CN112794918A - 针对新型冠状病毒的人ACE2改造蛋白、ACE2-hFc类抗体蛋白 - Google Patents

针对新型冠状病毒的人ACE2改造蛋白、ACE2-hFc类抗体蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供hACE2突变蛋白‑hFc融合蛋白，其对新冠病毒的突变株的结合能力强，比现有抗体更有优势，能够克服因为病毒变异而导致的抗体中和能力的下降的问题。本发明的hACE2改造片段的hFc融合蛋白特别适用于对新冠病毒及其突变株，例如英国株，巴西株，南非株以及貂501T株等的治疗或预防，及相应药物、疫苗的制备。

Description

针对新型冠状病毒的人ACE2改造蛋白、ACE2-hFc类抗体蛋白
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及针对新型冠状病毒具有中和效果的类抗体蛋白。
背景技术
世界卫生组织WHO公布的病毒暴发新闻(Disease Outbreak News)中谈及了四个引起广泛关心与讨论的新冠病毒变异，分别是：D614G变异株、英国变种新冠病毒株B.1.1.7、南非变种新冠病毒株501Y.V2，巴西P.1变异株和丹麦水貂变异株。现有新冠疫苗对新的变异毒株能否起效，决定着全球疫情防控局势的走向。已有体外实验显示现有疫苗对英国变异株有效，具体到人体内还有待观察。但一篇关于南非变异株的预印本论文带来了令人担忧的消息，并迅速引起了科学家的关注。
2020年12月上旬，南非政府向全球公告新冠病毒的新变异株501.V2(亦称501Y.V2)。这个突变株和英国变异株一样，也是在刺突蛋白上突变，它主要有三个突变：K417N，E484k和N501Y。初期研究显示，501.V2变异株有较高的病毒量，扩散较快、传播性较高。根据欧洲疾病预防管制中心快速风险评估(ECDC Rapid Risk Assessment)2020年12月29日的报导，501Y.V2毒株最早出现于2020年8月初，到11月初，已成为南非主要病毒株，后来在英国及其他国家也陆续出现。截至去年12月底，南非感染人数中，501Y.V2毒株的比例已逾80％。
南非国家传染病研究所(NICD)的研究人员Wibmer等人在bioRxiv发表了题为SARS-CoV-2 501Y.V2 escapes neutralization by South African COVID-19donorplasma的预印本论文。论文称，南非出现的新冠变异毒株501Y.V2能显著逃避三类相关单克隆抗体的攻击。更糟的是，康复期病人血清中的中和抗体对该变异株的效应也显著降低了。研究数据暗示，南非变种新冠毒株很有可能“二次感染”人，而当前基于刺突蛋白的疫苗可能对其无能为力，功效降低。
目前，对于巴西P.1变异株的扩散传播能力以及疫苗保护作用缺乏相应的科学研究依据，但是因为巴西P.1变异株和南非变种新冠病毒株501Y.V2非常类似，现其流行扩散能力，传播速度以及疫苗保护作用同样值得关注。
因此，迫切需要能够抵消抗体因为病毒变异而导致的中和能力的下降，从而对变异株仍然有效的抗体或抗体片段及它们衍生的疫苗，融合蛋白等。
发明内容
首先，参考SARS-Cov-2刺突蛋白受体结合区域(RBD)和人细胞膜受体ACE2蛋白复合物的结构(图1)。发明人推测，位于ACE2蛋白上的27位苏氨酸(以下也简称27T)可能是参与SARS-Cov-2刺突蛋白与人细胞膜受体ACE2蛋白相互作用的关键氨基酸，其与RBD上面多个疏水氨基酸F456,Y473,A475,Y489都有重要的相互作用。
因此，发明人通过设计，将hACE2蛋白中的氨基酸27T突变成苯丙氨酸(以下也简称27F)，以增强彼此之间疏水作用力从而增强彼此之间的亲和力，得到了本发明的改造蛋白hACE2-27F，其氨基酸序列如Seq ID No.4所示，其编码序列例如如Seq ID No.1所示。
人细胞膜受体ACE2的全称是血管紧张素转化酶2(ACE2)，调控血管收缩的血管紧张素II(AngII)，可将AngII裂解成Ang1-7多肽，具有舒张血管降血压的作用。
为了避免过多外源蛋白可能导致的过度降低血压的作用，接下来，发明人将hACE2蛋白的酶活中心关键氨基酸273位精氨酸(R)(以下简称273R)突变为谷氨酰胺(以下简称273Q)，得到了hACE2的进一步改造蛋白，下文称为hACE2-27F-273Q，其氨基酸序列如Seq IDNo.6所示，其编码序列例如如Seq ID No.3所示。该设计的目的意在使改造蛋白仍具有结合新冠病毒的能力，但不再具有降血压等酶活作用的能力。
进而，通过将上述两种改造蛋白hACE2-27F与hACE2-27F-273Q分别与人抗体Fc段蛋白(其氨基酸序列如Seq ID No.5所示)融合，得到了hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc两种融合类抗体蛋白。上述两种融合类抗体蛋白对新型冠状病毒新冠病毒及其突变株例如：WH01，南非株，英国株，巴西株，貂453F株，貂486L株，貂367F株，貂501T株等均具有良好的亲和力，从分子水平预测具有良好的中和能力。
本发明包括以下内容。
1.融合蛋白，其包含人血管紧张素转化酶2(hACE2)突变部分和hFc部分，hACE2突变部分包含突变的hACE2片段，hFc部分包含人抗体Fc段蛋白，
与天然人血管紧张素转化酶2相比，突变的hACE2片段的氨基酸序列具有将27位苏氨酸(T)突变成苯丙氨酸(F)的突变，
所述人抗体Fc段蛋白的氨基酸序列为如Seq ID No.5所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.2所示的序列。
2.根据项1所述的融合蛋白，其中，所述突变的hACE2片段的氨基酸序列为如SeqID No.4所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.1所示的序列。
3.根据项1或2所述的融合蛋白，其中，与天然人血管紧张素转化酶2相比，突变的hACE2片段的氨基酸序列进一步具有将273位精氨酸(R)突变为谷氨酰胺(Q)的突变。
4.根据项3所述的融合蛋白，其中，所述突变的hACE2片段的氨基酸序列为如SeqID No.6所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.3所示的序列。
5.药物组合物，其包含项1-4中任一项所述的融合蛋白。
6.试剂盒，其包含项1-4中任一项所述的融合蛋白。
7.项1-4中任一项所述的融合蛋白，用于制备检测样品中是否存在新冠病毒，优选为新冠病毒突变株(例如：突变株WH01，南非突变株501Y.V2，英国突变株B.1.1.7，巴西突变株P.1，丹麦水貂变异株貂453F株，貂486L株，貂367F株，貂501T株)的试剂。
8.项1-4中任一项所述的融合蛋白，用于制备用于治疗或预防新冠病毒引起的疾病的药物。
当突变株病毒侵染人体细胞的时候，本发明的改造hACE2更能优先识别并结合病毒，再加上ACE2后面融合了人抗体Fc段蛋白，从而形成了ACE2-hFc类抗体蛋白，进一步具有中和病毒的效果。
本发明的两种hACE2改造片段的hFc融合蛋白特别适用于对新冠病毒突变株，例如英国株，巴西株，南非株以及貂501T株等进行治疗或预防，能够规避及用于此类用途的相应药物制备。
附图说明
图1.SARS-Cov-2刺突蛋白受体结合区域(RBD)和人细胞膜受体ACE2蛋白复合物结构。
图2.改造hACE2-hFc融合蛋白对新型冠状病毒SARS-Cov-2的EC50。
图3.同源重组方法步骤示意图。
具体实施方式
本发明的改造hACE2融合蛋白例如可以通过本领域常规使用的方法得到。
例如，可以先将无突变的hACE2蛋白编码序列与hFc蛋白基因连接，而后进行突变，从而得到编码改造hACE2-hFc融合蛋白的序列，再进行转录。也可以先进行突变，之后再将突变的基因或多肽与hFc蛋白基因或蛋白片段进行连接。
作为得到本发明的改造蛋白的方法，除了实施例中举出的方法以外，也能够根据本领域常用的其他方法，只要能够实现对氨基酸进行替换，将27T换为27F，将273R突变为273Q即可，两种突变可以同时进行，也可以在不同的步骤中先后进行。
也可以将其完整或部分编码序列进行合成后转录，或直接合成完整的或部分氨基酸序列等，如果需要可以进行连接。
需要说明的是，在本发明的改造hACE2-hFc融合蛋白中，只要具有相当于27T突变为27F，或将27T突变为27F且将273R突变为273Q的突变即可，在不影响本发明的效果的范围内可以具有进一步的突变，氨基酸的增加或删除。
实施例1改造hACE2-hFc融合蛋白的获得
首先，将编码野生型hACE2蛋白的基因序列(序列如Seq ID No.7所示)与编码人的抗体hFc蛋白基因(序列如Seq ID No.2所示)无间隔地连接，将得到的序列人工合成(例如由艾柏森生物提供合成服务)，得到野生型ACE2-hFc融合蛋白基因。
将该融合蛋白基因克隆到pCAGGS真核细胞表达载体(例如购自丰晖生物)上，得到pCAGGS-ACE2(T27)-hFc载体，再通过同源重组的方法将27T突变成27F，得到pCAGGS-ACE2(27F)-hFc载体。其包含改造hACE2-27F-hFc融合蛋白基因(即，Seq ID No.1+Seq ID No.2的序列)。
在本说明书中，此处的“+”号表示两个序列中间无其他核苷酸或氨基酸，并以前后顺序直接连结得到的序列。
利用pCAGGS-ACE2(27F)-hFc载体，通过同源重组的方法将上述融合蛋白基因中相应的273R突变为273Q，得到pCAGGS-ACE2(27F)-273Q-hFc载体。其包含改造hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白基因(即，Seq ID No.3+Seq ID No.2的序列)。
使用pCAGGS-ACE2(27F)-hFc载体和pCAGGS-ACE2(27F)-273Q-hFc载体表达并纯化，分别得到了hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白。
同源重组的方法
通过PCR方法引入突变位点，将野生型hACE2蛋白的基因序列的对应27位氨基酸T密码子(ACA)突变为氨基酸F密码子(TTT)，273位氨基酸R密码子(AGA)突变成氨基酸Q密码子(CAG)，通过图3所示步骤形成重组质粒。
表达纯化的方法
将重组好的目的质粒通过脂质体转染到悬浮的293F细胞中，细胞密度约为2X106/ml。每隔两天添加补料液一次，5-7天收集细胞上清。通过蠕动泵将含有hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白的细胞上清在4摄氏度环境下泵到Protein A亲和层析柱上，使上清和亲和层析柱过夜充分结合。用结合缓冲液(0.5M NaCl,Na2HPO4 20mM，PH8.0)洗杂蛋白，直到缓冲液里不含蛋白；用洗脱液(0.5M NaCl,Na2HPO4 20mM，PH2.0)洗脱融合蛋白，收集管里预先加入150ul 1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止蛋白在过酸的环境下失活，最后PBS透析收集获得表达的融合蛋白。
实施例2改造hACE2-hFc融合蛋白的中和试验
测定了hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白在Vero细胞中对SARS-Cov-2(WH株)的中和效果。
设置了Vero E6细胞(细胞阴性对照组)，Vero细胞+SARS+培养基(无蛋白的阴性对照)，Vero细胞+SARS+hACE2野生型(hACE2-WT组)、Vero细胞+SARS+hACE2-27F蛋白(hACE2-27F组)、Vero细胞+SARS+hACE2-27F-273Q(hACE2-27F-273Q组)。
实验仪器和材料
Vero E6细胞(例如购自丰晖生物)，hACE2野生型-hFc蛋白(例如由国肽生物合成，其编码序列为Seq ID No.7+Seq ID No.2的序列)，hACE2-27F蛋白，hACE2-27F-273Q均为实施例1中得到的，新冠病毒SARS-Cov-2WH01株(例如购自中国科学院微生物研究所P3实验室)。
蛋白原液配制：分别将野生型hACE2-hFc，hACE2-27F-hFc融合蛋白，hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白在无菌条件下溶解在无菌的DMEM中，配制成浓度160μg/ml的溶液。
各hACE2蛋白的梯度稀释液的配制：在加入病毒前约2h，使用空的深孔板，在前11列中用DMEM培养基对各hACE2蛋白的蛋白原液进行2倍的倍比稀释。在起始梯度(即，浓度最高)孔中，各hACE2蛋白浓度均为160μg/ml。对每种蛋白均稀释11个浓度，每个浓度设8个复孔。同时，在深孔板的第12列仅加入培养基，作为无蛋白的阴性对照。
病毒稀释液：在使用前，取新冠病毒SARS-Cov-2病毒液(中国科学院微生物研究所P3实验室扩增)，用4％FBS的DMEM稀释800倍。配制为新冠病毒滴度为1.6*106TCID50/ml的病毒稀释液。
具体步骤如下。
a.在加入病毒的前一天，在96孔细胞培养板中铺对数生长期的Vero E6细胞，培养基为DMEM培养基，在培养箱中培养一晚。24h后细胞汇合密度达到80-100％。
b.取上述各hACE2蛋白的梯度稀释液，在深孔板中加入等体积的上述病毒稀释液，混匀后即为混合工作液，在37℃孵育1h后使用。此时，病毒量相当于96孔板中每孔病毒量100TCID50/100μl。
c.将96孔细胞培养板小心地弃去上清，用排枪分别缓慢，小心地加入上述混合工作液100μl/孔到Vero细胞上。在培养箱中培养72h。
b.通过观察细胞的病变指标计算了抑制率，将结果绘图示于图2。
结果显示：由图2可知，与野生型(约10.14μg/ml)相比，hACE2-27F的EC50为约2.464μg/ml，hACE2-27F-273Q为约2.877μg/ml，可知发生了突变的融合蛋白的中和能力提高了4-5倍。因此，证明了通过设置突变，改造hACE2-27F、hACE2-27F-273Q融合蛋白对于SARS-Cov-2的中和效果明显优于野生型hACE2。
实施例3 hACE2改造蛋白与新冠病毒突变株的RBD的亲和力
发明人利用表面等离子共振SPR技术，检测了新冠病毒野生株WH01，南非突变株501Y.V2，英国突变株B.1.1.7，巴西突变株P.1，丹麦水貂变异株貂453F株，貂486L株，貂367F株，貂501T株等新冠病毒突变株的RBD分别与hACE2野生型-hFc蛋白(下表记作WT-ACE2-hFc)，hACE2-27F(下表记作M1-ACE2-hFc)，hACE2-27F-273Q(下表记作M2-ACE2-hFc)，C110抗体，S2H14抗体，CB6抗体，H4抗体，B38抗体，REGN10933抗体，REGN10987抗体的亲和力。从分子水平预测了人ACE2野生型，改造后ACE2蛋白以及各种抗体对不同病毒变异株的中和能力的改变。
仪器与材料
使用的抗体：C110抗体，S2H14抗体，CB6抗体，H4抗体，B38抗体，REGN10933抗体，REGN10987抗体均由申请人实验室表达纯化，将它们的氨基酸序列编号示于表1中。
病毒RBD蛋白：野生株WH01，南非突变株501Y.V2，英国突变株B.1.1.7，巴西突变株P.1，丹麦水貂变异株貂453F株，貂486L株，貂367F株，貂501T株均由申请人实验室表达纯化，它们的氨基酸序列编号示于表1中。
表1
蛋白名称 序列号 蛋白名称 序列号
C110-重链 Seq ID No.8 C110-轻链 Seq ID No.9
S2H14-重链 Seq ID No.10 S2H14-轻链 Seq ID No.11
CB6-重链 Seq ID No.12 CB6-轻链 Seq ID No.13
H4-重链 Seq ID No.14 H4-轻链 Seq ID No.15
B38-重链 Seq ID No.16 B38-轻链 Seq ID No.17
REGN10933-重链 Seq ID No.18 REGN10933-轻链 Seq ID No.19
REGN10987-重链 Seq ID No.20 REGN10987-轻链 Seq ID No.21
野生株WH01 的RBD Seq ID No.22 南非株的RBD Seq ID No.23
巴西株的RBD Seq ID No.24 英国株的RBD Seq ID No.25
貂453F株的RBD Seq ID No.26 貂486L株的RBD Seq ID No.27
貂501T株的RBD Seq ID No.28 貂367F株的RBD Seq ID No.29
设备：biacore T100&CM5传感器芯片(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)
试剂：soluble human Neonatal Fc-receptor(FcRn，Cat#FCM-H5286，ACROBiosystems，Newark，DE)。
1.芯片表面预处理：利用共价结合将人hACE2-hFc融合蛋白偶联在羧基化处理的葡聚糖芯片(CM5)表面。
此实验使用了氨基共价偶联法：第一步芯片活化，pH 4.5-5条件下使用交联剂EDC/NHS使芯片表面酯化；第二步配体偶联(配体蛋白纯度要求在90％以上，用量以30-50KD蛋白为例，需准备蛋白浓度10-50ug/ml，1ml左右，随着蛋白性质的不同和分子量的变化可以调整)，分别将各hACE2-hFc融合蛋白或抗体偶联到CM5芯片表面(酯化后的芯片表面酯基和FcRn蛋白上的氨基发生反应)；第三步封闭，用1M乙醇胺盐酸盐(PH8.5)封闭芯片上多余的有活性的羧基。此次实验hACE2-hFc融合蛋白或抗体的最终偶联水平均为～9000RU(Response Units)。
对照表面的设计：CM5芯片分1，2，3，4四个Flow Cell通道，一般1，2通道配对使用(1通道作为参比)，3，4通道配对使用(3通道作为参比)，将参比通道对照表面选择活化-封闭无配体固定的方式来做削减对照。
2.进样：首先用运行缓冲液(50mM phosphate,100mM sodiumchloride,and0.01％vol/vol Tween 20,pH 6.0or 7.4)稀释样本，此实验样本含有不同突变株的RBD。进样时间为2min，进样流速20ul/min，蛋白解离时间为2.5min。
3.芯片再生：将残留蛋白用再生缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,and 0.01％vol/vol Tween 20,pH 7.4))洗脱下来，时间为30sec，流速设为30ul/min。
4.数据分析：用Biacore T100评价软件(version2.0.2)分析生成传感图，将数据列入表2中，与hACE2野生型-hFc蛋白相比亲和力升高的数据为粗体，亲和力降低的数据标有下划线。
结果显示，在英国株，巴西株，南非株以及貂501T株中，除REGN10987以外，它们与试验的多种抗体中的绝大部分的亲和力都有所下降，尤其是南非株中，与其他多种抗体的亲和力下降最明显突出。
这样的结果与现有论文提到南非突变株对康复期病人血清中的中和抗体对该变异株的效应也显著降低了的结论一致，这就意味着大部分的抗体在中和病毒能力方面大打折扣。
表2.新冠病毒突变株的RBD与改造蛋白及不同抗体的亲和力(nM)
Figure BDA0002947150310000101
而同时，本发明的两种改造蛋白与不同突变株RBD的亲和力都有所提高(表2)。与野生型hACE2-hFc蛋白相比，改造蛋白hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc的中和效果提高，与不同新冠病毒突变株的RBD之间的亲和能力提高。
可知从分子水平预测，本发明的改造蛋白hACE2-27F-hFc，hACE2-27F-273Q-hFc融合蛋白对新冠病毒的突变株的结合能力更强，对于检测在刺突蛋白上发生突变的新冠病毒株更有优势，能够避免因为病毒变异而导致的抗体中和能力的下降。
工业实用性
本发明的hACE2改造片段的hFc融合蛋白为类抗体蛋白，能够广泛用于在刺突蛋白上发生突变的新冠病毒株，预期可用于现有的绝大多数的新冠病毒株，从而避免因为病毒变异而导致抗体对变异株中和能力的下降。
本发明的hACE2改造片段的hFc融合蛋白特别适用于对新冠病毒突变株，例如英国株，巴西株，南非株以及貂501T株等进行研究，治疗或预防，可以广泛用于临床，流行病学调查及用于此类用途的相应药物包括疫苗的制备。也可以用于检测生物样本，非生物样本表面或内部中是否存在新冠病毒等。
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Claims (8)

1.融合蛋白，其包含人血管紧张素转化酶2(hACE2)突变部分和hFc部分，hACE2突变部分包含突变的hACE2片段，hFc部分包含人抗体Fc段蛋白，
与天然人血管紧张素转化酶2相比，突变的hACE2片段的氨基酸序列具有将27位苏氨酸(T)突变成苯丙氨酸(F)的突变，
所述人抗体Fc段蛋白的氨基酸序列为如Seq ID No.5所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述突变的hACE2片段的氨基酸序列为如SeqID No.4所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.1所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，与天然人血管紧张素转化酶2相比，突变的hACE2片段的氨基酸序列进一步具有将273位精氨酸(R)突变为谷氨酰胺(Q)的突变。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述突变的hACE2片段的氨基酸序列为如SeqID No.6所示的序列，优选其编码序列为如Seq ID No.3所示的序列。
5.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。
6.试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。
7.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，用于制备检测样品中是否存在新冠病毒，优选为新冠病毒突变株(例如：野生型株WH01，南非突变株501Y.V2，英国突变株B.1.1.7，巴西突变株P.1，丹麦水貂变异株貂453F株，貂486L株，貂367F株，貂501T株)的试剂。
8.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，用于制备用于治疗或预防新冠病毒引起的疾病的药物。
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