CN113897346A

CN113897346A - 能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用

Info

Publication number: CN113897346A
Application number: CN202111087440.1A
Authority: CN
Inventors: 逯光文; 叶飞; 林曦; 陈自敏; 杨凡力
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2022-01-07

Abstract

能够提高与SARS‑CoV‑2S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用，所述能够提高与SARS‑CoV‑2S蛋白亲和力的ACE2突变具体的ACE2突变位点为，氨基酸序列第19位S突变为W，第27位T突变为W，第330位N突变为Y。

Description

能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用

技术领域

本发明涉及ACE2突变位点研究领域，特别涉及能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用。

背景技术

新型冠状病毒(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是β冠状病毒属中重要的一员，与非典病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus， SARS-CoV)的基因组具有很高的相似性，是目前感染人类且能引起严重症状的三种冠状病毒之一。SARS-CoV-2比SARS-CoV和中东呼吸综合征病毒(Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)具有更高的传染性，目前已造成超过1.47亿人感染，311万人死亡，给全世界人民的生命健康造成了严重的威胁。与SARS-CoV相同，SARS-CoV-2也是通过刺突蛋白(Spike protein，S)识别宿主细胞表面的膜蛋白血管紧张素转化酶II(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)，从而引发病毒感染。目前，已有多个研究机构报道了ACE2 与S全长蛋白的复合物电镜结构，以及ACE2胞外域与S蛋白受体结合区域(Receptor binding domain，RBD)的复合物晶体结构。S蛋白作为重要的抗病毒药物靶点，是抗体治疗和疫苗研发的关键。

迄今为止，已有多种抗体药物进入临床实验，且取得了较好的疗效。世界各国也紧急批准了15种疫苗上市，还有上百种候选疫苗正处于临床实验和临床前研究之中，这让人们对消灭SARS-CoV-2充满了希望。但是，随着疫情的不断发展，病毒也在不停的发生变异，其中S蛋白也是病毒中最易发生突变的蛋白之一。由此产生了多种新的变异毒株(巴西毒株、南非毒株等)，这些变异毒株可抵抗多种中和抗体的活性和引起免疫逃逸，使恢复期血浆、多克隆血清、单克隆抗体和疫苗等抗病毒方法的疗效降低甚至完全丧失。据研究报道，重组表达人源ACE2蛋白可以作为一种“诱饵”，与宿主细胞表面ACE2蛋白竞争性结合SARS-CoV-2，从而达到抗病毒作用，且不产生免疫逃逸。另外，重组人源ACE2蛋白在多个国家都通过了临床安全评价，证明在体内是安全可靠的。体内和体外实验均显示，重组人源ACE2蛋白具有较好的抗病毒疗效。

重组表达ACE2胞外域蛋白作为一种极具潜力的抗SARS-CoV-2药物，提高它与SARS-CoV-2 S-RBD的亲和力，对增强其抗病毒疗效具有重要作用。然而截至目前，通过改造ACE2来提高抗病毒效果的研究较少，更没有增强对具有免疫逃逸的SARS-CoV-2变异毒株抗病毒能力的报道。因此，鉴定能够增强与SARS-CoV-2 S-RBD结合活性的ACE2突变和突变组合，并通过对ACE2的改造，实现提高与SARS-CoV-2 S-RBD及SARS-CoV-2免疫逃逸株S-RBD蛋白的亲和力，并进一步提高对SARS-CoV-2及其变异毒株的抗病毒能力，是本发明欲解决的技术问题。

ACE2的体内体外实验均验证出良好的抗新冠病毒疗效，但临床实验中仍使用的是野生型的ACE2胞外域蛋白。野生型ACE2胞外域蛋白的存在亲和力较低、抗病毒疗效一般等缺陷。鉴于ACE2作为最具潜力的抗病毒药物之一，对其进行改造，使其具有更好的抗病毒疗效具有重要意义。由此，本发明通过对ACE2进行突变，找出三个位点(S19W、T27W和N330Y)可增强与S-RBD的亲和力，也使抗新冠病毒的效果得到极大的提高。另外，改造后的ACE2蛋白对具有免疫逃逸能力的新冠病毒变异毒株的抵抗效果也增加。

ACE2作为COVID-19的潜在治疗药物，至目前为止，对ACE2的改造研究仍相对较少，目前相对有限的研究主要集中在：

1.ACE2蛋白C端融合Fc标签可增强与S-RBD的亲和力和抗病毒能力。

2.利用蛋白质工程使ACE2蛋白三聚化可增强与S-RBD的亲和力和抗病毒能力。

3.对ACE2蛋白进行突变也可可增强与S-RBD的亲和力和抗病毒能力。例如：T27Y、H34A、H374N等。

可见，目前针对ACE2蛋白的改造，虽然已有以上几种方法能够提高ACE2的抗病毒能力，但对于S19W、T27W和N330Y这三种突变能够提高ACE2与SARS-CoV-2 S-RBD 的亲和力，目前尚未有报道，更未提及这三种突变的有效组合、以及对应的ACE2突变重组蛋白对具有免疫逃逸的变异株病毒的抑制作用。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供能够提高与SARS-CoV-2S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变

具体的ACE2突变位点为，氨基酸序列第19位S突变为W，第27位T突变为W，第 330位N突变为Y。

进一步的，能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变位点的任意两种或是多种的组合。

进一步的，所述位点突变的ACE2蛋白，所述蛋白为ACE2/S19W、ACE2/T27W、 ACE2/N330Y。

进一步的，所述的位点突变组合得到的ACE2蛋白，所述蛋白为：ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330]蛋白。

进一步的，所述突变蛋白作为SARS-CoV-2治疗药物的应用。

进一步的，所述突变蛋白作为SARS-CoV-2治疗药物能够治疗现有SARS-CoV-2现有毒株以及部分变异毒株。

进一步的，所述变异毒株为：能够引起现有免疫逃逸的S-RBD区变异毒株。

进一步的，所述变异毒株的S-RBD区蛋白变异具体为：在SEQ ID No.6的基础上S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBD A475V、S-RBD V483A、S-RBD F490L、S-RBD Y508H、 S-RBDS477N、S-RBD E484K、S-RBD G446V和S-RBD N450K。

能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用

通过MOE软件分析和预测，筛选出7个ACE2突变位点，包括S19W、T27W、H34E、G326W、G326K、N330Y和K353R；利用昆虫表达系统和多种纯化方法，制备出高纯度的 SARS-CoV-2 S-RBD、ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、 ACE2/N330Y和ACE2/K353R蛋白，同时我们还制备了活性位点突变的ACE2蛋白 (ACE2/active-site-mutant)；通过表面等离子共振(SPR)，三次独立重复实验测定出 SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326K、 ACE2/G326W、ACE2/N330Y、ACE2/K353R、ACE2/active-site-mutant之间的亲和力，鉴定出ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/N330Y、ACE2/active-site-mutant与SARS-CoV-2 S-RBD 的亲和力高于ACE2/WT。

在活性位点突变的基础上，对S19W、T27W和N330Y进行组合，并通过与之前相同的表达纯化方法，得到四种高纯度的ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330] 和ACE2[W19/W27/Y330]蛋白。再次SPR实验，测定出SARS-CoV-2 S-RBD与 ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330]蛋白之间亲和力提高了约4-8 倍。接着，利用293T细胞表达和亲和层析等方法制备出高纯度的ACE2/WT-Fc、 ACE2[W19/Y330]-Fc、ACE2[W27/Y330]-Fc和ACE2[W19/W27/Y330]-Fc蛋白。通过假病毒抑制实验，验证出改造后的ACE2蛋白对SARS-CoV-2假病毒的抑制能力提高了30-173倍。然后，我们解析了SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]的复合物晶体结构。通过结构的比对分析，在结构上解释了S19W、T27W和N330Y突变使ACE2结合 S-RBD能力增高的原因。

另外，我们找出SARS-CoV-2 S-RBD中能够引起免疫逃逸的10个突变位点，表达纯化得到高纯度的S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBD A475V、S-RBD V483A、S-RBD F490L、S-RBD Y508H、S-RBD S477N、S-RBD E484K、S-RBD G446V和S-RBD N450K蛋白。通过SPR和假病毒抑制实验，验证出改造后的ACE2蛋白与以上10种S-RBD突变体蛋白的亲和力增高了4-20倍，对SARS-CoV-2变异毒株的抑制能力得到极大的增强。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明首次找出ACE2的3个突变位点(S19W、T27W和N330Y)、以及这3个位点单独或组合突变，能够增强与SARS-CoV-2 S-RBD及SARS-CoV-2免疫逃逸突变株S-RBD的亲和力，证明了含有上述突变或突变组合的重组人源ACE2蛋白，能够显著提高对 SARS-CoV-2及SARS-CoV-2免疫逃逸突变株的抑制能力。由此，含有S19W、T27W和N330Y 中一个或多个突变的重组人源ACE2蛋白在用于治疗COVID-19，尤其是抑制具有抗体抵抗的SARS-CoV-2免疫逃逸变异病毒株的感染上具有重要的潜在应用价值。

1.通过MOE软件预测和SPR等实验，找出了ACE2的3个单位点S19W、T27W和 N330Y的突变能够增强与SARS-CoV-2 S-RBD结合能力。另外，我们对以上3个位点进行组合，证明了N330Y可以与S19W和T27W协同增效，但S19W和T27W彼此不能够互相促进。

2.通过结构生物学手段，成功揭示了上述三个位点的突变能够增强结合的结构基础，并破译了S19W和T27W与N330Y协同增效，但彼此互不促进的分子机制。

3.通过制备10种S-RBD突变(具有抗体抗性的突变位点)蛋白和SPR实验，验证出含有上述突变和突变组合的重组人源ACE2蛋白对SARS-CoV-2免疫逃逸突变株S-RBD蛋白的结合能力也显著增强；

4.通过假病毒抑制实验，证明含有上述突变和突变组合的重组人源ACE2蛋白对SARS-CoV-2及具有抗体抵抗的SARS-CoV-2免疫逃逸变异病毒株的抑制能力均得到了极大的提高。

附图说明

图1为MOE软件对ACE2突变位点的预测图。

图2 ACE2蛋白构建示意图。

图3：ACE2/WT及其突变蛋白的分子筛层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图4SARS-CoV-2 S和S-Trx-RBD蛋白的模式图。

图5：S-RBD蛋白的分子筛层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图6 SPR技术测定S-RBD与ACE2及其突变蛋白间的亲和力。

图7：ACE2组合突变蛋白的分子筛层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图8 SPR技术测定的SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2组合突变蛋白间的亲和力。

图9 S19W、T27W和N330Y突变前后与S-RBD作用细节比对。

图10 ACE2/WT-Fc、ACE2[W19/W330]-Fc、ACE2[W27/W330]-Fc和ACE2[W19/W27/Y330]-Fc蛋白纯化的SDS-PAGE图。

图11 ACE2/WT、ACE2[W19/W330]、ACE2[W27/W330]和ACE2[W19/W27/Y330]蛋白抑制新冠假病毒入侵。

图12 ACE2/WT-Fc、ACE2[W19/W330]-Fc、ACE2[W27/W330]-Fc和 ACE2[W19/W27/Y330]-Fc抑制新冠假病毒入侵。

图13：S-RBD突变蛋白的分子筛层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图14 SPR技术测定的S-RBD突变蛋白与增强型ACE2蛋白间的亲和力。

图15 ACE2/WT、ACE2[W19/W330]、ACE2[W27/W330]和ACE2[W19/W27/Y330]抑制SARS-CoV-2突变株假病毒的入侵图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1所示，

受体结合区(receptor binding domain，RBD)：新冠病毒S蛋白的第320-537位氨基酸组成、与细胞表面受体ACE2结合的区域。

血管紧张素转化酶II(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)：是血管紧张素转化酶的同系物，可高效地水解血管紧张素II，形成舒血管物质血管紧张素1-7，与心血管、肾、肺等疾病相关。这里主要指新冠病毒的功能性受体，介导新冠病毒入侵。

胞外域：指ACE2位于细胞外侧的区域，ACE2作为单次跨膜蛋白，N端第19-615位氨基酸位于细胞膜外，形成一个大的胞外结构域，能够被新冠病毒识别。

免疫逃逸：免疫抑制病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答。这里指新冠病毒S蛋白发生突变，可以逃避机体的免疫应答，使中和抗体、疫苗效果降低或完全失去作用。

酶活中心：酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的活性中心。这里指ACE2与底物血管紧张素II结合区域。

Trx标签：硫氧还蛋白标签，分子量大小约13kD，是一种广泛用于帮助重组蛋白正确折叠的标签蛋白。

组合突变蛋白：ACE2胞外域蛋白的S19W、T27W和N330Y突变进行组合，形成的4 种多突蛋白，包括ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和 ACE2[W19/W27/Y330]。

增强型ACE2蛋白：即ACE2组合突变蛋白中与S-RBD亲和力增强较大的3种多突蛋白，包括ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330]。

1新冠病毒S蛋白结合力增强型ACE2突变位点的预测

通过检索PDB数据库，下载SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2(PDB编号为6LZG)复合物晶体结构，在Pymol软件对复合物结构进行分析，找出SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2结合界面的关键氨基酸(距离小于或等于

)。通过MOE软件对复合物结构中这些关键氨基酸位点进行计算，预测得到一系列的ACE2单突位点，可能与增强SARS-CoV-2 S-RBD亲和力相关，具体步骤如图1。

图1MOE软件对ACE2突变位点的预测图。基于结构SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2复合物结构，预测出能够增强S-RBD结合能力的ACE2突变,突变位点已列出。

MOE软件计算得到多种ACE2突变位点，通过对结构的反复分析，最终选择出7种可能性最高的单突位点，其中包括ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、 ACE2/G326K、ACE2/N330Y、ACE2/K353R。

2ACE2胞外域及其突变蛋白的制备

2.1ACE2胞外域蛋白编码基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的人肺组织中编码ACE2(GenBank 序列号为AB193259.1)蛋白的氨基酸序列，我们通过基因合成的方法获得了ACE2全基因序列(见序列表SEQ ID NO.1)。

2.2ACE2胞外域及其突变体的重组质粒构建

我们设计并合成了下述引物用于扩增和改造ACE2胞外域及突变蛋白：

为了使ACE2失去酶活性，使用引物F总ACE-His、R总ACE-His、FH374/378A、 RH374/378A、FE402A和RE402A把酶活中心位点进行突变，突变位点位H374A、H378A 和E402A，由此得到P-ACE2-active-site-mutant；使用引物F总ACE-His和R总ACE-His 得到P-ACE2/WT；使用引物FS19W和R总ACE-His得到P-ACE2/S19W；使用引物FT27W 和R总ACE-His得到P-ACE2/T27W；使用引物FH34E、F总ACE-His和R总ACE-His得到P-ACE2/H34E；使用引物FG326W、RG326W、F总ACE-His和R总ACE-His得到 P-ACE2/G326W；使用引物FG326K、RG326K、F总ACE-His和R总ACE-His得到 P-ACE2/G326K；使用引物FN330Y、RN330Y、F总ACE-His和R总ACE-His得到P-ACE2/N330Y；使用引物FK353R、RK353R、F总ACE-His和R总ACE-His得到 P-ACE2/K353R。所有构建通过最下游引物R总ACE-His在C端引入6xHis标签用于纯化。

PCR反应条件均为预变性96℃2min--(变性96℃30s-退火55℃30s-延伸72℃ 0.5-2min)30个循环—终延伸72℃10min。使用同源重组的方法把PCR得到片段分别构建到pFastBac1-GP67载体，重组体系中含5μL同源重组酶，0.1μg载体pFastBac1-GP67 (EcoR I和Hind III酶切后)，每个片段均0.3μg，最后用ddH2O补齐至10μL；反应条件为50℃，50min。重组得到的以上9个构建经测序证实插入的外源片段完全正确。

构建所用载体为含GP67信号肽的pFastBac1载体(pFastBac1-GP67)为本实验室构建，即在商品化pFastBac1载体(Invitrogen公司)上，在限制性酶切位点BamH I和EcoR I中间插入了一段GP67信号肽的编码序列(GP67信号肽的编码核酸序列见SEQ ID NO.2，GP67 信号肽的氨基酸序列见SEQ ID NO.3)。

以上改造后的蛋白构建序列包括ACE2蛋白的胞外段(氨基酸19-615)，得到的构建为 ACE2/active-site-mutant、ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、 ACE2/G326W、ACE2/G326K、ACE2/N330Y和ACE2/K353R。ACE2/WT的蛋白编码核酸序列见SEQ ID NO.4，其氨基酸序列见SEQ ID NO.5，其它构建均在ACE2/WT基础上进行突变。

该ACE2/WT的表达构建策略模式图请见图2。

2.3重组ACE2胞外域及其突变蛋白的制备

将ACE2/active-site-mutant、ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、ACE2/G326K、ACE2/N330Y和ACE2/K353R分别转化至感受态细胞 DH10Bac，然后在含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素以及100μg/ml X-gal和40μg/mlIPTG的LB平板上涂布，37℃培养48h后，挑取白色菌落，培养后使用质粒提取试剂盒提取对应的重组Bacmid。

将上述提取的重组Bacmid转染sf9昆虫细胞，培养72h收获P1代重组杆状病毒。通过将重组杆状病毒在sf9细胞中传代培养，扩增至P3代。将上述P3代重组杆状病毒接种sf9细胞进行表达。在接种病毒96h后，收获细胞上清。用HisTrap亲和层析柱(GE Healthcare)进行亲和层析初步纯化，然后再通过分子筛层析进一步精细纯化。

以ACE2/WT蛋白纯化为例，在亲和层析纯化中，首先将收获的含ACE2/WT蛋白的培养基上清通过HisTrap亲和层析柱，而后以10倍柱体积的buffer B(10mM imidazole，20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)清洗层析柱，然后用buffer C(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0，300mM imidazole)将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，由此得到粗纯的ACE2/WT蛋白。该蛋白进一步以Superdex 200Increase 10/300(GE Healthcare)层析柱进行精细纯化，并最终将ACE2/WT蛋白换液至buffer A(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0) 中。SDS-PAGE鉴定显示蛋白纯度达到95％以上，而蛋白在分子筛层析中的洗脱表现表明蛋白在溶液中均一性很好。ACE2/active-site-mutant、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、 ACE2/G326W、ACE2/G326K、ACE2/N330Y、ACE2/K353R与ACE2/WT蛋白的纯化方法相同。结果见图3。

由此，我们得到了高纯度、且性质均一的ACE2/active-site-mutant、ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、ACE2/G326K、ACE2/N330Y和 ACE2/K353R蛋白。

3SARS-CoV-2 S-RBD蛋白的制备

3.1S-RBD蛋白编码基因的获得及构建

新冠病毒S-RBD蛋白，选取了首株全基因组测序的新冠毒株(GenBank:MN908947.3) S蛋白的320-537位氨基酸(序列见SEQ ID NO.6)，基因序列由常州基宇生物科技有限公司合成(核酸序列见SEQ ID NO.7)。在新冠病毒的S-RBD上游加入了Trx基因(以辅助S-RBD 折叠)和6xHis标签(以辅助后续纯化)，在其后加入了EK酶切位点(通过EK酶切移除标签和所有非S-RBD的冗余氨基酸)，并构建到pFastBac1-gp67载体中(与ACE2构建使用的载体相同)，由安徽通用生物科技有限公司完成。Trx标签、His标签和EK酶切位点的核苷酸序列见SEQ ID NO.8，氨基酸序列见SEQ ID NO.9。

该S-RBD的表达构建策略模式图请见图4。

3.2 S-RBD蛋白的制备

将Trx-RBD的质粒转化至感受态细胞DH10Bac，然后在含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素以及100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG的LB平板上涂布，37℃ 培养48h后，挑取白色菌落，培养后使用质粒提取试剂盒提取对应的重组Bacmid。

将上述提取的重组Bacmid转染sf9昆虫细胞，培养72h收获P1代重组杆状病毒。通过将重组杆状病毒在sf9细胞中传代培养，扩增至P3代。将上述P3代重组杆状病毒接种sf9细胞进行表达。在接种病毒96h后，收获细胞上清。用HisTrap亲和层析柱(GE Healthcare)进行亲和层析、EK酶切、分子筛层析等方法进行纯化。在亲和层析纯化中，首先将收获的含有Trx标签的S-RBD蛋白(Trx-S-RBD)的培养基上清通过HisTrap亲和层析柱，而后以 10倍柱体积的buffer B(10mM imidazole，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)清洗层析柱，然后用buffer C(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，300mM imidazole)将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，由此得到粗纯的Trx-RBD蛋白；在Trx-RBD蛋白中加入EK酶进行酶切(酶与底物为1U：0.5mg)，18℃切割12h；切割后的蛋白加入HisTrap 亲和层析柱，4℃结合15min，流穿蛋白即S-RBD蛋白；

该蛋白进一步以Superdex 200Increase 10/300(GE Healthcare)层析柱进行精细纯化，并最终将S-RBD蛋白换液至buffer A(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)中。SDS-PAGE鉴定显示蛋白纯度达到99％以上，而蛋白在分子筛层析中的洗脱表现表明蛋白在溶液中均一性很好。由此，我们得到了高纯度、且性质均一的S-RBD蛋白。结果见图5。

4S-RBD与ACE2/WT及其突变蛋白的亲和力测定

通过BIACORE 8K仪器分别测定SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2/WT、ACE2/S19W、 ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、ACE2/G326K、ACE2/N330Y、ACE2/K353R、 ACE2/active-site-mutant蛋白之间的亲和力，结果如图6所示。

本实验把SARS-CoV-2 S-RBD作为固定相，固定值约为700RUs，把ACE/WT及其突变体作为流动相。ACE2/WT、ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/H34E、ACE2/G326W、 ACE2/N330Y和ACE2/active-site-mutant的浓度梯度为1.5-192nM，ACE2/G326K的浓度梯度为3.125-400nM，ACE2/K353R的浓度梯度为31.25-4000nM。根据结果分析，上述所有数据均采用慢结合/慢解离的动力学模型进行计算。其中ACE2/S19W(48.6±12.8nM)、 ACE2/T27W(38.5±8.5nM)、ACE2/N330Y(29.3±10.4nM)和ACE2/active-site-mutant(74.5 ±13.9nM)突变体的亲和力高于ACE2/WT(81.8±4.7nM)。因此，我们将基于这四种突变进行组合，进一步设计出亲和力更高的组合突变。

5ACE2组合突变蛋白的制备

上一步的SPR结果显示，S19W、T27W、N330Y和active-site-mutant位点突变使ACE2与SARS-CoV-2 S-RBD的亲和力增高。为了进一步提高亲和力，我们把这四种突变位点进行了组合。在ACE2/active-site-mutant的基础上分别进行S19W/T27W、S19W/N330Y、 T27W/N330Y和S19W/T27W/N330Y的组合，得到组合突变构建，分别命名为 ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330]。ACE2 组合突变与ACE2/WT的构建和表达方法一致。最后，我们得到了高纯度、且性质均一的 ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330]蛋白。结果如图7所示。

6S-RBD与ACE2组合突变蛋白的亲和力测定

通过BIACORE 8K仪器分别测定SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2[W19/W27]、 ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330]蛋白之间的亲和力，结果如图 8所示。

本实验把SARS-CoV-2 S-RBD作为固定相，固定值约为700RUs，把ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330]蛋白作为流动相，浓度梯度均为1.5-192nM。根据上图分析，所有数据均采用慢结合/慢解离的动力学模型进行计算。结果显示，与ACE2/WT相比，ACE2[W19/W27]与SARS-CoV-2 S-RBD亲和力未见增高， ACE2[W19/Y330]与SARS-CoV-2 S-RBD亲和力增高约8倍，ACE2[W27/Y330]与 SARS-CoV-2 S-RBD亲和力增高约6倍，ACE2[W19/W27/Y330]与SARS-CoV-2 S-RBD亲和力增高约4倍。最终，我们得到了3种结合力增强型ACE2突变蛋白(ACE2[W19/Y330]、 ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330])，命名为增强型ACE2。

7SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W19/Y330]和SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W27/Y330]复合物晶体筛选及结构解析

我们采用气相扩散座滴法(Vapor-diffusion sitting drop)，利用商品化的晶体筛选试剂盒 (Hampton和MolecularDimensions)，在18℃条件下进行复合物蛋白的晶体筛选，最终在 Molecular Dimensions的试剂盒Structure Screen 2MD1-0223#(1.6MAmmonium sulfate，0.1 M MES pH 6.5，10％v/v 1,4-Dioxane)条件下获得了SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W19/Y330] 的质量较好的复合物蛋白晶体，在Structure Screen1MD1-0130#(2.0MAmmonium sulfate， 0.1M Sodium HEPES pH 7.5，2％v/v PEG 400)筛选到了SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W27/Y330]的质量较好的晶体。

上述两种蛋白晶体的衍射数据均在上海同步辐射光源BL18U1线站完成。收集到的衍射数据通过HKL2000进行积分和平均；结构解析首先以SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2结构为模型(PDB号：6LZG)进行分子置换，然后通过Coot，REFMAC5及PHASER进行多轮的精修和优化，最终解析得到SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W19/Y330]和SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W27/Y330]晶体结构。

8S19W、T27W和N330Y突变增强SARS-CoV-2 S-RBD结合的分子机制

在之前报道的SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2(PDB:6LZG)结构中，ACE2的S19与S-RBD 相互作用的氨基酸只有2个，而在SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W19/W330]复合物的结构中， S19突变为W19，观察到有5个氨基酸与S-RBD相互作用。S19通过氢键、范德华力和疏水相互作用与S-RBD的A475和G476发生相互作用，且CCP4i计算出它们原子间相互作用仅有7个。当S19突变为W19，氨基酸侧链中引入一个大环吲哚基，使它与S-RBD的结合更加紧密。因此，我们观察到W19通过氢键、范德华力和疏水相互作用与S-RBD的K458、 Y473、Q474、A475和G476发生相互作用，且CCP4i计算出的原子间相互作用高达52个。具体细节如图9b所示。

通过比对SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2(PDB:6LZG)和SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2[W27/W330]的复合物结构，我们观察到T27和W27与S-RBD距离在

以内的氨基酸均为4个，分别是F456、Y473、A475和Y489。但通过CCP4i计算，我们发现当T27突变为W27，原子间相互作用由15个变为35个。具体细节如图9c所示。

如图9d所示，ACE2的N330与S-RBD相互作用的氨基酸有2个。N330通过氢键、范德华力和疏水相互作用与S-RBD的T500和N330发生相互作用，且计算出它们之间有8个原子间相互作用。N330突变为Y330后，观察到有3个氨基酸与S-RBD的距离小于等于

Y330也通过氢键、范德华力和疏水相互作用与S-RBD的P499、T500和N330发生相互作用，且计算出16个原子间相互作用。

综上所述，S19W、T27W和N330Y突变可提高ACE2与SARS-CoV-2 S-RBD的亲和力，这与在结构中的互作分析是相符的。

9增强型ACE2蛋白对SARS-CoV-2假病毒的抑制

由于新冠病毒通过飞沫和接触传播的特性，其高传染性要求对活病毒的操作需在P3等级的生物安全实验室中完成，这一高生物安全等级的是本实验室不具备的。假病毒体系既能很好的模拟病毒的侵入过程，用于靶向病毒侵入过程的抑制实验，同时又能规避高生物安全等级操作的限制。我们基于实验室已有的、以慢病毒为骨架的假病毒包装系统，通过 pNL4.3-Luc-R-E质粒与SARS-CoV-2-S质粒共转染至293T细胞包装得到新冠假病毒，并通过感染稳转ACE2的293T细胞、酶标仪对荧光素酶活性测定，定量分析假病毒对易感细胞的侵入特性。

9.1ACE2-Fc的构建、表达与纯化

据报道，Fc标签可以起到延长功能蛋白在血浆内的半衰期的作用(27)，ACE2蛋白作为新冠病毒潜在治疗药物，在其C端引入Fc标签，也应能提高ACE2蛋白对病毒的抑制能力。因此，我们将构建ACE2/WT-Fc、ACE2[W19/W330]-Fc、ACE2[W27/W330]-Fc和 ACE2[W19/W27/Y330]-Fc蛋白。通过引物F总ACE-His和R总ACE-His把ACE2/WT、 ACE2[W19/W330]、ACE2[W27/W330]和ACE2[W19/W27/Y330]构建中的ACE2(19至615 位氨基酸)区域扩增出来，然后把片段同源重组至含有Fc标签序列的pCAGGS载体中。 pCAGGS载体上IL2信号肽使蛋白分泌，位于ACE2序列的N端，Fc标签位于ACE2序列的C端。IL2和Fc基因序列分别见SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11，氨基酸序列分别见SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13。

把这些构建转染至293T细胞，72h后收集细胞上清，通过protein A的柱子进行纯化，得到高纯度的ACE2/WT-Fc、ACE2[W19/W330]-Fc、ACE2[W27/W330]-Fc和 ACE2[W19/W27/Y330]-Fc蛋白，如图10所示。

9.2增强型ACE2蛋白对SARS-CoV-2假病毒的抑制

通过假病毒抑制实验，我们测定了ACE2/WT、ACE2[W19/W330]、ACE2[W27/W330] 和ACE2[W19/W27/Y330]对SARS-CoV-2假病毒的抑制能力。结果如图11所示，ACE2/WT 的IC50为15.44μg/mL，ACE2[W19/W330]的IC50为1.21μg/mL，ACE2[W27/W330]的IC50 为1.524μg/mL，ACE2[W19/W27/Y330]的IC50为2.036μg/mL，假病毒抑制能力提高约8-13 倍。

另外，我们还测定了ACE2/WT-Fc、ACE2[W19/W330]-Fc、ACE2[W27/W330]-Fc和ACE2[W19/W27/Y330]-Fc蛋白对SARS-CoV-2假病毒的抑制能力。结果如图12所示， ACE2/WT-Fc的IC50为1.435μg/mL，ACE2[W19/W330]-Fc的IC50为0.089μg/mL， ACE2[W27/W330]-Fc的IC50为0.254μg/mL，ACE2[W19/W27/Y330]-Fc的IC50为0.532 μg/mL。与ACE2/WT相比，引入Fc标签的ACE2蛋白对假病毒抑制能力提高约11-173倍。

10增强型ACE2蛋白与S-RBD突变体亲和力测定

10.1S-RBD突变体的重组质粒构建

在新冠病毒变异毒株中，部分突变会产生抗体抵抗和免疫逃逸，而这些突变位点有很多位于新冠病毒S-RBD区域。因此，我们挑选出10种位于S-RBD区域的突变进行构建，包括N439K、L452R、A475V、V483A、F490L、Y508H、S477N、E484K、G446V和N450K 突变位点。我们设计并合成了下述引物用于扩增和突变S-RBD蛋白：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		F(N439K)	GTGATCGCTTGGAACTCAAAGAACCTGGACTCCAAGGTC
R(N439K)	GACCTTGGAGTCCAGGTTCTTTGAGTTCCAAGCGATCAC
		F(L452R)	GGTGGCAACTACAACTACAGGTACAGGCTGTTCAGAAAG
R(L452R)	CTTTCTGAACAGCCTGTACCTGTAGTTGTAGTTGCCACC
		F(A475V)	TCAACCGAAATCTACCAGGTCGGTTCCACTCCCTGCAAC
R(A475V)	GTTGCAGGGAGTGGAACCGACCTGGTAGATTTCGGTTGA
		F(F490L)	GAGGGCTTCAACTGCTACCTGCCCCTGCAGTCCTACGGT
R(F490L)	ACCGTAGGACTGCAGGGGCAGGTAGCAGTTGAAGCCCTC
		F(Y508H)	GGAGTCGGTTACCAGCCTCACCGTGTGGTCGTGCTGAGC
R(Y508H)	GCTCAGCACGACCACACGGTGAGGCTGGTAACCGACTCC
		(S477N)-F	GAAATCTACCAGGCTGGTAACACTCCCTGCAACGGTGTG
(S477N)-R	CACACCGTTGCAGGGAGTGTTACCAGCCTGGTAGATTTC
		(E484K)-F	ACTCCCTGCAACGGTGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTC
(E484K)-R	GAAGTAGCAGTTGAAGCCCTTCACACCGTTGCAGGGAGT
		(G446V)-F	AACCTGGACTCCAAGGTCGTCGGCAACTACAACTACCTG
(G446V)-R	CAGGTAGTTGTAGTTGCCGACGACCTTGGAGTCCAGGTT
		(N450K)-F	AAGGTCGGTGGCAACTACAAGTACCTGTACAGGCTGTTC
(N450K)-R	GAACAGCCTGTACAGGTACTTGTAGTTGCCACCGACCTT

构建策略与S-RBD相同，以上所有S-RBD突变体均在野生型S-RBD构建的基础上进行定点突变得到。通过PCR的方法扩增合成的野生型S-RBD质粒，在引物中引入突变位点，最终得到以上10种S-RBD突变体。使用引物F(N439K)和R(N439K)得到S-RBD N439K；使用引物F(L452R)和R(L452R)得到S-RBD L452R；使用引物F(A475V)和R(A475V)得到 S-RBDA475V；使用引物F(F490L)和R(F490L)得到S-RBD F490L；使用引物F(Y508H)和 R(Y508H)得到S-RBD Y508H；使用引物(E484K)-F和(E484K)-R得到S-RBD E484K；使用引物(G446V)-F和(G446V)-R得到S-RBD G446V；使用引物(N450K)-F和(N450K)-R得到 S-RBD G446V。

10.2 S-RBD及其突变蛋白的制备

S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBD A475V、S-RBD V483A、S-RBD F490L、S-RBDY508H、S-RBD S477N、S-RBD E484K、S-RBD G446V、S-RBD N450K与S-RBD蛋白的纯化方法相同。结果见图13。

由此，我们得到了高纯度、且性质均一的S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBDA475V、 S-RBD V483A、S-RBD F490L、S-RBD Y508H、S-RBD S477N、S-RBD E484K、S-RBDG446V 和S-RBD N450K蛋白。

10.3S-RBD突变蛋白与增强型ACE2蛋白的亲和力测定

通过BIACORE 8K仪器分别测定S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBD A475V、 S-RBDV483A、S-RBD F490L、S-RBD Y508H、S-RBD S477N、S-RBD E484K、S-RBD G446V、 S-RBDN450K与ACE2/WT、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330] 之间的亲和力。测定方法同前文，结果如图14(图14a，图14b和图14c)所示。

本实验把S-RBD突变体蛋白作为固定相，固定值均约为700RUs，把ACE2[W19/W27]、ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330]蛋白作为流动相，浓度梯度均为1.5-192nM。根据上图分析，所有数据均采用慢结合/慢解离的动力学模型进行计算。结果显示，与ACE2/WT相比，ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]和ACE2[W19/W27/Y330] 与S-RDB所有突变体的亲和力均显著增高。

11野生型及增强型ACE2对SARS-CoV-2及其变异毒株的抑制

为了得到SARS-CoV-2及其变异株假病毒，我们把新冠病毒及其变异株的S基因构建到 PCAGGS质粒中，突变位点与上文中S-RBD的位点一致，包括N439K，L452R，A475V，V483A，F490L，Y508H，S477N，E484K，G446V和N450K，然后分别与pNL4.3-Luc-R-E 质粒共转染至293T细胞包装得到新冠变异株假病毒。通过感染稳转ACE2的HEK293细胞株，酶标仪对荧光素酶活性测定，定量分析假病毒对易感细胞的侵入特性，结果如图15所示。

表1 ACE2(野生型和增强型)分别抑制SARS-CoV-2野生型及其突变株假病毒IC50列表

表中标注出不同突变体ACE2蛋白对不同假病毒的抑制能力，使用GraphPad Prism5计算的结果。

结果显示，增强型ACE2蛋白(ACE2[W19/W330]、ACE2[W27/W330]和 ACE2[W19/W27/Y330])对SARS-CoV-2及具有抗体抵抗变异株假病毒的抑制效果也显著增强。

综上所述，ACE2蛋白中S19W、T27W和N330Y单个或多个位点突变均能使其与 S-RBD及其突变体的亲和力增高，对SARS-CoV-2及其变异毒株的抗病毒效果也得到极大的增强。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 四川大学

<120> 能够提高与SARS-CoV-2 S蛋白亲和力的ACE2突变组合及应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2418

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380

tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620

aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680

ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740

gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800

aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860

aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920

tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980

cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040

tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100

gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160

agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220

atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280

atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340

tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400

gttcagacct ccttttag 2418

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp

35 40

<210> 4

<211> 1794

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccaccattg aggaacaggc caagacattt ttggacaagt ttaaccacga agccgaagac 60

ctgttctatc aaagttcact tgcttcttgg aattataaca ccaatattac tgaagagaat 120

gtccaaaaca tgaataatgc tggggacaaa tggtctgcct ttttaaagga acagtccaca 180

cttgcccaaa tgtatccact acaagaaatt cagaatctca cagtcaagct tcagctgcag 240

gctcttcagc aaaatgggtc ttcagtgctc tcagaagaca agagcaaacg gttgaacaca 300

attctaaata caatgagcac catctacagt actggaaaag tttgtaaccc agataatcca 360

caagaatgct tattacttga accaggtttg aatgaaataa tggcaaacag tttagactac 420

aatgagaggc tctgggcttg ggaaagctgg agatctgagg tcggcaagca gctgaggcca 480

ttatatgaag agtatgtggt cttgaaaaat gagatggcaa gagcaaatca ttatgaggac 540

tatggggatt attggagagg agactatgaa gtaaatgggg tagatggcta tgactacagc 600

cgcggccagt tgattgaaga tgtggaacat acctttgaag agattaaacc attatatgaa 660

catcttcatg cctatgtgag ggcaaagttg atgaatgcct atccttccta tatcagtcca 720

attggatgcc tccctgctca tttgcttggt gatatgtggg gtagattttg gacaaatctg 780

tactctttga cagttccctt tggacagaaa ccaaacatag atgttactga tgcaatggtg 840

gaccaggcct gggatgcaca gagaatattc aaggaggccg agaagttctt tgtatctgtt 900

ggtcttccta atatgactca aggattctgg gaaaattcca tgctaacgga cccaggaaat 960

gttcagaaag cagtctgcca tcccacagct tgggacctgg ggaagggcga cttcaggatc 1020

cttatgtgca caaaggtgac aatggacgac ttcctgacag ctcatcatga gatggggcat 1080

atccagtatg atatggcata tgctgcacaa ccttttctgc taagaaatgg agctaatgaa 1140

ggattccatg aagctgttgg ggaaatcatg tcactttctg cagccacacc taagcattta 1200

aaatccattg gtcttctgtc acccgatttt caagaagaca atgaaacaga aataaacttc 1260

ctgctcaaac aagcactcac gattgttggg actctgccat ttacttacat gttagagaag 1320

tggaggtgga tggtctttaa aggggaaatt cccaaagacc agtggatgaa aaagtggtgg 1380

gagatgaagc gagagatagt tggggtggtg gaacctgtgc cccatgatga aacatactgt 1440

gaccccgcat ctctgttcca tgtttctaat gattactcat tcattcgata ttacacaagg 1500

accctttacc aattccagtt tcaagaagca ctttgtcaag cagctaaaca tgaaggccct 1560

ctgcacaaat gtgacatctc aaactctaca gaagctggac agaaactgtt caatatgctg 1620

aggcttggaa aatcagaacc ctggacccta gcattggaaa atgttgtagg agcaaagaac 1680

atgaatgtaa ggccactgct caactacttt gagcccttat ttacctggct gaaagaccag 1740

aacaagaatt cttttgtggg atggagtacc gactggagtc catatgcaga ctaa 1794

<210> 5

<211> 597

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His

1 5 10 15

Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr

20 25 30

Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met

50 55 60

Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln

65 70 75 80

Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys

85 90 95

Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly

100 105 110

Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu

130 135 140

Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro

145 150 155 160

Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn

165 170 175

His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn

180 185 190

Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val

195 200 205

Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala

210 215 220

Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro

225 230 235 240

Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe

245 250 255

Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn

260 265 270

Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg

275 280 285

Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn

290 295 300

Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn

305 310 315 320

Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly

325 330 335

Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu

340 345 350

Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala

355 360 365

Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu

370 375 380

Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu

385 390 395 400

Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr

405 410 415

Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu

420 425 430

Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly

435 440 445

Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg

450 455 460

Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys

465 470 475 480

Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg

485 490 495

Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys

500 505 510

Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn

515 520 525

Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys

530 535 540

Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn

545 550 555 560

Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp

565 570 575

Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp

580 585 590

Ser Pro Tyr Ala Asp

595

<210> 6

<211> 218

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)

<400> 6

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

210 215

<210> 7

<211> 657

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)

<400> 7

gtgcagccaa ccgaatctat cgtcagattc ccaaacatca ctaacctgtg ccctttcgga 60

gaggtgttca acgctaccag gttcgccagc gtctacgctt ggaaccgcaa gcgtatcagc 120

aactgcgtcg ccgactactc tgtgctgtac aactccgcta gcttctctac tttcaagtgc 180

tacggcgtgt cacctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ctaacgtcta cgccgactcc 240

ttcgtgatcc gcggagacga agtccgtcag atcgctcctg gacagaccgg aaagatcgct 300

gactacaact acaagctgcc agacgacttc actggctgcg tgatcgcttg gaactcaaac 360

aacctggact ccaaggtcgg tggcaactac aactacctgt acaggctgtt cagaaagtca 420

aacctgaagc ctttcgagcg cgacatctca accgaaatct accaggctgg ttccactccc 480

tgcaacggtg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agtcctacgg tttccagcca 540

accaacggag tcggttacca gccttaccgt gtggtcgtgc tgagcttcga actgctccac 600

gctcctgcta ctgtgtgcgg tcccaagaag tctactaacc tggtcaaaaa caaataa 657

<210> 8

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcgacaaga tcatccacct gactgacgac agcttcgaca ctgacgtgct gaaggctgac 60

ggtgctatcc tggtcgactt ctgggccgag tggtgcggcc cttgcaagat gatcgctccc 120

atcctggacg agatcgccga cgagtaccag ggtaaactga ctgtggccaa gctgaacatc 180

gaccagaacc ccggtactgc tcctaagtac ggcatccgtg gtatccccac tctgctgctg 240

ttcaagaacg gtgaggtggc cgctaccaag gtcggtgctc tgagcaaggg ccagctgaag 300

gagttcctgg acgctaacct ggctggttcc ggcagcggcc acatgcacca ccaccaccat 360

cacagcagcg gcgacgacga cgacaag 387

<210> 9

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val

1 5 10 15

Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu

35 40 45

Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro

50 55 60

Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu

65 70 75 80

Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys

85 90 95

Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp

115 120 125

Lys

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt caccaattcg 60

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 12

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa ataa 684

<210> 13

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

Claims

1.能够提高与SARS-CoV-2S蛋白亲和力的ACE2突变

其特征在于，具体的ACE2突变位点为，氨基酸序列第19位S突变为W，第27位T突变为W，第330位N突变为Y。

2.根据权利要求1所述的能够提高与SARS-CoV-2S蛋白亲和力的ACE2突变位点的任意两种或是多种的组合。

3.基于权利要求1所述位点突变的ACE2蛋白，其特征在于，所述蛋白为ACE2/S19W、ACE2/T27W、ACE2/N330Y。

4.基于权利要求2所述的位点突变组合得到的ACE2蛋白，其特征在于，所述蛋白为：ACE2[W19/Y330]、ACE2[W27/Y330]、ACE2[W19/W27/Y330]蛋白。

5.权利要求2-4任一所述突变蛋白作为SARS-CoV-2治疗药物的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述突变蛋白作为SARS-CoV-2治疗药物能够治疗现有SARS-CoV-2现有毒株以及部分变异毒株。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述变异毒株为：能够引起现有免疫逃逸的S-RBD区变异毒株。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述变异毒株的S-RBD区蛋白变异具体为：在SEQ ID No.6的基础上S-RBD N439K、S-RBD L452R、S-RBDA475V、S-RBD V483A、S-RBDF490L、S-RBD Y508H、S-RBD S477N、S-RBD E484K、S-RBD G446V和S-RBD N450K。