CN116547000A

CN116547000A - 经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途

Info

Publication number: CN116547000A
Application number: CN202180073894.5A
Authority: CN
Inventors: 高晓飞; 黄彦杰; 聂小千
Original assignee: West Lake Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Current assignee: West Lake Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2023-08-04
Also published as: WO2022089605A1; US20230399616A1

Abstract

本公开提供用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合到RBC的至少一种膜蛋白上的条件下进行，其中该分选酶识别基序在N端到C端方向的第5位处包含可选取代的羟基羧酸。本公开还提供通过本公开的方法获得的具有与之连接的活性剂的红细胞(RBC)、以及该RBC在递送活性剂如药物和探针中的用途。

Description

经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途

技术领域

本公开一般涉及经修饰的红细胞(RBC)，更具体而言，涉及经共价修饰的RBC及其在递送药物和探针中的用途。

背景技术

用于在多种人类疾病治疗中延长药物存留时间的药物递送系统的最新发展引起了广泛关注。然而，许多系统仍然面临各种挑战和局限，例如稳定性差、不需要的毒性和免疫反应[1]。红细胞(RBC)是人体中最常见的细胞类型，由于其独特的生物学特性，已作为理想的体内药物递送系统被广泛研究了30多年，所述特性包括：(i)广泛的体内循环范围；(ii)作为生物材料具有良好的生物相容性，具有较长的体内存活时间；(iii)大的表面积体积比；(iv)没有细胞核、线粒体和其他细胞器。

通过直接包载、非共价连接外源肽，或通过使蛋白质与RBC表面蛋白特异性抗体融合来安装蛋白质，RBC已被开发为药物递送载体。已经证明，这种修饰的红细胞在体内应用方面存在局限性。例如，包载会破坏细胞膜，从而影响工程化细胞的体内存活。此外，聚合物颗粒与红细胞的非共价连接很容易解离，有效载荷将在体内很快降解。

细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶[2]。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的野生型分选酶A(wt SrtA)识别LPXTG基序并在苏氨酸和甘氨酸之间切割以在酶和底物蛋白之间形成共价酰基-酶中间体。该中间体通过肽或蛋白质的亲核攻击而解体，其中所述肽或蛋白质通常在N端具有三个连续的甘氨酸残基(3×甘氨酸，G₃)。以前的研究已经在RBC上遗传过表达C端具有LPXTG基序的膜蛋白KELL，它可以通过使用wt SrtA连接到3×甘氨酸或G_(n≥3)修饰的蛋白质/肽的N端[3]。这些携带药物的RBC已在动物模型上显示出治疗疾病的功效。然而，这需要对造血干细胞或祖细胞(HSPCs)进行工程改造以及将这些细胞分化为成熟RBC的步骤，这极大地限制了其应用。

使用SrtA将蛋白质共价标记到细胞上，在科学研究和临床应用中具有广阔的前景。然而，此方法有一定的限制：首先，需要将LPXTG基序序列构建到有效载荷蛋白的C端；第二，由于转肽酶反应是可逆的，需要过量的亲核标记试剂以确保反应平衡朝向有利于产物形成的方向。

因此，本领域仍然需要改进的RBC递送系统。

发明概述

在一个一般方面，本发明提供了一种红细胞(RBC)，其具有与其连接的活性剂，其中该活性剂通过分选酶介导的反应，且优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，与RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选地n为1或2。

在一些实施方案中，RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地RBC是天然RBC，例如天然人RBC。

在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基基团缀合，优选缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。例如，mgSrtA包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成。

在一些实施方案中，活性剂在与RBC连接之前，在其C-末端包含分选酶识别基序。

在一些实施方案中，分选酶识别基序包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中，X是任何氨基酸；或包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中，*表示具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、可选取代的羟基羧酸，n为0至3的整数；并且X和Y独立地表示任何氨基酸。

在一些实施方案中，所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚血管紧张素转换酶2(ACE2)的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC-肽复合物、药物如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

在一些实施方案中，与活性剂连接的RBC表面上的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A¹-LPXT-P¹结构，其中LPXT与P¹中的甘氨酸_(n)连接；和/或包含A¹-LPXT-P²结构，其中LPXT与P²中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2，A¹表示活性剂，P¹和P²独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域，X表示任何氨基酸。

在另一个方面，本发明提供了一种红细胞(RBC)，其具有与RBC表面上的至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的活性剂，其中与活性剂连接的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A¹-LPXT-P¹结构，其中LPXT与P¹中的甘氨酸_(n)连接；和/或包含A¹-LPXT-P²结构，其中LPXT与P²中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2，A¹表示活性剂，P¹和P²独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白，X表示任何氨基酸。在一些实施方案中，所述连接至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。

在另一个方面，本发明提供了一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶将分选酶底物缀合到RBC的所述至少一种膜蛋白上的条件下进行，其中所述分选酶底物包含A¹-Sp-M的结构，其中A¹表示活性剂，Sp表示一个或多个可选的间隔基，M表示分选酶识别基序，其中所述分选酶识别基序在其N端到C端方向的第5位包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、可选取代的羟基羧酸，n为0至3的整数，优选n＝0。

在一些实施方案中，M包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中，*表示可选取代的羟基羧酸；且X和Y独立地表示任何氨基酸。

在一些实施方案中，M包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M是LPET*G，其中*是2-羟基乙酸。

在一些实施方案中，该一个或多个Sp选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双官能NHS酯型；(4)同双官能亚氨酸酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；和(7)巯基-羟基型；并且优选该一个或多个Sp是NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂，如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸，并且该活性剂包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选C端半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述至少一种膜蛋白是至少一种内源性非工程化膜蛋白，并且所述分选酶底物通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基基团缀合与所述RBC的该至少一种内源性非工程化膜蛋白缀合。

在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选地发生在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。

在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。在一些实施方案中，mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC-肽复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

在一些实施方案中，RBC表面上共价修饰的所述至少一种膜蛋白包含A¹-L¹-P¹结构，其中L¹与P¹中的甘氨酸_(n)连接；和/或包含A¹-L¹-P²结构，其中L¹与P²中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2；A¹表示活性剂；L¹选自LPXT、LPXA、LPXS、LPXL、LPXV、LGXT、LAXT、LSXT、NPXT、MPXT、IPXT、SPXT、VPXT和YPXR；P¹和P²独立地表示所述至少一种膜蛋白；X表示任何氨基酸。

在另一个一般方面，本发明提供了一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种内源性非工程化膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶将分选酶底物缀合到RBC的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白上的条件下进行，其中所述缀合通过分选酶介导的反应，优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基基团缀合而实现。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。

在另一个一般方面，本发明提供通过本公开的方法获得的红细胞(RBC)。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本公开的具有与之连接的活性剂的红细胞和可选的生理学上可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含分选酶、包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物和可选的生理学上可接受的载体，其中所述分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的方法，包括向所述受试者施用如本公开中所述的红细胞或组合物。

在一些实施方案中，所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)、细菌感染、病毒感染如冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染，自身免疫性疾病和炎性疾病。

在另一个方面，本发明提供了一种将活性剂递送至有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用如本公开中所述的红细胞或组合物。

在另一个方面，本发明提供了一种增加活性剂在受试者中的循环时间或血浆半衰期的方法，所述方法包括：提供包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物，以及在分选酶存在下在适宜条件下缀合分选酶底物，其中所述条件适于所述分选酶通过分选酶介导的反应，将分选酶底物缀合到红细胞的至少一种膜蛋白上，其中所述分选酶底物包含A¹-Sp-M的结构，其中A¹表示活性剂，Sp表示一个或多个可选的间隔基，M表示分选酶识别基序，其中所述分选酶识别基序在其N端到C端方向的第5位包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、可选取代的羟基羧酸，n为0至3的整数，优选n＝0。

在一些实施方案中，M包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中，*表示可选取代的羟基羧酸；且X和Y独立地表示任何氨基酸。在一些实施方案中，M包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M是LPET*G，其中*是2-羟基乙酸。

在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。在一些实施方案中，mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。

在另一个方面，本发明提供了如本文所述的红细胞或组合物在制备用于诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的药物中的用途、或在制备用于诊断病症、病状或疾病的诊断剂中的用途、或在制备用于递送活性剂的药物中的用途。在一些实施方案中，所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)、细菌感染、病毒感染如冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染、自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方案中，药物是疫苗。

在另一个方面，本发明提供了本公开的红细胞或组合物用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病。在一些实施方案中，所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)、细菌感染、病毒感染如冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染、自身免疫性疾病和炎性疾病。

附图简述

在附图中，以举例的方式描述了本公开的实施方案。应当明了，该描述和附图仅用于举例说明和帮助理解的目的，并不旨在对本发明构成限制。

图1A-1K显示了天然小鼠或人RBC表面上通过野生型分选酶(wtSrtA)和突变型分选酶(mgSrtA)实现的肽和蛋白质的标记功效。

图1A和1B：10⁹/mL小鼠(图1A)或人(图1B)RBC与500μM生物素-LPETG一起在4℃孵育2小时，其中有或没有40μM野生型(wt)SrtA或mgSrtA。酶促反应后，通过将RBC与缀合了PE的链霉亲和素一起孵育来检测标记功效，并通过流式细胞术进行分析。流式直方图上显示了使用或没有使用mg分选酶或wt分选酶标记的RBC的表面上的生物素信号。红色：mg分选酶；蓝色：wt分选酶；橙色：没有分选酶。

图1C：10⁹/mL小鼠RBC与8μM生物素-LPETG肽和40μM mgSrtA或wtSrtA在37℃孵育2小时。通过用链霉亲和素-HRP进行免疫印迹，分析标记功效。血红蛋白亚基α1，HBA1，用作上样对照。

图1D：通过超速离心处理10⁹/mL小鼠RBC以富集膜蛋白。通过对Slc4a1基因编码的RBC膜蛋白带3蛋白(Band 3)的蛋白印迹，检测到膜蛋白的显著富集。

图1E：用mgSrtA对10⁹/mL小鼠RBCs进行生物素标记并进行膜蛋白富集。蛋白印迹结果显示，与未富集的样品相比，富集步骤后生物素信号显著增加。

图1F：通过mgSrtA或wtSrtA，用生物素-LPETG对10⁹个小鼠RBC进行分选标记(sortagging)。分选标记后，标记的RBC用DiR染料染色并静脉注射到小鼠体内。在输注后24小时，自小鼠采血。为检测生物素信号，将血液样品与缀合了FITC的链霉亲和素在37℃孵育1小时，并在洗涤3次后进行流式细胞术分析。选择DiR阳性细胞用于分析具有生物素信号的RBC的百分比。

图1G：在输注后的指定天数，自小鼠采血。通过DiR阳性细胞指示循环中输注的RBC的百分比。

图1H：分析来自上述实验的血液样品中的DiR阳性RBC，确定生物素阳性细胞的百分比。

图1I：在注射后第4天，通过成像流式细胞术分析血液样品，以分析在RBC上的生物素分选标记。为检测生物素信号，将血液样品与缀合了FITC的链霉亲和素在37℃孵育1小时，并在洗涤3次后进行流式细胞术分析。

图1J：10⁹/mL小鼠RBC用100μM eGFP-LPETG通过mgSrtA或wtSrtA在37℃分选标记2h。通过流式细胞术分析缀合功效。流式直方图上显示了使用或没有使用mg分选酶或wt分选酶标记的RBC表面上的生物素信号。红色：无分选酶；蓝色：mg分选酶；橙色：wt分选酶。

图1K：10⁹个eGFP分选标记的小鼠RBC用DiR染料染色并静脉注射到小鼠体内。在注射后第7天，自小鼠采血，并通过成像流式细胞术分析血液样品中RBC表面上的eGFP信号。

图2显示，静脉注射OT-1-RBCs在体内诱导了OT-1TCR T细胞的免疫耐受。

图2A：从CD45.1 OT-1TCR转基因小鼠中纯化的10⁶个CD8⁺T细胞被静脉注射到CD45.2受体小鼠中。24小时后，将具有或不具有mgSrtA介导的OT-1肽标记的2x10⁹个小鼠RBC输注到受体小鼠中，之后受体小鼠接受OT-1肽和完全弗氏佐剂(CFA)的攻击。在第15天，将这些小鼠安乐死并收获脾脏。

图2B：通过流式细胞术分析从脾中分离的悬浮细胞。首先筛选出CD8⁺T细胞用于分析CD45.1⁺T细胞的百分比，这说明过继转移的OT-1TCR CD8⁺T细胞的存活。进一步分析CD45.1⁺CD8⁺T细胞的PD1和CD44表达。CD45.2：在许多造血细胞表面表达的膜蛋白，在本实验中用于指示内源性T细胞。CD44：T细胞活化标志物；PD-1：细胞凋亡和衰竭的标志物。

图3显示SARS-CoV-2通过其S蛋白与ACE2结合而进入宿主细胞。

图4显示经表面工程化而具有三聚体ACE2的红细胞(RBC)。

图5显示不可逆接头6-Mal-LPET*G(6-马来酰亚胺基己酸-Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly；6-Mal表示6-马来酰亚胺基己酸)的化学结构。

图6显示不可逆接头6-Mal-LPET*G与经修饰的蛋白缀合的反应方案。将两种反应底物混合，并以1:4＝eGFP cys:6-Mal-LPET*G的比例反应，以获得最终反应产物。

图7显示不可逆接头6-Mal-K(6-Mal)-GGG-K(6-Mal)-GGGSAA-LPET*G和6-Mal-K(6-Mal)-GGGGGGSAA-LPET*G的化学结构(上部)以及通过双叉和三叉缀合蛋白质的示意图(底部)。

图8显示通过质谱法鉴定的产物。色谱脱盐并分离蛋白质，然后在6230TOF LC/MS质谱仪上分析蛋白质样品。熵包含在BioConfirm 10.0软件中。

图9显示eGFP-cys蛋白质序列和通过串联质谱法检测的蛋白质侧链修饰结果。

图10显示在天然RBC表面上通过突变型分选酶(mgSrtA)实现的eGFP-cys-6-Mal-LPET*G的标记功效。将RBC在10μM mg SrtA存在的情况下与75μM eGFP-cys-6-Mal-LPET*G在37℃下孵育2小时。酶促反应后，通过流式细胞术检测标记功效。流式直方图显示表面上的eGPF信号。红色：未标记；蓝色：eGFP-LPETG；橙色：eGFP-cys-6-Mal-LPET*G。

图11显示通过mg SrtA用eGFP-cys-6-Mal-LPET*G对10⁹个小鼠RBC进行分选标记的结果。分选标记后，用DiR染料对标记的RBC进行染色并静脉注射到小鼠体内。在输注后24小时，自小鼠采血。选择DiR阳性细胞用于分析具有eGFP信号的RBC的百分比。

图12显示，如DiR阳性细胞所指示的、循环中输注的RBC的百分比。在输注后的指定天数，自小鼠采血。

图13显示，通过分析来自上述实验的血液样品中的DiR阳性RBC获得的eGFP阳性细胞的百分比。

图14显示细胞表面eGFP信号的成像分析。通过DiR染料对10⁹个eGFP分选标记的小鼠RBC进行染色并静脉注射到小鼠体内。在注射后第7天，自小鼠采血，并通过成像流式细胞术分析血液样品中RBC表面的eGFP信号。

图15显示，HPV16(YMLDLQPET)-hMHC1-LPET*G在体外通过突变型分选酶(mgSrtA)在天然RBC表面的缀合功效。通过流式细胞术分析缀合功效。流式直方图显示在有或没有mg分选酶的情况下标记的RBC表面的Fc标签信号。对照：无分选酶；HPV16-RBC：有mg分选酶。

图16显示，UOX-His₆-Cys-LPET*G通过mg SrtA在天然RBC表面的标记功效。流式直方图显示在有mg分选酶(UOX-RBC)或没有mg分选酶(对照)的情况下标记的RBC表面的His标签信号。图16A：小鼠RBC；图16B：人RBC；图16C：大鼠RBC；图16D：食蟹猴RBC。

发明详述

为了促进对本发明的原理的理解，现将提及附图中给出的实施方案并对其进行具体描述。然而，应当理解，这并不意在限制本发明的范围。

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。本文描述了优选的方法和材料，但与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可用于实施本发明。因此，此处定义的术语通过说明书整体获得更全面的描述。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数表述“一”、“一种”和“该”涵盖复数指代。除非另有说明，核酸以5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以根据本领域技术人员使用的具体情形而变化。

如本文所用，在氨基酸序列的上下文中，术语“基本上由...组成”是指所述及的氨基酸序列连同添加在N-或C-末端的一个、两个、三个、四个或五个额外氨基酸。

除非上下文另有要求，否则术语“包括”、“包含”和“含有”或类似术语旨在表示非排他性的包括，由此元素或特征的列表不仅仅包括已经述及的或列出的那些元素或特征，还可以包括未列出或述及的其他元素或特征。

如本文所用，术语“患者”、“个体”和“受试者”用于本文公开的治疗或组合物的任何哺乳动物接受者的上下文中。因此，本文公开的方法和组合物可具有医学和/或兽医学应用。在优选的形式中，哺乳动物是人。

如本文所用，术语“序列同一性”是指，就序列在比较窗口上的相同程度而言，使用标准算法进行合适比对后完全匹配的核苷酸或氨基酸的数目。因此，“序列同一性百分比”通过如下方式来计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解为意指，由DNASIS计算机程序(Windows版本2.5；可从美国加利福尼亚州南旧金山的日立软件工程有限公司获得)计算的“匹配百分比”。

最近的研究已经发现了在基序识别上具有不同特异性的突变分选酶[4]。例如，Ge等证明，进化的SrtA变体(mgSrtA)能够识别G₁修饰肽的N端，但wtSrtA不具有此识别能力[5]。此外，在N端具有单个甘氨酸的膜蛋白比具有3个甘氨酸的膜蛋白丰富得多。Ge等对人膜蛋白质组进行N端序列分析并预测N端甘氨酸。根据先前的研究[7]，182种蛋白质在酶促去除信号肽或起始甲硫氨酸残基后含有N端甘氨酸残基。其中，176种蛋白质(96.70％)在N端含有一个甘氨酸残基，4种蛋白质(2.20％)在N端含有GG残基，而只有2种蛋白质(1.10％)在N端含有G_(n≥3)残基。已知182种蛋白质中没有一种在成熟的人红细胞表面表达。

本发明至少部分地基于如下令人惊讶的发现，即尽管不存在已知的N-末端甘氨酸，但通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链缀合，可以将分选酶底物缀合到天然人RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白上，其中所述缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n＝1或2)和赖氨酸ε-氨基基团上。不受理论限制，认为分选酶的非典型功能使得分选酶底物能够缀合至内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部甘氨酸_(n＝1或2)和/或赖氨酸侧链ε-氨基基团上。此外，不受任何理论限制，红细胞生成过程中广泛的组织特异性mRNA剪接和蛋白质翻译可能导致甘氨酸_(n＝1或2)的暴露。

由此，本发明人开发了一种新策略，通过分选酶介导的反应，用肽和/或小分子共价修饰天然RBC的内源性非工程化膜蛋白。该技术允许通过直接修饰天然RBC而不是来源受限的HSPC来产生RBC产品。此外，该修饰后的RBC可以很好地保留其原有的生物学特性，并与其天然状态一样保持稳定。

我们的结果显示，这种SrtA介导的细胞膜蛋白标记通常需要例如200-1000μM的底物蛋白质。为了更有效地提高产物的产率并减少逆反应的发生，本发明人还令人惊奇地发现，通过化学偶联修饰蛋白质可以大大降低细胞标记过程中所需的蛋白质浓度。

红细胞(RBCs)

在一些方面，本公开提供了具有与其连接的活性剂的红细胞(RBC)，其中所述活性剂通过分选酶介导的反应与RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，活性剂通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，与至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域中(例如，胞外结构域的内部位点上)的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选n为1或2。在一些实施方案中，不受任何理论限制，分选酶介导的甘氨酸缀合可在以前未报告的膜蛋白的暴露甘氨酸_(n＝1或2)上发生，其中所述暴露的甘氨酸_(n＝1或2)由红细胞生成过程中的组织特异性mRNA剪接和蛋白质翻译导致。在一些实施方案中，暴露的甘氨酸_(n＝1或2)可以是N末端暴露的甘氨酸_(n＝1或2)。在一些实施方案中，分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合发生在胞外结构域的末端赖氨酸或内部赖氨酸的ε-氨基基团上。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可发生在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的末端(例如，N-末端)和/或内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。

除非另有说明或自上下文可以明确另有含义，否则在本公开提及红细胞(RBC)时，其通常指成熟红细胞。在某些实施方案中，RBC是人RBC，例如人天然RBC。

在一些实施方案中，RBC是未曾经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质的红细胞。在一些实施方案中，RBC未曾经过基因工程改造。除非另有说明或自上下文可以明确另有含义，否则在本公开提及对红细胞进行分选标记时，其通常旨在指，之前未曾经历过基因工程改造来进行分选标记的红细胞。在某些实施方案中，红细胞不是基因工程改造的红细胞。

如果红细胞未曾经过基因工程改造以表达包含分选酶催化反应中的分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，则认为该红细胞是“未曾经历过基因工程改造来进行分选标记的”。

在一些实施方案中，本发明提供了通过分选酶介导的反应而具有与其缀合的活性剂的红细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含多数个这样的细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少选定百分比的细胞是被修饰的，即通过分选酶而具有与其缀合的活性剂。例如，在一些实施方案中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞具有与其缀合的活性剂。在一些实施方案中，缀合的活性剂可以是本文所述的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，所述活性剂可以与表5中列出的一个或多个或所有序列(例如，SEQ ID NOs：5-26)中的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基缀合。在一些实施方案中，所述活性剂可以与包含SEQ ID NO:5的序列中的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基缀合。

在一些实施方案中，本发明提供了一种红细胞，其包含通过分选酶介导的反应而缀合在细胞表达的非基因工程化内源性多肽上的活性剂。在一些实施方案中，由细胞表达的两种、三种、四种、五种或更多种不同的内源性非工程化多肽，通过分选酶介导的反应，具有与其缀合的活性剂。与不同多肽连接的活性剂可以是相同的，或者细胞可以用多种不同的活性剂进行分选标记。

在一些实施方案中，本发明提供了一种红细胞(RBC)，其具有与其连接的活性剂，其中通过分选酶介导的反应，所述活性剂连接在RBC表面的至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域中任意位置(优选内部位点)的甘氨酸_(n)或赖氨酸侧链上，其中n优选为1或2。在一些实施方案中，所述活性剂与胞外结构域中或胞外结构域内的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)甘氨酸_(n)或赖氨酸侧链ε-氨基基团连接。在某些实施方案中，所述至少一种内源性非工程化膜蛋白可选自下表5中列出的膜蛋白或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种内源性非工程化膜蛋白可选自表5中列出的22种膜蛋白或其任意组合。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可以发生在表5所列的一个或多个或所有序列(例如，SEQ ID NO:5-26)中的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上。在某些实施方案中，所述至少一种内源性非工程化膜蛋白可包含胞外钙敏感受体(CaSR)(甲状旁腺细胞钙敏感受体，PCaR1)。在某些实施方案中，连接可以是下表5中所示的一种或多种或所有修饰。在某些实施方案中，连接可发生在选自表5所列修饰位置的一个或多个位置及其任意组合上，例如包括CaSR的G526和/或K527位置；CD抗原CD3g的G158和/或K162；和/或TrpC2的G950和/或K964的位置。

在一些实施方案中，不受任何理论的限制，活性剂可连接至选自下表2、3和/或4所列蛋白质的蛋白质上或其任何组合上。

在一些实施方案中，本发明提供了一种红细胞(RBC)，其具有与BRC表面的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接的活性剂。在一些实施方案中，活性剂通过分选酶识别基序与至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶识别基序可以选自LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，分选酶识别基序可以在其N端到C端方向的第5位包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、可选取代的羟基羧酸，其中n为0至3的整数，优选n＝0。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中，*表示可选取代的羟基羧酸；X和Y独立地表示任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M是LPET*G，优选*是2-羟基乙酸。

可以理解，在活性剂与膜蛋白连接后，分选酶识别基序的最后一个或两个残基(即，按N端到C端方向从第5位开始的最后一个或两个残基)，将被发生连接的氨基酸替代，如本文其他地方所述。例如，与活性剂连接的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A¹-L¹-P¹结构，其中L¹与P¹中的甘氨酸_(n)连接，和/或包含A¹-L¹-P²结构，其中L¹与P²中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2；其中L¹选自LPXT、LPXA、LPXS、LPXL、LPXV、LGXT、LAXT、LSXT、NPXT、MPXT、IPXT、SPXT、VPXT和YPXR；A¹表示活性剂；P¹和P²独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白；X表示任何氨基酸。在一些实施方案中，与活性剂连接的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含结构A¹-LPXT-P¹，其中LPXT与P¹中的甘氨酸_(n)连接，和/或包含结构A¹-LPXT-P²，其中LPXT与P²中的赖氨酸侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2，A¹表示活性剂，P¹和P²独立地表示至少一种内源性非工程化膜蛋白，X表示任何氨基酸。在一些实施方案中，P¹和P²可以相同或不同。在一些实施方案中，活性剂与至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域之中或之内的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)甘氨酸_(n)或赖氨酸侧链ε-氨基连接。在某些实施方案中，所述至少一种内源性非工程化膜蛋白可选自下表5中列出的膜蛋白或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种内源性非工程化膜蛋白可选自表5中列出的22种膜蛋白或其任意组合。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合可以发生在表5所列的一个或多个或所有序列(例如，SEQ ID NO:5-26)中的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上。在某些实施方案中，至少一种内源性非工程化膜蛋白可以包含胞外钙敏感受体(CaSR)(甲状旁腺细胞钙敏感受体，PCaR1)。在某些实施方案中，连接可以是下表5中所示的一种或多种或所有修饰。在某些实施方案中，连接可发生在选自表5所列修饰位置的一个或多个位置上或其任意组合上，例如包括CaSR的G526和/或K527位置；CD抗原CD3g的G158和/或K162；和/或TrpC2的G950和/或K964的位置。

在一些实施方案中，使用分选酶，修饰基因工程化红细胞，以将分选酶底物连接至细胞的非基因工程化内源多肽上。例如，所述红细胞可以已经经过基因工程改造以表达多种产物中的任一种，例如多肽或非编码RNA，和/或可以经基因工程改造以缺失一个或多个基因的至少一部分，和/或可以经基因工程改造以在一个或多个内源基因的序列中具有一个或多个精确改变。在某些实施方案中，此类基因工程化细胞的非工程化内源性多肽，可以用本文所述的各种活性剂中的任一种进行分选标记。

在一些实施方案中，本公开考虑使用从个体分离的自体红细胞，在体外修饰后，将该分离的红细胞施用给所述个体。在一些实施方案中，本公开考虑使用免疫相容性红细胞，所述红细胞与将被施用此细胞的个体具有相同血型(例如，至少就ABO血型系统而言，并且在一些实施方案中，就D血型系统而言)或可以是相容的血型。

内源性非工程化膜蛋白

如本文所用的术语“非工程化”、“非遗传修饰”和“非重组”可互换使用，指未经基因工程改造、不存在遗传修饰等。非工程化膜蛋白包括内源性蛋白质。在某些实施方案中，非基因工程化红细胞不包含非内源性核酸，例如源自载体、不同物种或包含人工序列(例如人为引入的DNA或RNA)的DNA或RNA。在某些实施方案中，非工程化细胞未曾有意地在适合细胞摄取核酸的条件下接触过能够引起可遗传的基因改变的核酸。

在一些实施方案中，内源性非工程化膜蛋白可涵盖下表5中列出的任何或至少一种膜蛋白或其任何组合。在某些实施方案中，内源性非工程化膜蛋白可涵盖表5中列出的22种膜蛋白中的任何一种或至少一种或其任何组合。在某些实施方案中，内源性非工程化膜蛋白可包含胞外钙敏感受体(CaSR)(甲状旁腺细胞钙敏感受体，PCaR1)。

分选酶

已从多种革兰氏阳性细菌中分离出被鉴定为“分选酶”的酶。分选酶、分选酶介导的转酰基反应及其在蛋白质工程中的用途是本领域普通技术人员熟知的(参见例如PCT/US2010/000274(WO/2010/087994)和PCT/US2011/033303(WO/2011/133704))。根据来自革兰氏阳性细菌基因组的61种分选酶的序列比对和系统发育分析(Dramsi S,Trieu-Cuot P,Bierne H,Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases ofGram-positive bacteria.Res Microbiol.156(3):289-97,2005)，分选酶分为4类，命名为A,B,C和D。本领域技术人员可以基于分选酶的序列和/或其他特征，例如Drami等人，同上引文中描述的那些特征，容易地将分选酶归类为正确的类别。如本文所用，术语“分选酶A”是指任何特定细菌物种中的A类分选酶，通常称作SrtA，例如来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)或酿脓链球菌(S.pyogenes)的SrtA。

术语“分选酶”也称为转酰胺酶，是指具有转酰胺酶活性的酶。分选酶识别包含分选酶识别基序例如氨基酸序列LPXTG的底物。被分选酶识别(即，包含分选酶识别基序)的分子在本文中有时被称为“分选酶底物”。分选酶可以耐受各种不同的结构部分位于切割位点附近，由此允许多样化缀合各种不同的实体，条件是所述底物含有适宜暴露的分选酶识别基序并且可获得适宜的亲核试剂。术语“分选酶介导的转酰基反应”、“分选酶催化的转酰基反应”、“分选酶介导的反应”、“分选酶催化的反应”、“分选酶反应”、“分选酶介导的转肽反应”等术语在本文中可互换地使用以指代这样的反应。就转酰胺酶或分选酶识别的序列而言，术语“分选酶识别基序”、“分选酶识别序列”和“转酰胺酶识别序列”在本文中可互换使用。术语“亲核受体序列”是指能够在分选酶催化的反应中充当亲核试剂的氨基酸序列，例如，包含N-末端甘氨酸(例如，1、2、3、4或5个N-末端甘氨酸)或在一些实施方案中包含内部甘氨酸_(n＝1或2)或赖氨酸侧链ε-氨基的序列。

本发明涵盖与本领域已知的任何分选酶类别(例如，来自任何细菌物种或菌株的分选酶A、B、C或D)有关的实施方案。在一些实施方案中，使用分选酶A，例如来自金黄色葡萄球菌的SrtA。在一些实施方案中，考虑使用两种或更多种分选酶。在一些实施方案中，所述分选酶可以利用不同的分选酶识别序列和/或不同的亲核受体序列。

在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)。SrtA识别基序LPXTG，其中常见的识别基序有例如LPKTG、LPATG、LPNTG。在一些实施方案中，使用LPETG。但是，也可以识别落在该共有序列之外的基序。例如，在一些实施方案中，基序的第4位包含“A”、“S”、“L”或“V”而不是“T”，例如LPXAG、LPXSG、LPXLG或LPXVG，例如LPNAG或LPESG、LPELG或LPEVG。在一些实施方案中，基序的第5位包含“A”而不是“G”，例如LPXTA，例如LPNTA。在一些实施方案中，基序的第2位包含“G”或“A”而不是“P”，例如LGXTG或LAXTG，例如LGATG或LAETG。在一些实施方案中，基序的第1位包含“I”或“M”而不是“L”，例如MPXTG或IPXTG，例如MPKTG、IPKTG、IPNTG或IPETG。Pishesha等人2018描述了分选酶A的各种识别基序。

在一些实施方案中，分选酶识别序列是LPXTG，其中X是标准或非标准氨基酸。在一些实施方案中，X选自D、E、A、N、Q、K或R。在一些实施方案中，识别序列选自LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中X可以是任何氨基酸，例如在某些实施方案中选自D、E、A、N、Q、K或R的氨基酸。

在一些实施方案中，分选酶可以识别包含非天然氨基酸的基序，所述非天然氨基酸优选位于所述分选酶识别基序的N端到C端方向的第5位。该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、取代或未取代的羟基羧酸，n是0至5的整数，例如0、1、2、3、4或5，优选n＝0。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是取代的羟基羧酸，在一些其他实施方案中，该羟基羧酸被一个或多个选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、羟基、C_1-6烷氧基和C_1-6卤代烷氧基的取代基取代。术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指式C_nH_2n+1的烃基，其中n是大于或等于1的数。在一些实施方案中，可用于本公开的烷基包含1至6个碳原子，优选1至4个碳原子、更优选1至3个碳原子和更优选1到2个碳原子。烷基可以是直链或支链的，并且可以如本文所示进一步取代。C_x-y烷基是指包含x至y个碳原子的烷基。适宜的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、戊基及其异构体(例如正戊基、异戊基)、和己基及其异构体(例如正己基、异己基)。优选的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。术语“卤代烷基”单独或组合指具有如上定义的含义的烷基基团，其中一个或多个氢被如上定义的卤素替代。此类卤代烷基的非限制性实例包括氯甲基、1-溴乙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1,1,1-三氟乙基等。

在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中*表示可选取代的羟基羧酸；X和Y独立地表示任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M为LPET*G，优选*为2-羟基乙酸。

在一些实施方案中，本发明考虑使用天然存在的分选酶的变体。在一些实施方案中，所述变体能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选在红细胞的至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点上缀合，优选n为1或2。此类变体可以通过诸如定向进化、位点特异性修饰等过程产生。关于分选酶例如分选酶A，大量结构信息是可获得的，包括单独或与分选酶识别序列结合的SrtA的NMR或晶体结构(参见例如Zong Y等人J.Biol Chem.2004,279,31383-31389)。金黄色葡萄球菌SrtA的活性位点和底物结合口袋已被确定。本领域的普通技术人员可以通过例如不会破坏或显著改变分选酶的活性位点或底物结合口袋的缺失或取代来产生功能变体。在一些实施方案中，SrtA的定向进化可以通过利用Chen等人Sci.Rep.2016,6(1),31899描述的基于FRET(荧光共振能量转移)的选择测定法来进行。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA的功能变体可以是CN10619105A和CN109797194A中描述的那些。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可以是截短变体，例如从N端去除25-60个(例如，30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸。

在一些实施方案中，可用于本发明的金黄色葡萄球菌SrtA的功能变体可以是金黄色葡萄球菌SrtA变体，其包含在D124、Y187、E189和F200氨基酸位置上的D124G、Y187L、E189R和F200L中的一个或多个突变，并且任选地还包含P94S/R、D160N、D165A、K190E和K196T中的一个或多个突变。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可包含D124G；D124G和F200L；P94S/R、D124G、D160N、D165A、K190E和K196T；P94S/R、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；D124G、Y187L、E189R和F200L；或P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体从N末端去除了59或60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸。在一些实施方案中，上述的突变氨基酸位置根据野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，如SEQ ID NO:1所示)的编号，来进行编号。在一些实施方案中，野生型金黄色葡萄球菌SrtA的全长核苷酸序列显示在例如SEQ ID NO:2中。

SEQ ID NO:1(全长，GenBank登录号:CAA3829591.1)

SEQ ID NO:2(全长，野生型)

在一些实施方案中，与野生型金黄色葡萄球菌SrtA相比，金黄色葡萄球菌SrtA变体可以在对应于SEQ ID NO:1的94、105、108、124、160、165、187、189、190、196和200的一个或多个位置处包含一个或多个突变。在一些实施方案中，与野生型金黄色葡萄球菌SrtA相比，金黄色葡萄球菌SrtA变体可包含对应于P94S/R、E105K、E108A、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L的一个或多个突变。在一些实施方案中，与野生型金黄色葡萄球菌SrtA相比，金黄色葡萄球菌SrtA变体可包含对应于D124G、Y187L、E189R和F200L的一个或多个突变，并且任选地还包含对应于P94S/R、D160N、D165A、K190E和K196T的一个或多个突变以及任选地还包含对应于E105K和E108A的一个或多个突变。在某些实施方案中，与野生型金黄色葡萄球菌SrtA相比，金黄色葡萄球菌SrtA变体可包含对应于以下突变的突变：D124G；D124G和F200L；P94S/R、D124G、D160N、D165A、K190E和K196T；P94S/R、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；D124G、Y187L、E189R和F200L；或P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体相对于SEQ ID NO：1可包含P94S/R、E105K、E108A、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L中的一个或多个突变。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体相对于SEQ ID NO：1可以包含D124G、Y187L、E189R和F200L，并且任选地进一步包含P94S/R、D160N、D165A、K190E和K196T中的一个或多个突变，并且任选地进一步包含E105K和/或E108A。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可以，相对于SEQ ID NO：1，包含D124G；D124G和F200L；P94S/R、D124G、D160N、D165A、K190E和K196T；P94S/R、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E和K196T；D124G、Y187L、E189R和F200L；或P94S/R、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L。在一些实施方案中，突变E105K和/或E108A/Q允许分选酶介导的反应不依赖于Ca²⁺。在一些实施方案中，如本文所述的金黄色葡萄球菌SrtA变体可已从N端去除25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59或60个)氨基酸。在一些实施方案中，上述的突变氨基酸位置根据野生型金黄色葡萄球菌SrtA的全长(例如，如SEQ ID NO:1所示)编号来进行编号。

在一些实施方案中，用于本发明的金黄色葡萄球菌SrtA的功能变体可以是金黄色葡萄球菌SrtA变体，其包含P94S/R、E105K、E108A/Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L中的一个或多个突变。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可包含P94S/R、E105K、E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L；或P94S/R、E105K、E108A、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可相对于SEQ ID NO:1包含P94S/R、E105K、E108A/Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L中的一个或多个突变。在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可相对于SEQ ID NO：1包含P94S/R、E105K、E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L；或相对于SEQ ID NO:1包含P94S/R、E105K、E108A、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体从N端去除了25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59或60个)氨基酸。在一些实施方案中，上述突变氨基酸位置根据野生型金黄色葡萄球菌SrtA的编号(例如，如SEQ ID NO:1中所示)进行编号。

在一些实施方案中，本发明考虑金黄色葡萄球菌SrtA变体(mgSrtA)，其包含如下氨基酸序列、或基本上由如下氨基酸序列组成、或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或更高)的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3是截短的SrtA，并且其相对于野生型SrtA的突变在下文以粗体下划线显示。在一些实施方案中，SrtA变体包含如下氨基酸序列、或基本上由如下氨基酸序列组成、或由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或更高)的同一性，并且包含突变P94R/S、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L和任选地E105K和/或E108A/Q(根据SEQ ID NO:1编号)。

SEQ ID NO:3(粗体下划线显示突变)

在一些实施方案中，本发明提供编码金黄色葡萄球菌SrtA变体的核酸，并且在一些实施方案中，该核酸如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:4

在一些实施方案中，分选酶A变体可以包含以下之任一或多个：94位的S残基(S94)或94位的R残基(R94)，105位的K残基(K105)、108位的A残基(A108)或108位的Q残基(Q108)、124位的G残基(G124)、160位的N残基(N160)、165位的A残基(A165)、189位的R残基(R189)、190位的E残基(E190)、196位的T残基(T196)和200位的L残基(L200)(根据野生型SrtA，例如SEQ ID NO:1的编号来编号)，任选地相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA还具有约25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59或60个)氨基酸自N端去除。例如，在一些实施方案中，分选酶A变体相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)包含两个、三个、四个或五个上述突变。在一些实施方案中，分选酶A变体相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)包含：94位的S残基(S94)或94位的R残基(R94)、以及160位的N残基(N160)、165位的A残基(A165)和196位的T残基(T196)。例如，在一些实施方案中，分选酶A变体相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)包含P94S或P94R以及D160N、D165A和K196T。在一些实施方案中，相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)，分选酶A变体包含94位的S残基(S94)或94位的R残基(R94)、以及160位的N残基(N160)、165位的A残基(A165)、190位的E残基和196位的T残基。例如，在一些实施方案中，相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)，分选酶A变体包含P94S或P94R以及D160N、D165A、K190E和K196T。在一些实施方案中，相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQID NO:1)，分选酶A变体包含94位的R残基(R94)、160位的N残基(N160)、165位的A残基(A165)、190位的E残基和196位的T残基。在一些实施方案中，相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA(例如，SEQ ID NO:1)，分选酶包含P94R、D160N、D165A、K190E和K196T。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌SrtA变体可以从N端去除25-60个(例如，25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59或60个)氨基酸。

在一些实施方案中，可以使用比天然存在的分选酶A具有更高的转酰胺酶活性的分选酶A变体。在一些实施方案中，分选酶A变体的所述活性是野生型金黄色葡萄球菌分选酶的至少约10、15、20、40、60、80、100、120、140、160、180或200倍。在一些实施方案中，这种分选酶变体用于本发明的组合物或方法中。在一些实施方案中，相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA，分选酶变体包含任何一个或多个以下取代：P94S/R、E105K、E108A、E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T和F200L突变。在一些实施方案中，SrtA变体可以从N端去除25-60个(例如，30、35、40、45、50、55、59或60个)氨基酸。

在一些实施方案中，氨基酸突变位置通过亲本金黄色葡萄球菌SrtA(如本文所述的金黄色葡萄球菌SrtA变体的来源亲本)与SEQ ID NO:1的多肽比对来确定，即，用SEQ IDNO：1的多肽来确定亲本金黄色葡萄球菌SrtA中对应的氨基酸序列。用于确定对应于本文所述的突变位置的氨基酸位置的方法是本领域众所周知的。可以使用在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice etal.,2000,Trends Genet.16:276-277，优选3.0.0版或更高版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，确定在另一多肽中的对应氨基酸残基。基于上述众所周知的计算机程序，本领域技术人员可以常规地确定本文所述的目的多肽的氨基酸位置。

在一些实施方案中，分选酶变体还可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守氨基酸突变。不会显著影响蛋白质活性的保守氨基酸突变是本领域公知的。

在一些实施方案中，本公开提供了，鉴定可用于将活性剂缀合至红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白上的分选酶变体候选物的方法，包括使红细胞与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在分选酶变体候选物存在下、在适于分选酶变体候选物通过分选酶-介导的反应将分选酶底物缀合到RBC的至少一种内源性、非工程化膜蛋白上的条件下进行，优选地所述缀合通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合来实现。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在位于至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。在一些实施方案中，该方法进一步包括选择能够将活性剂缀合至红细胞的至少一种内源性非工程化膜蛋白的分选酶变体。

在一些实施方案中，本发明涉及向受试者施用分选酶和分选酶底物以在体内将分选酶底物缀合到红细胞上。为此目的，期望的是，使用经过进一步修饰以增强其在循环中的稳定性和/或降低其免疫原性的分选酶。稳定循环中的酶和降低酶免疫原性的方法是本领域熟知的。例如，在一些实施方案中，分选酶已经在不会显著影响分选酶活性的位置被PEG化和/或连接到Fc片段。

不可逆接头

由于SrtA介导的蛋白质-细胞缀合是一种可逆反应，为了提高细胞标记的效率，最小化逆反应的发生将是有利的。提高产物产率的一种解决方案是提高反应底物的浓度，但在实际应用中大分子蛋白质可能难以达到非常高的浓度；而且，即使可以达到高浓度，高成本也可能限制此技术的使用。另一种解决方案是持续地从反应系统移出产物，使得反应不会由于平衡而终止，但是由于反应是在细胞上进行的，因此产物分离可能是困难的。本申请的发明人发现，令人惊讶的是，对于细胞标记，可以通过引入不是逆反应底物的羟基乙酰基样副产物来防止逆反应，从而使得标记反应不可逆。

为了获得羟基乙酰基样副产物，本公开设想使用包含非天然氨基酸的分选酶识别基序，优选地所述非天然氨基酸位于分选酶识别基序的N端到C端方向的第5位处。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的取代或未取代的羟基羧酸，n是0至5的整数，例如0、1、2、3、4或5，优选n＝0。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*Y,LPXA*Y,LPXS*Y,LPXL*Y,LPXV*Y,LGXT*Y,LAXT*Y,LSXT*Y,NPXT*Y,MPXT*Y,IPXT*Y,SPXT*Y,VPXT*Y和YPXR*Y，其中*表示可选取代的羟基羧酸；X和Y独立地表示任何氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以选自：LPXT*G,LPXA*G,LPXS*G,LPXL*G,LPXV*G,LGXT*G,LAXT*G,LSXT*G,NPXT*G,MPXT*G,IPXT*G,SPXT*G,VPXT*G,YPXR*G,LPXT*S和LPXT*A，优选M为LPET*G，优选*为2-羟基乙酸。在一些实施方案中，使用Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly(LPET-(2-羟基乙酸)-G)作为接头，以确保副产物使得反应不可逆。

为了将不可逆接头引入活性剂，在一些实施方案中，化学合成作为接头的包含非天然氨基酸的分选酶识别基序，并且其可直接缀合至活性剂，如蛋白质或多肽。

在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的分选酶识别基序可以通过多种化学手段与活性剂缀合，以产生所希望的分选酶底物。这些方法可包括使用双官能交联剂(例如NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂)的化学缀合，以使伯胺基与还原的巯基连接。在分选酶识别基序和活性剂之间可以，例如通过间隔基，形成其他分子融合。

多种化学缀合手段、双官能交联剂或间隔基可用于本公开，包括但不限于：(1)零长度型(例如EDC；EDC加磺基NHS；CMC；DCC；DIC；N,N'-羰基二咪唑；Woodward试剂K)；(2)胺-巯基型，如NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂(例如马来酰亚胺基羧酸(C_2-8)(例如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸)；EMCS；SPDP、LC-SPDP、磺基-LC-SPDP；SMPT和磺基-LC-SMPT；SMCC、LC-SMCC和磺基-SMCC；MBS和磺基-MBS；SIAB和磺基-SIAB；SMPB和磺基-SMPB；GMBS和磺基-GMBS；SIAX和SIAXX；SIAC和SIACX；NPIA)；(3)同双官能NHS酯型(例如DSP；DTSSP；DSS；DST和磺基-DST；BSOCOES和磺基-BSOCOES；EGS和磺基-EGS)；(4)同双官能亚氨酸酯型(例如DMA；DMP；DMS；DTBP)；(5)羰基-巯基型(例如KMUH；EMCH；MPBH；M2C2H；PDPH)；(6)巯基反应型(例如DPDPB；BMH；HBVS)；(7)巯基-羟基型(例如PMPI)；等等。

在一些实施方案中，胺-巯基型或NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂是可用于本文的优选间隔基。在某些实施方案中，NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂(如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸)是用于构建所希望的分选酶底物的尤其有用的间隔基。该NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂(如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸)可以与(例如暴露的半胱氨酸上)暴露的巯基发生Michael加成反应，但不会与未暴露的半胱氨酸发生此反应。在一个实施方案中，将6-马来酰亚胺基己酸引入本公开的不可逆接头中，以获得如图5所示的6-马来酰亚胺基己酸-Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly。

通过使用本文所述的间隔基，尤其是NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸，本发明人成功地设计了具有不同结构的接头，包括双叉、三叉和多叉结构。这些不同的接头可根据实际需要用于标记RBC，例如以获得多模式治疗剂。在一些实施方案的多叉结构设计中，一个或多个间隔基可以连接到N端氨基酸的氨基和/或赖氨酸侧链的氨基上，并且该一个或多个间隔基可以与相同或不同的活性剂如蛋白质或多肽连接，如图7所示。此技术可以进一步扩大用于细胞标记的活性剂如蛋白质的种类，并提高RBC改造的效率。

分选酶底物

可以容易地设计底物以适用于分选酶介导的缀合。分选酶底物可以包含分选酶识别基序和活性剂。例如，可以修饰活性剂诸如多肽，以在其C末端处或附近包括分选酶识别基序，从而允许其用作分选酶的底物。分选酶识别基序不需要位于底物的最C端，但通常应能被酶充分接近以参与分选酶反应。在一些实施方案中，如果分选酶识别基序(例如，L)中的最N端氨基酸和该多肽的C-末端氨基酸之间存在不超过5、6、7、8、9、或10个氨基酸，则认为分选酶识别基序在C末端“附近”。包含分选酶识别基序的多肽可以通过向其掺入或附接多种结构部分(例如肽、蛋白质、化合物、核酸、脂质、小分子和糖)中的任何一种来修饰。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含A¹-Sp-M结构的分选酶底物，其中A¹表示活性剂，Sp表示一个或多个可选的间隔基，M表示如本文所示的包含非天然氨基酸的分选酶识别基序。在一些实施方案中，该一个或多个Sp选自以下类型的交联剂：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双官能NHS酯型；(4)同双官能亚氨酸酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；和(7)巯基-羟基型；优选地，该一个或多个Sp是NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂，如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸，并且该活性剂包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选C端半胱氨酸。在一些实施方案中，在存在两个或更多个间隔基时，连接到所述间隔基的活性剂可以相同或不同。

活性剂

取决于修饰的红细胞的预期应用，在本发明中可以考虑多种活性剂，例如结合剂、治疗剂或检测剂。在一些实施方案中，活性剂可包含蛋白质、肽(例如，寡聚ACE2的胞外结构域)、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位、MHC-肽复合物如包含HPV16抗原肽(例如YMLDLQPET肽)的复合物、药物如小分子药物(例如，抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如，功能性代谢或治疗性酶，如尿酸氧化酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分或其任何组合。

在一些实施方案中，除了如本文所述的治疗活性结构域如酶、药物、小分子(如小分子药物(例如，抗肿瘤剂如化疗剂))、治疗性蛋白质和治疗性抗体，所述活性剂可进一步包含用于将细胞和/或活性剂靶向至身体中需要该治疗活性的位点的靶向部分。靶向部分与存在于此类位点的靶标结合。可以使用任何靶向部分，例如抗体。所述位点可以是任何器官或组织，例如呼吸道(例如肺)、骨、肾、肝、胰腺、皮肤、心血管系统(例如心脏)、平滑肌或骨骼肌、胃肠道、眼睛、血管表面，等等。

在一些实施方案中，蛋白质是酶，例如功能性代谢酶或治疗性酶，例如在哺乳动物的代谢或其他生理过程中起作用的酶。在一些实施方案中，蛋白质是在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、卟啉代谢、嘌呤或嘧啶代谢、和/或溶酶体贮积中起作用的酶。酶或其他蛋白质的缺乏会导致多种疾病，例如与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、嘌呤或嘧啶代谢、溶酶体贮积症以及凝血等方面的缺陷相关的疾病。代谢疾病的特点是功能性酶缺乏或代谢物摄入过多。由此，代谢物沉积在循环和组织中，导致组织损伤。由于RBC在人体中的广泛分布，本发明考虑用功能性代谢酶修饰RBC的膜蛋白。酶靶向的RBC将摄取患者血浆中的代谢物。示例性酶包括用于痛风的尿酸氧化酶、用于苯丙酮尿症的苯丙氨酸氨裂合酶、用于酒精性肝炎的乙醛脱氢酶、用于可卡因代谢物的丁酰胆碱酯酶等。在一些实施方案中，可以对需要治疗慢性高尿酸血症的受试者(例如痛风患者，例如使用其他疗法难以治疗的痛风患者)施用其上缀合有尿酸氧化酶的红细胞。

在过去三十年中，酶替代疗法一直是用于溶酶体贮积症(LSD)患者的一种特别疗法。然而，这种药物有一定局限性，如免疫系统问题和经济负担。此外，该治疗性酶在人体中会因其广泛的分解代谢而被迅速清除。在一些实施方案中，本公开设想通过本文所述的分选酶反应使该治疗性酶结合到RBC膜蛋白上。使用RBC作为载体，可以将该功能性酶靶向于肝脏中的巨噬细胞(RBC在此被清除)，并且因酶半衰期增加，也可以减少药物干预的剂量和频率。示例性酶包括用于戈谢病(Gaucher disease)的葡糖脑苷脂酶、用于法布里病(Fabrydisease)的α-半乳糖苷酶、用于原发性高草酸尿症的丙氨酸乙醛酸氨基转移酶和乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶。

在一些实施方案中，活性剂可以包含肽。在本发明中可以考虑各种功能性肽。在某些实施方案中，肽可包含寡聚ACE2胞外结构域。

引起称为COVID-19的呼吸道疾病的SARS-CoV-2，与SARS-CoV属于同一冠状病毒科。SARS-CoV-2的基因组与SARS-CoV非常相似，在编码刺突蛋白的ORF中具有约80％的核苷酸序列同一性和94.6％的氨基酸序列同一性。SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白具有非常相似的结构，都通过刺突蛋白与ACE2相互作用以进入人体细胞，如图3所示。不幸的是，在SARS大流行17年后，没有从SARS-CoV开发出可容易地应用于SARS-CoV-2的有效检测方法(除了RT-PCR外)、预防方法或治疗方法。这导致每个人都急于考虑不同的策略，包括SARS-CoV-2特异性抗体、疫苗、蛋白酶抑制剂和RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂，来检测和对抗SARS-CoV-2感染疾病“COVID-19”。如果开发得足够快(可能在2-3个月内)，这些努力可能对SARS-CoV-2有用。然而，鉴于RNA病毒具有非常高的突变率，这些策略仍然可能不适用于未来的冠状病毒。由几种SARS-CoV特异性抗体与SARS-CoV-2之间缺乏交叉反应性，可以清楚地反映这一点。因此，非常需要开发不仅对SARS-CoV-2有用而且可以很容易地应用于未来冠状病毒的检测装置或治疗剂。

SARS-CoV和SARS-CoV-2都通过其S蛋白与ACE2结合而进入宿主细胞。这种机制也适用于其他冠状病毒来成功建立感染。因此，阻断S蛋白与ACE2相互作用的分子可以预防病毒感染。已经显示ACE2胞外结构域可以阻断病毒感染。然而，单体ACE2对S蛋白的结合亲和力有限，预计不会有高病毒阻断活性。另一方面，高亲和力寡聚ACE2具有高病毒结合亲和力，可以有效地与细胞表面ACE2竞争以中和病毒。

细胞测定表明，冠状病毒感染或甚至S蛋白与ACE2的结合都会导致ACE2从细胞表面脱落，从而导致细胞表面ACE2表达水平降低[10][11]。ACE2的下调导致血管紧张素II的累积，该累积与急性肺损伤密切相关[10][12][13]。这或许可以解释这样一个事实，即冠状病毒感染的患者表现出呼吸综合症，尤其是在肺部。冠状病毒感染的患者表现出呼吸综合症并且有些人甚至发展为ARDS，这一事实表明补充ACE2也可能缓解呼吸综合症以用于病毒感染治疗。

在一些实施方案中，本发明考虑使用红细胞作为寡聚ACE2的载体用于有效的病毒中和(图4)，其中使用新策略，应用肽和/或小分子通过如本文所述的mgSrtA介导的反应来共价修饰天然RBC的内源性膜蛋白。在本公开中，本发明人已经表征了体内在RBC膜上由mgSrtA介导的蛋白质标记的功效。将同时用荧光染料DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁(tetramethylindotricarbocyanine)碘化物)标记的GFP标记的小鼠RBC，输注到野生型受体小鼠中。定期分析体内DiR和GFP阳性RBC的百分比。发现GFP标记的RBC不仅显示出与对照组相同的寿命，而且在循环过程中保持90％的GFP阳性(图1G和1F)。成像分析还显示了细胞表面上令人信服的GFP信号和工程化RBC的正常形态(图1K)。总之，这些数据表明在天然RBC表面上由分选酶介导的有效蛋白质标记。基于这些数据，可以相信，通过本发明的共价修饰方法与红细胞连接的高亲和力寡聚ACE2不仅可以中和病毒颗粒，还可以补充丢失的细胞表面ACE2，从而减轻肺损伤，由此用于当前和未来的冠状病毒感染预防和治疗。

在一些实施方案中，活性剂可以包含抗体，包括抗体、抗体链、抗体片段例如scFv、抗原结合性抗体结构域、VHH结构域、单域抗体、骆驼抗体、纳米抗体、adnectin或anticalin。附着有抗体的红细胞可用作抗体的递送载体和/或所述抗体可用作靶向部分。示例性抗体包括抗肿瘤抗体，如PD-1抗体，例如纳武单抗(Nivolumab)和帕博利珠单抗(Pembrolizumab)，其都是人PD-1蛋白的单克隆抗体，目前是黑素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌症的前沿治疗药物。可以表达并纯化用分选酶识别基序如LPETG修饰的所述抗体的重链。同样，可以修饰靶向PD-L1用于治疗尿路上皮癌和转移性默克尔细胞癌的PD-L1抗体，如阿替利珠单抗(Atezolizum)、阿维单抗(Avelumab)和度伐利尤单抗(Durvalumab)。此外，可以通过使用本文所述的方法，修饰FDA批准用于治疗类风湿性关节炎的治疗性单克隆抗体——阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、Sarilumab和戈利木单抗(golimumab)。

在一些实施方案中，活性剂可以包含抗原或表位、或结合抗原或表位的结合部分。在一些实施方案中，抗原是包含至少一个被B细胞和/或T细胞识别的表位的任何分子或复合物。抗原可包含多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。抗原可以是天然存在的或合成的，例如由病原体、感染细胞、赘生性细胞(例如肿瘤或癌细胞)、病毒、细菌、真菌、或寄生物天然产生的和/或遗传编码的抗原。在一些实施方案中，抗原是自身抗原或移植物相关抗原。在一些实施方案中，抗原是包膜蛋白、衣壳蛋白、分泌蛋白、结构蛋白、细胞壁蛋白或多糖、荚膜蛋白或多糖、或酶。在一些实施方案中，抗原是毒素，例如细菌毒素。可以修饰抗原或表位，例如，通过缀合到另一个分子或实体(例如，佐剂)上。

在一些实施方案中，如本文所述，具有通过分选酶与其缀合的表位、抗原或其部分的红细胞可用作疫苗组分。在一些实施方案中，如本文所述使用分选酶与红细胞缀合的抗原可以是本领域已知的常规疫苗中使用的任何抗原。

在一些实施方案中，抗原是例如病毒衣壳、包膜或外壳，或细菌、真菌、原生动物或寄生细胞的表面蛋白或多糖。示例性病毒可包括例如冠状病毒(例如，SARS-CoV和SARS-CoV-2)、HIV、登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒、流感病毒和单纯疱疹病毒(HSV)1和2。

在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原(TA)，其可以是由肿瘤中的细胞产生的任何抗原物质，其中所述细胞可以是例如肿瘤细胞或在一些实施方案中肿瘤基质细胞(例如，肿瘤相关细胞如癌症相关的成纤维细胞或肿瘤相关的血管系统)。

在一些实施方案中，抗原是肽。所述肽可直接与细胞表面表达的MHC分子结合，可被APC摄取和加工并与MHC分子结合展示在APC细胞表面，和/或可与纯化的MHC蛋白(例如MHC寡聚体)结合。在一些实施方案中，肽包含至少一个能够结合合适的MHC I类蛋白的表位和/或至少一个能够结合合适的MHC II类蛋白的表位。在一些实施方案中，肽包含CTL表位(例如，当与合适的MHC I类蛋白结合时，该肽可以被CTL识别)。

在一些实施方案中，活性剂可以包含MHC-肽复合物，其可以包含MHC和肽，例如，本文所述的用于激活免疫细胞的抗原肽或抗原。在一些实施方案中，抗原肽与疾病相关并且当由MHC I类分子呈递时能够激活CD8⁺T细胞。I类主要组织相容性复合物(MHC-I)将抗原肽呈递给免疫细胞并激活免疫细胞，特别是CD8⁺T细胞，这对于对抗癌症、感染性疾病等是重要的。具有分选酶识别基序(如LPETG)的MHC-肽复合物可以通过真核或原核系统进行外源性表达和纯化。如本文所述，纯化的MHC-肽复合物将通过分选酶介导的反应与RBC共价结合。在本公开中，我们以MHC-I-OT1复合物为例。小鼠MHC-I-OT1蛋白由大肠杆菌表达，并通过组氨酸标签亲和层析纯化。纯化的MHC-I-OT1复合物成功连接到RBC的膜蛋白上。类似地，MHC-II将抗原肽呈递给免疫细胞并激活免疫细胞，特别是CD4⁺T细胞，因此包含MHC-II和抗原或抗原肽的MHC复合物可以通过如本文所述的分选酶介导的反应共价结合到RBC。

MHC复合物的这种策略可用于治疗或预防由病毒引起的疾病，所述病毒为例如HPV(靶向E6/E7)、冠状病毒(例如，靶向SARS-CoV或SARS-CoV-2刺突蛋白)和流感病毒(例如，靶向H抗原/N抗原)。在一个实例中，我们使用了包含HPV16抗原肽(YMLDLQPET)的MCH-肽复合物，并成功地将该复合物缀合在RBC上。HPV-MHC1缀合的RBC可用于治疗由HPV引起的疾病，如宫颈癌。这种MHC复合物策略也可用于靶向肿瘤突变，例如具有V8M和/或G12D等突变的Kras、具有E1171D等突变的Alk、具有W487C等突变的Braf、具有E92K等突变的Jak2、具有M28I等突变的Stat3、具有G242V和/或S258I等突变的Trp53、具有V88I等突变的Pdgfra和具有R2066K等突变的Brca2，以用于肿瘤治疗。

在一些实施方案中，活性剂可以包含生长因子。在一些实施方案中，所述活性剂可以包含用于一种或多种细胞类型的生长因子。生长因子包括例如血管内皮生长因子(VEGF，例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF；IGF-1、IGF-2)、成纤维细胞生长因子(FGF，例如FGF1至FGF22)、血小板衍生生长因子(PDGF)或神经生长因子(NGF)家族的成员。

在一些实施方案中，活性剂可以包含细胞因子或其生物活性部分。在一些实施方案中，细胞因子是白介素(IL)，例如IL-1至IL-38中的任一种(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)、干扰素(例如I型干扰素，例如IFN-α)和集落刺激因子(例如G-CSF、GM-CSF、M-CSF)。荷载细胞因子(如重组IL-2、重组IL-7、重组IL-12)的RBC是一种用于增加肿瘤细胞毒性和IFN-γ产生的治疗性递送系统。

在一些实施方案中，活性剂可以包含小分子，例如用作靶向部分、免疫调节剂、检测剂、治疗剂或配体(例如CD19、CD47、TRAIL、TGF、CD44)以激活或抑制相应受体的小分子。

在一些实施方案中，活性剂可以包含受体或受体片段。在一些实施方案中，受体是细胞因子受体、生长因子受体、白介素受体或趋化因子受体。在一些实施方案中，生长因子受体是TNFα受体(例如，I型TNF-α受体)、VEGF受体、EGF受体、PDGF受体、IGF受体、NGF受体或FGF受体。在一些实施方案中，受体是TNF受体、LDL受体、TGF受体或ACE2。

在一些实施方案中，与红细胞缀合的活性剂可以包括抗癌剂或抗肿瘤剂，例如化疗药物。在某些实施方案中，红细胞与抗肿瘤剂和靶向部分两者缀合，其中靶向部分将红细胞靶向癌症。抗癌剂常规可分类为以下组之一：放射性同位素(例如，碘-131、镥-177、铼-188、钇-90)、毒素(例如，白喉、假单胞菌毒素、蓖麻毒素、白树毒素(gelonin))、酶、激活前药的酶、放射增敏药物、干扰RNA、超抗原、抗血管生成剂、烷化剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、植物生物碱、嵌入型抗生素、芳香酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素和抗雄激素。在一些实施方案中，抗肿瘤剂是蛋白质，例如单克隆抗体或双特异性抗体，例如抗受体酪氨酸激酶(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗)、抗CD20(例如，利妥昔单抗和托西莫单抗)和其他抗体，例如阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐单抗和吉妥珠单抗(gemtuzumab)；酶，如天冬酰胺酶；化疗药物，包括例如烷化剂和类烷化剂，例如氮芥；铂剂(例如，类烷化剂，例如卡铂、顺铂)、白消安、达卡巴嗪、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派、曲奥舒凡和乌拉莫司汀；嘌呤类如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤；嘧啶类如卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类抗生素(例如柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、米托蒽醌、吡蒽醌(pixantrone)和戊柔比星(valrubicin))；和其他，例如紫杉醇、诺考达唑或β-紫罗兰酮(β-Ionone)。通过膜蛋白荷载抗肿瘤剂的RBC有望降低抗生素毒性和增加循环时间，并且可以发挥缓慢药物递送的作用。

在一些实施方案中，肿瘤是恶性肿瘤或“癌症”。术语“肿瘤”包括恶性实体瘤(例如，癌瘤、肉瘤)和没有可检测的实体瘤块的恶性生长(例如，某些血液恶性肿瘤)。术语“癌症”在本文中通常与“肿瘤”互换使用和/或指以一种或多种肿瘤，例如一种或多种恶性或潜在恶性的肿瘤为特征的疾病。癌症包括但不限于：乳腺癌；胆道癌；膀胱癌；脑癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液肿瘤；T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤；成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；黑色素瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括来源于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的卵巢癌；神经母细胞瘤；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括血管肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；肾癌，包括肾细胞癌和肾母细胞瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌。

在一些实施方案中，与红细胞缀合的活性剂可以包括抗微生物剂。抗微生物剂可包括抑制细菌、病毒、真菌、寄生物的增殖或活性、破坏或杀死细菌、病毒、真菌、寄生物的化合物。在一些实施方案中，红细胞与抗细菌、病毒、真菌或寄生物的抗微生物剂和靶向部分缀合，其中靶向部分将细胞靶向细菌、病毒、真菌或寄生物。在一些实施方案中，抗微生物剂可以包括用于治疗细菌感染的β-内酰胺酶抑制蛋白或金属-β-内酰胺酶。

在一些实施方案中，与红细胞缀合的活性剂可包括探针，其可用作例如诊断工具。分子成像已被证明是跟踪癌症等疾病进展的有效方法。可如本文所述通过分选酶A的酶促反应，而非可能对细胞造成损伤的常规化学反应，将小分子探针如荧光素标记在RBC上。

在一些实施方案中，与红细胞缀合的活性剂可包含前药。术语“前药”是指这样的化合物，该化合物可以在体内给药后被代谢或以其他方式转化为该化合物的生物学、药学或治疗上的活性形式。可以设计前药以改变化合物的代谢稳定性或转运特性、掩蔽副作用或毒性、改善化合物的味道和/或改变化合物的其他特性或性质。基于对体内药效过程和药物代谢的了解，一旦鉴定出具有药学活性的化合物后，药学领域的技术人员通常可以设计出该化合物的前药(Nogrady,“Medicinal Chemistry A Biochemical Approach”,1985,Oxford University Press:N.Y.,pages 388-392)。用于选择和制备合适前药的程序也是本领域已知的。在本发明的上下文中，前药优选是在体内给药后其活性形式的转化涉及酶催化的化合物。

共价修饰内源性、非工程化RBC膜蛋白的方法

在一个方面，本发明提供了一种用于共价修饰红细胞的至少一种内源性、非工程化膜蛋白的方法，包括使RBC与本文所述包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在分选酶存在的情况下、在适于分选酶通过分选酶介导的反应(优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链缀合)将分选酶底物缀合到RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白上的条件下进行。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域(例如，胞外结构域的内部位点)的甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基基团上，优选n为1或2。在一些实施方案中，不限于理论，分选酶介导的甘氨酸缀合也可以发生在先前未报道的膜蛋白中由于红细胞生成过程中的组织特异性mRNA剪接和蛋白质翻译而暴露的甘氨酸_(n＝1或2)上。在一些实施方案中，分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合发生在胞外结构域的末端赖氨酸或内部赖氨酸的ε-氨基基团上。

应当理解，本领域普通技术人员能够根据分选酶底物的性质、分选酶的类型等，选择适于分选酶将分选酶底物缀合至所述至少一种内源性、非工程化膜蛋白的条件(例如，最适温度、pH)。

用途

本文描述的分选标记的红细胞具有多种用途。在一些实施方案中，分选标记的红细胞可以用作疫苗成分、递送系统或诊断工具。在一些实施方案中，分选标记的红细胞可用于治疗或预防本文所述的各种病症、病状或疾病，例如肿瘤或癌症、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)、细菌感染、病毒感染，例如冠状病毒，例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染、自身免疫性疾病或炎性疾病。在一些实施方案中，分选标记的红细胞可用于细胞治疗。在一些实施方案中，施用治疗剂以治疗癌症、感染如细菌或病毒感染、自身免疫疾病或酶缺乏症。在一些实施方案中，用诱导免疫耐受的肽分选标记的红细胞可用于调节免疫反应，例如诱导免疫耐受。在一些实施方案中，施用的红细胞可以源自其待施用于的个体(自体的)，可以源自相同物种的遗传相同的不同个体(同基因的)，可以源自相同物种的非遗传相同的不同个体(同种异体的)，或可以源自不同物种的个体。在某些实施方案中，同种异体红细胞可源自与待接受所述细胞施用的受试者具有免疫相容性的个体。

在一些实施方案中，分选标记的红细胞用作活性剂的递送载体或系统。例如，表面缀合有蛋白质的分选标记的红细胞，可用作所述蛋白质的递送载体。此类细胞可施用于患有该蛋白质缺乏症或可能受益于该蛋白质水平增加的受试者。在一些实施方案中，例如通过输注，将细胞施用至循环系统。上文提供了与各种蛋白质(例如酶)缺乏相关的各种疾病的例子。在一些实施方案中，使用分选标记的RBC作为递送系统可以实现延时释放(retention release)，例如用于以延时释放方式递送激素如糖皮质激素、胰岛素和/或生长激素。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的方法，包括将本文所述的红细胞或组合物施用于受试者。在一些实施方案中，所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)、细菌感染、病毒感染如冠状病毒例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染、自身免疫性疾病和炎性疾病。

如本文所用，“治疗”、“治疗性”或“治疗的”是指，在病原体相关疾病、病症或病状的症状或病理体征开始出现后，至少部分地改善、消除或减轻该疾病、病症或病状的症状或病理体征的治疗性干预。治疗并无需对受试者绝对有益。可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法或标准来确定有益效果。

如本文所用，“预防”、“预防性”或“防止”是指，在被病原体或其分子成分感染之前、或暴露于病原体或其分子成分之前、和/或在疾病、病症或病状的症状或病理体征出现之前开始的行动过程，旨在防止感染和/或减轻所述症状或病理体征。应当理解，这样的预防并无需对受试者绝对有益。“预防性”处理是对未表现出疾病、病症或病状的体征或仅表现出早期体征的受试者进行的处理，目的是降低出现所述疾病、病症或病状的症状或病理体征的风险。

在一些实施方案中，如本文所述的方法进一步包括将缀合的红细胞施用于受试者，例如，直接施用到循环系统中，例如，静脉内施用，通过注射或输注方式施用。

在另一个方面，本发明提供了一种向有需要的受试者递送活性剂的方法，包括向受试者施用本文所述的红细胞或组合物。术语“递送”是指将分子或活性剂运输到所需的细胞或组织部位。可以递送至细胞表面、细胞膜、细胞内体、细胞膜内、细胞核或细胞核内，或任何其他期望的细胞区域。

在另一个方面，本发明提供了一种增加活性剂在受试者中的循环时间或血浆半衰期的方法，包括提供包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物，和缀合分选酶底物，其中所述缀合在分选酶存在下、在适于分选酶通过分选酶介导的反应(优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合)将分选酶底物缀合到红细胞的至少一种内源性非工程化膜蛋白上的条件下进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括将所述红细胞施用于受试者，例如，直接施用到循环系统，例如，静脉内或通过注射或输注施用。

在一些实施方案中，受试者在一个治疗过程中接受单个剂量的细胞，或接受多个剂量的细胞，例如，2至5、10、20或更多个剂量。在一些实施方案中，剂量或总细胞数可以表示为细胞/kg。例如，剂量可为约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸个细胞/kg。在一些实施方案中，一个疗程持续约1周至12个月或更长时间，例如1、2、3或4周或2、3、4、5或6个月。在一些实施方案中，受试者可以大约每2-4周接受一次治疗。本领域普通技术人员将理解，细胞数量、剂量和/或给药间隔可以基于各种因素例如受试者的体重和/或血容量、所治疗的病症、患者的反应来选择。所需细胞的确切数量可因受试者而异，这取决于诸如受试者的物种、年龄、体重、性别和一般状况、疾病或病症的严重程度、(一种或多种)特定细胞、与细胞缀合的(一种或多种)活性剂的性质及活性、给药方式、并行的治疗等因素。

组合物

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述的红细胞和任选地生理学上可接受的载体，例如以药物组合物、递送组合物或诊断组合物或药盒的形式。

在一些实施方案中，组合物可以包含多数个红细胞。在一些实施方案中，组合物中至少选定百分比的细胞被修饰，即具有通过分选酶与其缀合的活性剂。例如，在一些实施方案中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞具有与其缀合的活性剂。在一些实施方案中，包括与不同活性剂缀合的两种或更多种红细胞或红细胞群。

在一些实施方案中，组合物包含分选标记的红细胞，其中所述细胞用任何感兴趣的活性剂分选标记。在一些实施方案中，组合物包含有效量的细胞，例如不超过约10¹⁴个细胞,例如约10、10²、10³、10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、10⁹、5×10⁹、10¹⁰、5×10¹⁰、10¹¹、5×10¹¹、10¹²、5×10¹²、10¹³、5×10¹³或10¹⁴个细胞。在一些实施方案中，细胞的数量可以在上述数量之任意两个之间。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现目的生物反应或效果(例如，减轻疾病或病症的一种或多种症状或表现或调节免疫反应)的量。在一些实施方案中，向受试者施用的组合物包含不超过约10¹⁴个细胞，例如约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个细胞，或任何居间数量或范围。

在另一方面，本方面的组合物可包含分选酶和分选酶底物但不含红细胞。所述组合物可以施用于受试者的循环系统，并且如本文描述，在体内接触红细胞后，分选酶将通过分选酶介导的反应使分选酶底物缀合到红细胞的至少一种内源性非工程化膜蛋白上。在这种形式的组合物中，不存在红细胞不相容的风险以及诸如来自供体细胞的细菌或病毒污染等其他风险。在一些实施方案中，分选酶已被进一步修饰，(通过例如PEG化或融合至Fc片段)增强了其在循环中的稳定性和/或降低了其免疫原性。

如本文所用，术语“生理学上可接受的载体”是指可以安全地用于全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据具体的给药途径，可以使用本领域熟知的多种载体、稀释剂和赋形剂。这些可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水、和盐，如矿物酸的盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐，水和无热原水。

本领域技术人员将理解，也可以实施本文描述的实施方案的其他变型，而不偏离本发明的范围。因此，其他改变是可以的。

尽管已经以一定的详细程度以示例性形式描述和说明了本发明，但是应当注意，这些描述和说明仅是以举例说明的形式作出。可以对部分和步骤的构成和组合及其排布的细节进行许多改变。因此，这些变化旨在包括在本发明中，本发明的范围由权利要求书限定。

实施例

实施例1.MgSrtA介导的蛋白质-细胞缀合

方法

大肠杆菌中的重组蛋白表达和纯化

将mgSrtA(SEQ ID NO:3)、wtSrtA(SEQ ID NO:1，从N端去除了25个氨基酸)和eGFP-LPETG cDNA克隆到pET载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中用于蛋白质表达。转化的细胞在37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后加入500μM IPTG在37℃培养4小时。之后，通过离心收获细胞并通过预冷的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，100mM NaCl)进行裂解。裂解物在冰上超声处理(5秒开，5秒关，60个循环，25％功率，Branson Sonifier550超声波细胞破碎仪)。所有上清液在4℃14,000g离心40min后用0.22μM过滤器过滤。将过滤后的上清液上样到与设计的色谱系统相连的HisTrap FF 1mL柱(GEHealthcare)上。用含有20mM Tris-HCl，pH7.8、100mM NaCl和300mM咪唑的洗脱缓冲液，洗脱蛋白质。在12％SDS-PAGE凝胶上分析所有洗脱的级分。

wtSrtA或mgSrtA介导的对膜蛋白的酶标记

反应在PBS缓冲液中以200μL的总体积在37℃和10rpm的旋转速度下进行2小时。wtSrtA或mgSrtA的浓度为20-40μM，生物素-LPETG或GFP-LPETG底物在200-1000μM的范围。在酶促反应之前，人或小鼠RBC用PBS洗涤两次。反应中RBC的浓度为1×10⁶/mL至1×10¹⁰/mL。反应后，将RBC洗涤3次并在室温与链霉亲和素-藻红蛋白(PE)一起孵育10分钟，然后通过Beckman Coulter CytoFLEX LX或Merck Amnis Image Stream MarkII进行分析。

RBC膜蛋白的富集

将生物素标记的RBC重新悬浮在PBS中并在冰上进行超声处理(10秒开，10秒关，3个循环，25％功率，SONICS VCX150)。通过在4℃、300×g下离心15分钟，去除完整的细胞。通过冷冻和冻干获得干燥的粉末，然后与50mL冰冷的0.1M碳酸钠(pH＝11)在4℃和10rpm速度的轻柔旋转下孵育1小时。通过在4℃以125,000xg超速离心1小时，将膜级分沉淀下来，然后用Milli-Q水以相同速度洗涤两次30分钟。然后将样品与2mL冰冷的80％丙酮在-20℃孵育2小时以进行蛋白质沉淀。在4℃以130,000×g离心15分钟，收集膜蛋白。将膜蛋白样品重新溶解在1％SDS中，并使用12％SDS-PAGE通过凝胶电泳进行分析。

凝胶内消化

整块凝胶在室温下用考马斯蓝(H₂O、0.1％w/v考马斯亮蓝R250、40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)染色，轻轻摇晃过夜，然后用脱色溶液(40％v/v甲醇和10％v/v乙酸水溶液)脱色。凝胶在室温在蒸馏水中再水化3次10分钟，期间轻轻振荡。将蛋白质条带切出并进一步切成约1×1mm²块，然后在25℃用25mM NH₄HCO₃中的10mM TCEP还原30分钟，在25℃避光用25mM NH₄HCO₃溶液中的55mM IAA烷基化30分钟，随后用浓度100单位/ml的rPNGase F在37℃消化4小时，然后用浓度12.5ng/mL的胰蛋白酶在37℃消化过夜(第一次消化4小时，第二次消化12小时)。然后使用50％ACN/2.5％FA从凝胶块中提取胰蛋白酶消化肽3次，并在真空下干燥肽溶液。干燥的肽通过Pierce C18 Spin Tips(Thermo Fisher,USA)纯化。

质谱分析

在MS注射之前，将Biognosys-11iRT肽(Biognosys,Schlieren,CH)以10％的最终浓度掺入肽样品中，用于RT校准。肽通过Ultimate 3000nanoLC-MS/MS系统(Dionex LC-Packings，Thermo Fisher Scientific^TM，San Jose，USA)分离，该系统配备有15cm×75μmID熔融石英柱，填充有1.9μmC18。注射后，在装有3μm/>C18 Aqua的20mm×75μm ID捕集柱上，在0.1％甲酸和2％ACN中，以6μL/min的速度捕集500ng肽。以300nL/min的流速，通过60分钟3-28％线性LC梯度(缓冲液A：2％ACN、0.1％甲酸(Fisher Scientific)；缓冲液B：98％ACN、0.1％甲酸)分离肽(两次注射之间总共108分钟)。洗脱肽在+1.8kV的电压下电离并进入Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Fisher Scientific^TM，San Jose，USA)中。使用3E6电荷的AGC目标值和80ms的最大离子注射时间，在Orbitrap中以60,000(m/z 200)的分辨率，测量完整质量。前20个肽信号(电荷状态高于2+且低于+6)在HCD室(1.6amu隔离宽度，27％归一化碰撞能量)中进行MS/MS分析。使用1E5电荷的AGC目标值和最大离子注射时间100ms，在Orbitrap中以30,000(m/z 200)的分辨率获取MS/MS谱。应用动态排除，重复计数为1，排除时间为30秒。Maxquant(版本1.6.2.6)用作搜索引擎，其中固定修饰是半胱氨酸(Cys)的脲甲基化，甲硫氨酸(Met)氧化为可变修饰。可变修饰包括氧化(M)、脱酰胺(NQ)、GX808-G-N、GX808-G-任何位置、GX808-K-侧链。(详见表1)。其他参数使用默认设置。数据相对于2018年9月的Swissprot Mouse数据库进行搜索，并进一步以FDR≤1％过滤数据。

结果:

我们首先表征了在RBC膜上mgSrtA介导的标记的功效。wtSrtA基于其对蛋白质或肽的N末端三个甘氨酸的识别而被用作对照。我们的结果表明，>99％的天然小鼠或人RBC在体外通过mgSrtA被生物素标记。相比之下，在wtSrtA处理的小鼠或人RBC表面上以及在没有酶的模拟对照组的小鼠或人RBC表面上，未检测到显著的生物素信号(图1A和1B)。蛋白印迹分析也支持我们的流式细胞术结果，证明mgSrtA介导了小鼠RBC的生物素标记(图1C)。为了进一步验证这一发现，来自mgSrtA标记组或模拟对照组的天然小鼠RBC的膜蛋白，按照描述[6]，通过超速离心富集(图1D)。正如预期的那样，在RBC膜蛋白富集后[6]，在mgSrtA标记组中检测到生物素信号显著增加(图1E)。为了评估这些表面修饰的RBC在体内的寿命，我们接下来将同时标记了荧光染料DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)的生物素-LPETG标记的小鼠RBC，输注到野生型受体小鼠中。定期分析体内DiR和生物素阳性RBC的百分比。我们发现，通过mgSrtA标记生物素的RBC不仅显示出与对照组相同的寿命，而且在循环过程中保持90％的生物素阳性(图1F、1G和1H)。成像分析也显示了细胞表面上令人信服的生物素信号和mg分选酶标记的RBC的正常形态(图1I)。我们还用eGFP-LPETG对RBC进行了分选标记，并将其输注到野生型小鼠中。正如预期的那样，在体内检测到通过mgSrtA而非wtSrtA实现的与eGFP缀合的RBC，并且检测到的RBC表现出正常的细胞形态(图1J和1K)。总之，我们的数据表明，在体外和体内均有效地实现了由mgSrtA介导的、肽和蛋白质在天然RBC表面上的标记。

先前的研究表明，结合特异性抗原的RBC能够在几种动物疾病模型中诱导免疫耐受[8]。体外产生的标记了OT-1肽(具有SIINFEKL序列的卵清蛋白(OVA)表位)的小鼠RBC，在自身免疫性疾病小鼠模型中诱导CD8⁺T细胞的免疫耐受，其中所述CD8⁺T细胞具有识别H-2K^b-SIINFEKL的转基因TCR[8]。我们将从OT1 TCR小鼠纯化的CD8⁺CD45.1 T细胞过继转移到CD45.2受体小鼠中(图2A)。24小时后，将相同数量的如下天然小鼠RBCs注射到受体小鼠中，其中所述天然小鼠RBCs已经用或未用OT-1肽通过mgSrtA进行过修饰。接受OT-1-RBC的受体小鼠中CD8⁺CD45.1 T细胞的数量，与注射了未修饰RBC的小鼠相比，在OT-1肽攻击后减少了约7倍。值得注意的是，与注射天然RBC的受体小鼠相比，接受OT-1-RBC的小鼠中PD1⁺CD8⁺CD45.1⁺T细胞的百分比高出4倍以上。两组T细胞上CD44的表达水平均未发生变化，这与以往研究一致[8][9]。这些数据表明，携带OT-1肽的mgSrtA修饰的RBC可诱导OT-1TCR T细胞衰竭，比以前的策略[8]可以更方便和更有效地应用。

我们接下来旨在鉴定用作mg分选酶介导的反应的底物的RBC膜蛋白。通过质谱(MS)分析了通过mgSrtA标记生物素的RBC；检测到在甘氨酸(G)或赖氨酸(K)侧链上可能被生物素分子修饰的122种候选蛋白质(表1)。这些蛋白质中的68和54种分别在甘氨酸和赖氨酸侧链上被修饰(表2和表3)。所鉴定的蛋白质中18种检测到两种修饰(表4)。在所有鉴定的蛋白质中，表5中所示的22种蛋白质被注释为膜蛋白。例如，钙敏感受体(CaSR)是一种G蛋白偶联受体，可感应循环中的钙浓度。先前的研究已经确定CaSR是RBC表面的一种膜蛋白，可调节红细胞稳态[10]。有趣的是，在G526和K527位置检测到生物素信号，这两个位置都不靠近CaSR的N末端。此外，其余21种膜蛋白也没有在N末端的生物素修饰的甘氨酸。由此，我们确定了包括CaSR在内的、RBC表面上可与生物素分子共价连接的膜蛋白。

鉴定的RBC上生物素标记的膜蛋白显示在表1中。对图1E中富集的生物素标记的或天然的RBC膜蛋白进行MS分析。将富集的RBC膜蛋白加载到1D凝胶电泳中，进行最后的凝胶内消化，之后注射到MS仪器中。显示了MaxQuant软件的配置，即在N末端和任意位置的甘氨酸和赖氨酸上的分子量(808g/mol)增加，肽段搜索基于UniProt蛋白质数据库进行。

表1.

来自甘氨酸上有生物素-肽修饰的RBC的68种候选蛋白质的列表显示在表2中。

表2.

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来自(一个或多个)赖氨酸侧链上有生物素-肽修饰的RBC的54种候选蛋白质的列表显示在表3中。

表3

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来自在甘氨酸和赖氨酸侧链上有生物素-肽修饰的RBC的18种候选蛋白质的列表显示在表4中。

表4.

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来自在甘氨酸和赖氨酸侧链上有生物素-肽修饰的RBC的22种候选膜蛋白的列表显示在表5中。

表5.

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实施例2.Mg SrtA介导的经不可逆接头进行的蛋白质-细胞缀合

方法

大肠杆菌中的重组蛋白表达和纯化

将Mg SrtA和eGFP-cys cDNA克隆在pET载体中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞用于蛋白质表达。转化的细胞在37℃培养，直到OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后加入500μM IPTG。在37℃用IPTG培养细胞4小时，直到离心收获细胞，并用预冷的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，500mM NaCl)进行裂解。裂解物在冰上进行超声处理(5秒开，5秒关，60个循环，25％功率，Branson Sonifier 550超声波细胞破碎仪)。在4℃下14,000g离心40分钟后，将所有上清液通过0.45μM滤器过滤。将过滤后的上清液上样到与设计色谱系统连接的HisTrap FF 1mL柱(GE Healthcare)上。用含有20mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl和300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。在SDS-PAGE凝胶上分析所有洗脱的级分。

通过半胱氨酸偶联将不可逆接头缀合至蛋白质

合成了纯度超过99％的不可逆接头6-马来酰亚胺基己酸-Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly(6-马来酰亚胺基己酸-LPET-(2-羟基乙酸)-G，6-Mal-LPET*G)。反应在PBS缓冲液中以总体积1mL在室温和10rpm转速下进行1小时。6-Mal-LPET*G和eGFP-cys蛋白的浓度分别为2mM和500μM。此方法使用相对于eGFP-cys蛋白为四倍摩尔过量的不可逆接头。反应后，通过透析和超滤除去过量的不可逆接头，收集eGFP-cys-6-Mal-LPET*G产物。

MgSrtA介导的膜蛋白的酶促标记

反应在PBS缓冲液中以总体积200μL在37℃和10rpm转速下进行2小时。mg SrtA的浓度为10μM，eGFP-cys-6-Mal-LPET*G底物在25-75μM的范围内。用PBS洗涤人或小鼠RBC两次，然后进行酶促反应。反应中RBC的浓度为1×10⁹/mL。反应后，通过Beckman CoulterCytoFLEX LX或Merck Amnis Image Stream MarkII分析RBC的标记效率。

通过质谱法鉴定产物

在配有ZORBAX 300SB-C3柱(2.1×150mm)(Agilent Technologies)的1260Infinity II系统(Agilent Technologies)上，进行蛋白质的色谱脱盐和分离。将1μg蛋白质上样到柱上，并用流动相A(水，0.1％甲酸)和流动相B(乙腈，0.08％甲酸)的梯度以0.4ml/分钟的流速从干扰物中分离。所述梯度为12分钟内5％-95％流动相B。色谱分离后，在配有双ESI离子源的6230TOF LC/MS质谱仪(Agilent Technologies)上分析蛋白质样品。从总离子色谱图(TIC)提取TOF-MS谱，并使用BioConfirm 10.0软件(AgilentTechnologies)中的Maximum Entropy去卷积。

凝胶内消化

整块凝胶在室温下用考马斯蓝(H₂O、0.1％w/v考马斯亮蓝R250、40％v/v甲醇和10％v/v乙酸)染色，轻轻摇晃过夜，然后用脱色溶液(40％v/v甲醇和10％v/v乙酸水溶液)脱色。凝胶在室温在蒸馏水中再水化3次10分钟，期间轻轻振荡。将蛋白质条带切出并进一步切成约1×1mm²块，然后在25℃用25mM NH₄HCO₃中的10mM TCEP还原30分钟，在25℃避光用25mM NH₄HCO₃溶液中的55mM IAA烷基化30分钟，随后用浓度100单位/ml的rPNGase F在37℃消化4小时，用浓度12.5ng/mL的胰蛋白酶在37℃消化过夜(第一次消化4小时，第二次消化12小时)。然后使用50％ACN/2.5％FA从凝胶块中提取胰蛋白酶消化肽3次，并在真空下干燥肽溶液。干燥的肽通过Pierce C18 Spin Tips(Thermo Fisher,USA)纯化。

结果

我们首先表征了用于蛋白质缀合的不可逆接头。用eGFP来测试反应的缀合效率。我们表达并纯化了在C端具有半胱氨酸的eGFP(eGFP-cys)。我们还合成了不可逆接头6-Mal-LPET*G。这两种反应底物以1:4＝eGFP-cys:6-Mal-LPET*G的比例混合用于反应(图6)。收集反应的终产物进行质谱鉴定。结果显示，反应产物的分子量是反应底物和不可逆接头的总和(图8)。根据对eGFP的结构分析，C端半胱氨酸暴露于反应。为了进一步验证反应是否发生在C端半胱氨酸的巯基上，我们进行了串联质谱分析。结果显示，所有修饰都在C端半胱氨酸上(图9)。

然后我们表征了不同种类的eGFP在RBC膜上的标记效力。用eGFP-LPETG作为可逆底物对照。我们的结果显示，>75％的天然RBC在体外通过mg SrtA标记上eGFP-cys-6-Mal-LPET*G。相反，使用可逆底物eGFP-LPETG，仅在RBC表面检测到约30％的信号(图10)。

为了评估这些表面修饰的RBC在体内的寿命，我们接下来将同时标记了荧光染料DiR(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)的eGFP-cys-6-Mal-LPET*G标记的小鼠RBC，输注到野生型受体小鼠中。定期分析体内DiR和eGFP-cys-6-Mal-LPET*G阳性RBC的百分比。我们发现，通过mg SrtA标记上eGFP-cys-6-Mal-LPET*G的RBC不仅显示出与对照组相同的寿命，而且显示出在循环中持续35天的eGFP-cys-6-Mal-LPET*G信号(图11、12和13)。成像分析还显示了细胞表面令人信服的eGFP-cys-6-Mal-LPET*G信号以及通过mg SrtA标记eGFP-cys-6-Mal-LPET*G的RBC的正常形态(图14)。

虽然已经举例和描述了本发明的实施方案，但这些实施方案并非旨在举例和描述本发明的所有可能形式。相反，本说明书中使用的词语是描述性词语而非限制性词语，应理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行多种改变。

实施例3.通过不可逆接头由Mg SrtA介导的HPV16-hMHC1蛋白-细胞缀合

方法

HPV16-MHC1蛋白的重组表达和纯化

通过离心和微过滤分离细胞后，将superHPV16-MHC cDNA克隆到pcDNA3.1载体中。将cDNA和电穿孔缓冲液混合，然后放入电穿孔杯中。使用Flow Electroporator EBXP-F1(X-Porator F1，Etta，中国苏州)，按照针对CHO细胞优化的厂家流程，将载体电穿孔到CHO细胞中。7天后，通过在4℃下14,000g离心40分钟，收集所有上清液，并用0.22μM滤器过滤。通过离心和微过滤分离细胞，将包含所表达的HPV16-MHC1蛋白的上清液，上样到用结合缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.6)平衡的具有Ni2+离子的IMAC Bestarose FF柱(Bestchrom，中国上海)上。用结合缓冲液洗涤柱，然后用洗脱缓冲液1(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.6)洗脱，直到280nm处的UV吸光度变得稳定。用洗脱缓冲液2(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、100mM咪唑、pH7.6)收集蛋白质。HPV16-hMHC1蛋白的核酸序列和氨基酸序列如下：

DNA序列(SEQ ID NO:27)

/>

氨基酸序列(SEQ ID NO:28)

然后用ddH2O(1:1)稀释蛋白质级分，并将其上样到用结合缓冲液(10mM Tris-HCl，250mM NaCl，pH7.6)平衡的Diamond Mix-A柱(Bestchrom，中国上海)上。用结合缓冲液洗涤后，用洗脱缓冲液1(13.3mM Tris-HCl，337.5mM NaCl，pH7.6)洗脱，用洗脱缓冲液2(20mM Tris-HCl，2000mM NaCl，pH7.6)洗脱目标蛋白，然后用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore，Darmstadt，德国)浓缩。

将浓缩的蛋白质上样到用PBS平衡的Chromadex 200pg(Bestchrom，中国上海)上，并收集目标蛋白级分。将蛋白质浓缩并储存在-80℃。

通过半胱氨酸偶联将不可逆接头缀合至HPV16-MHC1

合成了纯度超过99％的不可逆接头6-马来酰亚胺基己酸-Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly(6-马来酰亚胺基己酸-LPET-(2-羟基乙酸)-G，6-Mal-LPET*G)。反应在PBS缓冲液中以总体积1mL在室温和10rpm转速下进行1小时。6-Mal-LPET*G和HPV16-MHC1蛋白的浓度分别为2mM和500μM。此方法使用相对于HPV16-MHC1蛋白为两倍摩尔过量的不可逆接头。反应后，通过透析和超滤除去过量的不可逆接头，收集HPV16-MHC1-LPET*G产物。

Mg SrtA介导的HPV16-MHC1-LPET*G标记

通过密度梯度离心从外周血分离红细胞。分离的红细胞用PBS洗涤3次。反应在PBS缓冲液中以10rpm的转速进行。反应中RBC的浓度为1×10⁹/mL。mg SrtA的浓度为10μM，HPV16-MHC1-LPET*G底物的浓度为25μM。反应后，通过Beckman Coulter CytoFLEX LX分析RBC的标记效率。

结果

我们表征了mg SrtA介导的HPV16(YMLDLQPET)-hMHC1在RBC膜上标记的效力。通过将标记的RBC与PE缀合的抗Fc标签抗体孵育来检测缀合效力，并通过流式细胞术分析。图15中的结果显示，>99％的天然人RBC在体外通过mg SrtA标记了HPV16(YMLDLQPET)-hMHC1。相反，使用不含mg SrtA酶的模拟对照组，在人RBC表面未检测到显著的Fc标签信号。

实施例4.通过不可逆接头由Mg SrtA介导的UOX蛋白-细胞缀合

方法

UOX-Cys、UOX-His₆-Cys或UOX-(GS)₃-Cys在大肠杆菌中的重组表达和纯化

针对在大肠杆菌中表达对UOX(黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸酶)的编码序列进行密码子优化，并由GenScript合成。通过标准PCR方法产生亚克隆，并插入到pET-30a载体中，其中在C端His₆或(GS)₃接头后接额外的半胱氨酸残基。所有构建体都通过测序验证，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白质表达。UOX-His₆-Cys和UOX-(GS)₃-Cys的核酸序列和氨基酸序列如下。

UOX-His₆-Cys：

DNA序列(SEQ ID NO:29)

氨基酸序列(SEQ ID NO:30)

UOX-(GS)₃-Cys：

DNA序列(SEQ ID NO:31)

氨基酸序列(SEQ ID NO:32)

将转化的单菌落接种到10ml补充氨苄青霉素(100μg/ml)的Luria Bertani(LB)培养基中，并在37℃下220rpm振荡培养过夜。将此10ml培养物转移到1L新鲜LB培养基中，并在37℃下220rpm振荡培养该培养物，直到OD₆₀₀达到0.6。然后将温度降至20℃，并加入1mMIPTG进行诱导。

诱导后20小时，通过在4℃下8000rpm离心10分钟收集细胞。对于无His₆标签的蛋白质，将细胞沉淀重悬在低盐裂解缓冲液(50mM Tris 7.5，50mM NaCl)中，并用超声处理裂解。将10000rpm离心1小时后收集的上清液，上样到用SPA缓冲液(20mM Tris 7.5)预平衡的SP Sepharose FF柱(Cytiva，Marlborough，USA)上。用SPA缓冲液洗涤柱，直到280nm处的吸光度和电导率变得稳定，然后使用20mM Tris 7.5中0-1M NaCl的线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析对应于洗脱峰的级分，并合并最纯的级分。为了避免半胱氨酸氧化，将2mM TCEP添加到合并的级分中，并使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore，Darmstadt，德国)进行样品浓缩。将浓缩的蛋白质上样到用PBS预平衡的EzLoad 16/60Chromadex 200pg(Bestchrom，中国上海)上，并收集目标蛋白峰。对于具有His₆标签的蛋白质，将细胞沉淀重悬在裂解缓冲液(50mM Tris 7.5、200mM NaCl、5mM咪唑)中，并用超声处理裂解。带标签的蛋白质通过Ni-Sepharose 6FF亲和柱(Cytiva)和阴离子交换柱，随后通过大小排阻层析，进行纯化。所有蛋白质均储存在-80℃。

通过半胱氨酸偶联将不可逆接头缀合至UOX-Cys、UOX-His₆-Cys或UOX-(GS)₃-Cys

合成了纯度99％以上的不可逆接头6-马来酰亚胺基己酸-Leu-Pro-Glu-Thr-2-羟基乙酸-Gly(6-马来酰亚胺基己酸-LPET-(2-羟基乙酸)-G，6-Mal-LPET*G)。反应在PBS缓冲液中以总体积1mL在室温和10rpm转速下进行1小时。6-Mal-LPET*G和UOX-cys(UOX-His₆或UOX-(GS)₃-Cys)蛋白的浓度分别为2mM和500μM。此方法使用相对于UOX-Cys、UOX-His₆-Cys和UOX-(GS)₃-Cys蛋白为两倍摩尔过量的不可逆接头。反应后，通过透析和超滤除去过量的不可逆接头，收集UOX-Cys-LPET*G或UOX-His₆-Cys-LPET*G或UOX-(GS)₃-Cys-LPET*G产物。

Mg SrtA介导的UOX-Cys-LPET*G或UOX-His₆-Cys-LPET*G或UOX-(GS)₃-Cys-LPET*G 的标记

反应在PBS缓冲液中以总体积200μL～15mL在37℃和10rpm转速下进行2小时。mgSrtA的浓度为10μM，UOX-Cys-LPET*G或UOX-His₆-Cys-LPET*G或UOX-(GS)₃-Cys-LPET*G底物的浓度在10-100μM范围中。用PBS洗涤人或小鼠或大鼠或食蟹猴RBC两次，然后进行酶促反应。反应中RBC的浓度为5×10⁹～1×10¹⁰/mL。反应后，通过与FITC-His标签孵育RBC来检测RBC的标记效力，并通过流式细胞术分析。

结果

我们表征了mgSrtA介导的UOX-His₆-Cys-LPET*G在RBC膜上标记的效力。将5×10⁹～1×10¹⁰/mL小鼠(图16A)或人(图16B)或大鼠(图16C)或食蟹猴(图16D)RBC与100μM UOX-His₆-Cys-LPET*G在有或没有10μM mgSrtA的情况下在37℃孵育2小时。酶促反应后，通过将RBC与PE-缀合的抗His标签抗体孵育来检测标记效力，并通过流式细胞术分析。直方图显示在有或没有mg分选酶的情况下标记的RBC表面的His标签信号。

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<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(S. aureus)

<400> 1

Met Lys Lys Trp Thr Asn Arg Leu Met Thr Ile Ala Gly Val Val Leu

1 5 10 15

Ile Leu Val Ala Ala Tyr Leu Phe Ser Lys Pro His Ile Asp Asn Tyr

20 25 30

Leu His Asp Lys Asp Lys Asp Glu Lys Ile Glu Gln Tyr Asp Lys Asn

35 40 45

Val Lys Glu Gln Ala Ser Lys Asp Lys Lys Gln Gln Ala Lys Pro Gln

50 55 60

Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp

65 70 75 80

Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Pro Glu Gln

85 90 95

Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn Glu Ser Leu Asp Asp

100 105 110

Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile Asp Arg Pro Asn Tyr

115 120 125

Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser Met Val Tyr Phe

130 135 140

Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr Ser Ile Arg Asp

145 150 155 160

Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu Gln Lys Gly Lys Asp

165 170 175

Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn Glu Lys Thr Gly

180 185 190

Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr Glu Val Lys

195 200 205

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(S. aureus)

<400> 2

atgaaaaaat ggacaaatcg attaatgaca atcgctggtg tggtacttat cctagtggca 60

gcatatttgt ttgctaaacc acatatcgat aattatcttc acgataaaga taaagatgaa 120

aagattgaac aatatgataa aaatgtaaaa gaacaggcga gtaaagataa aaagcagcaa 180

gctaaacctc aaattccgaa agataaatcg aaagtggcag gctatattga aattccagat 240

gctgatatta aagaaccagt atatccagga ccagcaacac ctgaacaatt aaatagaggt 300

gtaagctttg cagaagaaaa tgaatcacta gatgatcaaa atatttcaat tgcaggacac 360

actttcattg accgtccgaa ctatcaattt acaaatctta aagcagccaa aaaaggtagt 420

atggtgtact ttaaagttgg taatgaaaca cgtaagtata aaatgacaag tataagagat 480

gttaagccta cagatgtagg agttctagat gaacaaaaag gtaaagataa acaattaaca 540

ttaattactt gtgatgatta caatgaaaag acaggcgttt gggaaaaacg taaaatcttt 600

gtagctacag aagtcaaa 618

<210> 3

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

Lys Pro His Ile Asp Asn Tyr Leu His Asp Lys Asp Lys Asp Glu Lys

1 5 10 15

Ile Glu Gln Tyr Asp Lys Asn Val Lys Glu Gln Ala Ser Lys Asp Lys

20 25 30

Lys Gln Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala

35 40 45

Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro

50 55 60

Gly Pro Ala Thr Arg Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu

65 70 75 80

Glu Asn Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr

85 90 95

Phe Ile Gly Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys

100 105 110

Lys Gly Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr

115 120 125

Lys Met Thr Ser Ile Arg Asn Val Lys Pro Thr Ala Val Gly Val Leu

130 135 140

Asp Glu Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp

145 150 155 160

Asp Leu Asn Arg Glu Thr Gly Val Trp Glu Thr Arg Lys Ile Leu Val

165 170 175

Ala Thr Glu Val Lys

180

<210> 4

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

aaaccacata tcgataatta tcttcacgat aaagataaag atgaaaagat tgaacaatat 60

gataaaaatg taaaagaaca ggcgagtaaa gataaaaagc agcaagctaa acctcaaatt 120

ccgaaagata aatcgaaagt ggcaggctat attgaaattc cagatgctga tattaaagaa 180

ccagtatatc caggaccagc aacacgtgaa caattaaata gaggtgtaag ctttgcagaa 240

gaaaatgaat cactagatga tcaaaatatt tcaattgcag gacacacttt cattggccgt 300

ccgaactatc aatttacaaa tcttaaagca gccaaaaaag gtagtatggt gtactttaaa 360

gttggtaatg aaacacgtaa gtataaaatg acaagtataa gaaatgttaa gcctacagct 420

gtaggagttc tagatgaaca aaaaggtaaa gataaacaat taacattaat tacttgtgat 480

gatcttaatc gggagacagg cgtttgggaa acacgtaaaa tcttggtagc tacagaagtc 540

aaa 543

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

Leu Phe Ile Asn Glu Gly Lys

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

Asn Thr Trp Asn Leu Gly Asn Asn Ala Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

Asp Gly Gln Val Ile Ile Ser Gly Ser Gly Val Thr Ile Glu Ser Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

Glu Gly Leu Thr Leu Pro Val Pro Phe Asn Ile Leu Pro Ser Pro Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

Ile Pro Ile Ser Gln Gly Lys

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

Ile Leu Asn Lys Pro Val Gly Leu Lys

1 5

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

Glu Leu Glu Val Pro Val His Thr Gly Pro Asn Ser Gln Lys Thr Ala

1 5 10 15

Asp Leu Thr Arg

20

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

Gly Ser Arg Ser Gln Ile Pro Arg

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

Ile Leu Ser Ala Gln Gly Cys Lys

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

Asn Leu Ser Pro Gly Phe Asn Phe Arg

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

Asn Tyr Met Met Ser Asn Gly Tyr Lys

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

Phe Gln Gly Lys Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Ser Lys

1 5 10 15

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

Leu Phe Gly Gly Lys Lys

1 5

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 18

Asp Ile Lys Pro Asp Asn Val Leu Leu Asp Val Asn Gly His Ile Arg

1 5 10 15

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 19

Gly Ala Leu Lys Gln Asn Lys

1 5

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

Asn Ser Gln Gly Ser Glu Met Phe Gly Asp Asp Asp Lys Arg Arg

1 5 10 15

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 21

Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Arg

1 5

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

Arg Gln Ala Met Lys Glu Met Ser Ile Asp Gln Ala Arg

1 5 10

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 23

Leu Leu Leu Ser Val Leu Pro Gln His Val Ala Met Glu Met Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 25

Cys Ser Val Asn Asn Gln Gln Ser Lys

1 5

<210> 26

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 26

Asn Gln Glu Leu Cys Gln Val Ala Val Glu Lys Ser Pro Lys

1 5 10

<210> 27

<211> 2007

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 27

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

tacatgctgg acctgcagcc cgagaccggc tgcggcgcct ccggtggcgg tggctccggc 120

ggtggtgggt ccatccagcg tactccaaag attcaggttt actcacgtca tccagcagag 180

aatggaaagt caaatttcct gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacattgaa 240

gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg agcattcaga cttgtctttc 300

agcaaggact ggtctttcta tctcttgtac tacactgaat tcacccccac tgaaaaagat 360

gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc ccaagatagt taagtgggat 420

cgagacatgg gtggcggtgg ctccggcggt ggtgggtccg gtggcggtgg ctccggcggt 480

ggtgggtccg gcagccacag catgaggtac ttcttcacca gcgtgagcag gcccggcagg 540

ggcgagccca ggttcatcgc cgtgggctac gtggacgaca cccagttcgt gaggttcgac 600

agcgacgccg ccagccagag gatggagccc agggccccct ggatcgagca ggagggcccc 660

gagtactggg acggcgagac caggaaggtg aaggcccaca gccagaccca cagggtggac 720

ctgggcaccc tgaggggctg ttacaaccag agcgaggccg gcagccacac cgtgcagagg 780

atgtacggct gcgacgtggg cagcgactgg aggttcctga ggggctacca ccagtacgcc 840

tacgacggca aggactacat cgccctgaag gaggacctga ggagctggac cgccgccgac 900

atggccgccc agaccaccaa gcacaagtgg gaggccgccc acgtggccga gcagctgagg 960

gcctacctgg agggcacctg cgtggagtgg ctgaggaggt acctggagaa cggcaaggag 1020

accctgcaga ggaccgacgc ccccaagacc cacatgaccc accacgccgt gagcgaccac 1080

gaggccaccc tgaggtgctg ggccctgagc ttctaccccg ccgagatcac cctgacctgg 1140

cagagggacg gcgaggacca gaccaccgag ctggtggaga ccaggcccgc cggcgacggc 1200

accttccaga agtgggccgc cgtggtggtg cccagcggcc aggagcagag gtacacctgc 1260

cacgtgcagc acgagggcct gcccaagccc ctgaccctga ggtgggagat gggcggaggt 1320

ggctctactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 1380

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 1440

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 1500

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 1560

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1620

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1680

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1740

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1800

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1860

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1920

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1980

ctctccctgt ctccgggtaa atgttga 2007

<210> 28

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 28

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly

20 25 30

Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr

35 40 45

Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser

50 55 60

Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu

65 70 75 80

Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser

85 90 95

Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr

100 105 110

Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His

115 120 125

Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser

165 170 175

Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp

180 185 190

Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met

195 200 205

Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp

210 215 220

Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp

225 230 235 240

Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His

245 250 255

Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe

260 265 270

Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala

275 280 285

Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln

290 295 300

Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg

305 310 315 320

Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met

340 345 350

Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala

355 360 365

Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly

370 375 380

Glu Asp Gln Thr Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

385 390 395 400

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln

405 410 415

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

420 425 430

Leu Arg Trp Glu Met Gly Gly Gly Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro

435 440 445

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

450 455 460

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

465 470 475 480

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

485 490 495

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

500 505 510

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

515 520 525

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

530 535 540

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

545 550 555 560

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

565 570 575

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

580 585 590

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

595 600 605

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

610 615 620

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

625 630 635 640

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

645 650 655

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Cys

660 665

<210> 29

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 29

atgtcagcag taaaggcagc aagatacggt aaagataatg tcagagtcta caaggttcac 60

aaggacgaaa aaactggtgt tcaaacagtt tacgaaatga ctgtttgtgt tttgttggaa 120

ggtgaaatcg aaacttctta cacaaaggct gataactcag ttattgttgc aacagattct 180

attaaaaata ctatctatat cacagctaag caaaacccag ttactccacc agaattgttc 240

ggttcaatct tgggtacaca tttcatcgaa aagtacaacc atatccatgc tgcacatgtt 300

aacatcgttt gtcatagatg gactagaatg gatattgatg gtaaaccaca tccacattct 360

tttattagag attcagaaga aaagagaaat gttcaagttg atgttgttga gggtaaaggt 420

atcgatatca agtcttcatt gtcaggttta actgttttga agtctacaaa ttcacaattt 480

tggggtttct tgagagatga atacactaca ttgaaggaaa catgggatag aattttatct 540

actgatgttg atgctacatg gcaatggaag aacttctcag gtttgcaaga agttagatct 600

catgttccaa aatttgatgc tacttgggct acagcaagag aagttacttt gaagacattc 660

gcagaagata actctgcttc agttcaagca actatgtaca agatggctga acaaatcttg 720

gcaagacaac aattgatcga aacagttgaa tattcattac caaataagca ttacttcgaa 780

atcgatttgt cttggcataa gggtttgcaa aacactggta aaaatgctga agttttcgca 840

ccacaatctg atccaaatgg tttgattaaa tgcacagtcg gtagatcctc tttgaagtcc 900

aagttagcag catgctga 918

<210> 30

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 30

Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val

1 5 10 15

Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu

20 25 30

Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr

35 40 45

Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr

50 55 60

Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His

85 90 95

Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile

100 105 110

Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys

115 120 125

Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe

145 150 155 160

Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp

165 170 175

Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe

180 185 190

Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr

195 200 205

Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn

210 215 220

Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu

225 230 235 240

Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys

245 250 255

His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr

260 265 270

Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu

275 280 285

Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu Ala Ala

290 295 300

His His His His His His Cys

305 310

<210> 31

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 31

atgtcagcag taaaggcagc aagatacggt aaagataatg tcagagtcta caaggttcac 60

aaggacgaaa aaactggtgt tcaaacagtt tacgaaatga ctgtttgtgt tttgttggaa 120

ggtgaaatcg aaacttctta cacaaaggct gataactcag ttattgttgc aacagattct 180

attaaaaata ctatctatat cacagctaag caaaacccag ttactccacc agaattgttc 240

ggttcaatct tgggtacaca tttcatcgaa aagtacaacc atatccatgc tgcacatgtt 300

aacatcgttt gtcatagatg gactagaatg gatattgatg gtaaaccaca tccacattct 360

tttattagag attcagaaga aaagagaaat gttcaagttg atgttgttga gggtaaaggt 420

atcgatatca agtcttcatt gtcaggttta actgttttga agtctacaaa ttcacaattt 480

tggggtttct tgagagatga atacactaca ttgaaggaaa catgggatag aattttatct 540

actgatgttg atgctacatg gcaatggaag aacttctcag gtttgcaaga agttagatct 600

catgttccaa aatttgatgc tacttgggct acagcaagag aagttacttt gaagacattc 660

gcagaagata actctgcttc agttcaagca actatgtaca agatggctga acaaatcttg 720

gcaagacaac aattgatcga aacagttgaa tattcattac caaataagca ttacttcgaa 780

atcgatttgt cttggcataa gggtttgcaa aacactggta aaaatgctga agttttcgca 840

ccacaatctg atccaaatgg tttgattaaa tgcacagtcg gtagatcctc tttgaagtcc 900

aagttagcag caggttctgg ttctggttct tgctga 936

<210> 32

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 32

Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val

1 5 10 15

Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu

20 25 30

Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr

35 40 45

Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr

50 55 60

Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His

85 90 95

Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile

100 105 110

Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys

115 120 125

Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe

145 150 155 160

Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp

165 170 175

Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe

180 185 190

Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr

195 200 205

Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn

210 215 220

Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu

225 230 235 240

Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys

245 250 255

His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr

260 265 270

Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu

275 280 285

Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu Ala Ala

290 295 300

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Cys

305 310

Claims

1.一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合到RBC的至少一种膜蛋白上的条件下进行，

其中所述分选酶底物包含结构A¹-Sp-M，其中

A¹表示活性剂，Sp表示一个或多个可选的间隔基，M表示分选酶识别基序，其中所述分选酶识别基序在其N端到C端方向的第5位处包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是具有式CH₂OH-(CH₂)_n-COOH的、可选取代的羟基羧酸，其中n是0至3的整数，优选n＝0。

2.权利要求1的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中*表示可选取代的羟基羧酸；并且X和Y独立地表示任何氨基酸。

3.权利要求2的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M为LPET*G，*为2-羟基乙酸。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中该一个或多个Sp选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双官能NHS酯型；(4)同双官能亚氨酸酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；和(7)巯基-羟基型；并且优选该一个或多个Sp是NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂，如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸，并且所述活性剂包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选C端半胱氨酸。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述至少一种膜蛋白是至少一种内源性非工程化膜蛋白，并且通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，所述分选酶底物与RBC的该至少一种内源性非工程化膜蛋白缀合。

6.权利要求5的方法，其中所述分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地该至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点处，优选n为1或2。

7.权利要求5或6的方法，其中所述RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地所述RBC是天然RBC，例如天然人RBC。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

9.权利要求8的方法，其中分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。

10.权利要求9的方法，其中所述mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC-肽复合物如包含HPV的抗原肽(例如YMLDLQPET肽)的复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶，如尿酸氧化酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述在BRC表面上共价修饰的至少一种膜蛋白包含结构A¹-L¹-P¹，其中L¹与P¹中的甘氨酸_(n)连接、和/或结构A¹-L¹-P²，其中L¹与P²中赖氨酸的侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2；A¹表示活性剂；L¹选自LPXT、LPXA、LPXS、LPXL、LPXV、LGXT、LAXT、LSXT、NPXT、MPXT、IPXT、SPXT、VPXT和YPXR；P¹和P²独立地表示至少一种膜蛋白；X表示任何氨基酸。

13.通过权利要求1-12中任一项的方法获得的红细胞(RBC)。

14.一种组合物，其包含权利要求13的红细胞和任选地生理学上可接受的载体。

15.一种用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的方法，包括向所述受试者施用权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症如宫颈癌、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)和痛风、细菌感染、病毒感染如人乳头状瘤病毒(HPV)感染和冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染，自身免疫性疾病和炎性疾病。

17.一种将活性剂递送给有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物。

18.一种增加活性剂在受试者中的循环时间或血浆半衰期的方法，所述方法包括：提供包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物，以及在分选酶存在下在适宜条件下缀合分选酶底物，其中所述条件适于所述分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合到红细胞的至少一种膜蛋白上，

其中所述分选酶底物包含结构A¹-Sp-M，其中

19.权利要求18的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中*表示可选取代的羟基羧酸；并且X和Y独立地表示任何氨基酸。

20.权利要求19的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M为LPET*G，*为2-羟基乙酸。

21.权利要求18-20中任一项的方法，其中该一个或多个Sp选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双官能NHS酯型；(4)同双官能亚氨酸酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；和(7)巯基-羟基型；并且优选该一个或多个Sp是NHS酯-马来酰亚胺异双官能交联剂，如6-马来酰亚胺基己酸和4-马来酰亚胺基丁酸，并且所述活性剂包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选C端半胱氨酸。

22.权利要求18-21中任一项的方法，其中所述至少一种膜蛋白是至少一种内源性非工程化膜蛋白，并且通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合，所述分选酶底物与RBC的该至少一种内源性非工程化膜蛋白缀合。

23.权利要求22的方法，其中所述分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε-氨基缀合至少发生在甘氨酸_(n)和/或赖氨酸ε-氨基上，优选地该至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点处，优选n为1或2。

24.权利要求22或23的方法，其中所述RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地所述RBC是天然RBC，例如天然人RBC。

25.权利要求18-24中任一项的方法，其中所述分选酶能够介导甘氨酸_(n)缀合和/或赖氨酸侧链ε-氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。

26.权利要求25的方法，其中分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。

27.权利要求26的方法，其中所述mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。

28.权利要求18-27中任一项的方法，其中所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC-肽复合物如包含HPV的抗原肽(例如YMLDLQPET肽)的复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶，如尿酸氧化酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

29.权利要求18-28中任一项的方法，其中所述在BRC表面上共价修饰的至少一种膜蛋白包含结构A¹-L¹-P¹，其中L¹与P¹中的甘氨酸_(n)连接、和/或结构A¹-L¹-P²，其中L¹与P²中赖氨酸的侧链ε-氨基连接，其中n优选为1或2；A¹表示活性剂；L¹选自LPXT、LPXA、LPXS、LPXL、LPXV、LGXT、LAXT、LSXT、NPXT、MPXT、IPXT、SPXT、VPXT和YPXR；P¹和P²独立地表示至少一种膜蛋白；X表示任何氨基酸。

30.权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物在制备用于诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的药物中的用途、或在制备用于诊断病症、病状或疾病的诊断剂中的用途、或在制备用于递送活性剂的药物中的用途。

31.权利要求30的用途，其中所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症如宫颈癌、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)和痛风、细菌感染、病毒感染如人乳头状瘤病毒(HPV)感染和冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染，自身免疫性疾病和炎性疾病。

32.权利要求31的用途，其中所述药物是疫苗。

33.权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物，用于在有需要的个体中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病。

34.权利要求33的红细胞或组合物，其中所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症如宫颈癌、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)和痛风、细菌感染、病毒感染如人乳头状瘤病毒(HPV)感染和冠状病毒感染例如SARS-CoV或SARS-CoV-2感染，自身免疫性疾病和炎性疾病。