KR101682240B1 - Ａｃｅ２ 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합형 ACE2 폴리펩티드에 관한 것으로, ACE2 폴리펩티드는 다이머로서 존재한다. 다이머는 구체적으로 글리코실화된 모노머로 형성되고, 반감기가 연장된 의약품을 제조하는데 사용된다.

ACE2 폴리펩티드.

Description

ＡＣＥ２ 폴리펩티드{ACE2 POLYPEPTIDE}

본 발명은 재조합형 폴리펩티드 제조 분야에 관한 것이다.

안지오텐신 전환 효소(ACE)는 레닌 안지오텐신계에 있어서 중요한 효소이다. 이것은 카르복시펩티다아제로서 막에 고정되며, 주로 폐, 신장 및 심장 세포 뿐만 아니라 내피세포에서 수용체로서 발현하여 각종 펩티드 기질을 개열한다. 상기 기질의 유명한 대표예는 안지오텐신 1-7(Ang 1-7)로 개열되는 안지오텐신 II(Ang II), 안지오텐신 1-9로 개열되는 안지오텐신 I, 및 아펠린과 브래디키닌이다. Ang II 및 Ang 1-7은 레닌 안지오텐신계의 안타고니스트이다. 펩티드 비율을 조정함으로써, ACE2는 혈관 두께 및 내피 투과성을 조정하는데 관여하므로 생물체의 항상성에 영향을 미친다. ACE2 발현은 특히 사이토카인에 의해 제어되고, 각종 염증성 질환에 있어서 감소되고, 이어서 ACE2의 가장 중요한 기질 중 하나인 Ang II의 병적인 증가가 야기된다.

ACE2는 폐에서의 하방 제어된 ACE2 발현과 연관된 급성 폐질환의 두가지 형태인 ARDS 또는 ALI를 치료하는데 사용된다. 이 치료는 전신 투여되어 신속하게 전체 생체에서 이용가능한 재조합형의 가용성 인간 ACE2를 이용하여 증가된 Ang II의 농도를 저하시켜서 Ang 1-7을 생산한다. 이것은 Ang II의 농도 증가에 의한 악영향 을 상쇄시킨다. 이러한 경우에 있어서, 적당한 약리학적 특성을 갖는 유효한 생성물이 소망되고 있고, 따라서 적당한 물질은 생체 내에서의 분포성이 양호하고, 반감기가 약리학적으로 유용할 뿐만 아니라 면역원성이 낮은 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 생성물은 효소적으로 활성이고, 가용성이 우수하며, 또한 용액 중에서 안정적이고, 순도 높게 재생가능하고 경제적으로 생산될 수 있어야 한다.

Tipnis 외의 J. Biol. Chem. 275, (43) (2000): 33238-43에는 ACE2(이 경우에는 ACEH이라고도 함)의 단리 및 그것의 cDNA 단리에 대해서 기재되어 있다. CHO 세포에서의 생산을 행함으로써, 글리코실화된 단백질 모노머를 분자질량 120kDa로 생산했다. 글리코실화 후, 상기 단백질의 질량은 85kDa이었다.

Donoghue의 Cric. Res. 87, (5) (2000): 1-9에는 CHO 세포에서의 가용성 ACE2의 발현에 대해서 기재되어 있고; 이것은 완전히 글리코실화되어지 않고, 분자질량이 약 90kDa인 것을 특징으로 했다. 또한, 상기 문헌은 각종 ACE2 서열과 안티-ACE2 항체의 서열 비교에 관한 것이다.

WO 2004/023270 A2에는 Sf9 곤충 세포에서의 ACE2 모노머 발현 후 ACE2 결정화에 대해서 기재되어 있다. 단백질의 분자질량은 질량 분석법에 의한 분석에 따르면 89.6kDa이었다.

효과적인 효소 보충요법의 치료 작용은 초순수의 약리학적으로 유용한 생성물을 경제적으로 재생가능하게 생산할 수 있는 생산 프로세스를 요구한다. 가용성 ACE2의 세포외 획분은 7개의 N-글리코실화 부위를 포함한다. 비글리코실화된 ACE2는 용해성이 낮고, 응집되는 경향이 있고, 더욱 면역원성이고 반감기가 짧다. 또 한, 정제에 주로 악영향을 미치는 작은 유체역학 직경을 갖는다. 따라서, 본 발명의 목적은 양호한 인비보 반감기를 갖는 고활성의 ACE2를 제공하는 것이다. 상기 목적은 청구항의 내용에 의해 달성된다.

본 발명은 다이머로서 존재하는 재조합형 ACE2 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합형 ACE2 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 ACE2 폴리펩티드 모노머의 글리코실기는 총 적어도 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 또는 적어도 16개의 시알산 잔기, 바람직하게는 적어도 14개의 시알산 잔기에 존재하고, 상기 ACE2 폴리펩티드는 다이머로서 존재한다. 또한, 본 발명은 ACE2 모노머와 함께 글리코실화, 분자량 및 그외 여기에 정의된 상세를 포함한다. 상기 다이머는 호모다이머인 것이 바람직하고; 특히 그 모노머 유닛은 동일 서열 및 글리코실화를 갖는다. 일반적으로, 다이머의 모노머 유닛은 비공유결합되어 있다. 모노머는 다이머로부터 직접 얻거나 변성단계에 의해 얻을 수 있다. 여기에 언급된 모든 바람직한 글리코실화는 다이머 복합체의 하나의 모노머 또는 모노머 모두를 포함한, 다이머와 모노머 모두에 적용가능하다. 특히 바람직하게는 다이머는 2개의 아연 이온을 함유한다.

"시알산 잔기"란 구체적으로는 특히 N- 또는 O-글리코실화되는 N-아세틸-뉴라민산 타입(Neu5Ac)의 잔기를 의미한다.

일반적으로, 치료약의 안정성은 그 반감기 및 그 유효성을 고려했을 때 매우 중요한 기준이다.

현재까지 재조합형 인간 ACE2는 오로지 모노머로서만 알려져 있고, 또한 이러한 상기 문헌에서와 같이 관능성, 결정 구조, 및 고특이적 저해제와의 상호작용에 관해서 기술되어 있다.

따라서, 예를 들면 Vickers 외의 J. Biol. Chem. 277(17), 2002: 14838-14843)을 참조한 Towler 외의 J. Biol. Chem. 279(17), 2004: 17996-18007에는 최종 정제 단계인 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제한 후 모노머로서 얻어진 Sf9 곤충 세포에서의 ACE2 발현에 대해 기재되어 있다. 모노머의 분자질량은 89.6kDa였다.

시판의 ACE2(R&D System 제품, 카탈로그 번호 933-ZN, 배치번호 FIU035071)도 모노머 형태이고, Tipins 외(2000, supra)에 인용된 방법을 사용하여 제조된 것으로, 그 차이는 발현계가 CHO 세포 대신에 NSO인 것이다. 모노머는 환원성 조건과 비환원성의 양 조건 하에서 분자량 120kDa를 갖는 것이 기재되어 있다.

Donoghue 외의 Cric. Res. 87, 2000: e1-e9에 따르면, ACE2 모노머는 CHO 세포에서 발현하였고, 그 후 분비물의 분자량은 90kDa이었다.

여기에 인용된 문헌 및 공보의 모두는 참조로서 원용한다.

본 발명에 따른 치료약을 안정화시키기 위해서, 본 발명에 따라서 안정한 ACE2 다이머만을 생산하고, ACE2 모노머와 비교하여 생산성과 약리학적으로 모두 유리한 이점이 있는 방법이 개발되었다.

다이머화는 하기 이점을 갖는다:

ㆍ생리용액 중에서의 용해성 및 생체 이용률이 더욱 우수하다: 다이머는 용해성이 높고, 인비보 반감기 및 이용률이 길다.

ㆍ응집체를 형성하지 않는다: ACE2 다이머는 다이머에 ACE2 분자를 더 첨가하지 않고도 안정한 복합체를 형성한다.

ㆍ프로테아제 공격이 저감된다: 각각의 단백질 획분, 즉 가장 확실하게는 C-말단 일부는 다이머의 내측을 향하여 있기 때문에, 이 C-말단 단부는 분해되지 않는다.

ㆍ반감기가 증가한다: 면역원성이 낮을수록 용해성이 우수하고 단백질 분해에 대한 감수성이 저하하여 단백질의 반감기가 증가한다.

ㆍ 단백질 정제가 간단하다: ACE2 다이머의 유체역학 직경은 그 구조 및 현저한 용매화 층에 인하여 예상했던 것보다 크다. 따라서, ACE2 다이머를 단백질 발현으로부터 발생된 통상의 불순물, 예를 들면 혈청 알부민(67kDa)으로부터 사이즈 분리 컬럼을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다.

바람직하게는, 재조합형 ACE2 폴리펩티드는 N-글리코실화 가능 부위의 적어도 80%에 대해 글리코실화되고, 당의 비율은 10% 초과(전체 ACE2의 중량%), 또는 11%, 12%, 13%, 14%이고, 바람직하게는 15% 초과, 또는 16%, 17%, 18%, 19%이고, 특히 바람직하게는 20% 초과, 또는 21%, 22%, 23%, 24% 또는 25%이다.

초순수하고 효소적으로 활성이며, 고복합 글리코실화된 ACE2를 재생가능하게 제조하는 제조방법을 개발했다. 상기 생성물은 당의 비율이 높고(>20중량%), 복합체이며, 고분기상이며 부분적으로 음으로 하전된 당 구조인 것을 특징으로 한다. 이들은 생성물의 용해성, 생체 이용률, 효소 활성 뿐만 아니라 약리학적 특성에 대해서도 바람직한 효과를 갖는다. 적당한 발현 구성, 적당한 발현 호스트, 최적의 선정 전략의 선택, 세포 대사에 적합한 배지의 사용, 및 클론 분석 및 선택에 동반되는 수고에 의해서, 소망한 생성물을 분비하는 세포주가 제조될 수 있다.

ACE2는 Sf9 곤충 세포와 NSO 마우스 세포에서 이미 발현되어 있다. 상기 물질은 주로 인비트로 시험에서 주로 사용되었다. 또한, CHO 세포에서의 ACE2의 일시적 발현에 관한 결과에서도 존재한다. 지금까지, 세포주는 적당히 높은 생산성으로 생산되지 않았다. 또한, 생성물의 특성을 고려하여, 특히 N-글리코실화를 고려한 상응하는 콜론 선택이 행해지지 않았다.

단백질의 용해성은 그 아미노산 서열에 의해서 뿐만 아니라 그 폴딩 및 번역 후 수식에 의해서 결정된다. 하전된 당 구조는 단백질의 용해성을 증가시키는 주 요인이고, 그 약리학적 특성에 주로 영향을 미친다. 따라서, 복합 분기상 글리코구조의 복합체의 존재는 단백질의 반감기에 바람직한 효과를 갖는 EPO가 알려져 있다.

원리적으로, 각종 발현계는 ACE2의 재조합형 발현을 고려할 수 있고; 원핵 숙주 세포는 N-글리코실화 부위의 처리 부족 때문에 더 이상의 테스트를 행하지 못했다.

바람직하게는, 글리코실화된 N-글리코실화 부위의 적어도 70%는 서로 독립적으로 일반식 1~8에서 선택되는 구조를 갖는다.

바람직하게는, N-글리코실화 가능 부위의 모두가 글리코실화된다.

바람직하게는, 글리코실화된 N-글리코실화 부위의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 100%는 일반식 1~8을 갖는 구조를 갖는다.

바람직하게는, 다이머의 하나의 ACE2 모노머 유닛의 분자량은 적어도 90kDa, 바람직하게는 적어도 92kDa, 특히 바람직하게는 적어도 94kDa이고, 특히는 적어도 96kDa이고, 매우 바람직하게는 적어도 98kDa이고, 가장 바람직하게는 적어도 100kDa, 100.5kDa, 101kDa, 101.5kDa 또는 적어도 102kDa이다. 수화물층이 없는 펩티드 그 자체의 절대 분자질량은 펩티드 맵핑에 의해 측정할 수 있다. 더욱 고 글리코실화된 형태는 적어도 103kDa, 104kDa, 105kDa, 106kDa, 107kDa, 또는 적어도 108kDa의 분자량을 가져도 좋다.

수계에서의 크로마토그래피 또는 겔 전기영동법과 같은 수화물층과 같은 기타 팩터에 의해 영향을 받는 분자량의 측정은 더욱 높은 결과를 부여할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 다이머의 ACE2 모노머 유닛의 겉보기 분자량은 겔 전기영동법에 의해 측정한 바와 같이 적어도 101kDa 또는 적어도 102kDa, 바람직하게는 적어도 105kDa, 특히 바람직하게는 적어도 109kDa, 특히는 적어도 113kDa, 매우 바람직하게는 적어도 117kDa, 가장 바람직하게는 적어도 119kDa이다.

다른 실시형태에 있어서, 모노머의 분자량(겉보기 분자량 또는 절대 분자량)은 최대 102kDa, 103kDa, 104kDa, 108kDa, 110kDa, 112kDa, 116kDa, 120kDa, 125kDa, 130kDa, 135kDa 또는 140kDa이다. 높은 분자량은 ACE2의 수식, 예를 들면 PEG화에 의해 가능하다.

바람직하게는, 상기 모노머(다이머를 형성하지 않음)의 분자량은 적어도 82kDa, 바람직하게는 적어도 86kDa, 특히 바람직하게는 적어도 90kDa, 특히는 적어도 94kDa, 매우 바람직하게는 적어도 98kDa, 가장 바람직하게는 적어도 101kDa, 또는 최대 102kDa, 103kDa, 104kDa, 108kDa, 110kDa 또는 최대 112kDa이다. 이들 분자량은, 예를 들면 펩티드 맵핑법을 사용하여 측정할 수 있다.

바람직하게는, ACE2 폴리펩티드는 막관통 영역을 갖지 않는다. 따라서, 이것은 가용성 ACE2이다. 그러므로, 특히 바람직한 실시형태는 폴리펩티드 사슬이 아미노산 18-740 또는 그 효소 활성 단편으로 이루어진 가용성 ACE2 폴리펩티드를 포함한다. 다른 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1로부터 아미노산 18-615로 이루어진다.

인간 ACE2(SEQ ID NO: 1)는 대부분의 치료적 용도에 대해서는 바람직하지만, 그외의 포유류, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 영장류 또는 소 유래의 ACE2도 사용할 수 있다. ACE2는 각종 종에 있어서 동일한 Ang II 기질을 갖는 모든 포유류에 있어서 일반적인 효소이다. 그러므로, 원리적으로는 이종 생물체에도 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질은 ACE2의 유래에 상관없이, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 영장류 또는 소 유래의 것도 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에 있어서는 ACE2 유래와 처리할 생물체는 동일하다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Ser740에 상응하는 ACE2 폴리펩티드의 세린(또는 C-말단 아미노산)(예를 들면 C-말단 단부)는 O-글리코실화된다.

바람직하게는, 글리코실화된 N-글리코실화 부위의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 특히는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 100%가 시알산을 나타내고; 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 Asn53, Asn90, Asn103, Asn322, Asn432, Asn546, Asn690에 상응하는 N-글리코실화 부위는 시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn53에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn90에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn103에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn322에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn432에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn546에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn690에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

특정 실시형태에 있어서, SEQ ID NO: 1의 Asn740에 상응하는 아스파라긴은 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다. 바람직하게는, 하나의 ACE2 제제에 있어서, 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-시알화된다.

바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 특히 55%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 글리코실화 N-글리코실화 부위는 적어도 2개의 시알산을 갖는다. 따라서, 바람직하게는 하나의 ACE2 제제에 있어서 상기 아미노산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 시알화된다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn53에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn90에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn103에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn322에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn432에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn546에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn690에 상응하는 아스파라긴은 N-글리코실화되고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 여기에 정의된 바와 같은 폴리펩티드(ACE2 모노머 또는 다이머, 또는 다이머의 모노머 유닛)를 포함하는 재조합형 ACE2 폴리펩티드 제제에 관한 것으로, 여기서 겔 전기영동법으로 측정할 수 있는 겉보기 분자량이 100kDa 미만 또는 101kDa 미만, 바람직하게는 104kDa 미만, 보다 바람직하게는 108kDa 미만, 특히는 112kDa 미만, 특히 바람직하게는 117kDa 미만, 가장 바람직하게는 119kDa 미만인 ACE2 폴리펩티드의 부분이 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 특히는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만, 특히는 0%, 및 그 임의의 조합이다. 예를 들면, 100kD 미만의 ACE2 폴리펩티드가 0%의 양으로 존재할 수 있고, 100kDa 미만의 ACE2 폴리펩티드가 20% 미만의 양으로 존재할 수 있다. 상기 획분은 연관된 모든 ACE2 형태에 관한 것이고, 예를 들면 네거티브 겔 전기영동법을 사용하여 측정된다.

마찬가지로, 분자질량은 펩티드 맵핑에 의해 측정될 수 있는 절대 분자질량일 수 있다. 따라서, 분자량 86kDa 미만, 또는 89kDa 미만, 바람직하게는 92kDa 미만, 더욱 바람직하게는 94kDa 미만, 특히는 97kDa 미만, 특히 바람직하게는 100kDa, 가장 바람직하게는 101kDa 미만의 ACE2 폴리펩티드의 획분은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만, 특히는 0%, 및 그 임의의 조합이다. 예를 들면, 86kD 미만의 ACE2 폴리펩티드가 0%의 양으로 존재할 수 있고; 97kDa 미만의 ACE2 폴리펩티드가 20% 미만의 양으로 존재할 수 있다.

바람직하게는, 막관통 영역을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이고, 특히는 0%이다.

바람직하게는, ACE2 멀티머의 획분은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만, 특히는 0%이다. "ACE2 멀티머"란 3개 이상의 ACE2 폴리펩티드를 갖는 복합체를 의미한다. 또한, ACE2 다이머의 제제에 있어서, ACE2 모노머의 획분은 바람직하게는 20% 미만이고, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이고, 특히는 0%이다. 또한, ACE2 모노머의 제제에 있어서, ACE2 다이머의 획분은 바람직하게는 20% 미만이고, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만이고, 특히는 0%이다.

바람직하게는, ACE2 분자 중의 ACE2 다이머의 획분은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 적어도 99%이다. 다른 실시형태에 있어서, 함께 조합하여 또는 독립적으로 ACE2 분자 중의 ACE2 모노머의 획분은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 적어도 99%일 수 있다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn53에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn90에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn103에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn322에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn432에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn546에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Asn690에 상응하는 N-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과, 특히는 100%이고, 바람직하게는 일반식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 따른 구조를 갖는 글리칸을 갖는다.

바람직하게는, SEQ ID NO: 1의 Ser740에 상응하는 O-글리코실화된 아스파라긴을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 60% 초과, 바람직게는 70% 초과, 더욱 바람직하게는 80% 초과, 특히 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과이고, 특히는 100%이다.

바람직하게는 ACE2 폴리펩티드 또는 제제의 촉매활성 ccat는 Ang 1-7(안지오텐신 1-7) 전환에 대해서 적어도 4s^-1, 바람직하게는 적어도 5s^-1, 더욱 바람직하게는 적어도 6s^-1, 특히 바람직하게는 적어도 7s^-1, 가장 바람직하게는 적어도 7.6s^-1이다. Ang 1-7은 Ang II(안지오텐신 II)로부터 ACE2에 의해 형성된다. 상기 전환은 실시예에 기재된 바와 같은 간단한 방법으로 테스트될 수 있다. 또한, 이러한 전환 또는 ACE2의 촉매활성은 다른 시험 데이터로부터 추정할 수 있다. 상기 활성은, 예를 들면 WO 2008/046125 A에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 재조합형 ACE2 폴리펩티드의 제조방법 또는 재조합형 ACE2의 제제에 관한 것으로, ACE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 막관통 영역이 없는 ACE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포에 삽입하는 단계, ACE2 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 및 상기 발현된 ACE2, 특히 다이머 형태의 ACE2를 수집하는 단계를 포함한다. 그 후, 상기 세포는 여기에 기재되어 있는 바와 같이 본 발명에 따른 ACE2 폴리펩티드, 특히 고분자량의 ACE2 폴리펩티드를 제조하기 위해서 선택될 수 있다.

바람직하게는, ACE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 공급한다.

바람직하게는, ACE2 발현을 마커, 바람직하게는 DHFR을 사용하여 선택한다.

바람직하게는, 상기 벡터는 발현된 ACE2 mRNA에 대해(또는 코딩하는) IRES를 갖는다.

바람직하게는 진핵 세포는 CHO 세포이다.

또한, 본 발명은 이러한 방법에 의해 얻어질 수 있는 재조합형 ACE2 폴리펩티드 또는 재조합형 ACE2 폴리펩티드 제제에 관한 것이다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 ACE2를 코딩하는 트랜스펙트된 폴리뉴글레오티드를 갖는 안정한 진핵 세포주(또는 세포), 바람직하게는 상술한 바와 같이 특히 ACE2를 발현하는 CHO 세포주(또는 세포)를 제공한다. 상기 세포주는 소망한 특성, 예를 들면 상술한 바와 같이 분자량이 적어도 102kDa인 모노머 유닛으로부터 다이머의 제조를 위해 선택될 수 있다.

상기 세포는 바람직하게는 적어도 10pg/세포/일, 바람직하게는 적어도 15pg/세포/일, 특히 바람직하게는 적어도 20pg/세포/일의 ACE2 생산성을 갖는다.

ACE2의 발현은 바람직하게는 충분한 Zn^{2 +} 이온의 존재 하에서 일어난다. 바람직하게는, 적어도 0.5μM, 특히 5μM 이하의 Zn^{2 +}가 사용되고; 특히 2.5~3.5μM의 Zn²⁺를 사용하여 발효를 행할 수 있다. 발현된 세포의 배양액에서의 Zn^{2 +}의 농도는, 예를 들면 적어도 0.5μM, 0.75μM, 1.0μM, 1.25μM, 1.5μM, 1.75μM, 2.0μM, 2.25μM, 또는 적어도 2.5μM 또는 3.0μM이어도 좋다. 다른 처리단계를 Zn^{2 +} 이온의 존재 하에서 행하는 것도 바람직하다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 ACE2 생성물의, 특히 고혈압, 울혈성, 급성 또는 만성 심부전과 같은 심부전, 심근 경색이나 동맥경화, 신부전이나 신기능부전, 다낭성 신장 질환(PKD), 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 폐기종, 낭포성 섬유증, 간질성 폐질환, 폐동맥 고혈압, 폐색전증, 폐의 유육종증, 결핵, 폐수종, ALI, ARDS 또는 폐암과 같은 폐질환의 치료 또는 예방을 위한 약 또는 의약품에 관한 것이다. ACE2에 대한 일반적인 치료 적응이 WO 2004/000367 A에 언급되어 있고, 예를 들면 이 경우에 있어서 본 발명의 ACE2 생성물도 적합하다.

본 발명에 따르면, ACE2 단백질을 포함하는 의약 조성물 또는 약을 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 그 자체가 의약적으로 허용가능한 염이어도 좋고, 완충제, 강장성분 또는 의약적으로 허용가능한 담체를 더 첨가해도 좋다. 의약 담체 물질은 조성물의 상용성을 향상시키고, 또한 활성 성분의 우수한 용해성 및 우수한 생체 이용률을 제공하는 기능을 한다. 예로는 유화제, 증점제, 산화환원 성분, 전분, 알콜성 용액, 폴리에틸렌글리콜 및 지질을 들 수 있다. 적합한 의약 담체의 선택은 투여 경로에 크게 의존한다. 경구 투여를 위해서는 액체 또는 고체 담체가 사용될 수 있고; 예를 들면 주사와 같은 액체의 최종 조성물이 요구된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 ACE2 조성물은 완충제 또는 강장 물질을 포함한다. 상기 완충제는 약의 pH를 생리학적 조건으로 조정할 수 있고, 또한 pH 변화를 저감 또는 완화시킬 수 있다. 예를 들면, 포스페이트 완충제이다. 강장 물질은 삼투압을 조정할 수 있고, 또한 무기염, 예를 들면 NaCl 또는 KCl과 같은 이온 물질, 또는 글리세린 또는 탄수화물과 같은 비이온성 물질을 함유해도 좋다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 또는 약은 전신 투여, 국소성 투여, 경구 투여 또는 비강내 투여에 적합하게 제조되거나 또는 흡입 제제로서 제조된다. 이러한 본 발명의 조성물의 투여 형태는 빠르고 간편하게 취할 수 있다. ACE2 조성물은 경구 투여를 목적으로 할 경우에는 바람직하게는 위산에 내성이 있는 제형으로 제공되거나 또는 캡슐화된다. 경구 투여에 있어서는 고체 또는 액체 약을 직접, 또는 예를 들면 용해 또는 희석하여 취할 수 있다.

본 발명에 따른 용도의 약은 바람직하게는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 혈관내 투여, 복강내 투여 또는 피하 투여용으로 제조된다. 예를 들면 주사 또는 수혈이 이러한 목적에 적합하다. 혈류로의 직접 투여는 약의 활성 성분이 전신으로 분포될 수 있다는 이점을 가져서 타겟 조직으로 신속하게 도달된다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예를 이용하여 더 설명하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 ACE2 발현 및 선택 카셋이다.

도 2는 얻어진 클론 히스토리의 ACE2 특정 웨스턴 블롯 분석이다.

도 3은 ACE2 모노머의 SDS-PAGE 분석이다.

도 4A 및 4B는 클론 선택에 관한 도면이다.

도 5는 LC-MS 글리코실화 분석이다.

도 6은 ACE2의 예비 사이즈 분리에 관한 도면이다.

도 7은 3종에서의 ACE2의 약물동태에 관한 도면이다.

도 8은 Ang 1-7 및 Ang II의 정량화를 위한 검량곡선이다. Waters C18 μ-Bondapak RP 컬럼(2.1×300mm, 10㎛, 125Å)에서 RP-HPLC를 사용하여 펩티드를 정해진 농도 범위에서 분리했다.

도 9는 N-말단 펩티드의 MS/MS 스펙트럼이다. 도면에서 Q 및 K는 동일한 질량을 갖는다.

도 10은 ACE2와 N-글리코실화의 예상 서열에 관한 도면이다.

도 11A~11E는 글리코실화 부위 103(A), 부위 432(B), 부위 546(C), 부위 690(D), 부위 90(E)의 상세 스펙트럼이다.

도 12는 C-말단 O-글리코실화 펩티드의 스펙트럼이다. 구조 할당은 임시적으로서 분류되어야 한다.

도 13은 LC-MS 공개 글리칸이다.

도 14는 네이티브 PAGE(좌측, 은염색을 이용하여 가시화한 단백질 밴드) 및 SEC(우측, 10% 아세토니트릴 중의 pH 7.0의 200mM Na-포스페이트의 존재하에서의 Zorbax G-450 컬럼에서의 분리하고, 크로마토그램은 214nm에서 기록하였음)를 이용한 ACE2 다이머 구조의 측정에 관한 도면이다.

도 15는 ACE2 다이머의 사이즈 배제 크로마토그래피의 크로마토그램이다(체류 시간: 8.55분, 8.93분). 기준: 티로글로불린(670kDa, 7.43분), 감마-글로불 린(158kDa), 오발부민(43kDa, 10.08분), 미오글로불린(17kDa, 11.08분), 비타민 B-12(1.3kDa, 12.71분)

도 16은 피질(A), 뇌(B) 및 ACE2 다이머 발현 클론(C)으로부터의 세포 추출물의 ACE2 특정 웨스턴 블롯 분석에 관한 도면이다. D는 순수 ACE2 다이머를 나타낸다.

도 17은 ACE2 모노머 형태의 분석적 SEC-HPLC 크로마토그램이다. 조작 조건: 컬럼: Zorbax GF250, 버퍼: 220mM Na₂H-PO₄+10% CH₃CN, pH 8.0, 1mL/분

도 18은 ACE2 다이머(A) 및 ACE2 모노머(B)의 PAGE 분석에 관한 도면이고; 은염색(a) 및 ACE2 특정 웨스턴 블롯(b)을 이용하여 나타낸 단백질이다.

도 19는 ACE2 다이머와 비교하여 ACE2 모노머의 효소 활성을 측정한 도면이다. 소정의 형광 표식물질 쿠마린-APK-DNP의 초기 농도와 4개의 상이한 효소 농도를 사용하여 상응하는 형광 곡선을 비교했다.

도 20은 ACE2 다이머 투여(2.5mg/kg, 청색 컬럼) 또는 ACE2 모노머 형태 투여(2.5mg/kg, 회색 컬럼) 24시간 및 48시간 후에 측정한 ACE2 혈청 활성에 관한 도면이다.

실시예 1: 고 글리코실화 ACE 다이머의 발현

인간 ACE2 서열(SEQ ID NO: 1)의 가용성 획분을 증폭된 DHFR 선택 마커가 이미 첨가되어 있는 발현 벡터에 클로닝하여 ACE2 유전자의 발현을 개선시켰다. 이 단부에, ACE2와 DHFR을 코팅하는 유전자 사이에 약독화한 IRES를 삽입하여, 동일한 mRNA에 ACE2 및 DHFR의 바이시스트로닉(bicistronic) 전사를 행했다. ACE2 발현 및 선택 카셋을 도 1에 도시한다. 2개의 단백질 모두 동일한 프로모터의 제어하에 발현되었기 때문에, ACE2 발현은 MTX 안타고니스트를 사용하여 DHFR 선택에 의해 의도적으로 증가시킬 수 있다. 이러한 전략에 의해 일정한 품질의 생성물을 고수율로 제조하는 특히 안정한 발현 세포주를 제조할 수 있다. 또한, 이것은 적당한 생성물 타이터(titer)가 특정 타겟 단백질의 재조합 발현에 거의 적합하지 않을 수 있는 세포주에서도 얻어질 수 있다는 것을 의미한다.

이 벡터는 CHOdhfr 세포에서 트랜스펙팅되고, ACE2 유전자의 카피수가 MTX 압력이 계속적으로 증가함에 따라 증폭되었다. 수개의 선택 및 서브클로닝 사이클이 세포내 FACS 분석 및 단백질-화학 뿐만 아니라 효소 분석을 이용하여 최적의 생성물 특성을 갖는 최상의 생성물을 선택하는데 사용되었고; 특히 가장 적당한 클론을 선택하기 위해서 3개의 상이한 기질을 사용하여 측정한 특정 효소활성, 생성물 균질성, 세포 생산성 및 당의 복잡성을 고려했다. 도 2는 제조된 세포주를 정착시키기 위해서 사용되는 각각의 클론의 연속 배양 잔류물의 웨스턴 블롯 분석의 요약을 나타낸다. 각각의 클론의 생성물 특성은 질량이 대폭 증가하는 것으로부터 알 수 있듯이 우측으로부터 좌측으로 발현 생성물 중의 당의 비율이 증가한다는 것이 다르다. 이것은 고 글리코실화된 클론의 특이적 선택에 의해 얻어졌다. 마지막으로, 가장 높은 분자량을 갖는 발현 생성물을 갖는 1개의 클론(클론 5B9)이 제조된 세포주(184)를 정착시키는데 사용되었다.

고 활성이고 복합 N-글리코실화 ACE2를 효소적으로 발현하는 6개의 클론을 갖는 재료를 추적하였다. 가용성 ACE2는 83kDa의 분자량을 가지면서, 그 당 구조에 의해 결정되는 바와 같이 SDS-PAGE를 변성시킴에 있어서 120kDa 이하의 범위 내에 있는 클론이 선택된다. 도 3은 NS0에서 제조된 기준 ACE2(A 레인)와 비교하여 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 ACE2(B 레인)를 나타낸다. 본 발명에 따른 ACE2 폴리펩티드(여기서는 모노머로서 분석됨)는 균질하고 고 글리코실화되어 있어서 대략 120kDa에서 단일밴드로서 나타나고, 기준 재료의 밴드는 매우 불균질한 글리코실화를 나타내는 83kDa~120kDa이다.

그 후, 예비 클론을 무단백질 성장 배지(Polymun)에 전사했다. 이 시판의 배지는 화학적으로 제한된 무혈청, 동물성 단백질 비함유의 CHO에서의 당단백질의 재조합 발현을 위해 최적화된 것이다. 발효는 2.5~3.5μM Zn^{2 +}을 이용하여 행했다. 6개의 클론 모두를 배양 하에서 유지시키고 그 제조공정 안정성을 테스트했다. 특히, 성장 속도를 기록하고, 생성물의 양과 대사 산물을 검사했다(도 4A 및 4B). 또한, 발현 생성물과 클론을 정밀하게 분석했다. 모든 클론은 고 활성 ACE2를 발현하고, 20~30pg/세포/일의 생산성을 가졌다. 또한, 그 당 구조 및 불균질성을 분석했다. 마지막으로, 클론 1B4를 선택했다. 전체 제조공정에 걸쳐서, 균질한 당 구조를 나타냈다. 적어도 2중 분기상을 갖지만 3중 분기상 복합 글리코실화인 경우도 있는 7개의 N-글리코실화 부위 모두를 말단 시알산으로 처리했다.

이 클론에 기초하여 마스터 세포 뱅크를 제조하여 테스트하고, GMP류 정제공 정 및 GMP류 제조공정을 구성했다.

SEQ ID NO: 1(ACE2 단백질 서열; 자가 시그널 서열(밑줄)은 배제용 호스트 세포에 의해 개열됨):

ACE2의 이량화는 소수성 단백질 유닛의 모두가 상기 복합체의 내부를 향하여 있어서, N-결합 당 사슬과 같은 하전된 잔기가 외부로 돌출되어 있어 하전된 생리 용액에 상기 구조가 용매화된다. 상기 완전히 N-글리코실화된 ACE2의 발현에 의한 이량화가 Zn²⁺의 존재 하에서 관찰되었다. 이 경우에, 다이머 복합체는 서로 정전적으로 결합되어 있고, 또한 생리 용액 중에서 더 이상 분리되지 않는 2개의 동일한 서브유닛으로 이루어졌다. 이것에 의해 각각의 ACE2 분자에 대해 14개의 고 하전 시알산 구조를 갖고, 또한 다이머에 있어서는 28개의 시알산 구조를 갖는 당단백질이 매번 분비된다. 2개의 Zn²⁺ 이온은 상기 복합체에 삽입되어 그 구조를 안정화시킨다. 당 사슬의 높은 전하는 생리 수용액 중에서 분자를 용매화하여 연결된 하전 단백질 영역을 외부로 밀어낸다. 이 제조공정은 최종 생성물 중에 ACE2 다이머만이 존재하도록 구성된다.

이것은 ACE2를 생성함에 있어서 충분한 Zn²⁺ 이온이 존재하고(바람직하게는 1.5~5μM Zn²⁺가 사용되고; 특히, 발효는 2.5~3.5μM Zn²⁺에서 행할 수 있음); 이어지는 처리단계가 Zn²⁺의 존재 하에서 행해진다고 하는 사실에 의해서 가능해진다.

정제는 음이온 교환단계, 암모늄술페이트 석출, HIC 단계, 양이온 교환단계, 그 다음 고분해능 음이온 교환단계를 이용하여 행한다. 상기 공정에 있어서의 모든 매질은 포스페이트 완충되어 있고 염화나트륨을 함유했다. 최종 샘플 완충제는 주사용의 생리적 글리신 용액이다.

실시예 2: 생성물 특성

복합 고글시코실화 ACE2 모노머 또는 다이머의 모노머 유닛은 공유 결합된 당 구조로 인하여 아미노산 서열에 의해 나타나는 것보다 더 높은 분자량을 갖는다. 따라서, 펩티드 맵핑은 분자질량 102kDa를 제공하는 반면, 비글리코실화 ACE2의 분자질량은 단지 83kDa이다. 당의 비율은 대응해서 23%이고 후술하는 생성물 특성에 불가결한 것이다. 강한 수화작용에 때문에, 모노머 유닛은 참조 기준에 대해서 120kDa(도 3)에서 SDS-PAGE에 나타난다.

천연 막결합형 ACE2는 발현되지 않고 ACE2의 가용성 획분만이 발현되었다. 손실 막 영역 때문에 완전히 글리코실화된다.

복합 고 시알화되어 고도로 음으로 하전된 당 구조 때문에, ACE2는 비글리코실화 또는 미완료 글리코실화 ACE2에 비하여 더욱 우수한 용해성을 갖는다. 따라서, 15mg/mL 이상의 생리적 완충 단백질 포뮬레이션이 용이하게 제조될 수 있다.

또한, 생성물은 안정한 이량화와는 별개로 용액 중에서 안정하고, 장기간 보존시 활성을 잃지 않으며 또한 열화되거나 응집되는 경향도 없다. 한편, 탈 글리코실화된 ACE2는 저 농도 범위에서조차 석출된다. 이것은 PNGaseF를 사용한 예비 탈 글리코실화 실험에서도 볼 수 있다. ACE2에 대해 계산된 이론적 안정성 지표는 41.2이고, 단백질을 불안정으로 분류하고; 당 구조는 이 계산에 고려되지 않는다. 그러나, 포뮬레이션이 수 개월간 안정하게 유지되므로, 이것은 명백히 당의 비율이 높기 때문이다. ACE2의 용매화가 우수하다는 것은 이 포뮬레이션이 ACE2 다이머(또는 모노머의 인공 분리하여 모노머 배제 후)로만 이루어진 것을 의미하는 반면, 비 글리코실화된 ACE2는 멀티머 및 응집체를 형성하는 경향이 있다.

하전된 당 잔기의 큰 획분은 유체역학 직경을 증가시키기 때문에, 본 발명의 ACE2 제제의 용매화 층이 실질적으로 증가한다. 이 상황은 사이즈 분별 컬럼에 의해 ACE2의 예비 정제에 이용될 수 있고; 여기서 다이머로서만 존재하는 단백질의 겉보기 분자량은 계산치가 83kDa인 것과 비교하여 250kDa이다. 도 6에 예비 ACE2 정제의 크로마토그램을 나타낸다. ACE2(제 1 인출)가 체류 시간 69분에 용출된다. 이것은 티로글로불린(제 1 인출, 58분, 670kDa)과 감마-글로불린(제 1 인출, 74분, 158kDa) 사이의 겉보기 분자량에 상응한다. 이러한 고분자량 영역에 있어서, 배양 잔류물 중에 실질적으로 오염물이 없어서, 매우 순수한 생성물을 매우 간단한 공정 으로 분리할 수 있다.

실시예 3: 생성물의 약리학적 특성

본 발명의 ACE2 제제는 생리적 완충제 중에 안정한 극순수의 농축 단백질 용액으로서 존재하여, 더욱 안정화시키지 않고 보존될 수 있고 또한 투여될 수 있다. 예를 들면 포스페이트 완충제가 사용될 수 있다.

ACE2는 용액 중에서 모노머 또는 다이머로서 안정하고, 당의 비율이 높기 때문에 응집이 나타내지 않는다. 또한, ACE2 제제는 완전한 효소 활성을 갖는다.

이 용해성으로 인하여 ACE2는 볼루스로서 IV 투여될 수 있다. 동일한 이유로, 투여 직후 생체 이용률이 보증된다.

고분기상이며 복합체인 당의 비율이 높기 때문에, ACE2는 단지 천천히 열화된다. 그 결과, 각종 종, 특히 붉은 털 원숭이에서 측정시 적어도 10.5시간의 긴 반감기를 갖는다. 도 7은 3종에 있어서 IV 투여된 ACE2에 대해 측정한 반감기를 나타낸다.

시알산의 함유량이 높다는 것은 면역응답의 중화가 ACE2에 대해서는 증가하지 않는 것을 의미한다. 이것은 ACE2의 외인성 투여에 대해서는 비효과적일 뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 자가 ACE2를 중화시킬 수 있다.

모든 연관된 생성물 특성과 함께 기재한 ACE2 포뮬레이션은 rhACE2를 사용하여 효과적인 치료를 제공한다.

실시예 4: 특이적 ACE2 활성의 측정

ACE2 제제의 특이적 활성을 Ang II(Asp-Arp-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)의 전 환을 측정함으로써 측정했다. 모든 측정은 100μL 일정 분량에서 3회 실시했다. 효소 반응을 250ng/mL ACE2를 pH 6.5의 50mM MES, 300mM NaCl, 10μM ZnCl₂ 및 0.01% Brij-30 중의 80μM Ang II 용액에 첨가하여 개시했다. 샘플을 조심스럽게 혼합하고 37℃에서 정확시 18분간 배양했다. 100mM EDTA를 첨가함으로써 효소 반응을 중단했다. 분석을 위해서, 상기 용액을 RP-HPLC(Waters C18 μBondapak, 2.1(300mm, 10μm, 125Å))을 사용하여 유속 1mL/분으로 20분간 0.08% H₃PO₄ 중의 10~60% CH₃CN의 선형 구배를 사용하여 분리했다. 또한, Ang II 및 Ang 1-7 피크 모두를 크로마토그램에서 검출하여 통합했다. 펩티드 농도는 도 8에 나타낸 적당한 검량곡선을 사용하여 측정했다. 또한, 효소적 변환 및 특이 효소 활성을 측정했다.

상술한 바와 같이 ACE2 제제의 활성을 측정했다. 도 1은 피크 적분 및 계산된 효소 데이터의 결과를 나타낸다.

[표 1] 효소 데이터와 반응 조건. 3회 측정의 평균치를 나타낸다.

효소 반응성
피크 표면적 mAU.min	전환 μmol.min-1	반응 시간 min	ACE2 농도 ng.mL-1	Ccat s-1	특이 활성 μmol.mg-1.min-1
Ang II
17149890	62.1	18	250	8.0±0.3	4.7±0.2
Ang 1-7
4720141	23.1	18	250	8.8±0.2	5.2±0.1

ACE2 제제의 촉매 활성 ccat는 Ang II 전환을 사용해서는 8.0±0.3s^-1로 측정되었고, Ang 1-7 전환에 대해서는 8.8±0.2s^-1이었다. 양쪽 값이 양호하게 일치하 였고, ACE2의 촉매 활성이 3.5s^-1이라고 공개한 Vickers 외의 J. Biol. Chem. 277, (17) (2002): 14838-43에 나타낸 데이터보다 훨씬 높았다. 반응 조건을 동일했다. 본 발명의 제제의 활성이 240% 더 높은 이유는 번역 후 수식 때문이고, 이 경우에는 주로 Vickers가 사용한 재료에서는 더욱 적게 나타나는 N-글리코실화 때문이다. 이 재료는 곤충 세포에서 발현되고, 실제로 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 분기화의 범위 및 정도가 더욱 적게 글리코실화되었다. 또한, R&D Systems 제품의 시판의 ACE2 제제(cat no 933-ZN)도 2.0±0.1s^-1의 더욱 낮은 활성 ccat를 갖는 것이 조사되었다. 본 발명의 제제의 기본적 특성은 번역후 수식에 의해 주로 허용되는 효소 활성이 특히 높다.

실시예 5: 재조합형 ACE2의 글리코프로테옴 분석

정제한 CHO 발현 ACE2의 샘플을 2가지 방식으로 분석했다.

우선, 트립신 펩티드를 SDS-PAGE 및 S-알킬화를 사용하여 제조하고, LC-ESI-MS(및 MS-MS)를 사용하여 분석했다. N-말단 펩티드 및 수개의 내부 펩티드를 발견했다. 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위 중 5개가 푸코스 및 각종 양의 시알산을 갖는 2중 분기된 글리칸을 주로 함유하는 글리칸 구조를 갖는 글리코실화 형태로 발견되었다. C-말단 펩티드는 O-글리코실화되어 발견되었다.

두 번째로, 탄소-LC-MSI-MS를 사용하여 유리 및 저감된 N-글리칸을 분석했다. 푸코스를 갖는 2중 분기된 디시알화 글리칸에 있어서는 푸코스는 α1,6 핵에 결합되었고 시알산은 α2,3에 결합된 것을 나타냈다. 모노- 또는 디시알화된 2중 분기상 글리칸 이외에, 현저한 양의 3중 분기된 올리고당이 발견되었다. 생성된 글리코실화된 ACE2의 대략적 측정치는 101~102kDa으로, 즉 대략 17%의 탄수화물로 이루어진다.

SDS-PAGE를 사용하여 hBChE의 단백질 분해물을 분리했다.

SDS-PAGE를 행한 ACE2의 일정 분량을 상술한 바와 같이 탈오염화하고, 카르바미도메틸화하고, 양질의 트립신을 시퀀싱하여 분해하고, 겔 단편 상에서 추출했다. 추출물을 Speed Vac 농축기에서 건조하고, 0.1% 포름산을 함유하는 물로 재구성한 후, 이어서 LS-MS 분석을 행했다. 올리고당 분석을 위해서 펩티드를 PNGase F를 이용하여 분해하고, 글리칸을 C18 SPE 카트리지를 사용하여 정제했다.

트립신 펩티드와 글리콜 펩티드의 MS 분석

질량 분광분석을 최근 소개[Kolarich 2006]된 표준 전기스프레이 유닛, Cap-LC 시스템(Water Micromass 제품) 및 10포트 용매 교환 모듈(Rheodyne 제품)을 구비한 Q-TOF U1-tima Global Instrument(Water Micromass 제품)를 이용하여 행했다. 샘플을 우선 용제로서 물을 사용하여 Aquasil C18 예비 컬럼(30×0.32mm, Thermo Electron 제품) 상에 포착했다. 분석 컬럼인 Biobasic C18 컬럼(100×0.18mm, Thermo Electron 제품)에 유지시킨 후에 용제를 5% 아세토니트릴로 교환한 다음, 5~50% 아세토니트릴의 선형 구배를 유속 2μL/분으로 적용했다. 용리 매체 모두는 0.1% 포름산을 함유했다.

샘플을 MS- 및 MS-MS에 의해 분석했다. 데이터 분석을 MassLynx 4.0SP4 소프트웨어(Waters Micromass 제품)를 사용하여 행했다.

ACE2로부터의 유리 N-글리칸의 분석

붕소화 수소가 저감된 글리칸을 다공질 그래파이트 탄소 컬럼에서 분리하고 질량 분석을 이용하여 분석했다.

실시예 6: 글리코실화 분석

ACE2 단백질 서열에 대한 분자중량, 모든 글리코실화 부위의 위치 및 결합된 당의 구조를 측정했다. 샘플을 트립신 분해, S-알킬화 및 LC-ESI-MS를 이용하여 분석했다.

ㆍ측정된 글리코실화된 생성물의 단백질 질량은 102kDa였고, 여기서 당의 비율은 총 질량의 23%였다;

ㆍN-말단 단부 및 서열의 모든 내부 펩티드의 존재를 측정했다(서열 정보 참조);

ㆍ7개의 가정된 모든 N-글리코실화 부위(위치 53, 90, 103, 322, 432, 546 및 690)은 실질적으로 2중 분기된 복합 시알산을 함유하는 푸코실화된 당 구조(도 13)를 함유했다.

ㆍC-말단 펩티드는 O-글리코실화되었다.

이들 당 잔기의 구조는 개열 및 환원 후에 탄소-LC-ESI-MS에 의해 측정했다. 2중 분기된 구조의 각각 및 모두는 2개의 α2,3 결합된 시알산 및 1개의 α1,6 결합된 푸코스를 함유했다. 소량의 3중 분기된 구조도 발견되었다(도 11A~11E). 채용된 선별 전략은 완전히 글리코실화된 시알산 함유 발현물이 얻어지는 것을 도모했다.

방법:

샘플 제조

ACE2를 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 탈오염하고, 알킬화하고, 트립신을 사용하여 분해시켰다(Kolarich et al., Proteomics 6 (2006): 3369-3380). 겔 추출물을 건조하고, 0.1% 포름산에 용해시킨 후 LC-MS 분석했다. 당 분석을 위해서, 펩티드를 PNGage-F를 이용하여 분해시키고 C18 SPE 컬럼에서 정제했다.

MS 분석

모든 질량 분광 분석을 표준 전자스프레이 유닛 및 Cap-Lc System(Waters Micromass 제품)을 구비한 Q-TOF Ultima Global Instrument(Waters Micromass 제품)을 사용하여 행했다(Kolarich, 2006).

샘플을 물 중에서 Aquasil C18 예비 컬럼(30×0.32mm, Thermo Electron 제품)으로 농축했다. 사용된 분리 컬럼은 아세토니트릴 구배를 사용한 C18 컬럼(100×0.18nm, Thermo Electron 제품)이었다. 샘플을 MS 및 MS-MS 모드에서 분석했다.

유리 N-글리칸 분석

붕소화 수소를 사용하여 환원시킨 글리칸을 다공질 그래파이트 컬럼에서 특징화하였다.

실시예 7: rhACE2의 다이머화

실시예 1에 따라 제조된 ACE2를 다이머로 얻고, 이 다이머를 분리하지 않고 그대로 분석했다. 자연 처리란 변성 분석과는 대조적으로 다이머가 손상없이 잔존하는 것을 의미한다(도 3). "ACE2의 다이머화"란 모든 소수성 단백질 유닛은 복합 체의 내부를 향하고, N-결합 당 사슬과 같은 하전된 잔사는 외부로 돌출되어 있어서, 그 구조는 역시 하전된 생리적 매체 중에서 용매화된다. 완전히 N-글리코실화된 ACE2의 발현에 의한 다이머화는 Zn^{2 +}의 존재 하에서 이루어졌다. 이 경우의 다이머 복합체는 정전적으로 결합되어 있고 또한 생리적 용액 중에서 더 분리되지 않는 2개의 동일한 서브유닛으로 이루어진다. 이것은 각 ACE2 분자에 대해 고 하전된 14개의 시알산 구조 및 다이머 중에 28개의 시알산 구조를 가진 당단백질의 매회 분비물에 해당한다. 각각은 구조를 안정화시키는 복합체에 삽입된 2개의 Zn^{2 +} 원자를 갖는다. 당 사슬에 대한 고 하전은 생리적 수용액 중에서 분자를 용매화하여 연결된 하전 단백질 영역을 외부로 밀어낸다. 이 제조공정은 ACE2 다이머만이 최종 생성물에 존재하도록 구성된다.

이것은 rACE2 생성시 충분한 Zn^{2 +} 이온이 존재(바람직하게는, 1.5~5μM의 Zn²⁺ 이온이 사용되고; 특히 발효는 2.5~3.5μM Zn^{2 +}에서 행할 수 있음)한다는 사실에 의해 가능하게 되고, 그 다음의 다른 처리공정을 Zn^{2 +} 이온의 존재하에서 행한다.

도 14 및 15에 있어서, ACE2 복합체의 다이머화는 다른 방법을 이용하여 측정된다. 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 있어서, 은 염색 후의 단백질은 사이즈 약 250kDa의 단일 밴드로서 나타났다. pH 7.0의 220mM Na-포스페이트 완충제 중의 10% 아세토니트릴의 존재 하에서의 Zorbax G-450 컬럼에 의한 사이즈 분 리 크로마토그래피도 대략 250kDa의 분자량에 상응하는 체류 시간에서 생성물에 대한 단일 피크가 생성되었다. 이것은 두 경우 모두 다이머화된 단백질만이 측정되었음을 주지해야 한다. 모노머 구조와 고분자량 응집체 모두 관찰되지 않았다.

실시예 8: ACE2 다이머-막결합 ACE와의 차이

ACE2는 레닌 안지오텐신계의 필수 효소로서 모든 고등 종에서 우선적으로 신장, 심장, 폐 및 간 세포에 있어서 막관통 단백질로서 발현된다. 막결합 ACE2는 사실상 활성 입체배위에 있어서 ACE2를 안정화시키는 다른 막 단백질을 가진 막지질 이중 층으로 그 자체가 둘러싸여 있어서 단백질 분해로부터 ACE2의 세포외 영역을 보호한다. 가용성 ACE2의 약리학적 특성, 특히 가용성 단백질의 활성 및 안정성을 개선시키기 위해서, 안정한 다이머 ACE2 구조만이 제조되는 발현 및 제조 전략을 선택했다. 이것은 주로 단백질의 C-말단 영역과 다이머화에 근복적으로 관여하는 그 번역후 수식이다. ACE2 다이머 구조의 특수성을 강조하기 위해서, 막결합 ACE2의 구조를 네이티브 PAGE 및 ACE2-특정 웨스턴 블롯을 사용해서 분석했다(도 16). 트랙 A 및 B는 세포 추출물(피질 및 뇌)을 나타내고, 트랙 C는 실시예 1에 따라 제조된 ACE2 다이머에 대한 생성 클론의 세포 추출물을 나타낸다. 여기서 최초의 것은 세포외 부분만으로 이루어져 있지만, 막결합 생성물은 실시예 1의 발현 생성물(C 및 D)에 비하여 더욱 낮은 분자량을 가졌다. 이것은 막결합 ACE2가 모노머로서 존재한다는 것을 나타낸다. 한편, 발현 생성물은 약리학적 이점을 갖는 생성물을 제공하는 다이머로 이루어진다. 트랙 D에 있어서, 정제된 최종 생성물을 분석한다. 이것은 분자량이 약 240kDa인 단일 밴드만을 갖는다.

실시예 9: ACE2 다이머의 개선된 약리학적 특성

APN 01은 ACE2 다이머 구조만으로 이루어진 생리학적 ACE2 단백질 포뮬레이션을 디자인한다. 이 경우 동시에 2개의 ACE2 모노머가 비공유결합 복합체를 형성한다. 분자 생물학적 구성, 발현 세포주, 발효 공정, 정제, 및 보관 및 적용을 위한 완충제를 최종 생성물이 안정한 ACE 2 다이머만을 함유하도록 선택 및 설계한다. 이 다이머는 더욱 큰 복합체로 응집하지 않고, 또한 모노머에 대한 생리학적 조건 하에서 해리되지 않는다.

도 15(SEC-HPLC 분석 크로마트그램)에 있어서, APN 01을 사이즈 분리 기준과 비교했다(Bio-RAD GF-기준, 청색 곡선, 조작 조건: 컬럼: Zorbax GF250, 완충액: 220mM Na₂HPO₄+10% CH₃CN, pH 8.0, 1mL/분). APN 01가 체류 시간이 티로글로불린(680kDa, 체류 시간 7.4분)과 보빈 감마 글로불린(158kDa, 체류 시간 8.9분) 사이인 8.6분에 단일 피크의 형태로 용리되었다. 이 복합체의 계산된 분자질량은 약 214kDa이다. 이것은 대략 2개의 ACE2 유닛 각각의 예상된 분자량인 102kDa에 해당한다.

비교를 위해서, CHO 세포 중의 ACE2 모노머를 기준 재료로서 제조하고, SEC-HPLC를 사용하여 분석했다. 그 크로모토그램을 도 17에 나타낸다. 모노머 형태를 분자량 약 110kDa에 해당하는 체류 시간 9.0분에 용리했다. 2개의 생성물도 PAGE를 이용하여 비교했다(도 18a). APN 01(A)은 분자량이 대략 240kDa인 단백질 밴드를 갖는 반면, 모노머 형태(B)는 대략 100kDa에서 나타났다. 도 18b에서 볼 수 있듯 이, ACE2-특정 웨스턴 블롯은 2개의 생성물이 동일한 것을 나타냈다.

2개의 생성물은 형광 표식된 기질을 채용하는 활성 시험을 사용하여 측정한 특이적 효소 활성은 동일하게 나타났다. 도 19에서 볼 수 있듯이, 모노머 형태와 다이머 형태의 동일 효소 농도에 대한 곡선은 서로 겹쳐졌다.

2개의 생성물의 약리학적 특성을 비교하기 위해서, 2개의 제제를 B1-6 마우스에 2.5mg/kg의 급속정주법(bolus injection)으로 복강내에 투여하고, 혈청 샘플에서의 ACE2 효소 활성을 24시간 및 48시간 후에 측정했다(도 20 참조). 각 동물이 100μL의 생리학적 단백질 용액을 수용하도록 단백질 농도를 조정했다. 매회 7마리의 동물을 APN 01(ACE2 다이머)로 처리하고, 5마리의 동물은 ACE2 모노머로 처리했다. ACE2를 투여하기 이전에는 모든 혈청 샘플에서 ACE2 활성이 측정되지 않았으나, 투여 후에는 모든 경우에 있어서 전신적 ACE2 활성이 측정되었다. 투여후 24시간 직후, 2개의 군 모두가 현저히 달랐다(t 테스트, p<0.001): ACE2 다이머로 처리한 동물은 ACE2 농도 0.9μg/mL에 상응하는 활성을 가졌고, 농도 0.2μg/mL에 상응하는 활성이 모노머 ACE2가 투여된 군 중 1마리의 동물에게서만 발견되었다. 48시간 후, ACE2 호모다이머가 투여된 군에서는 여전히 활성은 0.2μg/mL이었지만, 모노머가 투여된 군에서는 더욱 조직적인 ACE2 활성은 검출되지 않았다. 이들 데이터는 다이머 ACE2 형태가 더욱 현저한 약리학적 이점을 갖는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungs GmbH <120> ACE2 Polypeptid <130> r52100 <150> AT A 913/2007 <151> 2007-06-12 <150> EP 08450052.9 <151> 2008-04-08 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 740 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser 740

Claims (48)

1. 효소적으로 활성이며, 글리코실화되어 있고, 가용성이며, 다이머인 인간 재조합형 안지오텐신 전환 효소(ACE2) 폴리펩티드를 포함하는 제조물로서,

   각각의 ACE2 다이머는 비공유 결합되어 있는 두 개의 ACE2 모노머 유닛으로 이루어지고 전체 ACE2 폴리펩티드 중 ACE2 다이머의 획분이 80% 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 ACE2 다이머의 획분은 90% 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 ACE2 다이머의 획분은 95% 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
4. 제 1 항에 있어서,

   막관통 영역을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 전체 ACE2 폴리펩티드의 20% 미만인 것을 특징으로 하는 제조물.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 막관통 영역을 갖는 ACE2 폴리펩티드의 획분은 상기 전체 ACE2 폴리펩티드의 10% 미만인 것을 특징으로 하는 제조물.
6. 제 1 항에 있어서,

   ACE2 멀티머의 획분은 10% 미만인 것을 특징으로 하는 제조물.
7. 제 1 항에 있어서,

   ACE2 모노머의 획분은 10% 미만인 것을 특징으로 하는 제조물.
8. 제 1 항에 있어서,

   상기 ACE2 다이머는 호모 다이머로서 존재하는 것을 특징으로 하는 제조물.
9. 제 1 항에 있어서,

   상기 ACE2 다이머 각각은 2개의 아연 이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조물.
10. 제 1 항에 있어서,

    상기 ACE2 모노머의 글리코실기는 총 10개 이상의 시알산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조물.
11. 제 1 항에 있어서,

    상기 ACE2 폴리펩티드는 전체 ACE2 폴리펩티드에 대한 중량%로 당의 비율이 10% 초과인 것을 특징으로 하는 제조물.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 ACE2 폴리펩티드는 전체 ACE2 폴리펩티드에 대한 중량%로 당의 비율이 15% 초과인 것을 특징으로 하는 제조물.
13. 제 1 항에 있어서,

    상기 ACE2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 18-740 또는 상기 아미노산 18-740의 효소 활성 단편으로 이루어지고,

    상기 폴리펩티드 또는 상기 단편은 Ang II(안지오텐신 II)의 Ang 1-7(안지오텐신 1-7)로의 전환에 대한 촉매활성이 4s^-1 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
14. 제 1 항에 있어서,

    상기 ACE2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 상기 SEQ ID NO: 1의 효소 활성 단편으로 이루어지고,

    상기 폴리펩티드 또는 상기 단편은 Ang II(안지오텐신 II)의 Ang 1-7(안지오텐신 1-7)로의 전환에 대한 촉매활성이 4s^-1 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
15. 제 1 항에 있어서,

    겔 전기영동법으로 측정된 분자량이 100kDa 미만인 ACE2 폴리펩티드의 획분이 20% 미만인 것을 특징으로 하는 제조물.
16. 제 1 항에 있어서,

    Ang II(안지오텐신 II)의 Ang 1-7(안지오텐신 1-7)로의 전환에 대한 촉매활성이 적어도 4s^-1 이상인 것을 특징으로 하는 제조물.
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 정의된 제조물을 포함하고,

    고혈압, 심부전, 심근 경색이나 동맥경화, 신부전이나 신기능부전, 다낭성 신장 질환(PKD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 폐기종, 낭포성 섬유증, 간질성 폐질환, 폐동맥 고혈압, 폐색전증, 폐의 유육종증, 결핵, 폐의 부종, 급성 폐손상(ALI), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 폐암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학적 조성물.
18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

    고혈압, 심부전, 심근 경색이나 동맥경화, 신부전이나 신기능부전, 다낭성 신장 질환(PKD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 폐기종, 낭포성 섬유증, 간질성 폐질환, 폐동맥 고혈압, 폐색전증, 폐의 유육종증, 결핵, 폐의 부종, 급성 폐손상(ALI), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 폐암의 치료 또는 예방을 위한 약의 제조에 사용하기 위한 제조물.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제 17 항에 있어서,

    상기 심부전은 울혈, 급성 또는 만성 심부전인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
22. 제 18 항에 있어서,

    상기 심부전은 울혈, 급성 또는 만성 심부전인 것을 특징으로 하는 제조물.
23. 삭제
24. 제 17 항에 있어서,

    급성 폐손상(ALI) 또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)으로부터 선택되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
25. 제 18 항에 있어서,

    급성 폐손상(ALI) 또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약의 제조에 사용하기 위한 제조물.
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