WO2009021468A1 - Péptidos penetradores a células y su uso fusionados a biomoléculas con acción terapéutica - Google Patents

Péptidos penetradores a células y su uso fusionados a biomoléculas con acción terapéutica Download PDF

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Maribel Guerra Vallespi
Milaid Granadillo Rodriguez
Osvaldo Reyes Acosta
Boris Ernesto Acevedo Castro
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention falls within the field of immunology, cell biology and cancer. Specifically, the methods and compositions of the present invention involve the binding of biomolecules of different origin to cell-penetrating peptides (PPC) to induce a potent therapeutic action.
  • PPC cell-penetrating peptides
  • the biomolecules can be antigenic peptides, nucleic acids, oligonucleotides, whole proteins, nanoparticles and liposomes. Many of the drugs are internalized with great difficulty in the cells, which is considered one of the main limitations in the development of therapeutic agents. Therefore, the fusion of therapeutic agents to PPCs can be a very effective strategy to improve their pharmacological properties.
  • Some PPCs that have been identified include the Tat protein of the human immunodeficiency virus (Frankel, AD, and Pabo, CO (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus.
  • CeII 55: 1189-1193 the VP22 protein of the Herpes simplex virus (Elliott, G., and O'Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein CeII 88: 223-233), and fibroblast growth factor (Rojas M, et al. (1998) Genetic engineering of protein with cell. Membrane permeability. Nat Biotechnol. 16: 370-375).
  • the Tat peptide has been used to transduce proteins to cells both in vitro and in vivo (Lindgren, M et al. (2000) Cell-penetrating peptides. Trenos Pharmacol. Sci. 21: 99-103).
  • HPVs can play an important role in cancer of the anus, vulva, vagina and some oropharyngeal cancers (the central part of the throat that includes the soft palate, the base of the tongue and the tonsils) ( Division of STD Prevention, Prevention of Genital HPV infection and sequelae: Report of an external consultants' meeting, Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1999).
  • HPVs are a group of more than 100 types of viruses and of them more than 30 types are usually transmitted by sexual contact. Some types of HPV are known as “low risk” viruses because they rarely turn into cancer. HPVs that are more likely to become cancer are known as “high risk” viruses. Both high-risk and low-risk viruses can cause the growth of abnormal cells, but generally only high-risk types of HPV can cause cancer. High-risk HPVs that are transmitted through sexual contact are types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69 and possibly some others. These types of high-risk HPV cause tumors that are generally flat and almost invisible.
  • Genital warts are generally related to two types of low-risk human papillomavirus, HPV-6 and HPV-11.
  • HPVs are small, double-stranded (50-60 nm) double-stranded DNA viruses with a circular DNA genome of 7800 to 7900 base pairs. The genome contains three main regions, one that codes for late genes, another that codes for early genes and a non-coding region (Park TW et al. (1995) Molecular biology of cervical cancer and its precursors. Cancer 76: 1902- 1913).
  • the region of late genes has two open reading fronts that encode the capsid proteins of virus L1 (majority) and L2 (minority).
  • the early gene region includes six open reading fronts, designated as E1, E2, E4, E5, E6 and E7.
  • the E6 and E7 proteins are critical oncoproteins for viral replication as well as for the immortalization of the host cell and its transformation.
  • the methods commonly used to treat HPV injuries are cryosurgery (freezing that destroys tissue), the electrosurgical excision procedure with a handle (LEEP), in which tissue is removed using a hot wire ring) and Ia conventional surgery. Similar treatments can be used for external genital warts. In addition, some medications can be administered to treat them (Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines 2002. Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity and Mortality Weekly Report 2002; 51: 1-78).
  • the dendritic cell and human cancer vaccines Curr Opin Immunol 12: 583-588 due to the fact that the response of reactive T cells against tumors is very weak, therefore, the main challenge of cancer vaccines is the breakdown of tolerance and the generation of a strong and lasting immunity through the manipulation of the antigen and the delivery or distribution system of the antigen to the cell.
  • the present invention in contrast to the state of the art Previously, it proposes the use of a new family of PPC and compositions containing HPV antigens genetically fused to this new family of PPC, which enhance the cellular and antitumor immune response against HPV antigens and against cells that exhibit HPV antigens including tumors associated with HPV.
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing a new family of cell-penetrating peptides (PPC) that can be used as a platform to fuse biomolecules and achieve effective drug internalization in cells.
  • the new PPC family consists of the peptide corresponding to region 32-51 of the LALF protein (SEQ ID NO. 1) and its analog peptides with specific amino acid substitutions at different positions for the amino acid alanine: L-2 ( SEQ ID NO. 2, replacement in position 2), L-8 (SEQ ID NO. 3, replacement in position 8), L-12 (SEQ ID NO. 4, replacement in position 12) and L-20 (SEQ ID NO. 5, replacement in position 20).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing HPV antigens genetically fused to the aforementioned PPC family that enhances Ia immune response against HPV antigens, where HPV protein antigens are covalently linked to the PPC family.
  • This genetic fusion guarantees the delivery and distribution of HPV antigens to cells, guaranteeing the processing of the cargo protein and the presentation to T cells of antigenic epitopes, for a prolonged time resulting in a potent cellular and antitumor immune response.
  • the immune response can be cellular, in particular a cell-mediated cytolytic response against the HPV protein antigen.
  • the compositions can be used therapeutically.
  • the induction of the immune response in a subject refers to the generation of response that exceeds, in such magnitude and quality, the response previously induced by contact with HPV protein antigens exhibited both by the virus, or by the infected subject, or by the transformed cells of the subject.
  • pharmaceutical compositions are used to generate an immune response against tumor cells that express and exhibit an HPV protein antigen.
  • the preferred HPV white protein antigens for the compositions are the early viral proteins E6 and E7 which are known to be consistently expressed in tumors associated with HPV.
  • the pharmaceutical compositions comprise the HPV E6 or E7 protein antigen bound to the PPC LALF at the nucleotide level, which allows the expression and purification of a protein that contains both the E6 / E7 antigen sequences and the PPC LALF.
  • the fusion protein can also be mixed with an adjuvant.
  • the compositions can be used therapeutically in the host previously infected with HPV to prevent future viral proliferation or to eliminate cells that proliferate as a consequence of HPV infection, including tumors that express and exhibit an HPV antigen or present a portion of the antigen.
  • the protein antigen includes the complete protein or a polypeptide portion of the HPV protein exhibited on the surface of the HPV or in the infected cell of a subject as well as in a peptide presented by an infected cell as a result of the processing and presentation of HPV proteins, for example, through the typical MHC class I or II pathways.
  • HPV genomes of several different types of HPV were cloned and characterized by DNA sequence analysis.
  • Bacterial vectors that contain the complete or partial HPV genome are available from several sources that include the American Tissue Culture Collection (abbreviated "American Type Culture Collection”, abbreviated ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Some additional types of HPV useful for the practice of the present invention can be isolated and typed by methods that have been previously established for these purposes, whose methods are well known in the state of the art.
  • E6 and E7 proteins are consistently expressed in cervix cancer (Zur Hausen H. (1987) Papillomaviruses in human cancer.
  • E6 and E7 are the preferred targets for immuno intervention, and therefore, are the preferred HPV protein antigens of the pharmaceutical compositions of the present invention to be used in the treatment of cancer associated with HPV
  • the pharmaceutical composition described herein can be used to enhance an immune response, particularly a cell-mediated cytolytic response, against an HPV, or an HPV-infected or transformed cell that express an HPV antigen.
  • composition described herein may contain and be administered together with adjuvants. It can also be used ex vivo as a way of stimulating the white blood cells obtained from a subject to induce, expand and spread, in vitro, specific immune cells against an HPV antigen that are subsequently reintroduced into the subject.
  • the effective amount is the amount that when administered results in the induction of an immune response.
  • the amount of the pharmaceutical composition administered to the host may vary depending on several factors, including the antigen or HPV protein antigens used, the size, age, body weight, general health, sex and diet, as well as their level of immune response in general.
  • Figure 1 Image by fluorescence microscopy demonstrating the ability of the LALF PPC to penetrate the cell.
  • FIG. 7 Graph showing the effect of treatment with LALF-E7 on the volume of established tumors of TC-1 cells in animals
  • Figure 8. Graph showing that the effect of treatment with LALF-E7 on the volume of established tumors of TC-1 cells in animals is dependent on covalent fusion.
  • Figure 9. Graph showing the count of effector point cells (CFS) by 10 6 of a pool of splenocytes of 3 mice immunized with different preparations
  • Different cell lines were used in this embodiment (Table 1).
  • the cells were grown on sterile coverslips 22mm place overnight at 37 0 C and 5% CO2 in RPMI 1640 with 10% inactivated fetal bovine serum and 2 mM glutamine. Subsequently Ie added 25 or 50 .mu.M CFP LALF or its analogues Biotinylated L-2 and L-20 and incubated at 37 0 C and 4 0 C and at different times (10 min, 20 min, 30 min, 1 hour and 2 hours). The cells were washed gently with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min at room temperature. Three washes were performed with PBS.
  • Permeabilization of the cells was performed with 0.5% Triton X-100 for 15 min at room temperature. Three washes were performed with PBS. Blocking was performed with 1% SFB in PBS for 1 hour at room temperature. Three washes were performed with PBS. Incubate with 1: 50,000 streptavidin-fluorescein in PBS for 45 minutes in a dark chamber. Wash extensively with PBS. Mount the covers on objects on slides with aqueous mounting medium. Examine using a fluorescence microscope with the appropriate filter. Table. one
  • the C57BL / 6 mice were euthanized by dislocation of the cervical and the spleens were removed aseptically.
  • Cell suspensions of the animals extracted from the spleens were collected in a pool and gently homogenized.
  • the splenocytes were washed and the erythrocytes were used with a 0.83% NH 4 CI solution. They were subsequently washed and finally separated in different tubes with 20x10 6 of total cells resuspended in 10 mL of fresh RPMI 1640 medium supplemented with 7% fetal bovine serum (in English "Fetal Bovine Serum", abbreviated FBS).
  • Each preparation was incubated with 0.8 mg of the biotinylated peptides L-2 (278 ⁇ M) and L-20 (280 ⁇ M) at different times: 10 minutes, 30 minutes, 1 hour and 18 hours. Incubations were performed at 37 0 C and 5% CO2. The cells were mounted on an object holder, fixed and permeabilized. The cells were treated with propidium lodide to stain the nucleus and with streptavidin-fluorescein to detect the peptides inside the cells. The results obtained from observation by confocal microscopy (Figure 2) showed that peptides L-2 and L-20 are internalized and short incubation times (30 min). These results are similar when using the LALF PPC and the L-8 and L-12 analogues.
  • Example 3 Cloning and expression of the PPC LALF recombinant fusion protein or its analogues with E7 To obtain the recombinant fusion of PPC LALF with the E7 protein, the chemical synthesis of the two DNA strands of each of the components of the fusion separately was started.
  • the PPC LALF DNA fragment (SEQ ID NO. 6) carries at the 5 ' and 3 ' ends, the open restriction sites Ncol and Hindlll, respectively.
  • the DNA sequence of the HPV 16 E7 gene carries at the 5 ' and 3 ' ends, the Hindlll and BamHI open restriction sites, respectively.
  • the ligation reaction was transformed into a preparation of competent E. coli cells. The colonies obtained were examined by analysis with 5 restriction enzymes.
  • the positive clones were examined by double chain sequencing, using a 27 base oligonucleotide (SEQ ID NO. 8) that produces hybridization with E7, thereby confirming the correct fusion (SEQ ID NO. 9 and 10) and the replacement of the cysteine with a glycine at the binding site to the Rb protein.
  • the selected clone ( Figure 3) was named pPEPE7M-7.
  • Plasmid pPEPE7M-7 was transformed into the E. coli strain BL-21.
  • the transformed bacteria were subjected to fermentation processes in minimal medium composed of M9 salt and supplemented with 0.1 mM CaCI2; 1 mM MgCl2; 1% glucose; 1% hydrolyzed casein; 0.5% tryptone and 100 ⁇ g / mL of ampicülina for 24 hours at 37 0 C with a stirring of 250 rpm.
  • the sedimentation of the cells was carried out by centrifugation of 10,000 rpm for 20 minutes at 4 0 C.
  • Five grams of biomass were resuspended in 25 mL of a buffer solution of 50 mM NaH 2 PO4 ⁇ 0.3 M NaCI; pH 8 and underwent a cell rupture by ultrasound (0.5 cycles, 70 amplitude for 1 minute).
  • the breaking process was repeated 5 times.
  • the broken cells were homogenized and centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 0 C. The supernatant was removed from this centrifugation and the insoluble fraction containing the recombinant protein was collected for later purification.
  • the supernatant was removed and the insoluble fraction was resuspended in 30 mL of 50 mM NaH 2 PO4 buffer solution; 0.3 M NaCL; pH 8 and homogenization was performed as described previously.
  • the homogenate was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 0 C.
  • To perform the extraction of the protein from the insoluble fraction 1 gram of it was resuspended in 100 mL of 4 M urea in a 50 mM NaH 2 PO 4 buffer; 0.3 M NaCI, pH 8. Homogenization was performed with a Politron at a rotation speed of 9500 rpm for 1 minute. Subsequently, the extraction was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 0 C.
  • the protein of interest In the soluble fraction is the protein of interest which was applied to a Ni-NTA column (His-Select TM Nickel Affinity GeI, Sigma) equilibrated with urea 4 M in 50 mM NaH 2 PO 4 buffer; 0.3 M NaCL; pH 8 and 5 mM imidazole.
  • the column was washed with the same equilibrium solution but with 40 mM imidazole and the protein was eluted with 250 mM imidazole.
  • the eluate underwent a dialysis process with a 1x pH 8.4 Tris buffer using a 10 ⁇ m pore diameter membrane. Finally, the protein was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter.
  • Example 5 Demonstration by fluorescence microscopy that the CPP LALF or their analogues internalize the protein E7 to the cell charge J774 cells were grown on sterile coverslips 22mm place overnight at 37 0 C and 5% CO2 in RPMI 1640 with 10% inactivated bovine fetal serum and 2 mM glutamine. Subsequently, different covers of objects were independently incubated with 1.66 ⁇ M of the LALF-E7 fusion protein, 1.66 ⁇ M of the E7 protein and PBS (as a negative control) at 37 0 C for 30 min, 1 hour and 2 hours . As a positive control, CasKi cells (human cells expressing HPV 16) were also cultured and maintained under the same experimental conditions.
  • CasKi cells human cells expressing HPV 16
  • J774 cells were grown on sterile coverslips 22mm place overnight at 37 0 C and 5% CO2 in RPMI 1640 with 10% inactivated fetal bovine serum and 2 mM glutamine. Subsequently they were separated into three aliquots of 5x10 6 cells. They were incubated separately with 25 uM of the fusion protein LALF-E7, 25 uM of the protein E7 and PBS during 4 hours at 37 0 C. The cells were centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The pellet was washed three times with PBS. Subsequently, the cells were resuspended in 100 ⁇ L of RIPA buffer (Promega) and subjected to 3 vortex cycles for 10 seconds and 2 minutes on ice.
  • RIPA buffer Promega
  • the broken cells were centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to separate the cell extract.
  • the protein concentration was determined thereto and 10 ⁇ g of total protein was applied in a 15% polyacrylamide electrophoresis gel.
  • the gel was transferred to a nitrocellulose membrane and after blocking it was incubated with a polyclonal IgG anti-E7 antibody of HPV 16 (Santa Cruz) obtained in goat and diluted in PBS (1: 100) for 2 hours at temperature ambient. Three washes were performed with PBS.
  • the membrane was incubated for 45 minutes at room temperature and in a dark chamber with a goat anti-IgG antibody conjugated to peroxidase (Sigma) and diluted in PBS (1: 5000).
  • the protein obtained in E. coli from the recombinant LALF-GFP fusion (GFP) was used to verify that the PPC LALF or its analogs could internalize the protein charge.
  • the GFP (GenBank Accession # U55762) was obtained with the use of the polymerase chain reaction from the plasmid pEGFP-N1 of Clontech using the oligonucleotides with SEQ ID NO. 11 and 12. Both oligonucleotides have restriction sites used for cloning (Hindlll- with sense and BamHI- with antisense).
  • the synthetic LALF fragment and the GFP gene obtained by PCR were inserted with the use of T4 ligase in the vector pM238 in a similar manner as in Example III.
  • the recombinant clone is identified with SEQ ID NO. 13 and 14.
  • an experiment similar to that of example V was performed, but in this case the J774 cells were incubated with LALF-GFP, biotinylated LALF, GFP and PBS.
  • Example 8 Treatment of tumors established in mice with the fusion of PPC LALF or its analogues with E7
  • the tumor cell line TC-1 expressing the E7 protein of HPV-16 was used. It was derived from a primary culture of lung cells of C57BL / 6 mice through the immortalization and transformation of the cells with the E6 and E7 genes of HPV-16 and an activated human c-Hras gene as described in Lin KY et al. (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class Il presentation of tumor antigen. Cancer Res. 56: 21-26. For the inoculation of the tumors, the TC-1 cells, supplied by Dr. T.-C.
  • Each group included 10 animals. Two immunizations were performed, every 14 days. Group 1 was immunized with the recombinant protein LALF-E7; group 2 with the recombinant E7 protein; group 3 with the synthetic LALF peptide and group 4 with PBS. Immunizations were performed subcutaneously on the flank of the mouse and in 0.2 mL volumes.
  • Example 9 Treatment of tumors established in mice with the fusion of PPC LALF or its analogues with E7 (LALF-E7) and the mixture of PPC LALF or its analogues with E7 (LALF + E7)
  • LALF-E7 the mixture of PPC LALF or its analogues with E7
  • LALF + E7 the mixture of PPC LALF or its analogues with E7
  • Each group included 10 animals. Two immunizations were performed, every 14 days. Group 1 was immunized with the LALF-E7 fusion protein; group 2 with the LALF + E7 mixture; group 3 with LALF; group 4 with E7 and group 5 with PBS. Immunizations were performed subcutaneously on the flank of the mouse and in 0.2 mL volumes. Tumor kinetics in the different groups was followed by the tumor volume which was determined and calculated as previously described in Example 9. The average volume of each group +/- the standard deviation 30 days after inoculation the tumors are represented. in Figure 8.
  • Example 10 Comparison of the ability of pharmaceutical preparations to induce a cellular immune response.
  • Group 1 was immunized with 30 ⁇ g of the recombinant protein LALF-E7; group 2 with 30 ⁇ g of the E7 recombinant protein; group 3 with 8 ⁇ g of the synthetic LALF peptide and group 4 with PBS. Immunizations were performed. subcutaneously on the flank of the animal with volumes of 0.2 ml_ and without adjuvants. Two doses were administered every 14 days. Seven days after the second immunization, the mice were euthanized by dislocation of the cervical and the splenocytes were removed aseptically for later analysis in an ELISPOT anti-gamma interferon (anti-IFN- ⁇ ) assay. The animal cell suspensions for each group were collected in a pool and gently homogenized.
  • the splenocytes were washed and the erythrocytes were used with a 0.83% NH 4 CI solution. They were subsequently washed and finally resuspended in a fresh medium of RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (in English "Fetal Bovine Serum", abbreviated FBS) and 10 U / mL of human IL-2 (hlL-2).
  • FBS fetal bovine serum
  • human IL-2 human IL-2
  • Mouse EL4 cells (H-2 b ), which do not express HPV-16 E7 epitopes were used as white cells, which were previously pulsed at a concentration of 10 ⁇ M with peptide 49 RAHYNIVTF 57 corresponding to the mouse CTL epitope C57BL / 6, H- 2 b (Feltkamp MC et al. (1993) Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 ). The cells were subsequently suspended in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS and hlL-2, which were used as antigen presenting cells. The non-pulsed EL4 cells were also included for the determination of the background of IFN- ⁇ secretory cells.
  • the assay for the determination of IFN- ⁇ secretion was performed as previously described (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of a strong HlV-specific CD8 + T cell response in mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi-CTL-epitope polypeptide Viral Immunol. 5 (2): 337-356).
  • the 96-well plates with the bottom coated with nitrocellulose paper were coated with 100 ⁇ L of 5 ⁇ g / mL of the capture Ab and incubated overnight at 4 0 C. After three washes with PBS, the plates were blocked with RPMI 1640 supplemented with 10% FBS at 37 0 C for one hour.
  • Splenocytes (10 6 , 2x10 5 and 4x10 4 cells per well) and white EL4 cells (10 5 per well) were added respectively in a final volume of 0.2 mL and co-incubated in duplicate at 37 0 C and 5 % of CO 2 for 17 hours. After incubation, a standard ELISPOT test was performed (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of a strong HIV-spec ⁇ f ⁇ c CD8 + T cell response in mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi- CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5 (2): 337-356).

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de nuevos péptidos penetradores a células (PPC) y en particular a la región 32-51 de la proteína Limulus antilipopolisacárido (LALF) y sus análogos. Esta invención se refiere a composiciones que contienen estos péptidos asociados a biomoléculas con propiedades terapéuticas. Esta invención consiste en composiciones que contienen la fusión covalente de biomoléculas, entre ellas antígenos del virus de papiloma humano (VPH), a estos PPC, para inducir una potente respuesta inmune celular contra el VPH y contra células que expongan antígenos del VPH incluyendo tumores asociados al VPH. Las composiciones referidas son aplicables en la industria farmacéutica como vacunas para uso terapéutico en humano.

Description

PÉPTIDOS PENETRADORES A CÉLULAS Y SU USO FUSIONADOS A BIOMOLÉCULAS CON ACCIÓN TERAPÉUTICA.
Campo de Ia técnica
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia inmunología, Ia biología celular y el cáncer. Específicamente los métodos y composiciones de Ia presente invención involucran Ia unión de biomoléculas de diferente origen a péptidos penetradores a células (PPC) para inducir una potente acción terapéutica.
Estado de Ia técnica anterior
En los últimos años se ha puesto en evidencia que algunas proteínas atraviesan Ia membrana celular por un proceso llamado transducción de proteínas mediante el cual penetran en las células conservando su actividad biológica (Prochiantz, A. (2000) Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others. Curr. Opin. CeII Biol. 12: 400-406). A partir de este descubrimiento, se han ido identificando pequeños péptidos derivados de dominios de transducción de proteínas, llamados péptidos penetradores a células o PPC, que se internalizan en Ia mayoría de las células. El uso de estos PPC fusionados o conjugados con biomoléculas pueden ser utilizados como transportadores de las biomoléculas al interior de las células (Schwarze, S. R. et al. (2000) Protein transduction: unrestricted delivery into all cells?. Trends CeII Biol. 10:290-295). Las biomoléculas pueden ser péptidos antigénicos, ácidos nucleicos, oligonucléotidos, proteínas completas, nanopartículas y liposomas. Muchas de las drogas se internalizan con mucha dificultad en las células, Io cual es considerado una de las principales limitaciones en el desarrollo de los agentes terapéuticos. Por Io tanto Ia fusión de agentes terapéuticos a los PPC puede ser una estrategia muy efectiva para mejorar sus propiedades farmacológicas. Algunos PPC que han sido identificados incluyen Ia proteína Tat del virus de inmunodeficiencia humana (Frankel, A. D., and Pabo, C. O. (1988) Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. CeII 55:1189- 1193), Ia proteína VP22 del virus del herpes simples (Elliott, G., and O'Hare, P. (1997) Intercelular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. CeII 88:223-233), y el factor de crecimiento de fibroblastos (Rojas M, et al. (1998) Genetic engineering of protein with cell. membrane permeability. Nat Biotechnol. 16:370-375). El péptido Tat ha sido utilizado para transducir proteínas a las células tanto in vitro como in vivo (Lindgren, M et al. (2000) Cell-penetrating peptides. Trenos Pharmacol. Sci. 21 :99-103). El uso de estos PPC en Ia entrega y reparto de antígenos tumorales a las células puede prolongar Ia presentación a las células T de péptidos, y como resultado Ia generación de una respuesta inmune más eficiente contra el cáncer. Alrededor del 1 % de las mujeres del mundo son afectadas por cáncer de cervix. Según Ia Organización Mundial de Ia Salud, más de 500,000 mujeres padecen de cáncer de cervix en el mundo cada año y en particular, en los países de menor desarrollo, el cáncer de cervix es Ia primera causa de muerte en mujeres. Los VPH se consideran ahora como Ia causa principal de cáncer cervical. Los estudios sugieren también, que los VPH pueden desempeñar un papel importante en el cáncer de ano, vulva, vagina y algunos cánceres de orofaringe (Ia parte central de Ia garganta que incluye el paladar blando, Ia base de Ia lengua y las amígdalas) (División of STD Prevention. Prevention of genital HPV infection and sequelae: Report of an external consultants' meeting. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1999).
Los VPH, son un grupo de más de 100 tipos de virus y de ellos más de 30 tipos son transmitidos generalmente por contacto sexual. Algunos tipos de VPH se conocen como virus de "bajo riesgo" porque rara vez se convierten en cáncer. Los VPH que tienen más probabilidades de convertirse en cáncer se conocen como virus de "alto riesgo". Tanto los virus de alto riesgo como los de bajo riesgo pueden causar el crecimiento de células anormales, pero generalmente sólo los tipos de VPH de alto riesgo pueden producir cáncer. Los VPH de alto riesgo que se transmiten por contacto sexual son los tipos 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 68, 69 y posiblemente algunos otros. Estos tipos de VPH de alto riesgo causan tumores que son, por Io general, planos y casi invisibles.
Las verrugas genitales (técnicamente conocidas como condilomas acuminados) están relacionadas generalmente con dos tipos de virus del papiloma humano de bajo riesgo, el VPH-6 y el VPH-11. Los VPH son virus de ADN pequeños (50-60 nm) sin envoltura, de doble cadena, con un genoma de ADN circular de 7800 a 7900 pares de base. El genoma contiene tres regiones principales, una que codifica para los genes tardíos, otra que codifica para los genes tempranos y una región no codificante (Park T.W. et al. (1995) Molecular biology of cervical cáncer and its precursors. Cáncer 76:1902-1913). La región de genes tardíos tiene dos frentes de lectura abiertos que codifican para las proteínas de Ia cápsida del virus L1 (mayoritaria) y L2 (minoritaria). La región de genes tempranos incluye seis frentes de lectura abiertos, designados como E1 , E2, E4, E5, E6 y E7. Las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas críticas para Ia replicación viral así como para Ia inmortalización de Ia célula hospedera y su transformación. Los métodos usados comúnmente para tratar las lesiones producidas por VPH son Ia criocirugía (congelamiento que destruye el tejido), el procedimiento de escisión electroquirúrgica con asa (LEEP, siglas en inglés, en el que se extirpa tejido usando un aro de alambre caliente) y Ia cirugía convencional. Tratamientos similares pueden usarse para las verrugas genitales externas. Además, pueden administrarse algunos medicamentos para tratar las mismas (Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines 2002. Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity and Mortality Weekly Report 2002; 51 :1-78).
Recientemente, Ia Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) aprobó una vacuna profiláctica para prevenir las infecciones con los tipos 16 y 18, dos tipos de VPH "de alto riesgo" que causan Ia mayoría (70 por ciento) de los cánceres cervicales, y los tipos 6 y 11 , los cuales causan Ia mayoría (90 por ciento) de las verrugas genitales (Koutsky L.A. et al. (2002) A controlled tria! of a human papillomavirus type 16 vaccine. New England Journal of Medicine 347:1645-1651 ).
Varias vacunas terapéuticas han sido propuestas para el tratamiento de lesiones asociadas al VPH. Por ejemplo Ia patente US 6,306,397 (CSL Limited) describe variantes de E6/E7 de VPH para generar una respuesta inmune celular; WO 93/20844 (Cáncer Research Campaign Technology) se refiere al uso de una vacuna contra VPH basada en Ia proteína E7. Las patentes WO 92/10513 (The University of Queensland); US 5,547,846 (Behringwerke Aktiengeellschaft) y US 6,013,258 (Zycos Inc.) describen péptidos que constituyen el componente antigénico de Ia vacuna contra VPH. La patente US 6,524,825 (Stressgen Biotechnologies) propone el uso de Ia fusión de E7 con Ia proteína de choque por calor (en inglés "Heat Shock Protein, abreviado Hsp) como vacuna para Ia terapia de lesiones producidas por VPH. Los resultados de los ensayos clínicos con estas vacunas terapéuticas contra VPH, así como los resultados de otras vacunas terapéuticas contra cáncer en general, utilizando diferentes antígenos tumorales, han tenido hasta el momento un éxito limitado (DaIIaI R. M. and Lotze MT. (2000) The dendritic cell and human cáncer vaccines Curr Opin Immunol 12:583-588) debido a que Ia respuesta de células T reactivas contra los tumores es muy débil. Por Io tanto, el principal reto de las vacunas de cáncer consiste en Ia ruptura de Ia tolerancia y en Ia generación de una fuerte y duradera inmunidad a través de Ia manipulación del antígeno y del sistema de entrega o reparto del antígeno a Ia célula. La presente invención en contraste al estado de Ia técnica anterior, propone el uso de una nueva familia de PPC y de composiciones que contengan antígenos de VPH fusionados genéticamente a esta nueva familia de PPC, las cuales potencian Ia respuesta inmune celular y antitumoral contra antígenos del VHP y contra células que expongan antígenos del VPH incluyendo tumores asociados al VPH.
Explicación de Ia invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, proporcionando una nueva familia de péptidos penetradores a células (PPC) que pueden ser utilizados como una plataforma para fusionar biomoléculas y lograr una efectiva internalización de drogas en las células. La nueva familia de PPC consiste en el péptido correspondiente a Ia región 32-51 de Ia proteína LALF (SEQ ID NO. 1 ) y los péptidos análogos de éste con sustituciones puntuales de aminoácidos en diferentes posiciones por el aminoácido alanina: L-2 (SEQ ID NO. 2, sustitución en Ia posición 2), L-8 (SEQ ID NO. 3, sustitución en Ia posición 8), L-12 (SEQ ID NO. 4, sustitución en Ia posición 12) y L-20 (SEQ ID NO. 5, sustitución en Ia posición 20).
En una realización particular, Ia presente invención proporciona una composición farmacéutica que contengan antígenos de VPH fusionados genéticamente a Ia familia de PPC anteriormente referida que potencia Ia respuesta inmune contra antígenos del VPH, donde los antígenos proteicos del VPH están unidos covalentamente a Ia familia de PPC. Esta fusión genética garantiza Ia entrega y reparto de antígenos de VPH a células, garantizando el procesamiento de Ia proteína cargo y Ia presentación a las células T de epitopos antigénicos, por un tiempo prolongado que resulta en una respuesta inmune celular y antitumoral potente.
La respuesta inmune puede ser celular, en particular una respuesta citolítica mediada por células contra el antígeno proteico de VPH. Las composiciones pueden ser usadas de manera terapéutica. En Ia aplicación terapéutica, Ia inducción de Ia respuesta inmune en un sujeto se refiere a Ia generación de respuesta que exceda, en tal magnitud y calidad, Ia respuesta previamente inducida por el contacto con antígenos proteicos de VPH exhibidas tanto por el virus, o por el sujeto infectado, o por las células transformadas del sujeto. En esta invención, las composiciones farmacéuticas son utilizadas para generar una respuesta inmune contra las células tumorales que expresan y exhiben un antígeno proteico del VPH. En esta realización, los antígenos proteicos blancos del VPH preferidos para las composiciones son las proteínas virales tempranas E6 y E7 de las cuales se conoce que son consistentemente expresadas en tumores asociados al VPH. En una materialización de Ia invención, las composiciones farmacéuticas comprenden el antígeno proteico E6 o E7 del VPH unido al PPC LALF a nivel de nucleótidos, Io que permite Ia expresión y purificación de una proteína que contiene tanto las secuencias del antígeno E6/E7 y del PPC LALF. La proteína de fusión puede además mezclarse con un adyuvante. Las composiciones pueden ser utilizadas de forma terapéutica en el hospedero previamente infectado con un VPH para prevenir una futura proliferación viral o para eliminar las células que proliferen como una consecuencia de Ia infección por VPH, incluyendo tumores que expresen y exhiban un antígeno del VPH o presenten una porción del antígeno. Cuando se refiera aquí a un antígeno proteico del VPH como blanco de una respuesta inmune inducida por las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención, se entiende que el antígeno proteico incluya Ia proteína completa o una porción polipeptídica de Ia proteína del VPH exhibida en Ia superficie del VPH o en Ia célula infectada de un sujeto así como también en un péptido presentado por una célula infectada como un resultado del procesamiento y Ia presentación de proteínas del VPH, por ejemplo, a través de las vías típicas MHC clase I ó II.
Las secuencias genómicas de varios tipos diferentes de VPH se clonaron y caracterizaron por análisis de secuencias de ADN. Vectores de bacteria que contienen el genoma completo o parcial del VPH están disponibles en varias fuentes que incluyen Ia Colección de Cultivo de Tejidos de América (en inglés "American Type Culture Collection", abreviado ATCC). Algunos tipos adicionales de VPH útiles para Ia práctica de Ia presente invención pueden ser aislados y tipados por métodos que han sido previamente establecidos para estos propósitos, cuyos métodos son bien conocidos en el estado del arte. De particular importancia en Ia aplicación de Ia presente invención para el tratamiento terapéutico del cáncer asociado al VPH es Ia observación de que las proteínas E6 y E7 son consistentemente expresadas en el cáncer de cervix (Zur Hausen H. (1987) Papillomaviruses in human cáncer. Appl Pathol 5:19-24; Pater M. M., Pater A. (1985) Human papillomavirus types 16 and 18 sequences in carcinoma cell lines of the cervix. Virology 145:313-318). Finalmente, los estudios en modelos animales han demostrado que Ia inmunización con Ia proteína E7 protege los ratones contra el reto de células de pulmón transformadas con el activo c-Ha-ras y los genes VPH E6/E7 (Lin K. Y. et al. (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class Il presentation of tumor antigen. Cáncer Res. 56:21-26). Teniendo en cuenta que estas proteínas son típicamente expresadas en el cáncer que aparecen como una consecuencia de Ia infección con VPH, que las mismas proteínas son también los oncogenes que juegan el rol principal en el desarrollo y mantenimiento de este cáncer, y que Ia respuesta inmune puede estar dirigida contra estas proteínas, Ia E6 y Ia E7 son los blancos preferidos para Ia inmuno intervención, y por ende, son los antígenos proteicos de VPH preferidos de las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención para ser usados en el tratamiento del cáncer asociado a VPH. La composición farmacéutica descrita aquí puede ser utilizada para potenciar una respuesta inmune, particularmente una respuesta citolítica mediada por células, contra un VPH, o una célula infectada o transformada por VPH que exprese un antígeno de VPH. La misma puede ser administradas a los hospederos por varias vías (intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural e intranasal). También puede ser utilizada alguna otra vía de administración que convenga, por ejemplo, infusión o inyección en forma de bolo, o absorción a través del epitelio o del revestimiento mucocutáneo. Además, Ia composición descrita aquí puede contener y ser administrada conjuntamente con adyuvantes. Además puede ser utilizada ex vivo como una vía de estimulación de las células blancas de Ia sangre obtenidas de un sujeto para inducir, expandir y propagar, in vitro, células inmune específicas contra un antígeno de VPH que subsecuentemente son reintroducidas en el sujeto.
La cantidad efectiva es Ia cantidad que al ser administrada resulta en Ia inducción de una respuesta inmune. Además Ia cantidad de Ia composición farmacéutica administrada al hospedero puede variar en dependencia de varios factores, que incluyen el antígeno o los antígenos proteicos de VPH empleados, Ia talla, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta así como también su nivel de respuesta inmunológica en general.
Breve descripción de las figuras: Figura 1. Imagen por microscopía de fluorescencia que demuestra Ia capacidad del PPC LALF de penetrar a Ia célula.
1- LALF en J774 a 370C por 10 mm
2- LALF en J774 a 370C por 20 mm
3- LALF en J774 a 370C por 30 mm 4- LALF en J774 a 40C por 10 mιn
5- LALF en J774 a 40C por 20 mm
6- LALF en J774 a 40C por 30 mm
7- LALF en CaSki a 370C por 30 min
8- LALF en CaSki a 370C por 1 h 9- LALF en CaSki a 370C por 2 h
10- LALF en HeLa a 370C por 30 mm
11- LALF en HeLa a 370C por 1 h
12- LALF en HeLa a 370C por 2 h
13- LALF en TC-1 a 370C por 30 mm 14- LALF en TC-1 a 370C por 1 h
15- LALF en TC-1 a 370C por 2 h
16- L-2 en Hep-2 a 370C por 30 min
17- L-2 en Hep-2 a 370C por 1 h
18- L-2 en Hep-2 a 370C por 2 h 19- L-20 en Hep-2 a 370C por 30 mιn 20- L-20 en Hep-2 a 370C por 1 h
21- L-20 en Hep-2 a 370C por 2 h
22- Células J774 (control negativo)
23- Peptido no relacionado em J774 a 370C por 2 h Figura 2. Imagen por microscopía confocal de fluorescencia que demuestra Ia capacidad de L-2 y L-20 de penetrar a Ia célula
1a y 1b Células no tratadas (control negativo)
2a y 2b Células tratadas durante 10 min con péptido L-2
3a y 3b Células tratadas durante 10 min con péptido L-20 4a y 4b Células tratadas durante 30 min con péptido L-2
5a y 5b Células tratadas durante 30 min con péptido L-20
6a y 6b Células tratadas durante 1 hora con péptido L-2
7a y 7b Células tratadas durante 1 hora con péptido L-20
8a y 8b Células tratadas durante 18 horas con péptido L-2 9a y 9b. Células tratadas durante 18 horas con peptido L-20
Figura 3. Representación esquemática de Ia construcción pPEPE7M-7
Figura 4. Imagen por microscopía de fluorescencia que demuestra Ia capacidad del LALF-E7 de internalizar a Ia célula Ia proteína cargo (E7)
1- LALF-E7 en J774 a 370C por 30 min 2- LALF-E7 en J774 a 370C por 1 hora
3- LALF-E7 en J774 a 370C por 2 horas
4- E7 en J774 a 370C por 2 horas
5- PBS en J774 a 370C por 2 horas
6- CasKi Figura 5. Western blot que demuestra Ia internalización de Ia proteína de fusión LALF-E7 en Ia célula
1- J774
2- J774 + E7
3- J774 + LALF-E7 4- LALF-E7
Figura 6. Imagen por microscopía de fluorescencia que demuestra Ia capacidad del LALF-GFP de internalizar en Ia célula Ia proteína cargo (GFP)
1- LALF-GFP
2- LALF biotinilado 3- GFP
4- PBS
Figura 7. Gráfico que muestra el efecto del tratamiento con LALF-E7 sobre el volumen de tumores establecidos de células TC-1 en los animales Figura 8. Gráfico que demuestra que el efecto del tratamiento con LALF-E7 sobre el volumen de tumores establecidos de células TC-1 en los animales es dependiente de Ia fusión covalente. Figura 9. Gráfico que muestra el conteo de células formadoras de puntos (SFC) efectoras por 106 de un pool de esplenocitos de 3 ratones inmunizados con diferentes preparaciones
Ejemplos de Realización.
Ejemplo 1. Internalización del PPC LALF o sus análogos a células de diferente origen histológico
Diferentes líneas celulares se utilizaron en esta realización (Tabla 1 ). Las células se cultivaron sobre cubre objetos estériles de 22 mm durante toda Ia noche a 370C y 5% de CO2 en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado y 2 mM de glutamina. Posteriormente se Ie añadieron 25 ó 50 μM de PPC LALF o sus análogos biotinilados L-2 y L-20 y se incubaron a 370C y a 40C y a diferentes tiempos (10 min, 20 min, 30 min, 1 hora y 2 horas). Las células se lavaron suavemente con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehido por 20 min a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. La permeabilización de las células se realizó con 0,5% Tritón X-100 por 15 min a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. El bloqueo se realizó con 1 % SFB en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Incubar con 1 :50 000 estreptavidina-fluoresceína en PBS por 45 minutos en una cámara oscura. Lavar extensivamente con PBS. Montar los cubre objetos sobre portaobjetos con medio de montaje acuoso. Examinar utilizando un microscopio de fluorescencia con el filtro apropiado. Tabla. 1
Internalización del PPC LALF o sus análogos a células de diferente origen histológico.
Figure imgf000010_0001
Como control negativo se utilizó un péptido no relacionado biotinilado y células solas sin péptidos.
Los resultados obtenidos (Figura 1) mostraron que el PPC LALF y sus análogos se internalizan en diferentes tipos de células y a cortos tiempos de incubación (30 min). Adicionalmente en las células J774 se pudo evidenciar que el PPC LALF es capaz de penetrar al interior de Ia célula con 10 minutos de incubación y a una temperatura de 40C, Io que confirma las características de estos péptidos como PPC cuya vía utilizada para Ia internalización es independiente de Ia endocitosis. Estos resultados son similares cuando se utilizan los análogos L-8 y L-12.
Ejemplo 2. Internalización de los análogos de L-2 y L-20 a células de esplenocitos de ratón
Para Ia obtención de los esplenocitos, los ratones C57BL/6 fueron eutanizados por dislocación de Ia cervical y los bazos fueron removidos asépticamente. Las suspensiones celulares de los animales extraídas de los bazos se reunieron en un pool y se homogenizaron suavemente. Los esplenocitos se lavaron y los eritrocitos se usaron con una solución de NH4CI 0,83%. Posteriormente se lavaron y finalmente se separaron en tubos diferentes con 20x106 de células totales resuspendidas en 10 mL de medio fresco de RPMI 1640 suplementado con 7% de suero fetal bovino (en inglés "Fetal Bovine Serum", abreviado FBS). Cada preparación se incubó con 0,8 mg de los péptidos biotinilados L-2 (278 μM) y L-20 (280 μM) a diferentes tiempos: 10 minutos, 30 minutos, 1 hora y 18 horas. Las incubaciones se realizaron a 370C y 5% de CO2. Las células se montaron en un porta objeto, se fijaron y permeabilizaron. Las células se trataron con loduro de propidio para teñir el núcleo y con estreptavidina- fluoresceína para detectar los péptidos en el interior de las células. Los resultados obtenidos a partir de Ia observación por microscopía confocal (Figura 2) mostraron que los péptidos L-2 y L-20 se internalizan y a cortos tiempos de incubación (30 min). Estos resultados son similares cuando se utilizan el PPC LALF y los análogos L-8 y L-12.
Ejemplo 3. Clonaje y expresión de Ia proteína de fusión recombinante PPC LALF o sus análogos con E7 Para obtener Ia fusión recombinante de PPC LALF con Ia proteína E7 se partió de Ia síntesis química de las dos cadenas de ADN de cada uno de los componentes de Ia fusión por separado. El fragmento de ADN PPC LALF (SEQ ID NO. 6) porta en los extremos 5' y 3', los sitios de restricción abiertos Ncol y Hindlll, respectivamente. La secuencia de ADN del gen E7 de HPV 16 porta en los extremos 5' y 3', los sitios de restricción abiertos Hindlll y BamHI, respectivamente. También contiene en el triplete que codifica para Ia primera cisteína de Ia E7 una sustitución de Ia base T por una G1 para eliminar el sitio de unión de Ia E7 a Ia proteína Rb (SEQ ID NO. 7). Ambos fragmentos sintéticos se insertaron con el uso de Ia T4 ligasa en el vector pM238 (Yero D. et al (2006) Bicistronic expression plasmid for the rapid production of recombinant fused proteins in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 44:27- 34) previamente digerido con Ncol y BamHI. Este vector contiene el promotor triptofano de E. coli y Ia señal de terminación del bacteriófago T4 (terminador T4) que Ie permite ser utilizado para Ia expresión de proteínas en E. coli. Además contiene una secuencia de 6 histidinas a continuación del extremo 3' del inserto y comprendida en Ia región de ADN codificante, que permite Ia posterior purificación de Ia proteína por cromatografía de unión a metales. La reacción de Ia ligazón fue transformada en una preparación de células competentes de E. coli. Las colonias obtenidas fueron examinadas mediante análisis con 5 enzimas de restricción. Además, los clones positivos fueron examinados mediante secuenciación de cadena doble, utilizando para ello un oligonucleótido de 27 bases (SEQ ID NO. 8) que produce hibridación con Ia E7, con Io que se corroboró Ia fusión correcta (SEQ ID NO. 9 y 10) y Ia sustitución de Ia cisteína por una glicina en el sitio de unión a a Ia proteína Rb. El clon seleccionado (Figura 3) se denominó pPEPE7M-7.
Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20. Ejemplo 4. Fermentación y purificación de Ia proteína de fusión recombinante PPC LALF o sus análogos con E7
El plasmidio pPEPE7M-7 se transformó en Ia cepa de E. coli BL-21. Las bacterias trasformadas se sometieron a procesos de fermentación en medio mínimo compuesto por M9 salt y suplementado con 0,1 mM CaCI2; 1 mM MgCI2; 1 % glucosa; 1 % hidrolizado de caseína; 0,5% triptona y 100 μg/mL de ampicülina durante 24 horas a 370C con una agitación de 250 rpm. A las 9 horas de comenzada Ia fermentación y cuando el cultivo alcanza aproximadamente una densidad óptica a 620 nm de 1 , se Ie adiciona 40 μg/mL de ácido indolacrílico para inducir Ia expresión de Ia proteína recombinante. Dicha inducción se mantuvo durante 15 horas. La sedimentación de las células se realizó por una centrifugación de 10 000 rpm por 20 minutos a 40C. Cinco gramos de biomasa se resuspendieron en 25 mL de una solución tampón de 50 mM NaH2PO4¡ 0,3 M NaCI; pH 8 y se sometieron a una ruptura celular por ultrasonido (0,5 ciclos, 70 amplitud por 1 minuto). El proceso de ruptura se repitió 5 veces. Las células rotas se homogenizaron y centrifugaron a 10000 rpm por 30 minutos a 40C. Se eliminó el sobrenadante de esta centrifugación y se colectó Ia fracción insoluble que contiene Ia proteína recombinante para su purificación posterior. Tres gramos de Ia fracción insoluble se lavaron con 30 mL de Ia solución tampón 50 mM Tris-HCI; 3 mM EDTA; 0,8 M NaCI; 0,01 M MgCI2; 0,1 % NP40 y Ia homogenización se realizó en un Politrón a una velocidad de rotación de 9500 rpm por 1 minuto. El homogenizado se centrifugó a 10000 rpm por 20 minutos a 40C. Se eliminó el sobrenadante de Ia centrifugación y Ia fracción insoluble se resuspendió en el mismo volumen de Ia solución tampón. El mismo proceso se repitió 2 veces. Seguidamente el homogenizado se centrifugó a 10000 rpm por 20 minutos a 40C. Se eliminó el sobrenadante y Ia fracción insoluble se resuspendió en 30 mL de solución tampón de 50 mM NaH2PO4; 0,3 M NaCL; pH 8 y Ia homogenización se realizó como se describió con anterioridad. El homogenizado se centrifugó a 10000 rpm por 20 minutos a 40C. Para realizar Ia extracción de Ia proteína de Ia fracción insoluble, 1 gramo de Ia misma se resuspendió en 100 mL de urea 4 M en buffer 50 mM NaH2PO4; 0,3 M NaCI, pH 8. La homogenización se realizó con un Politrón a una velocidad de rotación de 9500 rpm por 1 minuto. Posteriormente Ia extracción se centrifugó a 10000 rpm 20 minutos a 40C. En Ia fracción soluble se encuentra Ia proteína de interés Ia cual se aplicó a una columna de Ni-NTA (His-Select ™ Nickel Affinity GeI, Sigma) equilibrada con urea 4 M en buffer 50 mM NaH2PO4; 0,3 M NaCL; pH 8 y 5 mM imidazol. La columna se lavó con Ia misma solución de equilibrio pero con 40 mM de imidazol y Ia proteína se eluyó con 250 mM de imidazol. El eluato fue sometido a un proceso de diálisis con un buffer de Tris 1x pH 8,4 empleando una membrana de 10 μm de diámetro del poro. Por último Ia proteína se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 μm.
Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.
Ejemplo 5. Demostración por microscopía de fluorescencia que el PPC LALF o sus análogos internaliza Ia proteína cargo E7 a Ia célula Las células J774 se cultivaron sobre cubre objetos estériles de 22 mm durante toda Ia noche a 370C y 5% de CO2 en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado y 2 mM de glutamina. Posteriormente, diferentes cubre objetos se incubaron independientemente con 1 ,66 μM de Ia proteína de fusión LALF-E7, 1 ,66 μM de Ia proteína E7 y PBS (como control negativo) a 370C por 30 min, 1 hora y 2 horas. Como control positivo se cultivaron también células CasKi (células humanas que expresan VPH 16) que se mantuvieron en las mismas condiciones experimentales. Después de los tiempos de incubación las células se lavaron suavemente con PBS y _se- fijaron con 4% de paraformaldehido por 20 min a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. La permeabilización de las células se realizó con 0,5% Tritón X-100 por 15 min a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Posteriormente se realizó el bloqueo con 1 % SFB en PBS por 1 hora a temperatura ambiente y después se realizaron tres lavados con PBS. Las muestras se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal IgG anti-E7 de HPV 16 (Santa Cruz) obtenido en cabra y diluido en PBS (1 :50). Posteriormente, seguido tres lavados con PBS, las muestras se incubaron por 45 minutos, a temperatura ambiente y en una cámara oscura con un anticuerpo anti-lgG de cabra obtenido en burro conjugado con fluoresceína (Santa Cruz) y diluido en PBS (1 :50). Finalmente, después de varios lavados con PBS, los cubre objetos se prepararon con medio de montaje acuoso y se examinaron utilizando un microscopio de fluorescencia con el filtro apropiado. Los resultados obtenidos (Figura 4) mostraron células fluorescentes solamente en el caso de Ia incubación de las células J774 con Ia fusión LALF-E7 similar al obtenido en las células CasKi como control positivo. No se observaron células fluorescentes con Ia incubación de J774 con E7 y con PBS. Estos resultados demuestran que Ia proteína E7 logra su internalización a Ia célula solo en el caso cuando está fusionada al LALF.
Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20. Ejemplo 6. Demostración por Western blot que el PPC LALF o sus análogos internaliza Ia proteína cargo E7 a Ia célula
Las células J774 se cultivaron sobre cubre objetos estériles de 22 mm durante toda Ia noche a 370C y 5% de CO2 en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado y 2 mM de glutamina. Posteriormente se separaron en tres alícuotas de 5x106 células. Las mismas se incubaron por separado con 25 μM de Ia proteína de fusión LALF-E7, 25 μM de Ia proteína E7 y PBS durante 4 horas a 370C. Posteriormente las células se centrifugaron a 1000 rpm por 10 minutos. El pellet de lavó tres veces con PBS. Posteriormente las células se resuspendieron en 100 μL de buffer RIPA (Promega) y se sometieron a 3 ciclos de vortex por 10 segundos y 2 minutos en hielo. Las células rotas se centrifugaron a 12000 rpm por 15 minutos para separar el extracto celular. Al mismo se Ie determinó Ia concentración de proteínas y se aplicaron 10 μg de proteína total en un gel de electroforesis de poliacrilamida al 15%. Posteriormente el gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y Ia misma después de bloqueada se incubó con un anticuerpo policlonal IgG anti-E7 de HPV 16 (Santa Cruz) obtenido en cabra y diluido en PBS (1 :100) por 2 horas a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Posteriormente Ia membrana se incubó por 45 minutos a temperatura ambiente y en una cámara oscura con un anticuerpo anti-lgG de cabra conjugado con peroxidasa (Sigma) y diluido en PBS (1 :5000). Después de varios lavados el revelado se efectuó utilizando el sistema ECL de Amersham Pharmacia Biotech). Como se observa en Ia Figura 5 se pudo extraer cantidades suficientes de Ia proteína de fusión (LALF-E7) del interior de las células J774 después de un corto tiempo de incubación in vitro de las células con Ia proteína, Ia cual fue reconocida por el anticuerpo anti-E7. Sin embargo no se detectó ningún reconocimiento en el carril donde se aplicó el extracto de las células incubadas con Ia proteína E7 y PBS.
Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20. Ejemplo 7. Demostración por microscopía de fluorescencia que el PPC LALF o sus análogos internaliza Ia proteína cargo GFP a Ia célula
La proteína obtenida en E. coli a partir de Ia fusión recombinante LALF-GFP (GFP-del inglés, green fluorescence protein) se utilizó para verificar que el PPC LALF o sus análogos podía internalizar Ia proteína cargo.
La GFP (GenBank Accession # U55762) se obtuvo con el uso de Ia reacción en cadena de Ia polimerasa a partir del plasmidio pEGFP-N1 de Clontech utilizando los oligonucléotidos con SEQ ID NO. 11 y 12. Ambos oligonucléotidos tienen sitios de restricción utilizados para el clonaje (Hindlll- con sentido y BamHI- con el antisentido).
Para obtener Ia fusión recombinante el fragmento sintético LALF y el gen de GFP obtenido por PCR se insertaron con el uso de Ia T4 ligasa en el vector pM238 de manera similar que en el ejemplo III. El clon recombinante aparece identificado con las SEQ ID NO. 13 y 14. Después de obtener Ia proteína recombinante purificada LALF-GFP se realizó un experimento similar al del ejemplo V, pero en este caso las células J774 se incubaron con LALF-GFP, LALF biotinilado, GFP y PBS.
Los resultados obtenidos (Figura 6) mostraron células fluorescentes cuando las células J774 se incubaron con Ia fusión LALF-GFP, muy similar a los obtenidos con el LALF-biotinilado. No se observaron células fluorescentes con Ia incubación de J774 con GFP y con PBS. Estos resultados demuestran que Ia proteína cargo, en este caso Ia GFP logra su internalización a Ia célula solo cuando Ia misma está fusionada al LALF. Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.
Ejemplo 8. Tratamiento de tumores establecidos en ratones con Ia fusión de PPC LALF o sus análogos con E7
Para observar Ia regresión de tumores establecidos a partir del tratamiento con Ia fusión proteica LALF-E7 recombinante y valorar Ia fortaleza de Ia misma, se utilizó Ia línea celular tumoral TC-1 que expresa Ia proteína E7 de VPH-16. La misma se derivó de un cultivo primario de células de pulmón de ratones C57BL/6 a través de Ia inmortalización y transformación de las células con los genes E6 y E7 de VPH-16 y un gen humano activado c-Hras como se describió en Lin K.Y. et al. (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class Il presentation of tumor antigen. Cáncer Res. 56:21-26. Para Ia inoculación de los tumores, las células TC-1 , suministradas por el Dr. T.-C. Wu (The Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Md.), fueron crecidas hasta un 60-70% de confluencia en medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales, glutamina, piruvato, gentamicina, beta-mercaptoetanol y 0,4 mg/mL de Geneticin a 370C. Las células se cosecharon por tripsinización y se resuspendieron en una solución de buffer Hank a 2,5x105 células/mL. Ratones C57BL/6 se inocularon de forma subcutánea en Ia pata posterior derecha con 2x105 de TC-1 en volúmenes de 0,2 ml_. A los 10 días, cuando todos los animales habían desarrollado tumores palpables, los animales fueron asignados arbitrariamente a cuatro grupos de tratamientos. Cada grupo incluía 10 animales. Se realizaron dos inmunizaciones, cada 14 días. El grupo 1 se inmunizó con Ia proteína recombinante LALF-E7; el grupo 2 con Ia proteína E7 recombinante; el grupo 3 con el péptido sintético LALF y el grupo 4 con PBS. Las inmunizaciones se realizaron de forma subcutánea en el flanco del ratón y en volúmenes de 0,2 mL.
La cinética tumoral en los diferentes grupos se siguió por el volumen tumoral el cual se determinó utilizando un pié de rey digital y tomando las medidas en dos direcciones ortogonales. Los volúmenes (mm3) se calcularon a partir de esta medición utilizando Ia fórmula de conversión (largo x ancho2)/2. El volumen promedio de cada grupo +/- Ia desviación estándar a los 30 días de inoculado los tumores están representados en Ia Figura 7. Los resultados demuestran que el tratamiento con LALF-E7 resultó en una completa inhibición del crecimiento de los tumores establecidos. Los efectos en Ia disminución del volumen de los tumores resultantes por el tratamiento con LALF-E7 son estadísticamente significativos de los efectos obtenidos sobre el crecimiento de los tumores por los otros tratamientos con E7, LALF y PBS (p<0,01). Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.
Ejemplo 9. Tratamiento tumores establecidos en ratones con Ia fusión de PPC LALF o sus análogos con E7 (LALF-E7) y Ia mezcla de PPC LALF o sus análogos con E7 (LALF+E7) Para estudiar si el efecto antitumoral del LALF-E7 estaba asociado a Ia unión covalente de ambas moléculas, se realizó un experimento en el cual los ratones recibieron tratamiento de LALF y de E7, que se mezclaron en el momento previo a su uso y en cantidades equimolares que permitiera una comparación con los ratones que recibieron Ia proteína de fusión LALF-E7. En esta realización los ratones C57BL/6 se inocularon con 2x105 células TC-1 de forma subcutánea en Ia pata posterior derecha. A los 10 días, cuando todos los animales habían desarrollado tumores palpables, los animales fueron asignados arbitrariamente a cinco grupos de tratamientos. Cada grupo incluía 10 animales. Se realizaron dos inmunizaciones, cada 14 días.
Cada grupo incluía 10 animales. Se realizaron dos inmunizaciones, cada 14 días. El grupo 1 fue inmunizado con Ia proteína de fusión LALF-E7; el grupo 2 con Ia mezcla LALF+E7; el grupo 3 con LALF; el grupo 4 con E7 y el grupo 5 con PBS. Las inmunizaciones se realizaron de forma subcutánea en el flanco del ratón y en volúmenes de 0,2 mL. La cinética tumoral en los diferentes grupos se siguió por el volumen tumoral el cual se determinó y calculó como se describió previamente en el Ejemplo 9. El volumen promedio de cada grupo +/- Ia desviación estándar a los 30 días de inoculado los tumores están representados en Ia Figura 8. Los resultados obtenidos demostraron que los efectos en Ia disminución del volumen de los tumores se observa solamente con el tratamiento de los ratones con Ia fusión covalente LALF-E7, cuyos resultados fueron estadísticamente significativos al compararlos con los volúmenes resultantes de los tratamientos con Ia mezcla de LALF+E7, LALF, E7 y PBS (p<0,01 ). Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.
Ejemplo 10. Comparación de Ia capacidad de las preparaciones farmacéuticas para inducir una respuesta inmune celular. Para evaluar Ia respuesta inmune celular contra el antígeno E7 de VPH-16, 4 grupos de 3 ratones hembras C57BL/6, de 6 a 8 semanas de nacidos, recibieron 2 dosis de ¡nmunógenos.
El grupo 1 se inmunizó con 30 μg de Ia proteína recombinante LALF-E7; el grupo 2 con 30 μg de Ia proteína recombinante E7; el grupo 3 con 8 μg del péptido sintético LALF y el grupo 4 con PBS. Las inmunizaciones se realizaron de manera subcutánea en el flanco del animal con volúmenes de 0,2 ml_ y sin adyuvantes. Se administraron dos dosis cada 14 días. Siete días después de Ia segunda inmunización, los ratones fueron eutanizados por dislocación de Ia cervical y los esplenocitos fueron removidos asépticamente para su posterior análisis en un ensayo de ELISPOT anti-gamma interferón (anti-IFN-γ). Las suspensiones celulares de los animales por cada grupo se reunieron en un pool y se homogenizaron suavemente. Los esplenocitos se lavaron y los eritrocitos se usaron con una solución de NH4CI 0,83%. Posteriormente se lavaron y finalmente se resuspendieron en un medio fresco de RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (en inglés "Fetal Bovine Serum", abreviado FBS) y 10 U/mL de IL-2 humana (hlL-2). Células de ratón EL4 (H-2b), que no expresan epitopos de E7 de VPH-16 fueron utilizadas como células blanco, las cuales fueron previamente pulsadas a una concentración de 10 μM con el péptido 49RAHYNIVTF57 correspondiente al epítopo CTL de ratón C57BL/6, H- 2b (Feltkamp M. C. et al. (1993) Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. Eur. J. Immunol. 23:2242-2249). Posteriormente las células se suspendieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y hlL-2, las que se utilizaron como células presentadoras de antígeno. Las células EL4 no pulsadas fueron también incluidas para Ia determinación del fondo de células secretoras de IFN-γ.
El ensayo para Ia determinación de secreción de IFN-γ se realizó como se describió previamente (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of a strong HlV-specific CD8+ T cell response ¡n mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi-CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337- 356). Las placas de 96 pozos con el fondo recubierto con papel de nitrocelulosa se recubrieron con 100 μL de 5 μg/mL del Ab de captura y se incubaron durante toda Ia noche a 40C. Después de tres lavados con PBS, las placas se bloquearon con RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% a 370C por una hora. Los esplenocitos (106, 2x105 y 4x104 células por pozo) y las células blanco EL4 (105 por pozo) fueron añadidas respectivamente en un volumen final de 0,2 mL y co-incubadas en duplicado a 370C y 5% de CO2 por 17 horas. Después de Ia incubación, se realizó un ensayo de ELISPOT estándar (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of a strong HIV-spec¡f¡c CD8+ T cell response in mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi- CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337-356). Para las determinaciones de linfocitos re-estimulados in vitro, 2,8x107 de células de esplenocitos de cada condición se incubaron con células blancos EL4 cargadas con el péptido y con hlL-2, durante 7 días a 370C, en una atmósfera húmeda y con 5% de CO2. Después de este tiempo, las células supervivientes fueron contadas y utilizadas para determinaciones de ELISPOT bajo las mismas condiciones. Los resultados se expresaron como el número de células formadoras de puntos (en inglés "Spot Forming CeIIs", abreviado SFC) por 106 esplenocitos. El número de SFC se obtuvo a partir del conteo de los puntos por medio de un estereoscopio y Ia frecuencia se obtiene de relacionar el número de ellos con el número de células incubadas en cada pozo. Se consideraron positivo aquellos valores que fueran el doble del control negativo (EL4 sin péptido) más 10 SFC.
Como se muestra en Ia Figura 9 el número de células efectoras secretoras (SFC) de γ-IFN fue superior aproximadamente hasta 8 veces en el grupo inmunizado con LALF-E7 respecto al resto de los grupos inmunizados. Estos resultados demuestran Ia existencia de una respuesta efectiva de linfocitos CD8 en los animales tratados con LALF-E7.
Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizan cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición que contiene un péptido penetrador a células, donde dicho péptido puede ser el LALF, sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 o el LALF modificado asociado a una biomolécula.
2. Composición según Ia reivindicación 1 , donde Ia asociación del péptido penetrador a células con Ia biomolécula es mediante Ia unión covalente o Ia conjugación.
3. Composición según Ia reivindicaciones 1 y 2, donde el péptido penetrador a células está asociado a un antígeno.
4. Composición según Ia reivindicación 3, donde el antígeno es un antígeno viral, bacteriano o tumoral.
5. Composición según Ia reivindicación 4, donde el antígeno es un antígeno de VPH.
6. Composición según Ia reivindicación 5, donde el antígeno de VPH es Ia proteína E6 y E7.
7. Composición según Ia reivindicación 2, donde el péptido penetrador a células asociado con el antígeno se mezcla con un adyuvante.
8. Composición según Ia reivindicación 7, donde el adyuvante es un adyuvante incompleto, completo o de naturaleza polipeptídica.
9. Péptido penetrador a células según las reivindicaciones 1 y 6 caracterizado porque es Ia fusión del péptido LALF a Ia proteína E7 del antígeno de VPH 16 y tiene Ia Seq. No. 10.
10. Uso de una composición farmacéutica según las reivindicaciones anteriores, para inducir una respuesta inmune contra un antígeno proteico del VPH, mediante administración en humano de cantidades efectivas.
11. Método de tratamiento de un tumor que exprese un antígeno proteico de VPH, que comprende Ia administración de las composiciones de las reivindicaciones anteriores en humano, de cantidades efectivas para potenciar Ia respuesta inmune celular contra el VPH.
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