu initiieren. Dies macht es beispielsweise besonders für eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung geeignet. Ferner können Goldnanopartikel relativ preiswert bereitgestellt werden.
Ferner kann das Nanopartikel eine Keramik aufweisen oder aus einer Keramik bestehen.
Weiter bevorzugt kann das Nanopartikel ein organisches Molekül, insbesondere ein organisches Trägermolekül, aufweisen oder aus einem organischen Molekül, insbesondere einem organischen Trägermolekül, bestehen.
Unter dem Ausdruck „organisches Trägermolekül“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein organisches Molekül verstanden werden, das in der Lage ist, als Träger für ein weiteres Molekül, vorzugsweise einen medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoff, wie beispielsweise ein Virostatikum, zu wirken.
Zum Beispiel kann es sich bei dem organischen Molekül, insbesondere organischen Trägermolekül, um ein Polymer oder ein Biomolekül, d.h. um ein in der Natur vorkommendes Molekül, wie beispielsweise ein Lipid, handeln.
Vorzugsweise ist das organische Molekül, insbesondere organische Trägermolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polysaccharide, Chitosan, Proteine, Polyhydroxyalkanoate, Polylactid, Poly(lactid-co-glycolid), Polyglycolid, Poly-(3-hydroxybuttersäure), Poly-(4-hydroxybuttersäure), Polytrimethylencarbonat, Poly-p-dioxanon, Poly(amidoamine), Lipide, Polyethylenglykole und Kombinationen, insbesondere Mischungen, von wenigstens zwei der vorgenannten organischen Moleküle, insbesondere organischen Trägermoleküle.
Handelt es sich bei dem organischen Molekül, insbesondere organischen Trägermolekül, um ein Protein, kann es bevorzugt sein, wenn das Protein unmittelbar, d.h. ohne eine Linkereinheit, mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid verknüpft ist.
Weiter bevorzugt kann das organische Molekül eine Käfig-, Kapsel- oder Micellenstruktur ausbilden. Dies ist unter Trägergesichtspunkten, insbesondere im Hinblick auf einen medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoff, besonders vorteilhaft. Insbesondere kann hierdurch eine verzögerte Freisetzung beispielsweise eines medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoffes realisiert werden.
Ferner ist es bevorzugt, wenn das Konjugat einen medizinischen oder pharmazeutischen Wirkstoff, insbesondere ein Virostatikum, aufweist. Bevorzugt ist der medizinische oder pharmazeutische Wirkstoff, insbesondere das Virostatikum, in einer Käfig-, Kapsel- oder Micellenstruktur des organischen Moleküls enthalten. Dadurch können dem Konjugat vorteilhafterweise viruzide Eigenschaften übertragen werden. Die Viruzidität eines entsprechenden Konjugats liegt insbesondere darin begründet, dass beispielsweise Virostatika auf diese Weise an Virus-partikel, insbesondere Viruspartikel von SARS-CoV-2, die an das erfindungsgemäße Protein oder Peptid gebunden sind, approximiert werden können.
Weiter bevorzugt kann das Nanopartikel eine Beschichtung aufweisen. Dabei kann das Nanopartikel wenigstens teilweise, insbesondere nur teilweise oder vollständig, mit der Beschichtung bedeckt sein. Die Beschichtung kann Citrat und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) aufweisen oder aus Citrat und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) bestehen. Insbesondere bevorzugt ist ein mit Citrat beschichtetes Silber- oder Goldnanopartikel, d.h. ein aus Silber oder Gold bestehendes Nanopartikel, das mit Citrat beschichtet ist. Alternativ bevorzugt ist ein mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtetes Silber- oder Goldnanopartikel, d.h. ein Nanopartikel aus Silber oder Gold, das mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet ist.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Konjugat um ein Konjugat zur Anwendung bei der Prophylaxe, d.h. Vorbeugung, und/oder Behandlung einer durch Viren, bevorzugt durch Coronaviren, besonders bevorzugt durch SARS-CoV-2, und/oder einer durch Bakterien hervorgerufenen Infektion und/oder Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, und/oder einer Folgeerkrankung davon.
Bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, kann es sich um eine akute oder chronische Atemwegserkrankung handeln. Vorzugsweise ist die Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenentzündung (Pneumonie), akute Bronchitis, Erkältung, Grippe, Mandelentzündung, Kehlkopfentzündung (Laryngitis), Nebenhöhlenentzündung (Sinusitis), Asthma bronchiale, chronische Bronchitis und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD).
Bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Lungenentzündung.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Viruspneumonie, d.h. um eine virale, d.h. durch Viren hervorgerufene, Lungenentzündung.
Höchst bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um COVID-19, d.h. um eine durch SARS-CoV-2 hervorgerufene Atemwegserkrankung, insbesondere Lungenentzündung.
Die Folgeerkrankung ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonale Hypertonie, akutes Organversagen wie akutes Lungenversagen (ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome) oder akutes Nierenversagen, Lungenfibrose, Thrombosen, Thrombembolien, Blutgefäßschädigungen, Blutgerinnungsstörungen, und entzündliche Erkrankungen wie PIMS (Paediatric Inflammatory Multisystem Syndrome) oder Kawasaki-Syndrom.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Konjugats, insbesondere des Proteins oder Peptids, wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des ersten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf das Protein oder Peptid beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für das Konjugat gemäß fünftem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, d.h. ein Medikament oder Arzneimittel. Die pharmazeutische Zusammensetzung weist ein Protein oder Peptid gemäß erstem Erfindungsaspekt und/oder ein Konjugat gemäß fünftem Erfindungsaspekt auf.
Bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine inhalative Verabreichung, insbesondere Pulverinhalation, hergerichtet oder bevorzugt wird die pharmazeutische Zusammensetzung für eine inhalative Verabreichung, insbesondere Pulverinhalation, verwendet. Eine inhalative Verabreichung hat den Vorteil, dass sich hierdurch im Falle von SARS-CoV-2 unmittelbar das Zielorgan Lunge adressieren lässt. Insbesondere kann es bevorzugt sein, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Verabreichung in Form eines Aerosols, insbesondere zusammen mit einem Treibgas, wie beispielsweise Kohlendioxid, Stickstoff, Dimethylether, Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan oder einem Gemisch aus wenigstens zwei der vorgenannten Treibgase, hergerichtet ist oder für eine entsprechende Verabreichung verwendet wird. Eine solche Verabreichung kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn ein erfindungsgemäßes Konjugat verabreicht werden soll. Eine Pulverinhalation der pharmazeutischen Zusammensetzung kann bevorzugt sein, wenn ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid (ohne Konjugation mit einem Nanopartikel) verabreicht werden soll. Die menschliche Lungenoberfläche umfasst ca. 100 m² und eignet sich somit sehr gut für eine derart topische Anwendung. Eine inhalative Verabreichung hat ferner den Vorteil, dass hierdurch eine gezielte Einwirkung auf die Lunge möglich ist, so dass Nebenwirkungen, beispielsweise auf den Kreislauf eines Patienten, wenn überhaupt, nur eingeschränkt zu erwarten sind.
Alternativ bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung hergerichtet oder alternativ bevorzugt wird die pharmazeutische Zusammensetzung für eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung verwendet. Durch eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung lassen sich vorteilhafterweise als Zielorgane insbesondere Blutgefäße sowie das Herz adressieren. Hierfür geeignet sind beispielsweise erfindungsgemäße Konjugate mit Goldnanopartikeln. Sowohl Blutgefäße als auch Herz stellen sekundäre Wirkstätten von SARS-CoV-2 dar. Im Falle einer systemischen, insbesondere intravenösen, Verabreichung kann es erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt sein, wenn das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 5, entspricht, und/oder frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 6, entspricht, ist.
Alternativ bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine orale Verabreichung hergerichtet oder alternativ bevorzugt wird die pharmazeutische Zusammensetzung für eine orale Verabreichung verwendet. Im Falle einer oralen Verabreichung kann als Zielorgan vor allem der Darm eines Patienten, der allgemein einen Viruspool beinhaltet, adressiert werden. Im Falle einer oralen Verabreichung kann es erfindungsgemäß ebenso bevorzugt sein, wenn das Protein oder Peptid frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 5, entspricht, und/oder frei von einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 6, entspricht, ist.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung bei der Prophylaxe, d.h. Vorbeugung, und/oder Behandlung einer durch Viren, bevorzugt durch Coronaviren, besonders bevorzugt durch SARS-CoV-2, und/oder einer durch Bakterien hervorgerufenen Infektion und/oder Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, und/oder einer Folgeerkrankung davon.
Bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, kann es sich um eine akute oder chronische Atemwegserkrankung handeln. Vorzugsweise ist die Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenentzündung (Pneumonie), akute Bronchitis, Erkältung, Grippe, Mandelentzündung, Kehlkopfentzündung (Laryngitis), Nebenhöhlenentzündung (Sinusitis), Asthma bronchiale, chronische Bronchitis und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD).
Bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Lungenentzündung.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um eine Viruspneumonie, d.h. um eine virale, d.h. durch Viren hervorgerufene, Lungenentzündung.
Höchst bevorzugt handelt es sich bei der Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, um COVID-19, d.h. um eine durch SARS-CoV-2 hervorgerufene Atemwegserkrankung, insbesondere Lungenentzündung.
Die Folgeerkrankung ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonale Hypertonie, akutes Organversagen wie akutes Lungenversagen (ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome) oder akutes Nierenversagen, Lungenfibrose, Thrombosen, Thrombembolien, Blutgefäßschädigungen, Blutgerrinungsstörungen, und entzündliche Erkrankungen wie PIMS (Paediatric Inflammatory Multisystem Syndrome) oder Kawasaki-Syndrom.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere des Proteins oder Peptids sowie des Konjugats, wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des ersten und fünften Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf das Protein oder Peptid sowie das Konjugat beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß sechstem Erfindungsaspekt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Form von Beispielen. Dabei können Einzelmerkmale jeweils für sich alleine oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die bevorzugten Ausführungsformen dienen lediglich der weiteren Erläuterung und dem besseren Verständnis der Erfindung, ohne diese hierauf zu beschränken.
BEISPIELTEIL
1. Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH (gemäß SEQ ID NO: 8)
1.1 Expression
Es wurde zunächst ein Expressionsvektor mit dem Selektionsmarker dhfr (kodiert für das Enzym Dihydrofolatreduktase) und dem Promotor CAG (Cytomegalovirus, β-Actin, β-Globin) erstellt. Durch diesen Expressionsvektor war es möglich, besonders stabile Expressionszelllinien zu erhalten, die hohe Ausbeuten des Proteinproduktes mit konstanter Qualität liefern.
Anschließend wurden die für die ektope Domäne von ACE2 kodierende Gensequenz, die für das Surfactant-Protein A kodierende Gensequenz, eine Nukleinsäuresequenz codierend für eine protektive Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, eine Nukleinsäuresequenz codierend für eine protektive Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 sowie zwei weitere Nukleinsäuresequenzen jeweils codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 in den Expressionsvektor unter Erhalt des Expressionsvektors p-protekekt-ACE2-protek-pH-A-pH kloniert. Das Klonieren erfolgte derart, dass das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz codierend für die protektive Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 mit dem 5'-Ende der für die ektope Domäne von ACE2 kodierenden Gensequenz, das 3'-Ende der für die ektope Domäne von ACE2 kodierenden Gensequenz mit dem 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz codierend für die protektive Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz codierend für die protektive Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 mit dem 5'-Ende einer Nukleinsäuresequenz codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7, das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 mit dem 5'-Ende der für das Surfactant-Protein A kodierende Gensequenz und das 3'-Ende der für das Surfactant-Protein A kodierenden Gensequenz mit dem 5'-Ende einer weiteren Nukleinsäuresequenz codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 ligiert wurde.
Der Expressionsvektor p-protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH wurde anschließend in Sf9-Zellen (immortalisierte Insekten-Zelllinie) mit Hilfe des Baculovirus transfiziert und unter kontinuierlich gesteigertem Expressionsdruck die ekt-ace2-ph-A-ph Genexpression kontrolliert. Über mehrere Selektionsrunden wurde für die Auswahl des bestgeeigneten Sf9-Klons auf optimale Produkteigenschaften selektiert.
Der so selektierte bestgeeignete Sf9-Klon wurde für die Proteinproduktion im Weiteren unter Verwendung von Sf9-Medium (6 g/l 1-Hefezellulose-Ultrafiltrat, 10 g/l Glukose, g/l Glutamin, 0,5 g/l Fruktose, 2 g/l Laktose, 0,6 g/l Tyrosin, 1,48 g/l Methionin und 1 % (v/v) Lipidemulsion) kultiviert.
Die Fermentation wurde bei 27 °C für 4 Tage in einer nicht regulierten CO₂-Atmosphäre durchgeführt.
1.2 Aufreinigung
Die Sf9-Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (750 X g). Die erhaltenen Pellets wurden in eiskaltem Lysepuffer, bestehend aus Puffer A (50 mM sodium Hepes, pH 7.2, 1 mM EDTA, 3 mM EGTA, 5 mM MgCI, 3 mM Dithiothreitol, and 0.1 mM GDP) mit 25 mM NaCI, 10 mM NaF, 30 µm AlCl₃ und einer Protease-Inhibitormischung (0,02 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,03 mg/ml Leupeptin, 0,02 mg/ml 1l-Chlor-3-tosylamido-7-amino-2-heptanon, 0,02 mg/ml L-1-Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon und 0,03 mg/ml Limabohnen-Trypsininhibitor) lysiert.
Das so entstandene Zelllysat wurde anschließend zentrifugiert, um intakte Zellen und Zellkerne zu entfernen.
Die daraus gewonnenen Membranpellets wurden in Puffer A (enthaltend die Protease-Inhibitormischung) auf 5 mg Protein/ml verdünnt und danach durch Zugabe von 1% Natriumcholat bei konstantem Rühren für 60 min bis 90 min bei 4 °C inkubiert.
Die extrahierten Membranen wurden zentrifugiert und der Überstand (Cholat-Extrakt) entnommen.
Phenyl-Sepharose-Chromatographie
Eine Säule mit Phenyl-Sepharose CL-4B wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen (Puffer A mit 10 mM NaF, 30 µm AlCl₃, Protease-Inhibitormischung, 400 mM NaCI und 0,25% Natriumcholat). Das Cholat-Extrakt wurde 1:4 in Puffer A verdünnt und auf die Säule geladen. Die Säule wurde anschließend mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und eine Proteinelution mit einem linear absteigenden Gradient von 400-0 mM NaCI und linear aufsteigenden Konzentrationen von Natriumcholat (0,25-1,5%) durchgeführt.
Anionenaustausch-Chromatographie
Die Fraktionen aus der Phenyl-Sepharose-Chromatographie, die das Protein protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH enthielten, wurden zu einer Probe vereinigt und direkt auf eine Anionenaustausch-Säule (Mono Q 5/50 GL) geladen, welche mit Äquilibrierungspuffer (Puffer A mit 1% Octylglucosid) gewaschen wurde. Die Probe wurde unter Druck mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min auf die Säule gegeben und unter Verwendung eines linearen aufsteigenden Gradienten von 25-300 mM NaCI und anschließend mit 1000 mM NaCI eluiert.
Die Aufreinigung des Proteins wurde nach jedem Schritt über eine denaturierende SDS-PAGE mit Hilfe des spezifischen Molekulargewichts des Proteins ekt-ACE2-pH-A-pH überprüft.
Die erfindungsgemäße Protein-Präparation lag als stabile, hochreine und konzentrierte Proteinlösung in physiologischer Pufferung vor und konnte ohne weitere Stabilisierung gelagert werden.
2. Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH-Cvs (gemäß SEQ ID NO: 12)
Die Expression und Aufreinigung des Proteins erfolgte grundsätzlich wie unter 1. beschrieben, wobei beim Klonierungsschritt in den Expressionsvektor zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz codierend für eine aus 5 Cysteinresten bestehende Linkereinheit kloniert wurde, und zwar derart, dass das 5'-Ende dieser Nukleinsäuresequenz mit dem 3'-Ende der weiteren Nukleinsäuresequenz codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 unter Erhalt des Expressionsvektor p-protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH-Cys ligiert wurde.
Eine zu 1. analoge Expression sowie Aufreinigung lieferte das Protein protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH-Cys in Form einer stabilen, hochreinen und konzentrierten Proteinlösung in physiologischer Pufferung. Das Protein war ohne weitere Stabilisierung zur weiteren Verwendung lagerfähig.
3. Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH (gemäß SEQ ID NO: 9)
Die Expression und Aufreinigung des Proteins erfolgte grundsätzlich wie unter 1. beschrieben, wobei beim Klonierungsschritt in den Expressionsvektor anstelle der für das Surfactant-Protein A kodierenden Gensequenz eine für das Surfactant-Protein D kodierende Gensequenz verwendet wurde. Auf Basis des hierbei erhaltenen Expressionsvektors p-protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH lieferte eine zu 1. analoge Expression und Aufreinigung das Protein protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH in Form einer lagerfähigen stabilen, hochreinen und konzentrierten Proteinlösung in physiologischer Pufferung.
4. Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH-Cys (gemäß SEQ ID NO: 13)
Die Expression und Aufreinigung des Proteins erfolgte grundsätzlich wie unter 3. beschrieben, wobei beim Klonierungsschritt in den Expressionsvektor zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz codierend für eine aus 5 Cysteinresten bestehende Linkereinheit kloniert wurde, und zwar derart, dass das 5'-Ende dieser Nukleinsäuresequenz mit dem 3'-Ende der weiteren Nukleinsäuresequenz codierend für eine pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 unter Erhalt des Expressionsvektor p-protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH-Cys ligiert wurde.
Eine zu 3. (bzw. 1.) analoge Expression sowie Aufreinigung lieferte das Protein protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH-Cys in Form einer stabilen, hochreinen und konzentrierten Proteinlösung in physiologischer Pufferung. Das Protein war ohne weitere Stabilisierung zur weiteren Verwendung lagerfähig
5. Konjugation von Silbernanopartikeln mit protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH-Cvs
Die exprimierten und aufgereinigten Proteine protek-ekt-ACE2-protek-pH-A-pH-Cys und protek-ekt-ACE2-protek-pH-D-pH-Cys wurden jeweils in getrennten Ansätzen durch kovalente Konjugation an Silbernanopartikel gebunden.
Hierfür wurden jeweils 10 µl von carboxylierten Silbernanopartikeln zu 10 µL einer EDC/NHS (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysulfosuccinimide) Lösung gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Oberflächen der Nanopartikel zu aktivieren.
Nach der Zugabe von 1 ml Waschpuffer und gründlichem Mischen wurden die aktivierten Silberpartikel durch Zentrifugation pelletiert. Der Überstand wurde verworfen.
Es wurden daraufhin jeweils 10 µl des aufgereinigten Proteins (Konzentration: 1 mg Protein in 1 ml 1 x PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung)) hinzugegeben und für 2-4 Stunden inkubiert, um das Protein an die Nanopartikel zu konjugieren.
Unter Zugabe von 1 ml PBST (Phosphate Buffered Saline, 0.05% Tween 20) wurde das Silberkonjugat jeweils durch Zentrifugation pelletiert.
Das Silberkonjugat wurde jeweils anschließend mit 157 µl von PBS, dem zuvor 1% bovines Serumalbumin (BSA w/v) hinzugegeben worden war, resuspendiert.
Die Funktionalität des Silberkonjugats wurde jeweils mit Hilfe von proteinchemischen Analysen sowie enzymatischen Analysen auf optimale Produkteigenschaften überprüft und bei 4 °C gelagert.
Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Aminosäuresequenzen entsprechen den im nachfolgenden Sequenzprotokoll offenbarten Aminosäuresequenzen.
Sequenzprotokoll
SEQUENCE LISTING

<110> Karle Christoph
<120> Protein oder Peptid, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion und/oder Infektionskrankheit und/oder einer Folgeerkrankung davon
<130> P58930DE
<160> 15
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Bindungsmotiv (ACE2)
<400> 1
<210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> protektive Aminosäuresequenz
<400> 2
<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> protektive Aminosäuresequenz
<400> 3
<210> 4 <211> 343 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Bindungsmotiv (ACE2) mit protektiven Aminosäuresequenzen
<400> 4
<210> 5 <211> 278 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Aminosäuresequenz (Surfactant-Protein A)
<400> 5
<210> 6 <211> 375 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Aminosäuresequenz (Surfactant-Protein D)
<400> 6
<210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz
<400> 7
<210> 8 <211> 681 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 8
<210> 9 <211> 778 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 9
<210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Linker-Sequenz
<400> 10
<210> 11 <211> 218 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Linker-Sequenz
<400> 11
<210> 12 <211> 686 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 12
<210> 13 <211> 899 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 13
<210> 14 <211> 783 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 14
<210> 15 <211> 996 <212> PRT <213> künstliche Sequenz
<220> <223> Protein
<400> 15

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 2543724 A2 [0022]

Claims

Protein oder Peptid, aufweisend - einen ersten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer ektopen Domäne von ACE2 oder einer Teilsequenz davon entspricht, und - einen zweiten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder D oder einer Teilsequenz davon entspricht oder einen zweiten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins A oder einer Teilsequenz davon entspricht, und einen dritten Protein- oder Peptidabschnitt, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz eines Surfactant-Proteins D oder einer Teilsequenz davon entspricht.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des ersten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder eine Teilsequenz davon aufweist oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder einer Teilsequenz davon besteht.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder eine Teilsequenz davon aufweist oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder einer Teilsequenz davon besteht.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des zweiten Protein- oder Peptidabschnitts oder dritten Protein- oder Peptidabschnitts eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder eine Teilsequenz davon aufweist oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder einer Teilsequenz davon besteht.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Protein- oder Peptidabschnitt in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids hinter dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet ist.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der dritte Protein- oder Peptidabschnitt in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids vor oder hinter dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnet ist.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid ferner eine Anzahl von pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen, aufweisend oder bestehend aus basischen Aminosäureresten, aufweist, wobei es sich bei den pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen vorzugsweise um repetitive Aminosäuresequenzen, insbesondere mit Wiederholungseinheiten aus Histdin-, Lysin- und Argininresten, handelt.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid eine zwischen dem ersten Protein- oder Peptidabschnitt und dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete pH-Wert regulierende Aminosäuresequenz und/oder eine zwischen dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt und dem dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete pH-Wert-regulierende Aminosäuresequenz aufweist.
Protein oder Peptid nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Wert-regulierenden Aminosäuresequenzen jeweils eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 aufweisen oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 bestehen.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 aufweist oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 besteht.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9 aufweist oder aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9 besteht.
Protein oder Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid ferner eine Linkereinheit, insbesondere eine in Richtung des C-Terminus des Proteins oder Peptids hinter dem zweiten Protein- oder Peptidabschnitt oder dritten Protein- oder Peptidabschnitt angeordnete Linker-Einheit, insbesondere Peptidlinker-Einheit, vorzugsweise aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 11, aufweist.
Nukleinsäure, codierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9, Expressionsvektor, aufweisend eine Nukleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9 codiert, oder Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9 codiert, und/oder einen Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure aufweist, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9 codiert.
Konjugat, aufweisend ein Nanopartikel und ein Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder ein Nanopartikel und ein Protein oder Peptid, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer ektopen Domäne von ACE2 oder einer Teilsequenz davon entspricht.
Konjugat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Nanopartikel ein Metall aufweist oder aus einem Metall besteht, wobei das Metall vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Zink und Kombinationen, insbesondere Legierungen, aus wenigstens zwei der vorgenannten Metalle.
Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend ein Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder ein Konjugat nach Anspruch 14 oder 15.
Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, Konjugat nach Anspruch 14 oder 15 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 116 zur Anwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Viren, insbesondere Coronaviren, bevorzugt SARS-CoV-2, und/oder Bakterien hervorgerufenen Infektion und/oder Infektionskrankheit, insbesondere Atemwegserkrankung, und/oder einer Folgeerkrankung davon.