KR20130142104A - 인간 파필로마바이러스 e7 항원 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
인간 파필로마바이러스 e7 항원 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 파필로마바이러스 감염 및 관련 질병의 치료용 인간 파필로마바이러스 E7 항원 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로, E7 항원이 적어도 2개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 2 이상의 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 핵산 분자, 및 이를 이용한 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 인간 파필로마바이러스 감염 및 관련 질병의 치료용 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인간 파필로마바이러스 감염 및 관련 질병의 치료용 인간 파필로마바이러스 E7 항원 화합물 및 조성물에 관한 것이다.
인간 파필로마바이러스(Human papillomaviruses; HPV)는 동종이나, 크게 저위험과 고위험으로 분류될 수 있는 바이러스의 '타입(types)'으로, 유전학적으로 구별되는 100개 이상의 그룹이다. 저위험 HPV 타입은 심상성 사마귀와 관련이 있으며, 이는 일반적으로 양성이고 생명을 위협하지는 않는다(1,2). 대조적으로, 고위험 HPV 타입의 영구감염은 전암성 자궁경부이형성증 및 자궁경부암과 관련이 있다. 또한, 고위험 HPV 타입은 두경부암(4-6)과 유방암(57)의 특정집합뿐만 아니라 항문, 음문, 질, 음경의 암(3)과 관련이 있다.
고위험 HPV 타입은 일반적인 건강 인구에서 크게 유행하고 성적접촉에 의해 전염되는 자궁경부암을 유발한다. 이는 대부분의 사람들이 성적 활동 후 즉시 감염되는 것으로 추정된다(7, 59). 고위험 HPV 감염의 대부분은 최소 관련된 병리를 포함하는 자기-제한(자기 제어 방식)으로 여겨지나, 고위험 HPV을 포함하는 감염은 악성종양으로 발달될 수 있다(8).
HPV 16과 HPV 18은 고위험 HPV 타입 중에서 가장 유행하는 반면, HPV에 많은 추가 고위험 타입이 있다. 1,918명의 자궁경부암 환자와 1,928명의 건강한 대조 여성에 대한 최근 비교 분석은, 암환자에서 가장 공통적인 HPV 타입이 HPV 타입 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58 및 35임을 밝혀내었다(11). 또한, 자궁경부암에서 HPV 감염율의 글로벌 분석은, 사례에 대하여 HPV 16이 50%, HPV 18이 14%, HPV 45가 8%, HPV 31이 5%로 존재하고, 나머지 사례로 구성된 13%의 "고위험" 타입의 다른 맴버를 밝혀내었다(12).
그들의 감염성으로 인해, HPV 16와 HPV 18는 HPV에 의한 초기감염방어에 목적을 둔 광범위한 예방접종 캠페인에 초점을 맞추었으며(9,10), 예방 백신접종가 노년기에 HPV와 관련된 악성종양의 발생을 예방 또는 감소시킬 것을 예상하고, 현재 HPV 16 및 HPV 18 고위험 균주(HPV 6 및 HPV 11 저위험 균주뿐만 아니라)를 예방백신 표적으로 승인하였다. 또한, HPV 16 및 HPV 18 예방백신은 HPV의 다른 고위험 타입에 대항하는 부분적인 교차-방어(cross-protection)를 제안하였다(13-15).
현재 임상용 HPV 예방백신은 자발적으로 형성된 합성 바이러스-유사 입자 (virus-like particles; VLP)인 재조합 바이러스성 캡시드 당단백질(L1)로 구성되어 있다(60,61). VLP에 기초한 면역인, 예방백신은 입증된 바이러스성 감염을 예방하는 L1 단백질에 대항하여 강력한 항체반응과 중성 항체반응을 유도한다.
그러나, 예방백신은 입증된 감염에 최소의 영향만을 주는 것으로 보여진다 (16). 예를 들어, 자궁경부암 예방백신은 이미 HPV에 노출된 각각의 사람들에게는 비효과적인데, 이는 바이러스가 세포로 들어갈 때, 바이러스성 복제가 허용되는 세포외 항체의 중성효과로부터 보호되기 때문이다. 고위험 HPV에 의한 감염은 보통 일부 초기(E2, E4 및 E5) 및 말기 유전자(L1 및 L2)가 삭제되는 숙주 DNA로 바이러스성 에피솜이 융합된 결과이고, 이때 상기 유전자는 E6 및 E7인 HPV 단백질로부터 분리된 것이며, 상기 단백질은 감염된 세포에서 발현을 지속하는 유일한 바이러스성 단백질이다(23, 24, 59). 이런 상황에서, L1 캡시드 단백질에 대한 백신-유도된 면역은 치료에 비효과적이다.
또한, 예방백신의 다수의 수행이 자궁경부암의 발병율에 영향을 미칠 때까지는, 20년 또는 그 이상이 걸릴 것으로 예상되며, 이는 느리게 진행되는 자궁경부발암과 현대 성인 인구에서의 HPC 감염에 대한 높은 감염율 때문이다. 또한, 예방백신은 백신접종의 비율과 일부 사례의 변동에 영향을 받는다(17). 일부 지역에서는, 백신의 가격이 논란이 되고 있다.
치료용 HPV 백신은, 바이러스성 단백질을 발현하는 HPV에 의해 감염된 세포에 대항하여 세포면역을 일으킴으로써 기존의 병변을 근절하기 위해 설계된 것으로, 이는 많은 접종과 HPV와 관련된 암의 치료하기 위해 개발되었으며(검토를 위해 참조 19, 20, 62-65) 현재 승인된 많은 백신이 CD8+ 면역유도를 일반적으로 실패하기 때문에, 강력한 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 백신을 개발하고자 하였다(66, 67). HPV E7 치료용 예방백신 접종은 펩티드 면역화(26, 28-30), DNA 면역화(31-33, 68), 재조합 면역화, E7-발현 우두 바이러스(25, 34), 아데노 바이러스 (35-37), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)(38, 39) 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)(40, 41), E7-펄스 수지상 세포(E7-pulsed dendritic cells)(42-45) 또는 E7-함유 바이러스-유사 입자(E7-containing virus-like particles, VLP)(46-49)를 포함하여, 초기 임상 시험에 진보된 많은 치료용 백신전략을 포함한다.
이러한 많은 치료용 백신 전략은 항상 실행적으로 다루기 힘들고 유도된 반응은 입증된 항바이러스성 면역반응의 급성기 동안 보여지는 CD8+ T 세포의 증식단계에 이르지 못한다(69). DNA 바이러스 또는 프라임 부스터에 대한 두 가지 바이러스성 운송체인 DNA 펩티드를 포함하는 여러 종의 이형 프라임-부스트 식이요법 (rigimens)과 같은 부스터 예방접종을 통해서 CD8+ 면역을 강화하는 전략들은, CD8+ 면역을 유도하기 위해 사용되어 왔다(70-72). 그러나, 이러한 방법은 치료로 옮겨지기 어렵고 방법론들이 최적화되었다고 간주되어지기 부족한 일치의견이 있다.
HPV 백신은 PCT 출원으로 W02005/089164 (2005년 9월 29일 공개), W02007/121894 (2007년 11월 1일 공개), W02007/121895 (2007년 11월 1일 공개), W02008/049329 (2008년 5월 2일 공개), W02008/145745 (2008년 12월 4일 공개)을 포함하는 다수의 추원을 통해 설명되어 왔다.
TC-1 모델 종양 시스템은, HPV 치료용 백신을 위한 테스트 시스템으로 광범위하게 적용되어 왔으며, 상기 TC-1 모델 종양 시스템은 마우스 초기 폐 상피세포에서 유래된 것으로, 상기 마우스는 HPV 16 E6 및 E7 종양 유전자로 형질전환되었으며, 상기 종양 유전자는 형진전환 단계에서 세포 유지와 감염된 세포의 불멸화 및 형질전환을 위해 요구되어진 것으로(21, 22), 이는 활성화된 인간 c-Ha-ras(25)와 같다. 면역 적격 C57B1/6 마우스로 TC-1 종양 세포를 이식한 결과, 형성부에서 빠르게 진행되는 종양이 형성되었다. 그러나, HPV 16 E7에 대항하여 단백질 특정 세포면역은 TC-1 종양 부산물에 대항하여 방어를 제공할 수 있다. 예를 들어, E7의 2Db-제한된 에피토프 (2Db-restricted epitope) (E749-57~RAHYNIVTF)에 특이적인 CD8+ T 세포는 입증된 TC-1 종양의 퇴화를 유발하고 E7-발현 종양 세포를 용해할 수 있다(26, 27).
모든 외인성 단백질에 대한 면역은 MHC class I으로 제한된 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 비효율적인 방법으로 제안되어 왔다(50). 그러나, 재조합(51) 또는 합성된(52) 전장 E7 단백질에 대한 면역은, QuilA 또는 CPG를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 결합을 가져왔을 때 CD8+ T 세포의 면역을 유도한다고 알려져 있다. 또한, 면역성 열충격단백질(HSP)과 선별된 표적항원 사이에서 융합물로 구성되어진 재조합 단백질은 표적항원을 대항하여 CD8+ 면역을 유도하는 것으로 알려져 있다. 면역은 TLR 3 또는 TLR 9 작용제(agonists)와 모든 외인성 단백질을 포함하는데, 이는 크로스-프라이밍(cross-priming) 과정을 가능케 하며 항원-특이적인 CD8+ T 세포반응의 발달을 촉진시키는 것으로 제안되어 왔다(55, 56).
현재, 자궁경부 이형성증과 초기 자궁경부암은 비정상적인 조직을 전자전류로 충전된 얇은 와이어 고리를 사용하여 제거하는 LEEP((Loop electrosurgical excision procedure, 고리 전자수술 절단 과정)로 알려진 수술절차를 이용하여 가장 일반적으로 치료된다. 자궁경부암의 더 진보된 단계들은 화학요법 및/또는 방사선 요법과 결합된 수술에 의해 치료된다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 인간 파필로마바이러스 E7 항원 화합물 및 조성물을 제공한다. 화합물 및 조성물은 인간 파필로마바이러스 감염 및 관련 질병의 치료 또는 진단에 유용할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 E7 항원이 적어도 2개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 2 이상의 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
대안적 실시예에서, 다른 HPV 균주는 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 고위험 균주일 수 있다. 대안적 실시예에서, E7 항원은 HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV45, 및 HPV52와 같은 5개의 다른 HPV 균주로부터 선택될 수 있다.
대안적 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 16 또는 17로 나타낸 아미노산 서열과 같은, 2 이상의 서열번호 1 내지 15로 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 내지 5로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적 실시예에서, 폴리펩티드는 2 이상의 서열번호 18 내지 32로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
대안적 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 33 또는 34와 같은, 2 이상의 서열번호 18 내지 22로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
대안적 실시예에서, E7 항원은 2개의 다른 HPV 균주에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 E7 항원이 적어도 2개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 2 이상의 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 항원의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
대안적 실시예에서, 다른 HPV 균주는 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 고위험 균주일 수 있다.
대안적 실시예에서, E7 항원은 HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV45, 및 HPV52와 같은 5개의 다른 HPV 균주로부터 선택될 수 있다.
대안적 실시예에서, 핵산 분자는 2 이상의 서열번호 18 내지 32로 나타낸 핵산 서열을 포함할 수 있다.
대안적 실시예에서, 핵산 분자는 서열번호 33 또는 34와 같은, 서열번호 18 내지 22로 나타낸 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 HPV E7 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현을 허여하는 서열에 실시가능하게 결합된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 담체 및/또는 면역보강제(ajuvant)를 포함할 수 있다. 면역보강제는 TLR3 작용제(agonist) (예를 들어, 폴리(I:C)) 또는 TLR9 작용제 (예를 들어, CpG 함유 올리고뉴클레오티드)와 같은 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면역보강제는 인터페론-알파, 4-1BB 수용체의 작용제, CD40 수용체의 작용제, 또는 항-CD40 항체일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 피험자에게 투여하여 이를 필요로 하는 피험자의 면역 반응을 촉진시키는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 피험자에게 투여하여 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 피험자에게 투여하여 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염의 치료 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이를 필요로 하는 피험자의 면역 반응을 촉진시키기 위한, 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한, 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염의 치료를 위한, 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
HPV 감염과 관련된 질병은 유방암, 자궁경부암, 항문암, 외음부암(vulva cancer), 질암, 음경암(penis cancer), 두경부암(head and neck cancer), 및 폐암, 또는 이의 전암성 병변(pre-malignant lesion) 중 하나 이상의 암일 수 있거나, 또는 전암성 자궁경부 상피 신생물(pre-cancerous cervical epithelial neoplasia) (CIN I에서 CIN III 까지) 또는 자궁경부암일 수 있다.
대안 실시예에서, HPV 감염은 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 고위험 HPV 타입에 의할 수 있다. 대안 실시예에서, 방법 또는 용도는 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제 (예를 들어, TLR3 작용제 유사 폴리(I:C)) 또는 TLR9 작용제 유사 CpG 함유 올리고뉴클레오티드)와 같은 면역보강제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면역보강제는 인터페론-알파, 4-1BB 수용체의 작용제, CD40 수용체의 작용제, 또는 항-CD40 항체를 포함할 수 있다. 투여는 14일 미만의 기간 동안 수회 용량(multiple dose)의 투여를 포함할 수 있거나, 또는 1 내지 4일 동안 수회 용량의 투여를 포함할 수 있고, 및/또는 1일 수회 투여 용량의 투여를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 하나 이상의 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 하나 이상의 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드와 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 HPV31 감염의 진단방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 하나 이상의 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드와 시료를 접촉시켜 HPV31 감염에 대한 피험자의 반응을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 개요는 발명의 모든 특징을 반드시 기재하지 않는다.
본 발명의 특징은 첨부된 도면에 참조되는 다음의 설명에 의하여 더욱 명확하게 될 것이다.
도 1A-B는 (A) 친화성 태그(affinity tag)가 없는 펜타릭스(Pentarix) 단백질, 또는 (B) 분절가능한(Cleavable) 6x친화성 태그와 트롬빈 분절부위(cleavage site)를 가진 펜타릭스 단백질의 구조적인 구성을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 1C는 분절가능한 6x친화성 태그를 가진 펜타릭스 단백질의 제조 및 정제를 나타낸 도이다. 본 도면은 E.coli에서의 재조합 펜타릭스 단백질의 발현 및 니켈 친화성 정제법을 사용한 전형적인 정제의 예를 나타낸다. IPTG에 의해 유도된 E.coli의 용해물(lysate)에 포함된, HisTrap 칼럼(GE Healthcare)에 통과시키기 전및 후의 전체 단백질, 및 상기 칼럼(Fr#1-12)으로부터 용출시킨 단백질을 증가시키는 이미다졸(imidazole)의 농도 하에 쿠마시 블루 염색으로 검출하였다(좌측 판넬). 정제된 펜타릭스 단백질의 동정은, 항-6xHis tag 항체 또는 항-HPV 16E7 항체를 이용하여 정제된 펜타릭스 및 HPV 16E7 단백질 뿐만 아니라, 비유도(non-induced) 및 유도(induced) 배양물로부터 얻은 용해액의 웨스턴 블롯 분석법으로 확인하였다.
도 2A는 전체 외인성 OVA 단백질, 및 TLR3 작용제인 폴리(I:C) 또는 폴리IC/LC를 이용한 면역유도(immunization)에 반응하여 발생하는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도된 적 없는(Naive) C57BL/6 마우스는 전체 OVA 단백질(500μg)만으로, 또는 OVA 단백질 및 폴리(I:C)(10μg) 또는 폴리IC/LC(10μg/ml)와 함께 면역유도되었다(각 조건당 2마리씩). 면역유도 7일 후, 면역유도된 마우스를 안락사시키고, 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264(SIINFEKL)-특이적인 CD8+T 세포의 숫자를 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. 결과는 배양액, SIINFEKL 펩티드(10μg/ml)(서열번호 39) 포함, 또는 관계없는 H2Db-결합 펩티드(10μg/ml)를 포함한 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포(spot-forming cell)의 수로 보고되었다.
도 2B는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 반응이, 전체 외인성 OVA 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 면역유도 후 이에 용량의존적으로 일어나는 것을 나타낸 그래프이다.
도 3A-E는 장기 또는 단기의 간격으로 상동성 있는 면역원으로 프라임-부스팅하는 면역유도에 반응하여 일으키는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 또는 HPV16 E7 반응을 나타낸다. A, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 전체 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 -7일, -21일, 또는 -7일 및 -21일에 면역유도시키고 0일에 안락사되었다(각 조건당 2마리씩). 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자는 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 폴리(I:C)(10μg)로 혼합된 전체, 가용성 (soluble) OVA 단백질(100μg)을 제시된 숫자의 연속적인 매일 투여로 면역유도되었다(각 조건당 3마리씩). 추가 그룹의 마우스는 보통의 매일 사용하는 량의 4배와 동량(즉, 400μg의 OVA 단백질 및 40μg의 폴리(I:C))의 1회 투여로 면역유도되었다. 첫 번째 면역유도로부터 7일 후 마우스를 안락사시키고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자를 정량하였다. A와 B의 결과는 배양액, 또는 SIINFEKL 펩티드(10μg/ml) 포함 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. C, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 제시된 바와 같이, 1회 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 매일 투여하여 면역유도되었다. D, 4회 연속으로 매일 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 투여한 판넬 C의 마우스는 첫 번째 면역유도 후 47일부터 4회 연속 매일 투여하여 재면역유도되었다. 말초혈액은, 면역유도 후 제시된 날에 연속적으로 개별 마우스의 복재정맥으로부터 채혈하였다. 말초혈액의 적혈구는 용혈시켰고, 림프구는 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 H-2Kb/OVA257-264 사량체(tetramer)로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. C 및 D에 나타난 결과들은 CD8+ 림프구에 의해 좌우되고, 대표적인 단일 동물로부터 시간에 따른 항원-특이적 T 세포 반응의 전개를 정확하게 모니터링 할 수 있도록 한다. E, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 1회, 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 HPV16 E7 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg), 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 HPV16 E7 단백질(100μg)만을 매일 투여하여 면역유도되었다. 면역유도로부터 7일 후, 말초혈액을 면역유도한 마우스로부터 채취하였다. 림프구는 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE -결합 Db/E749-57 사량체로 염색하고 유세포분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8+ 림프구에 의해 좌우된다.
도 4는 연속적으로 전체, 가용성 단백질 및 폴리(I:C) TLR3 작용제로 매일 면역유도를 하면 대형의, 확립된 종양의 퇴행이 유도됨을 나타낸 일련의 그래프이다. 0일에 OVA를 발현하는 EG7 종양세포를 이식한 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나(좌측 상단), 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리되거나(우측 상단), 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 처리되거나(좌측 하단), 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 처리되었다. 각 그룹의 처리 시점은 화살표(arrowhead)으로 표시하였다. 각 그룹의 치료시점에서의 평균 종양의 부피는 224mm3 (폴리(I:C) 만 처리), 194mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 1회 처리), 344mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 4회 처리)였다. 연속적인 매일 면역유도의 유용한 효과를 예증하기 위하여 마지막 코호트 마우스는 의도적으로 종양 크기가 더 커졌을 때 처리되었다.
도 5A 및 5B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 한 1회 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나, 10 μg의 폴리(I:C)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 처리되거나, 10μg 의 폴리(I:C)로만 처리되었다(5B). 면역유도로부터 7일 후 마우스를 안락사시키고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 숫자를 정량하였다. 간략하게, 개별 동물로부터 채취한 비장세포를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호 40)로 자극하였다. 면역유도되지 않은 마우스로부터 얻은 결과도 비교를 위하여 포함되었다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다(5B).
도 6A 및 6B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR9 작용제 CpG 올리고뉴클레오티드로 1회 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나, 10 μg의 CpG 올리고 #2395(Invivogen), 또는 CpG 올리고로만 1회 면역유도되었다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 숫자를 정량하였다. 간략하게, 개별 동물로부터 채취한 비장세포(웰 당 3x105 개, 각 조건 당 웰 3개)를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호 40)로 자극하였다. 면역유도되지 않은 마우스로부터 얻은 결과도 비교를 위하여 포함되었다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 도 6B에 나타낸 결과는 상기 세 실험의 대표값이다; 결과는 1x106 개의 비장세포 당 3개의 웰의 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수(+/- 3개의 웰의 표준편차)로 보고되었다.
도 7A-B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 1회 투여, 또는 4회 연속으로 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)를 매일 투여를 통한 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T cell 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(도 7B의 코호트 당 3마리)는 아무 처리되지 않거나, 10μg의 폴리(I:C)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 1회 또는 4회(1일 내지 4일까지 매일) 면역유도되었다. 면역유도 7일 후(7A) 또는 8일 후(7B)에 마우스를 안락사하고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T cell의 숫자를 정량하였다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 개별 동물에서 채취한 비장세포(웰 당 3x105 개)를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호40)로 자극하였다. 도 7B에 나타난 결과는 상기 세 실험의 대표값이다; 결과는 1x106 개의 비장세포 당 3개의 웰의 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수(+/- 3개의 웰의 표준편차)로 보고되었다.
도 7C는 4회 연속으로 100μg의 펜타릭스 단백질 및 10μg의 폴리(I:C)(좌측 판넬)로 면역유도되거나, 100μg의 펜타릭스 단백질(우측 판넬)로만 면역유도된 마우스의 비장 및 말초혈액에서 채취한 림프구를 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 Db/16E749-57 사량체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8 림프구에의해 좌우되며, 4마리의 각 동물의 대표값을 나타낸다.
도 8A 및 도 8B는 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)를 이용한 면역유도가 대형의, 확립된 TC1 종양의 퇴행을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. A, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 3마리)에, 아무 처리되지 않거나(좌측), -14일 및 0일(종양이 약 200mm3 의 크기에 도달한 때)에 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리(중간), 또는 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리(우측)한 E7-발현 TC1 종양 세포(1x105)를 이식하였다. 종양은 매 2-3일 마다 전자 디지털 캘리퍼(electronic digital caliper)를 사용하여 측정되었고, 크기는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 8마리)에 피하로 1x105의 E7-발현 TC-1 종양 세포를 이식하였다. 종양의 평균 부피가 350mm3에 도달하면, 마우스를 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리하거나, 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 4회 연속으로 매일 처리하거나, 10μg의 폴리(I:C)만을 4회 연속으로 매일 처리하거나, 또는 아무 처리하지 않았다. 종양은 매 2 내지 4일에 전자 캘리퍼로 측정하였고, 종양을 가진 마우스는 종양의 부피가 약 2,000mm3에 도달하거나, 빈사상태에 이르렀을 때, 또는 체중이 20% 이상 감소된 때에 안락사하였다. 결과는 코호트 내(좌측 판넬) 또는 생존율(우측 판넬)을 평균 종양 부피로 나타내었다.
도 8C는 TC1-종양을 가진 마우스를 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)로 면역유도할 경우 완전한 종양의 퇴행 및 종양의 진행 후에 존재하는 E7-특이적 CD8+ 메모리 세포의 확립을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 8마리)에 피하로 1x105의 E7-발현 TC-1 종양 세포를 이식하였다. 종양의 평균 부피가 200mm3에 도달하였을 때, 마우스를 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리하자 종양이 면역유도 15일 이내에 완전히 퇴행되었다. 면역유도 후 21일에 복재정맥(saphenous vein)으로부터 채취한 말초혈액 샘플을, 메모리 표현형 마커 CD62L, CD127, 및 KLRG1으로 뿐만 아니라 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 Db/16 E749-57 사량체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8+ 림프구에 의해 좌우된다.
도 9A-B는 폴리(I:C) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드로 결합된 전체, 가용성 펜타릭스 단백질이 확립된 TC1 종양의 퇴행을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. A, C57BL/6 마우스(코호트 당 4마리)에 -21일 및 0일에 E7-발현 TC1 종양 세포(1x105)를 이식하였고, 전체, 가용성 펜타릭스 단백질(100μg) 및 CpG 올리고 #2395(10μg)로 1회 처리되거나(좌측 상단), CpG 올리고 #2395(10μg)만으로 1회 처리되거나(우측 상단), 또는 아무 처리되지 않았다(좌측 하단). 종양은 2-3일 간격으로 전자 디지털 캘리퍼로 측정되었고, 크기는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였다. 좌측 상단, 우측 상단, 및 좌측 하단의 3개의 플롯은 개별 마우스에서 종양의 퇴행을 나타내나, 우측 하단의 플롯은 각 코호트의 결합된 평균 종양 부피를 나타낸다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 마우스의 수로 표시됨)에 피하로 1x105개의 E7-발현 종양 세포를 이식하였다. 종양의 크기가 평균 200mm3에 도달하였을 때, 펜타릭스(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리하거나, 펜타릭스(100μg)와 CpG 올리고뉴클레오티드(10μg) 또는 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리하거나, CpG 올리고뉴클레오티드(10μg) 또는 폴리(I:C)(10μg)를 단독으로 처리하거나, 아무 처리하지 않았다. 종양은 매 2 내지 4일 간격으로 전자 캘리퍼로 측정되었으며, 결과는 각 코호트 내 개별동물의 시간에 따른 종양의 부피로 나타내거나(상단 6개 판넬) 각 코호트 내 모든 동물의 생존율로 나타내었다(하단 2개 판넬). 종양을 가진 마우스들은 종양의 부피가 약 2,000mm3를 초과하거나, 마우스가 빈사상태에 이르렀을 때, 또는 체중이 20% 이상 감소되었을 때 안락사시켰다. p 값은 log rank(Mantel-Cox) test를 사용하여 계산되었다.
도 10A는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)를 이용한 1회 면역유도에 대응하여 일어나는 에피토프-특이적 CD8+ T cell반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 10μg의 폴리(I:C)(Amersham)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 면역유도되었다.
면역유도 7일 후 마우스를 안락사하여 벌크 비장세포를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 각 표시된 펩티드에 특이적인 CD8+ T cell의 수를 정량하였다. 결과는 배양액 단독으로 또는 표시된 펩티드(10μg/ml)로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
도 10B-D는 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)가 복합 유전형 (multiple genotype)을 가진 HPV에 대한 면역반응을 일으키는 면역유도를 나타내는 그래프이다. C57BL/6(B), 또는 HLA-A2/Db 형질전환 마우스(C)를 4회 연속으로 매일 10μg의 폴리(I:C)와 결합된 100μg의 펜타릭스 단백질로 면역유도하였다. 면역 유도 8일 후 마우스를 안락사하고, 벌크 비장세포(B 및 C) 또는 CD4-고갈(depleted) 비장세포(B 단독)을 IFN-γ ELISPOT(CD4 결핍은 고갈 후 FACS 분석결과 99% 이상이었다)으로 분석하였다. 벌크 및 CD4-고갈 비장세포는 하룻밤 동안 전체 펜타릭스 단백질에 걸쳐 중첩되는 15머(mer) 펩티드(11개 아미노산이 중첩)로 자극하였다. D, 폴리(I:C)와 결합된 펜타릭스 단백질로 면역유도된 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포는 하룻밤 동안 배양액 단독으로, 또는 최소 펩티드 에피토프 HPV16 E749-57, HPV31 E749-57, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM)로 자극하였고, IFN-γ ELISPOT으로 분석하였다. 결과는 1x106 비장세포 당 IFN-γ의 수로 보고되었으며, 3개의 각 실험들의 대표값이다.
도 11은 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T cell이 전체 펜타릭스 단백질 단독으로(면역보강제 제외) 1회 투여하거나, 또는 4회 연속으로 매일 펜타릭스 단백질만(면역보강제 제외)을 투여로 한 면역유도에 반응하여 발생한다는 것을 나타낸 도이다. 면역유도되지 않은 C57Bl/6 마우스는 PBS에 포함된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 1회 또는 4회(매일 1~4일 동안) 면역유도되었다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하여 벌크 비장세포를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 수를 정량하였다. 결과는 배양액 단독으로 또는 HPV16 E749-57, 또는 관계없는 음성 대조군 펩티드(각 10μg/ml)로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
도 12A-O는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV45, HPV52, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 및 HPV82 각각으로부터 얻은 E7 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1-15) 및 뉴클레오티드서열(서열번호 18-32)을 나타낸 도이다.
도 12P-Q는 아미노 말단에 6xHis 친화성 태그가 있는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 16) 및 6xHis 친화성 태그가 없는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 17)을 나타낸 도이다.
도 12R-S는 6xHis 친화성 태그가 있는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호34) 및 6xHis 친화성 태그가 없는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 33)을 나타낸 도이다.
도 1A-B는 (A) 친화성 태그(affinity tag)가 없는 펜타릭스(Pentarix) 단백질, 또는 (B) 분절가능한(Cleavable) 6x친화성 태그와 트롬빈 분절부위(cleavage site)를 가진 펜타릭스 단백질의 구조적인 구성을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 1C는 분절가능한 6x친화성 태그를 가진 펜타릭스 단백질의 제조 및 정제를 나타낸 도이다. 본 도면은 E.coli에서의 재조합 펜타릭스 단백질의 발현 및 니켈 친화성 정제법을 사용한 전형적인 정제의 예를 나타낸다. IPTG에 의해 유도된 E.coli의 용해물(lysate)에 포함된, HisTrap 칼럼(GE Healthcare)에 통과시키기 전및 후의 전체 단백질, 및 상기 칼럼(Fr#1-12)으로부터 용출시킨 단백질을 증가시키는 이미다졸(imidazole)의 농도 하에 쿠마시 블루 염색으로 검출하였다(좌측 판넬). 정제된 펜타릭스 단백질의 동정은, 항-6xHis tag 항체 또는 항-HPV 16E7 항체를 이용하여 정제된 펜타릭스 및 HPV 16E7 단백질 뿐만 아니라, 비유도(non-induced) 및 유도(induced) 배양물로부터 얻은 용해액의 웨스턴 블롯 분석법으로 확인하였다.
도 2A는 전체 외인성 OVA 단백질, 및 TLR3 작용제인 폴리(I:C) 또는 폴리IC/LC를 이용한 면역유도(immunization)에 반응하여 발생하는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도된 적 없는(Naive) C57BL/6 마우스는 전체 OVA 단백질(500μg)만으로, 또는 OVA 단백질 및 폴리(I:C)(10μg) 또는 폴리IC/LC(10μg/ml)와 함께 면역유도되었다(각 조건당 2마리씩). 면역유도 7일 후, 면역유도된 마우스를 안락사시키고, 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264(SIINFEKL)-특이적인 CD8+T 세포의 숫자를 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. 결과는 배양액, SIINFEKL 펩티드(10μg/ml)(서열번호 39) 포함, 또는 관계없는 H2Db-결합 펩티드(10μg/ml)를 포함한 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포(spot-forming cell)의 수로 보고되었다.
도 2B는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 반응이, 전체 외인성 OVA 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 면역유도 후 이에 용량의존적으로 일어나는 것을 나타낸 그래프이다.
도 3A-E는 장기 또는 단기의 간격으로 상동성 있는 면역원으로 프라임-부스팅하는 면역유도에 반응하여 일으키는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 또는 HPV16 E7 반응을 나타낸다. A, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 전체 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 -7일, -21일, 또는 -7일 및 -21일에 면역유도시키고 0일에 안락사되었다(각 조건당 2마리씩). 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자는 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 폴리(I:C)(10μg)로 혼합된 전체, 가용성 (soluble) OVA 단백질(100μg)을 제시된 숫자의 연속적인 매일 투여로 면역유도되었다(각 조건당 3마리씩). 추가 그룹의 마우스는 보통의 매일 사용하는 량의 4배와 동량(즉, 400μg의 OVA 단백질 및 40μg의 폴리(I:C))의 1회 투여로 면역유도되었다. 첫 번째 면역유도로부터 7일 후 마우스를 안락사시키고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자를 정량하였다. A와 B의 결과는 배양액, 또는 SIINFEKL 펩티드(10μg/ml) 포함 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. C, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 제시된 바와 같이, 1회 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 매일 투여하여 면역유도되었다. D, 4회 연속으로 매일 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 투여한 판넬 C의 마우스는 첫 번째 면역유도 후 47일부터 4회 연속 매일 투여하여 재면역유도되었다. 말초혈액은, 면역유도 후 제시된 날에 연속적으로 개별 마우스의 복재정맥으로부터 채혈하였다. 말초혈액의 적혈구는 용혈시켰고, 림프구는 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 H-2Kb/OVA257-264 사량체(tetramer)로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. C 및 D에 나타난 결과들은 CD8+ 림프구에 의해 좌우되고, 대표적인 단일 동물로부터 시간에 따른 항원-특이적 T 세포 반응의 전개를 정확하게 모니터링 할 수 있도록 한다. E, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 1회, 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 HPV16 E7 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg), 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 HPV16 E7 단백질(100μg)만을 매일 투여하여 면역유도되었다. 면역유도로부터 7일 후, 말초혈액을 면역유도한 마우스로부터 채취하였다. 림프구는 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE -결합 Db/E749-57 사량체로 염색하고 유세포분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8+ 림프구에 의해 좌우된다.
도 4는 연속적으로 전체, 가용성 단백질 및 폴리(I:C) TLR3 작용제로 매일 면역유도를 하면 대형의, 확립된 종양의 퇴행이 유도됨을 나타낸 일련의 그래프이다. 0일에 OVA를 발현하는 EG7 종양세포를 이식한 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나(좌측 상단), 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리되거나(우측 상단), 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 처리되거나(좌측 하단), 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 처리되었다. 각 그룹의 처리 시점은 화살표(arrowhead)으로 표시하였다. 각 그룹의 치료시점에서의 평균 종양의 부피는 224mm3 (폴리(I:C) 만 처리), 194mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 1회 처리), 344mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 4회 처리)였다. 연속적인 매일 면역유도의 유용한 효과를 예증하기 위하여 마지막 코호트 마우스는 의도적으로 종양 크기가 더 커졌을 때 처리되었다.
도 5A 및 5B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 한 1회 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나, 10 μg의 폴리(I:C)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 처리되거나, 10μg 의 폴리(I:C)로만 처리되었다(5B). 면역유도로부터 7일 후 마우스를 안락사시키고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 숫자를 정량하였다. 간략하게, 개별 동물로부터 채취한 비장세포를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호 40)로 자극하였다. 면역유도되지 않은 마우스로부터 얻은 결과도 비교를 위하여 포함되었다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다(5B).
도 6A 및 6B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR9 작용제 CpG 올리고뉴클레오티드로 1회 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나, 10 μg의 CpG 올리고 #2395(Invivogen), 또는 CpG 올리고로만 1회 면역유도되었다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 숫자를 정량하였다. 간략하게, 개별 동물로부터 채취한 비장세포(웰 당 3x105 개, 각 조건 당 웰 3개)를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호 40)로 자극하였다. 면역유도되지 않은 마우스로부터 얻은 결과도 비교를 위하여 포함되었다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 도 6B에 나타낸 결과는 상기 세 실험의 대표값이다; 결과는 1x106 개의 비장세포 당 3개의 웰의 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수(+/- 3개의 웰의 표준편차)로 보고되었다.
도 7A-B는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)로 1회 투여, 또는 4회 연속으로 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)를 매일 투여를 통한 면역유도에 반응하여 일어나는 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T cell 반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(도 7B의 코호트 당 3마리)는 아무 처리되지 않거나, 10μg의 폴리(I:C)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 1회 또는 4회(1일 내지 4일까지 매일) 면역유도되었다. 면역유도 7일 후(7A) 또는 8일 후(7B)에 마우스를 안락사하고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T cell의 숫자를 정량하였다. 결과는 배양액만, HPV16 E749-57 을 포함, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 개별 동물에서 채취한 비장세포(웰 당 3x105 개)를 하룻밤 동안 배양액만으로, 또는 HPV16 E749-57 펩티드(10μg/ml)를 포함하거나, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM; 서열번호40)로 자극하였다. 도 7B에 나타난 결과는 상기 세 실험의 대표값이다; 결과는 1x106 개의 비장세포 당 3개의 웰의 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수(+/- 3개의 웰의 표준편차)로 보고되었다.
도 7C는 4회 연속으로 100μg의 펜타릭스 단백질 및 10μg의 폴리(I:C)(좌측 판넬)로 면역유도되거나, 100μg의 펜타릭스 단백질(우측 판넬)로만 면역유도된 마우스의 비장 및 말초혈액에서 채취한 림프구를 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 Db/16E749-57 사량체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8 림프구에의해 좌우되며, 4마리의 각 동물의 대표값을 나타낸다.
도 8A 및 도 8B는 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)를 이용한 면역유도가 대형의, 확립된 TC1 종양의 퇴행을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. A, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 3마리)에, 아무 처리되지 않거나(좌측), -14일 및 0일(종양이 약 200mm3 의 크기에 도달한 때)에 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리(중간), 또는 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리(우측)한 E7-발현 TC1 종양 세포(1x105)를 이식하였다. 종양은 매 2-3일 마다 전자 디지털 캘리퍼(electronic digital caliper)를 사용하여 측정되었고, 크기는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 8마리)에 피하로 1x105의 E7-발현 TC-1 종양 세포를 이식하였다. 종양의 평균 부피가 350mm3에 도달하면, 마우스를 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리하거나, 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 4회 연속으로 매일 처리하거나, 10μg의 폴리(I:C)만을 4회 연속으로 매일 처리하거나, 또는 아무 처리하지 않았다. 종양은 매 2 내지 4일에 전자 캘리퍼로 측정하였고, 종양을 가진 마우스는 종양의 부피가 약 2,000mm3에 도달하거나, 빈사상태에 이르렀을 때, 또는 체중이 20% 이상 감소된 때에 안락사하였다. 결과는 코호트 내(좌측 판넬) 또는 생존율(우측 판넬)을 평균 종양 부피로 나타내었다.
도 8C는 TC1-종양을 가진 마우스를 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)로 면역유도할 경우 완전한 종양의 퇴행 및 종양의 진행 후에 존재하는 E7-특이적 CD8+ 메모리 세포의 확립을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 8마리)에 피하로 1x105의 E7-발현 TC-1 종양 세포를 이식하였다. 종양의 평균 부피가 200mm3에 도달하였을 때, 마우스를 100μg의 펜타릭스 및 10μg의 폴리(I:C)로 1회 처리하자 종양이 면역유도 15일 이내에 완전히 퇴행되었다. 면역유도 후 21일에 복재정맥(saphenous vein)으로부터 채취한 말초혈액 샘플을, 메모리 표현형 마커 CD62L, CD127, 및 KLRG1으로 뿐만 아니라 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 Db/16 E749-57 사량체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 나타난 결과는 CD8+ 림프구에 의해 좌우된다.
도 9A-B는 폴리(I:C) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드로 결합된 전체, 가용성 펜타릭스 단백질이 확립된 TC1 종양의 퇴행을 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. A, C57BL/6 마우스(코호트 당 4마리)에 -21일 및 0일에 E7-발현 TC1 종양 세포(1x105)를 이식하였고, 전체, 가용성 펜타릭스 단백질(100μg) 및 CpG 올리고 #2395(10μg)로 1회 처리되거나(좌측 상단), CpG 올리고 #2395(10μg)만으로 1회 처리되거나(우측 상단), 또는 아무 처리되지 않았다(좌측 하단). 종양은 2-3일 간격으로 전자 디지털 캘리퍼로 측정되었고, 크기는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였다. 좌측 상단, 우측 상단, 및 좌측 하단의 3개의 플롯은 개별 마우스에서 종양의 퇴행을 나타내나, 우측 하단의 플롯은 각 코호트의 결합된 평균 종양 부피를 나타낸다. B, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 마우스의 수로 표시됨)에 피하로 1x105개의 E7-발현 종양 세포를 이식하였다. 종양의 크기가 평균 200mm3에 도달하였을 때, 펜타릭스(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리하거나, 펜타릭스(100μg)와 CpG 올리고뉴클레오티드(10μg) 또는 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리하거나, CpG 올리고뉴클레오티드(10μg) 또는 폴리(I:C)(10μg)를 단독으로 처리하거나, 아무 처리하지 않았다. 종양은 매 2 내지 4일 간격으로 전자 캘리퍼로 측정되었으며, 결과는 각 코호트 내 개별동물의 시간에 따른 종양의 부피로 나타내거나(상단 6개 판넬) 각 코호트 내 모든 동물의 생존율로 나타내었다(하단 2개 판넬). 종양을 가진 마우스들은 종양의 부피가 약 2,000mm3를 초과하거나, 마우스가 빈사상태에 이르렀을 때, 또는 체중이 20% 이상 감소되었을 때 안락사시켰다. p 값은 log rank(Mantel-Cox) test를 사용하여 계산되었다.
도 10A는 전체 펜타릭스 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C)를 이용한 1회 면역유도에 대응하여 일어나는 에피토프-특이적 CD8+ T cell반응을 나타내는 그래프이다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 10μg의 폴리(I:C)(Amersham)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 면역유도되었다.
면역유도 7일 후 마우스를 안락사하여 벌크 비장세포를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 각 표시된 펩티드에 특이적인 CD8+ T cell의 수를 정량하였다. 결과는 배양액 단독으로 또는 표시된 펩티드(10μg/ml)로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
도 10B-D는 전체, 가용성 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)가 복합 유전형 (multiple genotype)을 가진 HPV에 대한 면역반응을 일으키는 면역유도를 나타내는 그래프이다. C57BL/6(B), 또는 HLA-A2/Db 형질전환 마우스(C)를 4회 연속으로 매일 10μg의 폴리(I:C)와 결합된 100μg의 펜타릭스 단백질로 면역유도하였다. 면역 유도 8일 후 마우스를 안락사하고, 벌크 비장세포(B 및 C) 또는 CD4-고갈(depleted) 비장세포(B 단독)을 IFN-γ ELISPOT(CD4 결핍은 고갈 후 FACS 분석결과 99% 이상이었다)으로 분석하였다. 벌크 및 CD4-고갈 비장세포는 하룻밤 동안 전체 펜타릭스 단백질에 걸쳐 중첩되는 15머(mer) 펩티드(11개 아미노산이 중첩)로 자극하였다. D, 폴리(I:C)와 결합된 펜타릭스 단백질로 면역유도된 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포는 하룻밤 동안 배양액 단독으로, 또는 최소 펩티드 에피토프 HPV16 E749-57, HPV31 E749-57, 또는 관계없는 대조군 펩티드(KAVYNFATM)로 자극하였고, IFN-γ ELISPOT으로 분석하였다. 결과는 1x106 비장세포 당 IFN-γ의 수로 보고되었으며, 3개의 각 실험들의 대표값이다.
도 11은 HPV16 E749-57-특이적 CD8+ T cell이 전체 펜타릭스 단백질 단독으로(면역보강제 제외) 1회 투여하거나, 또는 4회 연속으로 매일 펜타릭스 단백질만(면역보강제 제외)을 투여로 한 면역유도에 반응하여 발생한다는 것을 나타낸 도이다. 면역유도되지 않은 C57Bl/6 마우스는 PBS에 포함된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 1회 또는 4회(매일 1~4일 동안) 면역유도되었다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하여 벌크 비장세포를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 HPV16 E749-57-특이적인 CD8+ T 세포의 수를 정량하였다. 결과는 배양액 단독으로 또는 HPV16 E749-57, 또는 관계없는 음성 대조군 펩티드(각 10μg/ml)로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
도 12A-O는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV45, HPV52, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 및 HPV82 각각으로부터 얻은 E7 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1-15) 및 뉴클레오티드서열(서열번호 18-32)을 나타낸 도이다.
도 12P-Q는 아미노 말단에 6xHis 친화성 태그가 있는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 16) 및 6xHis 친화성 태그가 없는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 17)을 나타낸 도이다.
도 12R-S는 6xHis 친화성 태그가 있는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호34) 및 6xHis 친화성 태그가 없는 펜타릭스 단백질의 아미노산 서열(서열번호 33)을 나타낸 도이다.
본 발명은 부분적으로, 인간 파필로마바이러스 E7 항원(antigen) 화합물 및 조성물을 제공한다. 상기 화합물 및 조성물들은 인간 파필로마바이러스 감염 및 관련 질병을 치료 또는 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
어떤 실시예로서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 다수의 HPV 타입, 예들들어 고위험 HPV 타입과 같은 적어도 2 이상의 HPV 표현형을 대상으로 하는 것에 유용하다. 추가적으로, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 HPV E7 항원 또는 실질적으로 화합물 및 조성물을 포함하는 HPV E7 항원에 실질적으로 동일한 서열에서 유래한 하나 이상의 HPV 타입에 대한 면역반응을 유도하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 넓은 개체군 범위를 갖는 화합물 및 조성물은 더욱 넓은 범위의 인간 그룹에게 적용가능하기 때문에 상업적으로 유용하다.
Human papollomavirus(HPV)
"저위험(low risk)" 및 "고위험(high risk)"으로 넓게 분류될 수 있는 100개 이상의 관련군에 속하나, 유전적으로 구별되는 "타입"에 속하는 바이러스들은 "인간 파필로마바이러스" 또는 "HPV"를 의미한다.
"저위험" HPV 타입은 이에 제한되지 않지만, HPV11, HPV40, HPV42, HPV43, HPV44, HPV54, HPV61, HPV70, HPV72, 및 HPV81과 같은 HPV 타입을 포함한다.
"고위험" HPV 타입은, 이에 제한되지 않지만, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 및 HPV82를 포함한다.
일반적으로 HPV의 유전체(genome)는 단백질 캡시드(capsid)에 의하여 둘러싸인 대략 7000~8000 길이의 염기서열로 이중-가닥의 원형 DNA이다. 상기 유전체는 초기 발현(early antigens)항원 E1-E7을 코딩하는 E(early) 구역 및 구조적인 L1 및 L2 캡시드 단백질을 코딩하는 L(late) 구역을 포함한다. 상기 E6 및 E7 단백질은 감염된 세포의 불멸화 및 형질전환에 필요하고, 형질전환된 상태로 세포를 유지하는데 상기 단백질의 계속적인 발현이 필요하다. 때때로, HPV DNA는 숙주세포의 DNA 안으로 통합되고, 바이러스의 여러 유전자의 손실은 이러한 과정과 관련되어 있다. 예를 들어, 일반적으로 통합(integration)은 감염된 세포에서 계속적으로 발현되는 바이러스 단백질인 E6 및 E7 유전자를 남겨두고, 여러 초기 발현(E2, E4 및 E5) 및 말기 발현(L1 및 L2) 유전자의 결실을 일으킨다. HPV 유전체 서열은 다양한 공공 데이터베이스에 기술되어 있고, 이를 이용가능하다. 예를 들어, 이러한 서열들은 GenBank accession numbers NP 041326 (HPVI6 E7), NP 040311 (HPV18 E7), AAA46951 (HPV31 E7), AAA46959 (HPV33 E7), AAA46967 (HPV35 E7), AAA47051 (HPV39 E7), P21736(HPV45 E7), P26558 (HPV51 E7), P36831 (HPV52 E7), P36833 (HPV56 E7), P26557 (HPV5820 E7), CAA54850 (HPV59 E7), P54668 (HPV68 E7), CAA63883 (HPV73 E7), 및 AAK28450 (HPV82 E7)에서 찾을 수 있다.
치료상의 표시(therapeutic indications)
본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 HPV 감염 또는 상기 감염과 연관된 질병을 치료하는데 사용할 수 있다. HPV 감염은 이에 제한되지 않지만, 일반 사마귀 (common warts; 또는 파필로마스) 및 암 등을 포함한다. 일반적으로, 저위험의 HPV 타입은 일반 사마귀(또는 파필로마스)와 관련되어 있고, 고위험의 HPV 타입은 암과 관련된다.
어떠한 생리학적 기능에 기여하지 않는 세포의 적절하지(unwanted) 성장을 "암(cancer)" 또는 "종양(neoplasm)"으로 정의된다. 일반적으로, 세포적 환경에서 종양 세포들은 통상적인 생화학적 및 물리적 영향에 의하여 조절되지 않은 성장을 하는 세포이며, 상기 종양 세포는 일반세포가 세포 분열 조절의 이상이 생겨 발생한다. 대부분의 경우에, 종양세포는 분열하여 양성 또는 악성의 세포 클론을 형성한다. 암 또는 종양의 예는 이에 제한되지는 않지만, 형질전환 및 불멸화된 세포, 종양(tumour) 및 유방암종, 자궁경부암종 같은 암종(carcinomas)을 포함한다. 상기 용어 암은 세포 성장이 기술적으로 양성이지만, 양성으로 될 위험을 수반하는 세포 성장을 포함한다. 어떤 세포 타입 또는 조직의 이상적인 성장은 악성(malignancy)으로 정의된다. 또한, 상기 용어 악성은 암, 암종, 종양(neoplasm), 종양 형성 (neoplasia), 또는 종양(tumor)을 포함한다.
따라서, HPV 감염이 존재 및 HPV 감염과 상호 관련되어 있는 질환(disese) 또는 장애(disorder), HPV 감염과 관련된 질병(condition), 예를 들어, 고위험의 HPV 감염이 존재하는 것과 상호 관련되어 있는 질병, 질환 또는 장애, HPV 감염과 관련된 질병을 "HPV 감염과 관련된 질병(condition associated with HPV infection)"이라고 정의한다. 어떤 실시예에서, HPV 감염과 관련된 질병은 자궁경부(cervix), 하부성기도(lower genital) 또는 항문성기관(anogenital tract), 피부 또는 충치의 질병, 질환 또는 장애를 포함한다.
어떤 실시예에서, HPV 감염 관련 질병은 악성 및/또는 자궁경부, 하부성 또는 항문성기관의 전암성 병변(pre-malignant lesions), 예를 들어, 자궁경부암, 항문암, 외음부암, 질암, 회음(perineum)암, 음경암 등 또는 기타 전암성 병변으로부터의 암을 포함한다. 다른 실시예에서, HPV 감염과 관련된 질병은 폐암, 호흡기관 암, 상피(epithelium) 암, 두경부암, 유방암 및 구강암 등 또는 기타 전암성 병변으로부터의 암을 포함한다.
다른 실시예에서, HPV 감염과 관련된 질병은 전암성 자궁경부 형성이상(pre-cancerous cervical dysplasia), 자궁경부 상피내 신생물(CIN; Cervical intra-epithelial neoplasia) 등급 1, 2 또는 3, 외음부 안쪽 상피 신생물(VIN; Vulval intraepithelial neoplasia), 질 상피내 신생물(VAIN; varginal intraepithelial neoplasia), 항문 상피내 신생물(anal intraepithelial neoplasia;AIN)등 초기-악성 형성이상의 질병(pre-malignant dysplastic condition)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 HPV 감염을 진단할 수 있다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)을 포함하는 펩티드는 HPV31 감염을 진단 또는 HPV31의 HPV31 E7 서열을 포함하는 조성물의 면역 반응을 결정하는데 이용할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 TSNYNIVTF, AEPDTSNYNIVTFCC 또는 TSNYNIVTFCCQCKS 서열은 HPV31 감염을 예방하는데 사용할 수 있다.
HPV E7 화합물, 시험 화합물 및 이의 제조 방법.
본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 다른 HPV 표현형으로부터의 2 이상의 HPV E7 항원을 포함하는 폴리펩티드, 그 유사체(analogues), 변이체 (variants), 동족체(homologues) 및 이로부터의 단편(fragment), 상기 폴리펩티드들을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 어떤 실시예에서, 상기 2 이상의 HPV E7 항원은 다른 HPV 표현형으로부터 기인하는 다른 HPV 표현형에 대항하여 T 세포 CD8+ 반응과 같은 면역반응을 유발하는 능력이 있다.
"단백질", "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 번역 후 변경(post-translational modification; 예를 들어, 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation))에 상관없이, 자연적으로 생산되는(naturally occuring) 또는 비 자연적으로 생산되는(non-naturally occuring) 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함하는 두 개 이상의 아미노산의 사슬이다. 본 발명의 "아미노산 서열", "폴리펩티드", "펩티드" 또는 "단백질"은 비 이상적 결합(abnormal linkages), 가교결합(cross link) 및 말단의 모자(end caps), 비-펩티드 결합(non-peptidyl bonds) 또는 선택적 변형 그룹 (alternative modifying groups)을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 변형은 발명의 범위 안에 있다. 상기 용어 "변형 그룹(modifying group)"은 펩티드 구조에 직접적으로 부착되는 구조(예를 들어, 공유 결합에 의하여)와 펩티드 구조에 간접적으로 부착되는 구조(예를 들어, 안정적인 비-공유 결합 또는 중심 펩티드 구조의 측면에 존재하는 추가적인 아미노산 잔기(residues) 또는 모방체, 유사체 또는 이로부터의 유도체와 공유 결합에 의하여)를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 변형 그룹은 펩티드 구조의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 결합될 수 있고, 중심 도메인(core domain)의 측면에 위치하는 펩티드 유사 구역 (peptidomimetrc region)에 결합할 수 있다. 대안적으로, 변형 그룹은 펩티드 구조의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 하나의 측면 사슬(side chain)에 결합할 수 있고, 중심 도메인의 측면에 위치하는 펩티드 유사 구역 또는 펩티드 구역에 결합할 수 있다(예를 들어, 리신 잔기의 입실론(epsilon) 아미노 그룹을 통하여, 아스파르르트산(spartic acid) 잔기 또는 글루탐산 잔기의 카르복실 그룹을 통하여, 또는 티로신 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기의 히드록실 그룹을 통하여, 또한 아미노산 측면 사슬의 다른 적당한 반응 그룹을 통하여). 펩티드 구조와 공유 결합된 변형 그룹은 당업계에 잘 알려진 아미드, 알킬아미노, 카바메이트 또는 우레아 결합을 포함하는 화학 구조를 결합하는 방법 및 수단에 의하여 부착될 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 RNA(plus 및 minus 가닥) 및 cDNA, 게놈 DNA(genomic DNA) 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA를 포함하는 DNA를 포함한다. 상기 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥이라면, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 자연적으로 생산되는 또는 비 자연적으로 생산되는 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 포함하는 두개 이상의 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬일 수 있다. "RNA"는 두개 이상의 자연적으로 생산되는 또는 변형되는 리보뉴클레오티드가 공유 결합된 서열을 의미한다. 이러한 용어에 포함되는 변형된 RNA의 하나의 예로 Phosphorothioate RNA가 있다. "DNA"는 두개 이상의 자연적으로 생산되는 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드가 공유 결합한 서열을 의미한다. "cDNA"는 RNA-의존 DNA 합성효소(역전사 효소)에 의하여 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 복사 DNA를 의미한다. 그러므로, "cDNA 클론"은 관심 RNA 분자에 상보적인 복제 DNA 서열을 의미하며, 클로닝 벡터에 수반한다. "상보적"은 두개의 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)은 왓슨-클릭 염기쌍을 형성하여 두 개의 핵산 사이의 이중-가닥 구역을 생성하는 충분한 뉴클레오티드 숫자를 포함하는 두 개의 핵산에 의하여 정의된다. 그러므로, DNA 또는 RNA의 하나의 가닥의 아데닌은 다른 상보적인 DNA 가닥의 티민 또는 다른 상보적인 RNA 가닥의 우라실과 쌍을 이룬다. 하나의 핵산 분자 안에서 각각의 뉴클레오티드는 이중나선을 형성하기 위하여, 반대편의 상보적인 가닥의 뉴클레오티드와 맞는(matched) 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 필요는 없다는 것은 잘 이해될 것이다. 높은 가혹한 조건에서 한 핵산분자가 다른 핵산분자와 혼성화된다면, 한 핵산분자는 다른 핵산분자에 상보적이다. 본 발명에 따른 핵산분자는 양쪽의 상보적인 분자를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 다른 HPV 타입으로부터 두개 이상의 E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 다른 HPV 타입으로부터 세개 이상의 E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 다른 HPV 타입으로부터 네개 이상의 E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 또는 HPV82와 같은 다른 HPV 타입으로부터 다섯개 이상의 E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, HPV16, HPV18, HPV31, HPV45, 및 HPV52와 같은 다른 HPV 타입으로부터 다섯개의 E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발병에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1 내지 15의 두개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발병에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1 내지 15의 세개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발병에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1 내지 15의 네개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발병에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1 내지 15의 다섯개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 16 또는 17의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 18 내지 32의 두개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 18 내지 32의 세개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 18 내지 32의 네개 이상의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 18 내지 22의 모든 다섯개의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 화합물은 이에 제한되지 않지만, 서열번호 33 또는 34의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
"실질적으로 동일한(substantially identical)"은 단지 하나 이상의 보존적인 치환(conservative substitutions) 또는 여기서 기술한 바와 같이, 핵산 분자에 의하여 코딩된 또는 아미노산 서열에 의하여 발현된 폴리펩티드의 T-세포 인식 및/ 또는 HLA 결합을 실질적으로 감소시키거나 파괴하지 않는 서열 위치에 하나 이상의 아미노산의 비 보전적 치환, 결실, 또는 삽입으로 참조서열과 달라진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, Align program(Myers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17) 또는 FASTA를 이용하여, 이러한 서열들을 비교에 사용되는 서열들과 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준으로 최적으로 배열한 경우, 50% 부터 90%, 또는 일반적으로 적어도 50%, 55% 또는 60% 또는 적어도 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 만큼 동등한 어떠한 값일 수 있다. 폴리펩티드를 위한 비교서열의 길이는 적어도 2, 5, 10 또는 15 아미노산 또는 적어도 20, 25 또는 30 아미노산일 수 있다. 다른 실시예에서, 비교서열의 길이는 적어도 35, 40 또는 50 아미노산, 또는 60, 80 또는 100 아미노산 이상일 수 있다. 핵산분자를 위한 비교서열의 길이는 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25 뉴클레오티드,또는 적어도 30, 40, 또는 50 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시예에서, 비교서열의 길이는 적어도 60, 70, 80 또는 90 뉴클레오티드, 또는 100, 200 또는 500 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 서열의 동일성은 공중에게 이용가능한 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, 또는 the National Library of Medicine에서 이용가능한 BLAST 소프트웨어, 또는 본 명세서에서 기술된 것)를 이용하여 쉽게 분석할 수 있다. 유용한 소프트웨어의 예로써 프로그램 Pile-up 및 pretty Box를 포함한다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 치환, 및 다른 변형에 대하여 유사 정도를 부여함으로써, 유사한 서열을 맞춘다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 높은 가혹한 조건에서 두 개의 핵산 서열이 혼성화된다면 상기 핵산 서열들은 "실질적으로 동일할" 수 있다. 다른 실시예에서, 높은 가혹한 조건은, 예를 들어, 65℃의 완충액(0.5 M NaHP04, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 및 1 % BSA (fraction V))에서 또는 42℃의 완충액(48% 포름아미드 4.8x SSC, 0.2 M Tris-Cl, pH 7.6, 1x Denhardt's solution, 10% 덱스트란 설페이트, 및 0.1 % SDS)에서 적어도 500개의 뉴클레오티드의 DNA 프로브를 이용하는 경우 일어나는 혼성화와 견줄 수 있는 혼성화를 일어나게 하는 조건을 의미한다. 혼성화는 대략 20 내지 30분 또는 대략 2시간 내지 6시간 또는 대략 10시간 내지 15시간, 또는 24시간 이상의 기간 동안 수행될 수 있다. 또한, 높은 가혹한 혼성화는 PCR, DAN 서열분석, 단일 가닥 형태의 다형성 분석(single strand conformational polymorphsim analysis), 및 인시츄 혼성화(in situ hybrization)와 같은 분자생물학자에 의하여 일반적으로 반복수행되는 수많은 방법의 성공을 위하여 신뢰될 수 있다. 노던 혼성화 및 서던 혼성화와 달리 이러한 기술들은 일반적으로 비교적 짧은 프로브에 의해 수행한다(예를 들어, 일반적으로 PCR 또는 서열분석을 위한 대략 16 뉴클레오티드 또는 이보다 더욱 긴 서열 및 인 시츄 혼성화를 위한 대략 40 뉴클레오티드 또는 이보다 긴 서열). 이러한 기술들에 사용되는 높은 가혹한 조건은 분자 생물학 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wi1ey & Sons, New York, N.Y., 1998에서 상기 기술들의 예를 찾을 수 있으며, 이것은 본 명세서에 참조로 포함된다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 순수 HPV E7 항원 서열과 실질적으로 동일한 화합물을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물에 사용되는 서열은 서열번호 1 내지 34 또는 어떤 다른 HPV E7 서열에 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
다른 표현형의 HPV으로부터 적어도 두개 이상의 E7 항원이 단일서열에 존재하는 한, 개별적인 E7 항원 서열들은 본 발명에 따른 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 특정 순서로 존재할 수 있다는 것은 이해될 수 있다. 어떤 실시예에서, 다른 HPV 타입으로부터의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상의 다른 HPV E7 항체는 본 발명에 따른 화합물에서 사용될 수 있다.
예시적인 HPV E7 항원 서열 순서는 표 1에 나타난 것을 포함할 수 있다.
[표 1]
5 HPV 타입으로부터 E7 서열의 예시적인 순열(permutation)
다른 실시예에서, E7 항원 서열은 "자연적으로 생산되는" 또는 "순수한" 것일 수 있다(예를 들어, 인공적으로 변형된 것보다는 천연 자원(natural source)으로부터 동정된 것임). 이러한 자원들은 이에 제한되지 않지만, 감염된 대상 또는 다른 자원으로부터 얻은 생물학적 시료(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 정액, 점액, 오줌, 타액(oral), 질액, 자궁경부 액(cervical fluids), 부인과적 시료 (gynecological sample), 생체 시료(biopsies) 등)를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 화합물은 여기에서 기술된 특정 HPV 타입 또는 폴리펩티드로부터 E7 항원 서열의 특정 위치를 결실시키거나, 다른 보존 아미노산 잔기( 예를 들어, 비슷한 물리적, 생물학적, 또는 화학적 성질을 갖는 잔기)로 치환하거나, 상기 잔기를 도입함으로써 제조할 수 있다. 그리고, 예를 들어 여기에서 기술된 또는 당업계에 잘 알려진 CD8+T 세포 반응을 일으키는 능력을 갖는 화합물을 스크리닝함으로써 화합물을 제조할 수 있다. 어떤 실시예에서, 실질적으로 감소된 T 세포 인식 및/또는 HLA 결합을 보이지 않는 순수 E7 항원 단편은 본 발명의 범위 안에 포함할 수 있다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "보존된 아미노산 치환(conserved amino acid substitutions)"은 펩티드의 주어진 위치에서 한 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하는 경우 관련된 기능의 실질적인 손실 없이 치환이 이루어지는 것을 말한다. 이러한 변화 이루기 위하여, 예를 들어, 유사 아미노산 잔기의 치환은 크기, 전하, 친수성, 소수성, 및 이와 유사한 것들과 같은 측면-사슬 치환 (side-chain substituents)의 비교 유사성에 근거하여 이루어질 수 있다. 일반적으로 수행되는 실험에 의하여, 상기 치환이 펩티드의 기능에 주는 효과를 평가할 수 있다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어 "아미노산"은 자연적으로 생산되는 단백질에서 일반적으로 발견되는 L-아미노산, D-아미노산 및 이러한 아미노산이 변형되었을 경우의 아미노산을 의미한다.
따라서, 본 발명의 아미노산은, 예를 들어, 2-아미노아디프산(2-Aminoadipic acid); 3-아미노아디프산(3-Aminoadipic acid); 베타-알라닌(beta-Alanine); 베타-아미노프로피온산(beta-Aminopropionic acid); 2-아미노부티르산(2-Aminobutyric acid); 4-아미노부티르산(4-Aminobutyric acid); 피페리딘산(piperidinic acid); 6-아미노카프로산(6-Aminocaproic acid); 2-아미노헵탄산(2-Aminoheptanoic acid); 2-아미노이소부티르산(2-Aminoisobutyric acid); 3-아미노이소부티르산(3-Aminoisobutyric acid); 2-아미노피멜산(2-Aminopimelic acid); 2,4 디아미노부티르산(2,4 Diaminobutyric acid); 데스모신(Desmosine); 2,2'-디아미노피멜산(2,2'-Diaminopimelic acid); 2,3-디아미노프로피온산(2,3-Diaminopropionic acid); N-에틸글리신(N-Ethylglycine); N-에틸아스파라진(N-Ethylasparagine); 히드록시리신(Hydroxylysine); 알로-히드록시리신(allo-Hydroxylysine); 3-히드록시프롤린(3-Hydroxyproline); 4-히드록시프롤린(4-Hydroxyproline); 이소데스모신 (Isodesmosine); 알로-이소류신(al1o-Isoleucine); N-메틸글리신(N-Methylglycine); 사코신(sarcosine); N-메틸이소류신(N-Methylisoleucine); 6-N-메틸리신(6-N-methyllysine); N-메틸발린(N-Methylvaline); 노발린(Norvaline); 노류신(Norleucine); 및 오르니틴(Ornithine)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 보존된 아미노산 치환은 유사한 친수성 값(예를 들어, 플러스 또는 한 아미노산 잔기가 마이너스 2.0, 또는 플러스 또는 마이너스 1.5, 또는 플러스 또는 마이너스 1.0, 또는 플러스 또는 마이너스 0.5)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환에 의하여 이루어질 수 있고, 하기는 Tyr(-1.3) 또는 Pro(-1.6) 처럼 아미노산 잔기에 지정된 대략 -1.6의 소수성 지표(hydropathic index)를 갖는 아미노산일 수 있다(본원 명세서에 참조에 의하여 결합된 미국특허번호 4,554,101에서 기술된 것): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser(+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); lle (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); 및 Trp (-3.4).
다른 실시예에서, 보존 아미노산 치환은 유사한 소수성 지표(예를 들어, 플러스 또는 한 아미노산 잔기가 마이너스 2.0, 또는 플러스 또는 마이너스 1.5, 또는 플러스 또는 마이너스 1.0, 또는 플러스 또는 마이너스 0.5)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 실시예에서, 각각의 아미노산 잔기는 하기와 같이 소수성 및 전하 특성에 근거한 소수성 지표를 지정할 수 있다. I1e (+4.5); Val (=4.2); Leu(+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+ l.9); Ala (+ l.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); 및 Arg (-4.5).
다른 실시예에서, 보존 아미노산 치환은 공중이 이용가능한 유사 매트릭스 (73-79)의 족을 이용하여 이루어질 수 있다. PAM 매트릭스는 진화 모델로부터 근거한 숫자에 근거하고, Blosum 매트릭스는 서열을 배열하는 경우에 높게 보존된 블록에 근거한 숫자를 이용한다. PAM 또는 Blosum 매트릭스 중 어느 하나의 양수의 유사 점수(score)는 보존 아미노산 치환을 수행하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 보존 아미노산 치환은 한 아미노산을 같은 클래스의 다른 아미노산으로 치환함으로써 이루어질 수 있고, 아미노산 서열은 하기와 같이 비극성, 산성, 염기성, 중성 클래스로 나눌 수 있다: 비극성: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; 산성: Asp, Glu; 염기성: Lys, Arg, His; 중성: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
보존 아미노산 변경-아미노산을 L-아미노산의 보존 치환, 이에 상응하는 D-아미노산, 보존 D-아미노산, 또는 자연적으로 생산되나 비유전적으로 인코딩된 형태의 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 자연적으로 생산되나 비 유전적으로 인코딩된 아미노산은 베타-알라닌(beta-a1anine), 3-아미노프로피온산(3-aminopropionic acid), 2,3-디아미노 프로피온산(2,3-diamino propionic acid), 알파-아미노이소부티르산(alpha-aminoisobutyric acid), 4-아미노-부티르산(4-aminobutyric acid), N-메틸글리신(N-methylglycine), 사코신(sarcosine), 히드록시프롤린(hydroxyproline), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), t-부틸알라닌(t-butylalanine), t-부틸글리신(t-butylglycine), N-메틸이소류신(N-methylisoleucine)， 페닐글리신(phenylglycine), 시클로헥실알라닌 (cyclohexylalanine), 노류신(nor1eucine), 노발린(norvaline), 2-나프틸알라닌( 2-napthylalanine), 피리딜알라닌(pyridylalanine), 3-벤조티에닐 알라닌(3-benzothienyl alanine), 4-클로로페닐알라닌(4-chlorophenylalanine), 2-플루오로페닐알라닌(2-fluorophenyalanine), 3-플루오로페닐알라닌(3-fluorophenylalanine)，4-플루오로페알라닌(4-fluorophenylalanine), 페니실아민(penicillamine), 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산(1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylix acid), 베타-2-티에닐알라닌(beta-2-thienylalanine), 메티오닌 설폭시드(methionine sulfoxide), 호모아르기닌(homoarginine), N-아세틸리신(N-acetyllysine), 2-아미노 부티르산(2-amino butyric acid), 2-아마노 부티르산(2-amino butyric acid), 2,4-디아미노 부티르산(2,4-diamino butyric acid), p-아미노페닐알라닌(p-aminophenylalanine), N-메틸발린(N-methylvaline), 호모시스테인 (homocysteine), 호모세린(homoserine), 시스테인산(cysteic acid), 엡실론-아미노 헥사노익산(epsilon-amino hexanoic acid), 델타-아미노 발레르산(delta-amino valeric acid), 또는 2,3-디아미노부티르산(2,3-diaminobutyric acid)을 포함한다.
다른 실시예에서, 보존 아미노산 변경은 소수성 또는 친수성, 크기 또는 부피, 또는 전하를 고려한 변경을 포함한다. 아미노산은 일반적으로 아미노산 측면 사슬의 성질에 주요적으로 의존한 친수성 또는 친수성으로 특성화할 수 있다. Eisenberg et. al에서 표준화된 consensus hydrophobicity scale에 근거한 소수성 아미노산은 양수의 소수성을 보이고, 친수성의 아미노산 서열은 음수의 친수성을 보인다. 유전적으로 인코딩된 소수성 아미노산은 Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met 및 Trp을 포함하고, 유전적으로 인코딩된 친수성 아미노산은 Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser, 및 Lys을 포함한다. 비-유전적으로 인코딩된 친수성 아미노산은 t-부틸알라닌을 포함하고, 비-유전적으로 인코딩된 소수성 아미노산은 시트룰린 및 호모시스테인을 포함한다.
친수성 또는 소수성 아미노산은 추가적으로 이것들의 측면 사슬의 특성에 근거하여 나눌 수 있다. 예를 들어, 방향족 아미노산(aromatic amino acid)은 측면 사슬에 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 고리(heteroaromatic ring)를 포함하는 소수성의 아미노산이고, 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리에 하나 이상의 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -1, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등과 같은 치환기를 포함할 수 있다. 여기서, R은 독립적으로 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐, (C5-C20) 아릴, 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알카릴, 치환된 (C6-C26) 알카릴, 5-20 원 헤테로아릴， 치환된 5-20 원 헤테로아릴, 6-26 원 알크헤테로아릴(6-26 membered alkheteroaryl) 또는 치환된 6-26 원 알크헤테로아릴이다. 유전적으로 인코딩된 방향족 아미노산은 Phe, Tyr 및 Trp을 포함한다. 반면에 비-유전적으로 인코딩된 방향족 아미노산은 페닐글리신(phenylg1ycine), 2-나프틸알라닌(2-napthylalanine), 베타-2-티에닐알라닌(beta-2-thienylalanine), 1,2,3,4-테트라히로-이소퀴놀린-3-카르복실산 (1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylic acid), 4-클로로페닐알라닌(4-chlorophenylalanine), 2-플루오로페닐알라닌(2-fluorophenylalanine), 3-플루오로페닐알라닌(3-fluorophenylalanine), 및 4-플루오로페닐알라닌(4-fluorophenylalanine)을 포함한다.
비극성 아미노산은 생리적인 pH에서 전하를 띄지 않은 측면사슬을 갖는 소수성 아미노산이고, 상기 아미노산에서 두개의 원자에 의하여 통상적으로 공유된 전자쌍은 일반적으로 동등하게 각각의 두개의 원자에 잡혀있는 결합을 갖는다(예를 들어, 측면사슬은 극성이 아니다). 유전적으로 인코딩된 비극성 아미노산은 Gly, Leu, Val, Ile, Ala, 및 Met를 포함하고, 비-유전적으로 인코딩된 비극성 아미노산은 시클로헥실알라닌을 포함한다. 비극성 아미노산은 추가적으로 지방족의 아미노산을 포함하도록 나눌 수 있다. 상기 지방족의 아미노산은 지방족 탄화수소 측면 사슬을 갖는 소수성의 아미노산이다. 유전적으로 인코딩된 지방족의 아미노산은 Ala, Leu, Val, 및 Ile를 포함하고, 비-유전적으로 인코딩된 지방족의 아미노산은 노류신(norleucine)을 포함한다.
극성의 아미노산은 생리학적 pH에서 전화를 띄지 않는 측면사슬을 갖는 친수성의 아미노산이고, 상기 아미노산의 두 개의 원자에 의하여 통상적으로 공유된 전자쌍이 어느 한쪽의 원자에 더욱 가깝게 잡혀있다. 유전적으로 인코딩된 극성 아미노산은 Ser, Thr, Asn, 및 Gln을 포함하고, 비-유전적으로 인코딩된 극성 아미노산은 시트룰린, N-아세틸 리신, 및 메티오닌 설폭시드(methionine sulfoxide)를 포함한다.
산성 아미노산은 pKa 값이 7 이하인 측면 사슬을 갖은 친수성의 아미노산이다. 산성 아미노산은 일반적으로 수소이온의 손실로 인하여, 생리적인 pH에서 음전하의 측면사슬을 갖는다. 유전적으로 인코딩된 산성 아미노산은 Asp 및 Glu를 포함한다. 염기성 아미노산은 일반적으로 수산화 이온(hydronium ion)의 결합으로 인하여, 생리적인 pH에서 양전하의 측면사슬을 갖는다. 유전적으로 인코딩된 염기성 아미노산은 Arg, Lys, 및 His를 포함하고, 비-유전적으로 인코딩된 염기성 아미노산은 비-고리형 아미노산(non-cyclic amino acid)인 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 및 호모아르기닌을 포함한다.
따라서, 보존적 치환은 이에 제한되지는 않지만 하기와 같다:
[표 2]
상기의 분류가 절대적이지 않고, 아미노산은 하나 이상의 카테고리로 분류될 수 있음은 당업자에게 잘 이해될 수 있을 것이다. 또한, 아미노산은 알려진 성질 및 또는 특정된 방법에 근거한 화학적, 물리적, 생물학적 성질 및 방법(behaviour)또는 이미 동정된 아미노산과 비교에 근거하여 분류될 수 있다. 또한, 아미노산은 아미노산-유사 측면사슬을 갖는 이작용성 부분들(bifunctional moieties)를 포함할 수 있다.
또한, 보존적 변형은 예를 들어, 아미노산의 기능적 측면 그룹(side group)의 반응에 의하여 화학적으로 파생된 부분이 비-파생적인 부분을 대체하는 것을 포함한다. 그러므로, 이러한 대체는 자유 아미노 기가 아민 히드로클로라이드(amine hydrochlorides), p-툴루엔 설포닐 기(p-toluene sulfonyl groups), 카르보벤즈옥시 기(carbobenzoxy groups), t-5-부틸옥시카르보닐 기(t-5-butyloxycarbonyl groups), 클로로아세틸 기(chloroacetyl groups) 또는 포르밀 기(formyl group)로 유도된 화합물을 포함할 수 있다. 유사하게, 자유 카르복실 기는 염, 메틸, 에틸 에스테르 또는 에스테르 또는 하이드라지드(hydrazide)를 형성하도록 유도될 수 있고, 측면 사슬은 자유 히드록시 기를 생성을 위한 O-아실(O-acyl) 또는 O-알킬 유도체가 형성되도록, 또는 히스티딘의 이미다졸 질소(imidazole nitrogen)를 위한 N-임-벤질히스티딘(N-im-benzylhistidine)을 형성되도록 유도시킬 수 있다. 또한, 펩티드 유사체는 예를 들어, 메틸화에 의하여; 에틸아민, 에탄올아민, 또는 에틸렌 디아민과 같은 알킬아민, 아미노산 측면 사슬의 아실화 또는 메틸화에 의한 C-말단 아미노산의 아미드화(amidation)에 의하여; 화학적으로 변경된 아미노산을 포함할 수 있다(리신의 엡실론 디아민 기의 아실화와 같은). 또한, 펩티드 유사체는 펩티드에서의 아미드 결합을 치환된 아미드(예를 들어, 화학식 -C(O)-NR의 그룹, 여기서 R은 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐) 또는 아미드 결합의 이소스테르(isostere; 예를 들어, -CH2NH-, -CH2S,- CH2CH2-, -CH=CH=(cis 및 trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2-, 또는 -CH2SO-)로 치환을 포함한다.
본 발명의 화합물은 예를 들어, 중합 또는 접합(conjugation)에 의하여 공유 결합하여 동형중합체(homopolymer) 또는 이형중합체(heteropolymer)를 형성할 수 있다. 통상적으로 생리적인 조건에서 전하를 띄지 않은 아미노산과 같은 작은 분자를 링커와 스패이서(spacer)로 사용할 수 있다. 결합은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 펩티드 말단에 더해질 수 있고, 다수의 펩티드는 조절된 산화반응에 의하여 공유 결합할 수 있다. 대안적으로, 디설파이드/아미드를 형성하는 물질 또는 티오에테르(thioether)/아미드 형성물질과 같은 헤테로이작용성 물질(heterobifunctional agents)이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 면역반응을 조절할 수 있는 다른 화합물과 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 고리 부분을 갖게 하여 구속할 수 있다(constrain).
폴리펩티드, 펩티드 또는 펩티드 유사체는 표준 화학 기술, 예를 들어, 액체상 또는 고체상 합성 방법론(solid phase synthesis methodology)을 이용한 자동화된 합성에 의하여 합성될 수 있다. 자동화된 펩티드 합성은 상업적으로 이용가능하고, 당업계에 잘 알려진 기술을 이용할 수 있다. 또한, 폴리펩티드, 펩티드 및 펩티드 유사체는 예를 들어, Sambrook, et al.(81) 또는 Ausuber et al(82)에 기술된 것과 같은 표준 방법을 이용한 DNA 재조합 기술을 이용한 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다.
어떤 실시예에서, 핵산분자는 사용가능하게 결합될 수 있다. "사용가능하게 결합된(operably linked)"은 유전자 및 조절서열이 적합한 분자(예를 들어, 전사 활성 단백질)가 조절 서열에 부착하는 경우, 유전자가 발현되도록 결합된 것을 의미한다. 이러한 사용가능하게 결합된 서열은 발현을 위한 숙주세포에 형질전환 또는 형질도입(transfected)될 수 있는 발현 구조체 또는 벡터 형태일 수 있다. pET15b(앰피실린 저항성) 또는 pET24a(카나마이신 저항성)과 같은 적당한 벡터가 사용될 수 있다.
용어 "재조합"은 어떤 것이 재결합되어서, 핵산 구조체에 관한 재조합이 이루어진 경우, 상기 용어는 분자생물학적 기술에 의하여 서로 결합되거나, 생산되는 핵산서열로 구성된 서열을 의미한다. 용어 "재조합"이 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 이루어진 경우, 상기 용어는 분자생물학적 기술에 의하여 만들어진 재조합 핵산 구조체를 이용하여 발현된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 재조합 핵산 구조체는 결합되거나 결합되도록 조작될 뉴클레오티드 서열이 자연상태에서는 결합되지 않았거나 다른 부위에 부착된 핵산 서열에 결합된 핵산 서열을 포함한다. 그러므로 "재조합"으로써 핵산구조체를 언급하는 것은 유전공학을 이용한 핵산분자의 인간의 관여에 의한 조작을 의미한다. 예를 들어, 재조합 핵산 구조체는 형질전환에 의하여 숙주세포에 도입될 수 있다. 이러한 재조합 핵산 구조체는 같은 숙주 세포 종 또는 다른 숙주세포 종으로부터 유래하는 서열일 수 있고, 상기 핵산 구조체를 분리하여 숙주 종의 세포로 재도입할 수 있다. 재조합 핵산 구조체 서열은 숙주 세포 유전체에 통합될 수 있고, 그 결과, 숙주세포의 원래의 형질전환 또는 형질전환에 이어지는 재조합 및/또는 수선이 일어날 수 있다.
유용한 것으로 밝혀진 화합물을 HPV 감염에 대한 TC1 모델 또는 다른 동물모델을 이용하여 분석할 수 있다.
약학적 및 수의학적 조성물, 복용량, 및 투여
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 리포좀, 면역보강제, 또는 예를 들어 인간, 소, 양 등의 포유동물에게 투여하기에 적합한 형태의 약학적으로 허용가능한 담체와 같은 다른 담체의 존재 하에 다른 화합물 (예를 들어, 핵산 분자, 저 분자, 펩티드, 또는 펩티드 유사체)과 조합하여 제공할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"는 어떤 또는 모든 용매, 확산 용액, 코팅, 항박테리아 및 항곰팡이 물질, 등장성 및 흡수 억제 제제, 및 생리적으로 적합한 물질을 포함한다. 일 실시예에서, 담체는 비경구 투여에 적합하였다. 그렇지 않으면, 담체는 정맥, 복강 내, 근육 내, 설하(sublingual) 또는 경구 투여에 적합할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균된 액체 용액 또는 확산 및 멸균된 주사가능한 용액 또는 확산 용액의 즉석의 준비를 위한 멸균된 가루를 포함한다. 이러한 약학적으로 활성화된 기질을 위한 배지 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 어느 상업적인 배지 또는 물질이 활성 화합물과 비적합한 것을 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에 제품의 사용이 고려된다. 추가적인 활성 화합물 또한 조성물 내에 통합될 수 있다.
종래의 약사실무기준(pharmaceutical practice)은 적합한 제형 또는 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질병의 전 증상으로 고통받는 피험자에게 화합물을 투여하기 위한 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 투여의 어떤 적절한 경로, 예를 들어, 비경구, 정맥, 피하, 근육 내, 두개 내, 안구 내, 심실 내, 낭 내, 척수 내, 척수강 내, 복강 내, 비강 내, 에어로졸, 국부 또는 경구 투여가 사용될 수 있다. 치료 제형은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다; 경구투여를 위해, 제형은 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다; 또한 비강 내 투여를 위해, 분말, 점비액 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
제형을 제조하기 위한 당업계에서 잘 알려진 방법은 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (83)에서 확인하였다. 비경구 투여를 위한 제형은 예를 들어, 부형제, 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 유래의 오일 또는 수소화 나프탈렌과 같은 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 화합물의 방출을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-바이닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 주입식 삽입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입을 위한 제형은 예를 들어, 락토오스와 같은 부형제를 포함할 수 있고, 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 포함하는 수용액, 또는 점비액 형태의 투여를 위한 유성 용액 또는 겔 형태를 포함할 수 있다. 일반적으로, 화합물은 HPV 감염과 관련된 질병을 멈추거나 느리게 하기 위해 또는 HPV 감염을 치료하기 위해, 장애에 따라 피험자에 적절한 양으로 투여된다.
백신 제형의 경우, 본 발명의 화합물의 유효량은 단독으로 또는 다른 화합물, 예를 들어 프로이트 불완전 면역보강제(Freund's incomplete adjuvant), 디메틸디옥타데실암모늄 히드록사이드 또는 알루미늄 히드록사이드와 같은 면역학적 면역보강제와의 조합으로 제공될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 TLR3 작용제 (예를 들어, poly(I:C) 및 이의 유도체, polyA:U 및 이의 유도체, 합성 RNA 분자, 자연적으로 발생한 RNA 분자, 이중-나선 RNAs, 미생물의 핵산 등) 또는 TLR9 작용제 (예를 들어, CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드, 미생물의 핵산 등)와 같은 TLR (Toll-like receptor) 작용제, 인터페론-알파, 4-1BB 수용체의 작용제, CD40 수용체의 작용제 또는 항-CD40 항체로부터 선택된 면역보강제와 함께 제공될 수 있다.
또한, 화합물은 면역원성(immunogenicity)을 향상시키기 위해 담체 또는 예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 다른 물질과 결합할 수 있다. 일 실시예에서, 화합물은 칼테티쿨린, HSP70 (Mycobacterium tuberculosis heat shock protein), 유비퀴틴, 세균 독소, 사이토카인 (인터루킨과 같은), 이미다조퀴몰린(imidazoquimolines) 등과 함께 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물은 선택적으로 담체, 및/또는 면역증강제와 함께, 사용을 위한 설명서와 함께 키트로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물의 "유효량(effective amount)"은 치료학적 유효량, 면역학적 유효량 또는 예방학적 유효량을 포함한다 "치료학적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 효과적인, HPV 감염 또는 상기 감염과 관련된 질병의 치료와 같은 치료적 결과를 달성하기 위해 요구되는 필수적인 시간의 복용량 및 기간을 의미한다. 치료의 결과는 예를 들어 HPV 바이러스혈증의 감소, 바이러스 유전자 발현의 억제, HPV 감염과 관련된 병리학적인 발달의 지연, 면역 시스템의 증강, 또는 치료 효과를 측정할 수 있는 어떤 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 화합물의 치료적 유효량은 질병 단계, 나이, 성별, 및 개인의 체중, 및 개인에서 원하는 반응을 끌어낼 수 있는 화합물의 능력과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 투여요법(dosage regimens)은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 화합물의 어떠한 독성 또는 해로운 효과가 치료상으로 유익한 효과에 의해 능가되는 양이다. "면역학적 유효량(immunogenically effective amount)"은 효과적인, 면역 반응의 자극 또는 도출, T 세포의 CD8+ 반응과 같은 면역 결과를 달성하기 위해 요구되는, 필수적인 시간의 복용량 및 기간을 의미한다. 일 실시예에서, "면역 반응의 자극(stimulation of an immune response)" 또는 "면역 반응을 자극(stimulating an immune response)"은 T 세포 CD 8+ 반응과 같은, 측정된 면역 반응에서의 대조군 또는 참고 샘플 또는 화합물과 비교하였을 때, 약 5% 내지 약 95% 사이, 또는 약 10% 내지 약 90% 사이, 또는 약 30% 내지 약 60% 사이, 또는 100 % 이상의 어느 값의 증가를 의미한다. 또 다른 실시예에서, "면역 반응의 자극" 또는 "면역 반응을 자극"은 T 세포 CD 8+ 반응과 같은, 측정된 면역 반응에서의 대조군 또는 참고 샘플 또는 화합물과 비교하였을 때, 약 2배 내지 약 1000배 사이, 또는 약 10배 내지 500배 사이, 또는 약 30배 내지 약 100배 사이, 또는 1000 배 이상의 증가된 어느 값의 증가를 의미한다. "예방학적 유효량(prophylactically effective amount)"은 효과적인, HPV 감염과 관련된 질병의 시작의 방지와 같은 예방 결과를 달성하기 위해 요구되는 필수적인 시간의 복용량 및 기간을 의미한다. 일반적으로, 예방학적인 농도는 먼저 또는 질병의 초기 단계에서 사용되고, 그 결과 예방학적 유효량은 치료학적 유효량에 비해 적을 수 있다. 화합물의 효과적인 양의 적절한 범위는 예를 들어, 1 nM-O.lM, 0.1 nM-0.05M, 0.05 nΜ-15μΜ 또는 0.01 nΜ-10μΜ로부터 선택되는 어떤 정수일 수 있다.
복용량 값은 완화되어야 하는 질병의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 어떤 특정한 피험자에게는, 특별한 복용량 요법이 시간이 지나면 개인의 요구 및 조성물의 투여를 관리하거나 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 조절될 수 있다. 여기에서 복용량 범위는 단지 예시적이며, 의료 실무자들에 의해 선택되는 복용량 범위를 제한하지 않는다. 조성물에서 유효 성분의 양은 질병 상태, 나이, 성별 및 개인의 체중 등과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 투여요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회 용량 (bouls)이 투여될 경우, 여러 번 나눈 농도가 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나 또는 농도가 치료 상황의 긴급 사태에 의해 비례해서 감소 또는 증가될 수 있다. 그것은 투여량 단위 형태에서 투여의 용이성 및 복용량의 균일성을 위한 비경구 조성물의 제형화에 바람직할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, TLR 작용제 또는 다른 면역보강제와의 조합으로 이루어진, 향상된 CD8+ 세포 반응을 이끌어내기 위해 "클러스터" 투여요법으로 제공될 수 있다. "클러스터" 투여요법이란 시간의 짧은 기간 동안, 다시 말해 약 14일 미만의 기간 동안 조성물의 투여를 의미하는 것으로, 예를 들어, 약 1일 내지 약 4, 5, 6, 7 또는 8일이다. 일 실시예에서, 클러스터 투여요법은 시간의 짧은 기간 동안, 다시 말해 약 14일 미만의 기간 동안, 조성물을 수회 매일 투여하는 것을 포함하며, 예를 들어, 약 1일 내지 약 4, 5, 6, 7 또는 8일이다.
원하는 경우, 본 발명에 따른 화합물로의 치료는 HPV 감염 또는 상기 감염과 관련된 질병을 위한 다른 전통적이고 현존하는 치료법과 조합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 화합물은 적절한 방사선 요법, 화학 요법 또는 수술 (예를 들어, LEEP)과 조합하여 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 만성적으로 또는 간헐적으로 제공될 수 있다. "만성적" 투여는 오랜 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)을 유지하기 위해서 급성 상태가 아닌 계속 상태에서의 제제의 투여를 의미한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속하여 완료된 것이 아니라, 자연적으로 순환되는 치료이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 상당한 독성을 야기하지 않고 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 독성은 정형화된 기법, 예를 들어, 세포 배양 또는 동물 모델에서의 실험을 이용하고, 예를 들어, LD50 (모집군의 50%가 사망하는 농도) 및 LD 100 (모집군의 100%가 사망하는 농도) 사이의 값과 같은, 치료 지수를 결정하는 것을 통해 결정될 수 있다. 그러나 심각한 질병 상태와 같은 어떠한 상황에서, 조성물의 상당한 과잉 투여는 필요할 수 있다.
다음 설명을 통해, 특별한 세부사항은 더욱 발명의 철저한 이해를 제공하기 위해 명시되어 있다. 그러나, 발명은 이러한 세부사항 없이 실행될 수 있다. 경우에 따라, 잘 알려진 요소가 표시되지 않거나 발명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 방지하기 위해 상세하게 기술하였다. 따라서, 발명의 상세한 설명 및 도면은 한정하는 의미보다는 일 실시예인 것으로 간주해야 한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더 설명될 것이다.
실시예 1: 펜타릭스 단백질의 제조 및 정제
HPV 16, 18, 31, 45, 및 52주의 E7 원종양단백질(oncoprotein)들은 E.coli에서 전장 재조합 단백질(이하 "Pentarix")로 제조되었다. 한 연구에 따르면, 아미노 말단의 6xHis 친화성 태그를 가진 HPV 균주 16, 18, 31, 45, 및 52로부터 얻은 완전한 E7 단백질, 및 트롬빈 분절부위(thrombin cleavage site)를 포함하는 하나의 인접한 DNA는 합성 DNA 구조체(construct)로 제조되었다(도 1B). 다중-유전자 서열은 발현벡터 pET17 및 pET24a(Invitrogen) 내로 차례로 클로닝되었고, 6xHis 친화성 태그를 가진 전장단백질(펜타릭스)은 E.coli 유전형 BL21(DE3) pLysS에서 발현되었다.
간략하게, pET17 구조체의 경우 암피실린(100μg/ml) 및 클로람페니콜(34μg/ml)을 포함하고, pET24a 구조체의 경우 카나마이신(34μg/ml) 및 클로람페니콜 (34μg/ml)을 포함하는 5ml의 LB 배양액에 단일 콜로니의 재조합 E.coli가 접종되었고, 하룻밤 동안 포화상태까지 배양되었다. 다음날 아침, 상기 5ml의 LB 배양액은 pET17 구조체의 경우 암피실린(100μg/ml) 및 클로람페니콜(34μg/ml)을 포함하고, pET24a 구조체의 경우 카나마이신(34μg/ml) 및 클로람페니콜(34μg/ml)을 포함하는 1000ml의 LB 배양액에 접종되었다. 1000ml의 배양액에서 세균을 배양한 결과 OD600값이 0.2 내지 0.4 사이에 도달하면, IPTG를 배양액에 첨가하여 최종 농도가 2mM이 되도록 조절하고, 2 내지 3시간 동안 더 배양하여 재조합 단백질을 발현시켰다. 세균은 연속적으로 원심분리하여 펠렛 형태로 만든 후, 30ml의 용해완충액 (lysis buffer, 20mM의 인산나트륨, pH 7.4, 500mM의 염화나트륨, 10mM의 이미다졸, 6M의 요소, 1mM의 DTT)에 재분산시켰다. 세균은 2회의 연속적인 동결 및 용융을 거친 후, 4회의 연속적인 초음파처리(회당 30초)를 하여 용균시켰다. 잔사 (debris)와 불용성 단백질은 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 제거하고, 가용성의 용해물(lysate) 용액을 제조하였다. 6x 친화성 태그를 가진 펜타릭스 단백질은 가용성 용해물을 AKTA 칼럼 크로마토그래피 시스템과 연관된 친화성 칼럼(HisTrap HP, GE Healthcare)에 통과시켜 정제하였다. 용해완충액(lysis buffer)으로 광범위하게 세척한 후, 6xHis 친화성 태그를 가진 펜타릭스 단백질은 500mM의 이미다졸을 포함하는 용해완충액을 이용하여 칼럼으로부터 용출시켰다. 6xHis 친화성 태그를 가진 펜타릭스 단백질을 포함하는 용출분획은 저장된 후, 4차례의 조직배양 등급의 인산완충용액으로 투석시켜 최종 펜타릭스 단백질 용액을 제조하였다. 단백질의 발현 및 정제는 다양한 과정과 SDS-PAGE 상에서 최종 분획을 수행하고, 쿠마시 블루 염색 또는 항-6x His tag 항체(ABM), 또는 항-HPV 16E7 항체 (Invitrogen)로 단백질을 시각화함으로써 모니터링하였다(도 1C). 정제된 단백질은 PBS에 완전히 용해었으며, 예상되는 분자량인 59,037 Da에 맞게 SDS-PAGE 겔 상에서 이동하였다(도 1C).
실시예 2: 외인성 단백질 항원에 대한 CD8 반응
전체 외인성 OVA 단백질 및 TLR3 작용제 폴리(I:C), 또는 폴리IC/LC를 이용한 면역유도에 반응하여 OVA257-264-특이적 CD8+ T 세포 반응을 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 면역유도된 적 없는(Naive) C57BL/6 마우스는 전체 OVA 단백질(500μg)만으로, 또는 OVA 단백질 및 폴리(I:C)(10μg) 또는 폴리IC/LC(10μg/ml)과 함께 면역유도되었다(각 조건당 2마리씩). 면역유도 7일 후, 면역유도된 마우스를 안락사하여, 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264(SIINFEKL)-특이적인 CD8+T 세포의 숫자는 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. 결과는 배양액 단독, SIINFEKL 펩티드(10μg/ml) 포함, 또는 관계없는 H2Db-결합 펩티드(10μg/ml)를 포함한 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 상기 결과는 폴리(I:C) 및 폴리IC/LC는 생체 내(in vivo)에서 비교할만한 면역보강제 활성을 가짐을 의미한다.(도 2A)
또 다른 연구에서는, 면역유도된 적 없는 C57BL/6 마우스를 상기 제시된 량의 전체, 가용성 OVA 단백질 및 폴리(I:C)로 면역유도하였다. 면역유도 7일 후, 면역유도된 마우스를 안락사하여, 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하였다. 개별 동물에서 얻은 비장세포(웰 당 3x105개, 조건당 3웰)는 배양액 단독, 또는 SIINFEKL 펩티드와 함께 하룻밤 자극하였고, 결과는 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수(+/- 코호트 표준편차)로 보고되었다.
실시예 3: 투여요법
장기 또는 단기의 간격으로 상동성 있는 면역원으로 프라임-부스팅하는 면역유도에 반응하여 발생하는 OVA257-264-특이적 CD8+T 세포 반응은 하기와 같이 측정되었다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스를 전체 OVA 단백질(100μg) 및 폴리 (I:C)(10μg)로 -7일, -21일, 또는 -7일 및 -21일에 면역유도시키고 0일에 안락사시켰다(각 조건당 2마리씩). 면역유도된 마우스의 비장세포 벌크(bulk) 내의 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자는 IFN-γ ELISPOT으로 정량하였다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스를 폴리(I:C)(10μg)로 혼합된 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg)을 제시된 수의 매일의 연속적인 투여로 면역유도하였다(각 조건당 3마리씩). 추가적 그룹의 마우스는 보통의 매일 사용되는 양의 4배와 동량(즉, 400μg의 OVA 단백질 및 40μg의 폴리(I:C))의 단일투여로 면역유도되었다. 첫 번째 면역유도로부터 7일 후 마우스를 안락사하고, 비장세포 벌크를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여 OVA257-264-특이적인 CD8+T 세포의 숫자를 정량하였다. 도 3A와 도 3B의 결과는 배양액, 또는 SIINFEKL 펩티드(10μg/ml)포함 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 도 3c에 제시된 바와 같이, 1회 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질 (100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 매일 투여하여 면역유도되었다. 4회 연속으로 매일 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)를 투여한 판넬 C의 마우스는 첫번째 면역유도 후 47일부터 4회 연속 매일 투여하여 재면역유도되었다. 말초혈액은, 면역유도 후 제시된 날에 연속적으로 개별 마우스의 복재정맥으로부터 채혈하였다. 말초혈액의 적혈구는 용혈시켰고, 림프구는 FITC-결합 항-CD8 항체 및 PE-결합 H-2Kb/OVA257-264 사량체(tetramer)로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. 도 3C 및 D에 나타난 결과들은 CD8+ 림프구에 의해 좌우되고, 대표적인 단일 동물로부터 시간에 따른 항원-특이적 T 세포 반응의 전개를 정확하게 모니터링 할 수 있도록 한다. 두 번째 백신접종 후, OVA-특이적 CD+ T 세포는 첫 번째 면역유도 후 성취된 것보다 훨씬 높은 수준으로 증가하였고, 두 번째 면역유도 7일 이내에 말초 CD8+ T 세포는 52%에 이르렀다(도 3d).
따라서, 시간적으로 후순위에 일어난 이차 반응은 클러스터 백신에 의한 일차 반응보다 상당히 더 강력하게 나타났다.
또 다른 연구에서는, 모델 항원 OVA에서 관찰된 것처럼 HPV16 E7 단백질 및 폴리(I:C)의 4회 투여는, HPV E7 단백질 단독 투여에 비하여 강력한 CD8 면역 반응을 나타내었다(도 3e).
또 다른 연구에서는, 도 4에 나타낸 바와 같이, 0일에 OVA를 발현하는 EG7 종양세포를 이식한 C57BL/6 마우스에 아무 처리하지 않거나(좌측 상단), 폴리(I:C) (10μg)로 1회 처리하거나(우측 상단), 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 1회 처리하거나(좌측 하단), 또는 4회 연속으로 전체, 가용성 OVA 단백질(100μg) 및 폴리(I:C)(10μg)로 매일 처리하였다. 각 그룹의 치료시점에서의 평균 종양의 부피는 224mm3 (폴리(I:C) 만 처리), 194mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 1회 처리), 344mm3 (OVA 및 폴리(I:C) 4회 처리)였다. 연속적인 매일 면역유도의 유용한 효과를 예증하기 위하여 마지막 코호트 마우스는 의도적으로 종양 크기가 더 커졌을 때 처리되었다.
실시예 4: 펜타릭스 단백질의 일회 또는 수회 투여를 통한 면역유도
면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 아무 처리되지 않거나, 10 μg의 폴리(I:C)와 혼합된 100μg의 재조합 펜타릭스 단백질로 처리되거나(도 5A), 또는 TLR9 작용제 CpG-2395(올리고 #2395, Invivogen)와 함께, 또는 CpG 올리고 단독으로만 처리되었다(도 6A). 면역유도 7일 후, 마우스를 안락사시키고, 비장을 적출하였다. 적출된 비장은 5ml 주사기를 사용하여 70μM의 여과기를 통과시켜 잘게 갈아, 10ml의 cRPMI(RPMI 1640, 10% FCS, 2mM L-글루타민, 50μM 2-머캅토에탄올, 10mM HEPES, 및 10mM 피루브산 나트륨) 용액에 비장세포의 단일 세포 분산액을 제조하였다. ELISPOT 플레이트(MSIP, Millipore)는 10μg/ml의 항-IFN-γ 캡쳐 항체(AN18-Mabtech)로 하룻밤 미리 코팅한 다음, cRPMI로 37℃에서 2시간 동안 블록(block)하였다. 비장세포(웰 당 3x105 개, 각 조건 당 웰 3개)는 어떤 자극물질도 없이 배양액만으로, 또는 10μg/ml의 H-2Db 제한된 HPV16의 E749-57 펩티드를 포함하거나, 또는 관계없는 H2-Db-결합 대조군 펩티드(KAVYNFATM)의 존재하에 플레이트에 배양하였다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후, ELISPOT 플레이트를 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 1μg/ml의 비오틴화 항-마우스 IFN-γ(mAb R4-6A2, Mabtech)와 함께 배양한 다음, 제조사의 지시(Vector Labs)에 따라 Vectastain ABC Elite kit 및 Vectastain AEC 기질 시약과 함께 발색시켰다. 상용화된 ELISPOT 계수 서비스(Zellnet)을 이용하여 점의 갯수(spot)를 정량하였다. 결과는 배양액만, 배양액 및 HPV16 E749-57, 또는 관계없는 펩티드(10μg/ml)를 포함하는 배양액으로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
또 다른 연구에서는(도 7A), 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스를 아무 처리하지 않거나, 10μg의 TLR3 작용제 폴리I-C(Amersham or Sigma)와 혼합된 100μg의 재조합 펜타릭스 단백질을 피하에 1회 또는 4회(1일 내지 4일까지 매일) 접종하여 면역유도하였다. 수회 연속적으로 면역유도를 받는 마우스는 약 24시간 간격으로 면역유도하였다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하고, 비장을 적출하였다. 적출된 비장은 5ml 주사기를 사용하여 70μM의 여과기를 통과시켜 잘게 갈아, 10ml의 cRPMI(RPMI 1640, 10% FCS, 2mM L-글루타민, 50μM 2-머캅토에탄올, 10mM HEPES, 및 10mM 피루브산 나트륨) 용액에 비장세포의 단일 세포 분산액을 제조하였다. ELISPOT 플레이트(MSIP, Millipore)는 10μg/ml의 항-IFN-γ 캡쳐 항체(AN18-Mabtech)로 하룻밤 미리 코팅한 다음, cRPMI로 37℃에서 2시간 동안 블록(block)하였다. 비장세포(웰 당 3x105 개, 각 조건 당 웰 3개)는 어떤 자극물질도 없이 배양액만으로, 또는 10μg/ml의 E749-57 펩티드의 존재하에 플레이트에 배양하였다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후, ELISPOT 플레이트를 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 1μg/ml의 비오틴화 항-마우스 IFN-γ(mAb R4-6A2, Mabtech)와 함께 배양한 다음, 제조사의 지시(Vector Labs)에 따라 Vectastain ABC Elite kit 및 Vectastain AEC 기질 시약과 함께 발색시켰다. 상용화된 ELISPOT 계수 서비스(Zellnet)을 이용하여 점의 갯수(spot)을 정량하였다. 결과는 배양액만, 배양액 및 HPV16 E749-57 펩티드의 존재하에 배양한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다.
또 다른 연구에서는, 4회 연속으로 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)를 투여받은 마우스에서, 최대 11% 까지 CD8+ T 세포가 말초혈액에서 나타나며, 최대 22% 까지 CD8+ T 세포가 H-2Db HPV16 E749-57 사량체로 양성적으로 염색된 비장에서 나타나는 것을 알 수 있었다(도 7C). 이 연구로부터, HPV-특이적 T 세포는 펜타릭스 단백질만으로 4회 면역유도된 마우스의 비장에서는 검출되지 않으며, 연구조건에 따른 CD8 T 세포의 확장을 위해서는 면역보강제가 중요함을 나타낸다.
또 다른 연구에서는(도 8A), 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스(코호트 당 3마리)의 좌측 옆구리 피하로 -14일에 E7-발현 TC1 종양 세포(마우스 당 1x105개)를 이식하였다. 0일(종양이 약 200mm3 의 크기에 도달한 때)에는 상기 마우스에 아무 처리하지 않거나, 폴리I-C (10μg)를 단독으로 1회 접종(목덜미 피하에 접종), 또는 펜타릭스 단백질(100μg) 및 TLR3 작용제 폴리I-C (10μg)를 1회 접종하였다. 펜타릭스 단백질(100μg) 및 TLR3 작용제 폴리I-C (10μg)로 면역유도된 마우스(도 8A, 우측 판넬)에서는 종양이 완전히 퇴행되었고, 실험기간(60일) 동안 종양이 사라진 채로 지속되었다. 종양은 매 2-3일 마다 전자 디지탈 캘리퍼(electronic digital caliper)를 사용하여 측정하였다. 종양의 부피는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였으며, 종양을 가진 마우스는 종양의 부피가 약 2,000mm3에 도달한 때, CCAC(Canadian Council on Animal Care) 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
또 다른 연구에서는, 0.4mg/ml의 G418 을 포함하는 cRPMI에서 60-80% 콘플루언시(confluency)까지 TC-1 종양 세포를 배양하고, 0.25% 트립신으로 짧게 노출한 뒤 cRPMI로 중화하여 이를 수거하였다. TC-1 종양 세포(마우스 당 1x105개)는 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스의 좌측 옆구리에 이식되었고, 종양의 성장은 매 2 내지 3일 간격으로 전자 캘리퍼를 사용하여 모니터링하였다. 종양의 부피는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였으며, 종양을 가진 마우스는 종양의 부피가 약 2,000mm3에 도달한 때, CCAC(Canadian Council on Animal Care) 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
본 연구에서는, 클러스터 백신에 의하여 증가된 수준의 E7-특이적 CD8 T 세포 역시 E7-발현 TC1 종양을 퇴행시키는 향상된 능력을 제공하며, 이는 종양이 치료의 개시에 앞서 정상보다 큰 사이즈로 자라는 것이 허용된다는 점에서 증명되었다(도 8B). 치료시점에 평균 부피 350mm3 의 종양을 가진 마우스는 1회 또는 4회의 연속적인 펜타릭스 및 폴리(I:C) 투여로 면역유도되었다. 8마리의 마우스 중 5마리에서 일시적인 (그러나 완전하지는 않았다) 종양의 퇴행 및 치료받지 않은 마우스나 폴리(I:C)로만 치료받은 마우스에 비하여 상당히 향상된 생존시간을 나타내었다. 그러나, 1회의 백신 투여를 받은 모든 마우스는 결국 점진적인 종양의 성장에 의하여 압도되었다. 이와 대조적으로, 4회의 연속적인 펜타릭스 및 폴리(I:C)를 투여받은 마우스 중에서는 100%(8마리 중 8마리)의 비율로 대형의 종양이 더 이상 촉진되지 않을 정도로 퇴행되었다. 몇몇 종양은 치료 4-5주 후 다시 재발하기도 하였지만, 4회 투여한 코호트 중, 75%의 마우스(8마리 중 6마리)가 38일에 여전히 생존하고 있었고, 50%는 종양이 없는 채로 유지되었다. 모든 다른 코호트의 모든 마우스는 이 시점에서 점진적인 종양의 성장으로 모두 안락사되었다.
또 다른 연구에서는, 면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스에 E7을 발현하는 TC1 종양세포를 이식하였고, TC1-종양을 가진 마우스를 펜타릭스 단백질 및 폴리(I:C)로 면역유도하자 완전한 종양의 퇴행 및 종양의 진행 후에 존재하는 E7-특이적 CD8+ 메모리 세포의 확립이 나타났다(도 8C).
또 다른 연구에서는(도 9A), HPV E7-발현 TC-1 종양 세포(마우스 당 1x105 개)를 -21일에 면역유도된 적 없는 C57BL/6 마우스(코호트 당 4마리)의 좌측 옆구리 피하에 이식하였다. 0일에(종양의 크기가 약 200 mm3에 도달한 때) 마우스의 목덜미 피하에 펜타릭스 단백질(100μg) 및 10μg의 TLR9 작용제 CpG 2395 (Invivogen)를, 또는 10μg의 TLR9 작용제 CpG 2395 단독으로(펜타릭스 없이) 투여하거나, 아무것도 투여하지 않았다. 펜타릭스 단백질(100μg) 및 10μg의 TLR9 작용제 CpG 2395로 면역유도된 마우스는 완전히 퇴행된 종양을 나타냈으며, 연구기간 동안 종양이 없는 상태로 유지되었다. 종양의 성장은 매 2 내지 3일 간격으로 전자 캘리퍼를 사용하여 측정함으로써 모니터링하였으며 종양의 부피는 너비2x길이x0.5의 공식을 사용하여 계산하였고, 종양을 가진 마우스는 종양의 부피가 약 2,000mm3에 도달한 때, CCAC(Canadian Council on Animal Care) 가이드라인에 따라 안락사시켰다.
또 다른 연구에서 펜타릭스 단백질 및 이들의 면역보강제로 한 1회 면역유도에 의해 발휘되는 CD8 T 세포의 확립된 E7-발현 종양을 퇴행시키는 능력의 면에서의 작용효과를 평가하기 위하여, HPV16 E7-발현 TC-1 종양을 면역유도 된적 없는 수여자 마우스의 피하에 이식하였고, 종양의 부피가 약 200mm3가 될 때까지 자라도록 하였다. 펜타릭스(100μg) 및 폴리(I:C) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드로 피하에 면역유도된 동물들은 일반적으로 면역유도 1주 이내에 종양의 크기가 줄어들기 시작했다.
본 연구에서는, 펜타릭스 단백질 및 면역보강제로 면역유도된 모든 동물에서 면역유도 후 3주 정도에 완전한 종양 퇴행을 보였으며, 적어도 3달 동안은 종양이 없는 상태가 유지되었다. 이와 대조적으로 아무것도 투여하지 않거나 면역보강제만 투여한 경우, 또는 펜타릭스 단백질만 투여한 마우스의 경우에는 점진적인 종양의 성장을 보였으며, 종양의 지나친 성장으로 안락사되었다(일반적으로 종양 이식 28일 내).
요약하면, OVA 단백질에서 관찰된 바와 같이, 펜타릭스는 TLR3(도 5A 및 5B) 또는 TLR9(도 6A 및 6B)의 작용제와 혼용시 강력한 CD8+ T-세포 매개 면역 반응을 유발한다. 또한 모델 항원 OVA에서 관찰된 바와 같이, 연속적인 매일의(클러스터) 면역유도 전략의 적용은 실질적으로 펜타릭스에 의한 CD8+ 면역반응을 향상시켰다(도 7A-C). 펜타릭스는 또한 면역보강제 없이도 CD8+ T-세포 매개 면역 반응을 유도하였다(도 11).
펜타릭스 단백질을 이용한 백신에 의해 유발되는 면역 반응은 확립된 TC-1 종양을 백신 기간 내에 퇴행시킬 수 있었다(도 8A, 8B, 9A, 및 9B). 이는 펜타릭스가 폴리(I:C)(도 8A, 8B, 및 9B) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드(도 9A 및 9B)와 조합되었을 때 사실로 나타났다. 두 가지 다른 실험에서, 펜타릭스를 투여받은 모든 마우스에서 확립된 TC-1 종양이 완전히 또는 거의 완전하게 퇴행된 반면에, 대조군의 100%에서(아무것도 투여하지 않거나, 면역보강제만 투여한 경우)점진적으로 성장하는 종양에 압도되었다.
실시예 5: 펜타릭스는 HPV31 E7 에피토프에 면역을 유발한다.
면역유도되지 않은 C57BL/6 마우스는 10μg의 폴리(I:C)(Amersham)와 혼합된 100μg의 전체, 가용성 펜타릭스 단백질로 면역유도되었다. 면역유도 7일 후 마우스를 안락사하여 벌크 비장세포를 IFN-γ ELISPOT으로 평가하여, 두가지 다른 예측적인 MHC-결합 알고리즘(SYFPEITHI and IEDB)을 사용하여 동정된 펩티드에 특이적인 CD8+ T 세포의 수를 정량하였다. 결과는 배양액 단독으로 또는 표시된 펩티드 (10μg/ml)로 자극한 1x106 개의 비장세포 당 IFN-γ 스팟-형성 세포의 수로 보고되었다. HPV31-유래의 후보자 펩티드(HPV31 E7252-260-TSNYNIVTF; 서열번호 35)뿐만 아니라, 길거나(14mer 및 20mer) 짧은(9mer)의 HPV16 E749-57 펩티드가 면역유도된 마우스에서 두가지 알고리즘 모두에서 가장 높은 H2Db 점수로 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다(도 10A). 이러한 결과는 HPV31 E7에 대한 새로운 에피토프를 나타내며, 펜타릭스가 HPV31 E7 에피토프에 대항하는 면역을 일으킴을 나타낸다.
실시예 6: 펜타릭스는 다중 유전자형의 HPV에 면역반응을 일으킨다.
펜타릭스에 의해 유발되는 세포성 면역반응의 정도를 평가하기 위하여, 비장세포 벌크 및 CD4-고갈 비장세포를 직접 ex vivo하게 전체 펜타릭스 단백질 서열에 걸쳐있는 15머(mer) 펩티드가 중첩되는 라이브러리를 이용하여 ELISPOT으로 분석하였다. 표시된 곳에서 자기적인 고갈(magnetic depletion)을 사용하여 CD4 세포들을 비장세포 벌크로부터 고갈시켰다. 간략하게, 제조사(Miltenyi)의 지시에 따라 비장세포 벌크는 PE-결합 항-CD4 항체(clone L3T4; BD biosciences)로 염색하였고, 라벨링한 세포들은 항-PE 마이크로비드를 사용하여 고갈시켰다. 도 10B에 나타낸 바와 같이, 펜타릭스에 의해 C57Bl/6에서 유발된 반응은 백신 내에 포함된 5종의 모든 HPV바이러스주를 방어할 수 있었다. 가장 특징적인 H-2Db-제한된 에피토프 HPV16 E749-57(RAHYNIVTF; 서열번호 38)를 포함하는 펩티드들은 항원 특이적인 CD8 T cell의 절대적인 숫자의 면에서 가장 강력한 반응을 나타내었다. 차순위의 강력한 반응은 관련된 펩티드(TSNYNIVTF; 서열번호 35)를 포함하는 HPV31의 15머 단백질에 의해 유발되었고, 이는 알고리즘 분석에 의해 HPV16 E749-57보다 H-2Db7에 대하여 훨씬 강력한 결합자(binder)인 것으로 예측되었다. 다른 HPV E7 단백질의 아미노산 서열로부터 얻어지는 다양한 15머 펩티드들 역시 벌크 및 CD4-고갈 비장세포로부터 다양한 강도의 반응을 나타내며, 펜타릭스가 넓은 범위의 세포 면역 반응을 유발할 수 있고, 제한된 종류의 MHC 분자를 가진 인브레드(inbred) 마우스에까지도 면역 반응을 유발할 수 있다. 또한, HLA-A2 형질전환 마우스(HLA-A2/Db, Jackson Labs stock #004191)를 펜타릭스 및 폴리(I:C)로 면역유도한 후 중첩되는 15 머(mer) 펩티드의 동일한 라이브러리를 사용하여 ELISPOT으로 평가한 결과하였다. 흥미롭게도, 일반적인 반응의 강점은 C57Bl/6에서 HLA-A2/Db보다 우수하였으나, 전반적인 반응의 복잡성은 매우 유사하였는데(도 10C), 이는 H2b에 의해 제한된 반응은 유발되었으나, HLA-A2에 의해 제한되는 반응은 유발되지 않았다는 것을 의미한다. 또한, HPV16 E7 항원을 사용한 많은 다른 연구에서 관찰된 바와 같이, 펜타릭스 및 폴리(I:C)로 면역유도된 마우스에서, HLA-A2에 의해 제한되는 11-20 또는 86-93의 HPV E7의 최소 펩티드 에프토프들에 대한 반응은 검출할 수 없었다.
TSNYNIVTF(서열번호 35)가, 강력한 반응성을 가진 HPV31 15머 펩티드 AEPDTSNYNIVTFCC(서열번호 36) 및 TSNYNIVTFCCQCKS(서열번호 37) 내의 정확한 최소 에피토프라는 것을 확인하기 위하여, 펜타릭스 및 폴리(I:C)로 면역유도된 마우스로부터 얻어진 비장세포를 ELISPOT으로 평가하였고, 이 9머(mer)의 최초 펩티드에 반응성이 있다는 것을 밝혀내었다.
다른 실시예들
본 발명의 다양한 실시예가 본 명세서에 공개되었음에도 불구하고, 본 발명에 관한 당업자의 통상의 지식에 따라 수많은 적용 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위 내에서 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 발명의 모든 관점에서 실질적으로 동일한 방법으로 동일한 결과를 성취하기 위하여 알려진 균등물의 치환을 포함한다. 본 명세서에 사용된 접근 번호는 뉴클레오티드 서열을 위한 GenBank, EMBL (European Molecular Biology Laboratory), DDBJ(DNA Database of Japan), 또는 GSDB(Genome Sequence Data Base)를 포함하는 다양한 데이터베이스의 접근 번호이고, GenBank, EMBL, DDBJ, 또는 RefSeq의 뉴클레오티드 서열의 코딩영역으로부터 번역되는 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라, PIR(Protein InformationResource), SWISSPROT, PRF(Protein Research Foundation), 및 PDB(Protein Data Bank)의 펩티드 서열을 위한 접근 번호를 포함한다. 숫자적인 범위는 범위를 정하는 숫자들 및 이들에 포함되는 하부 범위를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "포함하는", "포함한다", "갖는", 또는 "가진다"들은 개방형 종결 용어이고, 실질적으로 "~로 구성되나, 이에 제한되는 것은 아닌"과 균등하다. "the", "a", "an" 과 같은 용어는 단수 또는 복수를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술임을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명에 참고문헌으로 포함된 모든 간행물은, 마치 개별적인 간행물이 특이적으로, 그리고 개별적으로 참조로써 포함되는 것으로 지시되는 것과 같이, 완전히 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 모든 실시예 및 상기한 실시예와 도면에 참조되어 실질적으로 기술된 이들의 변용을 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 실시예에 관하여 기재되었다. 그러나, 이들의 수많은 다양한 변용 및 변형이 본 발명의 청구항에 정의된 발명의 범위를 벗어나지 않는 정도에서 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명하다.
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Claims (54)
- E7 항원이 적어도 2개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 2 이상의 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 항원의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 다른 HPV 균주는 고위험 균주인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 2항에 있어서, 고위험 균주는 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 및 HPV82로 이루어진 군으로부터 2 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, E7 항원은 5개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 4항에 있어서, 5개의 다른 HPV 균주는 HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV45, 및 HPV52를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, 폴리펩티드는 2 이상의 서열번호 1 내지 15로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 6항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 5로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 7항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 16 또는 17로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 6항에 있어서, 폴리펩티드는 2 이상의 서열번호 18 내지 32로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 8항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 33 또는 34를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 다른 HPV 균주에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- E7 항원이 적어도 2개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 2 이상의 인간 파필로마바이러스(HPV) E7 항원의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 12항에 있어서, 다른 HPV 균주는 고위험 균주인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 13항에 있어서, 고위험 균주는 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 및 HPV82로 이루어진 군으로부터 2 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 12항에 있어서, E7 항원은 5개의 다른 HPV 균주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 15항에 있어서, 5개의 다른 HPV 균주는 HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV45, 및 HPV52를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 12항에 있어서, 핵산 분자는 2 이상의 서열번호 18 내지 32로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 17항에 있어서, 핵산 분자는 서열번호 18 내지 32로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 18항에 있어서, 핵산 분자는 서열번호 33 또는 34로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
- 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현을 허여하는 서열에 실시가능하게 결합된 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 21항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
- 제 23항에 있어서, 담체를 더 포함하는 조성물.
- 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 면역보강제(ajuvant)를 더 포함하는 조성물.
- 제 25항에 있어서, 면역보강제는 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제(agonist)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 26항에 있어서, TLR 작용제는 TLR3 작용제 또는 TLR9 작용제인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 27항에 있어서, TLR3 작용제는 폴리(I:C)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 27항에 있어서, TLR9 작용제는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 25항에 있어서, 면역보강제는 인터페론-알파, 4-1BB 수용체의 작용제, CD40 수용체의 작용제, 또는 항-CD40 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 피험자의 면역 반응을 촉진시키는 방법.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법.
- 제 32항에 있어서, HPV 감염과 관련된 질병은 유방암, 자궁경부암, 항문암, 외음부암(vulva cancer), 질암, 음경암(penis cancer), 두경부암(head and neck cancer), 및 폐암, 또는 이의 전암성 병변(pre-malignant lesion)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32항에 있어서, HPV 감염과 관련된 질병은 전암성 자궁경부 상피 신생물 (pre-cancerous cervical epithelial neoplasia) (CIN I에서 CIN III 까지) 또는 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 방법.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염의 치료 방법.
- 제 31항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, HPV 감염은 고위험 HPV 타입인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항에 있어서, 고위험 HPV 타입은 HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, 및 HPV82로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역보강제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 38항에 있어서, 면역보강제는 면역보강제는 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, TLR 작용제는 TLR3 작용제 또는 TLR9 작용제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 40항에 있어서, TLR3 작용제는 폴리(I:C)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 40항에 있어서, TLR9 작용제는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38항에 있어서, 면역보강제는 인터페론-알파, 4-1BB 수용체의 작용제, CD40 수용체의 작용제, 또는 항-CD40 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 14일 미만의 기간 동안 수회 용량(multiple dose)의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 1 내지 4일 동안 수회 용량의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 투여는 1일 수회 투여 용량의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포의 용도로서, 이를 필요로 하는 피험자의 면역 반응을 촉진시키기 위한 용도.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포의 용도로서, 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 용도.
- 제 48항에 있어서, HPV 감염과 관련된 질병은 유방암, 자궁경부암, 항문암, 외음부암, 질암, 음경암, 두경부암, 및 폐암, 또는 이의 전암성 병변으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 48항에 있어서, HPV 감염과 관련된 질병은 전암성 자궁경부 상피 신생물 (CIN I에서 CIN III 까지) 또는 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 용도.
- 유효량의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제 21항의 발현 벡터 또는 제 22항의 숙주 세포의 용도로서, 이를 필요로 하는 피험자의 HPV 감염의 치료를 위한 용도.
- 본질적으로 하나 이상의 아미노산 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드.
- 본질적으로 하나 이상의 아미노산 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드와 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, HPV31 감염의 진단방법.
- 본질적으로 하나 이상의 아미노산 서열 TSNYNIVTF (서열번호 35), AEPDTSNYNIVTFCC (서열번호 36) 또는 TSNYNIVTFCCQCKS (서열번호 37)로 이루어진 펩티드와 시료를 접촉시켜 HPV31 감염에 대한 피험자의 반응을 측정하는 방법.
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