KR101515445B1

KR101515445B1 - 세포 투과 펩타이드 및 치료 작용을 갖는 생체 분자에 결합된 이의 용도

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Publication number: KR101515445B1
Application number: KR1020107004635A
Authority: KR
Inventors: 이시스 델 카르멘 토렌스 마드라소; 마리벨 구에라 발레스피; 밀레이드 그라나디로 로드리구에스; 오스발도 레예스 아코스타; 보리스 엘네스토 아세베도 카스트로
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2015-05-07
Also published as: BRPI0814452A2; WO2009021468A1; CN101808658A; CN101808658B; CA2694735C; AR068329A1; ZA201001337B; CU23674A1; EP2186526A1; KR20100045498A; CA2694735A1; EP2186526B1; US20120135021A1; ES2610408T3; US8673313B2

Abstract

본 발명은 신규한 세포 투과 펩타이드(CPP)의 용도, 및 특히 Limulus antilipopolisacarido(LALF) 단백질 및 이의 유사체의 32 내지 51번째 영역에 관한 것이다. 본 발명은 치료 특성을 갖는 생체 분자에 연결된 펩타이드들을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 인간 파필로마바이러스(human papillomavirus, HPV) 연관 종양을 포함하는 HPV 및 HPV 단백질 항원 제시 세포에 대한 강력한 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 CPP에 대한 HPV 항원들 사이의 생체 분자들의 공유 결합 융합체를 포함하는 조성물로 구성되어 있다. 상기 바람직한 조성물은 인간에서 치료를 위해 백신으로서 약학 산업에 적용할 수 있다.

Description

세포 투과 펩타이드 및 치료 작용을 갖는 생체 분자에 결합된 이의 용도{CELL-PENETRATING PEPTIDES AND USE THEREOF BONDED TO BIOMOLECULES WITH THERAPEUTIC ACTION}

본 발명은 면역학, 세포 생물학 및 암에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법 및 조성물은 강력한 치료 작용을 유도하기 위해 출처가 상이한 생체 분자들의 세포 투과 펩타이드(CPP)에 대한 융합에 관한 것이다.

지난 10년 동안 HIV-1 Tat, 초파리 안테나페디아 호메오단백질 (Drosophila Antennapedia homeoprotein) 및 HSV-1 VP22와 같은 몇몇 단백질들은 단백질 도입(protein transduction)으로 지칭되는 과정에 의해 세포막을 횡단하고, 이들의 생물 활성을 유지한 상태로 핵에 들어가는 것으로 알려져 있다(문헌[Prochiantz, A. (2000) Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others. Curr . Opin . Cell Biol. 12: 400-406]. 사실상, 단백질 도입 도메인(세포 투과 펩타이드, 또는 CCP)으로부터 유래된 짧은 펩타이드들은 대부분의 세포 유형에서 내부화(internalization)될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이들 CPP는 생체 분자들의 세포내 전달을 위해 성공적으로 사용되어 왔다(문헌[Schwarze, S.R. et al. (2000) Protein transduction: unrestricted delivery into all cells?. Trends Cell Biol. 10:290-295]). 항원성 펩타이드, 펩타이드 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 전장 단백질, 나노입자 및 리포좀과 같은 광범위한 생체 분자들은 이 같은 방식으로 전달되었다. 대부분의 약물은 세포에서 흡수가 잘 되지 않으며, 이는 치료제로서 이들의 개발에 있어 주요 제한 요인으로 고려된다. 따라서, CPP에 치료제의 융합은 이들의 약학 특성을 향상시키기 위한 정선된 전략이 될 수 있다.

몇몇 CPP가 인간 면역결핍 바이러스의 Tat 단백질(문헌[Frankel, A. D., and Pabo, C. O. (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55:1189-1193]), 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)의 VP22 단백질(문헌[Elliott, G., and O'Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell 88:223-233]), 및 섬유아세포 성장인자(문헌[Rojas M, 등 (1998) Genetic engineering of protein with cell. membrane permeability. Nat Biotechnol. 16:370-375])를 포함하는 단백질로부터 확인되었다. 상기 Tat 펩타이드는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 둘 모두에서 단백질을 세포로 도입하는데 사용되어 왔다(문헌[Lindgren, M 등 (2000) Cell-penetrating peptides. Trends Pharmacol . Sci. 21:99-103]). 종양 항원을 세포로 전달하는데 있어서 이들 CPP를 사용하면 펩타이드를 T 세포에 효과적으로 제시하는 기간을 연장시킬 수 있으며, 따라서 암에 대한 강력한 면역 반응을 야기할 수 있다.

전 세계적으로 약 1%의 여성이 자궁경부암에 걸려 있다. 세계 보건기구(WHO)에 따르면, 매면 전 세계에 걸쳐 500,000 명 이상의 여성이 자궁경부 암에 걸리고, 특히 소수의 선진국에서 자궁경부 암은 여성 사망의 주요 원인이다.

HPV는 현재 자궁경부암의 주요 원인으로서 인식된다. 또한 연구에 따르면, HPV는 직장, 음문, 질의 암 및 인두 중앙부(oropharynx, 연구개, 혀의 기저부 및 편도선을 포함하는 목의 중간 부분)의 몇몇 암에서 역할을 할 수는 것으로 제시되어 있다(문헌[Division of STD Prevention. Prevention of genital HPV infection and sequelae : Report of an external consultants' meeting . Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1999]).

인간 파필로마바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 100종 이상의 바이러스 군이다. 20종 이상의 유형이 성관계를 통해 전염된다. HPV의 몇몇 유형은 암으로 거의 전이되지 않게 때문에 "저위험군" 바이러스로서 지칭된다. 암 발병을 야기할 가능성이 더욱 높은 HPV 유형은 "고위험군"으로서 지칭된다. HPV의 고위험군 및 저위험군 유형 둘 모두는 비정상적인 세포의 성장을 야기할 수 있지만, 일반적으로 HPV의 고위험군 유형은 암을 발생시킬 수 있다. 성관계를 통해 전염되는 고위험군 HPV로는 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 및 69, 및 가능한 기타 유형이 있다. 이들 HPV의 고위험군 유형은 일반적으로 평편하거나 거의 보이지 않는 성장을 야기한다.

성병 사마귀(genital wart, 기술적으로는 condylomata acuminatum로서 공지됨)는 2종의 저위험군 HPV 유형, 즉 HPV-6 및 HPV-11과 가장 공통적으로 연관되어 있다.

파필로마바이러스들은 소형(50 내지 60nm)의 외피가 없는 DNA 바이러스로서, 7800 내지 7900개의 염기쌍을 갖는 이중 가닥의 환형 DNA 게놈(DNA genome)을 갖는다. 이러한 게놈은 말기 유전자를 코딩하는 영역, 초기 유전자를 코딩하는 영역 및 비-코딩 영역과 같은 3개의 주요 영역을 포함한다(문헌[Park T. W. 등 (1995) Molecular biology of cervical cancer and its precursors. Cancer 76:1902-1913]). 말기 유전자 영역은 2개의 독립된 열린 해독 프레임(open reading frame, ORF)를 가지며, 이들은 바이러스성 캡시드 단백질 L1(다수) 및 L2(소수)를 암호화한다. 초기 유전자 영역은 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7로 표시되는 6개의 ORF를 포함한다. 단백질 E6 및 E7은 숙주 세포의 불멸화(immortalization) 및 형질 전환뿐만 아니라 바이러스 백제에 중요한 종양 단백질(oncoprotein)이다.

손상 부위를 치료하기 위해 일반적으로 사용되는 방법으로는 냉동요법(cryosurgery, 조직을 파괴하는 냉동법), 루프 환상 투열절제술(loop electrosurgical excision procedure(LEEP), 고온의 파이어 루프를 이용한 조직 제거), 및 통상적인 외과적 수술을 들 수 있다. 외부 성병 사마귀에 대해 유사한 치료법을 사용할 수 있다. 또한, 외부 성병 사마귀를 치료하기 위해 몇몇 약물을 이용할 수 있다(문헌[Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines 2002. Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity and Mortality Weekly Report 2002; 51(RR-6):1-78]).

최근, 미국 식품의약국(FDA)은 대부분(70%)의 자궁경부암을 일으키는 2종의 "고위험군" HPV, 즉 유형 16 및 18, 및 대부분(90%)의 성병 사마귀를 일으키는 유형 6 및 11에 의한 감염을 방지하기 위한 예방 백신을 증인하였다(문헌[Koutsky LA, Ault KA, Wheeler CM, 등, A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine. New England Journal of Medicine 2002; 347(21):1645-1651]).

몇몇 치료 백신이 HPV와 연관된 상처부위의 치료를 위해 승인되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,306,397 호(CSL Limited)에는 세포성 면역 반응을 일으키기 위한 HPV의 E6/E7 변종이 개시되어 있으며, 국제 공개공보 제 WO 93/20844 호(Cancer Research Campaign Technology)에는 E7 단백질에 기초한 HPV에 대한 백신의 용도에 관해 언급되어 있다. 국제 공개공보 제 WO 92/10513 호(퀸스랜드 대학교(University of Queensland, UQ), 미국 특허 제 5,547,846 호(Behringwerke Aktiengeellschaft) 및 6,013,258 호(Zycos Inc.)에는 HPV에 대한 백신의 항원성 성분을 구성하는 펩타이드들이 개시되어 있다. 미국 특허 제 6,524,825 호(Stressgen Biotechnologies)에는 HPV에 의해 생성된 상처부위의 치료를 위해 백신으로서 열충격 단백질(heat shock protein, Hsp)과 E7의 융합체의 용도가 제안되어 있다.

이종의 종양 항원을 이용한 기타 치료 백신의 결과로서, 이들 백신을 이용한 임상 실험의 결과는 단지 제한적인 성공만을 이루어냈다(문헌[Dallal R.M. and Lotze M.T. (2000) The dendritic cell and human cancer vaccines Curr Opin Immunol 12:583-588]). 이는 이들 백신이 약한 자가 반응성 T 세포 반응을 유도하는 경향이 있기 때문이다. 따라서, 암 백신에 있어서 주요 문제점은 어떻게 자기 내성(self-tolerance)을 차단하고 항원 및 전달 시스템 둘 모두의 조작을 통해 강력하고 오래 지속되는 항종양 면역성을 형성할 것인지에 관한 것이다.

이전 기술의 상태와는 대조적으로 본 발명은 신규한 CPP 일족의 용도를 제안하고 있으며, 상기 조성물은 상기 신규한 CPP 일족에 유전적으로 융합된 HPV 항원을 포함하는데, 이는 HPV에 대한 세포성 면역 반응 및 HPV와 연관된 종양을 포함하는 HPV 단백질 항원 제시 세포(HPV protein antigen-exhibiting cell)에 대한 세포성 면역 반응을 증강시킨다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하여, 생체 분자들의 융합을 위한 기준으로서 사용될 수 있으며 약물의 세포 내로의 효과적인 내부화를 달성할 수 있는 신규한 CPP 일족을 제공한다. 상기 신규한 CPP 일족은 LALF 단백질(서열 번호: 1)의 영역 32-51 및 알라닌 아미노산에 대해 상이하나 위치에서 아미노산의 점 치환(point substitution)된 단백질로부터의 유사한 펩타이드로 이루어져 있으며, 상기 점 치환된 단백질은 L-2(서열 번호: 2, 2번째 위치에 치환), L-8(서열 번호: 3, 8번째 위치에 치환), L-12(서열 번호: 4, 12번째 위치에 치환) 및 L-20(서열 번호: 5, 20 번째 위치에 치환)이다.

특정 실시예에서, 본 발명은 앞서 언급된 CPP 일족에 유전적으로 융합되어 있는 HPV 항원을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것으로, 상기 약학 조성물은 HPV의 항원 단백질이 CPP 일족에 유전적으로 융합되어 있는 HPV 항원에 대해 강력한 면역 반응을 나타낸다. 이러한 유전적 융합은 세포 내로의 HPV 항원의 전달을 보장하여, 장기간 동안 수송 단백질(cargo protein)의 가공 및 항원성 에피토프(antigenic epitope)의 T 세포에 제시를 가능케 하였으며, 그 결과 강력한 세포성 면역 반응 및 항종양 반응을 초래한다.

상기 면역 반응은 HPV 단백질 항원에 대한 세포성 반응, 특히 세포 매개된 세포용해 반응일 수 있다. 상기 조성물은 치료학적으로 사용될 수 있다. 치료 응용분야에서, 개체에서의 면역 반응의 유도는 바이러스에 의해 또는 감염되거나 형질 전환된 개체의 세포에 의해 제시되는 HPV 단백질 항원들과의 접촉에 의해 앞서 유도된 반응을 규모 또는 품질 측면에서 뛰어 넘는 반응의 생성을 지칭한다.

특정 실시예에서, 약학 조성물들은 HPV 단백질 항원을 발현하고 제시하는 종양 세포에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다. 이들 실시예에서, 상기 조성물에 의해 타겟팅(targeting)되는 바람직한 HPV 단백질 항원은 HPV 연관 종양에서 일정하게 발현되는 것으로 알려져 있는 E6 및 E7 조기 바이러스성 단백질이다.

일 실시예에서, 약학 조성물은 뉴클레오타이드 수준에서 LALF CPP에 융합된 HPV E6 또는 E7 단백질 항원을 포함하며, 이때 LALF CPP에 대한 융합은 E6/E7 항원 및 LALF CPP 서열 둘 모두를 함유하는 단백질의 발현 및 정제를 가능케 한다. 융합 단백질은 면역 보조제(adjuvant)와 혼합될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 추가의 바이러스 확산을 방지하거나, HPV 항원을 발현하여 제시하거나 상기 항원의 일부를 제출하는 종양을 포함한 HPV 감염에 의해 확산되는 개체의 세포를 제거하기 위해 앞서 HPV로 감염된 개체에서 치료학적으로 사용될 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물에 의해 유도되는 면역 반응의 표적으로서 HPV 단백질 항원을 본원에서 참고하면, HPV 단백질 항원은, 예를 들어 전형적인 MHC class I 또는 II 경로를 통해 HPV 단백질의 가공 및 제출 결과로서 감염된 세포에 의해 나타나는 펩타이드뿐만 아니라, HPV 표면 상에 제시되거나 개체의 감염 세포에 의해 제시된 HPV 단백질 전체 또는 HPV 단백질의 폴리펩타이드 일부를 포함하는 것으로 이해된다.

다양한 다른 유형의 HPV의 게놈 서열(genomic sequence)이 클로닝(cloning)되어 DNA 서열 석에 의해 특성 분석(characterization)되었다. HPV 게놈 전체 또는 일부를 포함하는 박테리아 벡터는, 예를 들어 미국 유전자 은행 ATCC(American Tissue Culture Collection)를 포함하는 다양한 공급원으로부터 이용 가능하다. 본 발명에서 실시하기에 유용한 부가적인 유형의 HPV는 이전에 이러한 목적으로 확립된, 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 단리되어 분류될 수 있다.

HPV 연관 암의 치료에 본 발명의 적용에서 특히 중요한 것은, HPV E6 및 E7 단백질들이 자궁경부암에서 일정하게 발현된다는 관측이다(문헌[(Zur Hausen H. (1987) Papillomaviruses in human cancer. Appl Pathol 5:19-24) 및 문헌[Pater M.M., Pater A. (1985) Human papillomavirus types 16 and 18 sequences in carcinoma cell lines of the cervix. Virology 145:313-318]).

최종적으로, 동물 모델 연구에 따르면, E7 단백질로 면역화하는 경우 마우스가 활성화 c-Ha-ras 유전자 및 HPV E6/E7 유전자로 형질 전환된 폐 세포의 공격으로부터 보호받는 것으로 증명되었다(문헌[Lin K.Y. 등 (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res . 56:21-26]).

이들 단백질들이 HPV 감염의 결과로서 발생하는 암에서 전형적으로 발현된다는 견지, 동일한 단백질들이 또한 암 발생 및 유지에서 중요한 역할을 하는데 가장 가능성이 있는 종양 유전자이라는 견지, 및 이들 단백질에 대해 면역 반응이 일어난다는 견지로부터, E6 및 E7는 면역 중재 및 예방에 있어서 바람직한 표적(target)이고, 따라서 HPV 연관 암을 예방하고 치료하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 약학 주성물의 바람직한 HPV 단백질 항원이다.

본원에서 개시된 약학 조성물들은 HPV, 또는 HPV 항원을 발현하는 HPV-감염 또는 형질 전환 세포에 대한 면역 반응, 특히 매포 매개성 세포용해 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 조성물들은 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 이들 투여 경로로는 피내, 경피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 경구, 경막 및 코내 경로를 들 수 있다. 임의의 기타 편리한 투여 경로, 예를 들어, 주입, 볼버스(bolus) 주사, 또는 상피내층 또는 점막피부내층을 통한 흡착 등이 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 조성물들은 면역 보조제를 포함하여 함께 투여될 수 있다. 추가로, 상기 조성물들은 개체로부터 수득된 백혈구 세포를 자극하여 HPV 단백질 항원 특이적 면역 세포를 시험관내(in vitro)에서 유도하고, 확대하고 확산시키기 위한 수단으로서 생체외(ex vivo)에서 사용될 수 있으며, 이러한 면역 세포는 후속적으로 상기 개체에 다시 도입된다.

유효량이란, 개체에 투여되는 경우 개체가 암호화하고 있는 HPV 단백질 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 양을 지칭한다. 또한, 개체에 투여된 약학 조성물의 양은 일반적인 면역 반응성뿐만 아니라, HPV 단백질 항원 및 항원들, 개체의 크기, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이 등을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.

도 1은 세포 내로 LALF CPP의 침투 능력을 보여주는 형광 현미경 이미지를 보여주는 도면이다. 도면에서,
1- 37℃에서 10분 동안 J774에서의 LALF
2- 37℃에서 20분 동안 J774에서의 LALF
3- 37℃에서 30분 동안 J774에서의 LALF
4- 4℃에서 10분 동안 J774에서의 LALF
5- 4℃에서 20분 동안 J774에서의 LALF
6- 4℃에서 30분 동안 J774에서의 LALF
7- 37℃에서 30분 동안 CaSki에서의 LALF
8- 37℃에서 1시간 동안 CaSki에서의 LALF
9- 37℃에서 2시간 동안 CaSki에서의 LALF
10- 37℃에서 30분 동안 HeLa에서의 LALF
11- 37℃에서 1시간 동안 HeLa에서의 LALF
12- 37℃에서 2시간 동안 HeLa에서의 LALF
13- 37℃에서 30분 동안 TC-1에서의 LALF
14- 37℃에서 1시간 동안 TC-1에서의 LALF
15- 37℃에서 2시간 동안 TC-1에서의 LALF
16- 37℃에서 30분 동안 Hep-2에서의 L-2
17- 37℃에서 1시간 동안 Hep-2에서의 L-2
18- 37℃에서 2시간 동안 Hep-2에서의 L-2
19- 37℃에서 30분 동안 Hep-2에서의 L-20
20- 37℃에서 1시간 동안 Hep-2에서의 L-20
21- 37℃에서 2시간 동안 Hep-2에서의 L-20
22- J774 세포(음성 대조군)
23- 37℃에서 2시간 동안 J774에서 관련 펩타이드 없음.
도 2는 세포 내로 L-2 및 L-20의 침투 능력을 보여주는 형광 현미경 이미지를 보여주는 도면이다. 도면에서,
1a 및 1b: 세포 무처리(음성 대조군)
2a 및 2b: L-2 펩타이드로 10분 동안 처리된 세포
3a 및 3b: L-20 펩타이드로 10분 동안 처리된 세포
4a 및 4b: L-2 펩타이드로 30분 동안 처리된 세포
5a 및 5b: L-20 펩타이드로 30분 동안 처리된 세포
6a 및 6b: L-2 펩타이드로 1시간 동안 처리된 세포
7a 및 7b: L-20 펩타이드로 1시간 동안 처리된 세포
8a 및 8b: L-2 펩타이드로 18시간 동안 처리된 세포
9a 및 9b: L-20 펩타이드로 18시간 동안 처리된 세포.
도 3은 pPEPE7M-7 컨스트럭트를 개략적으로 보여주는 도면이다.
도 4는 세포 내로 LALF-E7의 침투 능력을 보여주는 형광 현미경 이미지를 보여주는 도면이다. 도면에서,
1- 37℃에서 30분 동안 J774에서의 LALF-E7
2- 37℃에서 1시간 동안 J774에서의 LALF-E7
3- 37℃에서 2시간 동안 J774에서의 LALF-E7
4- 37℃에서 2시간 동안 J774에서의 E7
5- 37℃에서 2시간 동안 J774에서의 PBS
6- CasKi.
도 5는 세포 내로 LALF-E7의 내부화(internalization)를 보여주는 웨스턴 블럿이다. 도면에서,
1- J774
2- J774 + E7
3- J774 + LALF-E7
4- LALF-E7.
도 6은 세포 내로 LALF-GFP의 침투 능력을 보여주는 형광 현미경 이미지를 보여주는 도면이다. 도면에서,
1- LALF-GFP
2- LALF biotin
3- GFP
4- PBS.
도 7은 마우스에서 TC-1 세포의 확립된 종양 부피에 대한 종양 상의 LALF-E7 처리 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 마우스에서 TC-1 세포의 확립된 종양 부피에 대한 종양 상의 LALF-E7 처리 효과가 단백질의 공유 결합성 융합에 의존한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9는 상이한 제제로 면역화된 3마리의 마우스의 10 ⁶ 비장세포 풀(splenocytes pool) 당 스팟 형성 세포(spot forming cell)의 수를 보여주는 그래프이다.

실시예

실시예 1. 상이한 조직 기원을 갖는 세포로의 CPP LALF 또는 이들의 유사체의 내부화

상이한 세포주(cell line)들이 이러한 실현을 위해 사용되었다(표 1). 세포를 RPMI 1640, 10% 불활성 소 태아 혈성 및 2mM 글루타민에서 5% CO₂의 존재하에 37℃에서 22mm 멸균 커버 글래스 상에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 이어, 25 또는 50μM의 CPP LALF 또는 이들의 비오틴 부착 유사체인 L-2 및 L-20를 첨가하고 상이한 시간(10분, 20분, 30분, 1시간 및 2시간) 동안 37℃ 및 4℃에서 배양하였다. PBS로 세포를 간단히 세척하고, 20분 동안 4% 파라-포름알데하이드로 실온에서 고정하였다. PBS로 3회 세척하였다. 0.5% 트리톤 X-100을 이용하여 실온에서 15분 동안 세포 투과를 실시하였다. PBS로 3회 세척하였다. 실온에서 세포를 PBS 내 1% 차단 SFB에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척하였다. PBS 스트렙타비딘-플루오레신에서 1:50000로 암실에서 45분 동안 배양하였다. PBS로 집중적으로 세척하였다. 수용성 마운팅 배지(mounting medium)로 커버 글래스를 덮었다. 적절한 필터가 구비된 형광 현미경을 이용하여 검사하였다.

상이한 조직 기원을 갖는 세포로의 CPP LALF 또는 이들 유사체의 내부화

세포	펩타이드 CPP (μM)	온도 (℃)	시간
J774	25μM LALF 50μM LALF	37℃, 4℃	10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간,
CasKi	50μM LALF	37℃	30분, 1시간, 2시간
HeLa	50μM LALF	37℃	30분, 1시간, 2시간
TC-1	50μM LALF	37℃	30분, 1시간, 2시간
Hep2	50μM LALF 50μM L-2 50μM L-20	37℃	30분, 1시간, 2시간

음성 대조군으로서 관련 펩타이드를 갖고 있지 않은 비오틴 부착 세포를 사용하였다.

그 결과, 상이한 세포 유형에서 짧은 배양 시간(30분)에 CFP LALF 및 이들 유사체들이 내부화되는 것으로 나타났다(도 1).

부가적으로, CPP LALF는 4℃에서 단지 10분 동안의 배양으로도 J774 세포내로 내부화되었는데, 이는 내부화를 위해 사용된 경로가 엔도사이토시스(endocytosis)에 의존하는 CPP로서의 이들 펩타이드의 특징인 것으로 확인되었다.

이들 결과는 유사체 L-8 및 L-12을 이용하는 경우와도 유사하다.

실시예 2 . 쥐 비장세포로의 유사체 L-2 및 L-20의 내부화

비장세포의 분리를 위해, C57BL/6 마우스를 경부의 절개에 의해 희생시키고, 비장세포를 무균하에서 제거하였다. 각 그룹에 따라 동물의 세포 현탁액을 풀 형태로 수집하고, 이들을 부드럽게 균질화하였다. 상기 비장세포를 세척하고, 적혈구를 0.83% NH ₄ Cl 용액으로 용해하였다. 세척 이후에 상기 비장세포를 7% 소 태아 혈성이 첨가된 10mL의 신선한 RPMI 1640 배지에 20x10⁶세포로 각각의 시험관에 분류하였다. 각 제제를 0.8mg의 비오틴 부착 펩타이드 L-2(278μM) 및 L-20(280μM)와 함께 상이한 시간(10분, 30분, 1시간, 18시간) 동안 배양하였다. 상기 배양은 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에서 수행되었다. 멸균 커버 글래스 상의 세포를 고정하고, 투과시키고 프로피디움 요오드화물로 처리하여 핵을 염색하고, 세포 내의 펩타이드를 검색하기 위해 스트렙타비딘-플루오레신으로 처리하였다. 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용해 얻은 결과는 상기 펩타이드 L-2 및 L-20은 짧은 배양 시간(30분) 이내에 내부화되는 것으로 나타났다(도 2).

이들 결과는 CPP LALF 및 유사체 L-8 및 L-12을 이용하는 경우와도 유사하다.

실시예 3 . E7 를 갖는 재조합 융합 단백질 CPP LALF 또는 유사체의 클로닝 및 발현

E7 단백질에 대한 CPP LALF이 재조합 융합체를 수득하기 위해 CPP LALF로부터 2종의 DNA 쇄의 화학적 합성을 수행하였다. CPP LALF의 DNA 단편(서열 번호: 6)은 5' 및 3' 말단에 개방 제한부위 NcoI 및 HindIII을 각각 포함한다. HPV 16 DNA 서열의 E7은 5' 및 3' 말단에 개방 제한부위 HindIII 및 BamHI를 각각 포함한다. 또한, 첫번째 E7 시스테인을 암호화하는 트리플릿(triplet)에는 Rb 단백질에 대한 pf E7의 인식 부위를 제거하기 위해 G에 대해 T의 치환을 포함한다(서열 번호: 7). T4 리가제를 이용하여 이전에 NcoI 및 BamHI으로 절단된 pM238 벡터(문헌[Yero D. et al (2006) Bicistronic expression plasmid for the rapid production of recombinant fused proteins in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 44:27-34])에 합성 단편 둘 모두를 삽입하였다. 이 벡터는 E. coli 트립토판 프로모터, 및 E. coli에서 단백질 발현을 위해 사용되는 박테리오파지 T4의 종결 신호(종결자)를 포함한다. 또한, 3' 말단에는 친화성 금속 크로마토그래피에 의한 단백질 정제를 가능케 하는 6개의 일련의 히스티딘을 포함한다.

연결 반응물을 E. coli의 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질 전환하였다. 수득된 형질 전화 세포를 5종의 제한 효소를 이용하여 분석하였다. 또한, E7 및 정확한 융합 단백질(서열 번호: 9 및 10)과 하이브리드를 형성하는 27개의 염기(서열 번호: 8)의 센스 프라이머(sense primer)를 이용하여 양성 클론의 이중 쇄 서열에 대해 검사하였으며, Rb 단백질에 대한 결합 부위에서 글리신에 대해 시스테인의 치환을 확인하였다. 상기 클론(도 3)을 pPEPE7M-7로 명명하였다.

이들 결과는 CPP LALF의 부위에서 임의의 유사체 L-8 및 L-12을 이용하는 경우와도 유사하다.

실시예 4 . E7 을 갖는 재조합 융합 단백질 CPP LALF 또는 유사체의 발효 및 정제

pPEPE7M-7 플라스미드를 E. coli strain BL-21에 형질 전환하였다. 상기 형질 전환 클론을 M9 SALT를 함유하고 0.1M CaCl ₂ , 0.1M MgCl ₂ , 1% 글루코스, 1% 카제인 가수분해물, 0,5% 트립톤 및 100㎍/mL 암피실린이 보충된 최소 배지에서 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 24시간 동안 발효 공정을 수행하였다. 620nm에서 광학 밀도가 약 1이 될 때까지 9시간 동안 발효한 이후에 인돌아크릴산(indolacrilic acid)을 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 이러한 유도는 15시간 동안 유지되었다. 4℃에서 20분 동안 10.000rpm으로 원심 분리하여 세포를 침전시켰다. 5g의 생물량(biomass)을 50mM NaH₂PO4; 0.3M NaCl; pH 8의 탐폰 용액(tampon solution) 25mL에 현탁하고, 초음파에서 세포 파쇄 하에 방치하였다(0.5 주기, 1분 동안의 70의 진폭). 파쇄 공정은 5회 실시하였다. 파쇄된 세포를 균질화하고, 4℃에서 30분 동안 10.000rpm으로 원심 분리하였다. 이러한 원심 분리 현탁액을 제거하고, 정제용으로 재조합 단백질을 포함하는 불용성 분획을 수집하였다.

3g의 침전물을 30mL의 완충액(50mM Tris-HCl; 3mM EDTA; 0.8M NaCl; 0.01M MgCl₂; 0.1% NP40)으로 세척하고 1분당 9.500의 회전 속도로 폴리트론(Polytron)에서 균질화하였다. 균질액을 4℃에서 20분 동안 10.000rpm으로 원심 분리하였다. 원심 분리의 상층액을 제거하고, 불용성 분획을 30mL의 완충액(50mM NaH₂PO₄; 0,3M NaCl; pH 8)에서 현탁하고, 앞서 개시한 바와 같이 균질화를 수행하였다. 균질액을 4℃에서 20분 동안 10.000rpm으로 원심 분리하였다. 불용성 분획의 단백질을 추출하기 위해 1g의 단백질을 완충액(50mM NaH₂PO₄; 0.3M NaCl, pH 8) 중의 100mL의 4M 우레아에서 현탁하였다. 1분당 9.500의 회전 속도로 폴리트론에서 균질화하였다. 그 이후, 추출액을 4℃에서 20분 동안 10.000rpm으로 원심 분리하였다. 가용성 분획을 상기 추출액으로부터 분리하였으며, 상기 가용성 분획은 목적하는 단백질을 함유하고 있다. 이러한 분획을 4M의 완충액(50mM NaH₂PO₄; 0.3 M NaCL; pH 8 및 5mM 이미다졸)로 평형된 Ni-NTA 컬럼(His-Select^TM Nickel Affinity Gel, Sigma)에 적용하였다. 상기 컬럼을 동일한 평형 완충액 및 40mM 이미다졸로 세척하고, 단백질을 250mM 이미다졸을 이용하여 용출하였다. 정제된 단백질을 10㎛ 직경의 막을 이용하여 트리스 완충액(1X, pH 8.4)으로 투석하였다. 최종적으로, 상기 단백질을 0.22㎛의 필터를 통환 여과에 의해 멸균하였다.

이들 결과는 CPP LALF의 부위에서 임의의 유사체 L-2, L-8, L-12 및 L-20을 이용하는 경우와도 유사하다.

실시예 5 . 형광 현미경을 이용하여 CPP LALF 또는 이들의 유사체가 수송 단백질 E7를 세포 내로 내부화하는 지에 대한 측정

세포 J774를 RPMI 1640, 10% 불활성 소 태아 혈성 및 2mM 글루타민에서 5% CO₂의 존재하에 37℃에서 22mm 멸균 커버 글래스 상에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 이어, 상이한 커버 글래스를 37℃에서 30분, 1시간 및 2시간 동안 1.66μM의 융합 단백질 LALF-E7, 1.66μM의 단백질 E7 및 PBS(음성 대조군)와 함께 배양하였다. CasKi 세포(HPV 16를 발현하는 인간 세포)를 동일한 실험 조건에서 양성 대조군으로서 성장시켰다.

배양 이후, 세포를 PBS로 간단히 세척하고, 실온에서 20분 동안 4% 파라-포름알데하이드로 세포를 고정하였다. PBS로 3회 세척하였다. 0.5% 트리톤 X-100을 이용하여 실온에서 15분 동안 세포 투과를 실시하였다. PBS로 3회 세척하였다. 이어, 실온에서 세포를 PBS 내 1% 차단 SFB에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척하였다. PBS를 1:50로 희석한 염소 IgG 항-E7/HPV 16 폴리클론성 항체(Santa Cruz)와 함께 배양하였다. PBS로 집중적으로 세척하였다. PBS를 1:50로 희석한 항-염소 플루오레신 IgG 폴리클론성 항체(Santa Cruz)와 함께 암실에서 45분 동안 배양하였다. PBS로 집중적으로 세척하였다. 수용성 마운팅 배지로 커버 글래스를 덮었다. 적절한 필터가 구비된 형광 현미경을 이용하여 검사하였다.

상기 결과에서 J774 세포를 LALF-E7 융합체와 함께 배양하고 CasKi 세포에서 배양하는 경우에만 형광 세포가 나타났다. 음성적 결과는 J774를 E7 및 PBS와 함께 배양하여 수득하였다. 이들 결과에 따르면, E7 단백질은 LALF에 융합되는 경우에만 세포내로의 내부화를 달성하는 것으로 나타났다.

실시예 6 . 웨스턴 블로팅을 이용하여 CPP LALF 또는 이들의 유사체가 수송 단백질을 세포 내로 내부화하는 지에 대한 측정

J774세포를 RPMI 1640, 10% 불활성 소 태아 혈성 및 2mM 글루타민에서 5% CO₂의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 그 이후, 상기 세포를 각 시험관에 5x10⁶의 세포로 분주하고, 37℃에서 4시간 동안 25μM의 융합 단백질 LALF-E7, 25μM의 단백질 E7 및 PBS와 함께 배양하였다. 10분 동안 1000rpm으로 원심 분리하여 세포를 침전시켰다. 펠렛(Pellet)을 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 100㎕의 RIPA 완충액(Promega)에서 파쇄하고, 얼음에서 10초 및 21분 동안 볼텍싱(vortexing)에 의해 혼합하였다. 15분 동안 12000rpm으로 원심 분리하여 파쇄된 세포를 침전시켰다. 세포 추출액에서 단백질 농도를 측정하고, 10㎍의 총 단백질을 15% 아크릴아마이드 겔에서 흘러보냈다. 이어, 상기 겔을 니트로셀룰로스 막에 전달하였다. 상기 막을 PBS(1:100)로 희석된 IgG 염소 폴리클론성 항체 항-E7 HPV 16(Santa Cruz)과 함께 실온에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척하였다. 이어, 상기 막을 PBS(1:5000)로 희석된 항-염소 IgG 페록시다제 접합체(Sigma)와 함께 암실에서 실온 조건으로 45분 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척하였다. 최종적으로, 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 사의 ECL 시스템을 이용하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(LALF-E7)를 포함하는 시험관 내 세포에서 짧은 시간 동안 배양한 이후에 충분한 양의 융합 단백질을 J774 세포에서 추출할 수 있었으며, 이는 항-E7 항체에 의해 인식되었다. 그러나, E7 단백질 및 PBS와 함께 배양한 세포에서 추출한 레인(lane)에서는 어떠한 인신도 검출되지 않았다.

실시예 7 . 형광 현미경을 이용하여 CPP LALF 또는 이들의 유사체가 수송 단백질 GFP를 세포 내로 내부화하는 지에 대한 측정

재조합 융합 단백질 LALF-GFP(녹색 형광 단백질)로부터 E. coli에서 생성한 단백질을 이용하여 CPP LALF 또는 이의 유사체가 수송 단백질을 내부화하는 지를 확인하였다. 상기 GFP(GenBank 접속 번호: 제 U55762 호)를 서열 번호: 11 및 12의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 클론테크(Clontech) 사의 pEGFP-N1 플라스미드로부터 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 수득하였다.

상기 올리고뉴클레오타이드 둘 모두는 클로닝을 위한 제한효소 부위(HindIII-센스 및 BamHI-안티센스)를 갖는다.

재조합 분획을 구축하기 위해 PCR에 의해 수득된 합성 LALF 및 GFP 유전자를 실시예 3에서와 유사하게 pM238 벡터에 T4를 이용하여 삽입하였다. 재조합 클론은 서열 번호: 13 및 14와 동일한 것으로 확인되었다.

정제된 재조합 LALF-GFP 단백질을 이용하여 실시예 5와 유사한 실험을 수행하였지만, 이 경우에 J774 세포를 LALF-GFP, 비오틴 첨부 LALF, GFP 및 PBS와 함께 배양하였다.

상기 얻어진 결과(도 6)는 융합 단백질 LALF-GFP와 함께 J774 세포를 배양했을 때의 형광 세포를 나타냈으며, 이는 비오틴 첨부 LALF에 의해 수득된 결과와 유사하였다. 어떠한 형광 세포도 J774 세포를 GFP 및 PBS와 함께 배양한 경우에 관측되지 않았다.

이들 결과에 따르면, GFP의 경우에 수송 단백질은 LALF와 융합되는 경우에 세포 내로의 내부화를 달성하는 것으로 나타났다.

이들 결과는 CPP LALF 대신에 임의의 이들의 유사체 L-2, L-8, L-12 및 L-20을 사용하는 경우와 유사하였다.

실시예 8 . E7 을 갖는 CPP LALF 융합 단백질 또는 이의 유사체( LALF + E7 )에 의한 마우스에서 확립된 종양의 치료

재조합 융합 단백질 LALF-E7에 의한 치료를 목적으로 확립된 종양의 퇴화를 관측하기 위해 종양 세포주 TC-1을 사용하였다. HPV16 E7 단백질을 발현하는 TC-1 종양 세포주는 문헌[Lin 등 (1996)) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res . 56:21-26]에 개시된 바와 같이 HPV16 E6 및 E7 및 활성화된 인간 C-Ha-ras 유전자로 불멸화(immortalization) 및 형질 전환에 의해 C57BI/6 마우스의 일차 폐 세포로부터 유래하였다. 종양 접종을 위해 티. 씨 유(T. C. Wu, 메릴랜드주 볼티모어 소재의 존 홉킨스 의료 기관) 박사에 의해 제공된 TC-1 세포를 10% 소 태아 혈청(우타주 로건 소재의 Hyclone), 비-필수아미노산, 글루타민, 피루페이트, 겐타마이신(gentamycin), 베타-메르캅토에탄올 및 0.4mg/mL 게네티신(Geneticin)이 보충된 RPMI1640 배지에서 60-70% 합류할 때까지 37℃에서 성장하였다. 트립신 처리에 의해 세포를 수확하였다. 행크스 완충 용액(Hank's buffer solution)에서 2,5x10 ⁵ 세포/mL로 재현탁하였다.

C57BL/6 마우스의 오른쪽 다리에 0.2 mL의 부피로 피하 주사에 의해 2x10 ⁵ 세포를 접종하였다. 모든 동물에서 명백한 종양이 발병하는 10일이 될 때까지 동물을 4개의 처리 그룹으로 임으로 분류하였다. 각 그룹은 10마리의 동물을 포함하였다. 매 14일 마다 2회의 면역화를 실시하였다. 제 1 그룹은 재조합 단백질 LALF-E7로 면역화하고, 제 2 그룹은 재조합 단백질 E7로 면역화하고, 제 3 그룹은 합성 펩타이드 LALF로 면역화하고, 제 4 그룹은 PBS로 면역화하였다. 상이한 그룹에서의 종양 역학은 종양 부피에 의해 성립하며, 상기 종양 부피는 전자 계측기(electronic caliper)를 이용하고 2개의 수직 치수로 측정하여 측정하였다. 종양 부피(mm³)는 식[길이 x 너비 ² )/2]에 따라 이들 측정치로부터 산정하였다. 각 그룹의 평균 부피는 30일 시점에서 표준 편자(+/-)로서 도 7에 나타나 있다.

이들 결과에 따르며, LALF-E7로 처리는 확립된 종양의 성장을 완전히 억제하는 것으로 증명되었다. 이들 결과는 E7, LALF 및 PBS와 같은 기타 처리에 의해 수득된 결과에 비해 통계학적으로 유의하다(p<0,01). 유사한 결과들이 L2, L-8, L-12 및 L-20과 같은 LALF CPP 유사체인 E7 융합 단백질로부터 수득하였다.

실시예 9 . E7 을 갖는 융합 단백질 CPP LALF 또는 이의 유사체( LALF - E7 ), 및 E7을 갖는 CPP LALF 또는 이의 유사체의 혼합물(LALF+E7)에 의한 마우스의 확립된 종양의 치료

LALF-E7의 항-종양 효과가 두 분자의 공유 결합과 연관이 있는 지를 연구하기 위해 본 발명자들은 동일한 몰 농도로 사용하기 이전에 혼합된 LALF 및 E7에 있어서 마우스를 치료하기 위한 실험을 수행하였으며, 이는 상기 융합 단백질 LALF-E7을 투여 받은 마우스와의 비교를 가능케 할 수 있다.

이러한 구현에서, C57BL/6 마우스의 오른쪽 다리에 0.2 mL의 부피로 피하 주사에 의해 2x10 ⁵ 세포로 접종하였다. 모든 동물에서 명백한 종양이 발병하는 10일이 될 때까지 동물을 5개의 처리 그룹으로 임으로 분류하였다. 각 그룹은 10마리의 동물을 포함하였다.

매 14일 마다 2회의 면역화를 실시하였다. 제 1 그룹은 재조합 단백질 LALF-E7로 면역화하고, 제 2 그룹은 LALF+E7:재조합 단백질 E7 혼합물로 면역화하고, 제 3 그룹은 합성 펩타이드 LALF로 면역화하고, 제 4 그룹은 재조합 단백질 E7로 면역하고, 제 5 그룹은 PBS로 면역화하였다. 상이한 그룹에서의 종양 역학은 실시예 8에서 앞서 기술한 바와 같이 성립한다. 각 그룹의 평균 부피는 30일 시점에서 표준 편자(+/-)로서 도 8에 나타나 있다.

상기 결과에 따르면, 종양 부피를 감소시키는 효과는 공유결합 융합체 LALF-E7로 마우스를 치료하는 경우에만 관측되는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 LALF + E7 혼합물, LALF, E7 및 PBS에 의한 처리에 의해 얻어진 부피에 비해 통계학적으로 유의했다(p<0,01).

이들 결과는 CPP LALF 대신에 임의의 이들 유사체 L-2, L-8, L-12 및 L-20를 사용하는 경우에 유사하였다.

실시예 10 . 세포성 면역 반응을 유도하는 약학 조성물의 능력 비교

HPV-16의 항원 E7에 대한 세포성 면역 반응을 평가하기 위해 6 내지 8주령의 3마리의 암컷 마우스 C57BL/6로 이루어진 4개의 그룹에 2회 분량의 면역원을 투여하였다. 제 1 그룹은 30㎍의 재조합 단백질 LALF-E7로 면역화시키고, 제 2 그룹은 30㎍의 재조합 단백질 E7로 면역화시키고, 제 3 그룹은 8㎍의 합성 펩타이드 LALF로 면역화시키고, 제 4 그룹은 PBS로 면역화시켰다. 면역 보조제 없이 0.2mL의 부피로 동물의 옆구리에서 피하 투여 방식으로 면역화하였다. 매 14일 마다 2회 투여하였다. 2차 면역한지 7일 후, 상기 마우스를 경부의 절개에 의해 희생시키고, ELISPOT 항-감마 인터페론(항-IFN-g) 시험에서 추후 분석을 위해 비장세포를 무균하에서 제거하였다. 각 그룹에 따라 동물의 세포 현탁액을 풀 형태로 수집하고, 이들을 부드럽게 균질화하였다. 상기 비장세포를 세척하고, 적혈구를 0.83% NH ₄ Cl 용액으로 용해하였다. 이후에 상기 비장세포를 세척하고, 10% 소 태아 혈성(FBS) 및 10U/mL의 인간 IL-2(hIL-2)가 첨가된 신선한 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. E7 HPV-16 에피토프를 발현하지 않은 EL4 (H-2 ^b ) 마우스 세포를 표적 세포로 사용하였으며, 이들 세포는 앞서 C57BL/6, H-2 ^b 마우스의 CTL 에피토프에 상응하는 ⁴⁹ RAHYNIVTF ⁵⁷ 펩타이드와 함께 10μM의 농도로 펄스를 가하였다(문헌[Feltkamp M.C. 등 (1993) Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. Eur . J. Immunol . 23:2242-2249]). 이후, 상기 세포를 10% FBS 및 hIL-2가 보충된 RPMI 1640에서 현탁하고, 항원 제시 세포로 사용하였다. 펄스를 가하지 않은 상기 EL4 세포는 IFN-g의 분비 세포의 배경을 측정하기 위해 포함되었다.

IFN-g 분비의 측정을 위한 시험을 앞서 문헌[Vazquez-Blomquist D. 등(2002) Induction of a strong HIV-specific CD8+ T cell response in mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi-CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337-356)]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 니트로셀룰로스 종이로 덮여 있는 바닥부를 갖는 96웰 플레이트를 100㎕의 포획 항체(5㎍/mL의 농도)로 회수하였으며, 이들을 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 상기 플레이트를 10% FBS가 보충된 RPMI 1640로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 상기 비장 세포(웰 당 10 ⁶ , 2x10 ⁵ 및 4x10 ⁴ 세포) 및 EL4 세포(웰 당 10 ⁵ 세포)을 각각 0.2mL의 최종 부피로 첨가하고, 5% CO ₂ 의 존재 하에 37℃에서 17시간 동안 2회 반복하여 공-배양하였다. 상기 배양 이후, 표준 ELISPOT 시험을 수행하였다(문헌[Vazquez-Blomquist D. 등 (2002) Induction of to strong HIV-specific CD8+ T cell response in mice using to fowlpox virus vector expressing an Hiv-1 multi-CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337-356]). 재-자극된 시험관내 림프 세포를 측정하기 위해 동일한 조건의 2,8x10 ⁷ 개의 비장 세포를 상기 펩타이드 및 hIL-2가 충진된 EL4 세포와 함께 37℃에서 7일 동안 5% CO ₂ 의 습한 대기에서 배양하였다. 이후, 살아 있는 세포의 수를 헤아려서, 동일한 조건 하에서 ELISPOT 측정을 위해 사용하였다.

그 결과는 10 ⁶ 개의 비장 세포당 스팟 형성 세포(SFC)의 수로서 나타냈다. SFC의 수는 입체 영상에 의해 점의 수로부터 수득하였으며, 빈도는 각 웰에서 배양된 세포의 수에 대한 이들의 상대적인 수에 의해 수득된다.

양성 대조군은 음성 대조군(EL4는 포함하지만 펩타이드는 없음) + 10개의 SFC의 배인 값을 갖는 것으로 간주한다.

도 9에 도시된 바와 같이, SFC의 수인 g-IFN의 효과기 분비 세포의 수는 VSSP 및 PBS로 면역화된 그룹에서 보다 LALF-E7로 면역화된 그룹에서 약 8배 이상 높은 것으로 나타났다.

이들 결과에 따르면, LALF-E7로 처리된 동물에서 T CD8⁺ 림프세포의 효과적인 반응이 존재한다는 것을 증명하였다.

<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> CELL-PENETRATING PEPTIDES AND USE THEREOF BONDED TO BIOMOLECULES WITH THERAPEUTIC ACTION <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: CPP LALF <400> 1 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Analogue L-2 <400> 2 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Analogue L-8 <400> 3 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Analogue L-12 <400> 4 His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 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Claims

서열 번호: 1 내지 서열 번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포 투과 활성을 갖는 펩타이드가 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원에 융합된 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원은 E6 또는 E7 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제2항에 있어서, 서열 번호: 1의 펩타이드가 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 단백질에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제3항에 있어서, 서열 번호: 10으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제1항에 따른 융합 단백질 및 면역 보조제(adjuvant)를 유효성분으로 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
제2항 또는 제3항에 따른 융합 단백질 및 면역 보조제(adjuvant)를 유효성분으로 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
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