CN117384864A - 表达SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了表达SARS‑CoV‑2Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用。本发明提供的重组腺病毒是将重组质粒转染腺病毒包装细胞然后进行细胞培养得到的。所述重组质粒为将编码序列3所示蛋白质的DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的。本发明在黑猩猩腺病毒载体的△E1区域插入全长SARS‑CoV‑2Omicron变异株Spike蛋白变体的编码基因，通过腺病毒侵染细胞将遗传物质导入靶细胞中转录表达相应的抗原蛋白。蛋白变体中具有膜锚定信号肽、跨膜区和胞内区，所以表达好的蛋白不会分泌到胞外，而是模拟病毒颗粒表面刺突，插在靶细胞的膜上从而起到免疫原的作用，刺激机体产生免疫反应。

Description

表达SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及表达SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)出现在全球多个国家和地区。多数SARS-CoV-2感染病人均会出现严重的呼吸道疾病。由于这种疾病可以人传染给人，因此引起了全世界的高度关注，成为影响人类健康的重大威胁之一。
随着传播进程，SARS-CoV-2产生了许多突变，导致新变异株的传播能力不断增强，并产生了不同程度的免疫逃逸，主要流行变异株例如Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株和Omicron株等。变异株的出现导致疫苗的保护效力产生不同程度的下降，许多单克隆抗体也对突变株的中和活性减弱甚至完全失去中和活性。发现预防新型变异株病毒的疫苗成为阻止疫情持续爆发的重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供表达SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用。
本发明提供的重组腺病毒，为表达序列表的序列3所示蛋白质的重组腺病毒。
本发明还保护蛋白质，为序列表的序列3所示的蛋白质。
序列表的序列3所示的蛋白质即全长SARS-CoV-2 Omicron变异株Spike蛋白变体。
本发明还保护编码所述蛋白质的核酸分子。
所述核酸分子具体可为DNA分子。
所述DNA分子具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。
本发明还保护重组质粒，为将编码序列表的序列3所示蛋白质的DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的重组质粒。
编码序列表的序列3所示蛋白质的DNA分子具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。
所述黑猩猩腺病毒载体可为源于Simian adenovirus 25(NCBI ReferenceSequence:AC_000011.1)的腺病毒载体。
所述黑猩猩腺病毒载体中，对Simian adenovirus 25进行了如下改造：E1和E3部分区域均已删除，E1部分区域删除使得产生的重组病毒不能在普通细胞复制以增强其生物安全性，E3区域部分删除增加了外源基因的插入容量。
所述黑猩猩腺病毒载体具体可为pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体。
pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体为环形质粒，如序列表的序列5所示。
所述重组质粒中，DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体的△E1区域。
所述重组质粒中，用所述DNA分子取代pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体的两个SrfI酶切位点之间的小片段。
本发明还保护重组腺病毒，是将以上任一所述重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的。
所述细胞培养可为单次细胞培养。
所述细胞培养可为多次连续细胞培养。
所述细胞培养为多次连续细胞培养时，第一次细胞培养为将重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，从第二次细胞培养开始，每次细胞培养的步骤均为：将上一代细胞培养完成后收集细胞并破碎后收集的上清液感染新的腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，最后一次细胞培养后，收集细胞并破碎，然后收集的上清液，进行病毒纯化，得到病毒液。
所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：
(1)将线性化的重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成；
(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液。
所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：
(1)将线性化的重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成；
(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
(3)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
(4)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
(5)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
(6)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
(7)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
(8)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
(9)取上清液，进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得病毒液。
线性化的重组质粒具体为：采用限制性内切酶PacI酶切重组质粒得到的大片段(约31kb)。
本发明还保护一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括以上任一所述重组质粒和腺病毒包装细胞。
所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。所述腺病毒包装细胞具体为HEK293A细胞。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组腺病毒。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述蛋白质或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组质粒。
所述产品的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)作为新型冠状病毒抑制剂；
(e2)作为新型冠状病毒疫苗；
(e3)作为抗新型冠状病毒药物。
本发明还保护以上任一所述重组腺病毒的应用。
本发明还保护以上任一所述蛋白质或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组质粒的应用。
本发明还保护所述试剂盒的应用。
以上任一所述应用为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)制备新型冠状病毒抑制剂；
(f2)制备新型冠状病毒疫苗；
(f3)制备抗新型冠状病毒药物。
所述重组腺病毒可以引起生物体产生抗体，抗体对新型冠状病毒具有中和作用。
以上任一所述新型冠状病毒具体可为新型冠状病毒奥密克戎毒株(SARS-CoV-2Omicron)。
本发明中包含1种SARS-CoV-2抗原蛋白形式：全长S蛋白尽可能地保证原始的S结构，不仅保留膜锚定信号肽，还保留了S2后部的跨膜区和胞内区，S2亚单位包含2个氨基酸突变(序列1中的第983-984位氨基酸残基“KV”替换为了“PP”)使得S蛋白保持更加稳定的三聚体构象，尽可能地模拟刺突蛋白锚定在细胞表面的状态，在其S1和S2亚单位切割位点包括3个氨基酸突变位点(序列1中的第679-682位氨基酸残基“RRAR”替换为了“GSAS”)使得S蛋白中的S1和S2亚单位保持完整，从而作为一个强有力的免疫原。
本发明在黑猩猩腺病毒载体的△E1区域插入全长SARS-CoV-2Omicron变异株Spike蛋白变体的编码基因，通过腺病毒侵染细胞，将遗传物质导入靶细胞中转录表达相应的抗原蛋白。全长SARS-CoV-2 Omicron变异株Spike蛋白变体中具有膜锚定信号肽(自带的信号肽“MFVFLVLLPLVSS”)、跨膜区和胞内区，所以表达好的蛋白不会分泌到胞外，而是模拟病毒颗粒表面刺突，插在靶细胞的膜上，从而起到免疫原的作用，刺激机体产生免疫反应。
本发明避免了人5型腺病毒载体预存免疫的缺陷，同时保留了腺病毒的高滴度、易生产储存的优点，对新型冠状病毒肺炎的根治提出了疫苗的有效策略，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中抗原表达鉴定的结果图。
图2为疫苗诱导的总抗体的检测结果。
图3为疫苗免疫后的动物血清中抗体中和活性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的质粒均已进行测序验证。
293F细胞：Thermo Fisher Scientific,R79007。质粒pcDNA3.1(+)：Invitrogen公司，产品目录号V790-20。293T细胞：盖德，CRL-11268。HEK293A细胞为腺病毒包装细胞，具有E1基因。hACE2-hela细胞(即文献中的“HeLa cell lines stably expressing the ACE2molecules”)，记载于如下文献：Wang,R.,Zhang,Q.,Ge,J.,Ren,W.,Zhang,R.,Lan,J.,Ju,B.,Su,B.,Yu,F.,Chen,P.,Liao,H.,Feng,Y.,Li,X.,Shi,X.,Zhang,Z.,Zhang,F.,Ding,Q.,Zhang,T.,Wang,X.&Zhang,L.Analysis of SARS-CoV-2variant mutations revealsneutralization escape mechanisms and the ability to use ACE2 receptors fromadditional species.Immunity54,1611-1621.e1615,doi:10.1016/j.immuni.2021.06.003(2021).。
实施例1、重组病毒的制备和鉴定
一、构建重组质粒
pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体为环形质粒，如序列表的序列5所示。pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体源于Simian adenovirus 25(NCBI Reference Sequence:AC_000011.1)，进行了如下改造：E1和E3部分区域均已删除，E1部分区域删除使得产生的重组病毒不能在普通细胞复制以增强其生物安全性，E3区域部分删除增加了外源基因的插入容量。pAdC68XY4pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体中具有两个SrfI酶切识别序列，该两个酶切识别序列之间的小片段中具有EGFP基因。应用pAdC68XY4pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体构建重组质粒时，选择两个SrfI酶切位点之间作为外源DNA分子的插入位点，该插入位置为△E1区域。
用序列表的序列4所示的双链DNA分子取代pAdC68XY4pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体的两个SrfI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒ChAdTS-Omicron。序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质，序列表的序列3所示的蛋白质即全长SARS-CoV-2 Omicron变异株Spike蛋白变体。
全长SARS-CoV-2 Omicron变异株Spike蛋白如序列表的序列1所示。与序列表的序列1相比，序列表的序列3的差异仅在于：将序列1中的第679-682位氨基酸残基“RRAR”替换为了“GSAS”，将序列1中的第983-984位氨基酸残基“KV”替换为了“PP”。
二、制备病毒液
细胞培养条件：37℃、5％CO2的恒温培养箱。
1、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。
2、取重组质粒，采用限制性内切酶PacI进行酶切以释放重组病毒基因组，回收约31kb的大片段。
3、借助X-tremeGENE HP DNA转染试剂将步骤2得到的大片段转染完成步骤1的细胞并培养6小时(采用无血清DMEM培养基)，然后将细胞转移至含10％胎牛血清的DMEM培养基培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成(约10-14天)。
4、完成步骤3后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P0代上清)。
5、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。
6、将P0代上清感染完成步骤5的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。
7、完成步骤6后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P1代上清)。
8、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。
9、将P1代上清感染完成步骤8的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。
10、完成步骤9后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P2代上清)。
11、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。
12、将P2代上清感染完成步骤11的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。
13、完成步骤12后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P3代上清)。
14、取P3代上清，进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得病毒液。
步骤2中采用重组质粒ChAdTS-Omicron时，进行上述步骤得到的病毒液命名为ChAdTS-Omicron病毒液。
步骤2中用pAdC68XY4 pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体代替重组质粒，进行上述步骤，得到的病毒液命名为ChAdTS病毒液。
三、酶切鉴定
供试病毒液：ChAdTS-Omicron病毒液或ChAdTS病毒液。取供试病毒液，提取基因组DNA。取基因组DNA，采用限制性内切酶NheI酶切，然后电泳检测。ChAdTS-Omicron病毒液显示7条大于250bp的条带，ChAdTS病毒液显示3条大于250bp的条带。
阳性对照：重组质粒ChAdTS-Omicron或pAdC68XY4pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体。取阳性对照，采用限制性内切酶NheI和限制性内切酶PacI进行酶切，然后电泳检测。重组质粒ChAdTS-Omicron显示7条大于250bp的条带，pAdC68XY4pAdC68-ΔE1(GFP)-ΔE3(SwaI)-E4(orf3-6Hu5)载体显示3条大于250bp的条带。
四、病毒的鉴定
1、滴度鉴定
供试病毒液：ChAdTS-Omicron病毒液或ChAdTS病毒液。
采用吸光光度值法检测供试病毒液的滴度。
病毒滴度＝OD260×稀释倍数×1.1×1012。
病毒滴度的单位为病毒颗粒数/毫升(vp/mL)。
ChAdTS-Omicron病毒液的滴度为8.6×1012vp/mL。
ChAdTS病毒液的滴度为1.5×1013vp/mL。
2、抗原表达的鉴定
供试病毒液：ChAdTS-Omicron病毒液或ChAdTS病毒液。
细胞培养条件：37℃、5％CO2的恒温培养箱。
①将HEK293A细胞以5×105个细胞/孔的密度接种六孔板，培养至细胞密度为90％左右。
②用供试病毒液感染完成步骤①的细胞(供试病毒液为ChAdTS-Omicron病毒液时，感染剂量分别设置为1010vp/孔、109vp/孔或108vp/孔；供试病毒液为ChAdTS病毒液时，感染剂量设置为1010vp/孔)，设置3个重复处理。培养24小时，然后收集细胞。
③取步骤②收集的细胞，分别进行细胞裂解，然后收集上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行Western Blot(一抗采用抗SARS-CoV-2Spike S2亚基的兔多克隆抗体)。β-actin蛋白作为内参。抗SARS-CoV-2Spike S2亚基的兔多克隆抗体的信息如下：SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S2 Antibody,Rabbit PAb,Antigen Affinity Purified：义翘神州，40590-T62。
结果见图1。
实施例2、重组病毒的应用
动物免疫使用的病毒液均为实施例1制备的病毒液。
一、动物免疫
6周龄的雌性BALB/C小鼠，分成2组，每组5只，分别处理如下：
第一组(G1组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为ChAdTS-Omicron病毒液(单只小鼠给予的病毒量为1×1010vp)；
第二组(G2组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为ChAdTS病毒液(单只小鼠给予的病毒量为1×1010vp)；
以上各组中，肌肉注射方式免疫的免疫体积均为每只小鼠100μl，用pH7.2的PBS缓冲液作为溶剂调整病毒浓度。
免疫后第八周采血一次(脸颊取血)。
二、SARS-CoV-2 Omicron假病毒的制备
表达全长SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的质粒(命名为SARS-CoV-2 Omicron质粒)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的SARS-CoV-2 Omicron假型病毒，其感染性同活病毒相似。骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase，即含有Luciferase的骨架质粒pNL4-3R-E(即文献中的vector with theluciferase gene containing backbone pNL4-3R-E)：Wang Q,Liu L,Ren W,Gettie A,Wang H,Liang Q,Shi X,Montefiori DC,Zhou T,Zhang L.Cell Rep.2019。
将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pcDNA3.1(+)载体的BamHII和EcoRI酶切位点之间，得到SARS-CoV-2 Omicron质粒。序列表的序列2所示的双链DNA分子表达序列表的序列1所示的蛋白质。
将SARS-CoV-2 Omicron质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，37℃静置孵育(采用含10％胎牛血清的DMEM培养基)，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有SARS-CoV-2 Omicron假病毒的病毒液(简称SARS-CoV-2 Omicron病毒液)。
三、SARS-CoV-2 Omicron Spike蛋白的制备
1、将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pcDNA3.1(+)载体的BamHI和HindIII酶切位点，得到重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2 Omicron Spike6P。
序列表的序列7所示的DNA分子编码序列表的序列6所示的蛋白质。将序列表的序列6所示的蛋白质命名为SARS-CoV-2 Omicron Spike6P胞外区融合蛋白，简称SARS-CoV-2OmicronS蛋白。SARS-CoV-2 OmicronS蛋白以三聚体形式存在，三聚体的预期分子量为420kDa。
序列表的序列6中，第1-13位氨基酸残基组成信号肽，第14-1210位氨基酸残基组成SARS-CoV-2 OmicronSpike 6P胞外区，第1213-1242位氨基酸残基组成三聚体标签，第1243-1250位氨基酸残基组成3C酶切位点，第1252-1259位氨基酸残基组成His8标签，第1262-1269位氨基酸残基组成strep-II标签，第1270-1282位氨基酸残基组成连接肽，第1283-1290位氨基酸残基组成strep-II标签，第1293-1300位氨基酸残基组成Flag标签。
2、借助PEI转染试剂，将步骤1得到的重组质粒转染293F细胞，采用SMM293-TII培养基培养72h，然后4000rpm离心30min，收集含SARS-CoV-2 OmicronS蛋白的上清液。
3、取步骤3得到的含SARS-CoV-2 OmicronS蛋白的上清液进行蛋白纯化。
(1)亲和层析
亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm。
亲和层析的柱填料：Strep-Tactin琼脂beads(购自iba公司，产品目录号为2-1201-025)。
依次进行如下操作步骤：①将含SARS-CoV-2 OmicronS蛋白的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育3小时；②用50mL BufferW(pH8.0，含100mM Tris/HCl、150mM NaCl、1mMEDTA)洗涤柱子；③用10mL含2.5mM Desthiobiotin的BufferW洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。
(2)取亲和层析后得到的过柱后溶液，用30kD浓缩管(购自Merck公司，产品目录号为UFC800396)进行浓缩，得到体积为1mL的浓缩液。
(3)凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的层析柱规格：长度24cm，内径2cm。
凝胶过滤层析的柱填料：superdex200 increase 10/300GL(购自GEHealthcare公司，产品目录号为28-9909-44)。
进行如下操作步骤：上样0.5mL步骤(2)得到的浓缩液，用流速为0.5mL/min的PBS缓冲液(pH7.2、10mM)洗脱，收集目标峰对应的过柱后溶液，即为纯化后蛋白液，命名为SARS-CoV-2 OmicronS蛋白溶液。
四、疫苗诱导的总抗体的检测
取步骤一得到血样，分离血清，采用ELISA进行总IgG的检测。总IgG检测中，用步骤三制备的SARS-CoV-2 OmicronS蛋白包被酶标板(100ng蛋白/孔)，血清先稀释至200倍体积、然后进行3倍梯度稀释(共8个稀释度，稀释用溶剂为pH7.2的PBS缓冲液)，二抗为Anti-mouse IgG HRP。
ED50值(半最大效应稀释倍数)：能引起50％最大效应的稀释倍数。
第八周小鼠血清的结合曲线图见图2。
第八周，各组小鼠血清的ED50值见表2(N.D代表检测结果为阴性)。
表2
组别 ED50值
G1组 16091.6
G2组 N.D.
五、疫苗免疫后的动物血清中抗体中和活性检测
待测溶液：取步骤一得到血样，分离获得的血清。
1、采用含10％FBS的DMEM培养基将待测溶液稀释至48倍，然后3倍梯度稀释，依次得到血清浓度不同的稀释液。
2、将100微升步骤1得到的稀释液与50微升步骤二制备的SARS-CoV-2 Omicron病毒液(病毒含量为100TCID50)混合，37℃静置孵育1小时。设置用100微升含10％FBS的DMEM培养基代替100微升稀释液的空白对照。
3、完成步骤2后，加入50微升hACE2-hela细胞的细胞液(约含2×104个hACE2-hela细胞)，37℃静置孵育48小时(实际应用中，48-72小时均可)。
4、完成步骤3后，加入100μl PBS缓冲液和50μl细胞裂解液(Bright-GloTMLuciferase Assay System，Promega，E2650)，静置2min，然后用化学发光仪检测荧光素酶活性。
每种处理设置3个复孔，结果取平均值。
中和活性＝(空白对照组的荧光强度-加入稀释液的实验组的荧光强度)/空白对照组的荧光强度×100％。
中和活性为50％时对应的血清稀释倍数即位ID50。
第八周小鼠血清的中和曲线图见图3。
第八周，各组小鼠血清的ID50值见表3(N.D代表检测结果为阴性)。
表3
组别 ID50值
G1组 937.24
G2组 N.D.
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.表达序列表的序列3所示蛋白质的重组腺病毒。
2.序列表的序列3所示的蛋白质。
3.编码权利要求2所述蛋白质的核酸分子。
4.将编码序列表的序列3所示蛋白质的DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的重组质粒。
5.重组腺病毒，是将权利要求4所述重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的。
6.一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括权利要求4所述重组质粒和腺病毒包装细胞。
7.一种产品，其活性成分为权利要求1或5所述重组腺病毒或者为权利要求2所述蛋白质或者为权利要求3所述核酸分子或者为权利要求4所述重组质粒；
所述产品的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)作为新型冠状病毒抑制剂；
(e2)作为新型冠状病毒疫苗；
(e3)作为抗新型冠状病毒药物。
8.权利要求1或5所述重组腺病毒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)制备新型冠状病毒抑制剂；
(f2)制备新型冠状病毒疫苗；
(f3)制备抗新型冠状病毒药物。
9.权利要求2所述蛋白质或者权利要求3所述核酸分子或者权利要求4所述重组质粒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)制备新型冠状病毒抑制剂；
(f2)制备新型冠状病毒疫苗；
(f3)制备抗新型冠状病毒药物。
10.权利要求6所述试剂盒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)制备新型冠状病毒抑制剂；
(f2)制备新型冠状病毒疫苗；
(f3)制备抗新型冠状病毒药物。
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