CN115925893A - 一种抗新型冠状病毒的中和抗体d7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗新型冠状病毒的中和抗体d7及其应用。本发明提供的抗SARS‑CoV‑2的抗体d7的重链可变区中H‑CDR1、H‑CDR2和H‑CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、2和3所示；轻链可变区中L‑CDR1、L‑CDR2和L‑CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、5和6所示。本发明制备了一种抗SARS‑CoV‑2的中和抗体d7。实验证明，抗体d7能够特异性结合SARS‑CoV‑2的S蛋白RBD，能够中和多种SARS‑CoV‑2流行突变株。本发明所提供的抗体可用于冠状病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。

Description

一种抗新型冠状病毒的中和抗体d7及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗新型冠状病毒的中和抗体d7及其应用。

背景技术

SARS-CoV-2是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，其基因组编码4种结构蛋白，分别是突刺(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)，以及8种辅助蛋白。 SARS-CoV-2病毒在氨基酸水平上与SARS-CoV非常相似，但存在一些显著差异。与其他人畜共患病冠状病毒一样，SARS-CoV-2表面存在大量突刺(Spike,S)蛋白，由 S1和S2亚基组成，形成一个同源三聚体病毒刺突，它们与宿主细胞表面的特定蛋白质受体相互作用。在与细胞受体结合后，S蛋白被宿主细胞的蛋白酶的酶切割，激活了病毒和细胞膜的融合。这种相互作用由S1受体结合域(receptor-binding domain, RBD)介导，RBD与宿主细胞受体血管紧张素转换酶-2(hACE2)的肽酶域(PD)结合。 S1中包含直接与ACE2结合的受体结合域(RBD)和N端结构域(NTD)。结构学研究显示 S蛋白有着不同的构象。在预融合阶段，RBD在封闭构象和开放构象之间切换，用于 hACE2相互作用。这两种状态被称为“向下”构象和“向上”构象，其中向下对应于受体不可结合状态，向上对应于受体可结合状态，后者被认为不太稳定。在融合后阶段，受体结合使融合前三聚体失配，导致S1亚基脱落，S2亚基发生构象变化，从而触发宿主膜融合。

中和抗体是宿主免疫应答病毒病原体的关键成分，而用于治疗COVID-19的抗体疗法正在开发。SARS-CoV-2的S蛋白是中和抗体的主要靶点，一些单克隆抗体的单一疗法和联合疗法已获得紧急使用授权用于COVID-19治疗，更多的疗法正在开发中。虽然目前已经研发了多种有针对性的抗体，但是新冠病毒还在不断传播，新的基因突变随时可能产生，并且会改变新冠病毒的传播力和免疫逃逸能力。目前已经报道了以 SARS-CoV-2的几种代表性突变株：Alpha、Beta、Gamma、Delta以及Omicron等，已有研究显示一些突变发生在病毒与中和抗体结合的关键位置，从而导致病毒对某些单克隆抗体产生逃逸。在突变方面，这种病毒正朝着一个最终可能导致逃避我们目前针对病毒S蛋白的治疗和预防干预的方向发展。如果病毒继续肆虐传播，更多的关键突变就会不断累积。因此，发展新的治疗和预防方法仍然是必要的，具有更强中和活性和更高覆盖度的新冠抗体的研发仍然非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗新型冠状病毒的中和抗体及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种抗SARS-CoV-2的抗体。

本发明所要求保护的抗SARS-CoV-2的抗体，命名为d7，其重链可变区中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述抗体的轻链可变区中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示。

其中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3为重链可变区中的三个互补决定区，L-CDR1、 L-CDR2和L-HCDR3为轻链可变区中的三个互补决定区。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.7自N端起第1-120位，或者与SEQ ID No.7自N端起第1-120位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8自N端起第1-110位，或者与SEQ ID No.8自N端起第1-110位具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区 (FR))。

更进一步地，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.7，或者与SEQ ID No.7具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQID No.8或者与SEQ ID No.8具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。

第二方面，本发明要求保护一种源自于前文第一方面所述抗体的抗原结合片段。

其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体、双特异抗体或多特异抗体。

dAb由VH或VL结构域组成，是一些最小功能性抗体片段，保留完整的抗原结合特异性。dAb约为正常抗体分子量的十分之ー。尽管dAb仅包含来自亲和抗体的六个互补決定区中的三个，但它们确实表现出抗原结合特异性和亲和力。dAb在苛刻的温度压力和化学变性条件下可以保持显著的稳定性。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb，简称双抗)是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。

第三方面，本发明要求保护一种核酸分子。

本发明要求保护的核酸分子编码前文第一方面所述的抗体或前文第二方面所述的抗原结合片段。

进一步地，在所述核酸分子中，编码所述重链可变区中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.9自5’端起第79-105位、第148-177位、第292-324 位所示。在所述核酸分子中，编码所述轻链可变区中L-CDR1、L-CDR2和L-HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.10自5’端起第67-99位、第157-186位、第271-300 位。

更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.9自5’端起第1-360位或者与SEQ ID No.9自5’端起第1-360位具有至少90％的一致性；编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.10自5’端起第1-330 位或者与SEQ IDNo.10自5’端起第1-330位具有至少90％的一致性。

更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述重链的核苷酸序列为SEQ ID No.9或者与SEQ ID No.9具有至少90％的一致性；编码所述轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.10 或者与SEQ ID No.10具有至少90％的一致性。

第四方面，本发明要求保护含有前文第一方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

在本发明的具体实施方式中，将SEQ ID No.9(抗体重链的编码基因)克隆到pcDNA3.1载体的酶切位点NheI和XbaI之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体；将SEQ ID No.10(抗体轻链的编码基因)克隆到pcDNA3.1载体的酶切位点NheI 和XbaI之间后得到表达所述抗体的轻链的重组表达载体。所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链和轻链的两个重组表达载体共转染293F细胞后得到的重组细胞。

第五方面，本发明要求保护一种药物组合物。

本发明要求保护的药物组合物包含：

(A1)前文第一方面所述的抗体或前文第二方面所述的抗原结合片段；以及

(A2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

第六方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

(B1)前文第三方面所述的核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌在制备前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第五方面所述药物组合物中的应用；

(B2)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述的抗原结合片段在制备前文第五方面所述药物组合物中的应用；

(B3)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2感染所致疾病的产品中的应用；

(B4)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于抑制SARS-CoV-2感染的产品中的应用；

(B5)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的产品中的应用；

(B6)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2的产品中的应用；

(B7)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的S蛋白或S蛋白的RBD的产品中的应用；

(B8)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述抗原结合片段或前文第三方面所述核酸分子或前文第四方面所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或前文第五方面所述药物组合物在制备用于结合SARS-CoV-2的S蛋白或S蛋白的RBD的产品中的应用。

本发明制备了一种抗SARS-CoV-2的中和抗体d7。实验证明，抗体d7能够特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白RBD，能够中和多种SARS-CoV-2流行突变株。本发明所提供的抗体可用于冠状病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。

附图说明

图1为pCDNA3.1(+)的骨架序列。

图2为经Protein G纯化后抗体d7洗脱纯化的SDS-PAGE结果图。

图3为抗体d7对SARS-CoV-2各流行毒株的中和实验结果图。

图4为抗体d7对SARS-CoV-2及几种流行毒株S-RBD的SPR实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗SARS-CoV-2的中和抗体d7的制备

一、用于表达抗体d7的重组表达载体的构建

本发明所涉及的抗SARS-CoV-2的中和抗体d7(重链恒定区为IgG1，轻链为Kappa)的重链氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。其中， SEQID No.7的第1-120位为重链可变区(第27-35位、第50-59位和第98-108位为三个CDR)；SEQID No.8的第1-110位为轻链可变区(第23-33位、第53-62位和第91-100位为三个CDR)。

将抗体d7的蛋白序列转化为DNA序列(重链编码基因如SEQ ID No.9所示，轻链编码基因如SEQ ID No.10所示)，在SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的前后两端通过overlapping PCR分别加入NheI(GCTAGC)和XbaI(TCTAGA)双酶切位点和同源臂后通过Gibson Assembly连接到双酶切(NheI和XbaI)的pCDNA3.1(+)载体上，连接产物转入DH5α菌体扩增并提质粒，获得表达载体。图1展示了pCDNA3.1(+)的骨架序列。最终经测序验证正确的连入SEQ ID No.9的重组质粒命名为pCDNA3.1-H，连入 SEQ ID No.10的重组质粒命名为pCDNA3.1-L。

pCDNA3.1-H结构描述：在pCDNA3.1(+)载体的NheI和XbaI之间克隆入SEQ ID No.9所示DNA片段后得到的重组质粒。

pCDNA3.1-L结构描述：在pCDNA3.1(+)载体的NheI和XbaI之间克隆入SEQ IDNo.10所示DNA片段后得到的重组质粒。

二、大规模培养/1L摇瓶的转染

根据标准操作手册培养悬浮培养293F细胞(ThermoFisher),一般是250ml的细胞培养摇瓶开始培养30ml-100ml的体积。按照0.5×10⁶cells/ml的接种量往1L 摇瓶的300ml培养基中接种细胞，于37℃，120rpm,5％二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育直到细胞密度达到1×10⁶cells/ml。吸取300μg的DNA(即步骤一得到的重组表达载体pCDNA3.1-H和pCDNA3.1-L各150μg)加到30ml的PBS中将1.2ml过滤除菌的PEI溶液(0.5mg/ml)加入到PBS/DNA的混合液中，静置20min，加入细胞。转染后，摇床培养箱中孵育48h。3000g,5min离心分离细胞培养基上清与细胞沉淀，收获培养基上清。

三、从细胞培养基上清中提取的蛋白复合物的纯化

步骤二转染后培养了48h的培养基上清经过0.45μm的滤膜过滤。每升的过滤上清使用1.25ml的Protein G柱料(Cytiva)孵育，用10mM柠檬酸/200mM NaCl缓冲液进行洗脱，再经过Q-sepharose离子交换柱(Cytiva)分离，上样缓冲液为10mM 磷酸缓冲液/200mMNaCl，随后用Sephacryal 200凝胶层析柱(Cytiva)纯化，上柱后用10mM磷酸缓冲液/150mMNaCl缓冲液进行洗脱，洗脱液即为d7抗体原液。

取10μl浓缩蛋白的样品，加入2×蛋白上样buffer做电泳检测。用0.22μm 滤器过滤蛋白。图2展示了从瞬时转染2L(8×250ml)的293F培养基上清液中提取的d7抗体重链和轻链目的蛋白。从图2的SDS-PAGE电泳图可知，在d7抗体重链和轻链菌体表达的细胞上清中分别在48-63KDa分子量和25KDa分子量左右处有目的蛋白表达，目的蛋白分子量与理论值相近(重链50KD和轻链25KD)(因蛋白存在糖基化过程，因此实际分子量略大于理论值)，且经纯化后基本无杂带。构建好的表达菌株冻存到-80℃冰箱备用。经估算，1L培养基的纯化蛋白产量接近1mg。

实施例2、抗体d7和SARS-CoV-2假病毒中和测定

假病毒中和实验即以水疱性口炎病毒(VSV)为基本骨架，将其受体结合蛋白G 蛋白替换成SARS-CoV-2的Spike蛋白，从而模拟其进入细胞以及被药物抑制的过程。与体外实验相比，假病毒模拟了病毒侵染细胞的过程，实验结果更加真实，可靠。抗体d7在体外实验中表现十分出色，因而需要进一步的实验证实其治疗效果。

一、假型病毒的制备

根据我们先前的研究，构建了SARS-CoV-2的假型病毒和突变株。具体如下：在转染前一天，将293T细胞消化并调整至5×10⁵–7×10⁵cells/mL的浓度。然后，将 15ml培养基中的细胞转移到T75细胞培养基中，并在37℃下用5％CO₂在培养箱中培养过夜。当细胞达到70％-90％覆盖度时，弃掉清液，并使用浓度为7×10⁴TCID₅₀/mL 的15ml的VSV-ΔG-荧光素酶质粒表达载体系统(Kerafast：EH1008)进行感染。同时，将30μg不同流行株的S蛋白表达质粒(以图1的pCDNA3.1(+)为载体，所有的几个S蛋白编码基因插入到pCDNA3.1(+)载体的酶切位点NheI和XbaI之间后得到的重组质粒)分别转入细胞。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。6-8小时后弃掉细胞上清液，并用PBS+1％FBS轻轻冲洗细胞两次，向T75细胞培养瓶中添加15mL新鲜DMEM。在37℃和5％CO₂的培养箱中培养24小时后，收集含有假型病毒的培养上清液，过滤，分装，得到病毒表面分别带有S-WT、S-alpha、S-beta、S-gamma、S-delta、S-lambda或S-Mu(分别表示野生型SARS-CoV-2、SARS-CoV-2的alpha、beta、gamma、 delta、lambda和Mu流行株的S蛋白)的VSV假型病毒，在-80℃下冷冻保存以供后续使用。

其中，7种SARS-CoV-2的S蛋白分别来自：野生型SARS-CoV-2、SARS-CoV-2的alpha、beta、gamma、delta、lambda和Mu流行株。来自野生型SARS-CoV-2(即Wuhan-Hu-1毒株)的S蛋白的氨基酸序列同NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1，对应编码基因序列为NCBI Reference Sequence:NC_045512.2 (21563..25384)，NCBI Gene ID为43740568；来自alpha流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：第69-70位氨基酸残基缺失，第144位氨基酸残基缺失，N501Y，A570D，D614G，P681H，T716I，S982A，D1118H，对应编码基因相比NC_045512.2(21563..25384)发生以下变化：第205-210位核苷酸缺失，第 430-432位核苷酸缺失，第1501-1503位突变为tat，第1708-1710位突变为gat，第1840-1842位突变为ggt，第2041-2043位突变为cat，第2146-2148位突变为atc，第2944-2946位突变为gcc，第3352-3354位突变为cac；来自beta流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：L18F，D80A，D215G，第242-244 位氨基酸残基缺失，K417N，E484K，N501Y，D614G，A701V，对应编码基因相比 NC_045512.2(21563..25384)发生以下变化：第52-54位突变为ttc，第238-240位突变为gcc，第643-645位突变为ggc，第724-732位核苷酸缺失，第1249-1251位突变为aat，第1450-1452位突变为aag，第1501-1503位突变为tat，第1840-1842 位突变为ggt，第2101-2103位突变为gta；来自gamma流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，K417T，E484K，N501Y，D614G，H655Y，T1027I，V1176F，对应编码基因相比NC_045512.2(21563..25384)发生以下变化：第52-54位突变为ttc，第58-60位突变为aac，第 76-78位突变为tct，第412-414位突变为tac，第568-570位突变为agc，第1249-1251 位突变为agc，第1450-1452位突变为aag，第1501-1503位突变为tat，第1840-1842 位突变为ggt，第1963-1965位突变为tat，第3079-3081位突变为atc，第3526-3528 位突变为ttc；来自delta流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：T19R，G142D，第156-157位氨基酸残基缺失，R158G，L452R，T478K，D614G， P681R，D950N，对应编码基因相比NC_045512.2(21563..25384)发生以下变化：第 55-57位突变为aga，第424-426位突变为gag，第466-471位核苷酸缺失，第472-474 位突变为ggc，第1354-1356位突变为aga，第1432-1434位突变为aag，第1840-1842 位突变为ggc，第2041-2043位突变为aga，第2848-2850位突变为aac；来自lambda 流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：G75V，T76I，第246-252位氨基酸残基缺失，L452Q，F490S，D614G，T859N，对应编码基因相比 NC_045512.2(21563..25384)发生以下变化：第223-225位突变为gtt,第226-228 位突变为att,第736-756位核苷酸缺失，第1354-1356位突变为cag,第1468-1470 位突变为tct,第1840-1842位突变为ggt,第2575-2577位突变为aat；来自Mu流行株的S蛋白的氨基酸序列相比YP_009724390.1发生以下变化：T95I、Y144S、Y145N、 R346K、E484K，N501Y、D614G、P681H和D950N，对应编码基因相比NC_045512.2 (21563..25384)发生以下变化：第283-285位突变为att,第430-432位突变为tct, 第433-435位突变为aac,第1036-1038位突变为aaa,第1450-1452位突变为aaa, 第1501-15203位突变为tat,第1840-1842位突变为ggt,第2041-2043位突变为 cat，第2848-2850位突变为aac。

二、假型病毒感染抑制试验

对步骤一收集到的假病毒进行RT-PCR定量分析后，将各假型病毒均稀释至滴度为2×10⁵TCID₅₀/mL，并取100μL加入96孔细胞培养板中。对REGN10933、REGN10987、 LY-cov555、JS016、AZD1061、S309、VHH-72(武汉科斯坦生物科技有限公司：CSD00700、CSD00701、CSD00702、CSD00717、CSD00704、CSD00715、CSDVV00316)和d7样品分别在96孔板中进行梯度稀释(100nM开始3倍稀释，共8个梯度)，加入对应的已加入病毒溶液的孔中。在孔板上设置8个仅加入病毒溶液的对照组和8个仅有细胞的对照组。37℃下孵育1小时，野生型ACE2过表达细胞(翌圣生物科技(上海)：41107ES03) 用胰蛋白酶消化，并以2×10⁴/100μL细胞浓度添加到96孔板的每个孔中。在含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养24小时后，检测荧光素酶基因表达的变化，以评估野生型d7抗体和7种商业化抗体(表1)分别对假病毒感染ACE2过表达细胞的中和效果。向每个孔中添加100μL荧光素酶底物(Perkinlemer)，在室温下培养2分钟，然后转移到检测白板上，并使用光度计(Perkinlemer)进行测量。每组包含两次重复实验。使用Reed–Muench方法计算每个样品的EC₅₀值。

表1、7种商业化抗体信息

Casirivimab(REGN10933)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00700
			Imdevimab(REGN10987)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00701
Bamlanivimab(LY-cov555)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00702
			Etesevimab(JS016)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00717
Cilgavimab(AZD1061)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00704
			Sotrovimab(S309)	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSD00715
VHH-72	武汉科斯坦生物科技有限公司	CSDVV00316

结果如图3可以看出，抗体d7对于实验中的所有突变体假病毒都有极强的抑制作用，从EC50的计算结果可以看出，其抑制作用明显优于其他抗体，且与对各种突变病毒效果都最好的Cilgavimab单抗和Imdevimab单抗相比，抗体d7对假病毒的抑制作用提高了一个数量级。

实施例3、d7抗体和SARS-CoV-2S蛋白RBD的亲和力测定

对于典型的亲和力的测定，实验中使用了Biacore 2000仪器，其检测原理基于表面等离子共振技术(SPR)，能够灵敏地反映芯片表面的折光率变化。为研究分子间的相互作用，其中一个分子被固定到芯片表面上，另一个分子以溶液的形式流过表面。 SPR的响应值与芯片附近的质量浓度变化成正比。

在典型的测试中，选取CM5芯片测定d7抗体和SARS-CoV-2Spike-RBD之间的蛋白-蛋白相互作用。CM5芯片基于共价偶联的策略，具有中等容量和通用的特性。运行缓冲液为HBS-EP(Cytiva)。SARS-CoV-2RBD或beta-RBD或delta-S1(义翘神州：40592-V08H、40592-V08H85-B、40591-V49H2-B)(20ng/μl)溶解在醋酸钠缓冲液(pH 4.5)中，作为配体固定在芯片上，固定时流速为5μl/min，大约30s 后停止，固定量约为60RU。分析物为d7抗体，浓度从100到1.56nM(每个梯度间为 2倍稀释)，稀释剂为运行缓冲液。流量设定为45μl/min，结合时间设定为180秒，解离时间为1800秒。每循环结束后使用pH1.5的甘氨酸溶液再生30秒，流速为 30μl/min。

反应过程中的信号曲线如图4所示。对于两种蛋白的结合，为了分析其动力学特征，可以假设二者符合简单相互作用模型，并假设[d7](分析物的浓度)为常数，因此结合过程的速率方程为：

而解离过程中，其速率方程为：

我们对全部浓度梯度的结合曲线进行拟合，得到表2的数据。

表2、d7抗体与几种Spike-RBD的分子互作参数

Spike	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(nM)
				WT-RBD	<![CDATA[1.30×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[1.92×10<sup>-4</sup>]]>	0.15
Beta-RBD	<![CDATA[1.73×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[1.05×10<sup>-4</sup>]]>	0.06
				Delta-S1	<![CDATA[5.10×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[1.11×10<sup>-4</sup>]]>	0.23

 d7抗体在测试中对SARS-CoV-2RBD或beta-RBD或delta-S1均表现出很强的 RBD亲和力，可以看出，该蛋白有较快的结合速率，并且解离曲线表明该蛋白的结合极其稳定。此外，综合考虑结合和解离过程，我们可计算出其解离常数KD，其数值小于nM量级。

该实施例体现了d7抗体与SARS-CoV-2RBD或beta-RBD或delta-S1蛋白的强亲和力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种抗SARS-CoV-2的抗体，其特征在于：所述抗体的重链可变区中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；和/或，所述抗体的轻链可变区中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.7自N端起第1-120位，或者与SEQ ID No.7自N端起第1-120位具有至少90％的一致性；

和/或

所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8自N端起第1-110位，或者与SEQ ID No.8自N端起第1-110位具有至少90％的一致性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQID No.7，或者与SEQ ID No.7具有至少90％的一致性；

和/或

所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.8或者与SEQ ID No.8具有至少90％的一致性。

4.源自于权利要求1-3中任一所述抗体的抗原结合片段。

5.根据权利要求4所述的抗原结合片段，其特征在于：所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体、双特异抗体或多特异抗体。

6.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1-3中任一所述的抗体或权利要求4或5所述的抗原结合片段。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：在所述核酸分子中，编码所述重链可变区中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.9自5’端起第79-105位、第148-177位、第292-324位所示；

和/或

在所述核酸分子中，编码所述轻链可变区中L-CDR1、L-CDR2和L-HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.10自5’端起第67-99位、第157-186位、第271-300位；

和/或

在所述核酸分子中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.9自5’端起第1-360位或者与SEQ ID No.9自5’端起第1-360位具有至少90％的一致性；编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.10自5’端起第1-330位或者与SEQ ID No.10自5’端起第1-330位具有至少90％的一致性；

和/或

在所述核酸分子中，编码所述重链的核苷酸序列为SEQ ID No.9或者与SEQ ID No.9具有至少90％的一致性；编码所述轻链的核苷酸序列为SEQ ID No.10或者与SEQ ID No.10具有至少90％的一致性。

8.含有权利要求6-7中任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

9.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含：

(A1)权利要求1-3中任一所述的抗体或权利要求4或5所述的抗原结合片段；以及

(A2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

10.应用，为如下任一所示：

(B1)权利要求6-8中任一所述的核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌在制备权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4或5所述的抗原结合片段或权利要求9所述药物组合物中的应用；

(B2)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4或5所述的抗原结合片段在制备权利要求9所述药物组合物中的应用；

(B3)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2感染所致疾病的产品中的应用；

(B4)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于抑制SARS-CoV-2感染的产品中的应用；

(B5)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的产品中的应用；

(B6)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2的产品中的应用；

(B7)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于检测SARS-CoV-2的S蛋白或S蛋白的RBD的产品中的应用；

(B8)权利要求1-9中任一所述抗体或所述抗原结合片段或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组细胞或所述重组菌或所述药物组合物在制备用于结合SARS-CoV-2的S蛋白或S蛋白的RBD的产品中的应用。

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