TW202311529A - β-己糖胺酶變體之組合物及其用途 - Google Patents

β-己糖胺酶變體之組合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本文揭示形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其具有最佳化特性以用於治療泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)或桑德霍夫氏病(Sandhoff Disease)。

Description

β-己糖胺酶變體之組合物及其用途
本文揭示一種形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其包含在對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元的S184、P209、N228、P229、V230、T231、P429、K432、D433、I436、N466、S491、L493、T494、F495、E498、L508、Q513、N518、V519、F521及E523的位置處的一或多個胺基酸序列取代或缺失，且進一步包含一或多個胺基酸序列元件，該一或多個胺基酸序列元件使得對該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體的細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加。在一些實施例中，增加細胞攝取之一或多個胺基酸序列元件係選自由相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元之胺基酸序列取代、添加或缺失組成之群。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含一或多個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少二十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少85%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少90%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列位於第一胺基酸序列之N端。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少20個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少100個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少100個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少150個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少85%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少90%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少95%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸，且與該至少500個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸，且與該至少525個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸，且與該至少550個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的甘露糖-6-磷酸化(M6P)。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少3個M6P位點由M6P佔據。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少4個M6P位點由M6P佔據。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在GM2活化因子蛋白之存在下展現出GM2神經節苷脂水解活性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加至少2倍、5倍、10倍、20倍或25倍。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取係在來自SD患者之人類纖維母細胞中同二聚體及甘露糖-6-磷酸的競爭分析中，藉由攝取非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)來評估的。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體具有增加的熱穩定性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為約60℃至約63℃。在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體增加小鼠的壽命。在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體使小鼠的壽命增加至少2倍。
本文揭示一種同二聚體，其包含根據以上實施例中之任一者之重組β-己糖胺酶變體α次單元。
本文揭示一種醫藥組合物，其包含根據任一以上實施例之同二聚體及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，一或多種醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及氯化鈣。在一些實施例中，醫藥組合物包含1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、0.8 mM氯化鎂、1.4 mM氯化鈣，pH 7.2。在一些實施例中，包含重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體以約20 mg/ml之濃度調配。
本文揭示一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之醫藥組合物。本文揭示一種改善患有SD之個體的SD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物經腦室內向個體投與。在一些實施例中，醫藥組合物經腦室內每週向個體投與。在一些實施例中，醫藥組合物每隔一週投與。在一些實施例中，醫藥組合物以規則時間間隔投與，其中該規則時間間隔大於每隔一週。在一些實施例中，個體為TSD症狀發生前。在一些實施例中，個體具有TSD相關突變。在一些實施例中，個體具有相對於TSD之生物標記的對照水準升高的TSD之生物標記的水準。在一些實施例中，TSD生物標記之升高水準係自來自個體之樣品中獲得的TSD生物標記的量測值。在一些實施例中，TSD生物標記之對照水準係來自不具有TSD相關突變之個體之樣品的TSD生物標記的量測值。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品係自CSF或血液獲得。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品為血漿樣品。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少100%至4000%。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少2×至100×。在一些實施例中，生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。在一些實施例中，個體為SD症狀發生前。在一些實施例中，個體具有SD相關突變。在一些實施例中，個體具有相對於SD之生物標記的對照水準升高的SD之生物標記的水準。在一些實施例中，SD生物標記之升高水準係自來自個體之樣品中獲得的SD生物標記的量測值。在一些實施例中，SD生物標記之對照水準係來自不具有SD相關突變之個體之樣品的SD生物標記的量測值。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品係自CSF或血液獲得。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品為血漿樣品。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少100%至4000%。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少2×至100×。在一些實施例中，生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。
本文揭示一種核酸，其編碼包含以上實施例中之任一者之重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體。本文揭示一種載體，其包含以上實施例中之任一者之核酸及一或多個基因調控區。在一些實施例中，載體進一步包含在該載體之5'及3'端兩者處的腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。本文揭示一種AAV病毒顆粒，其包含上述實施例之載體。本文揭示一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之AAV病毒顆粒。本文揭示一種改善患有TSD之個體的SD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之AAV病毒顆粒。本文揭示一種減少患有TSD或SD之個體中的GM2神經節苷脂累積的方法，其包含向患有TSD或SD之個體投與有效量之以上實施例中之任一者之醫藥組合物。本文揭示一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之醫藥組合物。本文揭示一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之AAV病毒顆粒。本文揭示一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之醫藥組合物。本文揭示一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之以上實施例中之任一者之AAV病毒顆粒。在一些實施例中，TSD或SD疾病進展的生物標記為GM2及GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)或神經絲輕鏈或游離聚醣。
交互參考
本申請案主張2021年6月25日申請之美國臨時申請案第63/215,328號之權益，其以全文引用之方式併入本文中。 具體實施方式
泰-薩克斯病(TSD)及桑德霍夫氏病(SD)為溶酶體貯積病(LSD)，其由各種溶酶體駐存酶之突變引起。酶活性之損失引起酶基質之累積，導致症狀性疾病。酶替代療法(ERT)作為治療LSD之可行方法出現。ERT係基於使用重組形式之缺失溶酶體酶治療LSD患者，該酶能夠由患者之細胞吸收且遞送至溶酶體區室，由此恢復缺失酶活性。
一種此類溶酶體酶係β-己糖胺酶，其包含兩個呈異二聚體或同二聚體之次單元(α及β)。β-己糖胺酶催化GM2神經節苷脂(呈異二聚體形式，具有GM2活化因子蛋白)及含有末端N-乙醯基己糖胺之其他分子降解。β-己糖胺酶之α或β次單元的缺失導致溶酶體GM2累積，其最終觸發神經元細胞死亡。此神經元細胞死亡導致TSD (由編碼α次單元之基因中的突變引起)及SD (由編碼β次單元之基因中的突變引起)。
己為β-己糖胺酶之α-次單元及β-次單元之異二聚體。HexA與GM2活化因子蛋白(GM2AP)組合，經由水解GM2之非還原末端β-連接之N-乙醯基-半乳糖胺殘基而將GM2轉化為GM3神經節苷脂。雖然HexA已用作TSD及SD之潛在治療劑，但HexA之功效由於HexA之異二聚體性質而較低。HexA造成表現上的挑戰，因為α及β次單元需要二聚以便使酶擁有對於GM2基質識別、GM2AP結合、細胞攝取及溶酶體靶向而言至關重要的所有殘基。HexA理論等電點(pI)為5.52，以及理論分子量(MW)為117147.96 Da。
HexB為包含β次單元之同二聚體之β-己糖胺酶。儘管HexB為β-己糖胺酶之最穩定二聚體形式，但HexB缺乏GM2水解所需之官能性殘基，且因此不適用於ERT。
HexM為包含經修飾之α次單元同二聚體之β-己糖胺酶。詳言之，HexM由2個α次單元構成，該等α次單元具有以下對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元之S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。HexM具有更大活性及穩定性，但活體外與HexA相比具有不佳細胞攝取。 重組 β - 己糖胺酶變體 α 次單元組合物
本文揭示已經最佳化以改良用於治療TSD及SD之特性的β-己糖胺酶變體α次單元組合物。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其具有改良之特性以用於相對於HexA、HexM、HexB或Mod2B治療TSD及SD。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其相對於HexA或HexM具有改良之特性以用於治療TSD及SD。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其相對於HexA及HexM具有改良之特性以用於治療TSD及SD。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其相對於HexA具有改良之特性以用於治療TSD及SD。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其相對於HexM具有改良之特性以用於治療TSD及SD。
在一些實施例中，本發明之β-己糖胺酶變體α次單元相對於HexA α次單元包含胺基酸變化，其可將二聚體界面自α轉化成β且將推定的GM2AP結合域自β引入至α次單元上。如本文所揭示之變體可為一種多肽，其相對於天然存在之參考序列包含變體之胺基酸序列的一或多個差異。變體可包括例如相對於參考序列的胺基酸殘基的缺失、添加或取代。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成同二聚體。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元形成異二聚體。在一些實施例中，本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元水解GM2神經節苷脂。
可併入本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元中之胺基酸殘基變化之實例顯示於 表 1中。胺基酸殘基變化可為例如突變、取代、缺失或添加。
表 1 ： β - 己糖胺酶變體 α 次單元之例示性胺基酸殘基變化
殘基位置 ( α 編號對應於SEQ ID NO : 1 ) 變化( α 至 β) 效應
184 Ser (S)至Lys (K) β二聚體界面
209 Pro (P) 至Gln (Q) β二聚體界面
228 Asn (N)至Ser (S) β二聚體界面
229 Pro缺失 β二聚體界面
230 Val (V)至Leu (L) β二聚體界面
231 Thr (T)至Ser (S) β二聚體界面
429 Pro (P)至Gln (Q) β二聚體界面及GM2A結合位點
432 Lys (K)至Arg (R) GM2A結合位點
433 Asp (D)至Lys (K) GM2A結合位點
436 Ile (I)或Val (V)至Lys (K) GM2A結合位點
466 Asn (N)至Ala (A) β二聚體界面
491 Ser (S)至Arg (R) GM2A結合位點
493 Leu (L)至Met (M) GM2A結合位點
494 Thr (T)至Asp (D) GM2A結合位點
495 Phe (F)至Asp (D) GM2A結合位點
498 Glu (E)至Asp (D) GM2A結合位點
508 Leu (L)至Val (V) β二聚體界面
513 Gln (Q)至Ala (A) β二聚體界面
518 Asn (N)至Tyr (Y) β二聚體界面
519 Val (V)至Ala (A) β二聚體界面
521 Phe (F)至Tyr (Y) β二聚體界面
523 Glu (E)至Asn (N) β二聚體界面
本文揭示一種形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其包含在對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元的S184、P209、N228、P229、V230、T231、P429、K432、D433、I436、N466、S491、L493、T494、F495、E498、L508、Q513、N518、V519、F521及E523的位置處的一或多個胺基酸序列取代或缺失，且進一步包含一或多個胺基酸序列元件，該一或多個胺基酸序列元件使得對該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體的細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加。在一些實施例中，增加細胞攝取之一或多個胺基酸序列元件係選自由相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元之胺基酸序列取代、添加或缺失組成之群。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含一或多個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少二十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元之序列可具有與本發明提供之胺基酸序列至少約70%同源性、至少約71%同源性、至少約72%同源性、至少約73%同源性、至少約74%同源性、至少約75%同源性、至少約76%同源性、至少約77%同源性、至少約78%同源性、至少約79%同源性、至少約80%同源性、至少約81%同源性、至少約82%同源性、至少約83%同源性、至少約84%同源性、至少約85%同源性、至少約86%同源性、至少約87%同源性、至少約88%同源性、至少約89%同源性、至少約90%同源性、至少約91%同源性、至少約92%同源性、至少約93%同源性、至少約94%同源性、至少約95%同源性、至少約96%同源性、至少約97%同源性、至少約98%同源性或至少約99%同源性。
本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元之序列可具有與本發明提供之胺基酸序列至少約70%一致性、至少約71%一致性、至少約72%一致性、至少約73%一致性、至少約74%一致性、至少約75%一致性、至少約76%一致性、至少約77%一致性、至少約78%一致性、至少約79%一致性、至少約80%一致性、至少約81%一致性、至少約82%一致性、至少約83%一致性、至少約84%一致性、至少約85%一致性、至少約86%一致性、至少約87%一致性、至少約88%一致性、至少約89%一致性、至少約90%一致性、至少約91%一致性、至少約92%一致性、至少約93%一致性、至少約94%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性或至少約99%一致性。在一些實施例中，本文所揭示之變體β-己糖胺酶包含與SEQ ID NO: 3具有100%一致性之胺基酸序列。
可使用各種方法及軟體程式來測定兩個或更多個序列之間的同源性，諸如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline或另一適合的方法或演算法。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少70%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少75%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少80%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少85%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少90%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少91%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少92%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少93%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少94%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少99%序列一致性。
在一些實施例中，本文所揭示之重組β-己糖胺酶包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或600個本文所揭示之任何胺基酸序列的連續胺基酸。在一些實施例中，胺基酸序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，胺基酸序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，胺基酸序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，胺基酸序列為SEQ ID NO: 13。
在一些實施例中，第二胺基酸序列位於第一胺基酸序列之N端。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少20個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少30個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少40個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少50個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少60個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少70個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少80個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少90個連續胺基酸殘基。
在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少50個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少60個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少70個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少80個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少90個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少100個連續胺基酸殘基。
在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少50個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少60個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少70個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少80個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少90個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少100個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少150個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少85%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少90%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少95%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少70%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸，且與該至少500個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸，且與該至少525個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸，且與該至少550個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
在一些實施例中，相對於本文所揭示之胺基酸序列，本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸截短。
如本文所用，l-鏡像異構及d-鏡像異構胺基酸之縮寫如下：丙胺酸(A，Ala)；精胺酸(R，Arg)；天冬醯胺(N，Asn)；天冬胺酸(D，Asp)；半胱胺酸(C，Cys)；麩胺酸(E，Glu)；麩醯胺酸(Q，Gln)；甘胺酸(G，Gly)；組胺酸(H，His)；異白胺酸(I, Ile)；白胺酸(L，Leu)；離胺酸(K，Lys)；甲硫胺酸(M，Met)；苯丙胺酸(F，Phe)；脯胺酸(P，Pro)；絲胺酸(S，Ser)；蘇胺酸(T，Thr)；色胺酸(W，Trp)；酪胺酸(Y，Tyr)；纈胺酸(V，Val)。在一些實施例中，胺基酸為L-鏡像異構物。在一些實施例中，胺基酸為D-鏡像異構物。
本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體可包含如下 表 2中所揭示之序列。
表 2 . 本文所揭示之 β - 己糖胺酶變體 α 次單元同二聚體之序列
構築體名稱 構築體描述 序列 SEQ ID NO:
Hex A α次單元(蛋白質序列) 野生型β-己糖胺酶α次單元       (理論pI/Mw: 4.95 /58379.09) MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATALWPWPQNFQTSDQRYVLYPNNFQFQYDVSSAAQPGCSVLDEAFQRYRDLLFGSGSWPRPYLTGKRHTLEKNVLVVSVVTPGCNQLPTLESVENYTLTINDDQCLLLSETVWGALRGLETFSQLVWKSAEGTFFINKTEIEDFPRFPHRGLLLDTSRHYLPLSSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDPSFPYESFTFPELMRKGSYNPVTHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYSGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGPDWKDFYIVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDNTNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTSDLTFAYERLSHFRCELLRRGVQAQPLNVGFCEQEFEQT 1
Hex A β次單元(蛋白質序列) 野生型β-己糖胺酶β次單元       (理論pI/Mw: 6.43 /58786.88) MELCGLGLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLTQVALVVQVAEAARAPSVSAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEEAFRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNISSDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINESTIIDSPRFSHRGILIDTSRHYLPVKIILKTLDAMAFNKFNVLHWHIVDDQSFPYQSITFPELSNKGSYSLSHVYTPNDVRMVIEYARLRGIRVLPEFDTPGHTLSWGKGQKDLLTPCYSRQNKLDSFGPINPTLNTTYSFLTTFFKEISEVFPDQFIHLGGDEVEFKCWESNPKIQDFMRQKGFGTDFKKLESFYIQKVLDIIATINKGSIVWQEVFDDKAKLAPGTIVEVWKDSAYPEELSRVTASGFPVILSAPWYLDLISYGQDWRKYYKVEPLDFGGTQKQKQLFIGGEACLWGEYVDATNLTPRLWPRASAVGERLWSSKDVRDMDDAYDRLTRHRCRMVERGIAAQPLYAGYCNHENM 2
Hex D3 (α次單元) (蛋白質序列) 變體β-己糖胺酶α次單元 MELCGLGLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLTQVALVVQVAEAARAPSVSAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEEAFRRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNISSDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINESTIIDSPRFPHRGLLLDTSRHYLPLKSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDQSFPYESFTFPELMRKGSYSLSHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYSGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGQDWRKFYKVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDATNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTRDMDDAYDRLSHFRCELVRRGVAAQPLYAGYCNQEFEQT 3
Hex A α次單元(核苷酸序列) 野生型β-己糖胺酶α次單元 ATGACTTCCTCCCGCCTTTGGTTCTCCCTCCTGCTTGCCGCTGCCTTCGCCGGACGCGCCACCGCCCTGTGGCCGTGGCCTCAGAACTTCCAGACTAGCGACCAAAGATACGTGCTGTACCCGAACAACTTCCAGTTTCAATACGACGTCAGCAGCGCCGCCCAGCCCGGCTGCTCGGTGCTCGATGAGGCATTCCAGCGGTACCGGGATCTCTTGTTCGGTTCCGGATCATGGCCTCGGCCGTACCTCACTGGAAAGAGGCACACTCTCGAAAAGAACGTCCTGGTGGTGTCCGTGGTCACCCCTGGCTGCAATCAGCTGCCCACCCTGGAATCAGTGGAGAACTACACTTTGACCATCAACGATGACCAATGCCTGCTGCTGTCGGAGACTGTGTGGGGTGCCCTGCGCGGGCTGGAAACCTTTAGCCAACTGGTCTGGAAGTCAGCCGAGGGGACCTTCTTCATTAACAAGACCGAAATCGAGGACTTCCCTCGGTTCCCGCACCGCGGCTTGCTGCTGGATACCTCGCGGCACTATCTGCCACTGTCCTCCATTCTCGATACCCTGGACGTGATGGCCTACAACAAGCTGAACGTGTTCCACTGGCATCTCGTGGACGACCCATCCTTTCCCTACGAGTCCTTCACCTTCCCTGAGTTGATGAGAAAGGGCTCCTACAACCCCGTGACCCATATCTACACGGCTCAGGACGTGAAGGAAGTGATCGAATATGCCCGGCTGAGAGGGATTAGGGTGCTGGCAGAATTTGACACCCCGGGACACACCCTGTCGTGGGGCCCTGGTATCCCGGGCCTGCTGACTCCGTGCTACTCCGGCTCCGAGCCATCCGGAACCTTCGGACCTGTGAATCCCTCCCTGAACAACACTTACGAGTTCATGTCCACCTTCTTCCTGGAAGTGTCGAGCGTGTTCCCCGACTTCTACCTCCACCTCGGTGGCGACGAAGTCGATTTCACTTGCTGGAAGTCTAACCCCGAGATCCAAGATTTCATGCGAAAGAAAGGATTCGGAGAGGACTTTAAGCAGCTGGAGTCCTTCTACATCCAAACCCTGCTGGACATTGTGTCATCGTATGGAAAGGGATACGTGGTGTGGCAGGAAGTGTTTGACAATAAGGTCAAAATTCAGCCCGATACAATCATCCAAGTCTGGCGCGAAGATATCCCCGTGAACTACATGAAAGAACTGGAACTGGTCACGAAGGCTGGATTCAGGGCGCTTCTGAGCGCCCCTTGGTACTTGAACCGGATTAGCTACGGCCCGGACTGGAAGGACTTCTACATCGTCGAACCTCTGGCCTTCGAGGGAACCCCCGAGCAGAAGGCCTTGGTGATCGGCGGCGAAGCCTGTATGTGGGGGGAATACGTGGACAACACCAACCTGGTGCCGCGCCTGTGGCCGAGAGCGGGAGCAGTGGCCGAGCGGCTCTGGTCGAACAAGCTGACTTCCGACCTCACCTTCGCATACGAGAGACTGAGCCACTTCCGCTGCGAACTTCTTCGGCGGGGGGTGCAGGCCCAGCCGCTCAACGTCGGGTTCTGTGAACAGGAGTTCGAGCAGACC 4
Hex A β次單元(核苷酸序列) 野生型β-己糖胺酶β次單元 ATGGAGCTGTGCGGGCTGGGGCTGCCCCGGCCGCCCATGCTGCTGGCGCTGCTGTTGGCGACACTGCTGGCGGCGATGTTGGCGCTGCTGACTCAGGTGGCGCTGGTGGTGCAGGTGGCGGAGGCGGCTCGGGCCCCGAGCGTCTCGGCCAAGCCGGGGCCGGCGCTGTGGCCCCTGCCGCTCTTGGTGAAGATGACCCCGAACCTGCTGCATCTCGCCCCGGAGAACTTCTACATCAGCCACAGCCCCAATTCCACGGCGGGCCCCTCCTGCACCCTGCTGGAGGAAGCGTTTCGACGATATCATGGCTATATTTTTGGTTTCTACAAGTGGCATCATGAACCTGCTGAATTCCAGGCTAAAACCCAGGTTCAGCAACTTCTTGTCTCAATCACCCTTCAGTCAGAGTGTGATGCTTTCCCCAACATATCTTCAGATGAGTCTTATACTTTACTTGTGAAAGAACCAGTGGCTGTCCTTAAGGCCAACAGAGTTTGGGGAGCATTACGAGGTTTAGAGACCTTTAGCCAGTTAGTTTATCAAGATTCTTATGGAACTTTCACCATCAATGAATCCACCATTATTGATTCTCCAAGGTTTTCTCACAGAGGAATTTTGATTGATACATCCAGACATTATCTGCCAGTTAAGATTATTCTTAAAACTCTGGATGCCATGGCTTTTAATAAGTTTAATGTTCTTCACTGGCACATAGTTGATGACCAGTCTTTCCCATATCAGAGCATCACTTTTCCTGAGTTAAGCAATAAAGGAAGCTATTCTTTGTCTCATGTTTATACACCAAATGATGTCCGTATGGTGATTGAATATGCCAGATTACGAGGAATTCGAGTCCTGCCAGAATTTGATACCCCTGGGCATACACTATCTTGGGGAAAAGGTCAGAAAGACCTCCTGACTCCATGTTACAGTAGACAAAACAAGTTGGACTCTTTTGGACCTATAAACCCTACTCTGAATACAACATACGCTTCCTTACTACATTTTTCAAAGAAATTAGTGAGGTGTTTCCAGATCAATTCATTCATTTGGGAGGAGATGAAGTGGAATTTAAATGTTGGGAATCAAATCCAAAAATTCAAGATTTCATGAGGCAAAAAGGCTTTGGCACAGATTTTAAGAAACTAGAATCTTTCTACATTCAAAAGGTTTTGGATATTATTGCAACCATAAACAAGGGATCCATTGTCTGGCAGGAGGTTTTTGATGATAAAGCAAAGCTTGCGCCGGGCACAATAGTTGAAGTATGGAAAGACAGCGCATATCCTGAGGAACTCAGTAGAGTCACAGCATCTGGCTTCCCTGTAATCCTTTCTGCTCCTTGGTACTTAGATTTGATTAGCTATGGACAAGATTGGAGGAAATACTATAAAGTGGAACCTCTTGATTTTGGCGGTACTCAGAAACAGAAACAACTTTTCATTGGTGGAGAAGCTTGTCTATGGGGAGAATATGTGGATGCAACTAACCTCACTCCAAGATTATGGCCTCGGGCAAGTGCTGTTGGTGAGAGACTCTGGAGTTCCAAAGATGTCAGAGATATGGATGACGCCTATGACAGACTGACAAGGCACCGCTGCAGGATGGTCGAACGTGGAATAGCTGCACAACCTCTTTATGCTGGATATTGTAACCATGAGAACATGTAA 5
Hex M (α次單元) (蛋白質序列) 變體β-己糖胺酶α次單元 MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATALWPWPQNFQTSDQRYVLYPNNFQFQYDVSSAAQPGCSVLDEAFQRYRDLLFGSGSWPRPYLTGKRHTLEKNVLVVSVVTPGCNQLPTLESVENYTLTINDDQCLLLSETVWGALRGLETFSQLVWKSAEGTFFINKTEIEDFPRFPHRGLLLDTSRHYLPLKSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDQSFPYESFTFPELMRKGSYSLSHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYSGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGQDWRKFYKVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDATNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTRDMDDAYDRLSHFRCELVRRGVAAQPLYAGYCNQEFEQT 6
Hex M (α次單元) (核苷酸序列) 變體β-己糖胺酶α次單元 ATGACTTCCTCCCGCCTTTGGTTCTCCCTCCTGCTTGCCGCTGCCTTCGCCGGACGCGCCACCGCCCTGTGGCCGTGGCCTCAGAACTTCCAGACTAGCGACCAAAGATACGTGCTGTACCCGAACAACTTCCAGTTTCAATACGACGTCAGCAGCGCCGCCCAGCCCGGCTGCTCGGTGCTCGATGAGGCATTCCAGCGGTACCGGGATCTCTTGTTCGGTTCCGGATCATGGCCTCGGCCGTACCTCACTGGAAAGAGGCACACTCTCGAAAAGAACGTCCTGGTGGTGTCCGTGGTCACCCCTGGCTGCAATCAGCTGCCCACCCTGGAATCAGTGGAGAACTACACTTTGACCATCAACGATGACCAATGCCTGCTGCTGTCGGAGACTGTGTGGGGTGCCCTGCGCGGGCTGGAAACCTTTAGCCAACTGGTCTGGAAGTCAGCCGAGGGGACCTTCTTCATTAACAAGACCGAAATCGAGGACTTCCCTCGGTTCCCGCACCGCGGCTTGCTGCTGGATACCTCGCGGCACTATCTGCCACTGAAGTCCATTCTCGATACCCTGGACGTGATGGCCTACAACAAGCTGAACGTGTTCCACTGGCATCTCGTGGACGACCAGTCCTTTCCCTACGAGTCCTTCACCTTCCCTGAGTTGATGAGAAAGGGCTCCTACTCCCTCTCCCATATCTACACGGCTCAGGACGTGAAGGAAGTGATCGAATATGCCCGGCTGAGAGGGATTAGGGTGCTGGCAGAATTTGACACCCCGGGACACACCCTGTCGTGGGGCCCTGGTATCCCGGGCCTGCTGACTCCGTGCTACTCCGGCTCCGAGCCATCCGGAACCTTCGGACCTGTGAATCCCTCCCTGAACAACACTTACGAGTTCATGTCCACCTTCTTCCTGGAAGTGTCGAGCGTGTTCCCCGACTTCTACCTCCACCTCGGTGGCGACGAAGTCGATTTCACTTGCTGGAAGTCTAACCCCGAGATCCAAGATTTCATGCGAAAGAAAGGATTCGGAGAGGACTTTAAGCAGCTGGAGTCCTTCTACATCCAAACCCTGCTGGACATTGTGTCATCGTATGGAAAGGGATACGTGGTGTGGCAGGAAGTGTTTGACAATAAGGTCAAAATTCAGCCCGATACAATCATCCAAGTCTGGCGCGAAGATATCCCCGTGAACTACATGAAAGAACTGGAACTGGTCACGAAGGCTGGATTCAGGGCGCTTCTGAGCGCCCCTTGGTACTTGAACCGGATTAGCTACGGCCAGGACTGGAGGAAGTTCTACAAGGTCGAACCTCTGGCCTTCGAGGGAACCCCCGAGCAGAAGGCCTTGGTGATCGGCGGCGAAGCCTGTATGTGGGGGGAATACGTGGACGCGACCAACCTGGTGCCGCGCCTGTGGCCGAGAGCGGGAGCAGTGGCCGAGCGGCTCTGGTCGAACAAGCTGACTAGGGACATGGACGATGCATACGACAGACTGAGCCACTTCCGCTGCGAACTTGTGCGGCGGGGGGTGGCGGCCCAGCCGCTCTACGCGGGGTACTGTAACCAGGAGTTCGAGCAGACC 7
Hex D3 (α次單元) (核苷酸序列) 變體β-己糖胺酶α次單元 ATGGAACTTTGCGGACTCGGCCTCCCAAGACCACCTATGCTTCTCGCCCTGCTGCTCGCCACCTTGCTCGCGGCTATGCTTGCGCTCCTGACTCAAGTGGCCCTTGTGGTCCAAGTGGCCGAGGCTGCCCGCGCCCCGAGCGTGTCAGCCAAGCCAGGACCGGCCCTGTGGCCGCTGCCTCTGAGCGTGAAGATGACTCCCAATCTCCTGCACCTGGCCCCGGAAAACTTCTACATCTCGCACTCGCCGAACAGCACCGCCGGTCCCTCCTGCACCCTGCTCGAAGAGGCATTCCGGCGGTACCACGGATACATCTTCGGTTTCTATAAGTGGCATCACGAGCCGGCAGAGTTCCAGGCCAAGACTCAGGTCCAGCAGCTGCTCGTGTCCATTACCCTGCAATCGGAGTGCGACGCCTTCCCCAACATCAGCTCAGACGAGTCATACACTTTGCTCGTGAAGGAACCTGTCGCCGTGCTGAAGGCCAACCGCGTGTGGGGTGCCCTGCGCGGGCTGGAAACCTTTAGCCAACTGGTCTACCAAGATTCATACGGGACCTTCACCATTAACGAGTCCACCATCATCGACTCCCCTCGGTTCCCGCACCGCGGCTTGCTGCTGGATACCTCGCGGCACTATCTGCCACTGAAGTCCATTCTCGATACCCTGGACGTGATGGCCTACAACAAGCTGAACGTGTTCCACTGGCATCTCGTGGACGACCAGTCCTTTCCCTACGAGTCCTTCACCTTCCCTGAGTTGATGAGAAAGGGCTCCTACTCCCTCTCCCATATCTACACGGCTCAGGACGTGAAGGAAGTGATCGAATATGCCCGGCTGAGAGGGATTAGGGTGCTGGCAGAATTTGACACCCCGGGACACACCCTGTCGTGGGGCCCTGGTATCCCGGGCCTGCTGACTCCGTGCTACTCCGGCTCCGAGCCATCCGGAACCTTCGGACCTGTGAATCCCTCCCTGAACAACACTTACGAGTTCATGTCCACCTTCTTCCTGGAAGTGTCGAGCGTGTTCCCCGACTTCTACCTCCACCTCGGTGGCGACGAAGTCGATTTCACTTGCTGGAAGTCTAACCCCGAGATCCAAGATTTCATGCGAAAGAAAGGATTCGGAGAGGACTTTAAGCAGCTGGAGTCCTTCTACATCCAAACCCTGCTGGACATTGTGTCATCGTATGGAAAGGGATACGTGGTGTGGCAGGAAGTGTTTGACAATAAGGTCAAAATTCAGCCCGATACAATCATCCAAGTCTGGCGCGAAGATATCCCCGTGAACTACATGAAAGAACTGGAACTGGTCACGAAGGCTGGATTCAGGGCGCTTCTGAGCGCCCCTTGGTACTTGAACCGGATTAGCTACGGCCAGGACTGGAGGAAGTTCTACAAGGTCGAACCTCTGGCCTTCGAGGGAACCCCCGAGCAGAAGGCCTTGGTGATCGGCGGCGAAGCCTGTATGTGGGGGGAATACGTGGACGCGACCAACCTGGTGCCGCGCCTGTGGCCGAGAGCGGGAGCAGTGGCCGAGCGGCTCTGGTCGAACAAGCTGACTAGGGACATGGACGATGCATACGACAGACTGAGCCACTTCCGCTGCGAACTTGTGCGGCGGGGGGTGGCGGCCCAGCCGCTCTACGCGGGGTACTGTAACCAGGAGTTCGAGCAGACC 8
Mod2B (β次單元) (核苷酸序列) 變體β-己糖胺酶β次單元 ATGGAACTTTGTGGACTTGGACTCCCTCGCCCTCCGATGCTGCTTGCACTGCTCCTCGCCACTCTCCTCGCCGCTATGCTGGCGCTGCTGACTCAAGTGGCACTGGTGGTCCAAGTGGCCGAGGCGGCCCGCGCACCATCCGTGTCCGCGAAGCCGGGCCCAGCCCTGTGGCCCCTGCCTCTGAGCGTGAAGATGACCCCTAACCTTCTGCACCTGGCGCCGGAGAACTTCTACATAAGCCACTCGCCCAACTCGACCGCGGGTCCCTCCTGTACCCTGCTGGAGGAGGCCTTCAGGCGCTACCACGGCTACATTTTCGGGTTCTATAAGTGGCACCACGAGCCGGCCGAGTTCCAAGCCAAGACTCAGGTCCAACAGCTGCTGGTGTCAATCACACTGCAGTCCGAATGCGATGCTTTCCCTAATATCTCCTCCGACGAGTCCTACACCCTGCTCGTGAAGGAACCTGTGGCCGTGCTCAAGGCCAACCGCGTCTGGGGAGCCCTCAGGGGTCTGGAAACCTTCAGCCAGCTGGTGTACCAGGACAGCTACGGCACCTTCACCATTAACGAGTCCACCATCATCGACTCACCGAGATTCAGCCACCGGGGAATCCTGATTGATACTTCAAGACACTATTTGCCCGTGAAGATCATCCTGAAAACCCTCGACGCTATGGCCTTTAACAAGTTTAACGTGTTGCATTGGCATATCGTGGACGATCAGTCCTTCCCGTATCAAAGCATCACTTTTCCGGAACTGTCCAACAAGGGATCTTACTCGCTGAGCCACGTGTACACTCCCAATGACGTGCGCATGGTCATCGAATACGCCCGGCTGAGGGGCATTAGAGTGCTCCCTGAATTTGACACCCCCGGCCATACCCTCTCCTGGGGAAAAGGACAGAAAGATTTGCTCACACCTTGCTACTCCGGCTCCGAGCCCTCTGGAACTTTCGGCCCCATCAACCCGACCCTGAACACCACTTACTCCTTCTTGACCACGTTCTTCAAGGAGATTTCCGAGGTGTTCCCGGACCAGTTCATCCACCTGGGGGGCGACGAAGTGGAGTTCAAGTGCTGGGAATCGAACCCAAAGATCCAGGACTTCATGAGGCAGAAGGGGTTTGGCACCGATTTCAAGAAGCTGGAGTCGTTCTACATTCAAAAGGTCCTGGACATCATTGCAACCATCAACAAGGGGTCAATCGTGTGGCAGGAAGTGTTCGATGACAAGGCTAAGCTGGCGCCCGGCACTATTGTGGAAGTCTGGAAAGACTCCGCCTACCCTGAGGAGCTGTCGAGAGTCACCGCCTCCGGATTCCCCGTCATCCTGAGCGCTCCGTGGTACCTGAACCGGATCTCCTACGGACAAGATTGGCGCAAGTACTACAAGGTCGAACCGCTGGACTTCGGAGGGACTCAGAAGCAGAAGCAGCTCTTTATTGGTGGAGAGGCCTGCCTTTGGGGCGAATACGTGGACGCCACCAACCTCACCCCGCGGCTCTGGCCACGGGCCAGCGCCGTGGGAGAACGCCTGTGGTCGTCAAAGGACGTCCGCGATATGGACGATGCCTACGACCGGCTCACTCGGCATCGGTGCCGGATGGTGGAACGCGGTATCGCAGCGCAGCCACTGTACGCTGGATACTGCAACCACGAGAATATG 9
Mod2B (β次單元) (蛋白質序列) 變體β-己糖胺酶β次單元 MELCGLGLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLTQVALVVQVAEAARAPSVSAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEEAFRRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNISSDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINESTIIDSPRFSHRGILIDTSRHYLPVKIILKTLDAMAFNKFNVLHWHIVDDQSFPYQSITFPELSNKGSYSLSHVYTPNDVRMVIEYARLRGIRVLPEFDTPGHTLSWGKGQKDLLTPCYSGSEPSGTFGPINPTLNTTYSFLTTFFKEISEVFPDQFIHLGGDEVEFKCWESNPKIQDFMRQKGFGTDFKKLESFYIQKVLDIIATINKGSIVWQEVFDDKAKLAPGTIVEVWKDSAYPEELSRVTASGFPVILSAPWYLNRISYGQDWRKYYKVEPLDFGGTQKQKQLFIGGEACLWGEYVDATNLTPRLWPRASAVGERLWSSKDVRDMDDAYDRLTRHRCRMVERGIAAQPLYAGYCNHENM 10
HexM片段 HexM片段 KSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDQSFPYESFTFPELMRKGSYSLSHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYSGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGQDWRKFYKVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDATNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTRDMDDAYDRLSHFRCELVRRGVAAQPLYAGYCN 11
HexB片段    ARAPSVSAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEEAFRRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNISSDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINESTIIDS 12
HexB片段    MELCGLGLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLTQVALVVQVAEAARAPSVSAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEEAFRRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNISSDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINESTIIDS 13
轉譯後修飾及熱穩定性
在一些實施例中，本文所描述之變體己糖胺酶α次單元包括成熟形式之多肽。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包括一或多種轉譯後修飾，包括蛋白水解及/或糖酵解處理。本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體可包含呈例如醣基化形式之轉譯後修飾。醣基化可為例如N-連接之醣基化、O-連接之醣基化、磷絲胺酸醣基化或C-甘露醣基化。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元在所選Asn-X-Ser/Thr (SEQ ID NO: 14)區處經醣基化。天冬醯胺殘基可藉由N-乙醯基葡糖胺-1-磷酸酯轉移酶經甘露糖-6-磷酸(M6P)殘基之N連接之醣基化進一步修飾。
本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元可進一步包含將M6P添加至α次單元之醣基化的位點。添加M6P可使得對β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取增加，因為細胞攝取係藉由非陽離子依賴性甘露糖6-磷酸(M6P)受體(CI-MPR)之攝取介導。在一些實施例中，相比於野生型β-己糖胺酶或例如HexM，本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體具有更大細胞攝取。本文所揭示之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體可呈現例如約500 nM、約300 nM、約200 nM、約100 nM、約90 nM、約80 nM、約70 nM、約60 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM、約20 nM、約10 nM、約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM或約1 nM之細胞攝取      (K 攝取)。在一些實施例中，本文所揭示之變體β-己糖胺酶具有3 nM至13 nM之K 攝取。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體包含相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的甘露糖-6-磷酸化(M6P)。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體，每個同二聚體上由M6P佔據的M6P位點之數目增加。在一些實施例中，每個同二聚體上由M6P佔據的M6P位點之數目為2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，每個同二聚體上由M6P佔據的M6P位點之數目為3。在一些實施例中，每個同二聚體上由M6P佔據的M6P位點之數目為4。
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體具有增加的熱穩定性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1之同二聚體具有增加的熱穩定性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為約58℃至約63℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為58℃至63℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59℃至62℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59℃至62℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59℃至61℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59.4℃至60.2℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為60℃。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為59.8℃。在一些實施例中，熔點使用差示掃描熱量測定法量測。 用於治療 TSD 及 SD 之改良的特性
在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在GM2活化因子蛋白之存在下展現出GM2神經節苷脂水解活性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加至少2倍、5倍、10倍、20倍或25倍。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取係在來自SD患者之人類纖維母細胞中同二聚體及甘露糖-6-磷酸的競爭分析中，藉由攝取非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)來評估的。
在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體增加小鼠的壽命。
在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體使小鼠的壽命增加至少2倍。
在一些實施例中，用於測試β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於HexA或HexM之經改良特性的模型包括小鼠模型。
SD ( HexB基因剔除；損失β-次單元)小鼠缺乏HexA，累積神經節苷脂GM2，且顯示嚴重的神經退化性疾病進展，最終導致下肢痙攣、運動障礙及壽命縮短。
TSD ( HexA基因缺乏；損失α次單元)小鼠亦缺乏HexA，但藉由鼠類唾液酸酶的作用，將GM2轉化為醣脂GA2，即避免了對HexA的需求。GA2隨後可藉由HexB代謝掉。在GM2AP缺乏型小鼠中，GA2仍可在GM 2AP不存在的情況下藉由鼠類HexA及HexB酶的低活性代謝，產生較弱表型。
SD貓科動物模型亦可用於研究LSD。SD貓科動物模型具有一個突變，導致 HEXB基因中的提早終止密碼子。此等貓科動物具有小於3%的HexA及HexB活性，其類似於患有SD之受影響的人類中之酶活性。SD貓科動物模型與人類患者具有表型及生物化學類似性。SD貓科動物模型局部且大量地累積神經節苷脂，此與人類之神經節苷脂類似。SD貓科動物動物模型通常至多在四週至七週內發育正常，但隨後開始出現共濟失調、癲癇及整體肌無力。
TSD綿羊模型含有影響 HEXA基因之錯義突變，導致綿羊模型產生約29%功能HexA酶活性，此與受影響的人類病變類似。HexA的缺乏隨後經由中心及周邊神經系統導致神經病變，該神經病變似於人類TSD患者中所見的神經病變。
生物標記可用於評估本文所揭示之任何β-己糖胺酶變體α次單元或β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之活性、功效及治療效果。可於本文所揭示之方法中量測的生物標記包括例如神經節苷脂、GM2 ((2S,3R,4E)-3-羥基-2-(十八烷醯基胺基)十八-4-烯-1-基2-乙醯胺基-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基-(1→4)-[5-乙醯胺基-3,5-二去氧基-D-甘油-α-D-半乳糖-壬-2-酮哌喃糖基(non-2-ulopyranonosyl)-(2→3)]-β-D-半乳哌喃糖基-(1→4)-β-D-葡萄哌喃糖苷，其與TSD相關，且通常在健康個體之溶酶體中水解為GM3神經節苷脂)、GA2 (一種代表性N-聚醣基質，含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0')、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈(NF-L)或游離聚醣。
BMP磷脂22:6 (BMP 22:6)負責降解、循環且伴隨分子(諸如膽固醇)進出溶酶體。在溶酶體壓力下，由於未完全降解的代謝產物過度積累，BMP磷脂會增加，其中最豐富的物質為BMP 22:6 (兩個醯基鏈各自具有22個碳原子及六個雙鍵)。因此，BMP 22:6之存在可為SD之存在或進展的指標。
游離聚醣為來自醣蛋白降解之產物。HexB藉由在此等結構之非還原端處裂解N-乙醯基己糖胺而使在醣蛋白中發現之N-及O-連接聚醣降解中起重要作用。缺乏HexA酶及B酶之SD患者顯示出的表型比TSD患者更嚴重，因為其累積可溶性聚醣的同時亦累積神經節苷脂。
可在各種細胞株中測試本文所揭示之任何β-己糖胺酶變體α次單元或β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。本文所用之細胞株可包括例如人類胚胎腎(HEK) 293、中國倉鼠卵巢(CHO)、猴腎(COS)、HT1080、C10、HeLa、嬰兒倉鼠腎(BHK)、3T3、C127、CV-1、HaK、NS/0及L-929細胞。可以用於測試本文中所揭示之任何融合蛋白的哺乳動物細胞之非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤株系(NS0/1，ECACC號：85110503)；人類視網膜母細胞(PER.C6)；由SV40轉化的猴腎臟CV1株系(COS -7，ATCC CRL 1651)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR (CHO)；小鼠塞特利氏細胞(TM4)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL -1 587)；人類子宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺部細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株系(Hep G2)。在一些實施例中，本文所揭示之融合蛋白由CHO細胞株產生。
本文所揭示之任何β-己糖胺酶變體α次單元或β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體亦可在各種非哺乳動物宿主細胞中表現，該等非哺乳動物宿主細胞諸如昆蟲(例如，Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如，豆科植物、穀類或菸草)、酵母菌(例如，釀酒酵母(S. cerivisae)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris))、原核生物(例如，大腸桿菌(E. Coli)、枯草桿菌(B. subtilis)及其他芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp))或真菌。
相對於參考多肽序列之序列一致性百分比(%)係在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的候選序列中之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守性取代基視為序列一致性之部分。出於判定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以各種已知方式實現；例如，使用公開可獲得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。用於比對序列之適當參數能夠經測定，包括在經比較序列之全長上獲得最大比對所需要之演算法。然而，出於本文之目的，除非另外說明，否則使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且原始程式碼已在U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, Calif或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式可經編譯以用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者其可表述為，既定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性一定%)如下計算：100×分數X/Y，其中X為序列比對程式ALIGN-2在該程式之A與B比對中評分為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等的情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如剛剛前段中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。 β - 己糖胺酶變體 α 次單元同二聚體
本文揭示一種包含重組β-己糖胺酶變體α次單元之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，該重組β-己糖胺酶變體α次單元包含在對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元的S184、P209、N228、P229、V230、T231、P429、K432、D433、I436、N466、S491、L493、T494、F495、E498、L508、Q513、N518、V519、F521及E523的位置處的一或多個胺基酸序列取代或缺失，且進一步包含一或多個胺基酸序列元件，該一或多個胺基酸序列元件使得對該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體的細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加。在一些實施例中，增加細胞攝取之一或多個胺基酸序列元件係選自由相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元之胺基酸序列取代、添加或缺失組成之群。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含一或多個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含至少二十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元包含對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少85%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少90%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列位於第一胺基酸序列之N端。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少20個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少100個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少100個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少150個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少85%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少90%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少95%序列一致性。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸，且與該至少500個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸，且與該至少525個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸，且與該至少550個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體包含相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的甘露糖-6-磷酸化(M6P)。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少3個M6P位點由M6P佔據。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少4個M6P位點由M6P佔據。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在GM2活化因子蛋白之存在下展現出GM2神經節苷脂水解活性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加至少2倍、5倍、10倍、20倍或25倍。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之細胞攝取係在來自SD患者之人類纖維母細胞中同二聚體及甘露糖-6-磷酸的競爭分析中，藉由攝取非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)來評估的。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體具有增加的熱穩定性。在一些實施例中，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為約60℃至約63℃。在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體增加小鼠的壽命。在一些實施例中，與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體使小鼠的壽命增加至少2倍。 重組 β - 己糖胺酶變體 α 次單元多核苷酸組合物
本文揭示編碼本文所揭示之任何重組β-己糖胺酶變體α次單元的多核苷酸。多核苷酸可為載體、構築體或質體之一部分。在一些實施例中，核酸編碼如本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，本文所揭示之載體包含核酸及一或多個基因調控區。在一些實施例中，多核苷酸包含根據SEQ ID NO: 8之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸包含與根據SEQ ID NO: 8之核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。 治療之方法
在一些實施例中，為治療、改善有需要之個體的TSD症狀或減緩其進展的方法，其包含向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，個體具有至少一種TSD症狀。在一些實施例中，個體已接受TSD診斷。在一些實施例中，個體處於TSD之早期階段。在一些實施例中，個體無症狀TSD。
在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少一年內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少11個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少10個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少9個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少8個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少7個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少6個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少5個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少4個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少3個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少2個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少1個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少3週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少2週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少1週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少6天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少5天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少4天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少3天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少2天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現TSD症狀之至少1天內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。
在一些實施例中，在本文所描述之疾病之無症狀階段期間內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在本文所描述之疾病之症狀前期階段期間內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在本文所描述之疾病之早期(症狀前期)階段期間內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在本文所描述之疾病之後期(中度至重度減退)階段期間內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。
在一些實施例中，個體為TSD症狀發生前。在一些實施例中，個體具有TSD相關突變。在一些實施例中，個體具有相對於TSD之生物標記的對照水準升高的TSD之生物標記的水準。在一些實施例中，TSD生物標記之升高水準係自來自個體之樣品中獲得的TSD生物標記的量測值。在一些實施例中，TSD生物標記之對照水準係來自不具有TSD相關突變之個體之樣品的TSD生物標記的量測值。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品係自CSF或血液獲得。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有TSD相關突變之個體的樣品為血漿樣品。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少100%至4000%。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少2×至100×。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、35×、40×、45×、50×、55×、60×、65×、70×、75×、80×、85×、90×、95×、100×、110×、120×、130×、140×、150×、160×、170×、180×、190×、200×、250×、300×、350×、400×、450×、500×、550×、600×、650×、700×、750×、800×、850×、900×、950×、1000×、2000×、3000×、4000×、5000×或10000×。在一些實施例中，TSD之生物標記的升高水準相對於TSD生物標記的對照水準升高至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、425%、450%、475%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%或10000%。在一些實施例中，生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。在一些實施例中，生物標記為神經絲輕鏈。
在一些實施例中，為治療、改善有需要之個體的SD症狀或減緩其進展的方法，其包含向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，個體具有至少一種SD症狀。在一些實施例中，個體已接受SD診斷。在一些實施例中，個體處於SD之早期階段。在一些實施例中，個體無症狀SD。
在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少6個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少5個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少4個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少3個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少2個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少1個月內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少3週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少2週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在一些實施例中，在初次表現SD症狀之至少1週內，向個體投與有效量之如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。
在一些實施例中，個體具有SD相關突變。在一些實施例中，個體具有相對於SD之生物標記的對照水準升高的SD之生物標記的水準。在一些實施例中，SD生物標記之升高水準係自來自個體之樣品中獲得的SD生物標記的量測值。在一些實施例中，SD生物標記之對照水準係來自不具有SD相關突變之個體之樣品的SD生物標記的量測值。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品係自CSF或血液獲得。在一些實施例中，來自個體之樣品及來自不具有SD相關突變之個體的樣品為血漿樣品。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少100%至4000%。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少2×至100×。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、35×、40×、45×、50×、55×、60×、65×、70×、75×、80×、85×、90×、95×、100×、110×、120×、130×、140×、150×、160×、170×、180×、190×、200×、250×、300×、350×、400×、450×、500×、550×、600×、650×、700×、750×、800×、850×、900×、950×、1000×、2000×、3000×、4000×、5000×或10000×。在一些實施例中，SD之生物標記的升高水準相對於SD生物標記的對照水準升高至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、425%、450%、475%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%或10000%。在一些實施例中，生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。在一些實施例中，生物標記為神經絲輕鏈。
本發明提供一種用於治療、改善個體之TSD、SD或GM2神經節苷脂之症狀或減緩其疾病進展的方法。個體可為例如患者。TSD係由基因中之突變引起，該突變編碼位於染色體15上之己糖胺酶的α次單元。己糖胺酶活性之缺失引起GM2神經節苷脂之累積，其最終導致神經元細胞死亡。SD係由基因中之突變引起，該突變編碼位於染色體5上之己糖胺酶的β次單元。己糖胺酶活性之缺失引起GM2神經節苷脂之累積，其最終導致神經元細胞死亡。
如本文所揭示，治療TSD或SD可以包含減少個體之各種組織中的GM2神經節苷脂(或GM2神經節苷脂前驅體分子)之溶酶體貯積。可減少GM2神經節苷脂之溶酶體貯積的問題包括例如腦、脊髓神經元或外周目標組織。本文所揭示之方法與對照相比可將GM2或GM2前驅體中之一或多者之溶酶體貯積減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%。本文所揭示之方法與對照相比可將GM2或GM2前驅體中之一或多者之溶酶體貯積減少至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
如本文所揭示，TSD或SD之治療可以包含各種組織中之己糖胺酶活性增加。己糖胺酶酶活性之增加與對照相比可增加例如約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約200%、約300%、約400%、約500%、約600%、約700%、約800%、約900%或約1000%。己糖胺酶酶活性之增加與對照相比可增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。增加的酶促活性為至少大約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg或更高。 酶替代療法
酶替代療法(ERT)可涉及遞送在特定溶酶體貯積病中減少或缺失之野生型或酶活性變體型溶酶體酶。ERT可涉及將缺失酶輸注至血流中。隨著血液灌注至患者組織，酶可被細胞攝取且傳輸至溶酶體，其中酶用以消除由於酶缺乏而累積在溶酶體中之材料。為了讓溶酶體酶代替療法有效，治療性酶必須遞送至存在貯積缺乏的組織中之適當細胞的溶酶體中。
舉例而言，TSD或SD之ERT可涉及向個體投與己糖胺酶之野生型或酶活性變體。為了有效，本文所揭示之變體β-己糖胺酶應能夠靶向神經元細胞，其可經由鞘內或腦室內投與實現。ERT亦可能需要投與之溶酶體酶吸收及遞送至細胞之溶酶體區室，其可能需要酶具有足夠M6P位點，以經由非陽離子依賴性甘露糖6磷酸(M6P)受體(CI-MPR)由細胞吸收。
為了避免針對ERT之免疫系統介導之反應，可向個體投與另一療法以及ERT。此類額外療法可為例如免疫耐受誘導療法。額外療法可為例如環孢素A (CsA)或硫唑嘌呤(Aza)。 基因療法
本文所揭示之方法可包含用於治療TSD及SD之基因療法。舉例而言，包含本文所揭示之變體β-己糖胺酶之載體可用於基因療法。在一些實施例中，該載體為腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，載體能夠穿越血腦載體，諸如AAV9。在一些實施例中，載體為慢病毒載體。舉例而言，慢病毒載體可用於將編碼變體己糖胺酶α次單元之核酸分子轉移至造血幹細胞中，其接著可以離體基因療法形式向個體投與。
本文所揭示之載體可包含在載體之5'及3'端兩者處的腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
在一些實施例中，本發明提供一種改善患有TSD之個體之TSD之症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有TSD之個體投與有效量之包含編碼重組β-己糖胺酶之載體的AAV病毒顆粒。
在一些實施例中，本發明提供一種改善患有TSD之個體之SD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有SD之個體投與有效量之包含編碼重組β-己糖胺酶之載體的AAV病毒顆粒。 醫藥組合物
本發明之醫藥組合物可為本文所描述之任何醫藥化合物與諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑之其他化學組分之組合。醫藥組合物促進化合物投與生物體。在一些實施例中，重組β-己糖胺酶變體α次單元進一步包含可偵測標記、治療劑或藥物動力學修飾部分。在一些實施例中，可偵測標記包含螢光標記、放射性標記、酶、核酸探針或對比劑。
用於投與之醫藥調配物可包括呈水溶性形式之活性化合物之水溶液。活性化合物懸浮液可製備為油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有適合的穩定劑或增加化合物之溶解度以允許製備高度濃縮溶液之試劑。活性成分可呈在使用之前用適合媒劑(例如，無菌無熱原質水)復原之粉末形式。
醫藥組合物可以使用一或多種生理學上可接受之載劑來調配，生理學上可接受之載劑包含賦形劑及助劑，其有助於將活性化合物加工成可以在醫藥學上使用之製劑。調配物可以視所選投與途徑而進行修飾。包含本文所描述之化合物的醫藥組合物可例如藉由混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾過程來製造。
醫藥組合物可以包括至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及呈游離鹼或醫藥學上可接受之鹽形式的本文中所描述之化合物。醫藥組合物可含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝液及防腐劑。
適用於本發明之醫藥學上可接受之賦形劑之非限制性實例包括黏合劑、崩解劑、抗黏劑、抗靜電劑、界面活性劑、抗氧化劑、塗佈劑、著色劑、塑化劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、抗微生物劑、滾圓劑及其任何組合。
本文所揭示之醫藥組合物可調配於人工腦脊髓液(CSF)調配物中。CSF調配物可包含例如磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及氯化鈣。本文揭示一種醫藥組合物，其包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，其中該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及氯化鈣。本文揭示醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、0.8 mM氯化鎂、1.4 mM氯化鈣，pH 7.2。 投與本文所揭示之醫藥組合物
在實踐本文所提供之治療方法或用途時，在醫藥組合物中將治療有效量之本文所描述之重組β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體投與至患有待治療疾病或病狀之個體。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。治療有效量可視疾病嚴重度、個體之年齡及相對健康狀況、所用化合物之效力及其他因素而不盡相同。在一些實施例中，在個體呈現疾病之任何症狀之前，向個體投與醫藥組合物。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物在個體之疾病發作早期投與。在一些實施例中，在個體之疾病發作早期投與本文所揭示之醫藥組合物比在疾病後期投與醫藥組合物展示出更高功效。
重組β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體藉由任何適當途徑投與。在各種實施例中，靜脈內投與重組β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體。在其他實施例中，治療蛋白藉由直接投與至目標組織，諸如心臟或肌肉(例如，肌肉內)或神經系統(例如，直接注射至腦中；腦室內；鞘內)來投與。
在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物藉由引入個體中樞神經系統中，例如個體腦脊髓液中而投與。在一些實施例中，將醫藥組合物經鞘內、腦室內或側腦室內引入腦室空間中。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物經側腦室內投與。
舉例而言，本文所揭示之醫藥組合物可使用Ommaya儲集器投與。在Ommaya儲集器中，經由在前角形成的孔中插入腦室管，且與安裝在頭皮下的Ommaya儲集器相連，儲集器經皮下穿刺以鞘內遞送正被替換的特定酶，該酶被注射至儲集器內。本文所揭示之醫藥組合物可例如藉由單次注射鞘內給與。本文所揭示之醫藥組合物之投與可經由直接注射組合物或藉由使用輸注泵進行。
在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物藉由橫向腦室內注射投與至個體之大腦中。該注射可例如經由個體之顱骨中所製造的頭部穿孔進行。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物經由以手術方式插入分流器至個體之腦室中而進行投與。舉例而言，即使亦可注入至第三及第四較小腦室中，亦可注入至側腦室中，側腦室較大。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至腦、大腦或脊髓之一或多個表面或淺組織。在一些實施例中，大腦之目標表面或淺組織選自軟腦膜組織、大腦皮質帶組織、海馬體、Virchow Robin空間、VR空間內之血管、海馬體、大腦之下表面上之下丘腦部分、視神經及束、嗅球及突起及其組合。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至大腦或脊髓之一或多個深組織。在一些實施例中，大腦或脊髓之目標表面或淺組織位於大腦之表面下方4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm或10 mm。在一些實施例中，大腦之目標深組織包括大腦皮質帶。在一些實施例中，大腦之目標深組織包括以下各者中之一或多者：間腦、下丘腦、丘腦、丘腦前、丘腦下、後腦、豆狀核、基底節、尾核、殼核、杏仁核、蒼白球及其組合。
在一些實施例中，脊髓之目標表面或淺組織含有軟腦膜及/或白質之碎片。在一些實施例中，脊髓之目標深組織含有脊髓灰色物質及/或室管膜細胞。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至小腦之一或多個組織中。在一些實施例中，小腦之目標一或多個組織係分子層之組織、普金斯細胞(Purkinje cell)層之組織、顆粒細胞層之組織、小腦腳及其組合。在一些實施例中，將本文所揭示之治療劑傳遞至小腦之一或多個深組織，包括(但不限於)普金斯細胞層之組織、顆粒細胞層之組織、深小腦白質組織(例如相對於顆粒細胞層的深層)及小腦核深層組織。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至腦幹之一或多個組織。在一些實施例中，腦幹之目標一或多個組織包括腦幹白質組織及/或腦幹核組織。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至各種腦組織，包括(但不限於)灰質、白質、腦室周圍區域、軟膜-蛛網膜、腦膜、新皮質、小腦、大腦皮質層中的深層組織、分子層、尾核/殼核區、中腦、腦橋或髓質的深層區域及其組合。
在一些實施例中，將本文所揭示之醫藥組合物遞送至腦中之各種細胞，包括(但不限於)腦幹之神經元、脊髓之神經元、膠細胞、血管周細胞及/或腦膜細胞。在一些實施例中，將治療蛋白遞送至深層白質之寡樹突神經膠質細胞。
本文所揭示之醫藥組合物可單獨或與其他藥劑(諸如抗組織胺(例如苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制劑或其他免疫治療劑)結合投與。本文所描述之醫藥組合物可在額外治療劑之前、同時或之後投與。舉例而言，額外治療劑可混合至含有治療蛋白之組合物中，且從而與治療蛋白同時投與。藥劑可單獨(例如不摻合)投與，但在投與治療蛋白短時間範圍內(例如在24小時內)進行投與。適合於與本發明組合物組合之醫藥活性劑之非限制性實例包括抗感染劑(亦即胺基糖苷)、抗病毒劑、抗菌劑、抗膽鹼激導性劑/抗痙攣劑、抗糖尿病劑、抗高血壓劑、抗贅瘤劑、心臟血管劑、中樞神經系統劑、凝血調節劑、激素、免疫劑及免疫抑制劑。
包含本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體可以治療有效量投與。本文所揭示之重組β-己糖胺酶變體α次單元可以約1 mg/mL、約2 mg/mL、約3 mg/mL、約4 mg/mL、約5 mg/mL、約6 mg/mL、約7 mg/mL、約8 mg/mL、約9 mg/mL、約10 mg/mL、約15 mg/mL、約20 mg/mL、約25 mg/mL、約30 mg/mL、約35 mg/mL、約40 mg/mL、約45 mg/mL或約50 mg/mL調配於醫藥組合物中。本文揭示一種醫藥組合物，其中包含重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體以約20 mg/ml之濃度調配。
用於特定個體之有效劑量可隨時間推移視個體需求而變化(例如，增加或減少)。舉例而言，在身體處於疾病或壓力時，或在疾病症狀惡化時，劑量可增加。
本文所揭示之醫藥組合物可在本文所揭示之任何病狀之症狀發作之後投與。若在後期疾病而非在早期疾病投與，則本文所揭示之醫藥組合物可顯示增加之功效。
在一些實施例中，本文揭示之醫藥組合物係每兩月一次、每月一次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每天投與。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物每週投與，持續12週，且隨後兩週一次進行投與。 用於本文揭示之方法中的套組
本文所揭示之化合物及組合物可封裝為套組。在一些實施例中，本發明提供一種套組，其包含本文所揭示之化合物，及關於套組在治療本文所描述之病狀中之使用的書面說明書。
本文所揭示之套組可包含如本文所描述之β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體，其用於以適用於向個體投與之劑量及形式治療溶酶體貯積病及溶酶體靶向部分。在一些實施例中，套組可包含用於鞘內遞送酶之裝置。
本文所揭示之套組可包含關於鞘內投與本文所揭示之醫藥組合物之說明書。在一些實施例中，本文所揭示之套組包含用於鞘內投與本文所揭示之醫藥組合物之導管或其他裝置。舉例而言，本文所揭示之套組可包含預載有醫藥學上可接受之調配物中的0.001-0.01 mg、0.01-0.1 mg、0.1-1.0 mg、1.0-10 mg、10-100 mg或更多之治療蛋白的導管，該治療蛋白包含溶酶體酶及溶酶體靶向部分，諸如HexD3或HexA。 實施例
實施例1包含一種形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其包含在對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元的S184、P209、N228、P229、V230、T231、P429、K432、D433、I436、N466、S491、L493、T494、F495、E498、L508、Q513、N518、V519、F521及E523的位置處的一或多個胺基酸序列取代或缺失，且進一步包含一或多個胺基酸序列元件，該一或多個胺基酸序列元件使得對β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體的細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加。
實施例2包含如實施例1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中增加細胞攝取之該一或多個胺基酸序列元件係選自由相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元之胺基酸序列取代、添加或缺失組成之群。
實施例3包含如實施例1至2中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含一或多個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例4包含如實施例1至3中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例5包含如實施例1至4中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例6包含如實施例1至5中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例7包含如實施例1至6中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少二十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例8包含如實施例1至7中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
實施例9包含如實施例1至8中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少85%序列一致性之第一胺基酸序列，且使得對該β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的該一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。
實施例10包含如實施例1至9中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少90%序列一致性。
實施例11包含如實施例9或實施例10之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少95%序列一致性。
實施例12包含如實施例9至11中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少99%序列一致性。
實施例13包含如實施例9至12中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
實施例14包含如實施例9至13中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列在該第一胺基酸序列之N端。
實施例15包含如實施例9至14中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少20個連續胺基酸殘基。
實施例16包含如實施例9至14中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少100個連續胺基酸殘基。
實施例17包含如實施例9至14中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少100個連續胺基酸殘基。
實施例18包含如實施例9至14及17中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少150個連續胺基酸殘基。
實施例19包含如實施例9至14及17至18中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少85%序列一致性。
實施例20包含如實施例9至14及17至19中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少90%序列一致性。
實施例21包含如實施例9至14及17至20中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少95%序列一致性。
實施例22包含如實施例9至14中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
實施例23包含如實施例1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
實施例24包含如實施例23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
實施例25包含如實施例23或實施例24之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
實施例26包含如實施例23至25中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
實施例27包含如實施例23至26中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸。
實施例28包含如實施例23至27中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸。
實施例29包含如實施例23至28中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸。
實施例30包含如實施例23至29中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸，且與該至少500個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
實施例31包含如實施例23至30中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸，且與該至少525個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
實施例32包含如實施例23至31中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸，且與該至少550個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
實施例33包含如實施例23至32中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。
實施例34包含如實施例1至33中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體包含相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的甘露糖-6-磷酸化(M6P)。
實施例35包含如實施例34之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少3個M6P位點由M6P佔據。
實施例36包含如實施例34或實施例35之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少4個M6P位點由M6P佔據。
實施例37包含如實施例1至36中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在GM2活化因子蛋白之存在下展現出GM2神經節苷脂水解活性。
實施例38包含如實施例1至37中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之該細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加至少2倍、5倍、10倍、20倍或25倍。
實施例39包含如實施例38之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之該細胞攝取係在來自SD患者之人類纖維母細胞中同二聚體及甘露糖-6-磷酸的競爭分析中，藉由攝取非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)來評估的。
實施例40包含如實施例1至9中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體具有增加的熱穩定性。
實施例41包含如實施例40之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為約60℃至約63℃。
實施例42包含如實施例1至41中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體增加小鼠的壽命。
實施例43包含如實施例1至42中任一例之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體使小鼠的壽命增加至少2倍。
實施例44包含一種同二聚體，其包含如實施例1至43中任一項之重組β-己糖胺酶變體α次單元。
實施例45包含一種醫藥組合物，其包含根據實施例44之同二聚體及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
實施例46包含如實施例45之醫藥組合物，其中該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及氯化鈣。
實施例47包含如實施例46之醫藥組合物，其包含1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、0.8 mM氯化鎂、1.4 mM氯化鈣，pH 7.2。
實施例48包含如實施例46之醫藥組合物，其中包含該重組β-己糖胺酶變體α次單元之該同二聚體以約20 mg/ml之濃度調配。
實施例49包含一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例45至48中任一例之醫藥組合物。
實施例50包含一種改善患有SD之個體的SD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例45至48中任一例之醫藥組合物。
實施例51包含如實施例49或50之方法，其中該醫藥組合物經腦室內向該個體投與。
實施例52包含如實施例49至51中任一例之方法，其中該醫藥組合物經腦室內每週向該個體投與。
實施例53包含如實施例49至51中任一例之方法，其中該醫藥組合物每隔一週投與。
實施例54包含如實施例49至51中任一例之方法，其中該醫藥組合物以規則時間間隔投與，其中該規則時間間隔大於每隔一週。
實施例55包含一種核酸，其編碼包含如實施例44之重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體。
實施例56包含一種載體，其包含如實施例55之核酸及一或多個基因調控區。
實施例57包含如實施例56之載體，其進一步包含在該載體之5'及3'端兩者處的腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
實施例58包含一種AAV病毒顆粒，其包含如實施例57之載體。
實施例59包含一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如實施例58之AAV病毒顆粒。
實施例60包含一種改善患有TSD之個體的SD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如實施例58之AAV病毒顆粒。
實施例61包含一種減少患有TSD或SD之個體中的GM2神經節苷脂累積的方法，其包含向患有TSD或SD之個體投與有效量之如實施例45至48中任一例之醫藥組合物。
實施例62包含一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如實施例45至48中任一例之醫藥組合物。
實施例63包含一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如實施例58之AAV病毒顆粒。
實施例64包含一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如實施例45至48中任一例之醫藥組合物。
實施例65包含一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如實施例58之AAV病毒顆粒。
實施例66包含如實施例62至65中任一例之方法，其中TSD或SD疾病進展的該生物標記為GM2及GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)或神經絲輕鏈或游離聚醣。
實施例67包含如實施例49之方法，其中該個體為TSD症狀發生前。
實施例68包含如實施例49或實施例67之方法，其中該個體具有TSD相關突變。
實施例69包含如技術方案49或67至68中任一例之方法，其中該個體具有相對於TSD之生物標記的對照水準升高的TSD之生物標記的水準。
實施例70包含如實施例69之方法，其中TSD生物標記之該升高水準係自來自該個體之樣品中獲得的TSD生物標記的量測值。
實施例71包含如實施例69或實施例70之方法，其中TSD生物標記之該對照水準係來自不具有TSD相關突變之個體之樣品的TSD生物標記的量測值。
實施例72包含如實施例70或實施例71之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。
實施例73包含如實施例70至72中任一例之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品係自CSF或血液獲得。
實施例74包含如實施例70至72中任一例之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品為血漿樣品。
實施例75包含如實施例69至74中任一例之方法，其中該TSD之該生物標記的該升高水準相對於該TSD生物標記的該對照水準升高至少100%至4000%。
實施例76包含如實施例69至74中任一例之方法，其中該TSD之該生物標記的該升高水準相對於該TSD生物標記的該對照水準升高至少2×至100×。
實施例77包含如實施例69至76中任一例之方法，其中該生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。
實施例78包含如實施例50之方法，其中該個體為SD症狀發生前。
實施例79包含如實施例50或實施例78之方法，其中該個體具有SD相關突變。
實施例80包含如實施例50或78至79中任一例之方法，其中該個體具有相對於SD之生物標記的對照水準升高的SD之生物標記的水準。
實施例81包含如實施例80之方法，其中SD生物標記之該升高水準係自來自該個體之樣品中獲得的SD生物標記的量測值。
實施例82包含如實施例80或實施例81之方法，其中SD生物標記之該對照水準係來自不具有SD相關突變之個體之樣品的SD生物標記的量測值。
實施例83包含如實施例81或實施例82之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。
實施例84包含如實施例81至83中任一例之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品係自CSF或血液獲得。
實施例85包含如實施例81至83中任一例之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品為血漿樣品。
實施例86包含如實施例80至84中任一例之方法，其中該SD之該生物標記的該升高水準相對於該SD生物標記的該對照水準升高至少100%至4000%。
實施例87包含如實施例80至84中任一例之方法，其中該SD之該生物標記的該升高水準相對於該SD生物標記的該對照水準升高至少2×至100×。
實施例88包含如實施例80至87中任一例之方法，其中該生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。 實例實例1：變體己糖胺酶酶類之表現及純化
變體己糖胺酶酶類(HexD3、HexM及Mod2B)之表現構築體係於表現載體pXC17.4中產生。HexD3構築體係由編碼HexM的羧基部分的DNA與編碼HexB的胺基末端部分(包括信號序列)的DNA接合而成。將各種己糖胺酶編碼片段插入表現載體pXC17.4中。
己糖胺酶編碼質體轉染至懸浮液GSKO CHO (麩醯胺酸合成酶基因剔除中國倉鼠卵巢)細胞中。細胞在具有6 mM麩醯胺酸之CDCHO培養基中在37℃及8% CO 2下之搖瓶中生長。使用電穿孔法對12×E6個細胞中的40 µg線性化質體DNA進行轉染。在轉染之後，將細胞以2500個細胞/孔塗佈於CDCHO培養基(-)麩醯胺酸中。培養盤在37℃及8% CO 2下培育約4至6週以鑑別純系生長。接著藉由針對己糖胺酶酶活性之4-MU活性分析法篩選菌落，且將具有最高酶活性之菌落轉移至CDCHO培養基(-)麩醯胺酸中之24孔盤中，隨後使呈現最高活性之純系後續轉移至6孔盤。最終，將純系轉移至搖瓶中以鑑別懸浮液培養物中之最佳表現純系。
使用標準蛋白質純化技術進行重組酶純化。起始物質為來自上文所描述之燒瓶培養物的哺乳動物細胞培養物上清液，其從-80℃的儲存中解凍。物質用NaCl調整以達到1 M之最終濃度，繼之進行0.2 μm無菌過濾。
將經過濾材料裝載至丁基疏水性相互作用管柱上，用丁基負載緩衝液(20 mM Tris，1 M NaCl，pH 7.5)預平衡。使用丁基溶離緩衝液(20 mM Tris，pH 7.5)，將結合材料用線性梯度經10份管柱體積溶離。將來自溶離峰之樣品彙集，緩衝液更換成20 mM Tris，pH 7.5，且裝載至Q陰離子交換管柱上。結合之蛋白質隨後用線性梯度(10份管柱體積)，使用Q溶離緩衝液(20 mM Tris，1 M NaCl，pH 7.5)溶離。純化之樣品接著使用離心旋轉濃縮器進行緩衝液更換，且進行無菌過濾以用於儲存。 己糖胺酶變體之構築、表現、製造、純化及調配。
使用DNA2.0套裝軟體產生編碼HexD3之DNA構築體。HexD3為包含獲自β-己糖胺酶之α及β次單元之序列的雜交物，該等β-己糖胺酶之結構構建於HexM之結構上。特定言之，HexD3含有β-次單元之信號序列及胺基端序列，其含有增加變體酶上M6P基團之數目的共有醣基化位點，其融合至α次單元之羧基端，該α次單元在對應於天然β-己糖胺酶α次單元序列的S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N的胺基酸位置處具有取代或缺失(圖1B)。
HexD3保留用於GM2AP結合之α/β界面、用於同二聚體穩定性之β/ β二聚體界面以及用於HexM之α次單元活性位點。與HexM相比，HexD3含有額外甘露糖-6-磷酸化(M6P)位點，以增加受體介導之細胞外攝取及遞送至溶酶體。為了添加M6P位點，HexM α次單元骨架上之整個域1經β-次單元域1置換。與HexM (2/6)及HexA (3/7)相比，此置換引起M6P型N-聚醣含量(4/8)增加。
HexM為α次單元之同二聚體變體己糖胺酶，其在對應於天然β-己糖胺酶α次單元序列的S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N的胺基酸位置處具有取代或缺失
對於大規模生產，表現變體己糖胺酶蛋白質之細胞在生物反應器中生長，進行典型的分批補料生產運作(14天)。如下自培養基純化HexD3蛋白質。將所收集之改良性培養基鹽調節至1 M NaCl，隨後負載至丁基瓊脂糖4 FF管柱上。藉由減少鹽梯度自丁基瓊脂糖4 FF管柱溶離變異型己糖胺酶蛋白質，收集且透析，且接著將其裝載於Q瓊脂糖HP管柱上。自Q瓊脂糖HP管柱鹽溶離變體己糖胺酶蛋白質，濃縮，且接著經由製備型丙烯葡聚糖凝膠S300尺寸排阻層析進一步純化。使用此純化程序，產生高度純化、酶活性變體己糖胺酶蛋白質。經純化之變體己糖胺酶蛋白質以20 mg/mL調配於由pH 7.2之1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀組成之人工腦脊髓液(CSF)中。內毒素水準在ICV投與之可接受範圍內：例如對於HexA為0.006 EU/mg且對於HexD3為0.004 EU/mg。
為確定HexA變體之N-聚醣輪廓是否不同，使用肽N-糖苷酶F (PNGase F)評估聚醣輪廓以自變性蛋白質裂解天冬醯胺連接(N-連接)之寡醣。裂解後，寡醣經乾燥且藉由用螢光染料8-胺基芘-1,3,6-三磺酸還原胺化衍生。將經標記寡醣施加至葡聚糖凝膠G10旋轉管柱以移除過量染料。接著藉由毛細管電泳分離經純化之寡醣。在P/ACE MDQ CE上，使用具有50 μ m I.D之65 cm N-CAP塗佈之毛細管以及提供N-CAP之套組進行樣品之電泳。 圖 16表明，HexD3及HexM具有與HexA相比不同的醣基化模式。在 圖 16中，BPM意謂雙磷酸化寡甘露糖型聚醣結構，MPM意謂單磷酸化寡甘露糖型聚醣結構，且Man係指寡甘露糖型聚醣結構。Man-7、8或9係指重複甘露糖單醣單元組合形成聚醣結構。
另外， 圖 18中比較HexD3及HexA之細胞半衰期。HexD3之細胞穩定性與其他溶酶體蛋白質之攝取相當(T 1 / 27至14天)。將細胞暴露於Hex同功酶4小時，洗滌，溶解且使用人工基質(MUGS)分析酶活性。各資料點表示3個孔之平均值(n=3)。
表 3 ：圖 18 之動力學資料
T 1 / 2 ( 天 ) 二階衰減速率 Hex A Hex D3
桑德霍夫 k 1 0.4 0.8
桑德霍夫 k 2 24 7
泰-薩克斯 k 1 0.9 1
泰-薩克斯 k 2 16 14
實例 2 ： 產生 HEXA 酶
使用電穿孔將己糖胺酶編碼質體(α次單元及β次單元)共轉染至懸浮液GSKO CHO細胞中。在轉染之後，將細胞以2500個細胞/孔接種於CDCHO培養基(-)麩醯胺酸中，隨後在37℃及8% CO 2下培育約4至6週以鑑別純系生長。接著藉由針對己糖胺酶酶活性之4-MU活性分析及使用抗HexA抗體及抗HexB抗體之西方墨點分析篩選菌落，以測定兩種次單元之表現。大多數篩選菌落僅表現β次單元，且因此表現HexB同二聚體；然而，發現少數菌落穩定地表現己糖胺酶同功酶(包括HexA異二聚體)之混合物。鑑別表現HexA異二聚體之細胞且以懸浮液培養物形式儲存。
使用標準蛋白質純化技術進行純化。在標準純化方法中，自在-80℃儲存中解凍在37℃水浴中或在室溫下儲存中解凍儲存條件培養基。將材料pH值調節至pH 6.0且進行0.2 µm過濾。
將經過濾材料直接裝載至已用陰離子交換負載緩衝液(20 mM BisTris，pH 6.0)預平衡之陰離子交換樹脂上。隨後用洗滌緩衝液(20 mM BisTris，75 mM NaCl，pH 6.0)洗滌結合材料，洗滌10份管柱體積。在洗滌之後，用10份管柱體積之溶離緩衝液(20 mM BisTris，200 mM NaCl，pH 6.0)溶離相關蛋白質。收集溶離物且將5M NaCl添加至樣品中直至導電率與第二步苯基疏水性相互作用管柱平衡緩衝液(20 mM NaPO4，1.5 M NaCl，pH 7.0)匹配為止。pH值調節至pH 7.0之後，將樣品裝載至管柱上，且首先用洗滌緩衝液(20 mM NaPO 4，1.3 M NaCl pH 7.0)洗滌結合蛋白10份管柱體積，接著用10份管柱體積之溶離緩衝液(20 mM NaPO 4pH 7.0)溶離。將最終合併之材料緩衝液更換成人工CSF調配物緩衝液，濃縮且無菌過濾以儲存在-80℃下。 實例 3 ：天然基質酶活性分析及酶熱穩定性
在天然基質分析中活體外測定經修飾重組人類Hex同二聚體之酶促活性。
用於天然基質分析中之材料包括：神經節苷脂單唾液酸化-2基質(GM2、磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯肌醇(PI)及膽固醇(Chol))。材料分別以10:50:20:20之莫耳比用於製備脂質體。簡言之，以指定莫耳比將GM2 (1:1於甲苯:乙醇中)、PC (2:1於甲苯:乙醇中)、PI (於氯仿中)及膽固醇(2:1於氯仿:甲醇中)混合在一起，真空乾燥，隨後再懸浮於1 mL 1 mM Tris緩衝液，pH 7.4中。最終脂質體製劑中之GM2濃度為1 mg/mL且儲存在-20℃下。將經修飾之重組人類Hex蛋白濃縮至大約20 mg/mL，調配於人工CSF (0.2 mM NaH 2PO 4，0.8 mM Na 2HPO 4，3 mM KCl及148 mM NaCl，pH 7.2)中且在-80℃下儲存。在含有10%甘油之酸性PBS (pH 6.5)中以1.3 mg/mL之濃度製備含有N端6x-組胺酸標籤(SEQ ID NO: 18)之重組人類GM2活化因子蛋白(GM2AP)且儲存在-80℃下。
天然基質分析-在聚丙烯微量離心管中，製備2×之GM2AP連續稀釋液，自1.26 mg/mL (66 μM)至0.079 mg/mL (4 μM)加上一個空白。在6個單獨聚丙烯離心管中，將5 µL以下分析組分中之每一者進行混合：分析緩衝液(0.2 M檸檬酸鈉，pH 4.4，含有1 mg/mL BSA)、GM2脂質體及己糖胺酶(0.2 mg/mL)。藉由將起始濃度除以4來計算分析中各反應組分之最終濃度，因為各反應組分被添加至混合物中的體積相等(5 µL/各組分，總反應體積=20 µL)。
為開始反應，將GM2AP稀釋液(5 µL)添加至各試管中，包括空白(無GM2AP)，隨後在37℃下培育1小時。藉由添加50 µL甲醇將20 µL反應物淬滅。將樣品劇烈渦旋10秒，隨後以12,000 rpm離心30秒。將上清液轉移至聚丙烯HPLC小瓶以藉由質譜分析評定產物形成(GM2至GM3)。
HPLC-20 µL經淬滅之上清液注射於先前已用60%甲醇、5 mM甲酸銨及1%甲酸(移動相A)平衡之C4 RP管柱上。GM2及GM3神經節苷脂使用0-50%梯度用99%甲醇、5 mM甲酸銨及1%甲酸(移動相B)溶離10分鐘。
質譜分析-最終反應混合物中GM2及GM3之量藉由質譜分析使用各神經節苷脂之[M+2H] + 2萃取之離子(m/z分別為701及600)進行定量。在此等條件下未觀測到飽和，因此使用最高濃度之GM2AP計算比活性且單位為nmol產生之GM3/min/mg Hex (表4)。
表 4
蛋白質構築體 比活性 GM2 (nmol GM3/min/mg) Vmax (nmol GM3/min/mg) Km [GM2AP], μ M
HexA (野生型； α / β異二聚體) 45.8 85.8 ± 5.4 14.5 ± 1.6
HexM (經修飾之 α / α同二聚體) 20.6 44.8 ± 3.7 19.6 ± 2.5
HexD3 (經修飾之 α / α同二聚體) 13.6 25.0 ± 2.5 13.7 ± 2.4
Mod2B (經修飾之 β / β同二聚體) 1.6 3.5 ± 0.8 20.4 ± 7.3
各Hex蛋白質之GM2AP-依賴性動力學示於 圖 2中。使用此天然基質分析，展示例示性經修飾之Hex同二聚體，包括HexD3，在活體外均具有酶促活性。與野生型Hex異二聚體相比，針對天然基質(GM2)之所量測之酶促活性為25%至30%，而Mod2B僅展示在此等條件下之痕量級活性。GM2AP與Hex同二聚體之結合動力學與野生型異二聚體相當，表明在比活性中觀測到之差異係歸因於基質之催化而非GM2AP與Hex同二聚體之結合。
表 5 ：圖 2 之動力學資料
構築體 Vmax Vmax 之標準誤差 Km Km 之標準誤差
Hex A 85.7638 5.4903 14.5356 1.6092
Hex M 44.8184 3.7100 19.5973 2.5583
Hex D3 24.9866 2.4713 13.6721 2.3786
Mod2B 3.5240 0.8086 20.4290 7.2727
Hex變體之熱穩定性或熔融溫度(Tm)藉由奈米差示掃描螢光測定法方法使用Prometheus NT.48測定。在pH 7.2之1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀中製備用於熱去摺疊實驗之蛋白質樣品，最終濃度為0.013-2.4 mg/ml。在溫度增加(以1℃/min下自20℃增加至95℃)時，在350 nm及330 nm之發射波長下監測基於螢光之熱去摺疊。螢光量測用於獲得野生型及經修飾之Hex蛋白質之Tm值。相比於較不穩定的野生型HexA (α/β)及HexS (α/α)二聚體(Tm=56℃至57℃)，經修飾之Hex同二聚體展現增加的熱穩定性，由60℃至63℃之較高Tm範圍指示( 表 6)。
表 6
蛋白質構築體 (0.013 - 2.4 mg/ml) Tm ( ℃ )
HexA (野生型； α / β異二聚體) 56.5 ± 0.8
HexB (野生型； β / β同二聚體) 62.2 ± 0.8
HexS (野生型； α / α同二聚體) 55.8 ± 0.4
HexM (經修飾之 α / α同二聚體) 62.1 ± 0.1
HexD3 (經修飾之 α / α同二聚體) 59.8 ± 0.4
Mod2B (經修飾之 β / β同二聚體) 62.8 ± 1.1
熱穩定性在不同批次之HexA及HexD3之間一致，其中HexD3隨後比HexA更穩定，如 圖 17A中所示。 圖 17A展示HexA及HexD3之熔融溫度(Tm)之3次量測的熔融溫度。為測定熱穩定性，進行差示掃描熱量測定法(DSC)。以25 mg/ml之濃度於1 mM PO 4、4%海藻糖、0.005% PS20、150 mM NaCl (pH 7.0)中製備HexA及HexD3蛋白質。所有實驗均在20至100℃溫度範圍內進行，加熱速率(dT/dt)為1℃min − 1。對於DSC，在3 atm之超壓下，藉由TA Nano-DSC儀器及NanoAnalyze軟體自動記錄隨溫度而變化的熱功率(dQ/dt)變化。原始資料經進一步處理以使用以下關係式產生隨溫度(T)而變的過量熱容量(Cp)之熔融等溫線：Cp = [(dQ/dt)]/ [(dT/dt)PV]，其中P為裝載至量熱細胞中之蛋白質之初始濃度且V為量熱細胞之有效體積(0.3 ml)。藉由剩餘MUG活性量測的CSF穩定性，展示HexM相對於HexA之增加的穩定性。MUG (4-甲基傘形基-2-乙醯胺基-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷)及MUGS (4-甲基傘形基-2-乙醯胺基-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷-6-硫酸酯)為易於用於偵測HexA及經修飾之Hex蛋白質之活性的合成螢光基質。倘若HexD3與HexM有相同的骨架，預測其穩定性與HexM相似。將Hex同功酶(最終濃度1 μg/mL)摻入含有50 mM BisTris，pH 7.3緩衝液之人類CSF中。在指定時間點處，在1 mM 4MUG存在下在37℃下分析10 uL樣品30分鐘( 圖 17B)。 圖 17B證實，HexM (經修飾之α/α同二聚體)維持比HexA更高的MUG活性，長達約6天，而HexA MUG活性在一天之後急劇降低。因此，HexD3已展現比HexA更熱穩定且預期與HexA相比在較長時間段內保留MUG活性( 圖 17A及 圖 17B)。 實例 4 ：合成基質酶活性分析
在兩種合成性基質分析中活體外測定經修飾重組人類Hex同二聚體之酶促活性。MUG及MUGS為容易用於偵測HexA及經修飾之Hex蛋白質之活性的螢光基質。儘管MUG及MUGS可藉由若干同功酶代謝，但GM2為HexA特有的。
MUGS及MUG於DMSO中各自製備成最終濃度為100 mM (儲備溶液)且儲存在-20℃下。在DMSO中，以10 mM製備4-甲基傘形酮(4-MU標準)之儲備溶液且在-20℃下以小等分試樣儲存。將經修飾之重組人類Hex蛋白濃縮至大約20 mg/mL，調配於人工CSF (0.2 mM NaH 2PO 4，0.8 mM Na 2HPO 4，3 mM KCl及148 mM NaCl，pH 7.2)中且在-80℃下儲存。
合成基質分析 -在黑色96孔稀釋培養盤上，使用2×標準物之連續稀釋液，自100 µM至1.56 µM，加上一個空白。在相同培養盤上，以若干稀釋度製備於分析緩衝液(56 mM檸檬酸鈉、88 mM磷酸鈉(二鹼基的)、0.5 mg/mL牛血清白蛋白，pH 4.4)中稀釋之蛋白質樣品以確保其在標準曲線內。
將50 µL標準品(100 µM至1.56 µM)或蛋白質樣品添加至50 µL基質(1 mM)，隨後在37℃下培育30分鐘。藉由添加200 µL停止緩衝液(0.5 M甘胺酸/NaOH，pH 10.7)淬滅反應物。在96孔螢光盤讀取器上以Ex355/Em460讀數，截止為455。
使用此合成性基質分析，展示例示性經修飾之Hex同二聚體，包括HexD3，在活體外均具有酶促活性。針對合成4-MUG及4-MUGS基質所量測之酶促活性與野生型Hex異二聚體相當( 表 7)。
與HexM及HexA相比，HexD3具有活性及穩定性差異( 表 7)。與HexM相比，HexD3對GM2AP之親和力有所提高，對人工基質4-MUG及4-MUGS的活性亦有所保留。域1修飾減弱HexD3-GM2比活性。然而，由於M6P含量增強，HexD3之K 攝取比HexM更佳且匹配HexA之       K 攝取。此外，HexD3顯示比HexA更大的熱穩定性。值得注意的係，β-醣基化位點N142比區域α次單元對應體N115更接近N端之六個胺基酸，其可影響穩定性。與HexA類似，發現HexD3在SD及泰-薩克斯人類纖維母細胞兩者中起作用。
表 7
蛋白質構築體 比活性 (MUG; μ mol/min/mg) 比活性 (MUGS; μ mol/min/mg) MUG/MUGS 比
HexA (野生型； α / β異二聚體) 66 23 2.9
HexB (野生型； β / β同二聚體) 79 n.d. N/A
HexS (野生型； α / α同二聚體) 19 23 0.80
HexM (經修飾之 α / α同二聚體) 31 47 0.66
HexD3 (經修飾之 α / α同二聚體) 27 39 0.69
Mod2B (經修飾之 β / β同二聚體) 20 16 1.25
實例 5 ： β - 己糖胺酶細胞攝取分析
使用細胞攝取分析測定變體β-己糖胺酶酶類經由受體介導之內吞作用進入細胞之能力。本文所描述之細胞攝取分析量測來自SD患者之人類纖維母細胞中非陽離子依賴性甘露糖6-磷酸酯受體(CI-MPR)的酶攝取。甘露糖6-磷酸(M6P)用作競爭性抑制劑以展示經由CI-MPR受體之攝取。收集資料以產生酶攝取之飽和曲線且測定該過程之動力學參數  K 攝取。
在攝取分析(24小時)之前，在24孔培養盤中以每0.5毫升1×10 5個細胞之密度接種匯合T-75燒瓶中的人類SD纖維母細胞(GM00203)。在攝取培養基中製備0.4-400 nM之酶樣品：496.6 mL DMEM + 13.0 mL 1.0 M HEPES  + 5.2 mL 50.0 mg/mL BSA  + 5.2 mL 200.0 mM L-麩醯胺酸。為了攝取抑制，將5.0 mM M6P添加至適當樣品中。
自細胞抽吸生長培養基(445 mL DMEM  + 50.0 mL FBS + 5.0 mL 20.0 mM L-麩醯胺酸)且替換為每孔0.5 mL攝取培養基。4小時培育後，將培養盤用1 mL 杜氏PBS (Dulbecco's PBS)洗滌2次。將120.0 µL M-PER溶解緩衝液添加至培養盤中且在室溫下用往復搖臂攪拌10分鐘及150運動/min 2。溶解物儲存在-80℃下直至即用於分析。
對於酶分析，將10 µL之各裂解物一式兩份添加至黑色96孔培養盤(VWR)中。
對於各酶負載，攝取表現為在30分鐘內釋放之4-MU的奈莫耳。對於飽和曲線，使用上文所描述之分析，使用0.4至400 nM範圍內之酶濃度產生飽和曲線。
藉由在14天時間段內監測細胞內β-Hex活性來測定經修飾之β-Hex蛋白質之細胞穩定性。在37℃下在5% CO 2氛圍中用400 nM最終濃度之β-Hex將12孔培養盤中之匯合人類SD纖維母細胞處理24小時。在24小時培育之後，在無β-Hex存在下將細胞轉換至生長培養基。對於各時間點(1天、2天、5天、8天、12天及14天)，細胞溶解於添加至培養盤中之200 µL M-PER溶解緩衝液中且在室溫下用往復搖臂攪拌10分鐘及150個運動/min 2。使用螢光4-MU基質分析細胞溶解物之β-Hex活性。使在14天樣品週期內的β-Hex活性之降低擬合成二階動力學以接近蛋白質之細胞半衰期。
使用此分析，包括野生型α/β異二聚體(HexA)、經修飾之β/β同二聚體(Mod2B)及經修飾之α/α同二聚體(HexD3)之β-Hex變體展示有效內化至具有平均K 攝取範圍為3至13 nM的SD纖維母細胞中( 圖 3A 及圖 3B)。相比之下，經修飾之α/α同二聚體(HexM)在此等實驗條件(≥ 120 nM)下展現不佳攝取效率( 圖 3A 及圖 3B)。M6P抑制HexM、HexA及HexD3之攝取，指示細胞攝取經由CI-MPR進行( 圖 4)。β-Hex變體之細胞穩定性與其他溶酶體酶處於同等水平，觀測到半衰期為約6至9天( 圖 5A 及圖 5B)。如藉由所計算之各別酶之不同速率常數所指示，雙相衰減可反映分析條件(亦即，持續24小時之400 nM高初始劑量)。衰減曲線之後期展現典型溶酶體穩定性，對於經修飾之同二聚體，估計半衰期為約6至14天，且對於野生型異二聚體估計半衰期為約16至25天，如SD或TS中HexA之T 1 / 2 ( 後期 )所指示。
表 8 ：圖 3A 之動力學
構築體 Vmax Vmax 之標準誤差 Km Km 之標準誤差
Hex A 102.7180 2.0158 3.3085 0.3236
Hex M 131.1395 2.3074 128.6621 5.3970
Mod2B 88.1564 3.3611 3.0053 0.5756
表 9 ：圖 3B 之動力學
構築體 Vmax Vmax 之標準誤差 Km Km 之標準誤差
Hex A 102.7180 2.0158 3.3085 0.3236
Hex M 131.1395 2.3074 128.6621 5.3970
Hex D3 92.9713 3.4393 5.7839 0.9793
表 10 ：圖 5A 之動力學
構築體 Hex A Hex M Mod2B
初始值1 42.7999 44.0250 30.4666
初始值1標準誤差 8.5996 9.1760 6.9092
速率常數1 1.5584 0.7223 2.2618
速率常數1標準誤差 0.8964 0.1860 1.5735
初始值2 57.3239 56.2869 69.6230
初始值2標準誤差 7.2619 9.1852 5.2035
速率常數2 0.0276 0.1121 -0.0003
速率常數2標準誤差 0.0132 0.0180 0.0077
T 1/2 ( 初始) 0.4天 1天 0.3天
T 1/2 ( 後期) 2天 6天 穩定
表 11 ：圖 5B 之動力學
構築體 Hex A - SD Hex A - TS Hex D3 - SD Hex D3 - TS
初始值1 42.5716 29.6571 46.5641 27.5500
初始值1標準誤差 8.3938 15.2082 4.3709 11.9428
速率常數1 1.6050 0.7909 0.8707 0.7160
速率常數1標準誤差 0.8576 0.7295 0.1198 0.4663
初始值2 57.5527 71.5947 53.2891 73.1086
初始值2標準誤差 7.1018 14.5027 4.3061 11.8163
速率常數2 0.0286 0.0439 0.1025 0.0498
速率常數2標準誤差 0.0129 0.0205 0.0094 0.0182
T 1/2 ( 初始) 0.4天 0.9天 0.8天 1天
T 1/2 ( 後期) 24天 16天 7天 14天
實例 6 ：腦室內 ( ICV ) 投與後之活體內 HEXD3 酶活性
為測定重組HexD3之活體內活性，向SD之β-己糖胺酶基因剔除(HEXB -/-KO)小鼠模型藉由腦室內(ICV)注射來投與HexD3。在6週齡時將永久性插管植入小鼠中。在恢復1週之後且在7至9週齡開始，將HexD3以5 µL之推注體積進行注射，投與5至10分鐘之時段。在兩週時間段內(100 µg/注射)每週給與ICV注射一次，總共進行3次注射。在第3次ICV注射之後24小時藉由心臟穿刺，接著用PBS灌注將動物安樂死。分離大腦且急驟冷凍。指標量測包括HexD3中大腦中之偵測及分佈、酶之組織活性水準、使用LAMP2信號校正細胞溶酶體、溶酶體生物標記BMP及GM2神經節苷脂儲存材料的降低。
使用螢光標記之合成基質活性分析測定活體內HexD3蛋白質之酶促活性，如下文所描述。
將冷凍的組織樣品(各稱重為150至300 mg之腦半球)轉移至預負載有氧化鋯珠粒之均質化試管，且將600 µL冷HPLC級水添加至各樣品中。在設定成4℃之冷室中用Bullet摻合器使樣品均質化。移除此勻漿之等分試樣(300 µL)用於Sensi-Pro分析(其量測基質累積)及質譜分析。在添加420 µL經冷卻T-Per緩衝液與蛋白酶抑制劑混合液之後，溶解管中之剩餘組織勻漿再次均質化。此勻漿與蛋白酶抑制劑一起轉移至含有額外300 µL T-Per之新試管中。將T-Per勻漿樣品在冷藏桌上型離心機中以最大速度(14,000 rpm)離心15分鐘，且將上清液轉移至新試管中且用於HexD3活性分析。使此等製備之樣品經受如下文所描述之酶活性分析。 活體內 HexD3 酶活性之分析
4-MUG及4-MUGS在DMSO中各製備成100 mM濃度且儲存在-20℃下。在DMSO中，以10 mM製備4-甲基傘形酮(4-MU標準)之儲備溶液且在-20℃下以小等分試樣進行儲存。
在透明的96孔稀釋培養盤上，4-MU標準物之3×連續稀釋液由75 µM至0.1 µM加一個空白組來製備，且HexD3標準物之3×連續稀釋液由4 ng/孔至0.0055 ng/孔加6 ng/孔及一種空白組來製備。用來自用作背景基質之未經治療之SD小鼠的腦蛋白質勻漿製備兩種標準物。以0.04 µg/µL之蛋白質濃度製備樣品。
為了量測組織中之HexD3活性，將50 µL如上文所描述之所有標準物及工作樣品一式兩份轉移至黑色未經處理之聚苯乙烯96孔盤中。對於各分析，將50 µL在1 mM之分析緩衝液(檸檬酸鹽，pH 4.4)中的基質添加至各孔中，隨後在37℃下培育30分鐘。隨後藉由向各孔添加200 µL停止緩衝液(0.5 M甘胺酸/0.3 M NaOH，pH 10.3)淬滅反應物。在具有365 nm下之激發波長及440 nm下之發射波長及435 nm之截止的FlexStation 3多模式微量培養盤讀取器上量測螢光。
使用SoftMax Pro 6.3獲得原始資料。藉由自7點標準曲線外推反應中產生之產物(4-MU)之量而計算樣品之活性程度，該標準曲線係藉由將已知量之4-MU加標至用作背景基質之SD小鼠腦蛋白質萃取物中而製備。活性水準表示為nmol裂解的4-MU/mg蛋白質/分鐘。來自ICV治療之SD小鼠的組織勻漿樣品中之活性人類HexD3之量根據標準曲線反演計算，該標準曲線係藉由將已知量之重組人類HexD3加標至用作背景基質之SD小鼠腦蛋白質萃取物中而製備。
使用此分析，在來自用HexD3治療之SD小鼠的腦勻漿樣品中偵測到針對合成螢光4-MUG及4-MUGS基質的HexD3活性，同時在來自未治療SD小鼠之樣品中未偵測到活性。在來自用HexD3給藥之小鼠之大腦勻漿中量測之平均活性與在來自野生型小鼠之大腦勻漿中量測之己糖胺酶活性相當( 圖 6A 及圖 6B)。在來自未經治療之SD小鼠的大腦勻漿中未偵測到針對任一基質之活性( 圖 6B)。與所用基質無關，基於活性分析測定的每毫克腦蛋白質HexD3之量係類似的，其與質譜資料充分相關( 圖 6C)。基於比活性，與所用螢光基質無關，計算類似量(NS，不顯著，t檢驗)。 實例 7 ：小鼠腦部勻漿中之 HEXD3 酶的偵測及定量
使用基於液相層析(LC)-平行反應監測(PRM)之靶向質譜分析(MS)測定野生型或SD小鼠腦蛋白質萃取物中HexD3蛋白質之量。 樣品製備
將冷凍小鼠腦樣品轉移至預負載有氧化鋯珠粒之均勻化試管，且將600 µL冷HPLC級水添加至各樣品中。在4℃之冷室中用Bullet摻合器使樣品均質化。隨後將四份Biognosys溶解緩衝液添加至一部分腦水勻漿中。所有樣品之蛋白濃度使用BCA分析測定。樣品係使用Biognosys還原及具有2-氯乙醯胺之烷基化溶液來還原及烷基化，且藉由經定序級改良之胰蛋白酶以50:1之蛋白質:蛋白酶比進行消化隔夜。使用C18 MacroSpin管柱清洗消化肽以進行質譜分析。使用真空離心蒸發濃縮器(SpeedVac)系統將清洗肽乾燥，且再溶解於含有iRT-肽混合物(Biognosys)之LC溶劑A (含0.1%甲酸(FA)之1%乙腈/水)中用於滯留時間校準。用SPECTROstar®奈米分光光度計在280 nm下量測肽濃度。以下定製穩定同位素標記之參考肽係專門為在其他腦蛋白質之背景中偵測HexD3而設計的：GSYSLSHIYTAQDVK ( SEQ ID NO : 15)、IQPDTIIQVWR ( SEQ ID NO : 16)、ISYGQDWR ( SEQ ID NO : 17)。對於HexD3蛋白質之絕對定量，使用等莫耳肽池且以已知濃度作為內部標準物摻入最終肽樣品中。 LC - PRM 量測
為定量HexD3，在Thermo Scientific Easy nLC 1200奈米-液相層析系統上將肽(1 µg/樣品)注射至室內封裝C18管柱(ReproSil-Pur120C18AQ，1.9 µm，120 Å孔徑；75 μm內徑，50 cm長度)。LC溶劑為A：含0.1% FA之1%乙腈/水；B：含0.1% FA之15%水/乙腈。LC梯度為5%-40%溶劑B，50分鐘，接著40%-90% B，2分鐘，及90% B中12分鐘(總梯度長度為64分鐘)。用於肽定量之LC-PRM運作係在配備有標準奈米-電噴霧源之Thermo Scientific Q Exactive質譜儀上進行。根據供應商之規範，碰撞能量為25 eV。
在PRM模式中進行不定期運行，隨後使用Biognosys之iRT概念獲取資料用於滯留時間校準。獲取窗為4分鐘。使用SpectroDive™ 7.0進行信號處理及資料分析。應用1%之Q-值濾波器。藉由將已知內部標準物肽之豐度與內源性肽進行比較來測定絕對定量。使用曲線下面積(內源性與參考肽之間)的比率測定樣品中之HexD3的絕對水準。
使用此分析，在小鼠腦蛋白質萃取物中偵測且定量HexD3蛋白質。所量測的HexD3量與使用基於4-MUG/4-MUGS之活性分析量測的HexD3量相關(r=0.995) ( 圖 7)。 實例 8 ：活體內 HEXD3 分佈及溶酶體校正
免疫組織化學(IHC)染色及原位酶促活性用於評估在ICV投與之後HexD3在小鼠腦中之分佈且評估HexD3 ICV ERT校正動物模型系統中溶酶體缺陷之能力。
將腦組織浸入固定於福馬林中且包埋於石蠟中。對於大部分IHC分析，在大致上矢狀竇(矢狀中線)處獲取7 µm厚矢狀切片，以描繪左腦半球及右腦半球。利用側腦室、海馬體、丘腦、腦橋(腦橋網狀核)及中心小腦區域之VIa小葉(對應於小葉小鼠Allen腦部圖譜(Allen Brain Atlas)之位置164)進行與矢狀切片之區域匹配。切片用針對LAMP2之抗體免疫染色。為了抗原擷取，將載玻片在Discovery CC1溶液中在95℃下浸沒30分鐘。阻斷緩衝液由2% NDS、0.1% BSA及0.3% Triton溶液於1×TBS組成。使用與Alexa Fluor 488結合之驢抗大鼠IgG (H+L)高度交叉吸附之二級抗體來偵測抗LAMP2抗體。將載玻片安放在DAPI Fluoromount中以觀察細胞核。
經由Adobe Photoshop及Image J套裝軟體進行信號分離及分析。對於螢光信號之定量，利用總調節信號之面積%進行下游分析。利用Tukey事後測試進行方差分析(ANOVA)以分析各治療組之間的差異。P＜0.05確定為在統計學上顯著的。
使用己糖胺酶酶促活性分析進一步量測外源性HexD3酶之活性及生物分佈。此分析之原理涉及使用萘酚化合物(己糖胺酶HexA之人工基質)定位活性重組己糖胺酶化合物(包括HexD3)之存在。65天(投與後)樣品之子集在無固定之情況下進行冷凍，準備用於此酶分析。
將來自同側注射側大腦之15 µm矢狀切割冷凍切片在含有2%甲醛、0.2%戊二醛及0.01% Nonidet P40替代物之溶液中在室溫下固定15分鐘。切片在基質萘甲酸AS-BI N-乙醯基-β-葡萄胺糖苷(NAP)中培育。NAP首先溶解於二甲基甲醯胺中(50-100 µl)。將6 mg/30-35 mL濃度之NAP稀釋於pH 4.5的1×檸檬酸鹽緩衝液(來自20×濃度)中，且培育3小時。隨後使用90 µL六偶氮副玫瑰苯胺將切片在NAP溶液，pH 5.2中再培育。等體積之此副玫瑰苯胺溶液(已在HCl中)與相同體積之4% (wt/vol)亞硝酸鈉溶液混合。將載玻片浸沒於副玫瑰苯胺試劑中1小時至2小時，直至形成紅色沈積物。
為確定萘酚信號是否定位在神經元細胞附近，將相同冷凍切片用針對NeuN之抗體(MAB377，1-100)免疫染色。為了抗原擷取，在酶促染色之後立即在95℃下將載玻片浸入Discovery CC1溶液中30分鐘。阻斷緩衝液含有2% NDS、0.1% BSA及0.3% Triton溶液於1×TBS。使用與Alexa Fluor 488 (A-21202，1-500)結合之驢抗小鼠IgG (H+L)高度交叉吸附之二級抗體來偵測抗NeuN抗體。將載玻片安放在DAPI Fluoromount中以觀察細胞核。
由於神經元為目標細胞類型，萘酚組織學染色轉化為偽螢光信號以與免疫螢光神經元染色NeuN共定位。可在整個組織中以及海馬體中之神經元中及神經元周圍看到萘酚染色( 圖 8)。使用所描述之方法， 圖 8顯示在中間圖中進行HexD3 ICV之Hex β-/-中使用NeuN及萘酚對CA1海馬體進行HexD3染色。顯微照片之左欄展示來自海馬體之CA1區之神經元核的NeuN染色。顯微照片之右欄顯示用代謝萘酚信號共染色的相同部分。箭頭指向各切片中之單一神經元( 圖 8)。
為理解在推注ICV注射後在腦組織中活性酶之生物分佈，藉由質譜分析對解剖腦區域之己糖胺酶進行表徵。 圖 9A顯示在單次ICV注射之後HexM的24小時生物分佈。熱圖係基於在解剖之大腦區域中發現之總HexM (作為Hex酶實例) ng/蛋白質的質譜分析定量。為了評估在HexA ICV注射之後的生物分佈，如3 q. wk之HexA之後所描述來處理腦組織。 圖 9B展示在HexA ICV方案之後的生物分佈。萘酚與質譜分析均顯示，後腦區(包括小腦及腦幹)對酶的暴露程度最低，似乎低於WT水準。
為理解LAMP2水準對大腦不同區域的影響，進行HexA或HexD3 ICV注射，且對海馬體、皮質、丘腦、腦幹及小腦LAMP2水準進行量化。儘管在不同腦區域中酶(HexA及HexDA3)水準不同，但整個大腦的LAMP2都受到抑制，甚至在小腦及腦幹區域亦如此( 圖 9C)。因此，在遠離投與位點之腦區域中之酶水準要低得多，但仍足夠高以恢復溶酶體的健康。即使在重複ICV注射(7次劑量，每週一次)之後，HexA的積累程度亦比HexD3大( 圖 9D)。
神經元係Hex替代療法之主要目標。為證實Hex活性與免疫螢光神經元染色NeuN之共定位，將萘酚組織學染色轉化為偽螢光信號( 圖 9E)。在 圖 9E之左上圖中，展示CA1野生型海馬體之染色，其中可在整個組織中、在海馬神經元中及周圍均看到萘酚染色。如在 圖 9E之右上圖中所見，萘酚信號在Hex β-/-背景中減少。使用神經元表現之Hex轉殖基因之研究展示海馬體中Hex之活性定位的模式類似。使用CA1海馬層，發現HexA及HexD3兩者之強信號，如 圖 9E之左下圖及右下圖中所示。
在一些情況下，CSF中之蛋白質可擴散至血流中且可藉由外周組織(諸如肝)拾取。為了評估肝臟中之HexA及HexD3分佈，對肝樣品進行萘酚染色以測定HexA或HexD3活性之存在。藉由萘酚染色，當比較 圖 9F之左下圖(HexA ICV )及右下圖(HexD3 ICV)時，HexA展示大於HexD3之肝臟累積。HexD3分佈及水準最接近地類似於WT( 圖 9F)。過量HexA染色集中於肝細胞周圍，可能在細胞外空間中。藉由LAMP2染色確定的肝臟溶酶體病變的逐漸增加，在ICV給藥HexA或HexD3之後亦被阻止( 圖 9G)，儘管HexD3酶似乎最有效地減少肝臟中LAMP2之表現。 實例 9 ：神經節苷脂及神經節苷脂前驅體水準之活體內分析
為了研究HexD3相比於HexA之原位活性，兩種純化酶藉由ICV注射至SD之Hexβ-/-KO小鼠模型中遞送至CNS。在2個月大時、在無症狀階段且在CNS惡化之前向小鼠注射。三次劑量各相隔一週藉由ICV插管遞送( 圖 10A)。在第3次劑量後二十四小時，自腦勻漿分析Hex活性、溶酶體生物標記脂質BMP及Hex天然基質。HexA顯示MUG及MUGS活性高於WT水準( 圖 10B)。相比之下，MUG (但非MUGS)活性對於HexD3顯著較低( 圖 10B)。HexD3之活性仍達到平均WT水準。相比於僅用媒劑治療，HexD3展示脂質BMP顯著較佳之降低( 圖 10C)。此外，HexD3能夠如HexA一樣有效地降低神經節苷脂GM2及GA2( 圖 10D)，即使在較小程度上。相反地，HexA在提高GM3水準(GM2代謝產物)方面表現得較好，根據 圖 10D之中間右圖。HexA亦顯著降低已知累積於SD中之N-聚醣代謝物(A2G0')的水準，其超過HexD3 ( 圖 10D)。雖然此等參數表明HexD3在基質代謝方面具有整體較弱的效力，但上面提到的磷脂BMP水準及LAMP2校正表明HexD3在改善溶酶體健康方面具有更大的性能。 樣品製備
使用Omni Bead Ruptor 24均質器用1.4 mm陶瓷珠粒在500-1000 µL水中均質化腦組織。使用Pierce BCA分析套組測定勻漿之蛋白質濃度。所有勻漿用水稀釋至4 µg蛋白質/µL勻漿。等於200 µg蛋白質(50 µL經稀釋勻漿)之量的樣品用500 µL 95/5甲醇/冰乙酸(v/v)萃取2小時，每20分鐘進行簡單渦旋。使樣品在5,000 rpm下短暫離心5分鐘且將上清液轉移至Nanosep Omega 10K離心過濾管中。樣品以12,000 rpm離心直至所有樣品通過過濾器，約30分鐘。直接注射樣品至LC-MS/MS或在-20℃下儲存直至使用。 標準製備
所有樣品均使用外部標準物校準曲線定量。標準物以95/5甲醇/冰乙酸(v/v)製備。神經節苷脂標準曲線為作為GM1、GM2、GM3、GA1及GA2標準物之混合物製備的五點標準曲線(100-6.25 pg/µL)。BMP標準曲線為BMP 14:0之五點標準曲線(100-6.25 pg/µL)。所有BMP 22:6濃度均報告為BMP 14:0之當量。 神經節苷脂之 LC - MS / MS 層析
在配備有聚醣BEH醯胺管柱(1.7 µm，2.1×150 mm)之Acquity UPLC系統上進行LC-MS/MS神經節苷脂分析，其中聚醣BEH醯胺VanGuard預管柱(1.7 µm，2.1×5 mm)連接至Xevo TQ-S微型三重四極桿質譜儀。移動相A為含5 mM乙酸銨之94.5%乙腈、2.5%甲醇、2.5%水及0.5%甲酸。移動相B為水。LC溶離梯度詳述於下 表 12中。管柱在整個操作中保持在50℃下。樣品藉由ESI以正模式電離。毛細管電壓設定為1.0 kV。去溶劑化溫度設定為500℃且去溶劑化氣流為1000 L/hr。錐體電壓設定為10 V且錐體氣流為10 L/hr。針對各神經節苷脂監測下文詳述之兩種前驅體至產物的離子轉移，一種為36:1物種及一種為38:1物種( 表 13)。
表 12 ： LC 梯度計劃
步驟 總時間 ( min ) 流速 ( mL / min ) 移動相 A (%) 移動相 B (%)
1 0.0 0.400 95 5
2 2.0 0.400 95 5
3 12.0 0.400 50 50
4 16.0 0.400 50 50
5 16.1 0.400 95 5
6 20.0 0.400 95 5
表 13 ：分析物轉移
分析物 物質 前驅體離子 產物離子 錐體 (V) 碰撞能量 ( V ) 大致滯留時間 ( min )
GM1 GM1(36:1) 1546.7 366.1 10 36 7.2
GM1(38:1) 1574.7 366.1 10 36
GA1 GA1(36:1) 1255.7 366.1 10 24 6.6
GA1(38:1) 1283.8 366.1 10 24
GM2 GM2(36:1) 1384.7 204.1 10 44 6.6
GM2(38:1) 1412.7 204.1 10 44
GA2 GA2(36:1) 1093.6 264.3 10 54 5.3
GA2(38:1) 1121.6 292.3 10 54
GM3 GM3(36:1) 1181.5 264.3 10 54 6.1
GM3(38:1) 1209.6 292.3 10 54
BMP 磷脂之 LC - MS / MS 層析
在配備有HSS C18管柱(1.8 µm，1.0×150 mm)與0.2 µm在線過濾器之Acquity UPLC系統上進行LC-MS/MS BMP磷脂分析，其中該過濾器使用以下 表 14中之條件連接至Xevo TQ-S微型三重四極桿質譜儀，且藉由Sensi-Pro量測A2G0'游離聚醣。移動相A為含5 mM甲酸銨之74%甲醇、25%水及1%甲酸。移動相B為含5 mM甲酸銨之99%甲醇及1%甲酸。下文詳述LC溶離梯度。管柱在整個操作中保持在50℃下。樣品藉由ESI以負模式電離。毛細管電壓設定為3.5 kV。去溶劑化溫度設定為600℃且去溶劑化氣流為1000 L/hr。錐體電壓設定為10 V且錐體氣流為0 L/hr。針對各BMP物質，14:0及22:6，監測到一種前驅體至產物的離子轉移( 表 15)。
表 14 ： LC 梯度計劃
步驟 總時間 ( min ) 流速 ( mL / min ) 移動相 A (%) 移動相 B (%)
1 0.0 0.100 80 20
2 1.0 0.100 80 20
3 6.0 0.100 0 100
4 16.0 0.100 0 100
5 16.1 0.100 80 20
6 20.0 0.100 80 20
表 15 ：分析物轉移
分析物 前驅體離子 產物離子 錐體 (V) 碰撞能量 ( V )
BMP 14:0 665.4 227.2 10 32
BMP 22:6 865.5 327.3 10 32
實例 10 ：用變體己糖胺酶治療之 SD 小鼠的存活分析
為評估HexD3及HexA校正己糖胺酶活性之損失的能力，經純化之HexD3或HexA投與至缺乏己糖胺酶活性之小鼠的大腦。在6週齡時將進入左側腦室之永久ICV插管植入小鼠中。在植入之後，將小鼠單一圈養於無金屬絲籠中，且提供地面上的食物顆粒及水凝膠杯(ClearH 2O)。在恢復1週之後且早在7至9週齡開始，在5至10分鐘之時段內將5 µL體積中之100 µg酶推注輸注。在ICV注射之前10分鐘給與以5 mg/kg苯海拉明之抗組織胺注射。每週持續ICV注射直至研究結束或存活終點。對於非存活研究，在最後一次ICV注射之後24小時藉由心臟穿刺及血液收集隨後用PBS灌注，使動物安樂死。
隨時間推移監測動物之健康情況。如 圖 11B所示 ，與用媒劑治療之小鼠相比，向SD小鼠之大腦投與HexD3或HexA可增加存活率。在無症狀期(56日齡)開始遞送酶，每週ICV遞送100 µg，中值存活年齡比疾病小鼠之正常生命期(未經治療中值，127日齡，n=60)延長約3.5倍。與經HexD3治療之動物相比(中值，442.5天，n=10)，經HexA治療之動物的存活率(中值，464天，n=13)無顯著差異( 圖 11B)。此等小鼠的行為非常正常的，除了後肢置放的一些錯誤。兩隻壽命最長的SD動物[618天(經HexA治療)及586天(經HexD3治療)]的壽命幾乎與正常小鼠壽命(600-900日齡)一樣長( 圖 11C)。此等經治療之小鼠之末端表型自猝死至體重的進行性下降之間變化，伴隨著痙攣跡象增加，但對隨著年齡增長對總體運動活動的影響較不嚴重。
雖然HexA及HexD3之治療在56天開始治療時展示類似的效應，但當治療開始年齡延遲至84或98天時，HexA及HexD3之治療效果出現了驚人差異( 圖 11A 及圖 11B)。選擇此等年齡以模擬早期發作及晚期神經退化性病變的治療範例，亦即升高之NF-L。當治療始於84日齡時，與HexA治療之小鼠(中值，155天，n=6)相比，用HexD3治療之小鼠的壽命(中值，363天，n=6)顯著提高。當治療始於98日齡時，與媒劑治療(中值，128天，n=20)相比，用HexA (中值，124天，n=6)未發現效果；而在98天時開始之HexD3治療顯示顯著的存活期益處(中值，205天，n=7)，甚至大於84日齡時開始之ICV HexA治療( 圖 11B)。
98日齡之前用HexD3治療之動物在其延長的壽命之持續時間內維持正常(或接近正常)築巢活動、穩定體重及運動活動( 圖 11C - 11E)。98日齡時治療之動物具有與早於98日齡治療之動物不同的重量概況。在98天時治療之動物中，用HexD3治療減緩但最終不改變體重減輕的持續軌跡。相比之下，築巢及運動活動之進行性下降更顯著地變化，自治療時間起顯而易見( 圖 11E)。然而，用HexD3在98天時治療之此等動物即使在延長時段之後仍無法恢復至正常活動水準。在治療開始時，運動活動降低在動物的剩餘壽命內會中斷或達到平穩( 圖 11F)。儘管體重減輕放緩，但最終符合終點標準( 圖 11C)。 實例 11 ： 血液神經絲輕鏈作為 GM2 神經退化的生物標記
神經絲輕鏈(NFL)已被探索為軸突神經元損傷之體液標記，且在神經退化性病症中容易升高。此亦應適用於具有神經退化之典型溶酶體貯積病。收集來自各種年齡之KO小鼠的血漿樣品且藉由Quanterix分析，其量測血漿NF-L。自末端放血或尾部靜脈切口使用最少20 µL血漿且分析每組最少3個動物。
圖 13A展示在NF-L水準升高之前基本上無症狀之階段，繼而在運動缺陷之顯著徵象之前的早期發作神經退化，繼而為其中NF-L水準達到其最大值且運動持續減退的晚期病變，且最後在達到安樂死標準時的發病/死亡。65日齡之後注意到高於WT之NF-L血漿水準的增加( 圖 13A)。在約100日齡時，SD小鼠模型中之NF-L水準上升至約100×正常水準。此等結果證實，NF-L為SD小鼠模型中之疾病進展的一個敏感且可靠的標記，且可以具有追蹤患者中之神經元損傷的臨床相關性。 實例 12 ： 藉由 HEX ICV 輸注遏制血液 NF - L 水準
為確定治療功效，縱向分析血液NF-L水準。患病小鼠在56日齡時開始進行治療，然後NF-L水準在統計學上顯著升高( 圖 12A 、圖 13A)。每週遞送HexA或HexD3的ICV輸注，直至滿足安樂死標準。在7次劑量及45次劑量之後經由血液收集檢查NF-L水準。
在7次劑量之後或當小鼠98日齡時，兩種Hex酶可部分抑制NF-L水準( 圖 12B)。在疾病早期發作階段，對於未經治療之84日齡KO小鼠，水準保持在預期之水準以下。在一歲小鼠中進行45次劑量之後，NF-L水準確實增加，但平均保持在84日齡KO動物預期之水準。經治療之一歲KO小鼠中報導之最高NF-L水準等於或低於在疾病晚期中對於98日齡未經治療之KO小鼠預期之水準( 圖 12B)。在98日齡時，在未經治療之SD小鼠中NF-L水準開始達到峰值( 圖 13A)。在一歲時大部分經治療之SD小鼠展現良好健康徵象，足以維持穩定體重( 圖 11C)及正常築巢行為( 圖 11D)。其他動物朝向存活終點下降且被安樂死。持續的NF-L水準達到通常在98日齡時可見之水準或高於該等水準之臨限值可能為最不利的。 實例 13 ： SD 之小鼠模型中之疾病進展
NF-L已被探索為軸突神經元損傷之標記，且在神經退化性病症中容易地升高。在帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及其他神經退化性病症中，NF-L水準隨著疾病發作及嚴重程度增加。量測NF-L血液水準以監測SD小鼠模型中之神經退化性疾病時程( 圖 13A - 13B)。收集不同年齡之來自SD ( HexβKO)小鼠的血漿樣品，且將NF-L水準與WT或Het對照物進行比較。在前8週齡內未見與正常存在顯著差異( 圖 13A)。在第9週(在65日齡之時間點)偵測到NF-L存在較小但顯著的升高。然後NF-L水準穩定持續增加且在第16週達到峰值，在115日齡時達到大致100×正常水準。平均NF-L水準在接近終點標準之大齡小鼠中略微下降( 圖 13A)。
結合行為表型及NF-L水準定義SD小鼠之疾病進展階段。在開場分析中量測以距離報導之運動活動，以追蹤神經表型的發作。小於65日齡之SD小鼠( 圖 13A)具有正常NF-L水準及運動活動。因此，在NF-L升高之前的任何年齡均為無症狀。與使用開放空間活動監測量測的運動缺乏之比較顯示，在13週齡偵測運動活動顯著差異之前，9週時NF-L之初始升高為明顯的( 圖 13A，灰線：運動活動；黑線：血漿NF-L)。在NF-L水準增加起始但運動活動不存在顯著降低時，此範圍視為疾病發作或早期( 圖 13A - 13B)。91日齡後，運動活動顯著下降，且在大約115日齡時看見NF-L之峰值升高( 圖 13A - 13B)。此年齡範圍標記為晚期疾病。在115天時間點之後，SD小鼠接近安樂死終點標準。NF-L水準似乎處於平穩或下降，可能歸因於在生命末期神經元的損失且隨之而來的NF-L來源減少( 圖 13A)。藉由RNA定序評估全腦組織。帶有回歸線之盒狀圖展示FPKM，其為NF-L之標準化RNA定序表現值。在15、50、80及115日齡對腦組織進行取樣。應注意，在115天(第16週)時，血液蛋白質水準達到峰值，而NF-L之RNA水準降低( 圖 15)。
為了捕捉救援老齡SD小鼠的有限機會窗口，對治療與未治療動物之間的壽命之中值增加與相對於在注射病毒時小鼠年齡的倍數變化進行比較。可繪製粗略負線性相關性( 圖 13)。當疾病分期覆疊時，顯而易見HexA基因療法治療對神經退化發作之後的疾病進展具有有限影響( 圖 13)，且當小鼠接近晚期疾病時不具有任何影響( 圖 13)。
下文展示 表 16為比較各種β-己糖胺酶酶類之活性的概述。
表 16 ： β - 己糖胺酶概述
Hex 同功酶 ( 名稱 ) HexA HexM HexD3
基因 HEXA/HEXB 經修飾之HEXA 經修飾之HEXA
α次單元中之胺基酸取代 無 S184K, P209Q, NPVT (SEQ ID NO: 19) 228-231 S-LS, P429Q, KD 432-433 RK, I436K, N466A, S491R, LTF 493-495 MDD, E498D, L508V, Q513A, NV 518-519 YA, F521Y, E523N S184K, P209Q, NPVT (SEQ ID NO: 19) 228-231 S-LS, P429Q, KD 432-433 RK, I436K, N466A, S491R, LTF 493-495 MDD, E498D, L508V, Q513A, NV 518-519 YA, F521Y, E523N, α 1-165 至β 1-198
次單元組合物(二聚體) αβ α 1'α 1' α 3'α 3'
M6P型N-聚醣/N-聚糖 3/7 2/6 4/8
M6P內容物(mol/mol Hex) 2.5-3 ＜1 3-3.5
K攝取(nM) MUG活性 3.3 +0.3 130 +5.4 5.8 +1.0
細胞內半衰期(t 1 /2) MUG活性 14天 12天 14天
K mGM2AP [μM] 14.5 +1.6    19.6 +2.5    13.7 +2.4
比活性GM2 [nmol GM3/min/mg] 45.8 20.6 13.6
比活性MUG (μmol/min/mg) 66.7 +7 31 +3 27 +2
比活性MUGS (μmol/min/mg) 23 +3 47 +4 39 +3
Tm (℃) 57 +0.1 63 +0.1 61 +0.2
在37℃活體外CSF下熱穩定性(t 1/2) 1.5天 6天 NA
實例 14 ： 晚期治療的治療窗
為了比較治療模態，繪製了接受ICV酶替代療法的小鼠的壽命改善與治療起始年齡的對比( 圖 14A)。由ICV遞送之HexA展示與外推HexA基因療法資料類似的趨勢線，指示藉由ICV進行之基因療法或酶置換對於HexA治療展現極小差異。另一方面，HexD3的趨勢線表明，當在較晚的年齡開始治療時，SD小鼠的生存率向改善的轉變，其表明治療窗口擴大到疾病的晚期階段，但亦表明救援潛力係藥物依賴性的。HexA及HexD3作為治療劑在疾病預防範式中表現同樣好，但僅HexD3能夠在治療範式中使用時改變疾病。
圖 14B為表明HexD3作為一種療法可能更有效，原因如下：(1)穩定性：與HexD3相比，HexA在液體中的穩定性可能較差；(2)同二聚體化：HexA更有可能重組為同功酶HexS (α/α次單元)及HexB (β/β次單元)，以及(3)積累：HexA比HexD3在組織中積累的程度更高。因此，儘管天然HexA在活體內使GM2及N-聚醣標準化方面有效，但HexD3在使溶酶體健康標準化方面為較佳的，如藉由LAMP2及磷脂BMP水準所判斷。在兩種治療情況下，SD小鼠模型中血液NF-L增加被阻止或減少，表明NF-L可用作追蹤神經疾病及GM2疾病之救援的流體生物標記。
進行額外實驗以評估用HexA或HexD3治療之後的小鼠之飼養籠行為。自56日齡起用HexA或HexD3治療之小鼠展示大體正常之飼養籠行為及活動。HexA及HexD3治療動物不容易地彼此區別。
亦評估自56日齡起用HexD3治療之小鼠的理毛及飼養活動。將小鼠置放於具有模檔之受限空間中(諸如淺Nalgene杯)，其會試圖後退來調查其周圍環境。此設置允許目視檢查行為、飼養時的腳墊位置、理毛及在受限空間中移動之能力。經治療小鼠展示正常理毛及飼養活動，但足部定位異常，可能歸因於一些神經元退化。未觀測到表型隨著年齡增長而惡化。
圖 1A - 1C 。 圖 1A提供基於HexA (PDB ID：2GJX)及HexB (PDB ID：1NOU)之晶體結構的HexD3模型及HexD3之功能域。
圖 1B證明，藉由使α次單元之域I與β次單元之域I交換，HexM之經修飾α次單元經修飾以保留β次單元甘露糖6-磷酸化位點。與次單元α中醣基化但未磷酸化S51N/A53T位點相比，所得嵌合α3'次單元在位置N84處含有磷酸化聚醣。亦包括兩個額外β醣基化位點N190/N142。
圖 1C展示以相對標度比較HexA、HexD3及HexM蛋白質之功能屬性的雷達圖。
圖 2為顯示針對變體己糖胺酶酶類所量測之GM2AP-依賴性GM2降解活性之飽和動力學的圖。
圖 3A為顯示測定桑德霍夫(SD)患者來源之纖維母細胞中之HexA、HexM及Mod2B己糖胺酶變體之K 攝取(半數最大細胞攝取的濃度)值的圖式。
圖 3B為顯示HexA、HexM及HexD3己糖胺酶變體之K 攝取(半數最大細胞攝取的濃度)值的圖式。
圖 4為展示桑德霍夫患者來源之纖維母細胞中甘露糖-6-磷酸(M6P)對各種己糖胺酶變體之細胞攝取的抑制的圖式。
圖 5A - 5B為顯示細胞穩定性的一對圖，其表示為在細胞中量測的酶活性的半衰期。 圖 5A提供桑德霍夫纖維母細胞中之HexA、HexM及Mod2B的資料。
圖 5B提供桑德霍夫(SD)及泰-薩克斯(TS)纖維母細胞中之HexA及HexD3的資料。
圖 6A - 6C為一組顯示在最終腦室內(ICV)劑量24小時後使用兩種螢光基質(4-MUG，4-甲基傘形基-N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖苷；4-MUGS，4-甲基傘形基-6-磺基-N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖苷)在經HexD3治療之桑德霍夫(KO-HexD3)小鼠的腦勻漿中量測的HexD3活性圖。
圖 6A顯示，在經HexD3治療之桑德霍夫小鼠中針對4-MUG之平均HexD3活性水準類似於野生型(WT，虛線)小鼠中之己糖胺酶活性水準。
圖 6B顯示在經HexD3治療之桑德霍夫小鼠中針對4-MUG之平均HexD3活性水準超出野生型(WT)小鼠中之己糖胺酶活性水準。
圖 6C顯示經ICV-HexD3治療之桑德霍夫小鼠中每毫克腦蛋白質中HexD3之數量。
圖 7為顯示在經ICV投與HexD3酶之後，桑德霍夫小鼠的腦中藉由質譜定量測定的HexD3蛋白質水準與使用4-MU-基質的特定酶活性量測值之間的相關性圖。
圖 8為一組來自野生型(WT)、經媒劑治療之SD (Hexβ -/-)及用HexD3治療之桑德霍夫小鼠之小鼠海馬體切片的顯微照片。
圖 9A - 9G顯示Hex藉由ICV進行遞送之後的CNS定位及外周溶酶體校正。
圖 9A顯示Hex酶之解剖腦部分佈之圖示。
圖 9B顯示指示3 q.wk.劑量之HexA酶之後的生物分佈圖案的萘酚信號。
圖 9C顯示3 q.wk.劑量之HexA或HexD3劑量後在各種腦部感興趣區(ROI)的LAMP2定量。
圖 9D顯示在Hex ICV給藥後整個腦半球之質譜定量。
圖 9E展示NeuN及萘酚信號之重疊，其指示Hex變體在海馬體神經元的定位以及組織中蛋白質的相對濃度。
圖 9F經由萘酚染色信號顯示肝臟中7 q.wk.劑量後的HexA或HexD3活性。
圖 9G展示投與HexA、HexD3或媒劑之 Hex β -/-KO中在3-7次劑量的Hex酶之後的肝臟LAMP2水準。
圖 10A - 10E展示HexD3酶之ICV遞送在SD之 Hex β -/-KO小鼠模型中的作用。
圖 10A展示研究示意圖，其中在插管插入之後2週開始，以每週一次劑量(q.wk)之頻率投與3次劑量之HexA或HexD3，持續2週。
圖 10B顯示SD之腦部 Hex β -/-KO小鼠模型中發現的HexA及HexD3酶活性水準。
圖 10C顯示SD之腦部 Hex β -/-KO小鼠模型中的BMP(22:6)水準。
圖 10D及 圖 10E展示SD之腦部 Hex β -/-KO小鼠模型中的N連接之聚醣及GM2:GA2神經節苷脂水準。
圖 11A - 11F展示HexD3 ICV對SD之 Hex β -/-KO小鼠模型的晚期階段疾病進展的作用。
圖 11A為一個示意圖，顯示了ICV治療開始時的年齡與疾病進展的目標階段的關係。
圖 11B顯示在不同時間點投與HexA或HexD3之治療組的存活曲線。
圖 11C顯示SD之 Hex β -/-KO小鼠模型接受HexA或HexD3不同治療後的重量曲線。
圖 11D提供築巢之資料，其用作56天或84天時治療之動物的持續健康的指標。
圖 11E展示開放區域運動活動分析。
圖 11F展示在SD之 Hex β -/-KO小鼠模型中HexD3治療後對運動功能損失的影響。
圖 12A - 12C展示HexA或HexD3投與對 Hex β -/-KO小鼠(KO)或 Hex β +/-小鼠(Het)之血液神經絲輕鏈(NF-L)水準的影響。
圖 12A顯示實驗示意圖，其顯示自56日齡開始每週注射媒劑與HexA或HexD3治療之動物。
圖 12B顯示Hex治療使血漿NF-L水準維持在低於未經治療之84天或98天大的KO小鼠(虛線)之預期水準。
圖 12C展示HexA或HexD3投與之血液NF-L水準。
圖 13A - 13B展示SD小鼠模型中疾病進展之時序及治療救援的窗口。
圖 13A展示重疊至運動活性(右y軸)上之血漿NF-L水準(左y軸)之輪廓，以指示疾病階段(箭頭)之間的發生過渡之年齡。SD小鼠之進行性神經退化之示意圖分成4個階段。
圖 13B展示描繪與當HexA基因療法開始時之治療年齡相比的生存益處程度之圖。虛線為經由中值存活年齡(黑色方形)之外推線性回歸。
圖 14A - 14B展示HexD3提供疾病救援潛能。
圖 14A表明在SD小鼠模型中用重組HexA ICV療法或HexA基因療法觀測到之益處程度。
圖 14B展示HexA及HexD3治療之建模行為，用於評估其在GM2治療中之活性。
圖 15表明桑德霍夫小鼠中NF-L表現之損失達到安樂死的標準。
圖 16展示己糖胺酶同功酶N-聚醣輪廓。
圖 17A - 17B展現HexD3熱穩定性。
圖 17A顯示不同批次的HexA及HexD3之間的熱穩定性一致。
圖 17B展現藉由剩餘MUG活性所量測的CSF穩定性。
圖 18表明Hex同功酶之細胞半衰期。 

          <![CDATA[<110> 美商拜奧馬林製藥公司(BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.)]]>
          <![CDATA[<120> β-己糖胺酶變體之組合物及其用途]]>
          <![CDATA[<130> 58039-719.851]]>
          <![CDATA[<140> TW 111123683]]>
          <![CDATA[<141> 2022-06-24]]>
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          <![CDATA[<170> PatentIn版本3.5]]>
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          <![CDATA[<211> 529]]>
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          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：HexA α次單元序列]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Met Thr Ser Ser Arg Leu Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ala Ala Ala Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Arg Ala Thr Ala Leu Trp Pro Trp Pro Gln Asn Phe Gln Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Val Ser Ser Ala Ala Gln Pro Gly Cys Ser Val Leu Asp Glu Ala 
              50                  55                  60                  
          Phe Gln Arg Tyr Arg Asp Leu Leu Phe Gly Ser Gly Ser Trp Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Tyr Leu Thr Gly Lys Arg His Thr Leu Glu Lys Asn Val Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Val Val Thr Pro Gly Cys Asn Gln Leu Pro Thr Leu Glu Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Glu Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Asp Gln Cys Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Ser Glu Thr Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Glu Asp Phe Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp Thr 
                          165                 170                 175     
          Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val 
                      180                 185                 190         
          Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Tyr Asn Pro Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly 
                  275                 280                 285             
          Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe 
              290                 295                 300                 
          Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln 
                          325                 330                 335     
          Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu 
                      340                 345                 350         
          Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys 
                  355                 360                 365             
          Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln 
              370                 375                 380                 
          Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu 
                          405                 410                 415     
          Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Pro Asp Trp Lys 
                      420                 425                 430         
          Asp Phe Tyr Ile Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln 
                  435                 440                 445             
          Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val 
              450                 455                 460                 
          Asp Asn Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Leu Thr Phe Ala 
                          485                 490                 495     
          Tyr Glu Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val 
                      500                 505                 510         
          Gln Ala Gln Pro Leu Asn Val Gly Phe Cys Glu Gln Glu Phe Glu Gln 
                  515                 520                 525             
          Thr 
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          <![CDATA[<400> 2]]>
          Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Ala Phe Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His His 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu Val 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser Ser 
              130                 135                 140                 
          Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser Thr 
                      180                 185                 190         
          Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Ser His Arg Gly Ile Leu Ile Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Asp Ala 
              210                 215                 220                 
          Met Ala Phe Asn Lys Phe Asn Val Leu His Trp His Ile Val Asp Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Ser Phe Pro Tyr Gln Ser Ile Thr Phe Pro Glu Leu Ser Asn Lys 
                          245                 250                 255     
          Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Val Tyr Thr Pro Asn Asp Val Arg Met 
                      260                 265                 270         
          Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Pro Glu Phe 
                  275                 280                 285             
          Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Lys Gly Gln Lys Asp Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Arg Gln Asn Lys Leu Asp Ser Phe Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Asn Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe Phe 
                          325                 330                 335     
          Lys Glu Ile Ser Glu Val Phe Pro Asp Gln Phe Ile His Leu Gly Gly 
                      340                 345                 350         
          Asp Glu Val Glu Phe Lys Cys Trp Glu Ser Asn Pro Lys Ile Gln Asp 
                  355                 360                 365             
          Phe Met Arg Gln Lys Gly Phe Gly Thr Asp Phe Lys Lys Leu Glu Ser 
              370                 375                 380                 
          Phe Tyr Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Ile Ala Thr Ile Asn Lys Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Ile Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asp Lys Ala Lys Leu Ala Pro 
                          405                 410                 415     
          Gly Thr Ile Val Glu Val Trp Lys Asp Ser Ala Tyr Pro Glu Glu Leu 
                      420                 425                 430         
          Ser Arg Val Thr Ala Ser Gly Phe Pro Val Ile Leu Ser Ala Pro Trp 
                  435                 440                 445             
          Tyr Leu Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Tyr Tyr Lys 
              450                 455                 460                 
          Val Glu Pro Leu Asp Phe Gly Gly Thr Gln Lys Gln Lys Gln Leu Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr Asn 
                          485                 490                 495     
          Leu Thr Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Ser Ala Val Gly Glu Arg Leu 
                      500                 505                 510         
          Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg Leu 
                  515                 520                 525             
          Thr Arg His Arg Cys Arg Met Val Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln Pro 
              530                 535                 540                 
          Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn His Glu Asn Met 
          545                 550                 555 
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 561]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His 
                      100                 105                 110         
          His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp 
                  195                 200                 205             
          Thr Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Lys Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys 
                      260                 265                 270         
          Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu 
                  275                 280                 285             
          Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly 
                      340                 345                 350         
          Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln 
                          405                 410                 415     
          Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr 
                      420                 425                 430         
          Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg 
              450                 455                 460                 
          Lys Phe Tyr Lys Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val 
                          485                 490                 495     
          Asp Ala Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val 
                      500                 505                 510         
          Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Arg Asp Met Asp Asp Ala 
                  515                 520                 525             
          Tyr Asp Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Val Arg Arg Gly Val 
              530                 535                 540                 
          Ala Ala Gln Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn Gln Glu Phe Glu Gln 
          545                 550                 555                 560 
          Thr 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 1587]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：HexA α次單元序列]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          atgacttcct cccgcctttg gttctccctc ctgcttgccg ctgccttcgc cggacgcgcc       60
          accgccctgt ggccgtggcc tcagaacttc cagactagcg accaaagata cgtgctgtac      120
          ccgaacaact tccagtttca atacgacgtc agcagcgccg cccagcccgg ctgctcggtg      180
          ctcgatgagg cattccagcg gtaccgggat ctcttgttcg gttccggatc atggcctcgg      240
          ccgtacctca ctggaaagag gcacactctc gaaaagaacg tcctggtggt gtccgtggtc      300
          acccctggct gcaatcagct gcccaccctg gaatcagtgg agaactacac tttgaccatc      360
          aacgatgacc aatgcctgct gctgtcggag actgtgtggg gtgccctgcg cgggctggaa      420
          acctttagcc aactggtctg gaagtcagcc gaggggacct tcttcattaa caagaccgaa      480
          atcgaggact tccctcggtt cccgcaccgc ggcttgctgc tggatacctc gcggcactat      540
          ctgccactgt cctccattct cgataccctg gacgtgatgg cctacaacaa gctgaacgtg      600
          ttccactggc atctcgtgga cgacccatcc tttccctacg agtccttcac cttccctgag      660
          ttgatgagaa agggctccta caaccccgtg acccatatct acacggctca ggacgtgaag      720
          gaagtgatcg aatatgcccg gctgagaggg attagggtgc tggcagaatt tgacaccccg      780
          ggacacaccc tgtcgtgggg ccctggtatc ccgggcctgc tgactccgtg ctactccggc      840
          tccgagccat ccggaacctt cggacctgtg aatccctccc tgaacaacac ttacgagttc      900
          atgtccacct tcttcctgga agtgtcgagc gtgttccccg acttctacct ccacctcggt      960
          ggcgacgaag tcgatttcac ttgctggaag tctaaccccg agatccaaga tttcatgcga     1020
          aagaaaggat tcggagagga ctttaagcag ctggagtcct tctacatcca aaccctgctg     1080
          gacattgtgt catcgtatgg aaagggatac gtggtgtggc aggaagtgtt tgacaataag     1140
          gtcaaaattc agcccgatac aatcatccaa gtctggcgcg aagatatccc cgtgaactac     1200
          atgaaagaac tggaactggt cacgaaggct ggattcaggg cgcttctgag cgccccttgg     1260
          tacttgaacc ggattagcta cggcccggac tggaaggact tctacatcgt cgaacctctg     1320
          gccttcgagg gaacccccga gcagaaggcc ttggtgatcg gcggcgaagc ctgtatgtgg     1380
          ggggaatacg tggacaacac caacctggtg ccgcgcctgt ggccgagagc gggagcagtg     1440
          gccgagcggc tctggtcgaa caagctgact tccgacctca ccttcgcata cgagagactg     1500
          agccacttcc gctgcgaact tcttcggcgg ggggtgcagg cccagccgct caacgtcggg     1560
          ttctgtgaac aggagttcga gcagacc                                         1587
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 1670]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知之描述：HexA β次單元序列]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          atggagctgt gcgggctggg gctgccccgg ccgcccatgc tgctggcgct gctgttggcg       60
          acactgctgg cggcgatgtt ggcgctgctg actcaggtgg cgctggtggt gcaggtggcg      120
          gaggcggctc gggccccgag cgtctcggcc aagccggggc cggcgctgtg gcccctgccg      180
          ctcttggtga agatgacccc gaacctgctg catctcgccc cggagaactt ctacatcagc      240
          cacagcccca attccacggc gggcccctcc tgcaccctgc tggaggaagc gtttcgacga      300
          tatcatggct atatttttgg tttctacaag tggcatcatg aacctgctga attccaggct      360
          aaaacccagg ttcagcaact tcttgtctca atcacccttc agtcagagtg tgatgctttc      420
          cccaacatat cttcagatga gtcttatact ttacttgtga aagaaccagt ggctgtcctt      480
          aaggccaaca gagtttgggg agcattacga ggtttagaga cctttagcca gttagtttat      540
          caagattctt atggaacttt caccatcaat gaatccacca ttattgattc tccaaggttt      600
          tctcacagag gaattttgat tgatacatcc agacattatc tgccagttaa gattattctt      660
          aaaactctgg atgccatggc ttttaataag tttaatgttc ttcactggca catagttgat      720
          gaccagtctt tcccatatca gagcatcact tttcctgagt taagcaataa aggaagctat      780
          tctttgtctc atgtttatac accaaatgat gtccgtatgg tgattgaata tgccagatta      840
          cgaggaattc gagtcctgcc agaatttgat acccctgggc atacactatc ttggggaaaa      900
          ggtcagaaag acctcctgac tccatgttac agtagacaaa acaagttgga ctcttttgga      960
          cctataaacc ctactctgaa tacaacatac gcttccttac tacatttttc aaagaaatta     1020
          gtgaggtgtt tccagatcaa ttcattcatt tgggaggaga tgaagtggaa tttaaatgtt     1080
          gggaatcaaa tccaaaaatt caagatttca tgaggcaaaa aggctttggc acagatttta     1140
          agaaactaga atctttctac attcaaaagg ttttggatat tattgcaacc ataaacaagg     1200
          gatccattgt ctggcaggag gtttttgatg ataaagcaaa gcttgcgccg ggcacaatag     1260
          ttgaagtatg gaaagacagc gcatatcctg aggaactcag tagagtcaca gcatctggct     1320
          tccctgtaat cctttctgct ccttggtact tagatttgat tagctatgga caagattgga     1380
          ggaaatacta taaagtggaa cctcttgatt ttggcggtac tcagaaacag aaacaacttt     1440
          tcattggtgg agaagcttgt ctatggggag aatatgtgga tgcaactaac ctcactccaa     1500
          gattatggcc tcgggcaagt gctgttggtg agagactctg gagttccaaa gatgtcagag     1560
          atatggatga cgcctatgac agactgacaa ggcaccgctg caggatggtc gaacgtggaa     1620
          tagctgcaca acctctttat gctggatatt gtaaccatga gaacatgtaa                1670
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 528]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Thr Ser Ser Arg Leu Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ala Ala Ala Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Arg Ala Thr Ala Leu Trp Pro Trp Pro Gln Asn Phe Gln Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Val Ser Ser Ala Ala Gln Pro Gly Cys Ser Val Leu Asp Glu Ala 
              50                  55                  60                  
          Phe Gln Arg Tyr Arg Asp Leu Leu Phe Gly Ser Gly Ser Trp Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Tyr Leu Thr Gly Lys Arg His Thr Leu Glu Lys Asn Val Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Val Val Thr Pro Gly Cys Asn Gln Leu Pro Thr Leu Glu Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Glu Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Asp Gln Cys Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Ser Glu Thr Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Glu Asp Phe Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp Thr 
                          165                 170                 175     
          Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Lys Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val 
                      180                 185                 190         
          Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp 
                  195                 200                 205             
          Gln Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu Phe 
                          245                 250                 255     
          Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly Pro 
                  275                 280                 285             
          Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe Phe 
              290                 295                 300                 
          Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln Asp 
                          325                 330                 335     
          Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu Ser 
                      340                 345                 350         
          Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys Gly 
                  355                 360                 365             
          Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln Pro 
              370                 375                 380                 
          Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr Met 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu Ser 
                          405                 410                 415     
          Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys 
                      420                 425                 430         
          Phe Tyr Lys Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln Lys 
                  435                 440                 445             
          Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr 
                          485                 490                 495     
          Asp Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Val Arg Arg Gly Val Ala 
                      500                 505                 510         
          Ala Gln Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn Gln Glu Phe Glu Gln Thr 
                  515                 520                 525             
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 1584]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          atgacttcct cccgcctttg gttctccctc ctgcttgccg ctgccttcgc cggacgcgcc       60
          accgccctgt ggccgtggcc tcagaacttc cagactagcg accaaagata cgtgctgtac      120
          ccgaacaact tccagtttca atacgacgtc agcagcgccg cccagcccgg ctgctcggtg      180
          ctcgatgagg cattccagcg gtaccgggat ctcttgttcg gttccggatc atggcctcgg      240
          ccgtacctca ctggaaagag gcacactctc gaaaagaacg tcctggtggt gtccgtggtc      300
          acccctggct gcaatcagct gcccaccctg gaatcagtgg agaactacac tttgaccatc      360
          aacgatgacc aatgcctgct gctgtcggag actgtgtggg gtgccctgcg cgggctggaa      420
          acctttagcc aactggtctg gaagtcagcc gaggggacct tcttcattaa caagaccgaa      480
          atcgaggact tccctcggtt cccgcaccgc ggcttgctgc tggatacctc gcggcactat      540
          ctgccactga agtccattct cgataccctg gacgtgatgg cctacaacaa gctgaacgtg      600
          ttccactggc atctcgtgga cgaccagtcc tttccctacg agtccttcac cttccctgag      660
          ttgatgagaa agggctccta ctccctctcc catatctaca cggctcagga cgtgaaggaa      720
          gtgatcgaat atgcccggct gagagggatt agggtgctgg cagaatttga caccccggga      780
          cacaccctgt cgtggggccc tggtatcccg ggcctgctga ctccgtgcta ctccggctcc      840
          gagccatccg gaaccttcgg acctgtgaat ccctccctga acaacactta cgagttcatg      900
          tccaccttct tcctggaagt gtcgagcgtg ttccccgact tctacctcca cctcggtggc      960
          gacgaagtcg atttcacttg ctggaagtct aaccccgaga tccaagattt catgcgaaag     1020
          aaaggattcg gagaggactt taagcagctg gagtccttct acatccaaac cctgctggac     1080
          attgtgtcat cgtatggaaa gggatacgtg gtgtggcagg aagtgtttga caataaggtc     1140
          aaaattcagc ccgatacaat catccaagtc tggcgcgaag atatccccgt gaactacatg     1200
          aaagaactgg aactggtcac gaaggctgga ttcagggcgc ttctgagcgc cccttggtac     1260
          ttgaaccgga ttagctacgg ccaggactgg aggaagttct acaaggtcga acctctggcc     1320
          ttcgagggaa cccccgagca gaaggccttg gtgatcggcg gcgaagcctg tatgtggggg     1380
          gaatacgtgg acgcgaccaa cctggtgccg cgcctgtggc cgagagcggg agcagtggcc     1440
          gagcggctct ggtcgaacaa gctgactagg gacatggacg atgcatacga cagactgagc     1500
          cacttccgct gcgaacttgt gcggcggggg gtggcggccc agccgctcta cgcggggtac     1560
          tgtaaccagg agttcgagca gacc                                            1584
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 1683]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          atggaacttt gcggactcgg cctcccaaga ccacctatgc ttctcgccct gctgctcgcc       60
          accttgctcg cggctatgct tgcgctcctg actcaagtgg cccttgtggt ccaagtggcc      120
          gaggctgccc gcgccccgag cgtgtcagcc aagccaggac cggccctgtg gccgctgcct      180
          ctgagcgtga agatgactcc caatctcctg cacctggccc cggaaaactt ctacatctcg      240
          cactcgccga acagcaccgc cggtccctcc tgcaccctgc tcgaagaggc attccggcgg      300
          taccacggat acatcttcgg tttctataag tggcatcacg agccggcaga gttccaggcc      360
          aagactcagg tccagcagct gctcgtgtcc attaccctgc aatcggagtg cgacgccttc      420
          cccaacatca gctcagacga gtcatacact ttgctcgtga aggaacctgt cgccgtgctg      480
          aaggccaacc gcgtgtgggg tgccctgcgc gggctggaaa cctttagcca actggtctac      540
          caagattcat acgggacctt caccattaac gagtccacca tcatcgactc ccctcggttc      600
          ccgcaccgcg gcttgctgct ggatacctcg cggcactatc tgccactgaa gtccattctc      660
          gataccctgg acgtgatggc ctacaacaag ctgaacgtgt tccactggca tctcgtggac      720
          gaccagtcct ttccctacga gtccttcacc ttccctgagt tgatgagaaa gggctcctac      780
          tccctctccc atatctacac ggctcaggac gtgaaggaag tgatcgaata tgcccggctg      840
          agagggatta gggtgctggc agaatttgac accccgggac acaccctgtc gtggggccct      900
          ggtatcccgg gcctgctgac tccgtgctac tccggctccg agccatccgg aaccttcgga      960
          cctgtgaatc cctccctgaa caacacttac gagttcatgt ccaccttctt cctggaagtg     1020
          tcgagcgtgt tccccgactt ctacctccac ctcggtggcg acgaagtcga tttcacttgc     1080
          tggaagtcta accccgagat ccaagatttc atgcgaaaga aaggattcgg agaggacttt     1140
          aagcagctgg agtccttcta catccaaacc ctgctggaca ttgtgtcatc gtatggaaag     1200
          ggatacgtgg tgtggcagga agtgtttgac aataaggtca aaattcagcc cgatacaatc     1260
          atccaagtct ggcgcgaaga tatccccgtg aactacatga aagaactgga actggtcacg     1320
          aaggctggat tcagggcgct tctgagcgcc ccttggtact tgaaccggat tagctacggc     1380
          caggactgga ggaagttcta caaggtcgaa cctctggcct tcgagggaac ccccgagcag     1440
          aaggccttgg tgatcggcgg cgaagcctgt atgtgggggg aatacgtgga cgcgaccaac     1500
          ctggtgccgc gcctgtggcc gagagcggga gcagtggccg agcggctctg gtcgaacaag     1560
          ctgactaggg acatggacga tgcatacgac agactgagcc acttccgctg cgaacttgtg     1620
          cggcgggggg tggcggccca gccgctctac gcggggtact gtaaccagga gttcgagcag     1680
          acc                                                                   1683
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 1668]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          atggaacttt gtggacttgg actccctcgc cctccgatgc tgcttgcact gctcctcgcc       60
          actctcctcg ccgctatgct ggcgctgctg actcaagtgg cactggtggt ccaagtggcc      120
          gaggcggccc gcgcaccatc cgtgtccgcg aagccgggcc cagccctgtg gcccctgcct      180
          ctgagcgtga agatgacccc taaccttctg cacctggcgc cggagaactt ctacataagc      240
          cactcgccca actcgaccgc gggtccctcc tgtaccctgc tggaggaggc cttcaggcgc      300
          taccacggct acattttcgg gttctataag tggcaccacg agccggccga gttccaagcc      360
          aagactcagg tccaacagct gctggtgtca atcacactgc agtccgaatg cgatgctttc      420
          cctaatatct cctccgacga gtcctacacc ctgctcgtga aggaacctgt ggccgtgctc      480
          aaggccaacc gcgtctgggg agccctcagg ggtctggaaa ccttcagcca gctggtgtac      540
          caggacagct acggcacctt caccattaac gagtccacca tcatcgactc accgagattc      600
          agccaccggg gaatcctgat tgatacttca agacactatt tgcccgtgaa gatcatcctg      660
          aaaaccctcg acgctatggc ctttaacaag tttaacgtgt tgcattggca tatcgtggac      720
          gatcagtcct tcccgtatca aagcatcact tttccggaac tgtccaacaa gggatcttac      780
          tcgctgagcc acgtgtacac tcccaatgac gtgcgcatgg tcatcgaata cgcccggctg      840
          aggggcatta gagtgctccc tgaatttgac acccccggcc ataccctctc ctggggaaaa      900
          ggacagaaag atttgctcac accttgctac tccggctccg agccctctgg aactttcggc      960
          cccatcaacc cgaccctgaa caccacttac tccttcttga ccacgttctt caaggagatt     1020
          tccgaggtgt tcccggacca gttcatccac ctggggggcg acgaagtgga gttcaagtgc     1080
          tgggaatcga acccaaagat ccaggacttc atgaggcaga aggggtttgg caccgatttc     1140
          aagaagctgg agtcgttcta cattcaaaag gtcctggaca tcattgcaac catcaacaag     1200
          gggtcaatcg tgtggcagga agtgttcgat gacaaggcta agctggcgcc cggcactatt     1260
          gtggaagtct ggaaagactc cgcctaccct gaggagctgt cgagagtcac cgcctccgga     1320
          ttccccgtca tcctgagcgc tccgtggtac ctgaaccgga tctcctacgg acaagattgg     1380
          cgcaagtact acaaggtcga accgctggac ttcggaggga ctcagaagca gaagcagctc     1440
          tttattggtg gagaggcctg cctttggggc gaatacgtgg acgccaccaa cctcaccccg     1500
          cggctctggc cacgggccag cgccgtggga gaacgcctgt ggtcgtcaaa ggacgtccgc     1560
          gatatggacg atgcctacga ccggctcact cggcatcggt gccggatggt ggaacgcggt     1620
          atcgcagcgc agccactgta cgctggatac tgcaaccacg agaatatg                  1668
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 556]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His 
                      100                 105                 110         
          His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Ser His Arg Gly Ile Leu Ile Asp 
                  195                 200                 205             
          Thr Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Asp 
              210                 215                 220                 
          Ala Met Ala Phe Asn Lys Phe Asn Val Leu His Trp His Ile Val Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Gln Ser Ile Thr Phe Pro Glu Leu Ser Asn 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Val Tyr Thr Pro Asn Asp Val Arg 
                      260                 265                 270         
          Met Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Pro Glu 
                  275                 280                 285             
          Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Lys Gly Gln Lys Asp 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Ile Asn Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Lys Glu Ile Ser Glu Val Phe Pro Asp Gln Phe Ile His Leu Gly 
                      340                 345                 350         
          Gly Asp Glu Val Glu Phe Lys Cys Trp Glu Ser Asn Pro Lys Ile Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Phe Met Arg Gln Lys Gly Phe Gly Thr Asp Phe Lys Lys Leu Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Phe Tyr Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Ile Ala Thr Ile Asn Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Ser Ile Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asp Lys Ala Lys Leu Ala 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Thr Ile Val Glu Val Trp Lys Asp Ser Ala Tyr Pro Glu Glu 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Arg Val Thr Ala Ser Gly Phe Pro Val Ile Leu Ser Ala Pro 
                  435                 440                 445             
          Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Tyr Tyr 
              450                 455                 460                 
          Lys Val Glu Pro Leu Asp Phe Gly Gly Thr Gln Lys Gln Lys Gln Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr 
                          485                 490                 495     
          Asn Leu Thr Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Ser Ala Val Gly Glu Arg 
                      500                 505                 510         
          Leu Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg 
                  515                 520                 525             
          Leu Thr Arg His Arg Cys Arg Met Val Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln 
              530                 535                 540                 
          Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn His Glu Asn Met 
          545                 550                 555     
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 339]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Lys Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Glu Ser 
                      20                  25                  30          
          Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn 
                      100                 105                 110         
          Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu 
                          165                 170                 175     
          Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Phe Tyr Lys Val Glu Pro Leu 
                          245                 250                 255     
          Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr Asn Leu Val Pro Arg 
                  275                 280                 285             
          Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys 
              290                 295                 300                 
          Leu Thr Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg Leu Ser His Phe Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Glu Leu Val Arg Arg Gly Val Ala Ala Gln Pro Leu Tyr Ala Gly 
                          325                 330                 335     
          Tyr Cys Asn 
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 155]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Ala Arg Ala Pro Ser Val Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro 
          1               5                   10                  15      
          Leu Pro Leu Ser Val Lys Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          Glu Asn Phe Tyr Ile Ser His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser 
                  35                  40                  45              
          Cys Thr Leu Leu Glu Glu Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Tyr Lys Trp His His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Val Gln Gln Leu Leu Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp 
                          85                  90                  95      
          Ala Phe Pro Asn Ile Ser Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Val Ala Val Leu Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Phe Thr Ile Asn Glu Ser Thr Ile Ile Asp Ser 
          145                 150                 155 
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 197]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His 
                      100                 105                 110         
          His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Ile Ile Asp Ser 
                  195         
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 3]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223> Ser或Thr]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Asn Xaa Xaa 
          1           
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Ile Gln Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          His His His His His His 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 4]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Asn Pro Val Thr 
          1
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028

Claims (88)

  1. 一種形成β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其包含在對應於SEQ ID NO: 1之天然β-己糖胺酶α次單元的S184、P209、N228、P229、V230、T231、P429、K432、D433、I436、N466、S491、L493、T494、F495、E498、L508、Q513、N518、V519、F521及E523的位置處的一或多個胺基酸序列取代或缺失，且進一步包含一或多個胺基酸序列元件，其使得對該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體的細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加。
  2. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中增加細胞攝取之該一或多個胺基酸序列元件係選自由相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元之胺基酸序列取代、添加或缺失組成之群。
  3. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含一或多個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  4. 如請求項3之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  5. 如請求項4之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  6. 如請求項5之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少十五個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  7. 如請求項6之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含至少二十個對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  8. 如請求項7之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元相對於SEQ ID NO: 1之該天然β-己糖胺酶α次單元包含對應於S184K、P209Q、N228S、P229Δ、V230L、T231S、P429Q、K432R、D433K、I436K、N466A、S491R、L493M、T494D、F495D、E498D、L508V、Q513V、N518Y、V519A、F521Y及E523N之胺基酸取代或缺失。
  9. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含有包含與SEQ ID NO: 11至少85%序列一致性之第一胺基酸序列，及該使得對該β-己糖胺酶變體α次單元之細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的一或多個胺基酸序列元件包含第二胺基酸序列。
  10. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少90%序列一致性。
  11. 如請求項10之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少95%序列一致性。
  12. 如請求項11之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 11至少99%序列一致性。
  13. 如請求項12之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第一胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
  14. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列位於該第一胺基酸序列之N端。
  15. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2之至少20個連續胺基酸殘基。
  16. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12之至少100個連續胺基酸殘基。
  17. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少100個連續胺基酸殘基。
  18. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少150個連續胺基酸殘基。
  19. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少85%序列一致性。
  20. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少90%序列一致性。
  21. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 13至少95%序列一致性。
  22. 如請求項9之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
  23. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
  24. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  25. 如請求項24之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
  26. 如請求項25之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  27. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸。
  28. 如請求項27之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸。
  29. 如請求項28之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸。
  30. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少500個連續胺基酸，且與該至少500個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
  31. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少525個連續胺基酸，且與該至少525個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
  32. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的至少550個連續胺基酸，且與該至少550個連續胺基酸具有至少95%序列一致性。
  33. 如請求項23之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%序列一致性之胺基酸序列。
  34. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體包含相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加的甘露糖-6-磷酸化(M6P)。
  35. 如請求項34之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少3個M6P位點由M6P佔據。
  36. 如請求項34之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在每個同二聚體上至少4個M6P位點由M6P佔據。
  37. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體在GM2活化因子蛋白之存在下展現出GM2神經節苷脂水解活性。
  38. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之該細胞攝取相對於SEQ ID NO: 6之同二聚體增加至少2倍、5倍、10倍、20倍或25倍。
  39. 如請求項38之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之該細胞攝取係在來自SD患者之人類纖維母細胞中同二聚體及甘露糖-6-磷酸的競爭分析中，藉由非陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)之攝取來評估。
  40. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體相對於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體具有增加的熱穩定性。
  41. 如請求項40之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體之熔點(Tm)為約60℃至約63℃。
  42. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體增加該小鼠的壽命。
  43. 如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元，其中與在實質上等效的分析條件及年齡下向 Hexb基因剔除小鼠投與的SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之異二聚體相比，當向至少80日齡之 Hexb基因剔除小鼠投與時，該β-己糖胺酶變體α次單元同二聚體使該小鼠的壽命增加至少2倍。
  44. 一種同二聚體，其包含如請求項1之重組β-己糖胺酶變體α次單元。
  45. 一種醫藥組合物，其包含如請求項44之同二聚體及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
  46. 如請求項45之醫藥組合物，其中該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及氯化鈣。
  47. 如請求項46之醫藥組合物，其包含1 mM磷酸鈉、148 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、0.8 mM氯化鎂、1.4 mM氯化鈣，pH 7.2。
  48. 如請求項46之醫藥組合物，其中包含該重組β-己糖胺酶變體α次單元之該同二聚體以約20 mg/ml之濃度調配。
  49. 一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項45之醫藥組合物。
  50. 一種改善患有SD之個體的SD症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項45之醫藥組合物。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該醫藥組合物經腦室內向該個體投與。
  52. 如請求項49或50之方法，其中該醫藥組合物經腦室內每週向該個體投與。
  53. 如請求項49或50之方法，其中該醫藥組合物每隔一週投與。
  54. 如請求項49或50之方法，其中該醫藥組合物以規則時間間隔投與，其中該規則時間間隔大於每隔一週。
  55. 一種核酸，其編碼包含如請求項24之重組β-己糖胺酶變體α次單元之同二聚體。
  56. 一種載體，其包含如請求項55之核酸及一或多個基因調控區。
  57. 如請求項56之載體，其進一步包含在該載體之5'及3'端兩者處的腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
  58. 一種AAV病毒顆粒，其包含如請求項57之載體。
  59. 一種改善患有TSD之個體的TSD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如請求項58之AAV病毒顆粒。
  60. 一種改善患有TSD之個體的SD症狀或減緩疾病進展的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如請求項58之AAV病毒顆粒。
  61. 一種減少患有TSD或SD之個體中的GM2神經節苷脂累積的方法，其包含向患有TSD或SD之個體投與有效量之如請求項45之醫藥組合物。
  62. 一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如請求項45之醫藥組合物。
  63. 一種降低患有TSD之個體之TSD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有TSD之該個體投與有效量之如請求項58之AAV病毒顆粒。
  64. 一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如請求項45之醫藥組合物。
  65. 一種降低患有SD之個體之SD疾病進展的生物標記水準的方法，其包含向患有SD之該個體投與有效量之如請求項58之AAV病毒顆粒。
  66. 如請求項63或64之方法，其中TSD或SD疾病進展的該生物標記為GM2及GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)或神經絲輕鏈或游離聚醣。
  67. 如請求項49之方法，其中該個體為TSD症狀發生前。
  68. 如請求項49之方法，其中該個體具有TSD相關突變。
  69. 如請求項49中任一項之方法，其中該個體具有相對於TSD之生物標記的對照水準升高的TSD之生物標記的水準。
  70. 如請求項69之方法，其中TSD生物標記之該升高水準係自來自該個體之樣品中獲得的TSD生物標記的量測值。
  71. 如請求項70之方法，其中TSD生物標記之該對照水準係來自不具有TSD相關突變之個體之樣品的TSD生物標記的量測值。
  72. 如請求項71之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。
  73. 如請求項72中任一項之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品係自CSF或血液獲得。
  74. 如請求項72中任一項之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有TSD相關突變之該個體的該樣品為血漿樣品。
  75. 如請求項69中任一項之方法，其中該TSD之該生物標記的該升高水準相對於該TSD生物標記的該對照水準升高至少100%至4000%。
  76. 如請求項69中任一項之方法，其中該TSD之該生物標記的該升高水準相對於該TSD生物標記的該對照水準升高至少2×至100×。
  77. 如請求項69中任一項之方法，其中該生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。
  78. 如請求項50之方法，其中該個體為SD症狀發生前。
  79. 如請求項50或請求項78之方法，其中該個體具有SD相關突變。
  80. 如請求項50中任一項之方法，其中該個體具有相對於SD之生物標記的對照水準升高的SD之生物標記的水準。
  81. 如請求項80之方法，其中SD生物標記之該升高水準係自來自該個體之樣品中獲得的SD生物標記的量測值。
  82. 如請求項81之方法，其中SD生物標記之該對照水準係來自不具有SD相關突變之個體之樣品的SD生物標記的量測值。
  83. 如請求項82之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品係使用液相層析及質譜分析進行定量。
  84. 如請求項83中任一項之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品係自CSF或血液獲得。
  85. 如請求項83中任一項之方法，其中來自該個體之該樣品及來自不具有SD相關突變之該個體的該樣品為血漿樣品。
  86. 如請求項80中任一項之方法，其中該SD之該生物標記的該升高水準相對於該SD生物標記的該對照水準升高至少100%至4000%。
  87. 如請求項80中任一項之方法，其中該SD之該生物標記的該升高水準相對於該SD生物標記的該對照水準升高至少2×至100×。
  88. 如請求項80中任一項之方法，其中該生物標記為GM2、GA2、含有β-連接末端N-乙醯基-D-己糖胺之A2G0'、BMP(22:6)磷脂(雙[單醯基甘油]磷酸酯)、神經絲輕鏈或游離聚醣。
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