JP2001252087A - インスリン様成長因子（ｉｇｆ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ａｌｓ） - Google Patents
インスリン様成長因子（ｉｇｆ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ａｌｓ）Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複
合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）の特徴付け。 【解決手段】 XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyPro
AlaCysProAlaAlaCys−［XaaはGlyまたはAla］（配列番
号：１）で表される部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有
し、生物学的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合
蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を提供す
る。
合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）の特徴付け。 【解決手段】 XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyPro
AlaCysProAlaAlaCys−［XaaはGlyまたはAla］（配列番
号：１）で表される部分的Ｎ−末端アミノ酸配列を有
し、生物学的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合
蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、従来知られておら
ず、特徴付けされたことがないポリペプチド（以下、イ
ンスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複合体の酸不安
定サブユニット（ＡＬＳ）という）に関する。
ず、特徴付けされたことがないポリペプチド（以下、イ
ンスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合蛋白複合体の酸不安
定サブユニット（ＡＬＳ）という）に関する。
【０００２】
【従来の技術】インスリン様成長因子（ＩＧＦ）族のペ
プチド類は、その構造およびその多くの作用の双方にお
いてインスリンに類似する。該ＩＧＦ族はＩＧＦ−Ｉお
よびＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ類）と命名された２種のメン
バーよりなる。該ＩＧＦ類は同化性インスリン様作用
（例えばアミノ酸輸送およびグリコーゲン合成の刺
激）、細胞分裂誘起活性および細胞分化の刺激を含めた
生物学的活性の広範囲なスペクトルを呈する。
プチド類は、その構造およびその多くの作用の双方にお
いてインスリンに類似する。該ＩＧＦ族はＩＧＦ−Ｉお
よびＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ類）と命名された２種のメン
バーよりなる。該ＩＧＦ類は同化性インスリン様作用
（例えばアミノ酸輸送およびグリコーゲン合成の刺
激）、細胞分裂誘起活性および細胞分化の刺激を含めた
生物学的活性の広範囲なスペクトルを呈する。
【０００３】ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、広
範に特徴付けがされており、ほぼ７．６Ｋｄ（ＩＧＦ−
Ｉ）および７．４７Ｋｄ（ＩＧＦ−ＩＩ）の分子量を有
することが判明している。ほとんどのペプチドホルモン
類と異なり、ＩＧＦ類は１種またはそれ以上の結合蛋白
と連結して循環系(ｉｎ ｖｉｖｏ)および細胞培養培地
で見い出される。ＩＧＦ類と連結した結合蛋白または結
合蛋白類の性質は論争の主題であった。ウィルキンズ・
ジェイ・ァールおよびデルコール・エイ・ジェイ（Wilk
ins, J.R. and D'Ercole, A.J.)は、（１９８５、ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Clin. Invest., ７５, １３５０〜１３５８)、ＩＧ
Ｆのｉｎ ｖｉｖｏ形態は２４Ｋｄないし２８Ｋｄの分
子量を有する６個の同一サブユニットと連結したＩＧＦ
よりなる複合体であることを提唱している。第２の提唱
において、ＩＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態は酸安定結合蛋
白および酸不安定蛋白と連結してほぼ１５０Ｋｄの複合
体を生成すると言われている（フルランネット・アール
・ダブリュー（Furlanetto,R.W.）（１９８０）、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド
・メタボリズム（J. Clin. Endocrinol.Metab.), ５
１，１２〜１９）。
範に特徴付けがされており、ほぼ７．６Ｋｄ（ＩＧＦ−
Ｉ）および７．４７Ｋｄ（ＩＧＦ−ＩＩ）の分子量を有
することが判明している。ほとんどのペプチドホルモン
類と異なり、ＩＧＦ類は１種またはそれ以上の結合蛋白
と連結して循環系(ｉｎ ｖｉｖｏ)および細胞培養培地
で見い出される。ＩＧＦ類と連結した結合蛋白または結
合蛋白類の性質は論争の主題であった。ウィルキンズ・
ジェイ・ァールおよびデルコール・エイ・ジェイ（Wilk
ins, J.R. and D'Ercole, A.J.)は、（１９８５、ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Clin. Invest., ７５, １３５０〜１３５８)、ＩＧ
Ｆのｉｎ ｖｉｖｏ形態は２４Ｋｄないし２８Ｋｄの分
子量を有する６個の同一サブユニットと連結したＩＧＦ
よりなる複合体であることを提唱している。第２の提唱
において、ＩＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態は酸安定結合蛋
白および酸不安定蛋白と連結してほぼ１５０Ｋｄの複合
体を生成すると言われている（フルランネット・アール
・ダブリュー（Furlanetto,R.W.）（１９８０）、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド
・メタボリズム（J. Clin. Endocrinol.Metab.), ５
１，１２〜１９）。
【０００４】本発明者らは、以前、分子当たり単一のＩ
ＧＦ−結合部位を有し、ＩＧＦの１５０Ｋｄ ｉｎ ｖ
ｉｖｏ形態に免疫学に関連し、かつほぼ５３Ｋｄの見掛
けの分子量を有する酸安定血清蛋白を同定した（バクス
ター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Ba
xter, R.C., and Martin, J. L.)(１９８６)、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. C
lin. Invest.），７８，１５０４〜１５１２；およびマ
ーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ
（Martin, J. L. and Baxter, R.C.)(１９８６)、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Bio
l. Chem.)，２６１，８７５４〜８７６０）。この５３
Ｋｄ ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５３）はフルラネット（Fu
rlanetto）によって提唱されている酸安定結合蛋白に対
応するらしい。該５３Ｋｄ蛋白は酸安定ＩＧＦ結合蛋白
の族のうち最高の分子量のメンバーである。この族の他
のメンバーはほぼ２０、３４、３６、３０および４７Ｋ
ｄの分子量を有し、かつ集合的に「酸安定ＩＧＦ結合蛋
白」の定義内に入る。
ＧＦ−結合部位を有し、ＩＧＦの１５０Ｋｄ ｉｎ ｖ
ｉｖｏ形態に免疫学に関連し、かつほぼ５３Ｋｄの見掛
けの分子量を有する酸安定血清蛋白を同定した（バクス
ター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Ba
xter, R.C., and Martin, J. L.)(１９８６)、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. C
lin. Invest.），７８，１５０４〜１５１２；およびマ
ーチン・ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ
（Martin, J. L. and Baxter, R.C.)(１９８６)、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Bio
l. Chem.)，２６１，８７５４〜８７６０）。この５３
Ｋｄ ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５３）はフルラネット（Fu
rlanetto）によって提唱されている酸安定結合蛋白に対
応するらしい。該５３Ｋｄ蛋白は酸安定ＩＧＦ結合蛋白
の族のうち最高の分子量のメンバーである。この族の他
のメンバーはほぼ２０、３４、３６、３０および４７Ｋ
ｄの分子量を有し、かつ集合的に「酸安定ＩＧＦ結合蛋
白」の定義内に入る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、今回、
酸不安定蛋白を同定したが、驚くべきことに、ＩＧＦに
よって占められた５３Ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベ
ートした場合、それを１ＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態に対
応する高分子量複合体に変換する。
酸不安定蛋白を同定したが、驚くべきことに、ＩＧＦに
よって占められた５３Ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベ
ートした場合、それを１ＧＦのｉｎ ｖｉｖｏ形態に対
応する高分子量複合体に変換する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の１の態様におい
て、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１）[式中、該最初のアミノ酸Ｘａ
ａはＧｌｙまたはＡｌａを意味する]を有する、生物学
的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合蛋白複合体
の酸不安定サブユニットが（ＡＬＳ）が提供される。
て、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列：
XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１）[式中、該最初のアミノ酸Ｘａ
ａはＧｌｙまたはＡｌａを意味する]を有する、生物学
的に純粋な形態のインスリン様成長因子結合蛋白複合体
の酸不安定サブユニットが（ＡＬＳ）が提供される。
【０００７】本発明のもう１つの態様において、実質的
にインスリン様成長因子結合複合体の酸不安定サブユニ
ット（ＡＬＳ）よりなる組成物(Composition of matte
r)が提供される。
にインスリン様成長因子結合複合体の酸不安定サブユニ
ット（ＡＬＳ）よりなる組成物(Composition of matte
r)が提供される。
【０００８】本発明のもう１つの態様において、３種の
ポリペプチド成分、即ちＩＧＦ、ＢＰ‐５３およびＡＬ
Ｓから復元した組成物が提供される。該組成物は１種ま
たはそれ以上の医薬上許容される担体または添加剤と組
み合わせて処方できる。
ポリペプチド成分、即ちＩＧＦ、ＢＰ‐５３およびＡＬ
Ｓから復元した組成物が提供される。該組成物は１種ま
たはそれ以上の医薬上許容される担体または添加剤と組
み合わせて処方できる。
【０００９】さらに、本発明のもう１つの態様におい
て、（ａ）酸不安定ＩＧＦ結合蛋白に結合したまたはそ
れと連結したＩＧＦを付着させて有する支持マトリック
スにＡＬＳ源を適用し、それにより、適用された物質に
おけるＡＬＳは該酸安定結合蛋白に結合し、非結合物質
は該支持マトリックスから分離され；次いで、（ｂ）該
ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に溶出さ
せ、回収する工程よりなることを持徴とするＡＬＳの製
法が提供される。
て、（ａ）酸不安定ＩＧＦ結合蛋白に結合したまたはそ
れと連結したＩＧＦを付着させて有する支持マトリック
スにＡＬＳ源を適用し、それにより、適用された物質に
おけるＡＬＳは該酸安定結合蛋白に結合し、非結合物質
は該支持マトリックスから分離され；次いで、（ｂ）該
ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に溶出さ
せ、回収する工程よりなることを持徴とするＡＬＳの製
法が提供される。
【００１０】好ましくは、ＡＬＳは、 （ａ）ＩＧＦを支持マトリックスに結合させ； （ｂ）酸安定ＩＧＦ結合蛋白を支持マトリックスに、そ
れがＩＧＦに結合しまたはＩＧＦと連結するように添加
し； （ｃ）ＡＬＳ源を支持マトリックスに適用し、それによ
り適用された物質におけるＡＬＳは酸安定蛋白に結合
し、非結合物質は該支持マトリックスから分離され； （ｄ）該ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に
溶出させ；次いで、 （ｅ）所望により、さらに、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣに
よって回収されたＡＬＳを分画する工程よりなる。
れがＩＧＦに結合しまたはＩＧＦと連結するように添加
し； （ｃ）ＡＬＳ源を支持マトリックスに適用し、それによ
り適用された物質におけるＡＬＳは酸安定蛋白に結合
し、非結合物質は該支持マトリックスから分離され； （ｄ）該ＡＬＳ蛋白を該ＩＧＦ蛋白複合体から選択的に
溶出させ；次いで、 （ｅ）所望により、さらに、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣに
よって回収されたＡＬＳを分画する工程よりなる。
【００１１】本発明のさらなる態様により、体液をサイ
ズ分画マトリックス上で分画して遊離ＡＬＳをインスリ
ン成長因子結合複合体の他の成分から分離し、しかる後
分画された試料中のＡＬＳのレベルを定量することを特
徴とする体液中のＡＬＳレベルを検出する方法が提供さ
れる。
ズ分画マトリックス上で分画して遊離ＡＬＳをインスリ
ン成長因子結合複合体の他の成分から分離し、しかる後
分画された試料中のＡＬＳのレベルを定量することを特
徴とする体液中のＡＬＳレベルを検出する方法が提供さ
れる。
【００１２】本発明のなおさらなる態様において、イン
スリン様成長因子の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を
コード付けする組換え核酸配列が提供される。該組換え
核酸配列は、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ
酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを
意味する]を有する、ポリペプチドをコード付けする。
また、本発明はＡＬＳをコード付けする組換え核酸配列
を含有する発現ベクター、かかるベクターで形質転換し
た宿主細胞、およびかかる宿主細胞によって生産された
場合のＡＬＳに関する。
スリン様成長因子の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）を
コード付けする組換え核酸配列が提供される。該組換え
核酸配列は、好ましくは、以下の部分的Ｎ−末端アミノ
酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを
意味する]を有する、ポリペプチドをコード付けする。
また、本発明はＡＬＳをコード付けする組換え核酸配列
を含有する発現ベクター、かかるベクターで形質転換し
た宿主細胞、およびかかる宿主細胞によって生産された
場合のＡＬＳに関する。
【００１３】本発明のさらにもう１つの態様において、
ＡＬＳの断片よりなるポリペプチド、およびそれをコー
ド付けする配列よりなる核酸を提供し、それらはＡＬＳ
の残基１〜５、２〜７、５〜９、７〜１１、８〜１４、
１１〜１５、１３〜１７、３〜９、２〜８、４〜１０、
６〜１２、８〜１４、１０〜１６、１２〜１８、１〜
６、３〜９、５〜１１、７〜１３、９〜１５、１１〜１
７、４〜９、６〜１１、８〜１３、１０〜１５、または
１２〜１７を包含またはコード付けする。
ＡＬＳの断片よりなるポリペプチド、およびそれをコー
ド付けする配列よりなる核酸を提供し、それらはＡＬＳ
の残基１〜５、２〜７、５〜９、７〜１１、８〜１４、
１１〜１５、１３〜１７、３〜９、２〜８、４〜１０、
６〜１２、８〜１４、１０〜１６、１２〜１８、１〜
６、３〜９、５〜１１、７〜１３、９〜１５、１１〜１
７、４〜９、６〜１１、８〜１３、１０〜１５、または
１２〜１７を包含またはコード付けする。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、ＡＬＳ、ＩＧＦとその
酸安定結合蛋白ＢＰ―５３の間の複合体に結合し、かつ
それをｉｎ ｖｉｖｏで安定化するポリペプチド関す
る。ＢＰ−５３は糖蛋白である。即ち、１種またはそれ
以上の炭水化物鎖はＢＰ−５３ポリペプチド配列と連結
する。酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ‐５３について
言及する場合、インスリン様成長因子に結合でき、かつ
ＡＬＳとＩＧＦとの複合体を形成できる酸安定蛋白をい
うと理解されたい。該酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ
−５３がこれらの機能を満足する限り、それはグリコシ
ル化されていなくても、部分的にグリコシル化されてい
るものであっても、アノ酸欠失または置換または挿入に
よって修飾されていてもよく、２０、３０、３４、３
６、４７および５３Ｋｄの分子量を有し得る。この成分
の正確な分子量は一般に重要ではない。
酸安定結合蛋白ＢＰ―５３の間の複合体に結合し、かつ
それをｉｎ ｖｉｖｏで安定化するポリペプチド関す
る。ＢＰ−５３は糖蛋白である。即ち、１種またはそれ
以上の炭水化物鎖はＢＰ−５３ポリペプチド配列と連結
する。酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ‐５３について
言及する場合、インスリン様成長因子に結合でき、かつ
ＡＬＳとＩＧＦとの複合体を形成できる酸安定蛋白をい
うと理解されたい。該酸安定ＩＧＦ結合蛋白またはＢＰ
−５３がこれらの機能を満足する限り、それはグリコシ
ル化されていなくても、部分的にグリコシル化されてい
るものであっても、アノ酸欠失または置換または挿入に
よって修飾されていてもよく、２０、３０、３４、３
６、４７および５３Ｋｄの分子量を有し得る。この成分
の正確な分子量は一般に重要ではない。
【００１５】本発明により、本明細書に記載した方法を
用いると、該ＡＬＳは生物学的に純粋である。生物学的
に純粋とは、少なくとも６５重量％のＡＬＳ、好ましく
は少なくとも７５％重量％のＡＬＳよりなる組成物を意
味する。さらに好ましくは、該組成物は少なくとも８０
％のＡＬＳよりなる。従って、該組成物は均質なＡＬＳ
を含有し得る。本明細書中では、「生物学的に純粋」な
る語は「本質的にまたは実質的に純粋」と同一の意味を
有する。
用いると、該ＡＬＳは生物学的に純粋である。生物学的
に純粋とは、少なくとも６５重量％のＡＬＳ、好ましく
は少なくとも７５％重量％のＡＬＳよりなる組成物を意
味する。さらに好ましくは、該組成物は少なくとも８０
％のＡＬＳよりなる。従って、該組成物は均質なＡＬＳ
を含有し得る。本明細書中では、「生物学的に純粋」な
る語は「本質的にまたは実質的に純粋」と同一の意味を
有する。
【００１６】本発明が本質的にＡＬＳよりなる組成物(c
omposition of matter)に関する場合、該組成物は広い
文脈で理解されるべきである。該組成物はＡＬＳ自体、
または１種またはそれ以上の医薬上または獣医学上許容
される担体または添加剤と組み合わせたＡＬＳであって
よい。適当な担体は水、グリセロール、スクロース、緩
衝液またはアルブミン等のごとき他の蛋白を包含するこ
とができる。「本質的に〜よりなる」なる語句は前記
「生物学的に純粋」と同一の意味である。ＩＧＦに結合
するとは、ＩＧＦが酸安定成分ＢＰ−５３に結合または
連結する場合に形成される複合体に結合するＡＬＳの能
力を意味する。
omposition of matter)に関する場合、該組成物は広い
文脈で理解されるべきである。該組成物はＡＬＳ自体、
または１種またはそれ以上の医薬上または獣医学上許容
される担体または添加剤と組み合わせたＡＬＳであって
よい。適当な担体は水、グリセロール、スクロース、緩
衝液またはアルブミン等のごとき他の蛋白を包含するこ
とができる。「本質的に〜よりなる」なる語句は前記
「生物学的に純粋」と同一の意味である。ＩＧＦに結合
するとは、ＩＧＦが酸安定成分ＢＰ−５３に結合または
連結する場合に形成される複合体に結合するＡＬＳの能
力を意味する。
【００１７】ＡＬＳは糖蛋白である。即ち、１種または
それ以上の炭水化物鎖が該ＡＬＳポリペプチド配列と連
結している。本発明は十分にグリコシル化され、部分的
にグリコシル化され、または非グリコシル化形態のＡＬ
Ｓまで拡張され、それらは当該分野でよく知られた方法
によって容易に調製することができる。例えば、本明細
書中で開示する方法により調製したＡＬＳはエンドグリ
コシダーゼのごとき酵素と反応してＮ−結合炭水化物を
部分的にまたは全部を除去することができる。Ｏ−結合
炭水化物も当該分野でよく知られた方法によって同様に
除去できる。
それ以上の炭水化物鎖が該ＡＬＳポリペプチド配列と連
結している。本発明は十分にグリコシル化され、部分的
にグリコシル化され、または非グリコシル化形態のＡＬ
Ｓまで拡張され、それらは当該分野でよく知られた方法
によって容易に調製することができる。例えば、本明細
書中で開示する方法により調製したＡＬＳはエンドグリ
コシダーゼのごとき酵素と反応してＮ−結合炭水化物を
部分的にまたは全部を除去することができる。Ｏ−結合
炭水化物も当該分野でよく知られた方法によって同様に
除去できる。
【００１８】先に述べたように、ＡＬＳは、好ましく
は、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを
意味する]を有する。しかしながら、本発明のＡＬＳは
前記Ｎ−末端アミノ酸配列を占有することに限定されな
いと理解されるべきである。むしろ、ＡＬＳは、機能的
に、ＩＧＦが前記定義の酸安定結合蛋白ＢＰ−５３に結
合しまたはそれと連結できる場合に形成される複合体に
結合または連結できる酸不安定ポリペプチドと定義され
る。該定義ＡＬＳは、当業者に容易に理解されるごと
く、ＡＬＳの天然配列に対する合成または天然に生じる
アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むまで拡張
される。例えば、公知の技術を用い、遺伝子工学を容易
に使用してアミノ酸置換、欠失および／または挿入する
ことができる。
は、以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａを
意味する]を有する。しかしながら、本発明のＡＬＳは
前記Ｎ−末端アミノ酸配列を占有することに限定されな
いと理解されるべきである。むしろ、ＡＬＳは、機能的
に、ＩＧＦが前記定義の酸安定結合蛋白ＢＰ−５３に結
合しまたはそれと連結できる場合に形成される複合体に
結合または連結できる酸不安定ポリペプチドと定義され
る。該定義ＡＬＳは、当業者に容易に理解されるごと
く、ＡＬＳの天然配列に対する合成または天然に生じる
アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含むまで拡張
される。例えば、公知の技術を用い、遺伝子工学を容易
に使用してアミノ酸置換、欠失および／または挿入する
ことができる。
【００１９】一般に、本発明を限定する意味ではない
が、ＡＬＳは以下の点で特徴付けられる： （ｉ）酸不安定である。即ち、４未満のｐＨで不安定で
ある。 （ii）ＩＧＦによって占められる酸安定ＩＧＦ結合蛋白
に対し結合する。 （iii）ＳＤＳ一ＰＡＧＥによって測定するとほぼ８０
Ｋｄおよび１５Ｋｄの間の分子量を有する。 本明細書中でいうＡＬＳはヒトＡＬＳである。動物ＩＧ
Ｆとで複合体を形成できる動物ＡＬＳもまたＡＬＳなる
語の範囲内に入ると理解されるべきである。ＡＬＳはＩ
ＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳよりなる生理学的ＩＧＦ
複合体の調製で有用であると考えられる。かかる複合体
は結合組織、皮膚および骨のごとき組織の再成長に関連
する傷の治癒および関連治療に；ヒトおよび動物におけ
る身体の成長を促進するのに；および他の成長関連過程
を刺激するのに有用である。また、該ＡＬＳ蛋白はＩＧ
Ｆのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の顕著な増加を付与する。結
合蛋白を伴わないＩＧＦの半減期自体は数分に過ぎな
い。ＩＧＦを酸安定ＩＧＦ結合蛋白、およびＡＬＳとの
複合体の形態にすると、その半減期は数時間まで増大
し、かくして、その付随する治療作用を有するＩＧＦの
生物学的利用性を増大させる。さらに、純粋なＡＬＳ
は、ラジオイムノアッセイまたはＡＬＳについての他の
アッセイを確立するために、特異的単クローンまたは多
クローン抗体を生じさせるのに用いることができる。ヒ
ト血清におけるＡＬＳの測定は成長障害を持つ患者の成
長ホルモン状態を診断するのに有用であり得る。
が、ＡＬＳは以下の点で特徴付けられる： （ｉ）酸不安定である。即ち、４未満のｐＨで不安定で
ある。 （ii）ＩＧＦによって占められる酸安定ＩＧＦ結合蛋白
に対し結合する。 （iii）ＳＤＳ一ＰＡＧＥによって測定するとほぼ８０
Ｋｄおよび１５Ｋｄの間の分子量を有する。 本明細書中でいうＡＬＳはヒトＡＬＳである。動物ＩＧ
Ｆとで複合体を形成できる動物ＡＬＳもまたＡＬＳなる
語の範囲内に入ると理解されるべきである。ＡＬＳはＩ
ＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳよりなる生理学的ＩＧＦ
複合体の調製で有用であると考えられる。かかる複合体
は結合組織、皮膚および骨のごとき組織の再成長に関連
する傷の治癒および関連治療に；ヒトおよび動物におけ
る身体の成長を促進するのに；および他の成長関連過程
を刺激するのに有用である。また、該ＡＬＳ蛋白はＩＧ
Ｆのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の顕著な増加を付与する。結
合蛋白を伴わないＩＧＦの半減期自体は数分に過ぎな
い。ＩＧＦを酸安定ＩＧＦ結合蛋白、およびＡＬＳとの
複合体の形態にすると、その半減期は数時間まで増大
し、かくして、その付随する治療作用を有するＩＧＦの
生物学的利用性を増大させる。さらに、純粋なＡＬＳ
は、ラジオイムノアッセイまたはＡＬＳについての他の
アッセイを確立するために、特異的単クローンまたは多
クローン抗体を生じさせるのに用いることができる。ヒ
ト血清におけるＡＬＳの測定は成長障害を持つ患者の成
長ホルモン状態を診断するのに有用であり得る。
【００２０】各成分が好ましくは生物学的に純粋な形態
であるＡＬＳ、ＩＧＦおよび酸安定蛋白ＢＰ−５３を混
合することによって形成されるＩＧＦ結合蛋白複合体は
適当な医薬上許容されるおよび／または治療的にまたは
獣医学的に許容される担体と一緒に処方でき、例えば、
ヒトおよび非ヒト動物における成長促進または傷の治療
に使用できる。医薬上許容される担体の例は生理食塩
水、血清アルブミン、または血漿調製物を包含する。意
図した投与の態様に応じて、ＩＧＦ結合蛋白複合体の組
成物は、例えば錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、液剤、
懸濁剤等のごとき固体、半固体または液体の投与製剤の
形態とできる。別法として、ＩＧＦ結合蛋白複合体は、
長期間にわたる物質の放出用浸透圧ポンプのごとき徐放
埋込剤に一体化できる。治療目的でヒト患者または動物
に投与するＩＧＦ結合蛋白複合体の量は治療されるべき
個々の障害または病気、投与方法、および処方する医者
または獣医の判断による。
であるＡＬＳ、ＩＧＦおよび酸安定蛋白ＢＰ−５３を混
合することによって形成されるＩＧＦ結合蛋白複合体は
適当な医薬上許容されるおよび／または治療的にまたは
獣医学的に許容される担体と一緒に処方でき、例えば、
ヒトおよび非ヒト動物における成長促進または傷の治療
に使用できる。医薬上許容される担体の例は生理食塩
水、血清アルブミン、または血漿調製物を包含する。意
図した投与の態様に応じて、ＩＧＦ結合蛋白複合体の組
成物は、例えば錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、液剤、
懸濁剤等のごとき固体、半固体または液体の投与製剤の
形態とできる。別法として、ＩＧＦ結合蛋白複合体は、
長期間にわたる物質の放出用浸透圧ポンプのごとき徐放
埋込剤に一体化できる。治療目的でヒト患者または動物
に投与するＩＧＦ結合蛋白複合体の量は治療されるべき
個々の障害または病気、投与方法、および処方する医者
または獣医の判断による。
【００２１】ＡＬＳはヒト血清または血漿、またはコー
ン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＶのごとき血漿画分から精製でき
る。全血清からの精製が好ましく、これは物質の最も経
済的かつ豊富な源であって、最高の効率を与える。ＡＬ
Ｓからの精製はＩＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳの間の
生理学的相互作用を利用する。ＡＬＳは、それに結合ま
たは連結したＩＧＦ−ＢＰ−５３を有する支持マトリッ
クスに血清を通すことによってヒト血清から回収され
る。連結とは静電的付着または疎水性相互作用のごとき
非共有結合相互作用を意味する。次いで、ＡＬＳとアフ
ィニティーマトリックスとの相互作用を破壊することに
よって、例えばイオン強度の増大（例えば、少なくとも
０．３Ｍ ＮａＣｌ、または他の同等塩）またはアルカ
リ性ｐＨ（ｐＨ８を超える）の条件によってＩＧＦ−Ｂ
Ｐ−５３アフィニティーマトリックスに結合したＡＬＳ
を溶出させることができる。
ン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＶのごとき血漿画分から精製でき
る。全血清からの精製が好ましく、これは物質の最も経
済的かつ豊富な源であって、最高の効率を与える。ＡＬ
Ｓからの精製はＩＧＦ、ＢＰ−５３およびＡＬＳの間の
生理学的相互作用を利用する。ＡＬＳは、それに結合ま
たは連結したＩＧＦ−ＢＰ−５３を有する支持マトリッ
クスに血清を通すことによってヒト血清から回収され
る。連結とは静電的付着または疎水性相互作用のごとき
非共有結合相互作用を意味する。次いで、ＡＬＳとアフ
ィニティーマトリックスとの相互作用を破壊することに
よって、例えばイオン強度の増大（例えば、少なくとも
０．３Ｍ ＮａＣｌ、または他の同等塩）またはアルカ
リ性ｐＨ（ｐＨ８を超える）の条件によってＩＧＦ−Ｂ
Ｐ−５３アフィニティーマトリックスに結合したＡＬＳ
を溶出させることができる。
【００２２】全血漿またはそのＣｏｈｎ画分IVのごとき
ＡＬＳ源はイオン性樹脂で分画してアフィニティーマト
リックスに適用する前にＡＬＳ量を富化することができ
る。カチオン交換樹脂が好ましい。所望により、アフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製したＡＬＳを
ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）の商標）のごときさらなる精製工程に付すとが
できる。例えば、ＨＰＬＣ工程は逆相マトリックス、ゲ
ルパーミエーションマトリックスまたはイオン性マトリ
ックスを用いることによって行うことができる。
ＡＬＳ源はイオン性樹脂で分画してアフィニティーマト
リックスに適用する前にＡＬＳ量を富化することができ
る。カチオン交換樹脂が好ましい。所望により、アフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製したＡＬＳを
ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）の商標）のごときさらなる精製工程に付すとが
できる。例えば、ＨＰＬＣ工程は逆相マトリックス、ゲ
ルパーミエーションマトリックスまたはイオン性マトリ
ックスを用いることによって行うことができる。
【００２３】本発明がＡＬＳに結合することができる抗
体に関する場合、該抗体は単クローン抗体または多クロ
ーン抗体であってよい。かかる抗体は血清中のＡＬＳレ
ベルを測定するのに用いることができ、成長関連障害を
テストするための診断キットの一部を形成できる。ＡＬ
Ｓに対する抗体は、常法（ゴウディング・ジェイ・ダブ
リュー（Goding, J. W.（１９８６）,単クローン抗体；
原理および実践(Monoclonal Antibodies; Principles a
nd Practices)，第２版、アカデミック・フ゜レス(Acad
emic Press)により精製したＡＬＳで動物（例えば、マ
ウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマ、ヒツジまたはヒト
さえ）を免疫化することによって調製できる。例えば、
血清蛋白を支持マトリックスに付着させ、ＡＬＳを検出
するためのレポーター基(例えば、蛍光基、酵素または
コロイド状基)で標識できる抗−ＡＬＳ抗体と共にイン
キュベートできる。別法として、ＡＬＳに結合した非標
識抵−ＡＬＳ抗体を（抗−ＡＬＳまたは抗−免疫グロブ
リン抗体に対し指向される抗体のごとき）適当な剤と反
応させて抗体結合、かくして定量的ＡＬＳレベルを検出
することができる。
体に関する場合、該抗体は単クローン抗体または多クロ
ーン抗体であってよい。かかる抗体は血清中のＡＬＳレ
ベルを測定するのに用いることができ、成長関連障害を
テストするための診断キットの一部を形成できる。ＡＬ
Ｓに対する抗体は、常法（ゴウディング・ジェイ・ダブ
リュー（Goding, J. W.（１９８６）,単クローン抗体；
原理および実践(Monoclonal Antibodies; Principles a
nd Practices)，第２版、アカデミック・フ゜レス(Acad
emic Press)により精製したＡＬＳで動物（例えば、マ
ウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマ、ヒツジまたはヒト
さえ）を免疫化することによって調製できる。例えば、
血清蛋白を支持マトリックスに付着させ、ＡＬＳを検出
するためのレポーター基(例えば、蛍光基、酵素または
コロイド状基)で標識できる抗−ＡＬＳ抗体と共にイン
キュベートできる。別法として、ＡＬＳに結合した非標
識抵−ＡＬＳ抗体を（抗−ＡＬＳまたは抗−免疫グロブ
リン抗体に対し指向される抗体のごとき）適当な剤と反
応させて抗体結合、かくして定量的ＡＬＳレベルを検出
することができる。
【００２４】本発明が組換え核酸分子に関する場合、該
分子はここではＡＬＳまたはその一部をコード付けする
ＤＮＡまたはＲＮＡであると定義される。１の具体例に
おいて、組換え核酸分子は哺乳動物、好ましくはヒトＡ
ＬＳをコード付けする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ある
いは塩基欠失、挿入または置換あるいはヌクレオチド配
列または化学組成（例えばメチル化）に関する他の変更
を含めたその部分である。本明細書中におけるｃＤＮＡ
によってコード付けされるＡＬＳとは、組換えＤＮＡを
いう。
分子はここではＡＬＳまたはその一部をコード付けする
ＤＮＡまたはＲＮＡであると定義される。１の具体例に
おいて、組換え核酸分子は哺乳動物、好ましくはヒトＡ
ＬＳをコード付けする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ある
いは塩基欠失、挿入または置換あるいはヌクレオチド配
列または化学組成（例えばメチル化）に関する他の変更
を含めたその部分である。本明細書中におけるｃＤＮＡ
によってコード付けされるＡＬＳとは、組換えＤＮＡを
いう。
【００２５】ＡＬＳをコード付けする核酸（ｃＤＮＡ、
ＤＮＡ、ＲＮＡ）と少なくとも６０％の配列相同性また
はより好ましくは８０ないし９９％の相同性を示す、あ
るいはＡＬＳの生物学的活性を有する蛋白をコード付け
する組換え核酸はＡＬＳをコード付けする核酸とみなさ
れる。
ＤＮＡ、ＲＮＡ）と少なくとも６０％の配列相同性また
はより好ましくは８０ないし９９％の相同性を示す、あ
るいはＡＬＳの生物学的活性を有する蛋白をコード付け
する組換え核酸はＡＬＳをコード付けする核酸とみなさ
れる。
【００２６】組換えＡＬＳｃＤＮＡを得るにおいて有用
と考えられる方法は、マニアティスら（Maniatis et a
l），１９８２、「モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning： A La
boratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究
所、ニューヨーク、１〜５４５頁に含まれている。簡単
に言えば、ポリアデニル化ｍＲＮＡを肝臓のごとき適当
な細胞または組織源から得る。所望により、ｍＲＮＡを
アガロースゲル、または密度勾配遠心で分画し、翻訳さ
せ、例えば免疫沈降によってＡＬＳについて検定する。
富化または非富化ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として
使用する。ｃＤＮＡクローンのライブラリーは（ホモポ
リマーテイリング法を用い）ｐＢＲ３２２または他のベ
クターのごときベクターのＰｓｔＩ部位に構築し；ある
いは（ＥｃｏＲＩリンカーのごとき）リンカーをｃＤＮ
Ａ末端に結び、次いで該リンカーに相補的な部位を有す
るベクターにクローン化することによって構築される。
次いで、ライブラリーにおけるベクター中の特異的ｃＤ
ＮＡ分子を、ＡＬＳの前記Ｎ−末端アミノ酸に基づく特
異的オリゴヌクレオチドを用いて選択する。別法とし
て、商業的に入手可能なヒト・ラムダライブラリーをオ
リゴヌクレオチドでスクリーニングできる。別法アプロ
ーチにおいて、ラムダｇｔ１１のごとき発現ベクターに
ｃＤＮＡを挿入し、精製したＡＬＳに対し生じた特異性
抗体と発現蛋白との反応に基づいて選択する。いずれに
せよ、同定したならば、次いで、ＡＬＳのすべてまたは
一部をコード付けするｃＤＮＡ分子を発現ベクターに結
ぶ。さらに遺伝子操作をルーチン的に行って使用する特
定の宿主におけるｃＤＮＡの発現を最大化することがで
きる。
と考えられる方法は、マニアティスら（Maniatis et a
l），１９８２、「モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning： A La
boratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究
所、ニューヨーク、１〜５４５頁に含まれている。簡単
に言えば、ポリアデニル化ｍＲＮＡを肝臓のごとき適当
な細胞または組織源から得る。所望により、ｍＲＮＡを
アガロースゲル、または密度勾配遠心で分画し、翻訳さ
せ、例えば免疫沈降によってＡＬＳについて検定する。
富化または非富化ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として
使用する。ｃＤＮＡクローンのライブラリーは（ホモポ
リマーテイリング法を用い）ｐＢＲ３２２または他のベ
クターのごときベクターのＰｓｔＩ部位に構築し；ある
いは（ＥｃｏＲＩリンカーのごとき）リンカーをｃＤＮ
Ａ末端に結び、次いで該リンカーに相補的な部位を有す
るベクターにクローン化することによって構築される。
次いで、ライブラリーにおけるベクター中の特異的ｃＤ
ＮＡ分子を、ＡＬＳの前記Ｎ−末端アミノ酸に基づく特
異的オリゴヌクレオチドを用いて選択する。別法とし
て、商業的に入手可能なヒト・ラムダライブラリーをオ
リゴヌクレオチドでスクリーニングできる。別法アプロ
ーチにおいて、ラムダｇｔ１１のごとき発現ベクターに
ｃＤＮＡを挿入し、精製したＡＬＳに対し生じた特異性
抗体と発現蛋白との反応に基づいて選択する。いずれに
せよ、同定したならば、次いで、ＡＬＳのすべてまたは
一部をコード付けするｃＤＮＡ分子を発現ベクターに結
ぶ。さらに遺伝子操作をルーチン的に行って使用する特
定の宿主におけるｃＤＮＡの発現を最大化することがで
きる。
【００２７】従って、ＡＬＳは、該ｃＤＮＡ配列を発現
ベクターに挿入し、得られた組換え分子を適当な宿主に
形質転換し、次いで、該分子の合成に必要な条件下で培
養または増殖させることによってｉｎ ｖｉｖｏにて合
成される。本明細書中で定義する組換え分子は、所望の
宿主中で機能するプロモーターの下流に挿入された所望
のポリペプチドをコード付けする核酸配列、真核生物ま
たは原核生物レプリコンおよび抗生物質に対する耐性の
ごとき適当な選択マーカーよりなるべきである。また、
組換え分子は合成されたポリペプチドを細胞外環境に輸
送するのを容易とするシグナル配列を必要とし得る。別
法として、ポリペプチドは、超音波処理、圧力崩壊また
は洗剤処理のごとき種々の技術によってまず宿主細胞を
溶解することによって回収できる。本発明で考えられる
宿主は、原核生物（例えば、エシェリヒア・コリ (Esc
herichia coli)、バチラス(Bacillus)種、シウドモナス
（Pseudomonas）種）および真核生物（例えば、哺乳動
物細胞、酵母および菌類培養、昆虫細胞および植物培
養）よりなる群から選択できる。また、当業者ならば、
所与のアミノ酸配列はヌクレオチドまたはトリプレット
ヌクレオチド（コドン）の欠失、置換および付加を受け
得ることを認識するであろう。かかる変異はすべて本発
明の範囲内にある。さらに、組換えＳＬＡを発現する宿
主に応じ、該ＡＬＳはグリコシル化されていてよく、ま
たされていなくてもよい。一般には、真核生物、例え
ば、哺乳動物細胞等は組換えＡＬＳをグリコシル化す
る。原核生物、例えばエシェリヒア・コリのごとき細菌
は組換えＡＬＳをグリコシル化しない。グリコシル化ま
たは非グリコシル化ＡＬＳは前記したごとく本発明に含
まれる。
ベクターに挿入し、得られた組換え分子を適当な宿主に
形質転換し、次いで、該分子の合成に必要な条件下で培
養または増殖させることによってｉｎ ｖｉｖｏにて合
成される。本明細書中で定義する組換え分子は、所望の
宿主中で機能するプロモーターの下流に挿入された所望
のポリペプチドをコード付けする核酸配列、真核生物ま
たは原核生物レプリコンおよび抗生物質に対する耐性の
ごとき適当な選択マーカーよりなるべきである。また、
組換え分子は合成されたポリペプチドを細胞外環境に輸
送するのを容易とするシグナル配列を必要とし得る。別
法として、ポリペプチドは、超音波処理、圧力崩壊また
は洗剤処理のごとき種々の技術によってまず宿主細胞を
溶解することによって回収できる。本発明で考えられる
宿主は、原核生物（例えば、エシェリヒア・コリ (Esc
herichia coli)、バチラス(Bacillus)種、シウドモナス
（Pseudomonas）種）および真核生物（例えば、哺乳動
物細胞、酵母および菌類培養、昆虫細胞および植物培
養）よりなる群から選択できる。また、当業者ならば、
所与のアミノ酸配列はヌクレオチドまたはトリプレット
ヌクレオチド（コドン）の欠失、置換および付加を受け
得ることを認識するであろう。かかる変異はすべて本発
明の範囲内にある。さらに、組換えＳＬＡを発現する宿
主に応じ、該ＡＬＳはグリコシル化されていてよく、ま
たされていなくてもよい。一般には、真核生物、例え
ば、哺乳動物細胞等は組換えＡＬＳをグリコシル化す
る。原核生物、例えばエシェリヒア・コリのごとき細菌
は組換えＡＬＳをグリコシル化しない。グリコシル化ま
たは非グリコシル化ＡＬＳは前記したごとく本発明に含
まれる。
【００２８】省略法 ＩＧＦ− インスリン様成長因子 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ− ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動 ＫｄまたはＫ− キロダルトン ＧＨ− 成長ホルモン
リルアミドゲル電気泳動 ＫｄまたはＫ− キロダルトン ＧＨ− 成長ホルモン
【００２９】
【実施例】以下の図面および実施例は本発明を説明する
ものであるが、本発明を限定するものではない。
ものであるが、本発明を限定するものではない。
【００３０】実施例１ 材料：ＡＬＳ調製のために新鮮なヒト血清を実験室任意
提供者から得た。コモンウェルス・セラム・ラボラトリ
ーズ（Commonwealth Serum Laboratories)、メルボーン
(Melbourne)、オーストラリア国によって提供されたヒ
ト血漿のＣｏｈｎ画分ＩＶを出発材料として用いてヒト
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩならびにＩＧＦ−結合蛋
白ＢＰ−５３を調製した。 ＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ−５０、ＳＰ−セファデックスＣ−２５、電気泳動標
品、およびスーパーローズ１２ＨＲ１０／３０カラムは
ファルマシア（Pharmacia）、シドニーから；Affi-Gel
10およびAffi−Ge１ 15はバイオラド(Bio-Rad)から;お
よびPoly WAX LP（ポリエチレンイミン）アニオン交換
ＨＰＬＣカラム（２００×４．６ｍｍ）はＰｏｌｙＬ
Ｃ、コロンビア、マディソン州から入手した。すべての
他の試薬は少なくとも分析グレードであった。
提供者から得た。コモンウェルス・セラム・ラボラトリ
ーズ（Commonwealth Serum Laboratories)、メルボーン
(Melbourne)、オーストラリア国によって提供されたヒ
ト血漿のＣｏｈｎ画分ＩＶを出発材料として用いてヒト
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩならびにＩＧＦ−結合蛋
白ＢＰ−５３を調製した。 ＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ−５０、ＳＰ−セファデックスＣ−２５、電気泳動標
品、およびスーパーローズ１２ＨＲ１０／３０カラムは
ファルマシア（Pharmacia）、シドニーから；Affi-Gel
10およびAffi−Ge１ 15はバイオラド(Bio-Rad)から;お
よびPoly WAX LP（ポリエチレンイミン）アニオン交換
ＨＰＬＣカラム（２００×４．６ｍｍ）はＰｏｌｙＬ
Ｃ、コロンビア、マディソン州から入手した。すべての
他の試薬は少なくとも分析グレードであった。
【００３１】ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを単離
し、従前に記載されている（バキスター・アール・シイ
およびデ・メロウ・ジェイ・エス・エム（Baxter,R.C.,
andDe Mellow,J.S.M.）、クリニカル・エンドクリノロジ
ー（Clin.Endicrinol．）２４，２６７〜２７８；およ
びバキスター・アール・シイおよびブラウン・エイ・エ
ス（Baxter,R.C and Brown, A.S.（１９８２）クリニカ
ル・ケミストリー（Clin. Chem.）２８，４８５）ごと
くにヨウ素化した。従前に記載されている（マーチン・
ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Marti
n,J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Che
m)，２６１，８７５４〜８７６０）ごとくに５３Ｋ Ｉ
ＧＦ−結合蛋白ＢＰ−５３をＣｏｈｎ画分IVから精製
し、ジスクシンイミジル基質を用いて架橋させた［
１２５ Ｉ 〕ＩＧＦ−Ｉを持つ共有結合複合体を訓製
し、バキスター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ
・エル（Baxter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）１９８６）ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Clin. Invest.), ７８，１５０４〜１５１２の方法
に従ってゲルクロマトグラフィーによって精製した。２
８Ｋ ＩＧＦ−結合蛋白ＢＰ−２８は、バキスター・ア
ール・シイ、マーチン・ジェイ・エルおよびウッド・エ
ム・エイチ（Baxter,R.C., Martin,J.Ｌ. and Wood, M.
H.）（１９８７）、ジャーナル・オブ・エンドクリノロ
ジー・アンド・メタボリズム(J. Clin. Endocrinol. Me
tab)，６５,４２３〜４３１に従って、アフィニティー
クロマトグラフィーおよび逆相高圧液体クロマトグラフ
ィーによってヒト羊水から精製した。
し、従前に記載されている（バキスター・アール・シイ
およびデ・メロウ・ジェイ・エス・エム（Baxter,R.C.,
andDe Mellow,J.S.M.）、クリニカル・エンドクリノロジ
ー（Clin.Endicrinol．）２４，２６７〜２７８；およ
びバキスター・アール・シイおよびブラウン・エイ・エ
ス（Baxter,R.C and Brown, A.S.（１９８２）クリニカ
ル・ケミストリー（Clin. Chem.）２８，４８５）ごと
くにヨウ素化した。従前に記載されている（マーチン・
ジェイ・エルおよびバクスター・アール・シイ（Marti
n,J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Che
m)，２６１，８７５４〜８７６０）ごとくに５３Ｋ Ｉ
ＧＦ−結合蛋白ＢＰ−５３をＣｏｈｎ画分IVから精製
し、ジスクシンイミジル基質を用いて架橋させた［
１２５ Ｉ 〕ＩＧＦ−Ｉを持つ共有結合複合体を訓製
し、バキスター・アール・シイおよびマーチン・ジェイ
・エル（Baxter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）１９８６）ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Clin. Invest.), ７８，１５０４〜１５１２の方法
に従ってゲルクロマトグラフィーによって精製した。２
８Ｋ ＩＧＦ−結合蛋白ＢＰ−２８は、バキスター・ア
ール・シイ、マーチン・ジェイ・エルおよびウッド・エ
ム・エイチ（Baxter,R.C., Martin,J.Ｌ. and Wood, M.
H.）（１９８７）、ジャーナル・オブ・エンドクリノロ
ジー・アンド・メタボリズム(J. Clin. Endocrinol. Me
tab)，６５,４２３〜４３１に従って、アフィニティー
クロマトグラフィーおよび逆相高圧液体クロマトグラフ
ィーによってヒト羊水から精製した。
【００３２】ＡＬＳヨウ素化およびラジオイムノアッセイ ［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳは、５０μｌＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ７．４中の５μｇＡＬＳを１ｍＣｉＮａ
１２５Ｉおよび１０μｇクロルアミン−Ｔと２０秒間反
応させ、次いで５０μｇメタ重亜硫酸ナトリウムで反応
を停止させることによって調製した。ほぼ１００μｇの
精製したＡＬＳの４用量で７週間にわたってウサギを免
疫化することによってＡＬＳに対する抗血清を生じさせ
た。最終容量０．５ｍｌにおけるラジオイムノアッセイ
インキュベーションは１：５００００最終希釈の抗血
清、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳ（試験管当たりほぼ１０
０００ｃｐｍ）、および０．５〜１００ｎｇ／試験管の
範囲のＡＬＳを含有していた。２２℃における１６時間
のインキュベーションの後、遠心し、続いてヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリン（２μｌ）、キャリア正常ウサギ血清
（０．５μｌ）を添加し、３０分後、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ中の６％ポリエチレングリコール１ｍｌを添加する
ことによって結合トレーサーおよび遊離トレーサーを分
離した。
ウム緩衝液ｐＨ７．４中の５μｇＡＬＳを１ｍＣｉＮａ
１２５Ｉおよび１０μｇクロルアミン−Ｔと２０秒間反
応させ、次いで５０μｇメタ重亜硫酸ナトリウムで反応
を停止させることによって調製した。ほぼ１００μｇの
精製したＡＬＳの４用量で７週間にわたってウサギを免
疫化することによってＡＬＳに対する抗血清を生じさせ
た。最終容量０．５ｍｌにおけるラジオイムノアッセイ
インキュベーションは１：５００００最終希釈の抗血
清、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳ（試験管当たりほぼ１０
０００ｃｐｍ）、および０．５〜１００ｎｇ／試験管の
範囲のＡＬＳを含有していた。２２℃における１６時間
のインキュベーションの後、遠心し、続いてヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリン（２μｌ）、キャリア正常ウサギ血清
（０．５μｌ）を添加し、３０分後、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ中の６％ポリエチレングリコール１ｍｌを添加する
ことによって結合トレーサーおよび遊離トレーサーを分
離した。
【００３３】ＡＬＳについてのアッセイ ＡＬＳの存在下でほぼ６０Ｋの共有結合ＢＰ−５３−Ｉ
ＧＦ−Ｉ複合体の１５０Ｋ形態への変換に基づき、ＡＬ
Ｓ活性についてのルーチンアッセイを行った。ＡＬＳ活
性についてテストすべき試料を、５０ミリモル／Ｌリン
酸ナトリウム、０．１５モル／ＮａＣｌ、および０．２
ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５をウシ・アルブミ
ンと共に含有する緩衝液２００μＬ中に希釈した。架橋
ＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜８００００ｃｐ
ｍ；４ｎｇ）を同緩衝液５０μＬ中に添加した。 ２２
℃における２５〜３０分間のインキュベーションの後、
Ｖ−７インジェクターバルブ（ファルマシア（Pharmaci
a））を用いて混合物２００μＬをスーパーローズ−１
２ゲルパーミエーションカラムに適用し、無アルブミン
アッセイ緩衝液中１．０ｍＬ／分（〜２メガパスカル圧
力）で溶出した。主として画分２２〜２４に溶出し、画
分２３にピークが出現するウサギ免疫グロブリンＧ（ペ
ンテックス（Pentex）；〜１５０Ｋ））；主として画分
２５〜２７に溶出し、画分２６にピークが出現するＢＰ
−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜６０Ｋ）；ＢＰ一２
８に結合したＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜３５Ｋ、画分２
８にピーク）；およびＩＧＦ−Ｉトレーサー（７．５
Ｋ、画分３３にピーク）でカラムの検量線を作成した。
１ｏｇ（分子量）対溶出容量をプロットし、これらの４
種のマーカーより、直線状の検量線が得られた（図示せ
ず）。ＡＬＳ活性の定量インデックス（即ち、ＢＰ−５
３から１５０Ｋ複合体への変換度）として、画分２２〜
２４における放射能活性を画分２５〜２７の放射能活性
で除して１５０Ｋ／６０Ｋ比を得た。典型的には、この
比の値は０．１と２．０の間で変動する。広範囲の値を
カバーする８の複数測定値の変動分析に基づき、１５０
Ｋ／６０Ｋ比の変動係数は３．２％であった。各クロマ
トグラフィー泳動は３０分を要し、かつアッセイの精度
は高かったので、各決定は一般に各実験内単独で行っ
た。
ＧＦ−Ｉ複合体の１５０Ｋ形態への変換に基づき、ＡＬ
Ｓ活性についてのルーチンアッセイを行った。ＡＬＳ活
性についてテストすべき試料を、５０ミリモル／Ｌリン
酸ナトリウム、０．１５モル／ＮａＣｌ、および０．２
ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５をウシ・アルブミ
ンと共に含有する緩衝液２００μＬ中に希釈した。架橋
ＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜８００００ｃｐ
ｍ；４ｎｇ）を同緩衝液５０μＬ中に添加した。 ２２
℃における２５〜３０分間のインキュベーションの後、
Ｖ−７インジェクターバルブ（ファルマシア（Pharmaci
a））を用いて混合物２００μＬをスーパーローズ−１
２ゲルパーミエーションカラムに適用し、無アルブミン
アッセイ緩衝液中１．０ｍＬ／分（〜２メガパスカル圧
力）で溶出した。主として画分２２〜２４に溶出し、画
分２３にピークが出現するウサギ免疫グロブリンＧ（ペ
ンテックス（Pentex）；〜１５０Ｋ））；主として画分
２５〜２７に溶出し、画分２６にピークが出現するＢＰ
−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜６０Ｋ）；ＢＰ一２
８に結合したＩＧＦ−Ｉトレーサー（〜３５Ｋ、画分２
８にピーク）；およびＩＧＦ−Ｉトレーサー（７．５
Ｋ、画分３３にピーク）でカラムの検量線を作成した。
１ｏｇ（分子量）対溶出容量をプロットし、これらの４
種のマーカーより、直線状の検量線が得られた（図示せ
ず）。ＡＬＳ活性の定量インデックス（即ち、ＢＰ−５
３から１５０Ｋ複合体への変換度）として、画分２２〜
２４における放射能活性を画分２５〜２７の放射能活性
で除して１５０Ｋ／６０Ｋ比を得た。典型的には、この
比の値は０．１と２．０の間で変動する。広範囲の値を
カバーする８の複数測定値の変動分析に基づき、１５０
Ｋ／６０Ｋ比の変動係数は３．２％であった。各クロマ
トグラフィー泳動は３０分を要し、かつアッセイの精度
は高かったので、各決定は一般に各実験内単独で行っ
た。
【００３４】ＡＬＳの不存在下において、放射能活性は
圧倒的に画分２５〜２７で見い出され、これは６０Ｋの
分子量に対応し、典型的には０．１０またはそれ以下の
１５０Ｋ／６０Ｋ比を与える。プレインキュベーション
におけるＡＬＳ濃度の増加は６０Ｋトレーサーの１５０
Ｋ形態（画分２２〜２４）への変換の増大を引き起こ
し、１５０Ｋ／６０Ｋ比について高い値を与えた。純粋
なＢＰ−５３と共にプレインキュベートしたが共有結合
架橋しなかったＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両トレ
ーサーもまたＡＬＳとのインキュベーションによって１
５０Ｋに変換することができた。他のＩＧＦ酸安定結合
蛋白は、（２０、２４、２６、３０および４７Ｋのもの
のごとき）小サイズのうちこの反応で対応する小さな複
合体を形成する沈殿以外は、構造的にＢＰ−５３に関連
するものであった。架橋したＢＰ−５３−ＩＧＦ−ＩＩ
トレーサーはテストしなかった。実施例２に従って製造
した精製ＡＬＳ調製物を用いる用量依存性曲線は架橋Ｂ
Ｐ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサーを用いて作成した。高
い再現性のあるシグモイド状半対数プロットが得られ、
これは（例えば精製の間の）未知試料中のＡＬＳを定量
するための標準曲線として用いることができた。ＡＬＳ
へ複合体化したトレーサーをスーパーローズ−１２カラ
ム上で分画する代わりに抗ＡＬＳ抗血清と共にプレイン
キュベートすると、同様の結果が得られる。
圧倒的に画分２５〜２７で見い出され、これは６０Ｋの
分子量に対応し、典型的には０．１０またはそれ以下の
１５０Ｋ／６０Ｋ比を与える。プレインキュベーション
におけるＡＬＳ濃度の増加は６０Ｋトレーサーの１５０
Ｋ形態（画分２２〜２４）への変換の増大を引き起こ
し、１５０Ｋ／６０Ｋ比について高い値を与えた。純粋
なＢＰ−５３と共にプレインキュベートしたが共有結合
架橋しなかったＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両トレ
ーサーもまたＡＬＳとのインキュベーションによって１
５０Ｋに変換することができた。他のＩＧＦ酸安定結合
蛋白は、（２０、２４、２６、３０および４７Ｋのもの
のごとき）小サイズのうちこの反応で対応する小さな複
合体を形成する沈殿以外は、構造的にＢＰ−５３に関連
するものであった。架橋したＢＰ−５３−ＩＧＦ−ＩＩ
トレーサーはテストしなかった。実施例２に従って製造
した精製ＡＬＳ調製物を用いる用量依存性曲線は架橋Ｂ
Ｐ−５３−ＩＧＦ−Ｉトレーサーを用いて作成した。高
い再現性のあるシグモイド状半対数プロットが得られ、
これは（例えば精製の間の）未知試料中のＡＬＳを定量
するための標準曲線として用いることができた。ＡＬＳ
へ複合体化したトレーサーをスーパーローズ−１２カラ
ム上で分画する代わりに抗ＡＬＳ抗血清と共にプレイン
キュベートすると、同様の結果が得られる。
【００３５】実施例２ＡＬＳの精製 新鮮なヒト血清またはヒト血漿のＣｏｈｎ因子IVペース
トをＡＬＳ源として用いた。新鮮なヒト血清（１００〜
１３０ｍｌ）を２℃にて、ｐＨ８．２の０．０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌの２×５０容量に対して透析し、次いで、２
２℃で透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックス
Ａ−５０（５×２３ｃｍ）のカラムに負荷した。該カラ
ムを透析緩衝液２リットル、次いで０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌを含有する同緩衝液２〜２．５リットルで洗浄した。
この工程によりすべての免疫反応性ＢＰ−５３がカラム
から除去された。１ｍｌ／分でポンプ送液する０．０５
Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２の
１リットルを適用することによってＡＬＳを溶出させ
た。１０ｍｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２
８０ｎｍにおける吸収についてアッセイを行った。活性
画分を合し（全量ほぼ１４０ｍｌ）、２℃にて、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐ
Ｈ６．５の５リットルに対して透析した。
トをＡＬＳ源として用いた。新鮮なヒト血清（１００〜
１３０ｍｌ）を２℃にて、ｐＨ８．２の０．０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌの２×５０容量に対して透析し、次いで、２
２℃で透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックス
Ａ−５０（５×２３ｃｍ）のカラムに負荷した。該カラ
ムを透析緩衝液２リットル、次いで０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌを含有する同緩衝液２〜２．５リットルで洗浄した。
この工程によりすべての免疫反応性ＢＰ−５３がカラム
から除去された。１ｍｌ／分でポンプ送液する０．０５
Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２の
１リットルを適用することによってＡＬＳを溶出させ
た。１０ｍｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２
８０ｎｍにおける吸収についてアッセイを行った。活性
画分を合し（全量ほぼ１４０ｍｌ）、２℃にて、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐ
Ｈ６．５の５リットルに対して透析した。
【００３６】Ｃｏｈｎ因子IVがＡＬＳ源である場合、凍
結ペースト（６００ｇ）を粉砕して小片とし、５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ア
ジ化ナトリウム、ｐＨ８．２の３リットルと共に撹拌す
ることによって２℃にて１６時間抽出した。混合物をSo
rvall RC5C遠心機のＧＳＡローター中、１２０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心し、濁った緑〜茶色の上澄み画分
（２．８リットル）を得た。これを２の等容量に分け、
抽出緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５
０（５×２２ｃｍ）の２のカラムに重力供給によって負
荷し、各カラムを緩衝液２リットルで洗浄した。この段
階で、顕著な青〜緑色バンドがカラムの上半分に濃縮さ
れた。時々、洗浄工程の間にこのバンドはカラムを通っ
て移動を開始し；これらの場合には、洗浄容量は１リッ
トルに減少した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０２％
アジ化ナトリウム、ｐＨ８．２（合計２リットル容量）
における直線状０．１５〜０．３５Ｍ ＮａＣｌグラジ
エントによってＡＬＳをカラムから溶出させた。１０ｍ
ｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２８０ｎｍに
おける吸収（またはビウレット法による蛋白）について
アッセイを行った。２の平行カラムからの活性画分を合
し（合計ほぼ１リットル）、５０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨ６．５で２倍希釈し、ｐＨを１Ｍ ＨＣｌのゆっく
りとした添加によって６．５に調整した。活性画分は溶
出画分における青〜緑色蛋白に対応するので、イオン交
換手法を通じての活性物の進行用の便利な肉眼で見える
マーカーがこれにより提供された。
結ペースト（６００ｇ）を粉砕して小片とし、５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ア
ジ化ナトリウム、ｐＨ８．２の３リットルと共に撹拌す
ることによって２℃にて１６時間抽出した。混合物をSo
rvall RC5C遠心機のＧＳＡローター中、１２０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心し、濁った緑〜茶色の上澄み画分
（２．８リットル）を得た。これを２の等容量に分け、
抽出緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５
０（５×２２ｃｍ）の２のカラムに重力供給によって負
荷し、各カラムを緩衝液２リットルで洗浄した。この段
階で、顕著な青〜緑色バンドがカラムの上半分に濃縮さ
れた。時々、洗浄工程の間にこのバンドはカラムを通っ
て移動を開始し；これらの場合には、洗浄容量は１リッ
トルに減少した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．０２％
アジ化ナトリウム、ｐＨ８．２（合計２リットル容量）
における直線状０．１５〜０．３５Ｍ ＮａＣｌグラジ
エントによってＡＬＳをカラムから溶出させた。１０ｍ
ｌずつの画分を収集し、ＡＬＳ活性および２８０ｎｍに
おける吸収（またはビウレット法による蛋白）について
アッセイを行った。２の平行カラムからの活性画分を合
し（合計ほぼ１リットル）、５０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨ６．５で２倍希釈し、ｐＨを１Ｍ ＨＣｌのゆっく
りとした添加によって６．５に調整した。活性画分は溶
出画分における青〜緑色蛋白に対応するので、イオン交
換手法を通じての活性物の進行用の便利な肉眼で見える
マーカーがこれにより提供された。
【００３７】前記にて詳細に記載したごとく血漿または
Ｃｏｈｎ因子IVから得られた画分を含有するＡＬＳを、
（１）従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルお
よびバクスター・アール・シイ（Martin,J.Ｌ., and Ba
xter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem)，２６１，８７
５４〜８７６０）ように３ｍｇＩＧＦ−ＩＩを正確にカ
ップリングさせたAffi-Gel１５カラム（１×１２ｃ
ｍ）、（２）同一手法によってほぼ５ｍｇＩＧＦ−Ｉお
よび２ｍｇＩＧＦ−ＩＩを含有する混合物をカップリン
グさせたAffi-Gel１０カラム（１×１５ｃｍ）の２のＩ
ＧＦアフィニティーカラムのうちいずれか一方に適用し
た。従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルおよ
びバクスター・アール・シイ（Martin, J.Ｌ., and Bax
ter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに正確に調製した
ＢＰ−５３を該アフィニティーカラムに負荷した。簡単
に述べると、６００ｇＣｏｈｎペーストを２Ｍ酢酸、７
５ｍＭ ＮａＣｌの５倍容量と共にホモジネートし、混
合物を速心し、ｐＨ３．０のホモジネート緩衝液中で予
め平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−２５のほぼ４０
０ｍｌ充填容量と共に２〜３日間撹拌することによって
内因性ＩＧＦを上澄みから欠乏させた。混合物を遠心し
てゲルを除去し、従前記載されている（マーチン・ジェ
イ・エル、およびバクスター・アール・シイ（Martin,
J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに
上澄みを２工程でｐＨ６．５に調整した。次いで、該ｐ
Ｈ６．５上澄みをほぼ０．５ｍｌ／分でアフィニティー
カラムにポンプで送液し、該カラムを５０ｍＭリン酸ナ
トリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５の２５０ｍ
ｌ、および５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５の１００ｍ
ｌで１〜２ｍｌ／分で洗浄した。
Ｃｏｈｎ因子IVから得られた画分を含有するＡＬＳを、
（１）従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルお
よびバクスター・アール・シイ（Martin,J.Ｌ., and Ba
xter,R.C.）（１９８６）、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem)，２６１，８７
５４〜８７６０）ように３ｍｇＩＧＦ−ＩＩを正確にカ
ップリングさせたAffi-Gel１５カラム（１×１２ｃ
ｍ）、（２）同一手法によってほぼ５ｍｇＩＧＦ−Ｉお
よび２ｍｇＩＧＦ−ＩＩを含有する混合物をカップリン
グさせたAffi-Gel１０カラム（１×１５ｃｍ）の２のＩ
ＧＦアフィニティーカラムのうちいずれか一方に適用し
た。従前記載されている（マーチン・ジェイ・エルおよ
びバクスター・アール・シイ（Martin, J.Ｌ., and Bax
ter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに正確に調製した
ＢＰ−５３を該アフィニティーカラムに負荷した。簡単
に述べると、６００ｇＣｏｈｎペーストを２Ｍ酢酸、７
５ｍＭ ＮａＣｌの５倍容量と共にホモジネートし、混
合物を速心し、ｐＨ３．０のホモジネート緩衝液中で予
め平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−２５のほぼ４０
０ｍｌ充填容量と共に２〜３日間撹拌することによって
内因性ＩＧＦを上澄みから欠乏させた。混合物を遠心し
てゲルを除去し、従前記載されている（マーチン・ジェ
イ・エル、およびバクスター・アール・シイ（Martin,
J.Ｌ., and Baxter,R.C.）（１９８６）前掲）ごとくに
上澄みを２工程でｐＨ６．５に調整した。次いで、該ｐ
Ｈ６．５上澄みをほぼ０．５ｍｌ／分でアフィニティー
カラムにポンプで送液し、該カラムを５０ｍＭリン酸ナ
トリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５の２５０ｍ
ｌ、および５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５の１００ｍ
ｌで１〜２ｍｌ／分で洗浄した。
【００３８】ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフ
ィーからのＡＬＳ含有画分を０．１〜０．１５ｍｌ／分
でＢＰ−５３を負荷したＩＧＦアフィニティーカラムに
ポンプで送液した。典型的には、これにより、ＡＬＳ活
性の９０％以上が保持される。該カラムを１ｍｌ／分に
て５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の１５０ｍ
ｌ、および５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５の５０ｍ
ｌで洗浄して該カラムの緩衝能力を低下させた。５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を
０．５ｍｌ／分でカラムに適用することによってＡＬＳ
を溶出させた。これを第１図に示し、それは、ＡＬＳ
（μｇ／ｍｌ）に対するアフィニティーカラムからの溶
出容量および２８０ｎｍにおける吸収のプロットを示
す。２ｍｌずつの画分をシリコン化ガス試験管に収集
し、ＡＬＳ活性についてアッセイを行った。還元雰囲気
下、免疫精製したＡＬＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）
により、分子量ほぼ９０Ｋの接近したバンドのダブレッ
トが得られた。該ダブレットはＡＬＳのグリコシル化の
変動によるものであろう。それ以外のバンドは存在せ
ず、これによりＡＬＳは均質であることが示された。
ィーからのＡＬＳ含有画分を０．１〜０．１５ｍｌ／分
でＢＰ−５３を負荷したＩＧＦアフィニティーカラムに
ポンプで送液した。典型的には、これにより、ＡＬＳ活
性の９０％以上が保持される。該カラムを１ｍｌ／分に
て５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の１５０ｍ
ｌ、および５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５の５０ｍ
ｌで洗浄して該カラムの緩衝能力を低下させた。５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を
０．５ｍｌ／分でカラムに適用することによってＡＬＳ
を溶出させた。これを第１図に示し、それは、ＡＬＳ
（μｇ／ｍｌ）に対するアフィニティーカラムからの溶
出容量および２８０ｎｍにおける吸収のプロットを示
す。２ｍｌずつの画分をシリコン化ガス試験管に収集
し、ＡＬＳ活性についてアッセイを行った。還元雰囲気
下、免疫精製したＡＬＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）
により、分子量ほぼ９０Ｋの接近したバンドのダブレッ
トが得られた。該ダブレットはＡＬＳのグリコシル化の
変動によるものであろう。それ以外のバンドは存在せ
ず、これによりＡＬＳは均質であることが示された。
【００３９】任意の最終精製工程として、高効率アニオ
ン交換クロマトグラフィーによってアフィニティー精製
ＳＬＡを分画した。泳動当たり０．５ｍｌの試料負荷
を、０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウム中１．５ｍｌ／分
で平衡化したＰｏ１ｙＷＡＸ高効率アニオン交換カラム
に適用した（非調整ｐＨ＝７．８）。０．０５Ｍないし
０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ調整）の直線状塩
グラジエント（モデル６８０グラジエント・コントロー
ラー、ウォーターズ（Waters）、ミルフォード(Milfor
d)、マサチューセッツ州)を１．５ｍｌ／分で１５分間
にわたって適用することによってＡＬＳを溶出させた。
いくつかの調製において、同濃度範囲にわたって凹状グ
ラジエントを用い（グラジエントＮｏ．７、モデル６８
０グラジエント・コントローラー）、匹敵する結果が得
られた。ウォーターズ（Waters）モデル４４１アブソー
バンス・ディテクターを用いて２８０ｎｍにおける吸収
をモニターした。０．７５ｍｌずつの画分を収集し、Ａ
ＬＳ活性についてアッセイを行った。直線グラジエント
を用い１．５ｍｌ／分の溶出９〜１０分後、または凹状
グラジエントを用いる１１〜１２分後、単一の主要蛋白
ピークがカラムから出現した。 ＲＩＡによって決定し
た検出可能なＡＬＳ活性のすべてはこのピークに関連し
ており、評価した適用活性の回収は７５％以上で、さら
に特異的活性は１．６倍に増加していた。該ＡＬＳ活性
は常に単一ピークに関連していた。図２は、還元および
非還元両条件下での直線１０〜１５％ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動させたＨＰＬＣ分画後の精製ＡＬＳを
示す。調製物は、非還元（左パネル）または還元いずれ
かの条件下の見掛け分子量８４および８６ＫＤａのダブ
レットとして出現した。活性の実質的喪失をもたらした
（１Ｍ酢酸２０μｌで０，０５Ｍ炭酸水素アンモニウム
５０μｌ中のＡＬＳをｐＨ３に調整し、２２℃で１５分
間インキュベートし、２Ｍトリス塩基１０μｌで中和す
ることによって調製した）蛋白の酸性化は非還元または
還元いずれかで泳動させた場合、ＤＳＤ−ＰＡＧＥ上の
蛋白移動度に影響を与えなかった。しかしながら、Ｎ−
グリカナーゼ（０．５％ＳＤＳ４０μｌ中で沸騰させ、
次いで、０．５５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．６および
NonidetＰ−４０で各々０．２Ｍおよび１．２５％の最
終濃度まで希釈し；次いで、Ｎ−グリカナーゼ（ゲンジ
ーン・コーポレーション（Genzyme Corp.）, ボスト
ン、マサチューセッツ州）を添加して最終濃度６０ユニ
ット／ｍｌとした２５μｇＡＬＳ、および２７℃で１６
時間インキュベートした混合物）でＮ−結合炭水化物を
除去する処理により、見掛け分子量が８０ｋＤａの非還
元（左側パネル）および６６ｋＤＡ（右側パネル）まで
かなり減少する。注目すべきは、該蛋白はＮ−グリカナ
ーゼでの脱グリコシル化の後、単一のバンドとして移動
し、これは、天然調製物に観察されるダブレットは少な
くとも２のグリコシル化変異体によるものであることを
示唆した。還元条件下、脱グリコシル化調製物は範囲５
０〜６０ｋＤａにいくつかのバンドを示し、これは、さ
らに脱グリコシル化が可能なことを示唆する。
ン交換クロマトグラフィーによってアフィニティー精製
ＳＬＡを分画した。泳動当たり０．５ｍｌの試料負荷
を、０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウム中１．５ｍｌ／分
で平衡化したＰｏ１ｙＷＡＸ高効率アニオン交換カラム
に適用した（非調整ｐＨ＝７．８）。０．０５Ｍないし
０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ調整）の直線状塩
グラジエント（モデル６８０グラジエント・コントロー
ラー、ウォーターズ（Waters）、ミルフォード(Milfor
d)、マサチューセッツ州)を１．５ｍｌ／分で１５分間
にわたって適用することによってＡＬＳを溶出させた。
いくつかの調製において、同濃度範囲にわたって凹状グ
ラジエントを用い（グラジエントＮｏ．７、モデル６８
０グラジエント・コントローラー）、匹敵する結果が得
られた。ウォーターズ（Waters）モデル４４１アブソー
バンス・ディテクターを用いて２８０ｎｍにおける吸収
をモニターした。０．７５ｍｌずつの画分を収集し、Ａ
ＬＳ活性についてアッセイを行った。直線グラジエント
を用い１．５ｍｌ／分の溶出９〜１０分後、または凹状
グラジエントを用いる１１〜１２分後、単一の主要蛋白
ピークがカラムから出現した。 ＲＩＡによって決定し
た検出可能なＡＬＳ活性のすべてはこのピークに関連し
ており、評価した適用活性の回収は７５％以上で、さら
に特異的活性は１．６倍に増加していた。該ＡＬＳ活性
は常に単一ピークに関連していた。図２は、還元および
非還元両条件下での直線１０〜１５％ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動させたＨＰＬＣ分画後の精製ＡＬＳを
示す。調製物は、非還元（左パネル）または還元いずれ
かの条件下の見掛け分子量８４および８６ＫＤａのダブ
レットとして出現した。活性の実質的喪失をもたらした
（１Ｍ酢酸２０μｌで０，０５Ｍ炭酸水素アンモニウム
５０μｌ中のＡＬＳをｐＨ３に調整し、２２℃で１５分
間インキュベートし、２Ｍトリス塩基１０μｌで中和す
ることによって調製した）蛋白の酸性化は非還元または
還元いずれかで泳動させた場合、ＤＳＤ−ＰＡＧＥ上の
蛋白移動度に影響を与えなかった。しかしながら、Ｎ−
グリカナーゼ（０．５％ＳＤＳ４０μｌ中で沸騰させ、
次いで、０．５５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．６および
NonidetＰ−４０で各々０．２Ｍおよび１．２５％の最
終濃度まで希釈し；次いで、Ｎ−グリカナーゼ（ゲンジ
ーン・コーポレーション（Genzyme Corp.）, ボスト
ン、マサチューセッツ州）を添加して最終濃度６０ユニ
ット／ｍｌとした２５μｇＡＬＳ、および２７℃で１６
時間インキュベートした混合物）でＮ−結合炭水化物を
除去する処理により、見掛け分子量が８０ｋＤａの非還
元（左側パネル）および６６ｋＤＡ（右側パネル）まで
かなり減少する。注目すべきは、該蛋白はＮ−グリカナ
ーゼでの脱グリコシル化の後、単一のバンドとして移動
し、これは、天然調製物に観察されるダブレットは少な
くとも２のグリコシル化変異体によるものであることを
示唆した。還元条件下、脱グリコシル化調製物は範囲５
０〜６０ｋＤａにいくつかのバンドを示し、これは、さ
らに脱グリコシル化が可能なことを示唆する。
【００４０】表１は典型的なＡＬＳ精製の結果をまと
め、同様なスケールで行い、同様の結果が得られたった
４の試行のうちの１つである。０．０５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２によってＤＥＡＥ
−セファデックスカラムから溶出させた画分（ＤＥＡＥ
溶出物Ｎｏ２）は、適用したＡＬＳ免疫活性の６０％お
よび合計蛋白の１３％を超えて含有し、一方、０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出させた画分（ＤＥ
ΛＥ溶出物Ｎｏ１）は、ＡＬＳ活性の１５％しか含有し
なかったが、蛋白の７９％を含有していた。アガロース
−ＩＧＦに共有結合していないＢＰ−５３のカラム上の
アフィニティークロマトグラフィーによるＤＥＡＥ溶出
物Ｎｏ２画分のさらなる精製により、２００倍に増大し
たＡＬＳ特異的活性が得られた。
め、同様なスケールで行い、同様の結果が得られたった
４の試行のうちの１つである。０．０５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２によってＤＥＡＥ
−セファデックスカラムから溶出させた画分（ＤＥＡＥ
溶出物Ｎｏ２）は、適用したＡＬＳ免疫活性の６０％お
よび合計蛋白の１３％を超えて含有し、一方、０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出させた画分（ＤＥ
ΛＥ溶出物Ｎｏ１）は、ＡＬＳ活性の１５％しか含有し
なかったが、蛋白の７９％を含有していた。アガロース
−ＩＧＦに共有結合していないＢＰ−５３のカラム上の
アフィニティークロマトグラフィーによるＤＥＡＥ溶出
物Ｎｏ２画分のさらなる精製により、２００倍に増大し
たＡＬＳ特異的活性が得られた。
【００４１】使用した精製戦略は、サブユニットは低ｐ
Ｈで不可逆的に不活性化されるという事実が余儀ない
が、高ｐＨでは可逆的にＢＰ−ＵＧＦ複合体から解離す
るという事実の利点がある。精製におけるポイントとな
る工程は、アフィニティークロマトグラフィーの通常で
ない適用であり、そこでは、アフィニティーリガンド
（ＢＰ―５３）は共有結合によってアガロースマトリッ
クスに結合しないが、アガロース−ＩＧＦビーズとＡＬ
Ｓの間の非共有結合架橋として作用するらしい。惟う
に、ＢＰ−５３非占有ＩＧＦ−Ｉ またはＩＧＦ−ＩＩ
はＡＬＳを結合させ得ないので、共有結合アガロース−
ＢＰ―５３マトリックスの使用は働かなかったことが明
瞭である。任意の最終工程、塩グラジエント溶出でのＰ
ｏ１ｙＷＡＸ(弱アニオン交換）カラム上の高効率クロ
マトグラフィーは、高分解能以外では、実質的にＤＥＡ
Ｅ−セファデックスクロマトグフィーの最初の工程を繰
り返す。
Ｈで不可逆的に不活性化されるという事実が余儀ない
が、高ｐＨでは可逆的にＢＰ−ＵＧＦ複合体から解離す
るという事実の利点がある。精製におけるポイントとな
る工程は、アフィニティークロマトグラフィーの通常で
ない適用であり、そこでは、アフィニティーリガンド
（ＢＰ―５３）は共有結合によってアガロースマトリッ
クスに結合しないが、アガロース−ＩＧＦビーズとＡＬ
Ｓの間の非共有結合架橋として作用するらしい。惟う
に、ＢＰ−５３非占有ＩＧＦ−Ｉ またはＩＧＦ−ＩＩ
はＡＬＳを結合させ得ないので、共有結合アガロース−
ＢＰ―５３マトリックスの使用は働かなかったことが明
瞭である。任意の最終工程、塩グラジエント溶出でのＰ
ｏ１ｙＷＡＸ(弱アニオン交換）カラム上の高効率クロ
マトグラフィーは、高分解能以外では、実質的にＤＥＡ
Ｅ−セファデックスクロマトグフィーの最初の工程を繰
り返す。
【００４２】実施例３ＡＬＳのアミノ末端配列 標準的なＰＴＨプログラムを用い、１２０Ａ ＰＴＨア
ナライザーにカップリングしたアプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）４７０Ａ自動気相蛋白シ
ーケンサーを用いて、エドマン分解により、ＡＬＳのＮ
−末端配列をＨＰＬＣ精製物質の３５μｌ試料で決定し
た。メルカプトエタノールでの還元およびヨード酢酸で
のカルボキシメチル化の後、Ｃｙｓ残基は第２の試料で
確認された。
ナライザーにカップリングしたアプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）４７０Ａ自動気相蛋白シ
ーケンサーを用いて、エドマン分解により、ＡＬＳのＮ
−末端配列をＨＰＬＣ精製物質の３５μｌ試料で決定し
た。メルカプトエタノールでの還元およびヨード酢酸で
のカルボキシメチル化の後、Ｃｙｓ残基は第２の試料で
確認された。
【００４３】２の決定において、アミノ末端分析は、分
析した調製物は単一提供者の血清からのものであったと
いう事実に拘わらず、第１残基についてほぼ等モル量の
ＧｌｙおよびＡｌａを示した。最初の１８残基の分析に
より、配列 Ｇｌｙ（Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ−（配列番号：１）が得られ、１４およ
び１８位における該Ｃｙｓ残基は還元されかつカルボキ
シメチル化された試料で確認された。このアミノ酸配列
は他のＩＧＦ蛋白またはレセプターに対し明白な相同性
を示さなかった。
析した調製物は単一提供者の血清からのものであったと
いう事実に拘わらず、第１残基についてほぼ等モル量の
ＧｌｙおよびＡｌａを示した。最初の１８残基の分析に
より、配列 Ｇｌｙ（Ａｌａ）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ−（配列番号：１）が得られ、１４およ
び１８位における該Ｃｙｓ残基は還元されかつカルボキ
シメチル化された試料で確認された。このアミノ酸配列
は他のＩＧＦ蛋白またはレセプターに対し明白な相同性
を示さなかった。
【００４４】実施例４血清のＤＥＡＥ−セファデックス分画 出発物質は、従前に公表されているテーブル（グリーン
・エイ・エイおよびフゲス・ダブリュー−エル（Green,
A.A.,and Hughes, W.L．）、メソッズ・オブ・エンザイ
モロジー（Methods of Emzymol.），１．６７に従って
調製した３０〜５０％飽和からの血清の硫酸アンモニウ
ム画分であった。過剰の５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．２に対して透析し得られた沈殿は全血清の
ほぼ７５％のＢＰ−５３免疫反応性を含有していた。続
いての実験において、硫酸アンモニウム画分は不必要で
あることが判明し、トリスーＨＣｌ緩衝液に対して透析
した全血清を用いた。５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．２で平衡化したＤＥＡＥ―セファデックス
Ａ−５０の１×１７．５ｃｍカラムに１ｍＬ透析試料を
負荷し、３５ｍＬ出発緩衝液、５０ｍＬ出発緩衝液＋
０．１５モル／Ｌ ＮａＣｌ、および５０ｍＬ出発緩衝
液＋０．６モル／Ｌ ＮａＣｌで溶出した。大規模のプ
ロトコルにおいて、１０ｍＬ透析試料を１．５×２０ｃ
ｍカラムに負荷し、各々３種の緩衝液５０、１００およ
び１００ｍＬで溶出させた。 ０．１５モル／Ｌ Ｎａ
Ｃｌの存在下で溶出させた主要蛋白ピークをピークＡ、
０．６モル／Ｌ ＮａＣｌに出現したピークをピークＢ
と命名した（図３）。
・エイ・エイおよびフゲス・ダブリュー−エル（Green,
A.A.,and Hughes, W.L．）、メソッズ・オブ・エンザイ
モロジー（Methods of Emzymol.），１．６７に従って
調製した３０〜５０％飽和からの血清の硫酸アンモニウ
ム画分であった。過剰の５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．２に対して透析し得られた沈殿は全血清の
ほぼ７５％のＢＰ−５３免疫反応性を含有していた。続
いての実験において、硫酸アンモニウム画分は不必要で
あることが判明し、トリスーＨＣｌ緩衝液に対して透析
した全血清を用いた。５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．２で平衡化したＤＥＡＥ―セファデックス
Ａ−５０の１×１７．５ｃｍカラムに１ｍＬ透析試料を
負荷し、３５ｍＬ出発緩衝液、５０ｍＬ出発緩衝液＋
０．１５モル／Ｌ ＮａＣｌ、および５０ｍＬ出発緩衝
液＋０．６モル／Ｌ ＮａＣｌで溶出した。大規模のプ
ロトコルにおいて、１０ｍＬ透析試料を１．５×２０ｃ
ｍカラムに負荷し、各々３種の緩衝液５０、１００およ
び１００ｍＬで溶出させた。 ０．１５モル／Ｌ Ｎａ
Ｃｌの存在下で溶出させた主要蛋白ピークをピークＡ、
０．６モル／Ｌ ＮａＣｌに出現したピークをピークＢ
と命名した（図３）。
【００４５】大部分の免疫反応性ＢＰ−５３が最初のピ
ーク（ピークＡ）に見い出され、一方、第２のピーク
（ピークＢ）はＡＬＳ活性を含有していたが、ＢＰ−５
３免疫反応はほとんど含有していなかった（図３ボト
ム）。少量のＡＬＳ活性はピークＡの下降側に対応する
画分に検出された（図示せず）。同様の結果が６の別々
の実験で得られた。
ーク（ピークＡ）に見い出され、一方、第２のピーク
（ピークＢ）はＡＬＳ活性を含有していたが、ＢＰ−５
３免疫反応はほとんど含有していなかった（図３ボト
ム）。少量のＡＬＳ活性はピークＡの下降側に対応する
画分に検出された（図示せず）。同様の結果が６の別々
の実験で得られた。
【００４６】３の同様の実験の代表である図４は、スー
パーローズ−１２クロマトグラフィーによって分画した
場合、別々のおよび一緒にしたプレインキュベーション
の後、これらの蛋白ピークについてのＢＰ−５３免疫反
応性プロフィールを示す。ピークＡからのＢＰ−５３免
疫反応性物は、分子量範囲ほぼ３０〜６０Ｋに対応する
画分２５と３０の間のブロードなピークにて最初に溶出
し、１５０Ｋに対応する画分２２〜２４の小さなピート
が出現した（図４）。ピークＢからなんとか検出できる
ＢＰ−５３活性はスーパーローズ−１２からほとんど画
分２３〜２５で溶出した（図４ｂ）。ピークＡおよびＢ
を混合し、２２℃で６０分間プレインキュベートした
後、５０％を越えるピークＡ ＢＰ−５３活性が３０〜
６０Ｋから１５０Ｋにシフトし、３０〜６０Ｋになお残
存する（図４ｃ）。これは、９０％以上の活性が１５０
Ｋにおけるものであって５〜１０％のみが３０〜６０Ｋ
領域におけるものである全血清におけるＢＰ−５３プロ
フィールと比較することができる（図４ｄ）。図４ｃで
示したごとく、ピークＢのＡＬＳ活性は、ＮａＣｌを含
まないまたは０．６モル／Ｌ ＮａＣｌを含むトリス緩
衝液に対するピークＢ画分の透析によって影響されず、
高塩またはいずれの他の透折可能分子もピークＢではＢ
Ｐ−５３とＡＬＳとの間の反応に関与しないことが示さ
れる。
パーローズ−１２クロマトグラフィーによって分画した
場合、別々のおよび一緒にしたプレインキュベーション
の後、これらの蛋白ピークについてのＢＰ−５３免疫反
応性プロフィールを示す。ピークＡからのＢＰ−５３免
疫反応性物は、分子量範囲ほぼ３０〜６０Ｋに対応する
画分２５と３０の間のブロードなピークにて最初に溶出
し、１５０Ｋに対応する画分２２〜２４の小さなピート
が出現した（図４）。ピークＢからなんとか検出できる
ＢＰ−５３活性はスーパーローズ−１２からほとんど画
分２３〜２５で溶出した（図４ｂ）。ピークＡおよびＢ
を混合し、２２℃で６０分間プレインキュベートした
後、５０％を越えるピークＡ ＢＰ−５３活性が３０〜
６０Ｋから１５０Ｋにシフトし、３０〜６０Ｋになお残
存する（図４ｃ）。これは、９０％以上の活性が１５０
Ｋにおけるものであって５〜１０％のみが３０〜６０Ｋ
領域におけるものである全血清におけるＢＰ−５３プロ
フィールと比較することができる（図４ｄ）。図４ｃで
示したごとく、ピークＢのＡＬＳ活性は、ＮａＣｌを含
まないまたは０．６モル／Ｌ ＮａＣｌを含むトリス緩
衝液に対するピークＢ画分の透析によって影響されず、
高塩またはいずれの他の透折可能分子もピークＢではＢ
Ｐ−５３とＡＬＳとの間の反応に関与しないことが示さ
れる。
【００４７】血清のスーパーローズ１２画分 常健被験者からの血清を５０ミリモル／Ｌリン酸ナトリ
ウム、０．１５モル／Ｌ ＮａＣl、および０．２ｇ／
Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５で１:１希釈し、２０
０μＬをスーパーローズ−１２カラムに適用し、ルーチ
ンＡＬＳアッセイについて記載されたごとくに溶出させ
た。次いで、各画分をＢＰ−５３およびＡＬＳ活性につ
いてテストを行った。
ウム、０．１５モル／Ｌ ＮａＣl、および０．２ｇ／
Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ６．５で１:１希釈し、２０
０μＬをスーパーローズ−１２カラムに適用し、ルーチ
ンＡＬＳアッセイについて記載されたごとくに溶出させ
た。次いで、各画分をＢＰ−５３およびＡＬＳ活性につ
いてテストを行った。
【００４８】図４ｄに示したごとく、ＢＰ−５３免疫反
応性は１５０Ｋに対応する画分２３にピークを持つ（図
５）。対照的に、３の実験において、ピークＡＬＳ活性
は９０〜１１０Ｋに対応する画分２４（図５）に再現性
よく溶出し、血清にはＢＰ−５３を越える過剰のＡＬＳ
があること、および遊離サブユニットは９０〜１１０Ｋ
の見掛け分子量を有することが示唆される。ＡＬＳ活性
の同様のピークが、９９％を超える免疫反応性ＢＰ−５
３（即ち、実質的にすべての１５０Ｋ複合体）がアガロ
ースにカップリングした抗−ＢＰ−５３抗体のカラム上
のアフィニティークロマトグラフィーによって除去され
た血清に見い出され（図示せず）、９０〜１１０Ｋにて
検出可能なＡＬＳはＢＰ−５３に複合体化しなかったこ
とが確認された。血清を第３に示すごとくにイオン交換
クロマトグラフィーによって分画し、ピークＢをスーパ
ーローズ−１２クロマトグラフィーに忖した場合に匹敵
する結果が得られた。
応性は１５０Ｋに対応する画分２３にピークを持つ（図
５）。対照的に、３の実験において、ピークＡＬＳ活性
は９０〜１１０Ｋに対応する画分２４（図５）に再現性
よく溶出し、血清にはＢＰ−５３を越える過剰のＡＬＳ
があること、および遊離サブユニットは９０〜１１０Ｋ
の見掛け分子量を有することが示唆される。ＡＬＳ活性
の同様のピークが、９９％を超える免疫反応性ＢＰ−５
３（即ち、実質的にすべての１５０Ｋ複合体）がアガロ
ースにカップリングした抗−ＢＰ−５３抗体のカラム上
のアフィニティークロマトグラフィーによって除去され
た血清に見い出され（図示せず）、９０〜１１０Ｋにて
検出可能なＡＬＳはＢＰ−５３に複合体化しなかったこ
とが確認された。血清を第３に示すごとくにイオン交換
クロマトグラフィーによって分画し、ピークＢをスーパ
ーローズ−１２クロマトグラフィーに忖した場合に匹敵
する結果が得られた。
【００４９】ルーチンＡＬＳァッセイでテストした場
合、血清容量の増加は、１５０Ｋ／６０Ｋ比における用
量依存性増加を与えた（図示せず）。高活性が５人の末
端肥大被験者からの血清に見い出され、かつ５人のＧＨ
−欠損被験者からの血清における活性が常健者からの試
料で検出可能なものよりも低いので、全血清における検
出可能ＡＬＳはＧＨ依存性のようである。このＧＨ依存
性は血清におけるＧＨレベルを測定する診断アッセイに
ついての基礎を与え、例えばＡＬＳに対して指向される
抗体を用いる成長障害の診断で利用できるであろう。
合、血清容量の増加は、１５０Ｋ／６０Ｋ比における用
量依存性増加を与えた（図示せず）。高活性が５人の末
端肥大被験者からの血清に見い出され、かつ５人のＧＨ
−欠損被験者からの血清における活性が常健者からの試
料で検出可能なものよりも低いので、全血清における検
出可能ＡＬＳはＧＨ依存性のようである。このＧＨ依存
性は血清におけるＧＨレベルを測定する診断アッセイに
ついての基礎を与え、例えばＡＬＳに対して指向される
抗体を用いる成長障害の診断で利用できるであろう。
【００５０】実施例５ＡＬＳの酸不安定性 (実施例２の手法による）全血清における精製ＡＬＳま
たはＡＬＳの酸不安定性は低ＰＨへの暴露による不可逆
的不活性化により明らかであった。蛋白は５もの低いｐ
Ｈ値でかなり安定に見えたが、これより下がると、急速
に活性を失い（図７）；１５０Ｋ／６０Ｋ比はｐＨ３で
８０％以上減少する。１５０Ｋ／６０Ｋ比におけるこの
減少は９９％以上の見掛けＡＬＳ活性の減少と同等であ
る。対照的に、高ｐＨ値（ｐＨ１０まで）での暴露は全
血清または精製調製物におけるＡＬＳ活性に影響を与え
なかった。
たはＡＬＳの酸不安定性は低ＰＨへの暴露による不可逆
的不活性化により明らかであった。蛋白は５もの低いｐ
Ｈ値でかなり安定に見えたが、これより下がると、急速
に活性を失い（図７）；１５０Ｋ／６０Ｋ比はｐＨ３で
８０％以上減少する。１５０Ｋ／６０Ｋ比におけるこの
減少は９９％以上の見掛けＡＬＳ活性の減少と同等であ
る。対照的に、高ｐＨ値（ｐＨ１０まで）での暴露は全
血清または精製調製物におけるＡＬＳ活性に影響を与え
なかった。
【００５１】実施例６機能についての実験 ＢＰ−５３へのＡＬＳの結合動力学を測定するために、
［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳおよび種々の濃度のＢＰ−５
３ならびにＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを含有するイ
ンキュベーションを設定した。遊離および複合体化形態
双方においてＢＰと反応することが予め示されているＢ
Ｐ−５３に対する抗血清を用い、ＡＬＳトレーサーのＢ
Ｐ−５３との複合体を免疫沈降の後に検出した（バキス
サー・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Ba
xter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）（１９８６）ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J. Cli
n.Invest.), ７８，１５０４〜１５１２)。図７（左）
は０．２５ないし１００ｎｇ／試験管（０．０１６ない
し６．５ｎＭ）の範囲にわたるＢＰ−５３濃度増加が複
合体形成に与える影響を示す。ＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ
−ＩＩの不存在下で、ＡＬＳトレーサーとＢＰ−５３の
間で反応はほとんどないか、または全然なかった。モル
過剰のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験
管または２２ｎＭ）の存在下、ＡＬＳトレーサー結合に
おける用量依存性増加が観察され、１００ｎｇ／試験管
のＢＰ−５３に対する５０％特異的結合まで増加した。
高濃度のＢＰ−５３は免疫沈降系の制限のためテストで
きなかった。複合体形成はＩＧＦ−ＩＩよりもＩＧＦ−
Ｉの存在下で終始高かった。
［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳおよび種々の濃度のＢＰ−５
３ならびにＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを含有するイ
ンキュベーションを設定した。遊離および複合体化形態
双方においてＢＰと反応することが予め示されているＢ
Ｐ−５３に対する抗血清を用い、ＡＬＳトレーサーのＢ
Ｐ−５３との複合体を免疫沈降の後に検出した（バキス
サー・アール・シイおよびマーチン・ジェイ・エル（Ba
xter,R.C. and Martin,J.Ｌ.）（１９８６）ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J. Cli
n.Invest.), ７８，１５０４〜１５１２)。図７（左）
は０．２５ないし１００ｎｇ／試験管（０．０１６ない
し６．５ｎＭ）の範囲にわたるＢＰ−５３濃度増加が複
合体形成に与える影響を示す。ＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ
−ＩＩの不存在下で、ＡＬＳトレーサーとＢＰ−５３の
間で反応はほとんどないか、または全然なかった。モル
過剰のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験
管または２２ｎＭ）の存在下、ＡＬＳトレーサー結合に
おける用量依存性増加が観察され、１００ｎｇ／試験管
のＢＰ−５３に対する５０％特異的結合まで増加した。
高濃度のＢＰ−５３は免疫沈降系の制限のためテストで
きなかった。複合体形成はＩＧＦ−ＩＩよりもＩＧＦ−
Ｉの存在下で終始高かった。
【００５２】ＡＬＳとＢＰ−ＩＧＦ複合体の間での結合
アフィニティーは競合結合実験から評価した。図７
（右）における典型的実験で示したごとく、
［１２５Ｉ］標識ＡＬＳの結合はＩＧＦ−ＩＩよりもＩ
ＧＦ−Ｉの存在下で再度高かった。３つの同様の実験に
おいて、１０ｎｇ／試験管ＢＰ−５３に対する平均特異
的結合（±標準偏差）(即ち、ＢＰ−５３の存在下で沈
殿した放射能活性について補正したもの）は過剰のＩＧ
Ｆ−Ｉの存在下で２４．３±４．４％、過剰のＩＧＦ−
ＩＩの存在下では１９．６±３．９％（ペアのｔ−テス
トによりＰ＝０．００９）であった。非標識ＡＬＳの濃
度増加は、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳの免疫沈降可能複
合体からの用量依存性置き換えを引き起こした。スカチ
ャード（Scatchard）プロットによる結合データの解析
は、非特異的結合成分（解離定数＜１０６Ｍ−１）およ
びＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩよりもＢＰ−ＩＧＦ−Ｉについて
のわずかに高いアフィニティーをもつ単一の特異的結合
成分を明らかとした。３の同様の実験において、ＢＰ−
ＩＧＦ−Ｉに対するＡＬＳ結合についての平均解離定数
（±標準偏差）は６．０６±０．７１×１０８Ｍ−１、
ＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩに対するＡＬＳ結合については４．
１２±０．２９×１０８Ｍ−１であった。結合部位濃度
はＩＧＦ−Ｉの存在下で１．２８±０．４６モルＡＬＳ
／モルＢＰ−５３、ＩＧＥ−ＩＩの存在下で．１．１８
±０．２９モル／モルであり、ＡＬＳおよびＢＰ−５３
の分子量は各々８６ｋＤａおよび５３ｋＤａであること
が推定された。計算をＢＰ−５６３についての４３ｋＤ
ａの減少した分子量に基づけば、結合部位濃度は各々
１．０４±０．３７モル／モルおよび０．９６±モル／
モルである。この結果はＢＰ−５３の分子当たりのＡＬ
Ｓについての単一の結合部泣に合致する。
アフィニティーは競合結合実験から評価した。図７
（右）における典型的実験で示したごとく、
［１２５Ｉ］標識ＡＬＳの結合はＩＧＦ−ＩＩよりもＩ
ＧＦ−Ｉの存在下で再度高かった。３つの同様の実験に
おいて、１０ｎｇ／試験管ＢＰ−５３に対する平均特異
的結合（±標準偏差）(即ち、ＢＰ−５３の存在下で沈
殿した放射能活性について補正したもの）は過剰のＩＧ
Ｆ−Ｉの存在下で２４．３±４．４％、過剰のＩＧＦ−
ＩＩの存在下では１９．６±３．９％（ペアのｔ−テス
トによりＰ＝０．００９）であった。非標識ＡＬＳの濃
度増加は、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳの免疫沈降可能複
合体からの用量依存性置き換えを引き起こした。スカチ
ャード（Scatchard）プロットによる結合データの解析
は、非特異的結合成分（解離定数＜１０６Ｍ−１）およ
びＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩよりもＢＰ−ＩＧＦ−Ｉについて
のわずかに高いアフィニティーをもつ単一の特異的結合
成分を明らかとした。３の同様の実験において、ＢＰ−
ＩＧＦ−Ｉに対するＡＬＳ結合についての平均解離定数
（±標準偏差）は６．０６±０．７１×１０８Ｍ−１、
ＢＰ−ＩＧＦ−ＩＩに対するＡＬＳ結合については４．
１２±０．２９×１０８Ｍ−１であった。結合部位濃度
はＩＧＦ−Ｉの存在下で１．２８±０．４６モルＡＬＳ
／モルＢＰ−５３、ＩＧＥ−ＩＩの存在下で．１．１８
±０．２９モル／モルであり、ＡＬＳおよびＢＰ−５３
の分子量は各々８６ｋＤａおよび５３ｋＤａであること
が推定された。計算をＢＰ−５６３についての４３ｋＤ
ａの減少した分子量に基づけば、結合部位濃度は各々
１．０４±０．３７モル／モルおよび０．９６±モル／
モルである。この結果はＢＰ−５３の分子当たりのＡＬ
Ｓについての単一の結合部泣に合致する。
【００５３】ＢＰ−５３とＩＧＦとの間の相互作用に与
えるＡＬＳ影響の欠落は図８に示す。［１２５ Ｉ ］−
標識ＩＧＦ−ＩＩは、［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉ
よりも、増大した濃度のＢＰ−５３に対する高い結合を
終始示す。いずれかのトレーサーの結合は、試験管当た
り１００ｎｇの純粋なＡＬＳの添加によって影響されな
かった（図８、左）。非標識ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−
ＩＩの濃度を増加させることによってＢＰ−５３から［
１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩに置き換えた競合結合
曲線を図８（右）に示す。ＢＰ−５３からトレーサーを
置き換えるにおいて、ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−Ｉよりも
矛盾なく優れており、置き換え曲線はいずれも１００ｎ
ｇ／試験管のＡＬＳの添加によって影響を受けなかっ
た。［１２ ５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉをトレーサーとし
て用いた場合、同様の結果が観察された（図示せず）。
えるＡＬＳ影響の欠落は図８に示す。［１２５ Ｉ ］−
標識ＩＧＦ−ＩＩは、［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉ
よりも、増大した濃度のＢＰ−５３に対する高い結合を
終始示す。いずれかのトレーサーの結合は、試験管当た
り１００ｎｇの純粋なＡＬＳの添加によって影響されな
かった（図８、左）。非標識ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−
ＩＩの濃度を増加させることによってＢＰ−５３から［
１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩに置き換えた競合結合
曲線を図８（右）に示す。ＢＰ−５３からトレーサーを
置き換えるにおいて、ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−Ｉよりも
矛盾なく優れており、置き換え曲線はいずれも１００ｎ
ｇ／試験管のＡＬＳの添加によって影響を受けなかっ
た。［１２ ５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−Ｉをトレーサーとし
て用いた場合、同様の結果が観察された（図示せず）。
【００５４】純粋なＡＬＳはＢＰ−５３を１５０ｋＤａ
形態に変換できることを確認するために、図８に示した
競合結合実験で用いたものと同様なインキュベーション
混合物をスーパーローズ１２上のゲルクロマトグラフィ
ーに付した。［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩは放射
能活性の単一ピークのように見え、画分３４にピークが
出現する。分画前におけるこのトレーサーと純粋ＡＬＳ
（１００ｎｇ／２００μｌ）とのインキュベーションは
放射能活性プロフィールに影響を与えず、ＡＬＳ単独で
はＩＧＦ−ＩＩトレーサー（図９、左）を結合させるこ
とができないことが示される。Ｉｎｇ／２００μｌ純粋
ＢＰ−５３とのＩＧＦ−ＩＩトレーサーのインキュベー
ションの結果、放射能活性の７０％が６０ｋＤａ形態
に、即ちＢＰ―５３−ＩＧＦ−Ｉに変換される。このイ
ンキュベーションが１００ｎｇ／２００μｌ純粋ＡＬＳ
も包含する場合、６０ｋＤａ複合体は実質的に１５０ｋ
Ｄａ形態に変換され（図４、右）、複合体形成には純粋
ＩＧＦ、純粋ＢＰ−５３、および純粋ＡＬＳ以外の成分
は必要でないことが示される。
形態に変換できることを確認するために、図８に示した
競合結合実験で用いたものと同様なインキュベーション
混合物をスーパーローズ１２上のゲルクロマトグラフィ
ーに付した。［１２５ Ｉ ］−標識ＩＧＦ−ＩＩは放射
能活性の単一ピークのように見え、画分３４にピークが
出現する。分画前におけるこのトレーサーと純粋ＡＬＳ
（１００ｎｇ／２００μｌ）とのインキュベーションは
放射能活性プロフィールに影響を与えず、ＡＬＳ単独で
はＩＧＦ−ＩＩトレーサー（図９、左）を結合させるこ
とができないことが示される。Ｉｎｇ／２００μｌ純粋
ＢＰ−５３とのＩＧＦ−ＩＩトレーサーのインキュベー
ションの結果、放射能活性の７０％が６０ｋＤａ形態
に、即ちＢＰ―５３−ＩＧＦ−Ｉに変換される。このイ
ンキュベーションが１００ｎｇ／２００μｌ純粋ＡＬＳ
も包含する場合、６０ｋＤａ複合体は実質的に１５０ｋ
Ｄａ形態に変換され（図４、右）、複合体形成には純粋
ＩＧＦ、純粋ＢＰ−５３、および純粋ＡＬＳ以外の成分
は必要でないことが示される。
【００５５】実施例７ＢＰ−５３−ＩＧＦ−ＩへのＡＬＳ結合の抑制 ＡＬＳに結合するトレーサーＢＰ−５３−ＩＧＦ−Ｉを
抑制するその能力について種々の物質をテストした。酸
性化し、再中和してその内因性ＡＬＳ活性を破壊し、そ
の酸安定ＢＰ―５３を無疵で遊離した場合、ヒト血清は
優れた競合活性を含有していた。正常、末端肥大、およ
びＧＨ−依存性被験者からの試料を３の別々の実験でこ
のように比較すると、競合活性は、かかる試料において
内因性ＢＰ−５３について予測されるごとく、強力なＧ
Ｈ−依存性を示した。これを図１０ａにかかる実験につ
いて説明する。図８ａの曲線を各試料の免疫反応性ＢＰ
−５３含量項にて再度プロットすると、それらは、重ね
ることが可能となり（図１０ｂ）、酸性化全血清におけ
る内因性ＢＰ―５３はＡＬＳ反応において架橋トレーサ
ーと競合できることを示す。本アッセイで使用した条件
下、ほぼ１μｇＢＰ−５３／ｍＬ反応容積（即ち、２５
０ｎｇ／２５０μＬ）はＢＰ−ＡＬＳ複合体から架橋ト
レーサーを十分に置き換え、２００〜２５０ｎｇ／ｍＬ
ＢＰ−５３で半最大置換された。
抑制するその能力について種々の物質をテストした。酸
性化し、再中和してその内因性ＡＬＳ活性を破壊し、そ
の酸安定ＢＰ―５３を無疵で遊離した場合、ヒト血清は
優れた競合活性を含有していた。正常、末端肥大、およ
びＧＨ−依存性被験者からの試料を３の別々の実験でこ
のように比較すると、競合活性は、かかる試料において
内因性ＢＰ−５３について予測されるごとく、強力なＧ
Ｈ−依存性を示した。これを図１０ａにかかる実験につ
いて説明する。図８ａの曲線を各試料の免疫反応性ＢＰ
−５３含量項にて再度プロットすると、それらは、重ね
ることが可能となり（図１０ｂ）、酸性化全血清におけ
る内因性ＢＰ―５３はＡＬＳ反応において架橋トレーサ
ーと競合できることを示す。本アッセイで使用した条件
下、ほぼ１μｇＢＰ−５３／ｍＬ反応容積（即ち、２５
０ｎｇ／２５０μＬ）はＢＰ−ＡＬＳ複合体から架橋ト
レーサーを十分に置き換え、２００〜２５０ｎｇ／ｍＬ
ＢＰ−５３で半最大置換された。
【００５６】酸性化血清における内囚性ＢＰ−５３とは
対照的に、０．８μｇ／ｍＬまでテストした場合、純粋
なＢＰ−５３はＡＬＳ反応で架橋トレーサーと競合でき
なかった(図１１)。しかしながら、３．５倍モル過剰の
純粋なヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（即ち、５０
０ｎｇ ＩＧＦ／μｇＢＰ−５３）での２２℃における
３０分間のプレインキュベーションの後、精製したＢＰ
−５３は架橋トレーサーをＢＰ−５３―ＡＬＳ複合体か
らを十分に置き換えた。以下の；粋な羊水ＢＰ−２８
（０．８μｇ／ｍＬ）、過剰のＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ
−ＩＩ（０．５μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートした
ＢＰ−２８、またはヒトＧＨ（２０μｇ／ｍＬ）もテス
トし、ＡＬＳ反応において競合しないことが判明した。
これらの実験は、再度、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ
で占められたＢＰ−５３のみがＡＬＳとの反応に参画で
きることを示し、占有されているか否かに拘わらず、Ｂ
Ｐ−２８はＡＬＳと反応できないことを示唆する。これ
までに言及した科学文献はその全体を本明細書中にて一
体化する。請求の範囲は記載の一部を形成する。
対照的に、０．８μｇ／ｍＬまでテストした場合、純粋
なＢＰ−５３はＡＬＳ反応で架橋トレーサーと競合でき
なかった(図１１)。しかしながら、３．５倍モル過剰の
純粋なヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（即ち、５０
０ｎｇ ＩＧＦ／μｇＢＰ−５３）での２２℃における
３０分間のプレインキュベーションの後、精製したＢＰ
−５３は架橋トレーサーをＢＰ−５３―ＡＬＳ複合体か
らを十分に置き換えた。以下の；粋な羊水ＢＰ−２８
（０．８μｇ／ｍＬ）、過剰のＩＧＦ―ＩまたはＩＧＦ
−ＩＩ（０．５μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートした
ＢＰ−２８、またはヒトＧＨ（２０μｇ／ｍＬ）もテス
トし、ＡＬＳ反応において競合しないことが判明した。
これらの実験は、再度、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ
で占められたＢＰ−５３のみがＡＬＳとの反応に参画で
きることを示し、占有されているか否かに拘わらず、Ｂ
Ｐ−２８はＡＬＳと反応できないことを示唆する。これ
までに言及した科学文献はその全体を本明細書中にて一
体化する。請求の範囲は記載の一部を形成する。
【００５７】第１表 ヒト血清からの酸不安定サブユニ
ットの精製 精製工程は実施例２に記載した通り。ラジオイムノアッ
セイによって測定したＡＬＳは純粋な標品調製項にて表
す。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ１とは０．１５Ｍ ＮａＣｌを
含有する緩衝液によるＤＥＡＥ―セファデックスから溶
出した画分のプールをいう。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ２とは
０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画
分のプールをいい；このプールはアッセイ前に透析し
た。アフィニティー溶出物はアフィニティーカラムから
溶出し、次いで限外濾過によって濃縮した画分のプール
である。ＨＰＬＣプールはＨＰＬＣ工程から回収した活
性画分のプールである。
ットの精製 精製工程は実施例２に記載した通り。ラジオイムノアッ
セイによって測定したＡＬＳは純粋な標品調製項にて表
す。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ１とは０．１５Ｍ ＮａＣｌを
含有する緩衝液によるＤＥＡＥ―セファデックスから溶
出した画分のプールをいう。ＤＥＡＥ溶出物Ｎｏ２とは
０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画
分のプールをいい；このプールはアッセイ前に透析し
た。アフィニティー溶出物はアフィニティーカラムから
溶出し、次いで限外濾過によって濃縮した画分のプール
である。ＨＰＬＣプールはＨＰＬＣ工程から回収した活
性画分のプールである。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【発明の効果】本発明により、従来知られておらず、特
徴付けされたことがないインスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）
を同定し、それを該ＡＬＳＩＧＦによって占められた５
３ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベートした場合、それ
をＩＧＦのin vivo 形態に対応する高分子複合体に変換
することが分った。
徴付けされたことがないインスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）結合蛋白複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）
を同定し、それを該ＡＬＳＩＧＦによって占められた５
３ｋｄ酸安定蛋白と共にインキュベートした場合、それ
をＩＧＦのin vivo 形態に対応する高分子複合体に変換
することが分った。
【００６０】
【配列表】 Sequence Listing <110> Central Sydney Area Health Service <120> Acid-Labile Subunit (ALS) of Insulin-Like-Growth Factor (IGF) Bidi ng Protein Complex <130> 175874 <160> 1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Human <220> <221> Gly or Ala <222> (1) <223> Amino terminal analysis of the N-terminal sequence of ALS showed a pproximately equimolar amounts of Gly and Ala for the first residue. <400> 1 Xaa Asp Pro Gly Thr Pro Gly Glu Ala Glu Gly Pro Ala Cys Pro Ala Ala Cys- 5 10 15
【図１】 ＡＬＳのアフィニティークロマトグラフィ
ー。ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーによ
って不完全精製した画分のプール１３２ｍｌを、アガロ
ースによって共有結合したＩＧＥ―ＩおよびびＩＧＥ−
ＩＩの混合物を含有し、ＢＰ−５３を非共有結合的に吸
着した１×１５ｃｍのアフィニティーカラムに０．１３
ｍｌ／分で負荷した。該カラムを５０ｍＭ リン酸ナト
リウム、ｐＨ６．５（洗浄Ｎｏｌ）１５０ｍｌおよび５
ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ（洗浄
Ｎｏ２）５０ｍｌで１ｍｌ／分にて洗浄した。５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０，３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を
０．５ｍｌ／分で適用することによって溶出させた。
ー。ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーによ
って不完全精製した画分のプール１３２ｍｌを、アガロ
ースによって共有結合したＩＧＥ―ＩおよびびＩＧＥ−
ＩＩの混合物を含有し、ＢＰ−５３を非共有結合的に吸
着した１×１５ｃｍのアフィニティーカラムに０．１３
ｍｌ／分で負荷した。該カラムを５０ｍＭ リン酸ナト
リウム、ｐＨ６．５（洗浄Ｎｏｌ）１５０ｍｌおよび５
ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ（洗浄
Ｎｏ２）５０ｍｌで１ｍｌ／分にて洗浄した。５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０，３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を
０．５ｍｌ／分で適用することによって溶出させた。
【図２】 精製したＡＬＳのＳＤＳ‐ポリアクリルアミ
ド電気泳動 左側パネル：未処理、酸性化、およびＮ−グリカナーゼ
処理試料（１５μｇ／レーン）を非還元状態で泳動させ
た。 右側パネル：同一試料を還元雰囲気下で逆の順序で泳動
させた。ゲルをコーマシーブルーで染色した。還元ゲル
についての右側レーンに示す標品蛋白の（ｋＤａ単位
の）分子量もまた非還元ゲルで泳動させた標品について
矢印で示す。
ド電気泳動 左側パネル：未処理、酸性化、およびＮ−グリカナーゼ
処理試料（１５μｇ／レーン）を非還元状態で泳動させ
た。 右側パネル：同一試料を還元雰囲気下で逆の順序で泳動
させた。ゲルをコーマシーブルーで染色した。還元ゲル
についての右側レーンに示す標品蛋白の（ｋＤａ単位
の）分子量もまた非還元ゲルで泳動させた標品について
矢印で示す。
【図３】 図３はＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−５０
のカラムでのヒト血清の分画を示す。１リットルの透析
血清を１×１７．５ｃｍゲルベッドに負荷し、該カラム
を３５ｍＭ ０．０５モルの／Ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．２で洗浄し、０．１５モル／Ｌ ＮａＣｌを含有
する同一緩衝液５０ｍＬで溶出を開始する。次いで、
０．６モル／Ｌ ＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶出
を継続する。１ｍＬずつの画分を収集し、２８０ｎｍに
おける吸収について検定し、ＢＰ−５３はＲＩＡによ
る。 ＡＬＳをルーチンアッセイ法によってピークＢ画
分の２０μＬ分で測定した。
のカラムでのヒト血清の分画を示す。１リットルの透析
血清を１×１７．５ｃｍゲルベッドに負荷し、該カラム
を３５ｍＭ ０．０５モルの／Ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．２で洗浄し、０．１５モル／Ｌ ＮａＣｌを含有
する同一緩衝液５０ｍＬで溶出を開始する。次いで、
０．６モル／Ｌ ＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶出
を継続する。１ｍＬずつの画分を収集し、２８０ｎｍに
おける吸収について検定し、ＢＰ−５３はＲＩＡによ
る。 ＡＬＳをルーチンアッセイ法によってピークＢ画
分の２０μＬ分で測定した。
【図４】 図４はＤＥＡＥ−セファデックス分画血清か
らの１５０Ｋ複合体の生成を示す。図３に示すごとく、
ピークＡおよびＢプールは、１０ｍＬ血清のＤＥＡＥ−
セファデックスクロマトグラフィーによって調製し、次
いで、スーパーローズ−１２クロマトグラフィーによっ
て分画した。各々２００μＬの容量で注入した試料はピ
ークＡ（ａ：１００μＬ）、ピークＢ（ｂ：１００μ
Ｌ）、混合し、負荷前に２２℃で１時間インキュベート
したピークＡおよびＢ（ｃ：各１００μｌ）、および全
血清（ｄ：３３μＬ）であった。ＢＰ―５３免疫反応性
を各０．５ｍＬ画分５０μＬで測定した。矢印は１５０
Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。
らの１５０Ｋ複合体の生成を示す。図３に示すごとく、
ピークＡおよびＢプールは、１０ｍＬ血清のＤＥＡＥ−
セファデックスクロマトグラフィーによって調製し、次
いで、スーパーローズ−１２クロマトグラフィーによっ
て分画した。各々２００μＬの容量で注入した試料はピ
ークＡ（ａ：１００μＬ）、ピークＢ（ｂ：１００μ
Ｌ）、混合し、負荷前に２２℃で１時間インキュベート
したピークＡおよびＢ（ｃ：各１００μｌ）、および全
血清（ｄ：３３μＬ）であった。ＢＰ―５３免疫反応性
を各０．５ｍＬ画分５０μＬで測定した。矢印は１５０
Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。
【図５】 図５はスーパーローズ−１２で分画した血清
で示したごとく、ＢＰ−５３免疫反応性およびＡＬＳ活
性の比較を示す。各画分は０．５ｍＬであった。矢印は
１５０Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。ＡＬＳ
蛋白を検出するのに用いた方法は１５０Ｋ複合体として
存在しない蛋白のみを検出することに注意されたい。
で示したごとく、ＢＰ−５３免疫反応性およびＡＬＳ活
性の比較を示す。各画分は０．５ｍＬであった。矢印は
１５０Ｋ、６０Ｋおよび３５Ｋマーカーを示す。ＡＬＳ
蛋白を検出するのに用いた方法は１５０Ｋ複合体として
存在しない蛋白のみを検出することに注意されたい。
【図６】 図６はＡＬＳ活性の酸不安定性を示す。通常
血清（ａ）または不完全精製ＡＬＳ（ｂ）をＡＬＳアッ
セイ緩衝液に希釈し、１モル／Ｌ ＨＣｌまたはＮａＯ
Ｈで示したｐＨ値に調整した。２２℃での３０分後、試
料を再度中和し、ルーチンアッセイ（１０μＬ血清また
は６００ｎｇＡＬＳ調製／インキュベーション)におけ
るＡＬＳ活性について検定した。
血清（ａ）または不完全精製ＡＬＳ（ｂ）をＡＬＳアッ
セイ緩衝液に希釈し、１モル／Ｌ ＨＣｌまたはＮａＯ
Ｈで示したｐＨ値に調整した。２２℃での３０分後、試
料を再度中和し、ルーチンアッセイ（１０μＬ血清また
は６００ｎｇＡＬＳ調製／インキュベーション)におけ
るＡＬＳ活性について検定した。
【図７】 図７はＩＧＦ類がＡＬＳのＢＰ−５３への結
合に与える影響を示す。左側パネル：ＩＧＦ−Ｉまたは
ＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験管）の存在下または不存
在下において、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳトレーサーと
共に３００μｌ反応容量にて、濃度を増加させてＢＰ−
５３をインキュベートした。右側パネル：１０ｎｇＢＰ
−５３＋１０ｎｇＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、Ａ
ＬＳトレーサーと共に、非標識ＡＬＳの濃度を増加させ
て、３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。
ＢＰ−５３に結合したトレーサーを抗−ＢＰ−５３抗
血清Ｒ−７で免疫沈降させた。
合に与える影響を示す。左側パネル：ＩＧＦ−Ｉまたは
ＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／試験管）の存在下または不存
在下において、［１２５Ｉ］−標識ＡＬＳトレーサーと
共に３００μｌ反応容量にて、濃度を増加させてＢＰ−
５３をインキュベートした。右側パネル：１０ｎｇＢＰ
−５３＋１０ｎｇＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、Ａ
ＬＳトレーサーと共に、非標識ＡＬＳの濃度を増加させ
て、３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。
ＢＰ−５３に結合したトレーサーを抗−ＢＰ−５３抗
血清Ｒ−７で免疫沈降させた。
【図８】 図８はＡＬＳがＩＧＦのＢＰ−５３への結合
に対する影響を示す。 左側パネル：示すごとく、ＡＬＳ（５００ｎｇ／試験
管）の不存在または存在下、［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ
−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩトレーサー（ＩＧＦ−Ｉ＊また
はＩＧＦ−ＩＩ＊）と共に、ＢＰ−５３の濃度を増加さ
せて３００μｌの反応容量中でインキュベートした。１
００ｎｇＡＬＳの存在下または不存在にて、０．２５ｎ
ｇ ＢＰ−５３をＩＧＦ−ＩＩトレーサーおよび増加さ
せる濃度の非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと共に
３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。ＢＰ
−５３に結合したトレーサーを抗ＢＰ−５３抗血清Ｒ−
７で免疫沈降させた。
に対する影響を示す。 左側パネル：示すごとく、ＡＬＳ（５００ｎｇ／試験
管）の不存在または存在下、［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ
−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩトレーサー（ＩＧＦ−Ｉ＊また
はＩＧＦ−ＩＩ＊）と共に、ＢＰ−５３の濃度を増加さ
せて３００μｌの反応容量中でインキュベートした。１
００ｎｇＡＬＳの存在下または不存在にて、０．２５ｎ
ｇ ＢＰ−５３をＩＧＦ−ＩＩトレーサーおよび増加さ
せる濃度の非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと共に
３００μｌ中でインキュベートした競合結合実験。ＢＰ
−５３に結合したトレーサーを抗ＢＰ−５３抗血清Ｒ−
７で免疫沈降させた。
【図９】 図９はＢＰ−５３およびＡＬＳが
［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ−ＩＩトレーサーのクロマト
グラフィー像に与える影響を示す。ＢＰ−５３（１ｎｇ
／２００μｌ）またはＡＬＳ（１００ｎｇ／２００μ
ｌ）の存在下または不存在下にて、２２℃で２時間予め
インキュベートした、５００００ｃｐｍＩＧＦ−ＩＩト
レーサーを含有する２００μｌ試料を、５０ｍＭリン酸
ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化
ナトリウム、０．１％ウシ・アルブミン、ｐＨ６．５に
てのスーパーローズ−１２高効率クロマトグラフィーカ
ラム上のクロマトグラフィーに付した。０．５ｍｌずつ
の画分を１ｍｌ／分で収集し、各画分の放射能活性を測
定した。各パネルで、左から右への３つの矢印は１５０
ｋＤａ、６０ｋＤａおよび７．５ｋＤａの分子量マーカ
ーを示す。左側パネル：実線標識、ＩＧＦ−ＩＩトレー
サー；開いた標識、トレーサー＋ＡＬＳ。右側パネル：
実線標識、トレーサー＋ＢＰ−５３：開いた標識、トレ
ーサー＋ＢＰ−５３＋ＡＬＳ。
［１２５Ｉ］−標識ＩＧＦ−ＩＩトレーサーのクロマト
グラフィー像に与える影響を示す。ＢＰ−５３（１ｎｇ
／２００μｌ）またはＡＬＳ（１００ｎｇ／２００μ
ｌ）の存在下または不存在下にて、２２℃で２時間予め
インキュベートした、５００００ｃｐｍＩＧＦ−ＩＩト
レーサーを含有する２００μｌ試料を、５０ｍＭリン酸
ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化
ナトリウム、０．１％ウシ・アルブミン、ｐＨ６．５に
てのスーパーローズ−１２高効率クロマトグラフィーカ
ラム上のクロマトグラフィーに付した。０．５ｍｌずつ
の画分を１ｍｌ／分で収集し、各画分の放射能活性を測
定した。各パネルで、左から右への３つの矢印は１５０
ｋＤａ、６０ｋＤａおよび７．５ｋＤａの分子量マーカ
ーを示す。左側パネル：実線標識、ＩＧＦ−ＩＩトレー
サー；開いた標識、トレーサー＋ＡＬＳ。右側パネル：
実線標識、トレーサー＋ＢＰ−５３：開いた標識、トレ
ーサー＋ＢＰ−５３＋ＡＬＳ。
【図１０】 図１０は、ルーチンＡＬＳアッセイにおけ
る正常な、下垂体機能低下または先端肥大症の被験者か
らの酸性化〜中性化ヒト血清の濃度を増加させることに
よる競合を示し、そこでは、不完全精製ＡＬＳ／２５０
μＬインキュベーション培地の６００ｎｇ（即ち、２．
４μｇ／ｍＬ）が添加血清の不存在下でほぼ１の１５０
Ｋ／６０Ｋ比を与えた。血清濃度は容量項（ａ）または
免疫活性ＢＰ−５３含量項（ｂ）により表される。説明
した酸性化〜中性化血清試料は、ＲＩＡによると４．４
９μｇ／ｍＬ（正常）、０．９３μｇ／ｍＬ（下垂体機
能低下）、または１ ０．４９μｇ／ｍＬ（先端肥大
症）ＢＰ―５３を含有していた。
る正常な、下垂体機能低下または先端肥大症の被験者か
らの酸性化〜中性化ヒト血清の濃度を増加させることに
よる競合を示し、そこでは、不完全精製ＡＬＳ／２５０
μＬインキュベーション培地の６００ｎｇ（即ち、２．
４μｇ／ｍＬ）が添加血清の不存在下でほぼ１の１５０
Ｋ／６０Ｋ比を与えた。血清濃度は容量項（ａ）または
免疫活性ＢＰ−５３含量項（ｂ）により表される。説明
した酸性化〜中性化血清試料は、ＲＩＡによると４．４
９μｇ／ｍＬ（正常）、０．９３μｇ／ｍＬ（下垂体機
能低下）、または１ ０．４９μｇ／ｍＬ（先端肥大
症）ＢＰ―５３を含有していた。
【図１１】 図１１はルーチンＡＬＳアッセイにおける
純粋なＢＰ−５３による競合、（ａ）ＩＧＦ類なくし
て、または３．５倍モル過剰の純粋なヒトＩＧＦ−Ｉま
たはＩＧＦ−ＩＩと共に行った行ったプレインキュベー
ションの後のＢＰ−５３濃度の増加の効果を示す。パネ
ル（ｂ）は濃度を増大させたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−
ＩＩと共にインキュベートする固定したＢＰ−５３濃度
（０．８μｇ／ｍＬ）の効果を示す。
純粋なＢＰ−５３による競合、（ａ）ＩＧＦ類なくし
て、または３．５倍モル過剰の純粋なヒトＩＧＦ−Ｉま
たはＩＧＦ−ＩＩと共に行った行ったプレインキュベー
ションの後のＢＰ−５３濃度の増加の効果を示す。パネ
ル（ｂ）は濃度を増大させたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−
ＩＩと共にインキュベートする固定したＢＰ−５３濃度
（０．８μｇ／ｍＬ）の効果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/65 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 27/447 Ａ６１Ｋ 37/36 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 14/65 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ａ
Claims (16)
- 【請求項１】 以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａ
であってよい]を得るために必要な程度まで精製され、
さらに、非複合体形成ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、または
ＢＰ−５３に結合するその無能力、およびＩＧＦ−１と
複合体を形成した場合にはＢＰ−５３に結合するその能
力によって特徴付けられ、ここに該ＡＬＳは還元または
非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定し
て約８４ないし８６ｋＤａの分子量を有し、Ｎ−グルカ
ナーゼで処理した後は６６ｋＤａの分子量を有する該イ
ンスリン様成長因子結合蛋白複合体の酸不安定サブユニ
ット(ＡＬＳ)より実質的になる組成物。 - 【請求項２】 ＩＧＦ、酸安定ＩＧＦ結合蛋白（ＢＰ５
３）および請求の範囲第１項記載のＡＬＳを一緒に混合
し、さらに医薬上許容されるまたは獣医学上許容される
担体または添加剤と組み合わせることにより製造したＩ
ＧＦ蛋白複合体を含有する組成物。 - 【請求項３】 該ＩＧＦ、該酸安定ＩＧＦ結合蛋白（Ｂ
Ｐ５３）および該ＡＬＳが生物学的に純粋である請求の
範囲第２項記載の組成物。 - 【請求項４】 体液をサイズ分画マトリックスで分画し
て遊離ＡＬＳをインスリン成長因子結合複合体の他の成
分から分離し、しかる後、分画した試料中のＡＬＳのレ
ベルを定量することを特徴とする体液中のＡＬＳのレベ
ルの検出方法。 - 【請求項５】 復元されたインスリン様成長因子結合蛋
白複合体の形成の程度を測定することによって身体試料
におけるＡＬＳのレベルを検出する請求の範囲第４項記
載の方法。 - 【請求項６】 以下の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａ
であってよい]を有するインスリン様成長因子の酸不安
定サブユニット(ＡＬＳ)をコード付けする組換え核酸配
列。 - 【請求項７】 請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列を含
有する発現ベクター。 - 【請求項８】 請求の範囲第７項記載の発現ベクターで
形質転換した原核生物または真核生物である宿主細胞。 - 【請求項９】 ｃＤＮＡである請求の範囲第６項記載の
組換え核酸配列。 - 【請求項１０】 請求の範囲第８項記載の宿主細胞によ
って生産されたＡＬＳ。 - 【請求項１１】 配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａ
であってよい]をコード付けする核酸よりなる核酸単離
体。 - 【請求項１２】 ＡＬＳの残基１〜５、２〜７、５〜
９、７〜１１、８〜１４、１１〜１５、１３〜１７、３
〜９、２〜８、４〜０、６〜１２、８〜１４、１０〜１
６、１２〜１８、１〜６、３〜９、５〜１１、７〜１
３、９〜１５、１１〜１７、４〜９、６〜１１、８〜１
３、１０〜１５、または１２〜１７をコード付けする核
酸よりなる核酸単離体。 - 【請求項１３】 さらに複製可能なベクターよりなる請
求の範囲第１１項または第１２項記載の核酸単離体。 - 【請求項１４】 さらに、配列： XaaAspProGlyThrProGlyGluAlaGluGlyProAlaCysProAlaAl
aCys−（配列番号：１） [式中、該最初のアミノ酸ＸａａはＧｌｙまたはＡｌａ
であってよい]をコード付けする核酸の５’末端に結ば
れた分泌シグナル配列をコード付けする核酸よりなる請
求の範囲第１１項記載の核酸単離体。 - 【請求項１５】 請求の範囲第１１〜１４項いずれか１
項に記載の単離体で形質転換した宿主細胞。 - 【請求項１６】 ＡＬＳの残基１〜５、２〜７、５〜
９、７〜１１、８〜１４、１１〜１５、１３〜１７、３
〜９、２〜８、４〜０、６〜１２、８〜１４、１０〜１
６、１２〜１８、１〜６、３〜９、５〜１１、７〜１
３、９〜１５、１１〜１７、４〜９、６〜１１、８〜１
３、１０〜１５、または１２〜１７の配列よりなるＡＬ
Ｓの断片からなるポリペプチド。
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