CN115160435A - 一种双特异性抗hiv-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双特异性抗HIV‑1抗体或其抗原结合分子，编码该双特异性抗体或其抗原结合分子的核酸分子，包含该核酸分子的载体，包含该载体的宿主细胞，以及该双特异性抗体、其抗原结合分子、其同源二聚体在制备治疗或预防HIV‑1病毒所导致的疾病的药物方面的应用，以及在检测产品方面的应用；本发明的双特异性抗HIV‑1抗体对于HIV‑1病毒具有显著的中和能力，未来有很好的临床应用前景。

Description

一种双特异性抗HIV-1抗体
技术领域
本发明涉及一种双特异性抗HIV-1抗体，属于生物医药领域。
背景技术
艾滋病是一种危害性极大的传染病，起因是感染了人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,HIV)，迄今发现的主要有两种，1型(HIV-1)和2型(HIV-2)。1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)也是目前全球流行的主要毒株。
自从1983年发现HIV-1是艾滋病的主要致病因子以来，寻找针对HIV-1的有效治疗方法一直是应对艾滋病大流行的首要任务。
近几年研究者们通过新开发的B细胞培养技术或探针(probe)标记分选细胞的方法从能产生广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies，bNAb)的艾滋病病人中发现了多株新型的抗HIV-1广谱中和抗体；在动物实验和人体临床研究中，这些抗HIV-1广谱中和抗体也被证明了具有防御、治疗和预防艾滋病病毒的效果。
例如，香港大学的陈志伟教授发现了一个具有HIV中和活性的双特异性抗体PGT128-iMab，该抗体能够很好地保护猴子免于SHIV的感染，在临床上有着很高的应用价值。
虽然，已有的研究中检测了各种广谱中和抗体对HIV-1的中和效力、广度以及与HIV-1包膜蛋白结合的晶体结构和作用方式等等，以及它们在体外和体内对HIV-1病毒的预防和治疗效果等。但是，当这些中和抗体单独用于临床预防和治疗实验时，却发现这些中和抗体难以对抗天然抗性病毒；特别是，由于HIV-1病毒容易突变逃逸产生抗药性突变病毒，单一中和抗体难以有效抑制HIV-1病毒的突变逃逸；因此，基于单一中和抗体的治疗方法无法持久抑制艾滋病患者的血浆病毒血症。
为了提高中和抗体对HIV-1病毒的中和广度和效力，科学家们对已有的HIV-1中和抗体进行基因工程改造，希望构建出靶向病毒多个表位，有效抑制病毒逃逸，中和活性更好的双特异性抗体。
双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点，能够同时靶向两个不同的表位的人工抗体。BsAb不仅能够靶向同一分子的两个表位起到多位点特异性结合的作用，也能够靶向不同靶分子的两个表位起到不同靶分子之间的桥梁作用，因此具有治疗艾滋病的巨大潜力。
双特异性抗体最初是通过融合两个不同抗体的杂交瘤来制备。由于每个杂交瘤均能够产生不同的免疫球蛋白，融合所得的杂交瘤或四倍体瘤理论上能够产生具有同时第一个亲本杂交瘤和第二个亲本杂交瘤的抗原特异性的抗体，然而这种方法产生的抗体轻重链配对组合复杂，正确配对比率低，无法达到药物生产所期望的效果。近年来通过“结-入-穴”(knob-into-hole)等基因工程方法提高了目的重链正确配对的比率，但是这些不同的构建方式均需要三质粒或四质粒等多个不同表达质粒的共同优化转染才能产生目的双特异性抗体分子，后续需要去除非正确配对的副产物，抗体纯化步骤也比较复杂，导致应用性较差。
近几年来科学家发明的一种单基因编码的双特异性抗体的构建方法受到广泛关注，其优点在于能够显著提高双特异性抗体的纯化效率，产生的双特异性抗体能很好的发挥中和作用。
因此，本领域技术人员希望能够开发出新的针对HIV-1的双特异性抗体。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其中，所述双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块；所述第一抗原结合模块特异性结合MPER抗原，所述第二抗原结合模块特异性结合CD4抗原；
所述第一抗原结合模块包含轻链可变区VL-1和重链可变区VH-1；
所述轻链可变区VL-1的序列如SEQ ID NO.1所示，或者，其与SEQ ID NO.1所示序列有80％以上的序列同源性；所述重链可变区VH-1的序列如SEQ ID NO.2所示，或者，其与SEQ ID NO.2所示序列有80％以上的序列同源性；
所述第二抗原结合模块包含轻链可变区VL-2和重链可变区VH-2；
所述轻链可变区VL-2的序列如SEQ ID NO.3所示，或者，其与SEQ ID NO.3所示序列有80％以上的序列同源性；所述重链可变区VH-2的序列如SEQ ID NO.4所示，或者，其与SEQ ID NO.4所示序列有80％以上的序列同源性。
在本发明的一个具体实施方案中，上述轻链可变区VL-1可以上述序列的基础之上进行少量氨基酸的缺失、插入或者氨基酸突变，获得同源性在80％以上的氨基酸序列。少量氨基酸的置换(缺失或插入，或者氨基酸突变，或者相似氨基酸的替代)，特别是在构架区部分的保守的氨基酸置换所获得的变体，其与上述序列具有较高的同源性(80％以上的同源性)，且保留了轻链可变区原有的性质和功能，即与HIV病毒特异性结合的抗体性质和功能，那么，这些变体也落入本发明的保护范围之内。同样的，上述重链可变区VH-1也可以上述序列的基础之上进行少量氨基酸的缺失、插入或者氨基酸突变，特别是在构架区部分的保守的氨基酸置换所获得的变体，所获得的变体保留了重链可变区原有的性质和功能，即与HIV病毒特异性结合的抗体性质和功能，这些变体也都落入本发明的保护范围之内。同理，上述情况也适用于轻链可变区VL-2和重链可变区VH-2，具体不再赘述。
在本发明的一个具体实施方案中，所述第一抗原结合模块选自Fv、Fab、Fab’、dsFv或scFv的任意一种；所述第二抗原结合模块选自Fv、Fab、Fab’、dsFv或scFv的任意一种。
优选的，所述第一抗原结合模块为单链抗体片段scFv-1；所述第二抗原结合模块为单链抗体片段scFv-2；
所述ScFv-1从N端到C端依次包含轻链可变区VL-1、接头肽Linker-1和重链可变区VH-1；
所述ScFv-2从N端到C端依次包含轻链可变区VL-2、接头肽Linker-2和重链可变区VH-2；或者，所述ScFv-2从N端到C端依次包含重链可变区VH-2、接头肽Linker-2和轻链可变区VL-2；
所述ScFv-1的C端通过接头肽Linker-3与所述ScFv-2的N端连接。
优选的，所述接头肽Linker-1和接头肽Linker-2的序列为(Gly4Ser)3；所述接头肽Linker-3的序列为GlySer(Gly4Ser)4。
优选的，所述ScFv-2的C端连接标签序列；所述标签序列为小分子多肽纯化标签序列。
在本发明的另一个替代实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块是Fab或Fab’片段。在本发明的再一个替代实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块，其中一个是Fab或Fab’片段，另一个是Fv、dsFv或scFv。
在本发明的一个替代实施方案中，本发明的双特异性抗体或其抗原结合分子还可以包含更多的抗原结合模块，它们可以与第一/第二抗原结合模块相同，也可以不同，例如可以是结合其他抗原的抗原结合模块。
在本发明的一个替代实施方案中，第一/第二抗原结合模块选自鼠源抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在本发明的一个具体实施方案中，所述双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子包含重链恒定区；所述重链恒定区优选人IgG1、2、3、4的重链恒定区。
优选的，所述ScFv-2的C端通过铰链肽连接人IgG1的Fc结构域。
优选的，所述人IgG1的Fc结构域从N端到C端依次包含重链恒定区CH2和重链恒定区CH3；
所述重链恒定区CH2的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述重链恒定区CH3的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述铰链肽的序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明另一方面提供了一种双特异性抗HIV-1抗体的同源二聚体，其中，当上述的双特异性抗HIV-1抗体在宿主细胞中表达时，所述的重链恒定区，优选的人IgG1的Fc结构域，发生同源二聚化形成所述双特异性抗HIV-1抗体的同源二聚体。
本发明再一方面提供了一种核酸分子，其中，所述核酸分子编码如上述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子。
本发明还一方面提供了包含如上述核酸分子的载体，优选的，包含编码上述双特异性抗体或其抗原结合分子的核酸分子的载体，特别是表达上述的双特异性抗体或其抗原结合分子的表达载体。
术语“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使该蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体可以包含多种控制表达的元件，例如启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因等。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。在本发明的实施方案中，载体可以选自，但不限于：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体(如酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC或P1来源的人工染色体PAC)、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)以及用作载体的动物病毒，例如，逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
本发明还一方面提供了包含如上述载体的宿主细胞。
关于“宿主细胞”，可以选择，但不限于：大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞等动物细胞模型。优选的，所述宿主细胞为HEK293细胞。
本发明再一方面提供了一种生产上述的双特异性抗体或其抗原结合分子的方法，其中，通过培养含有编码上述的双特异性抗体或其抗原结合分子的核酸分子的宿主细胞，以生产上述双特异性抗体。
在本发明的上述的双特异性抗体或其抗原结合分子可以采用上述的重组的方式进行生产，也可以采用杂交瘤的方式进行生产。
本发明还提供了一种生产上述的双特异性抗体的同源二聚体的方法，培养上述的宿主细胞，当上述的双特异性抗体在所述宿主细胞中表达时，所述的重链恒定区的结构域发生同源二聚化，以生产所述的双特异性抗体的同源二聚体。
本发明的其他方面还提供了上述的双特异性抗体的糖基化变体、经半胱氨酸工程化改造的抗体变体、抗体衍生物、重组蛋白以及免疫缀合物等。
所述重组蛋白包含上述的双特异性抗体或者包含上述的同源二聚体。所述免疫缀合物包含上述的双特异性抗体或者包含上述的同源二聚体。优选的，所述免疫缀合物的缀合部分采用1个或多个异源分子，例如采用可以应用于免疫缀合物的、具有细胞毒性的异源分子。
本发明另一方面还提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的双特异性抗体或其抗原结合分子，或者包含上述的同源二聚体，或者包含上述的核酸分子，或者包含上述载体，或者包含上述宿主细胞，或者包含上述的重组蛋白，或者包含上述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载剂。
本发明还一方面提供了上述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子、或者上述的同源二聚体，或者上述的药物组合物，在制备治疗或预防HIV-1病毒所导致的疾病的药物方面的用途。
本发明还一方面提供了一种检测产品，其中，所述检测产品包含上述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，或者包含上述的同源二聚体。
所述检测产品用于检测HIV-1病毒在样品中的存在或水平。
在本发明的一个具体实施方案中，所述检测产品包括，但不限于，检测试剂、检测试剂盒、检测芯片或试纸等。
本发明的上述双特异性抗体或其抗原结合片段可以通过化学方法或者基因工程的方法进行标记，标记后的抗体或其抗原结合片段可以用于检测；标记后的抗体或其抗原结合片段，落入本发明的保护范围之内。
具体的检测方法，可以采用以下步骤，1)提供样品；2)将所述样品与上述本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段进行接触；3)检测样品与抗体或其抗原结合片段之间的免疫反应。
本发明涉及一种双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，编码该双特异性抗体或其抗原结合分子的核酸分子，包含该核酸分子的载体，包含该载体的宿主细胞，以及该双特异性抗体、其抗原结合分子、其同源二聚体在制备治疗或预防HIV-1病毒所导致的疾病的药物方面的应用，以及在检测产品方面的应用；本发明的双特异性抗HIV-1抗体对于HIV-1病毒具有显著的中和能力，未来有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的双特异性抗体的制备中所使用的pcDNA3.4-Fc表达载体的质粒图谱；
图2为本发明的实施例1的双特异性抗体的制备中所构建的表达载体pcDNA3.4-10E8-iMab-Fc的质粒图谱。
图3为本发明实施例1的双特异性抗体在表达时形成的同源二聚体的示意图；
图4为实施例1和2的双特异性抗体的Reducing SDS-PAGE的鉴定结果图；
图5为采用SDS-PAGE对实施例1和2的双特异性抗体进行鉴定的电泳结果图；
图6为实施例1双特异性抗体，以及已知的抗HIV-1单抗(VRC01、10E8、PGT128、iMab)和双抗(PGT128-iMab)对96种常规的HIV-1假病毒的中和活性和广谱性的图谱结果；
图7和图8分别为，当采用实施例1双特异性抗体治疗HIV-1病毒持续感染的恒河猴时，恒河猴体内的病毒载量随时间变化的图谱和血浆中的相应抗体浓度随时间变化的图谱。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
实施例1
实施例1的双特异性抗HIV-1抗体包含两个单链抗体可变结构域ScFv-1和ScFv-2，其中，单链抗体可变结构域ScFv-1特异性结合MPER抗原，单链抗体可变结构域ScFv-2特异性结合CD4抗原。
ScFv-1从N端到C端依次包含轻链可变区VL-1、接头肽Linker-1和重链可变区VH-1；
ScFv-2从N端到C端依次包含轻链可变区VL-2、接头肽Linker-2和重链可变区VH-2；
ScFv-1的C端通过接头肽Linker-3与ScFv-2的N端连接；
ScFv-2的C端通过铰链肽Hinge连接人IgG1的Fc结构域；
人IgG1的Fc结构域从N端到C端依次包含重链恒定区CH2和重链恒定区CH3；
即，实施例1的双特异性抗HIV-1抗体的序列，从N端到C端依次为：VL-1—Linker-1—VH-1—Linker-3—VL-2—Linker-2—VH-2—Hinge—CH2—CH3。
其中，轻链可变区VL-1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链可变区VH-1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述轻链可变区VL-2的序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链可变区VH-2的序列如SEQ ID NO.4所示；
Linker-1和Linker-2的序列为(Gly4Ser)3，如SEQ ID NO.5所示。
Linker-3的序列为GlySer(Gly4Ser)4，如SEQ ID NO.6所示；
重链恒定区CH2的序列如SEQ ID NO.8所示；重链恒定区CH3的序列如SEQ ID NO.9所示；
铰链肽Hinge的序列如SEQ ID NO.10所示。
实施例1的双特异性抗HIV-1抗体的构建和表达
步骤1)构建含有Fc基因片段的抗体表达载体pcDNA3.4-Fc
通过金斯瑞公司合成全人源IgG1信号肽基因SP、铰链肽Hinge、重链恒定区CH2和重链恒定区CH3的基因片段(SP-Fc基因)。
在信号肽和铰链区基因之间插入AgeI和BamHI酶切位点，中间由GTACGC核酸序列间隔开来，即合成SP-AgeI-BamHI-Fc序列，将SP-AgeI-BamHI-Fc序列通过TA克隆连接到pcDNA3.4载体上，最终得到pcDNA3.4-Fc表达载体，其具体的质粒图谱如图1所示。
步骤2)合成抗体基因序列
上述特异性结合MPER抗原的单链抗体可变结构域ScFv-1采用全人源HIV-1中和抗体10E8的ScFv；
上述特异性结合CD4抗原的单链抗体可变结构域ScFv-2采用全人源HIV-1中和抗体iMab的ScFv；
由南京金斯瑞公司，按常规方法合成单链抗体ScFv-1—Linker-3—ScFv-2对应的核苷酸序列，即从5’端到3’端依次为抗体10E8的ScFv基因序列(如SEQ ID NO.11所示)、Linker-3的基因序列和抗体iMab的ScFv基因序列(如SEQ ID NO.12所示)。
步骤3)构建抗体基因的表达载体
将上述第2)步骤合成的单链抗体ScFv-1—Linker-3—ScFv-2的核苷酸序列的5’端和3’分别通过AgeI和BamHI酶切位点插入到上述第1)步骤构建的pcDNA3.4-Fc表达载体中，最终获得的双特异性抗HIV-1抗体的表达质粒，将其命名为pcDNA3.4-10E8-iMab-Fc，其质粒图谱如图2所示。
步骤4)双特异性抗HIV-1抗体在哺乳动物细胞HEK 293F中的表达将步骤3)构建好的双特异性抗HIV-1抗体的表达质粒(pcDNA3.4-10E8-iMab-Fc)通过HEK 293F瞬时转染来进行蛋白表达，以便进行后续的纯化鉴定和功能研究。
首先通过质粒提取试剂盒(美基生物)提取序列正确的表达质粒，再将表达质粒瞬时转染进入HEK 293F悬浮细胞。
具体转染步骤为：转染前一天将50ml的HEK293F细胞以1.2×106/ml的密度铺在250mL细胞培养摇瓶中，转染当天用转染试剂EZTrans与步骤3)构建的表达质粒充分混合(质量体积比为DNA:EZTrans＝1:3)溶于无血清的239-TⅡ培养基中得到EZTrans-DNA混合物(即60μg DNA和180μl EZTrans溶于4mL培养基)，静置15分钟后将EZTrans-DNA混合物以雨滴状均匀加入HEK293F细胞中，转染六天后离心获取细胞培养上清用于后续的双特异性抗HIV-1抗体的提取和纯化步骤。(附注：当抗体在宿主细胞中表达时，人IgG1的Fc结构域会发生同源二聚化形成同源二聚体；该同源二聚体的示意图如图3所示，经后续的提取和纯化后，会进行鉴定。)
步骤5)抗体的提取和纯化
将上述步骤4)收集的细胞上清液用0.45μm滤膜过滤，用结合缓冲液稀释上清，采用Protein G(常州天地人和)亲和层析柱纯化，纯化后的获得的抗体通过SDS-PAGE进行纯度分析和分子大小的鉴定。
具体操作方法：通过戊二醛交联(Cross-linking)的方法把抗体交联在一起，保持其二聚体结构，然后用SDS-PAGE电泳方法进行大小和纯度鉴定。
Cross-linking SDS-PAGE步骤：取2μg抗体，用PBS补齐20μL,加入50％戊二醛1μL室温交连2分钟，1μLTris-HCL(1M，PH＝8.0)终止交连后，加入5μL 5×蛋白样品上样缓冲液，在4％-20％的预制胶中(金斯瑞生物科技)进行电泳分离。
鉴定结果参见图5，实施例1的抗体经过戊二醛交联后，在170kDa附近观察到同源二聚体大小条带，没有观察到明显的小分子量条带。这说明实施例1的双特异性抗体经纯化后形成了正确的同源二聚体，而且纯度很高，符合预期。
然后，对本发明实施例1的双特异性抗体进行蛋白变性处理(Reducing)，然后通过SDS-PAGE鉴定双特异性抗体变性后产生的单体大小。
Reducing SDS-PAGE的具体操作步骤：取2μg抗体，用PBS补齐20μL，加入5μL 5×蛋白样品上样缓冲液，100℃金属水浴锅中加热变性10分钟后，在4％-20％的预制胶中(金斯瑞生物科技)进行电泳分离。
Reducing SDS-PAGE实验结果如图4所示，实施例1的抗体经加热和SDS变性后，在80kDa附近观察到双特异性抗体单体的大小条带，符合预期。
最后，利用Nanodrop2000(ThermoFisher)测定280nm吸光值并计算抗体浓度。
实施例2
实施例2的双特异性抗HIV-1抗体，与实施例1的抗体的区别在于：交换了单链抗体可变结构域ScFv-2中的轻链可变区VL-2与重链可变区VH-2的位置。
实施例2的双特异性抗HIV-1抗体的序列，从N端到C端依次为：VL-1—Linker-1—VH-1—Linker-3—VH-2—Linker-2—VL-2—Hinge—CH2—CH3。
实施例2的双特异性抗HIV-1抗体的构建和表达方法，与上述实施例1的区别仅在于：在步骤2)的合成抗体基因序列过程中，合成的单链抗体可变结构域ScFv-2的序列替换为VH-2—Linker-2—VL-2；其他步骤操作均与实施例1的相同，具体不再赘述。
实施例2获得的纯化后抗体通过SDS-PAGE进行纯度分析和分子大小的鉴定，鉴定结果参见图5；Reducing SDS-PAGE的鉴定结果参见图4，鉴定结果的分析同实施例1，具体不再赘述。
实施例3
实施例3的双特异性抗HIV-1抗体，与实施例1的抗体的区别在于：采用His标签序列替代了Fc纯化标签序列。
His标签序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例3的具体构建和纯化步骤如下：
步骤1)构建含有His标签序列的抗体表达载体pcDNA3.4-His.
通过金斯瑞公司合成全人源IgG1重链信号肽SP和His tag基因片段，在信号肽和His tag基因之间插入酶切位点AgeI和BamHI，中间由GTACGC核酸序列间隔开来，即合成SP-AgeI-BamHI-His tag基因，通过TA克隆插入到pcDNA3.4载体上；最终得到pcDNA3.4-His表达载体，抗体基因通过AgeI和BamHI酶切位点插入抗体表达载体。
步骤2)合成抗体基因序列
具体操作与实施例1的步骤2)相同，不再赘述。
步骤3)构建抗体基因的表达载体
将上述第2)步骤合成的单链抗体ScFv-1—Linker-3—ScFv-2的核苷酸序列的5’端和3’分别通过AgeI和BamHI酶切位点插入到上述第1)步骤构建的pcDNA3.4-His表达载体中，最终获得的双特异性抗HIV-1抗体的表达质粒。
步骤4)双特异性抗HIV-1抗体在哺乳动物细胞HEK293F中的表达
将步骤3)构建好的双特异性抗HIV-1抗体的表达质粒通过哺乳动物细胞HEK293F瞬时转染来进行蛋白表达，以便进行后续的纯化鉴定和功能研究。
具体的转染操作同实施例1的步骤4)，不再赘述。
步骤5)抗体的提取和纯化
提取和纯化的具体操作与实施例1的步骤5)相同，不再赘述。
对比例
对比例1的抗体序列，从N端到C端依次为：
VH-1—Linker-1—VL-1—Linker-3—VL-2—Linker-2—VH-2—Hinge—CH2—CH3。
对比例1的抗体序列，与实施例1的区别在于，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1中的轻链可变区VL-1与重链可变区VH-1的位置。
对比例2的抗体序列，从N端到C端依次为：
VH-1—Linker-1—VL-1—Linker-3—VH-2—Linker-2—VL-2—Hinge—CH2—CH3。
对比例1的抗体序列，与实施例1的区别在于，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1中的轻链可变区VL-1与重链可变区VH-1的位置；以及，交换了单链抗体可变结构域ScFv-2中的轻链可变区VL-2与重链可变区VH-2的位置。
对比例3的抗体序列，从N端到C端依次为：
VL-2—Linker-2—VH-2—Linker-3—VL-1—Linker-1—VH-1—Hinge—CH2—CH3。
对比例3的抗体序列，与实施例1的区别在于，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1和ScFv-2的位置。
对比例4的抗体序列，从N端到C端依次为：
VH-2—Linker-2—VL-2—Linker-3—VL-1—Linker-1—VH-1—Hinge—CH2—CH3。
对比例4的抗体序列，与实施例1的区别在于，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1和ScFv-2的位置，并且，交换了单链抗体可变结构域ScFv-2中的轻链可变区VL-2与重链可变区VH-2的位置。
对比例5的抗体序列，从N端到C端依次为：
VH-2—Linker-2—VL-2—Linker-3—VH-1—Linker-1—VL-1—Hinge—CH2—CH3。
对比例5的抗体序列，与实施例1的区别在于，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1和ScFv-2的位置，并且，交换了单链抗体可变结构域ScFv-1中的轻链可变区VL-1与重链可变区VH-1的位置，以及单链抗体可变结构域ScFv-2中的轻链可变区VL-2与重链可变区VH-2的位置。
对比例1-5均按照实施例1中的步骤1)的过程构建含有Fc基因片段的抗体表达载体pcDNA3.4-Fc，再合成各自的合成抗体基因序列，然后均按照实施例1中步骤3)-5)来获得各自的抗体。
对比例6：特异性结合MPER抗原的全人源HIV-1中和抗体10E8；
对比例7：特异性结合CD4抗原的全人源HIV-1中和抗体iMab。
效果数据
一、HIV-1假病毒毒株的生产
HIV-1假病毒分别通过各自的HIV包膜蛋白质粒和带荧光素酶报告基因的HIV Env缺陷的骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)共转染HEK293T细胞获得。HIV包膜蛋白质粒由本实验室保存，pNL4-3.Luc.R-E-骨架质粒源自美国NIH AIDS Reagent Program。所有质粒通过转化DH5ɑ进行扩增，采用美基生物质粒提取试剂盒进行质粒提取。
具体的包毒步骤如下：提前一天在直径10cm的圆形细胞培养皿中接种5×106个HEK293T细胞。24小时后，利用EZTrans细胞转染试剂(李记生物)将骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)与HIV包膜蛋白表达质粒以3:1的体积质量比共转染293T细胞，详细转染方法参见EZ Trans细胞转染试剂的使用说明书。转染48小时后，收取含有假病毒的上清液，2500转离心10分钟去除细胞碎片，充分混匀后分装冻存于-80℃冰箱，用于抗体纯度和大小鉴定以及中和活性的检测。
二、抗体的中和活性检测
检测对象：实施例1、2和3的抗体，以及对比例1-7的抗体；
选择了覆盖中国和世界流行的6种常规HIV-1假病毒毒株(Q168.a2、CAAN.A2、CNE58、Bal.01、ZM106.9和CNE56)进行抗体中和实验。
中和实验的具体步骤为：在96孔U底培养板中，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基梯度稀释抗体，然后转移到96孔平底板中，再加入已稀释好的HIV-1假病毒，二者充分混匀后，放入到细胞培养箱37℃静置孵育30分钟，孵育期间消化U87MG细胞，调节细胞密度到5×105/mL，每孔加入20μl等量的U87MG细胞，再放入到细胞培养箱中继续培养，24小时后补10％FBS的DMEM高糖培养基到200μl/孔，继续放入细胞培养箱中培养24小时,吸去细胞培养上清，裂解细胞，利用荧光素酶检测试剂盒(Luciferase Assay System，Promega Cat.#E1500)检测细胞内荧光素酶的强度，利用多功能酶标仪(Perkin Elmer)检测每孔化学发光RLU值；并计算抑制病毒进入细胞的百分比和抗体抑制病毒的半数抑制剂量IC50。
检测结果参见下表1和2：
表1
Figure BDA0003722803730000141
Figure BDA0003722803730000151
表2
Figure BDA0003722803730000152
从表1和表2的数据可以看出，本发明实施例1和2的抗体对于上述6种HIV-1假病毒毒株均具有显著优异的中和能力，均能够在比1μg/ml级别低2至4个数量级的浓度水平显示出中和活性；例如对于HIV-1假病毒Q168.a2、CNE58、Bal.01和CNE56，均在0.1ng/ml级别的浓度水平显示出中和活性；对于HIV-1假病毒CAAN.A2均在1ng/ml级别的浓度水平显示出中和活性；对于HIV-1假病毒ZM106.9也在0.01μg/ml级别的浓度水平显示出中和活性。从表1中的统计结果来看，实施例1和实施例2的抗体对这6个病毒的中位IC50值和几何平均IC50值基本相同；说明实施例1和实施例2的抗体对于HIV-1病毒的中和能力相当。
然而，对比例6和7的单抗，对于上述6种HIV-1假病毒毒株中的任意一种的中和活性，明显劣于实施例1和2抗体的效果。从统计结果中的几何平均IC50值来看，实施例1和2抗体的中和能力是对比例6单抗的445倍，是对比例7单抗的84倍。
对比例1至5的抗体，也是基于对比例6和7的单抗(抗体10E8和抗体iMab)的序列进行组合的双抗，但是它们的中和活性都明显劣于实施例1和2抗体的。从统计结果中的几何平均IC50值来看，实施例1和2抗体的中和能力是对比例1-5抗体几十甚至几千倍(998、2111、49、9585、1138倍)。
现有技术中虽然公开了特异性结合MPER抗原的全人源HIV-1中和抗体10E8的序列和特异性结合CD4抗原的全人源HIV-1中和抗体iMab的序列。理论上来说，两个单抗组合形成的双抗，其中和能力可以推测为两个单抗的中和能力的“加和”。但是本发明的发明人在科研过程中，却发现实际情况并非如此。发明人发现，单链抗体可变结构域ScFv-1和ScFv-2的重轻链排列顺序，以及ScFv-1与ScFv-2两者之间排列顺序对于双特异抗体的中和活性影响很大。对比例1-5的抗体，虽然也是基于抗体10E8和抗体iMab的序列进行组合的双抗，但是它们的中和活性，不仅明显劣于实施例1和2抗体的，而且从整体数据来看，比对比例6和7单抗的还要差。
发明人意外地发现，将抗体10E8和抗体iMab的序列按照特定的组合方式构建成双抗(实施例1和2的双特异性抗体)，其对于HIV-1病毒的中和能力远大于抗体10E8和抗体iMab中和能力的简单加和(实施例1和2抗体的中和能力是对比例6抗体的445倍，是对比例7抗体的84倍)，取得了预料不到的技术效果。
实施例1和实施例3的数据结果比较参见下表3。
表3：
Figure BDA0003722803730000161
Figure BDA0003722803730000171
从表3的数据，可以看出：实施例1与实施例3均能中和这6种病毒，且中位IC50和几何平均IC50相当，说明不同的标签(Fc、His标签)对抗体的中和活性影响不大。
三、抗体对96种常规HIV-1假病毒毒株的中和活性和广谱性比较
本发明实施例1的双特异性抗体、目前已进入美国临床试验的抗HIV-1单克隆抗体(VRC01、10E8、PGT128、iMab)，以及已知的双特异性抗HIV-1抗体(PGT128-iMab)对96种常规HIV-1假病毒毒株(目前中国和世界流行的96种HIV-1病毒对应的假病毒毒株)的中和活性和广谱性结果，参见下表4和图6。
表4
Figure BDA0003722803730000172
Figure BDA0003722803730000181
从表4的数据可以看出，本发明实施例1的双特异性抗体对于96种HIV-1假病毒毒株均具有显著优异的广谱中和能力。
1)在抗体浓度为20μg/ml的水平，实施例1的抗体能100％中和96种常规HIV-1假病毒毒株，中位数IC50值为0.0008μg/ml。单抗VRC01、10E8、PGT128、iMab的中位数IC50值分别为0.3133μg/ml、0.2169μg/ml、0.0267μg/ml和0.0632μg/ml，双抗PGT128-iMab的中位数IC50值为0.0293μg/ml。可以看出：实施例1抗体的中和能力是其对应的亲本单抗10E8、iMab的252倍和58倍，是单抗VRC01的342倍，是双抗PGT128-iMab的27倍。
2)在抗体浓度为0.1μg/ml的水平，实施例1抗体依然能100％中和96种常规HIV-1假病毒毒株，然而单抗VRC01、10E8、PGT128和iMab，以及双抗PGT128-iMab的广谱性均大幅下降，能够中和的病毒株数量占总数的百分比分别为11％、21％、54％、68％和84％(相比抗体浓度20μg/ml的数据，分别下降了62％、75％、12％、26％和16％)。
3)当抗体浓度为0.01μg/ml的水平，实施例1抗体依然能中和96％的常规HIV-1假病毒毒株，其对应亲本单抗10E8和iMab能够中和的毒株数占比仅有1％和10％。单抗VRC01不能中和任何毒株(0％)，双抗PGT128-iMab的广谱性也明显下降(能够中和的毒株数占比仅有28％)。
从图6中，可以更直观地看出本发明实施例1的双抗的广谱中和活性，远超过目前已知的处于临床试验阶段的HIV-1单抗和双抗。
更为重要的是，本发明实施例1双抗的广谱中和能力，远大于其对应的亲本单抗10E8和iMab的简单加和，取得了预料不到的技术效果。
四、抗体对于HIV-1病毒持续感染的恒河猴的治疗效果
北京中国医学科学院医学实验动物研究所建立了HIV-1病毒持续感染恒河猴模型，我们用此模型验证本发明实施例1双特异性抗体对HIV-1感染恒河猴的治疗效果。
恒河猴的体重大约5-6kg/只，按照10mg/kg(实施例1双抗)的剂量给药，在给药前保留恒河猴血浆作为本底对照，第0天通过静脉注射给药，然后每隔4天取血，分离血浆-80℃保藏，取样直到63天结束。把不同时间点收取的所有血浆通过qRT-PCR测量血浆病毒载量，ELISA检测血浆抗体浓度。
qRT-PCR测量血浆病毒载量：通过定量实时逆转录-PCR(qRT-PCR)测定SIVgag477，使用上游引物GCAGAGGGAGAAATTACCCTAC，下游引物CAATTTTACCCAGGCATTTATTTT和探针FAM(6-羧基荧光素)-ACCTGCCATTAAGCCCGA-MGB在Perkin-ElmerABI7500仪器上测定血浆病毒载量。通过使用QIAamp病毒RNAmini kit(Qiagen)从无细胞血浆中提取和纯化病毒RNA。在20μl无核酸酶的水中洗脱RNA，并在-80℃下立即冷冻直至分析。SIV gag477 cDNA序列被用作PCR阳性对照。检测限为每毫升血浆100拷贝当量RNA。对每个样品进行一式三份的测试反应。
ELISA检测血浆抗体浓度：用包被液碳酸氢钠缓冲液稀释能被实施例1双抗中10E8识别的MPER多肽至终浓度为10μg/mL，按100μl/孔加到96孔板，放置在4℃下孵育过夜。除去包被液，加入300μl含5％脱脂奶粉的PBS封闭液室温封闭至少1小时。用PBS-T缓冲液清洗板3次。将恒河猴血浆从1：100开始进行5倍连续梯度稀释，按照100μl/孔加入到96孔板。室温孵育1小时。在PBS缓冲液中加入100μl/孔HRP抗人IgG(PBS缓冲液1：2500稀释)，室温孵育1小时。用PBS-T缓冲液中洗3次。每孔加入100μl的显色液ABTS。在室温下显色，读取A405处的吸光度。
从图7可以看出，实施例1双特异性抗体注射入恒河猴体内后，血浆中大量的病毒被抗体中和，病毒载量在7天内迅速下降到检测不到的水平；之后由于恒河猴体内存在被HIV-1感染的细胞，细胞内潜伏的病毒复制后释放出病毒粒子，血浆中病毒载量又逐渐上升；令人意想不到的是，病毒载量在21天的时候又开始慢慢下降，在35-63天几乎检测不到病毒；这表明本发明实施例1的双特异性抗体能识别并杀死恒河猴体内被HIV-1病毒感染的细胞，清除病毒储存库，彻底清除体内的病毒。
图8显示实施例1双特异性抗体在恒河猴血浆中浓度的变化，抗体注入体内后由于中和了大量的游离病毒粒子，浓度从15μg/ml迅速下降，之后维持在大约5μg/ml的水平，然后再慢慢下降，持续到63天，这表明本发明实施例1双特异性抗体在恒河猴体内较为稳定，半衰期比较长。
综上所述，本发明实施例1的双特异性抗体在恒河猴体内能稳定存在，不但能清除血浆中游离的病毒粒子，而且能清除HIV-1感染的细胞，降低病毒储存库，达到彻底体内清除病毒的目标。因此，实施例1双特异性抗体具有良好的治疗HIV-1的效果及临床应用前景。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003722803790000011
Figure IDA0003722803790000021
Figure IDA0003722803790000031
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Figure IDA0003722803790000151

Claims (13)

1.一种双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：
所述双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块；所述第一抗原结合模块特异性结合MPER抗原，所述第二抗原结合模块特异性结合CD4抗原；
所述第一抗原结合模块包含轻链可变区VL-1和重链可变区VH-1；
所述轻链可变区VL-1的序列如SEQ ID NO.1所示，或者，其与SEQ ID NO.1所示序列有80％以上的序列同源性；所述重链可变区VH-1的序列如SEQ ID NO.2所示，或者，其与SEQID NO.2所示序列有80％以上的序列同源性；
所述第二抗原结合模块包含轻链可变区VL-2和重链可变区VH-2；
所述轻链可变区VL-2的序列如SEQ ID NO.3所示，或者，其与SEQ ID NO.3所示序列有80％以上的序列同源性；所述重链可变区VH-2的序列如SEQ ID NO.4所示，或者，其与SEQID NO.4所示序列有80％以上的序列同源性。
2.如权利要求1所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：所述第一抗原结合模块为单链抗体片段scFv-1；所述第二抗原结合模块为单链抗体片段scFv-2；
所述ScFv-1从N端到C端依次包含轻链可变区VL-1、接头肽Linker-1和重链可变区VH-1；
所述ScFv-2从N端到C端依次包含轻链可变区VL-2、接头肽Linker-2和重链可变区VH-2；或者，所述ScFv-2从N端到C端依次包含重链可变区VH-2、接头肽Linker-2和轻链可变区VL-2；
所述ScFv-1的C端通过接头肽Linker-3与所述ScFv-2的N端连接。
3.如权利要求2所示的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：所述接头肽Linker-1和接头肽Linker-2的序列为(Gly4Ser)3；所述接头肽Linker-3的序列为GlySer(Gly4Ser)4。
4.如权利要求2所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：
所述ScFv-2的C端连接标签序列；所述标签序列为小分子多肽纯化标签序列。
5.如权利要求2-4中任意一项所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：所述双特异性抗HIV-1抗体包含重链恒定区；所述重链恒定区优选人IgG1、2、3、4的重链恒定区；优选的，所述ScFv-2的C端通过铰链肽连接人IgG1的Fc结构域。
6.如权利要求5所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，其特征在于：
所述人IgG1的Fc结构域从N端到C端依次包含重链恒定区CH2和重链恒定区CH3；
所述重链恒定区CH2的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述重链恒定区CH3的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述铰链肽的序列如SEQ ID NO.10所示。
7.一种双特异性抗HIV-1抗体的同源二聚体，其特征在于：当权利要求5或6所述的双特异性抗HIV-1抗体在宿主细胞中表达时，所述的重链恒定区发生同源二聚化形成所述双特异性抗HIV-1抗体的同源二聚体。
8.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码如权利要求1至6中任意一项所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子。
9.包含如权利要求8中所述核酸分子的载体。
10.包含如权利要求9所述载体的宿主细胞。
11.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含如权利要求1至6中任意一项所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，或者包含如权利要求7所述的同源二聚体。
12.如权利要求1至6中任意一项所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，如权利要求7所述的同源二聚体，或者如权利要求11所述的药物组合物，在制备治疗或预防HIV-1病毒所导致的疾病的药物方面的用途。
13.一种检测产品，其特征在于：所述检测产品包含如权利要求1至6中任意一项所述的双特异性抗HIV-1抗体或其抗原结合分子，或者包含如权利要求7所述的同源二聚体。
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