KR20210070325A - 변형된 사람 에리트로포이에틴 - Google Patents
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Abstract
증가된 혈장 반감기를 지니고, 조혈 활성이 천연 에리트로포이에틴과 관련하여 0.5% 미만이며, 신경보호 및 신경가소성 능력을 유지하고, N-글리코실화용 컨센수스 부위를 혼입시킴으로써 적어도 하나의 결합 부위에 단독이량체성 또는 헤테로이량체성 수용체의 돌연변이를 포함하는, 변형된 사람 에리트로포이에틴이 본원에서 개시된다.
Description
본 발명은 중추 신경계, 예를 들면, 뇌혈관 발작(cerebrovascular accident), 신경외상(neurotrauma), 신경염증(neuroinflammation) 및 신경변성(neurodegeneration)의 질환 치료에 유용한 신경가소성(neuroplastic) 및 신경 보호능을 지닌 변형된 에리트로포이에틴 분자(modified erythropoietin molecule)를 기술하고 있다.
기술의 설명
에리트로포이에틴(EPO)은 이의 중요한 다면발현성 활성에 의해 특징화되는 제I형 사이토킨 상과(superfamily)의 부분이다[1]. 이러한 사이토킨은 다른 분자와 상승적으로 작용하여 적혈구 계통 세포 전구세포(erythroid lineage cell progenitor)의 분화 및 생존을 촉진하는, 적혈구생성의 주요 조절인자 중 하나이며 순환하는 적혈구의 덩어리를 유지한다[2].
사람 EPO(hEPO)는 고도로 글리코실화된 단백질이며, 이의 분자량은 30 내지 39 kDa이다. 이는 3개의 컨센수스(consensus) N-글리코실화 부위 및 전체 점유 정도와 함께 발생할 수 있는 하나의 O-글리코실화 부위[3]를 나타낸다. 당의 쇄는 단당류의 가변 서열 및 가변량의 시알산(SA)으로 구성된다[4, 5]. N-연결된 탄수화물은 2, 3 또는 4개의 측쇄를 함유할 수 있으며, 이들 각각은 음으로 하전된 SA 분자로 종결된다. 이의 부분의 경우, O-글리코실화 부위에 결합된 탄수화물은 2개 이하의 SA 분자를 함유할 수 있다[6].
글리코실화, 특히 N-글리칸의 SA 말단은 EPO의 생체내(in vivo) 생물학적 활성에는 기본적이지만, 시험관내(in vitro) 수용체 결합에는 필수적이지 않다[7, 8] . 즉, 보다 낮은 글리코시드 함량을 지닌 EPO 분자가 EPO 수용체(EPOR)에 대해 높은 친화성을 갖는 이유이지만; 이의 생체내 활성은 이의 혈장 청소(plasma clearance)의 증가에 의해 소멸된다[8] . 이러한 사이토킨의 글리코실화 정도는 이의 생산 효율, 수용체에 대한 친화성, 혈장 반감기, 분비 및 단백질 안정성에 영향을 미친다[5, 9].
1985년에 hEPO 유전자의 클로닝 이래로, 사이토킨 생물학에 대한 지식은 놀랍게 변화되어 왔다. 첫번째 진전 중 하나는 분자의 새로운 생물학적 작용의 발견이며, 이는 이의 적혈구생성 능력(erythropoietic capacity)을 확장시키고 몇가지 중요한 생리학적 공정을 포함하였다. 가장 중요한 것 중 일부는 혈관형성, 혈관 내성 조절 및 보다 중요하게는 세포 보호이다[10, 11]. 에리트로포이에틴의 가장 중요한 활성이 조혈이지만, 다양한 조직 및 비-조혈 세포 내에서 EPO 및 이의 수용체의 존재는 EPO가 다수의 기능을 가지고 있다는 앞서 언급한 가설을 입증하였으며, 가장 중요한 것 중 하나는 중추신경계, 심장, 신장, 위장 시스템, 생식관 및 내피 세포[12]에서, 세포 증식, 혈관형성을 촉진하는 세포보호 기능이며 세포 세포자멸사를 억제한다[13]. 이러한 발견은 심장 마비(heart attacks), 뇌혈관 공격 및 신경보호와 관련된 많은 다른 것과 같은 다른 병리학의 치료를 위한 임상 용도의 예측을 확장시켰다[14].
신경보호는 뇌에서 세포 상호작용을 유지 및 회복시켜, 신경 기능의 최대 보호를 야기하기 위한 접근법으로 정의될 수 있다[15]. 신경보호의 목표는 중추신경계의 질환, 예를 들면, 뇌혈관 발작, 신경외상, 신경염증 및 신경변성에서 병리학적 신경 손실을 방지하기 위한 것이다.
신경변성 질환은 신경계에 영향을 미치는 병리학적 세트이며, 인지 장애, 거동 장애 및 신체 조절 시스템에서의 변화를 유발한다. 이는 이의 만성 및 점진적인 발전을 특징으로 한다. 이러한 병리학은 질환, 예를 들면, 다른 것들 중에서도 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 상이한 유형의 치매(dementia), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 다발 경화증(multiple sclerosis) 및 헌팅톤 질환(Huntington's disease)을 포함하며, 이는 모든 국가들이 직면하여야 하는 의학, 보건, 사회 및 경제적 측면으로부터의 문제를 구성한다[16]. 그러나, 세계 인구가 노화됨에 따라, 신경학적 장애의 영향은 선진국 및 개발도상국 둘 모두에서 커질 것이다. 신경학적 장애의 부담은 65세 연령의 국민의 퍼센트가 증가하는 국가에서 유의적인 비에 도달한다. 알츠하이머 질환 만을 고려할 때, 통계는 2050년에는 1억 1500만명으로 증가한다고 추정되는 수치인, 전세계적으로 대략 4400만 명의 사람이 치매를 앓고 있음을 나타낸다. 이는 당해 병리학이 세계적 유행으로 고려되는 이유이다[17-19]. 이러한 이유로, 세계적으로 다수의 연구 그룹이 이러한 유형의 신경변성 병리학을 제어하기 위한 치유를 제공하는 치료에 대한 연구에 종사하고 있다.
다수의 연구 그룹의 결합 효과는 문제의 근원에 대한 새로운 및 촉망되는 기반을 전달하기 위한 연구 진전을 허용하여 왔으며 조기 단계에서 이를 검출할 뿐만 아니라 이를 공격할 보다 특수한 방식을 정의하는 희망을 제공하여 왔다. 그러나, 심지어 이러한 노력은 이러한 병리학을 치유할 수 있는 임의의 생물치료제를 확인하지 않았다. 이러한 의미에서, 의약품 시장은 이러한 질환이 검출되면 이러한 질환의 진행을 지연시키기 위해 처방된 의약을 단지 제공하지만 이의 이점은 종종 감지할 수 없으며, 이는 새로운 치료법을 개발하는 것이 필요한 이유이다. 심경변성 질환이 오늘날 나타내는 건강 문제를 해결하는데 있어서의 성공은 다른 양태 중에서, 병인 또는 잠재하는 병리학에 양호하게 영향을 미치고, 질환의 발생 또는 점진적인 임상적 악화를 안전하고 성공적이며 효과적인 방식으로 방지하거나 지연시킴으로써 이점 및 지속된 효과를 생성하는 치료요법의 달성에 의존할 것이다. 그러나, 차례로 많은 인구에 접근가능한 효율적인 기술을 제시하는 것이 필수적일 것이다. 최근 몇년 동안 의약품 산업의 주요 목적은 중추 신경계의 많은 질환, 예를 들면, 세포자멸사, 산화 스트레스, 염증, 대사 기능장애 또는 절충된 신경가소성(compromised neuroplasticity)의 발달에서 일반적인 주요 포인트를 공격할 수 있는 화합물을 발견하여 왔다.
연구 영역에서, EPO는 세포 손상의 보호 및 회복과 직접적으로 관련된, 뇌 속에서 광범위한 세포 반응을 개발하기 위한 이의 능력으로 인하여 매우 중요한 역활을 한다[20]. EPO는 소염, 항산화, 항신경독성, 혈관형성, 신경영양, 재생 및 항-세포자멸사 메카니즘을 통해 신경보호를 유도할 수 있다.
이러한 관점에서, EPO의 연구시 다른 매우 중요한 진전은 이의 조혈 및 세포보호 생물학적 활성과 관련된 2개의 상이한 분자 부위의 확인이었다. 이러한 2개의 활성은 사이토킨의 2개의 상이한 수용체 시스템: 조혈 활성에 관여하는 단독이량체성 수용체(EPOR)2 및 세포보호 활성과 관련된 이종이랑체 수용체 EPOR-pCR에 대한 결합을 통해 부여된다. 이러한 발견은 이들이 EPO가 이의 생물학적 활성을 발달시키는 경로를 이해하는데 필수적인 정보를 제공하였으며, 따라서 EPO 또는 EPO 유사체와 같은 비-선택적인 제제의 사용과 관련된 부작용을 피하거나 적어도 제거하는 목적과 함께 이의 조혈 또는 세포보호 반응의 선택적인 조절을 허용한다.
이러한 의미에서, EPO는 치매의 치료시 안전하고 잘 견디어지는 약물로 고려되지만, EPO를 뇌혈관 공격 또는 심장마비를 가진 환자에서 세포보호제로서, 즉, 치매를 앓지 않는 환자에서 신경보호제로서 사용하려는 경우, 이의 조혈 효과는 적혈구증가증(polycythemia), 고혈압(hypertension) 및 부혈전 현상(prothrombotic phenomena)을 유발할 수 있으므로, 부작용으로 고려되어야 한다[22-25]. 이는 이의 조혈 역활 및 이의 세포보호 역활을 선택적으로 조절하는 EPO 유사체의 개발이 매우 관련되어 있기 때문이다[14]. 이러한 목적 이후로, 다양한 전략이 사이토킨의 조혈 활성을 제거하면서도, 분자에서 화학적 변형의 적용 또는 글리코시드 함량의 조작을 통해, 이의 신경보호 잠재능을 유지시키는 것이 고안되었다.
EOP 분자에서의 화학적 변형을 사용하는 전략과 관련하여, 호모시트룰린 잔기를 생성하는, 7개의 라이신 잔기의 카바밀화가 평가되었다[26]. 그러나, 이러한 방법론은 이의 기능에 영향을 미치는 단백질내 구조적 변화를 생성한다. 이러한 결과를 기반으로, 상이한 작업 그룹은 카바밀화에 의해 재조합 hEPO(rhEPO)를 완전히 변형시켜, 이의 세포보호 활성을 보유하지만 조혈 활성을 결여하는 ECPO로 불리는 신규 분자를 수득하였다[26-28]. 그러나, 바람직한 목적을 달성하고 이의 치료학적 효능을 유지하기 위해서는 높은 및 다수의 용량이 요구된다.
다른 한편, 시알산의 이의 함량을 조작함으로써 rhEPO에 대해 변형이 이루어져 왔다(SA). 2003년에, 에르바이락타(Erbayraktar) 등[29]은 EPO 글리코시드 쇄의 말단에 존재하는 SA의 잔기를 완전히 제거함으로써 소위 시알로 EPO를 생성하였다. 이러한 새로운 EPO 변이체는 높은 시험관내 활성을 나타내었다. 그러나, 이의 생체내 신경보호 활성은 rhEPO를 사용하여 수득된 것과 필적하였다.
다른 한편, 및 조혈-자극 사이토킨의 순환하는 반감기를 증가시킬 목적으로, 에그리에(Egrie) 및 브라운(Brown)[6]은 조혈작용을 자극하는 단백질: NESP를 개발하였으며, 이는 hEPO로부터 유래되고 2개의 추가의 N-글리코시드화 부위를 나타낸다. 이러한 변형은 혈장내 반감기 및 이의 생체내 조혈 효능에 있어서 3배 증가를 이끌었다.
글루시드 함량의 조작과 관련하여, 본 출원의 발명자는 대뇌 EPO(rhNEPO)와 유사한 특성을 지닌 rhEPO 변이체를 수득하였으며, 이는 rhEPO의 산성이 거의 없는 동형의 조합이다. 이러한 변이체는 rhEPO의 것과 동일한 신경보호 활성을 나타내었으며 4% 미만의 조혈 활성을 나타내었다[30]. 그러나, rhNEPO의 신속한 혈장 청소는 당해 분자를 혈장 농도를 시간 맞춰 지속시기고 이의 생물학적 작용을 발휘하도록 하는 데 적절한 만성 신경학적 질환의 치료를 위한 후보물로서 제한하는 경우 단점이다. 더욱이, 당형태의 조합이 이의 시험관내 조혈 활성을 보유하는 것을 고려할 때, 목적을 달성하기 위한 높고 흔한 용량의 투여는 부작용으로 고려된, 조혈 효과를 생산할 위험을 수반한다.
또한, 당해 분야의 첨단 기술은 신경보호 활성, 및 조혈 활성의 부재를 나타내는 에리트로포이에틴의 분자 또는 이로부터 유래된 펩타이드를 수득하는데 있어서 많은 다른 노력을 나타낸다. 이와 관련하여, 특허 제US2015119325호는 식물에서 생산된 아시알로에리트로포이에틴(아시알로-rhEPO)을 기술하고 있다. 특허원 제US2009170759호, 제US2003130197호, 제MXPA02011727호, 및 제US2003130197호는 중추 신경계를 포함한 질환의 치료를 위한 EPO 수용체에 결합하는 펩타이드를 기술하고 있다.
문서 제W02004043382호는 2개 이상의 상이한 EPO 변형 부위에서 아미노산 차이 및 향상된 에리트로포이에틴 활성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 사람 에리트로포이에틴 폴리펩타이드의 변이체를 기술하고 있다. 본 발명은 2개 이상의 상이한 EPO 변형 영역내 아미노산 차이 및 이의 세포보호 능력과 관련된 중간의 에리트로포이에틴 활성을 갖는 사람 에리트로포이에틴 아미노산 서열을 함유하는 에리트로포이에틴 폴리펩타이드의 사람 변이체를 목표로 한다.
특허 제US2011008363호는 1 내지 10개의 아미노산이 단백질의 C-말단에서 결실된 EPO의 상이한 변이체를 기술하고 있다. 이는 감소된 조혈 활성 및 보존된 신경보호 작용을 지닌 보다 낮은 분자량의 변이체이다.
출원 제US2007027068호는 글리코페길화된 EPO 펩타이드를 기술하고 있다. 돌연변이된 EPO 펩타이드 중 하나는 아미노산 서열(서열 번호: 73)을 포함하고 Arg<139> 내지 Ala <139>, Arg<143> 내지 Ala <143> 및 Lys<154> 내지 Ala <154>로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.
제ES2457398(T3)호는 EPO 변이체를 암호화하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
제PCT W02005025606(Al)호는 조혈 활성을 증가시키고 이의 세포보호 활성을 유지시키기 위해 올리고사카라이드를 혼입시키는 변형된 EPO를 기술하고 있다.
유사하게, 제W02006127910호는 글리코실화되어 적혈 세포의 생산을 향상시키는 EPO를 기술하고 있다. 그러나, 이는 세포보호 기능을 발휘하므로 신경변성 질환을 치료하는 데 또한 유용함이 여기에 언급되어 있다.
아르헨티나에 출원된 특허원(AR055654)은 신경변성 장애의 치료용의 재조합 에리트로포이에틴을 기술하고 있다. 이의 명세서는 글리코실화 부위를 가하도록 변형될 수 있는 아미노산을 상세히 설명하고 있으며 다음의 잔기의 변형이 강조되어 있다: 87, 88, 90 // 30, 32, 87, 88, 90 // 24, 87, 88, 90 // 38, 87, 88, 90 // 83, 87, 88, 90. 이는 순환하는 반감기를 증가시켜 조혈 활성을 증가시키기 위하여 글리칸을 혼입시키는 것을 목표로 하고 있다. 동일한 목적이 특허 제WO9505465호에 도입된 변형에 나타나 있으며 상기 특허는 추가의 글리코실화 부위를 갖는 에리트로포이에틴의 변이체를 기술하고 있다. 특허에 언급된 부위들 중 일부는 25, 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136, 138이다.
또한, 다음의 치환이 언급된다:
Asn<30>Thr<32> EPO;
Asn<51>Thr<53> EPO; Asn<57>Thr<59> EPO;
Asn<69>EPO;
Asn<69>Thr<71> EPO;
Ser<68>Asn<69>Thr<71> EPO;
Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Gly<89>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90>Thr<92> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90>Ala<l 62> EPO;
Asn<69>Thr<72>Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO;
Ser<87>Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO;
Asn<136>Thr<138> EPO;
Asn<138>Thr<140> EPO;
Thr<125> EPO; 및
Pro<124>Thr<125> Epo.
문서 제W02005103076호는 짝수의 시스테인 잔기, 바람직하게는 4개 이하의 시스테인 잔기, 또는 보다 바람직하게는 2개 이하의 시스테인 잔기를 갖는 EPO 변이체를 기술하고 있다. 바람직하게는, 시스테인 잔기는 7, 29, 33, 및 161번 위치, 심지어 보다 바람직하게는 7 및 161번 위치에 존재할 수 있다. 당해 출원에 의해 제공된 추가의 변이체는 다음의 위치 중 하나 이상에서 첨가에 의한 임의의 변형을 포함한다: 6, 29, 33, 45, 47, 48, 49, 61, 64, 74, 88, 92, 107, 109, 133, 135, 154, 157, 및 158.
특허원 제US2011003744호는 조혈 특성을 증가시키기 위하여 효소적으로 변형된 글리코시드 잔기를 통해 폴리에틸렌 글리콜-접합된 단백질 또는 폴리 에탄올아민-접합된 단백질을 포함하는 에리트로포이에틴 제형을 기술하고 있다.
문서 제MXPA05000063호는 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과 중 하나 이상을 결여한 조직-보호 재조합 사이토킨을 기술하고 있으며; 조직-보호 재조합 사이토킨은 조혈 활성을 결여하고 있고; 보다 바람직하게는 조직-보호 재조합 사이토킨은 골수 내 에리트로포이에틴의 모든 효과를 결여하고 있다. 설명에서, 변화는 하나 이상의 아미노산에서, 또는 EPO에 대해 결실 또는 첨가를 이룰 수 있다고 언급하고 있다. 바람직한 구현예에서, 조직-보호성 재조합 사이토킨은 다음 영역 중 하나 이상에서 하나 이상의 변형을 갖는다: VLQRY(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 11-15, 서열 번호: 1) 및/또는 TKVNFYAW(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 44-51, 서열 번호: 2) 및/또는 SGLRSLTTL(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 100-108, 서열 번호: 3) 및/또는 SNFLRG(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 146-151, 서열 번호: 4). 다른 돌연변이가 서열 번호: 10의 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156, 및 161번 아미노산에서 제공될 수 있다. 이러한 다른 돌연변이는 앞서 언급한 영역 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 돌연변이에 대해 유일하거나 추가적일 수 있다.
특정의 구현예에서, 천연의 사람 에리트로포이에틴의 TKVNFYAW의 하나 이상의 아미노산(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 44 내지 51번, 서열 번호: 2)내 변화는 부분 기능, 즉, rhRPO보다 조혈 활성이 더 적은 변형된 에리트로포이에틴 분자를 생성한다. 다른 구현예에서, SGLRSLTTL의 하나 이상의 아미노산 내 변화(천연의 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 100 내지 108번, 서열 번호: 3)로, 시알산 또는 글리칸을 결여하는 분자의 함량에 있어서의 변형 또는 산화, 환원과 같은 탄수화물내 변형 또는 질화, 아실화, 석시닐화, 바이오티닐화, 요오드화 및 카바밀화와 같은 화학적 변형을 지닌 변이체가 심지어 존재한다. 이를 환원시키거나 차단시키기 위한 목적으로 조혈 활성에 관여하는 부위내 새로운 글리칸의 첨가에 대한 참고는 존재하지 않는다.
지금까지 개발된 당해 분야의 첨단 기술의 설명에서 기술된 노력은 신경보호 활성 및 조혈 활성의 부재를 나타내는 에리트로포이에틴을 수득하는데 있어서 성공적인 결과를 수득하지 못하였음을 인식하는 것이 가능하다. 본 발명은 신경보호 및 신경영양 효과를 갖는 새로운 hEPO 뮤테인(mutein)을 나타낸다. 이러한 뮤테인은 hEPO 분자를 단독- 및 헤테로이량체성 수용체에 대한 이의 결합에 관여하는 hEPO 분자 영역 상에서 N-글리코실화를 위한 새로운 컨센수스 부위의 생성을 통해 hEPO 분자를 변형시키는 원래의 공정에 의해 수득되었다. 예상치못하게, 새로운 hEPO 뮤테인은 조혈 활성을 결여하지만 이의 신경보호/신경가소성 활성은 변경되지 않거나, 심지어 개선되었고, 궁극적으로 이들은 이의 약동학적 특성에 있어서의 개선을 나타낸다. 원래의 EPO의 변형은 최소이며, 이는 천연 단백질의 구조와 큰 유사성을 유지하도록 한다.
발명의 간단한 개요
본 발명은 이의 조혈 활성의 부재 또는 감소, 바람직하게는 사람 에리트로포이에틴과 관련하여 0.5% 이하의 조혈 활성, 혈장 속에서 보다 긴 반감기를 지니고, 이는 이의 신경보호 및 신경가소성 능력을 유지하는 변형된 사람 에리트로포이에틴을 기술한다. 이러한 변형된 사람 에리트로포이에틴의 단독- 또는 헤테로이량체성 수용체 중 적어도 하나에 대한 결합은 부분적으로 또는 완전히 제거된다. 이러한 무효성은 N-글리코실화에 대한 컨센수스 부위의 혼입에 의한 단독- 또는 헤테로이량체성 수용체에 대한 결합 부위 중 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Tyrl5Asn 및 Leul7Thr를 갖고, 서열 번호: 2를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Lys45Asn 및 Asn47Thr를 가지고, 서열 번호: 4를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Glu62Asn 및 Trp64Thr을 가지고, 서열 번호: 8을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Gln65Asn 및 Leu67Thr을 가지고, 서열 번호: 10을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Glu72A 및 Val74Thr을 가지고, 서열 번호: 12를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Arg76Asn 및 Gln78Thr을 가지고, 서열 번호: 14를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Ala98Asn 및 SerlOOThr을 가지고, 서열 번호: 16을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Serl04Asn을 가지고, 서열 번호: 18을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Thrl06Asn 및 Leul08Thr을 가지고, 서열 번호: 20을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Leul49Thr을 가지고, 서열 번호: 22를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 사람 에리트로포이에틴은 다음의 돌연변이: Glyl51Asn 및 Leul53Thr을 가지고, 서열 번호: 24를 포함한다.
본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴은 사람 에리트로포이에틴과 관련하여 1% 이하의 조혈 활성을 갖는다. 바람직하게는, 이는 사람 에리트로포이에틴과 관련하여 0.5% 이하의 조혈 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 이는 사람 에리트로포이에틴과 관련하여 0.2% 이하의 조혈 활성을 갖는다.
다른 한편, 본 발명은 본 발명의 에리트로포이에틴의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 기술한다. 또한, 기술되고 생성된 뮤테인 각각을 암호화하는 이러한 DNA 서열이 요약되어 있다. 이러한 DNA 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23이다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 이러한 핵산은 세포를 형질전환하기 위한 벡터이거나, 발현 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 3이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 7이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 9이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 11이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 13이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 15이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 17이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 19이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 21이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 23이다.
또한, 본 발명은 일반적으로 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23에 의해 포함된 세트로부터 선택된 임의의 DNA 서열을 지닌 변형된 세포를 기술하며; 여기서 이러한 유전적으로 변형된 세포는 본 발명의 변형된 에리트로포이에틴을 발현할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 유전적으로 변형된 세포는 식물 세포, 또는 동물 세포 또는 N-글리칸의 첨가를 허용하는 임의의 세포 숙주이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 동물 세포주로부터 유래된다. 바람직하게는, 이러한 세포주는 CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21, 및 HeLa에 의해 포함된 세트로부터 선택된다.
다른 한편, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 변형된 사람 에리트로포이에틴을 수득하는 공정을 기술한다:
a. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
b. 패키징 세포(packaging cell)의 적어도 하나의 공-형질감염 벡터를 구축하는 단계;
c. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 당해 핵산 서열을 함유하는 렌티바이러스 입자를 생산하는 패키징 세포를 공-형질감염시키는 단계;
d. 단계 c의 패키징 세포에 의해 생산된 이러한 렌티바이러스 입자를 수거(harvesting)하는 단계;
e. 변형된 사람 에리트로포이에틴을 발현할 수 있는 세포를 단계 d의 상기 렌티바이러스 입자로 형질도입시키는 단계;
f. 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단계 e에서의 세포를 선택하는 단계;
g. 단계 f로부터의 세포를 배양하여 이들이 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 발현하도록 하는 단계; 및
h. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 단리 및 정제하는 단계.
상기 단계 a에서, 핵산 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23에 의해 포함된 세트로부터 선택된다.
여기서 단계 b는 세포내로 렌티바이러스 입자의 도입을 허용하는 벡터(vector), 매트릭스 단백질(matrix protein), 캡시드, 렌티바이러스 프로테아제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 인테그라제를 암호화하는 벡터, 변형된 사람 에리트로포이에틴 서열을 포함하는 전달 벡터(transfer vector), 및 형질감염 벡터의 핵 외수송(nuclear export)을 유도하는 벡터를 포함한다.
상기 단계 e에서, 상기 세포는 CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21, 및 HeLa를 포함하는 세트로부터 선택된다.
여기서 상기 단계 h는 항-rhEPO 항체, 및 용출물(eluent)을 포함하는 면역친화성에 의한 정제이다.
여기서 상기 용출물은 글리신, 아세트산-NaCl, 아세테이트 염, 시트르산, 인산염, 에탄올, 이소프로필 알코올, 디옥산, 에틸렌 글리콜, 트리스-HCl, 및 이의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이러한 용출물은 글리신, 아세트산-NaCl을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 용출물은 0.1 M 글리신(pH=2); 0.15 M 글리신(pH=2.5), 및 0.2 M 아세트산, 0.15 M NaCl(pH=3)을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
도 1. 부위-지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 통해 12개의 hEPO 뮤테인을 수득하기 위한 단계의 순서의 개략도.
도 2. 아가로즈 겔을 사용하여 PCR 반응 각각에서 수득된 단편의 분석, a- PCR1으로부터 수득된 단편. b- PCR2로부터 수득된 단편.
도 3. IEDB 데이타베이스를 사용한 hEPO 뮤테인 및 변형되지 않은 분자의 잠재적인 항원성의 인 실리코(in silico) 분석.
도 4. 새로운 N-글리코시드화 부위의 삽입을 입증하는 웨스턴 블롯(Western Blot).
도 5. ELISA 샌드위치 기술에 의해 평가된 rhEPO 분자 또는 이의 뮤테인의 용출능.
■ 프로토콜 A(복합체 Ag-Ac가 형성된 후 용출능).
■ 프로토콜 B(상이한 용출물로 mAb를 처리한 후 목적한 분자에 대한 결합능의 보존도).
도 6. mAb 2B2를 사용한 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통한 hEPO 뮤테인 Mut 104의 정제.
A - hEPO 뮤테인 Mut 104의 정제 동안에 수득된 완전한 크로마토그램.
B - 크로마토그램 A 용출 구역의 확장.
도 7. 용출물 용액으로서 0.15 M 글리신(pH 2.5)을 사용한 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통한 뮤테인 Mut 104 정제의 평가. 샘플: 1- 씨딩(Seeding), 2- 유동통과(Flowthrough), 3- 세척 1, 4- 세척 2, 5- 세척 3, 6- 용출 분획의 혼합, 7- rhEPO 표준(Zelltek S.A.).
도 8. hEPO 뮤테인의 면역친화성 크로마토그래피(IAC) 후 수득된 용출물 속의 순도 분석. 샘플: 1- 분자량 마커, 2- rhEPO 표준(Zelltek S.A.), 3- 용출물 Mut 45_47, 4- 용출물 Mut 104, 5- 용출물 Mut 151_153.
도 9. hEPO 뮤테인의 겉보기 분자량의 측정. MM: 분자량 마커.
도 10. 면역친화성 크로마토그래피(IAC)로 정제한 hEPO 뮤테인의 IEF. 샘플: 1- Mut 45_47, 2- Mut 104, 3-rhEPO 표준(Zelltek S.A).
도 11. rhEPO 및 이의 뮤테인에 대해 수득된 ECZ 전기영동도. A: Mut 45_47; B: Mut 104; C: rhEPO. 용어 "피크(Peak)"는 ECZ 전기전도도에서 지정된 각각의 피크에 상응하고 "면적(Area)"(%)은 각각의 피크의 곡선하 면적을 통합하여 계산한, 각각의 동형의 퍼센트를 나타낸다.
도 12-a-. hEPO 뮤테인에 대해 시험관내에서 평가된 특이적인 조혈 생물학적 활성의 비교.
도 12-b-. hEPO 뮤테인에 대한 생체내 조혈 활성의 평가. hEPO 뮤테인(Mut)의 생체내 조혈 활성은, 적절하게는, 동일한 rhEPO 덩어리 또는 hEPO, 또는 대조군으로서 PBS로 처리한 노르모사이테믹 마우스(normocytemic mice)(n=4)에서 평가하였다. 처리 후, 망상적혈구 퍼센트를 각각의 처리에 대해 정량화하였다. ***p < 0.001 및 ns(유의적이지 않음)은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 터키 시험(Tukey test)( n=4 ) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 13. 신경세포 기원한 SH-SY5Y의 세포 배양물을 사용한, rhEPO 및 Mut 104의 세포/신경보호 활성. CSTP: 대조군 스타우로스포린(STP) 첨가, Ccel: 세포 대조군(STP 또는 뮤테인의 첨가 없음) . *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 던넷 시험(Dunnet test)(n=3) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 14. 해마 뉴우런의 1차 배양물 속에서 뉴우런 발달의 대표적인 도해.
도 15. 뮤린 N2a 세포를 통한 신경돌기 형성의 평가, (a) 분석된 그룹 각각의 대표적인 영상. (b) 신경돌기의 다음의 매개변수의 평가로부터 수득된 그래프 표시: 평균 길이, 가장 긴 신경돌기의 연장 및 뉴우런당 신경돌기의 평균 수. *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(Bonferroni test)(n=3) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 16. 랫트 배아로부터 해마 뉴우런의 1차 배양물을 사용한 사상위족(filopodia) 밀도의 평가. *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(n=3) 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
도 17. 랫트 배아로부터 해마 뉴우런의 1차 배양물을 사용한 시냅스 형성의 평가. *p ￡ 0.05 ***p < 0.001은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(n=3) 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
도 18. 11일의 시험관내(DIV) 배양물에서 hEPO 뮤테인의 신경보호 생물학적 활성의 평가. hEPO 뮤테인(Mut)의 시험관내 신경보호 활성을 11 DIV의 스프라그-다울리 랫트(Sprague-Dawley rat)의 해마 뉴우런의 1차 배양물에서 평가하였다. 배양물을, 적절하게는, 동일한 질량의 rhEPO 또는 뮤테인, 또는 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 이후에, 스타우로스포린(STP)과 함께 항온처리함으로써 세포자멸사를 유도시켰다. 면역형광성을 Hoescht 및 팔로딘-FITC 시약으로 수행하여 세포자멸사성 핵의 퍼센트를 분석하였다. ***p < 0,001, **p ￡ 0.01 및 ns(유의적이지 않음)는 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
도 2. 아가로즈 겔을 사용하여 PCR 반응 각각에서 수득된 단편의 분석, a- PCR1으로부터 수득된 단편. b- PCR2로부터 수득된 단편.
도 3. IEDB 데이타베이스를 사용한 hEPO 뮤테인 및 변형되지 않은 분자의 잠재적인 항원성의 인 실리코(in silico) 분석.
도 4. 새로운 N-글리코시드화 부위의 삽입을 입증하는 웨스턴 블롯(Western Blot).
도 5. ELISA 샌드위치 기술에 의해 평가된 rhEPO 분자 또는 이의 뮤테인의 용출능.
■ 프로토콜 A(복합체 Ag-Ac가 형성된 후 용출능).
■ 프로토콜 B(상이한 용출물로 mAb를 처리한 후 목적한 분자에 대한 결합능의 보존도).
도 6. mAb 2B2를 사용한 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통한 hEPO 뮤테인 Mut 104의 정제.
A - hEPO 뮤테인 Mut 104의 정제 동안에 수득된 완전한 크로마토그램.
B - 크로마토그램 A 용출 구역의 확장.
도 7. 용출물 용액으로서 0.15 M 글리신(pH 2.5)을 사용한 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통한 뮤테인 Mut 104 정제의 평가. 샘플: 1- 씨딩(Seeding), 2- 유동통과(Flowthrough), 3- 세척 1, 4- 세척 2, 5- 세척 3, 6- 용출 분획의 혼합, 7- rhEPO 표준(Zelltek S.A.).
도 8. hEPO 뮤테인의 면역친화성 크로마토그래피(IAC) 후 수득된 용출물 속의 순도 분석. 샘플: 1- 분자량 마커, 2- rhEPO 표준(Zelltek S.A.), 3- 용출물 Mut 45_47, 4- 용출물 Mut 104, 5- 용출물 Mut 151_153.
도 9. hEPO 뮤테인의 겉보기 분자량의 측정. MM: 분자량 마커.
도 10. 면역친화성 크로마토그래피(IAC)로 정제한 hEPO 뮤테인의 IEF. 샘플: 1- Mut 45_47, 2- Mut 104, 3-rhEPO 표준(Zelltek S.A).
도 11. rhEPO 및 이의 뮤테인에 대해 수득된 ECZ 전기영동도. A: Mut 45_47; B: Mut 104; C: rhEPO. 용어 "피크(Peak)"는 ECZ 전기전도도에서 지정된 각각의 피크에 상응하고 "면적(Area)"(%)은 각각의 피크의 곡선하 면적을 통합하여 계산한, 각각의 동형의 퍼센트를 나타낸다.
도 12-a-. hEPO 뮤테인에 대해 시험관내에서 평가된 특이적인 조혈 생물학적 활성의 비교.
도 12-b-. hEPO 뮤테인에 대한 생체내 조혈 활성의 평가. hEPO 뮤테인(Mut)의 생체내 조혈 활성은, 적절하게는, 동일한 rhEPO 덩어리 또는 hEPO, 또는 대조군으로서 PBS로 처리한 노르모사이테믹 마우스(normocytemic mice)(n=4)에서 평가하였다. 처리 후, 망상적혈구 퍼센트를 각각의 처리에 대해 정량화하였다. ***p < 0.001 및 ns(유의적이지 않음)은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 터키 시험(Tukey test)( n=4 ) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 13. 신경세포 기원한 SH-SY5Y의 세포 배양물을 사용한, rhEPO 및 Mut 104의 세포/신경보호 활성. CSTP: 대조군 스타우로스포린(STP) 첨가, Ccel: 세포 대조군(STP 또는 뮤테인의 첨가 없음) . *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 던넷 시험(Dunnet test)(n=3) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 14. 해마 뉴우런의 1차 배양물 속에서 뉴우런 발달의 대표적인 도해.
도 15. 뮤린 N2a 세포를 통한 신경돌기 형성의 평가, (a) 분석된 그룹 각각의 대표적인 영상. (b) 신경돌기의 다음의 매개변수의 평가로부터 수득된 그래프 표시: 평균 길이, 가장 긴 신경돌기의 연장 및 뉴우런당 신경돌기의 평균 수. *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(Bonferroni test)(n=3) 후 통계적 유의성 정도를 나타낸다.
도 16. 랫트 배아로부터 해마 뉴우런의 1차 배양물을 사용한 사상위족(filopodia) 밀도의 평가. *p ￡ 0.05 및 **p ￡ 0.01은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(n=3) 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
도 17. 랫트 배아로부터 해마 뉴우런의 1차 배양물을 사용한 시냅스 형성의 평가. *p ￡ 0.05 ***p < 0.001은 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험(n=3) 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
도 18. 11일의 시험관내(DIV) 배양물에서 hEPO 뮤테인의 신경보호 생물학적 활성의 평가. hEPO 뮤테인(Mut)의 시험관내 신경보호 활성을 11 DIV의 스프라그-다울리 랫트(Sprague-Dawley rat)의 해마 뉴우런의 1차 배양물에서 평가하였다. 배양물을, 적절하게는, 동일한 질량의 rhEPO 또는 뮤테인, 또는 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 이후에, 스타우로스포린(STP)과 함께 항온처리함으로써 세포자멸사를 유도시켰다. 면역형광성을 Hoescht 및 팔로딘-FITC 시약으로 수행하여 세포자멸사성 핵의 퍼센트를 분석하였다. ***p < 0,001, **p ￡ 0.01 및 ns(유의적이지 않음)는 ANOVA 시험 y 후-ANOVA 본페로니 시험 후 통계적 유의성의 정도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
당해 분야의 첨단 기술에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 목적은 이의 신경보호 및 신경영양 잠재능을 유지하면서, 사이토킨의 조혈 활성을 감소시키는 상이한 접근법을 고안하고자 함이며, 이는 분자상의 화학적 변형의 적용 또는 이의 글리코시드 함량의 조작을 기반으로 한다. 그러나, 당해 분야의 첨단 기술은 조혈에 관여하는 상호작용에 포함된 분자 부위의 차단 메카니즘으로서 글리코실화의 사용을 기술하고 있지 않다.
따라서, 본 발명은 다음을 동시 달성함으로써 당해 분야의 첨단 기술에서 언급된 문제를 해결하는 신규한 변형된 에리트로포이에틴을 제공한다:
· 신경보호와 관련된 치료를 필요로 하고 여기서 조혈은 부작용이 되는 환자에서 hEPO 조혈 기능의 억제.
· 생체내 생물학적 활성을 개선시키고 투여될 용량의 수를 감소시키기 위한 hEPO 반감기의 연장.
따라서, 본 발명은 신경가소성 및/또는 신경보호가 유리한 효과를 갖는, 질환, 또는 이러한 질환을 앓을 유전적 소인의 예방 또는 치료를 위해 의도된 약제학적 조성물의 제조를 위해 hEPO로부터 유래된 하이퍼글리코시드화된 뮤테인의 용도를 포함한다. 본 발명은 다른 것들 중에서, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)(AD), 파킨슨 질환(Parkinson's disease)(PD), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)을 지닌 환자, 다른 것들 중에서 운동 신경 질환, 예를 들면, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 척수소뇌실조증(spinocerebellar atrophies), 크로이펠츠-야콥 질환(Creutzfeld-Jakob disease); 장애 질환(disabling disease), 예를 들면, 우울증 또는 조현병(schizophrenia); 발달 질환, 예를 들면, 다운 증후군(Down syndrome) 뿐만 아니라 뇌혈관 발작(accident) 또는 두개내 외상(cranioencephalic trauma)으로부터의 신경 조직 손상을 앓는 사람에게 투여될 수 있다.
본 서류에서 용어 "뮤테인"은 N-글리코실화를 위한 컨센수스 및 잠재적인 부위를 도입하기 위하여 이의 아미노산 잔기의 1 또는 2번의 교체를 포함하는 부위-지시된 돌연변이에 의해 변형된 단백질을 지칭한다.
N-글리코실화를 위한 컨센수스 부위의 생성 또는 첨가는 목적한 분자의 부위 또는 영역에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 세포가 글리칸의 첨가를 수행하기 위해서는, Asn-Xaa- Ser/Thr 부위가 존재하는 것이 필수적이며, 여기서 Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산일 수 있다. 이를 위해, Asn 잔기가 N-글리코실화 부위가 첨가되어야 하는 부위에 존재하는 경우, +2번 위치(Asn과 관련하여)에서의 아미노산은 Thr로 돌연변이되고, 이는 Ser과 비교하여 보다 높은 효율을 가짐으로써 Asn 잔기는 글리칸에 의해 점유된다. 상이한 방식으로, 변형될 부위가 Ser 또는 Thr의 존재를 입증하는 +2번 위치에서 아미노산을 갖는 경우, 이러한 아미노산은 Asn으로 돌연변이된다. 다시 말해서, 모든 시기에 보존적 변화가 존재한다.
본 발명은 다음의 달성을 허용하는 아미노산 구조의 변형을 갖는 사람 에리트로포이에틴을 기술한다:
i. 분자 구조 또는 신경보호/신경가소성 활성의 발달을 위한 필수 부위를 구성하는 아미노산 잔기의 보존.
ii. 조혈 활성의 폐지시 제안된 아미노산의 변형.
iii. N-글리코실화용 컨센수스 부위의 생성.
12개의 hEPO 뮤테인을 작제하였다. 이러한 뮤테인에서, 1 또는 2번 아미노산의 변형은 조혈 활성을 폐지하고, 신경보호성/신경가소성 활성을 보존하며 보다 우수한 혈장 반감기를 지닌 돌연변이체를 수득하기 위한 N-글리코실화용 컨센수스 부위를 도입시키기 위해 수행되었다.
본 발명의 분자를 수득하기 위해 수행된 검정(assay)은 하기에 상세히 설명된다. 이러한 검정은 적용을 예시함을 의미하며 본 발명의 보호 범위를 제한하지 않고, 이의 가장 광범위한 의미에서 이해되어야 한다.
1. 조혈 활성을 폐지하고 신경보호성/신경가소성 작용을 보존하는 hEPO-유래된 뮤테인의 설계 및 수득.
본 발명자는 26개의 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다: 이들 중 2개는 새로운 완전한 EPO 서열을 증폭시키기 위한 것이고, 나머지 24개(전방 및 역방 올리고뉴클레오타이드)는 12개의 점 돌연변이를 도입시키기 위한 것이었다.
본 발명에 제공된 설명에 따라서, 변형은 주어진 위치에서의 아미노산의 동일한 위치에서의 다른 아미노산에 의한 치환으로서 해석되어야 한다. 따라서, 예로서 및 돌연변이 1(Lys45 →Asn45) + (Asn47 →Thr47)을 고려할 때, 45번 위치에서의 아스파라긴 잔기에 대해 동일한 위치에서 라이신 잔기의 변화 및 트레오닌에 대해 47번 위치에서의 아스파라긴의 변화로서 해석되어야 한다.
부위-지시된 돌연변이유발에 의해 hEPO 뮤테인을 생성하기 위해 시행된 전략은 도 1에 나타낸다.
주형(template)으로서 hEPO DNA를 사용하는 경우, 각각의 돌연변이체에 대한 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 pMATEPOF(GCCGTCAAGGCCACGTGTCTTGTCCA) 및 PMATEPOR(AGGCCAGTCTTGTGCTCCAGGTACCG), 이는 hEPO 서열의 말단에 대해 상보성으로 결합하며, 제1의 PCR을 수행하여 전술한 돌연변이 각각을 도입시켰다. 12개의 hEPO 뮤테인에 상응하는 24개의 단편을 수득하였다. 상기 12개의 합성된 hEPO 뮤테인(muteins)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
뮤테인 15-17(Tyr15 →Asn15) + (Leu17 → Thr17)
프라이머(primer)는 다음과 같았다:
Mutl5_17F : GTGCTGGAAAGAAACCTGACGGAAGCCAAA
MUT15_17R : TTTGGCTTCCGTCAGGTTTCTTTCCAGCAC
뮤테인 15 내지 17의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGAAACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 15 내지 17의 아미노산 서열(서열 번호: 2)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERNLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
뮤테인 45-47(Lys45 → Asn45) + (Asn47 → Thr47)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut45_47F : CCCGACACCAACGTGACCTTCTACGCC
Mut45_47R: GGCGTGAAGGTCACGTTGGTGTCGGG
뮤테인 45 내지 47의 아미노산 서열(서열 번호: 3)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAACGTGACCTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 45 내지 47의 아미노산 서열(서열 번호: 4)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTNVTFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
뮤테인 49(Thr49 → Thr 49)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut49F: AAAGTGAACTTCACCGCCTGGAAGCGG
Mut49R : CCGCTTCCAGGCGGTGAAGTTCACTTT
뮤테인 49의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 5)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCACCGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 49의 아미노산 서열(서열 번호: 6)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFTAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
뮤테인 62-44(Glu62 → Asn62) + (Trp64 → Thr64)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut62_64F : CAGGCTGTGAACGTGACGCAGGGACTG
MUT62_64R : CAGTCCCTGCGTCACGTTCACAGCCTG
뮤테인 62 내지 64의 아미노산 서열(서열 번호: 7)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGAACGTGACGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 62 내지 64의 아미노산 서열(서열 번호: 8)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVNVTQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
뮤테인 65-67(Gln65 → Asn 65) + (Leu67 → Thr67)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut65_67F : GAAGTGTGG A A C GGA AC GGCTCTGCTG
MUT65_67R : CAGCAGAGCC GT TCC G T T CCACACTTC
뮤테인 65 내지 67의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 9)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGAACGGAACGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 65 내지 67의 아미노산 서열(서열 번호: 10)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWNGTALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
뮤테인 72-74(Glu72 → Asn72) + (Val74 → Thr74)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut72_74F : CTGCTGAGC A A C GCT AC GCTGAGAGGA
MUT72_74R : TCCTCTCAGC GT AGC G T T GCTCAGCAG
뮤테인 72 내지 74의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 11)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCAACGCTACGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 72 내지 74의 아미노산 서열(서열 번호: 12)
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뮤테인 76-78(Arg76 → Asn76) + (Gln78 → Thr 78)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut76_78F : GCTGTGCTGA AC GGA AC GGCCCTGCTC
MUT76 78R : GAGCAGGGCC GT TCC GT TCAGCACAGC
뮤테인 76 내지 78의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 13)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAACGGAACGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 76 내지 78의 아미노산 서열(서열 번호: 14)
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뮤테인 98 내지 100 (Ala98 →Asn98)+(SerlOO →ThrlOO)
프라이머는 다음과 같았다:
Mut98_100F : GTGGACAAG AA TGTG A CCGGCCTGAGATCC
MUT98_100R: GGATCTCAGGCCGG T CACA TT CTTGTCCAC
뮤테인 98 내지 100의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 15)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG GACAAGAATGTGACCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 98 내지 100의 아미노산 서열(서열 번호: 16)
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뮤테인 104(Serl04 →Asnl04)
프라이머는 다음과 같았다:
Mutl04F : TCCGGCCTGAGA AA CCTGACCACCCTG
MUT104R: CAGGGTGGTCAGG TT TCTCAGGCCGGA
뮤테인 104의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 17)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGAAACCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 104의 아미노산 서열(서열 번호: 18)
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뮤테인 106-108 (Thrl06 → Asn106) + (Leu108 → Thr108)
프라이머는 다음과 같았다:
Mutl06_108F : AGATCCCTGA A CACC AC GCTGAGAGCA
MUT106_108R : TGCTCTCAGC GT GGTG T TCAGGGATCT
뮤테인 106 내지 108의 아미노산 서열(서열 번호: 19)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGAACACCACGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 106 내지 108의 아미노산 서열(서열 번호: 20)
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뮤테인 149 (Leul49 →Thrl49)
프라이머는 다음과 같았다:
Mutl49F: TACTCCAACTTC AC GCGGGGCAAGCTG
MUT149R: CAGCTTGCCCCGC GT GAAGTTGGAGTA
뮤테인 149의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 21)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCACGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 149의 아미노산 서열(서열 번호: 22)
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뮤테인 151 내지 153 (Glyl51 → snl51) + (Leul53 →Thrl53)
프라이머는 다음과 같았다:
Mutl51_153F : AACTTCCTGCGG AA CAAG AC GAAGCTGTAC
MUT151_153R : GTACAGCTTC GT CTTG TT CCGCAGGAAGTT
뮤테인 151 내지 153의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 23)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGAACAAGACGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
뮤테인 151 내지 153의 아미노산 서열(서열 번호: 24)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRNKTKLYTGEACRTGDR
사람 EPO 서열
사람 EPO의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 25)
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTCTGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGAAAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
사람 EPO의 아미노산 서열(서열 번호: 26)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
이는 도 2a에 나타낸다. 이러한 단편을 주형으로 사용하여 제2의 PCR을 수행하고, 이 시기에 hEPO에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 만을 사용하여 12개의 돌연변이체의 서열을 수득하였다(도 2b). PCR 반응 후, hEPO 뮤테인에 상응하는 생성물을 제한 효소 Xbal/Sall로 분해하였으며, 이는 hEPO 분자를 플랭킹(flanking)하여 동일한 제한 효소로 분해된 pLV-PLK 벡터내로 클로닝한다. 상부 10개의 세균을 형질변환시키고 암피실린으로 선택하였다. 각각의 hEPO 뮤테인의 3 내지 4개 콜로니를 액체 배지 속에서 증폭시켜 플라스미드 DNA의 미니(mini) 제조를 수행하였다. 이후에, 본 발명자는 hEPO 서열내에 존재하고 벡터 서열에는 부재하는 부위의 제한 효소 분해에 의한 삽입물의 존재를 확인하였다. 마지막으로, 플라스미드 DNA 미니-제제(mini-preparation)를 서열분석하여 hEPO 분자에서 수행된 돌연변이의 삽입을 확인하였다.
2. hEPO 뮤테인 잠재적 항원성의 인 실리코(in silico) 분석
IEDB 데이타베이스(Immune Epitope Database and Analysis Resources)를 사용하여 hEPO 뮤테인의 잠재적 항원성과 변형되지 않은 분자의 잠재적 항원성을 비교하기 위한 인 실리코 분석을 수행하였다. 이들 모두의 경우, 부류 II 주요 조직적합성 복합체(Class II Major Histocompatibility Complex)(MHC II)에서 인식된-T 에피토프의 예측-을 세계적으로 8개의 가장 대표적인 대립형질(사람, HLA-DR: DRB1*01.01, DRB1*03.01, DRB1*04.01, DRB1*07.01, DRB1*08.01, DRB1*11.01, DRB1*13.01, DRB1*15.01)을 분석함으로써 수행하였다. 항원성 점수는 각각의 hEPO 변이체로부터 수득하였으며, 각각을 hEPO에 대해 수득된 점수와 비교하였다. 이들 중 각각에 대한 잠재적인 항원성의 정도는 도 3에 개략적으로 요약한다. 따라서, hEPO와 동일한 항원성 정도를 지닌 2개의 뮤테인이 관찰되었으며(Mut98_100, Mutl51_153), 2개의 뮤테인은 잠재적으로 보다 항원성이었고(Mut72_74 및 Mut62_64), 최종적으로 8개의 뮤테인은 잠재적으로 덜 항원성이었으며(Mut45_47, Mut49, Mutl5_17, Mut65_67, Mutl49, Mut76_78, Mutl04, 및 Mutl06_108), 이러한 마지막 2개는 항원성이 거의 없는 것이었다.
3. 전술된 뮤테인을 생산하는 세포주의 수득
렌티바이러스 입자를 조립하여 CHO.K1 세포에 후속적으로 형질도입하였다. 이러한 이유로, HEK 293 T/17 세포(패키징 세포)를 4개의 벡터로 공-형질감염시켜 12개의 뮤테인 각각에 대한 상응하는 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 사용된 4개의 벡터는 다음과 같았다: pREV(이는 전달 벡터 및 이의 패키징의 핵 외수송을 유도한다), pVSVG(이는 광범위한 굴성으로, 세포내로 바이러스 입자의 도입에 필요한 VSV 엔벨로프 G 단백질을 암호화한다), pMDL(이는 구조 성분의 절단 및 세포 게놈 내로의 통합에 요구되는 발현 벡터, 프로테아제, 역전사 효소 및 인테그라제를 패키징할 수 있는 매트릭스 및 캡시드 단백질을 암호화한다) 및 모든 바이러스 게놈이 제거되고 본 발명의 hEPO 뮤테인에 상응하는 목적한 유전자에 의해 대체된 전달 벡터 pLV-PLK-Mut X. HEK 293T/17 세포의 형질감염 2일 후, mut X 렌티바이러스 입자를 함유하는 세포 각각으로부터의 상층액을 수거하고, 이를 사용하여 CHO.K1 세포를 형질도입시켰다. 12 CHO.K1mutX hEPO 라인(line)을 수득하였다. 72 시간 후, 상층액을 수거하고 이후 특성화를 위해 보존하였다. 유사하게, 안정한 재조합 세포주를 생성하기 위하여, 이를 증가하는 양의 푸로마이신 항생제로 프레싱(pressing)함으로써, 전이유전자가 도입된 세포를 선택하였다. 프레싱된 세포주를 증폭시키고 극저온 혼합물(90% (v/v) FBS, 10% (v/v) DMSO) 속에 동결보존하고, 이를 액체 질소 탱크 속에 저장하였다.
초기에, 샌드위치 ELISA 기술(Sandwich ELISA technique) 및 hEPO 분자에 대해 특이적인 항체를 사용하여, 형질도입에 의해 수득된 세포주의 배양물을 사용하여 농도를 측정하였다. 모노클로날 항체를 포획물(capture)로서 사용하여 토끼 폴리클로날 항체를 검출에 사용하였다(항체 유형 둘 다를 본 발명자의 실험실에서 개발하였다). 수득된 농도(표 I에 나타냄)는 연구의 연속성에 적절한 것으로 고려되었다.
또한, 배양 상층액을 웨스턴 블롯 기술(Western Blot technique)에 의해, 폴리클로날 항체를 사용하여 분석함으로써 모든 hEPO 뮤테인을 검출하였다. 이러한 방법은 본 발명자가 변형되지 않은 hEPO와 비교하는 경우 더 큰 분자량을 나타내었음을 가시화하도록 하였으며, 이는 분자 구조내 새로운 N-글리코실화 부위의 삽입과 일치한다(도 4).
유사하게, 등전위 포커싱 분석(isoelectric focusing analysis)에 이은 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 CHO내에서 발현된 hEPO 뮤테인 각각에서 당동형(glycoisoform)의 수를 연구하였다. K1 세포 배양 상층액. 평가된 12개의 뮤테인 중 11개에서 수득된 동형의 수는 변형되지 않은 hEPO의 것보다 더 높았다. 동형의 범위는 변형되지 않은 hEPO의 배양 상층액에서 관찰된 7개의 동형과 비교하는 경우 8 내지 16개 동형의 범위이었다.
본 발명은 잠재적인 신경보호성/신경가소성 후보물로서 사용하는 경우 사이토킨에 의해 생산된 부작용을 피하기 위해 조혈 활성을 거의 가지지 않거나 가지지 않는 hEPO 뮤테인을 제공한다. 이러한 이유로, 상술한 시험관내 활성을 이의 증식이 hEPO의 존재에 의존하는 TF-1 세포를 사용하여 연구하였다. 조혈 활성을 측정하기 위하여, 이러한 세포의 증식을 잘 알려진 생물학적 활성을 지닌 hEPO 표준을 사용한 96시간의 자극 후 평가하였다. 모든 발달된 hEPO 뮤테인은 이의 조혈 활성을 유지한 Met49를 제외하고는, 시판되는 hEPO 표준 및 변형되지 않은 hEPO 분자와 비교하는 경우 감소된 조혈 활성을 성공적으로 나타내거나 조혈 활성을 나타내지 않았다. 결과는 표 I에 요약한다.
NDA: 검출불가능한 활성; rhEPO: 재조합 사람 에리트로포이에틴; Mut: 뮤테인.
표 I: hEPO 뮤테인의 특성화. 샌드위치 ELISA에 의한 배양 상층액 속에서 농도 정량화. 등전점 포커싱에 의해 측정된 동형의 수의 평가 및 변형되지 않은 분자와 관련하여 퍼센트로 나타낸 시험관내 생물학적 활성의 측정
본 발명은 동결보호 생물학적 활성을 폐지하지 않지만 조혈 활성을 폐지한 위치에서 N-글리코실화되기 쉬운 부위를 함유하는 hEPO 뮤테인을 제공한다. 이는 CHO로 나타낸다. K1 세포 배양 상층액 및 후속적인 특성화. 이들 모두는 보다 높은 글리코실화도를 나타내었으며, 이의 혈장 반감기를 허용하는 N-글리코실화에 대한 첨가 부위를 포함하는 목적을 달성하였다. 유사하게, 분자에 대해 이루어진 변형은 뮤테인의 대부분에서 조혈 생물학적 활성이 제거되거나 나머지에서 조혈 생물학적 활성이 감소된, 조혈 생물학적 활성에 있어서의 효과를 가졌다.
4. 면역친화성 크로마토그래피에 의한 hEPO-유래 뮤테인의 정제
본 발명의 뮤테인에 대한 정제 과정을 하기에 나타낸다. 이러한 과정의 보다 나은 이해를 위하여, 다음의 뮤테인을 면역친화성(IA) 정제의 개략도를 통해, 예로서 나타낸다: Mut 45_47, Mut 104, Mut 151_153. 초기에, 본 발명자는 본 발명자의 실험실에서 당해 목적을 위해 개발한 항-rhEPO 모노클로날 항체에 의해 포획된 과글리코실화된 hEPO 뮤테인 각각을 용출시키기에 가장 양호한 조건을 확립할 목적으로 IA 매트릭스내에서 발생하는 것과 동일한 공정을 모의시험하였다(프로토콜 A). 상기를 기반으로 하여, 샌드위치 ELISA 검정을 수행하여 항원-항체 복합체를 각각의 용출 조건에 적용시킨 후 mAb 2B2에 결합되어 남아있는 hEPO 유도체의 비를 정량화하였다. 유사하게, 본 발명자는 항체 상의 각각의 용출물 용액의 효과를 평가하여 이들이 IA 매트릭스의 과정을 앞으로 재사용하는 측면에서 hEPO 뮤테인에 결합하는 능력에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 측정하였다.
다음의 용액의 용출능(eluent capacity)을 평가하였다:
1. 글리신 0.1 M pH 2
2. 글리신 0.15 M pH 2.5
3. 아세트산 0.2 M, NaCl 0.15 M pH 2.5
4. 글리신 0.15 M pH 3
5. 시트르산 0.1 M pH 3
6. 아세트산 0.2 M, NaCl 0.15 M pH 3
7. 글리신 0.15 M pH 3.5
8. 아세트산나트륨 0.1 M pH 4
9. 아세트산나트륨 0.1 M / 디옥산(Dioxane) 10% (v/v) pH 4
10. 아세트산나트륨 0.1 M pH 5
11. 인산나트륨 0.1 M pH 6
12. 인산염-완충된 염수(PBS) pH 7 중 이소프로필 알코올 40% (v/v)
13. PBS pH 7
14. PBS pH 7 중 에탄올 40%(v/v)
15. PBS pH 7 중 디옥산 10%(v/v)
16. PBS pH 7 중 에틸렌 글리콜 40%(v/v)
17. 트리스/HCl 0.1 M pH 8
18. 글리신 0.1 M pH 9
19. 글리신 0.1 M pH 10
20. 글리신 0.1 M pH 11
21. 인산나트륨 0.1 M pH 11
22. 인산나트륨 0.1 M pH 11.7
PBS로 처리한 항원-항체 복합체에 대해 수득된 흡광도 값을 항원-항체 복합체의 100% 형성, 즉 rhEPO 또는 이의 뮤테인의 흡수가 없는 것으로 추정하여 대조군으로서 고려하였다. 프로토콜 B를 위해, PBS로 처리한(Ag-Ac 복합체의 형성 전) 항체에 대해 수득한 흡광도 값을 연구 하에 분자에 대한 항체의 결합능의 보존의 대조군으로서 고려하였다. 따라서, 시험한 용액의 나머지에 대해 수득된 결과는 PBS로 평가한 대조군에 대해 나타내었다(도 5).
모든 경우에서 글리신 0.1 M pH 2에 의해 확립된 조건이 다른 용액과 비교하여 가장 높은 항원의 탈착능을 가졌음이 관찰되었다. 그러나, 상술한 복합체의 형성능은 이를 사용한 앞서의 처리 후 현저하게 감소하였다. 따라서, 면역친화성 크로마토그래피에서 이러한 용출물의 사용은 크로마토그래피적 매트릭스의 재사용에 영향을 미치므로 편리하지 않다.
한편, 당해 검정은 면역친화성 크로마토그래피(IAC)에서 사용될 후보물로서 2개의 용출물 용액의 선택이 가능하도록 하였다: 글리신 0.15 M pH 2.5 및 아세트산 0.2 M, NaCl 0.15 M pH 3. 용액 둘 다는 Ag-Ac 복합체를 해리시키고, 목적한 단백질을 스트라이핑(stripping)시킬 수 있었으며(표 II), 또한 이를 사용한 처리 전 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않았다.
(2) 글리신 0.15 M pH 2.5
(6) 아세트산 0.2 M NaCl 0.15 M pH 3
표 II. 선택된 용출물 용액을 고려하는 hEPO 뮤테인의 용출
IA 수지에 사용된 2B2 mAb를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 미리 정제하고 카보네이트 용액에 대해 투석하였다. 이후에, 수지 CNBr-활성화된 세파로즈4B를 커플링시켰다. 커플링 정도는 면역화 반응 전 및 후에 용액 속의 면역글로불린의 농도를 측정함으로써 계산하였으며, 96%를 생성하였다. 따라서, 이론적 능력은 겔 ml당 rhEPO 481 pg이었다.
도 6은 글리신 용출물 용액 0.15 M pH 2.5를 사용하는, 뮤테인 Mut 104의 정제의 예시적인 크로마토그래피적 프로파일을 나타낸다.
샌드위치 ELISA 기술을 사용하여 상이한 분획 속의 hEPO 변이체의 존재를 각각의 크로마토그래피적 과정(유동통과, 세척, 용출)에서 평가하여 공정 성능을 분석하도록 하는 매개변수를 계산하였다.
정제를 위해 수득한 결과는 표 III에 나타낸다. 동적 조건 하에서, 플레이트에서 평가된 정적 조건과 비교하는 경우 목적한 단백질의 회수시의 효율과 관련하여 일부 차이가 관찰되었다. pH 2.5 용액을 사용한 용출은 pH 3 용액과 비교하는 경우, 뮤테인 Mut 104 및 Mut 151_153에 대해 더 우수한 회복을 야기하였지만(각각 54% 대 19%, 및 55% 대 21%), Mut 45_47 변이체의 경우, pH 3 용액으로 용출시 보다 큰 회복이 수득되었다(49% 대 34%).
Sol. I: 아세트산 0.2 M, NaCl 0.15 M pH 3.0 및 Sol. II: 글리신 0.15 M pH 2.5
표III. hEPO 뮤테인의 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통한 정제 매개변수
SDS-PAGE에 이어 꼬마지에 브릴리언트 블루 염료(Coomassie Brilliant Blue dye)를 사용한 염색에 의한 뮤테인 Mut 104의 크로마토그래피적 공정의 상이한 단계를 분석하는 경우(도 7), 샘플 속에 존재하는 대부분의 오염물질이 남아있지 않았으며 유동통과 및 세척의 부분이었음이 관찰될 수 있다. 따라서, 언급한 도면의 레인 6에서 관찰된 바와 같이, 높은 정도의 순도가 수득되었다.
IAC가 목적한 단백질의 높은 회수를 나타내지 않았지만, 이는 출발 샘플과 관련하여, 고도의 순도 및 단일 크로마토그래피적 단계에서 이의 정제를 37 내지 90배 가능하도록 하였으므로, hEPO 뮤테인의 정제에 가장 적합한 방법이었다.
각각의 hEPO 뮤테인에 상응하는 용출물의 순도 평가는 밴드 농도계로 수행하였다(도 8).
전기영동적 작동 전에, 샘플을 10kDa 컷오프 점을 사용하는 한외여과 카트릿지(diafiltration cartridge)를 사용하여 75 내지 80배 농축시켰다. 수득된 순도는 모든 뮤테인에 대해 89%를 초과하였고(표 IV), 이는 IA 정제 공정에 대한 특징적인 값이다.
표 IV: 각각의 면역친화성 크로마토그래피(IAC)로부터 수득된 용출물의 정제도
IAC 결과는 고 순도의 hEPO 뮤테인이었고, 이는 다음 시험에 사용하기에 적합한 것으로 고려되었다. 따라서, IAC가 본 발명의 hEPO 뮤테인의 정제를 위한 적절하고, 단순하며 실제적인 방법으로 확립되었다.
5. hEPO 뮤테인의 물리화학적 특성화
5.1. 상이한 hEPO 뮤테인의 겉보기 분자량(apparent molecular mass)의 측정.
도 9는 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 통해 정제된 뮤테인의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 이는 공지된 분자량 마커를 사용하여 이러한 뮤테인의 분자량을 계산하는데 사용되었다.
hEPO의 과글리코실화된 뮤테인의 겉보기 분자량의 측정은 이의 분자량의 로그(log)에 따라 각각의 마커에 의해 이주된 거리의 변화 곡선에 있어서 각각의 변이체에 상응하는 밴드의 앞쪽의 전방 및 후방의 이주 거리를 내삽(interpolating)함으로써 수행하였다. 각각의 변이체에 대해 계산된 겉보기 분자량은 하기 요약한다:
*Mut 45_47: 34-66 kDa
*Mut 104: 29-66 kDa
*Mut 151_153: 35-45 kDa
*rhEPO: 31-43 kDa
이러한 측정은, 뮤테인이 변형되지 않은 hEPO의 평균 분자량보다 더 큰 평균 분자량을 나타내었으므로, hEPO 분자 내로 추가의 N-글리코실화 부위 혼입의 성공을 입증하였다.
5.2. IEF에 의한 동형 프로파일의 측정
글리코실화 및 특히, 시알산 잔기의 함량으로 인한 hEPO 뮤테인의 이질성 정도를 평가하기 위하여, 샘플을 IEF로 평가하여 각각의 hEPO 과글리코실화된 변이체를 이루는 상이한 pi를 지닌 동형을 측정하였다.
도 10은 Mut 45_47 변이체를 이루는 13개의 동형, Mut 104 변이체를 위한 14개의 동형, 및 표준 rhEPO를 위한 6개의 동형의 검출을 나타낸다. rhEPO 표준은 조혈작용을 선호하도록 의도된 생물치료제로서 생산된 호르몬이며, 여기서 hEPO 분자의 가장 산성인 동형이 우세하고, 이는 4개의 크로마토그래피적 단계에서 개발된 정제 공정 후 수득된다. 또한, 뮤테인 Mut 45_47 및 Mut 104는 rhEPO 동형보다 5 내지 7개 더 많은 산성 동형을 함유함을 알 수 있으며, 이는 이러한 분자 내의 시알산 함량을 반영한다.
IEF로부터의 데이타와 함께 겉보기 분자량의 측정시 수득된 데이타는 생성된 뮤테인이 rhEPO와 비교하는 경우 더 높은 정도의 글리코실화를 가짐을 입증한다.
5.3. IAC-정제된 hEPO 뮤테인의 모세관 구역 전기영동(capillary zone electrophoresis)(CZE)의 수단에 의한 동형 프로파일의 분석
CZE를 또한 적용 예로서 고려된 각각의 hEPO 변이체에 대한 동형의 측정을 위해 사용하였다. 공정을 물로 한외여과한 hEPO 뮤테인의 IAC 정제로부터 수득된 샘플에 대해 수행하고 대략 1 mg/ml로 농축시켰다.
CZE는 관찰된 상이한 동형에서 정량적인 정보를 제공한다. 따라서, CZE 데이타를 사용하여, 동형을 각각의 hEPO 변이체에 대해 각각 관찰된 피크에 지정하였다. 1 내지 11번으로부터의 뮤테인 Mut 45_47 및 Mut 104, 및 1 내지 7번으로부터 rhEPO의 경우; 동형 1은 모세관 구역을 따라 대부분 이주하는 동형이었다(도 11). 다음에, 각각의 동형의 퍼센트를 각각의 피크의 곡선 하 면적을 통합하여 계산하였다.
rhEPO에 대한 각각의 변이체의 전기영동적 이동성을 비교하는 경우, 후자의 동형이 Mut 45_47의 동형 1 내지 7 및 Mut 104의 동형 3 내지 9와 일치함이 밝혀졌으며, 이는 Mut 45_47이 rhEPO와 비교하는 경우 4개 이상의 산성 동형을 나타내지만, Mut 104는 rhEPO와 비교하는 경우 2개 미만의 산성 동형 및 2개 이상의 산성 동형을 나타낸다.
각각의 동형의 비를 평가하는 경우, rhEPO는 동형 3, 4, 및 5의 보다 높은 비를 가짐이 밝혀졌지만, Mut 45_47은 동형 6, 7, 8, 및 9의 보다 높은 비를 나타내며, Mut 104는 동형 4, 5, 6, 및 7의 보다 높은 비를 나타낸다. 이는 보다 높은 함량의 보다 산성인 동형 및 이의 보다 높은 비로 인하여 rhEPO의 글리코실화 정도와 관련하여 각각의 hEPO 변이체의 rhEPO 이질성을 다시 입증한다.
각각의 hEPO 변이체의 전기영동도를 관찰하는 경우, 2개의 추가의 피크(2개 이상의 동형)의 존재는 피크 1의 앞쪽의 하나 및 피크 11의 앞쪽의 다른 것, 둘 다의 경우에서 가시화될 수 있느며, 이는 정확하게 해결되지 않을 수 있었다. 이는 샘플 속의 이러한 동형의 낮은 비에 기인하며, 이는 시스템의 검출 한계보다 더 낮다. 이는 IEF 및 CZE에 의해 검출된 동형의 수에 있어서의 차이를 설명한다.
5.4. 뮤테인의 시험관내 조혈 생물학적 활성의 특성화.
정제되고 설계된 hEPO 뮤테인의 생물학적 특성화를 수행하였다. 이를 위해, 시험관내 증식 검정을 UT-7 세포주 배양물을 사용하여 수행하여 본 발명의 구현예(A 내지 F)를 나타내기 위한 적용 실시예로서 취한 뮤테인의 조혈 생물학적 활성을 평가하였는데, 그 이유 이러한 세포 계통의 생존 및 증식은 성장 배지 속에서 hEPO의 존재에 의존하기 때문이다. TF-1 세포주를 사용하는 검정과는 달리, UT-7 세포주를 사용하는 검정을 보다 높은 민감성 반응으로 특성화함으로써, 이를 작업의 당해 단계를 위해 선택하였다.
이들 각각의 생산 세포주로부터 발현된 모든 뮤테인 및 예로서 고려된 3개의 IAC-정제된 뮤테인의 배양 상층액을 분석하였다. 이러한 분자에 의해 발달한 증식을 rhEPO 표준에 의해 발달한 증식과 비교하였다.
적용 예로서 고려된 hEPO 뮤테인(Mut 49는 제외)은 rhEPO 표준과 동일한 농도에서 시험하는 경우 세포 증식을 자극하는 능력이 낮거나 없었다(도 12-a-). 시험관에서 평가된 비 조혈 활성(specific erythropoietic activity)(SEA)을 계산하기 위해, 본 발명자는 보다 높은 농도의 뮤테인, 즉, 순수한 배양물 상층액에 존재하는 것을 사용하여 작업하였다. 따라서, 뮤테인 Mut 104 및 Mut 151_153은 조혈 생물학적 활성의 완전한 상실을 나타내었지만, Mut 45_47, Mut 62_64, 및 Mut 98_100은 매우 낮은 조혈 활성을 나타내었다(rhEPO에 대한 SEA = 120 UI/pg와 비교하는 경우, SEAMut 45_47 = 0.2 UI/pg, SEAMut 62_64 = 0.2 UI/pg, 및 SEAMut 98_100 = 0.1 UI/pg). 대조적으로, Mut 49는 이러한 활성을 유지하였던 것으로 고려된다(SEA = 216 UI/pg). Mut 49 SEA에서 증가가 있었으며, 이는 Mut 49 곡선의 직선 반응 구역의 기울기가 표준물 중 하나와 현저하게 상이하였음을 고려할 때, 이러한 매개변수를 측정하는데 사용된 곡선의 구역에 기인할 수 있다. 따라서, 이러한 뮤테인을 수득하기 위해 이루어진 변형은 이의 조혈 활성을 억제하는데 효율적이지 않은 것으로 고려되었다.
또한, 정제된 rhEPO 뮤테인의 시험관내 세포/신경보호 생물학적 활성을 본 발명의 적용 예로서 분석하였다. 평가를 수행하여 세포/신경보호 활성, 즉 스타우로스포린(STP)에 의해 생성된 세포자멸사/세포독성 효과로부터 SH-SY5Y 뉴우런 세포를 보호하는 rhEPO 및 이의 뮤테인의 능력을 연구하였다. 따라서, 세포/신경보호 검정은 STP에 의해 유발된 세포 손상의 유도 12시간 전에 rhEPO 또는 이의 뮤테인 12h를 가함으로써 뉴우런 세포를 보호하는 것으로 이루어졌다. 세포 손상 유도 시간 후, 배양물의 생존능을 대사적으로 활성인 세포를 측정함으로써 평가하였다.
이러한 검정에서, 본 발명의 적용 예로서 고려된 rhEPO 및 정제된 Mut 104 둘 다는 동일한 농도에서 사용하였다(도 13).
수득된 결과는 ANOVA 시험에 이어, 던넷 시험(Dunnet test)을 사용하여 통계적으로 분석함으로써 각각의 샘플을 CSTP와 비교하였다. CSTP에 대해 수득된 세포독성 퍼센트는 100% 독성으로서 고려하였으며, 결과적으로, 각각의 샘플에 대해 측정된 세포독성 값은 CSTP와 관련하여 계산하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, rhEPO는 STP에 의해 유도된 세포독성을 45%(p < 0.05)까지 감소시킬 수 있는 반면, Mut 104는 STP에 의해 유발된 세포독성을 99%(p < 0.01)의 유의성 정도로 65%까지 감소시킴으로써, 이에 의해 유발된 세포독성에 있어서 유의적인 감소를 나타내었다.
5.4.b. 뮤테인의 생체내 조혈 생물학적 활성의 특성화
적용 예로서 사용된 뮤테인은 시험관내 생물학적 활성을 가지지 않거나 거의 가지지 않는다. 결과적으로, 집중된 글리코실화는 혈액 속의 잔류 시간을 증가시키는데 필수적인 약동학적 특성을 부여한다. 이러한 특성은 분자가 수용체와의 상호작용에 대한 낮은 능력을 개선시키고 조혈 활성을 입증하도록 할 수 있다.
이러한 생체내 활성을 평가하기 위하여, 노르모사이테믹 마우스(normocytemic mice)에게 표준물로서 rhEPO 또는 앞서의 실시예에서 사용된 3개의 뮤테인 각각, 또는 음성 대조군으로서 PBS를 주사하였다. 단백질 접종에 상응하는 모든 경우에, 80 IU의 rhEPO과 동일한 단백질 질량을 사용하였다. 혈액을 접종 96시간 후 수집하고, 유동 세포분석법을 사용하여 티아졸 오렌지-표지된 망상세포의 함량 퍼센트를 측정하였다.
도 12-b-는 rhEPO와 관련하여 각각의 뮤테인 및 음성 대조군의 유의적으로 상이한 반응(p <0.001)을 나타낸다. 또한 각각의 뮤테인에 의해 생성된 망상적혈구 반응을 음성 대조군과 비교하는 경우 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 분석 유형 둘 다는 과글리코실화 접근법의 결과로서 뮤테인의 조혈 활성의 예측된 손실을 입증한다.
5.5. 구조적 신경 가소성에서 hEPO 과글리코실화된 뮤테인의 효과
5.5.1. 신경 발달(분화) 및 구조적 가소성
구조적 신경 가소성은 이에 의한 신경 발달 및/또는 분화가 자극되거나 촉진되는 공정을 포함한다. 이러한 의미에서, 신경돌기의 형성 및/또는 축색돌기의 성장, 사상위족/수상돌기의 발달 및/또는 시냅스의 수의 증가를 촉진하는 화학제 또는 화합물을 신경영양성 화합물로 고려할 것이다. 뉴우런 및 신경 세포주의 1차 배양물은 이러한 공정의 시험관내 연구를 위해 광범위하게 사용되어 왔다.
해마 뉴우런의 1차 배양물 속에서 신경 발달의 단계는 도 14에 요약되어 있다. 이러한 단계는 도티(Dotti) 등 (1998)[31]의 작업에서 적절히 특성화되었으며, 여기서 씨딩된 후, 뉴우런은 이들이 기질에 부착하는 라멜라를 발달시킨다(0 DIV, 시험관내 배양 일 수). 이후에, 처음 2일 동안(1 내지 2 DIV) 미성숙 신경돌기가 혈장막의 연장부로서 발달한다. 2 내지 3 DIV에서, 이러한 신경돌기 중 하나는 나머지들보다 신장되어 분화함으로써 액손(axon)을 형성하고, 이는 이의 말단에 엑손 성장 콘(axonal growth cone)으로 알려진 삼각형 구조를 갖는다. 이후에, 신경돌기는 갈라져서 제2의 신경돌기를 형성한다(3 내지 4 DIV). 얇은 세포질성 돌기부는 사상위족으로 알려진 가교-결합된 액틴 필라멘트를 함유하는 이러한 신경돌기 이상으로 발달한다(4 내지 5 DIV). 사상위족은 이후에 시냅스가 발생하는 바람직한 위치인 수지상극(dendritic spine)를 이끌 수 있다(7 내지 21 DIV).
연구의 이러한 부분은 상이한 단계의 신경 발달에서 본 발명의 상이한 hEPO 과글리코실화 뮤테인의 신경영양 작용을 평가하였다.
5. 5. 2. 신경돌기의 형성
본 발명의 뮤테인이 신경성 효과(뉴우런당 신경돌기의 수 및 길이에서의 증가)를 생산하였는지를 측정하기 위하여, N2a 신경 세포주(마우스 신경아세포종)를 사용하였다. 세포(50,000)를 배양 플레이트(24 웰)에서 유리 위에 씨딩하고 신경 분화를 억제하는 20%(V/V)의 소 태아 혈청(FBS), 및 항생제로서 겐타마이신을 보충한 DMEM 완전 배지 속에 유지시켰다. 이후에, 배양 배지를 상이한 농도(50 및 300 ng/ml)의 rhEPO, 또는 뮤테인이 보충된 FBS가 없는 배지로 3시간 동안 교체하여 신경돌기생성(neuritogenesis)을 유도하였다[32]. 이러한 시간 후, 세포를 인산염 완충된 염수(PBS) 속에서 파라포름알데하이드 4%(PFA)와 슈크로즈 4%로 4℃에서 10분 동안 고정시키고 PBS 중 0.1%(V/V) 트리톤 X-100으로 2분 동안 투과시켰다. 이후에, 고정된 세포를 PBS 중 3%(W/V)의 소 혈청 알부민(BSA)을 1%(W/V) BSA(1:1000, Sigma) 중 마우스 항-알파-투불린 IgG 모노클로날 항체와 함께 1 내지 2시간 동안 차단시켜 4℃에서 16시간 동안 신경돌기를 마킹하였다. 다음날, PBS로 3회 세척한 후, 이를 액틴 필라멘트(1:1000, Invitrogen)를 표지시키기 위한 로다민-접합된 팔로이딘 및 Alexa 488(1:1000, Invitrogen)에 접합된 염소 항-마우스 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 냉 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, 유리에 Fluorsave(Calbiochem)를 올려놓았다.
신경돌기생성을 정량화하기 위하여, 영상을 Nikon TE2000 에피형광 현미경(epifluorescence microscope)(Nikon)으로 획득하였다. 정량화는 신경돌기의 수 및 이의 평균 길이(신경돌기의 연장) 및 조건당 적어도 30개의 뉴우런 속에서 가장 긴 신경돌기(축색돌기 성장)의 길이를 Image J(NIH) 소프트웨어의 NeuroJ 플러그-인(plug-in)을 사용하여 수행하였다. 이후에, 대표적인 영상을 Adobe Photoshop으로 가공하고, 통계적 분석을 소프트웨어 GraphPadPrism 5를 사용하여 수행하였다.
도 15-a-는 연구된 그룹 각각의 대표적인 영상을 나타낸다. 측정들 각각의 통계적 분석은 우측에 상세히 설명되어 있다. 본 발명의 뮤테인은 뉴우런당 신경돌기의 수, 신경돌기의 연장 및 축색돌기 성장에 있어서의 증가로 나타난 유의적인 용량-의존성 신경생성 효과를 갖는다. 이러한 효과는 rhEPO에 대해 수득된 값과 유사한 값을 고려할 때 비교가능하다. 다시 말해서, 본 발명의 뮤테인은 N2a 세포주에서 rhEPO에 대해 관찰된 것과 유사한 신경영양 효과를 나타내었다.
5. 5. 3. 사상위족 밀도
사상위족 및 수지상극은 신경돌기/수상돌기로부터 나타나는 액틴 필라멘트가 풍부한 막 돌출부이며 중추신경계의 흥분성 시냅스에서 매우 풍부한 후-시냅스 구획으로서 작용한다. 척추의 형태학은 다양하며 이들은 이의 구조적 구조에 따라 분류된다. 사상위족은 신경 가소성을 선호하는 신경 발달 동안 이의 형태/구조를 변화시킬 수 있다[33]. 이러한 의미에서, 특정의 신경변성 질환은 수지상극의 형태 및 수에 있어서의 변화(증가 및 감소 둘 다)와 관련되었다. 다운 증후군(Down syndrome)에서, 예를 들면, 척추의 양은 심각하게 감소되는 것으로 측정되었다[34]. 대조적으로, 척추는 자폐성 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder)에서 보다 많은 양으로 발견된다[35].
따라서, 신경 가소성을 유도하는 능력은 본 발명의 과글리코실화 뮤테인의 사상위족의 형성을 촉진함으로써 측정하였다. 본 발명자는 상이한 농도(50 및 300 ng/ml)의 rhEPO, 또는 상이한 농도의 뮤테인 Mut 104, Mut 45-47, 및 Mut 151-153에 4일 동안(4 DIV) 노출된 해마 뉴우런의 1차 배양물을 사용하였다.
신경 배양물을 앞서 기술한 바와 같이[36] 랫트 배아 해마(E19)로부터 제조하였다. 요약하면, 조직을 트립신-EDTA(0.25% (W/V) )로 37℃에서 15분 동안 처리하였다. 완전히 분산된 세포의 용액을 2 mM 글루타민, 100 단위/ml의 페니실린(PEN), 100 pg/ml의 스트렙토마이신(Strp), 및 10%(V/V)의 말 혈청이 보충된 신경기본 배지(Neurobasal Medium)(NB, Invitrogen) 속에서 제조하였다. 20,000 내지 30,000개의 다수의 세포를 0.1 mg/ml의 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(Sigma) 및 20 mg/ml의 라미닌(Invitrogen)으로 미리 처리된 24-웰 배양 플레이트에서 씨딩하였다. 2시간 후, 배지를 정의된 배지(1 g/1 오브알부민; Invitrogen으로부터의 혈청-유리된 보충물인 N2 및 B27)로 교환하고 상이한 농도(50 및 300 ng/ml)의 rhEPO, 또는 본 발명의 뮤테인을 가하고 4 DIV 동안 유지시켰다. 세포를 PBS 중 4%(W/V) PFA 4%(W/V) 슈크로즈로 4℃에서 10분 동안 고정시켰다. 이후에, 세포를 PBS 중 0.1% (V/V) 트리톤 X-100으로 2분 동안 투과시켰다. 이후에, 고정된 세포를 PBS 중 3%(W/V)의 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단시키고 16시간 동안 4℃에서 1%(W/V) BSA 중 마우스 항-알파-투불린 IgG 모노클로날 항체(1:1000, Sigma)와 함께 항온처리하여 신경돌기를 마킹하였다. 다음날, PBS로 3회 세척한 후, 이를 액틴 필라멘트(1:1000, Invitrogen)를 표지하기 위한 로다민-접합된 팔로이딘과 함께 항온처리하고 Alexa 488에 접합된 제2의 염소 항-마우스 항체(1:1000, Invitrogen)와 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 냉 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, 유리를 Fluorsave(Calbiochem) 위에 두었다.
사상위족 형성을 정량화하기 위해, 영상을 Nikon E600 에피형광 현미경(Nikon)으로 획득하였다. 정량화는 신경세포 소마(soma)로부터 50 pm 미만의 거리에서 20 pm의 신경돌기(적어도 30개의 뉴우런내 3개의 신경돌기/뉴우런) 속에 존재하는 사상위족(신경돌기 막으로부터 돌출된 액틴이 풍부한 돌출부)의 수를 계수함으로써 수행하였다. 이후에, 대표적인 영상을 Adobe 포토샵으로 가공하고, 통계적 분석을 소프트웨어 GraphPadPrism 5로 수행하였다.
도 16(좌측 패널)은 사상위족의 밀도의 대표적인 영상을 나타내지만, 우측상의 패널은 각각의 그룹에 대한 통계적 분석을 상세히 설명한다. 본 발명의 뮤테인은 대조군 뉴우런(PBS)과 비교하는 경우, 사상위족 형성을, 용량에 따라 유의적으로 유도함에 주목한다. 놀랍게도, 이러한 효과는 rhEPO로 처리한 뉴우런에 대해 관찰된 것보다 여전히 더 우수하다. 요약하면, 본 발명의 뮤테인은 rhEPO에 대해 관찰된 것보다 더 우수한 해마 뉴우런의 1차 배양물에서 신경영양 효과를 나타내었다.
5. 5. 3. 시냅스
시냅스는 2개의 뉴우런 사이의 막의 전문화된 접근 관계(유니온)로 정의된다. 이러한 유니온(시냅스 간극으로 공지됨)은 전기적 임펄스(electrical impulse)의 유도 및 이들 중 하나(전-시냅스성) 및 다른 것(후-시냅스성)으로부터의 물질의 통과를 촉진한다. 상이한 기술을 개발하여 시냅스의 수를 정량화하였다. 따라서, 시냅스의 허용된 정의는 후-시냅스 구획으로부터 독점적으로 단백질 집단을 지닌 전-시냅스 구획으로부터 독점적으로 단백질 집단의 동시-발생이다.
본 발명의 뮤테인의 신경영양성 효과의 연구와 연속적으로, 신경 시냅스를 유도하는 이의 능력을 평가하였다.
이를 위해, 면역검출 검정을 15 DIV 1차 신경 배양물 속에서 수행하였으며 여기서 시냅스 형성은 전- 및 후-시냅스 마커를 오버랩핑시켜 검출한다.
간단하게, 뉴우런(15,000/웰)을 상이한 농도(50 및 300 ng/ml)의 hEPO 뮤테인, 또는 rhEPO, 또는 PBS로 15 DIV 동안 처리하였다. 이후에, 이를 90%(V/V) 메탄올 및 10% (V/V)MES(100 mM MES pH 6.9, 1 mM EGTA, 1 mM MgC12) 용액으로 4℃에서 10분 동안 고정시켰다. 이후에, 이를 PBS로 3회 세척하고 트윈 20(0.1% (V/V))으로 5분 동안 여과하였다. 차단은 FBS와 트리톤 X-100(PBS 중 10% FBS (V/V), 트리톤 X-100 0.1%(V/V))으로 1시간 동안 실온에서 수행한 다음, 이를 또한 PBS 중 3% (W/V) BSA 용액으로 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 차단 용액 둘 다를 최대 속도에서 10분 동안 먼저 원심분리하였다. 이후에, 이를 12 내지 16시간 동안 4℃에서 1차 마우스 항-NMDA-Rl 항체(Synaptic Systems로부터의 후-시냅스 마커) 및 토끼 항-시냅토피신 항체(rabbit anti-synaptophysin antibody)(Synaptic Systems로부터의 전-시냅스 마커)와 함께 항온처리하였다. 항체 둘 다를 1%(W/V) PBS-BSA 용액 속에서 제조하고, 10분 동안 최대 속도에서 항온처리하였다. PBS로 3회 세척한 후, 이를 10분 동안 원심분리된 3%(W/V) BSA 및 10%(V/V) FBS 용액, 트리톤 X-100 0.1%(V/V) PBS로 실온에서 1시간 동안 다시 차단시켰다. 이후에 이를 Alexa 647에 접합된 제2의 항-마우스 항체 및 1%(W/V) BSA 속에서 제조된 Alexa 568에 접합된 항-토끼 항체와 함께 항온처리하고 10분 동안 최대 속도(둘 다 Molecular Probes로부터)로 원심분리하였다. 이후에, 이를 Fluorsave 위에 두었다.
사진을 Olympus 1X81 역위 현미경(inverted microscope)과 연합된 Olympus FV1000 공초점 현미경으로 취하였다. 영상을 Nyquist 범주에 부합하는, 소프트웨어 FluoView(버젼 3.3, Olympus; 60X objective; AN 1.42; 0.066 pm/픽셀 해상도)로 후속적으로 가공하였다.
시냅스 형성을 전-시냅스 마커와 후-시냅스 마커 사이에서 25 pm 수지세포내 공-국재화 점(co-localization point)으로서, 조건당 대략 10 내지 20개 뉴우런으로 뉴우런당 3개 분절(segment)을 사용하여 측정하였다. 이러한 공-국재화 점은 Puncta 분석기인, Image J 플러그-인(plug-in)(버젼 1.28u)을 사용하여 측정하였다[37].
도 17은 시험된 조건 각각 및 이의 상응하는 정량화의 대표적인 사진을 나타낸다. 신경돌기생성 및 사상위족 도입의 경우에서와 같이, 본 발명자는 뮤테인이 신경세포 배양물 속에서 새로운 시냅스의 형성을 유의적으로 유도함을 관찰하였다. 이러한 효과는 rhEPO에 대해 관찰된 것과 유사하다.
상술한 데이타를 고려하여, 본 발명의 새로이 과글리코실화된 hEPO 뮤테인이 신경세포 발달/분화(신경돌기의 형성으로부터 시냅스 형성까지)의 상이한 단계에서 효과를 촉진하는 신경세포 가소성을 가짐을 나타내는 강력한 실험적 증거가 존재한다. 더욱이, 이러한 효과는 EPO에 대해 관찰된 것과 비교가능하며, 일부 특수한 경우에 효과(사상위족 형성)는 훨씬 더 크다. 본 발명의 이러한 놀랍고 신규한 기술적 효과 및 혁신적인 기술적 특성은 본 발명의 뮤테인이 신경 세포 가소성이 감소되거나 이러한 질환에 대해 유전적 소인이 있는 치료에서 사용하기에 이상적인 것으로 만든다.
5.6.b. 랫트 해마 뉴우런의 1차 배양물 속에서 rhEPO 뮤테인의 신경보호 생물학적 활성의 연구
해마 뉴우런의 1차 배양물에 대한 hEPO 뮤테인 항세포자멸사 효과의 평가는 본 발명자가 이의 물질대사가 확립된 세포주 내에서와 같이 변경되지 않은 세포내에서 이러한 세포가 갖는 효과를 연구하도록 한다. 이러한 이유로, 이는 뇌에서 생체내에서 발생할 수 있는 것과 보다 실제적으로 유사하므로 흥미로운 모델을 구성한다.
hEPO 및 본 발명의 변형된 에리트로포이에틴의 신경보호 활성을 스타우로스포린을 사용한 처리에 의해 유도딘 세포자멸사 자극으로부터 신경세포를 보호하기 위한 이러한 분자의 능력으로서 평가하였다.
이러한 시험관내 활성을 평가하기 위하여, 스프라그-다울리 랫트로부터의 해마 뉴우런의 1차 배양물을 수득하였다. 11 DIV 배양물을 400 ng/ml의 본 발명으로부터의 hEPO 뮤테인 또는 조혈 회복의 치료에 일반적으로 사용된 400 ng/ml의 rhEPO를 사용하여 24시간 동안 예비처리하였다. 이 시간 후에, 세포를 분자의 존재하에서 24시간 동안 30 nM STP에 노출시키고, 최종적으로, 이를 고정시키고 Hoechst 플루오로크롬 및 팔로이딘-FITC로 착색시켰다.
도 18은 STP의 부재하에 세포 대조군과 유사한 세포자멸사 값에 도달하는, 세포 사멸 대조군(STP만으로 처리한 세포)과 비교하는 경우, 상이한 분자를 사용한 치료는 세포자멸사를 유의적으로 감소시켰음(**p <0.01; ***p <0.001)을 나타낸다. 또한, 본 발명의 분자 대부분은 STP의 효과로부터 해마 뉴우런의 1차 배양물을 보호하는 측면에서 rhEPO의 것보다 우수한 효과를 나타내었다.
결과는 또한 SH-SY5Y 신경세포 배양물에서 뮤테인의 신경보호 활성의 연구에서 수득된 것에 상응한다. 따라서, 본 발명의 분자를 수득하기 위한 여분의 글리코실화 부위의 첨가는 신경보호와 관련된 것을 변형시키지 않고 이의 조혈 생물학적 활성의 차단을 허용하였다.
참고문헌
[1] J.W. Fisher. Exp Biol Med (Maywood) 228 (2003) 1-14.
[2] C. Lacombe, P. Mayeux. Nephrol Dial Transplant 14 Suppl 2 (1999) 22-28.
[3] U. Hammerling, R. Kroon, T. Wilhelmsen, L. Sjodin, J.
Pharm Biomed Anal 14 (1996) 1455-1469.
[4] H. Sasaki, B. Bothner, A. Dell, M. Fukuda. J Biol Chem 262 (1987) 12059-12076.
[5] E. Tsuda, M. Goto, A. Murakami, K. Akai, M. Ueda, G. Kawanishi, N. Takahashi, R. Sasaki, H. Chiba, H. Ishihara, et al . Biochemistry 27 (1988) 5646-5654.
[6] J.C. Egrie, J.K. Browne. Br J Cancer 84 Suppl 1 (2001)
3-10.
[7] A.J. Sytkowski, L. Feldman, D.J. Zurbuch, Biochem Biophys Res Commun 176 (1991) 698-704.
[8] E. Delorme, T. Lorenzini, J. Giffin, F. Martin, F.
Jacobsen, T. Boone, S. Elliott. Biochemistry 31 (1992) 9871- 9876.
[9] T. Toyoda, T. Arakawa, H. Yamaguchi. J Biochem 131
(2002) 511-515.
[10] Nangaku, M. Kidney International (2013) 84, 427-429.
[11] T Ng, G Marx, T Littlewood, I Macdougall . Postgrad Med J (2003) 79: 367-376
[12] N. Debeljak, A.J. Sytkowski, Erythropoietin: new approaches to improved molecular designs and therapeutic alternatives. Curr Pharm Des 14 (2008) 1302-1310.
[13] Noguchi, C.T., Asavaritikrai , P., Teng, R. , 및 Jia, Y.
(2007). Role of erythropoietin in the brain. Crit Rev Oncol Hematol 64, 159-171.
[14] P.a. Konstantinopoulos , M.V. Karamouzis, A.G. Papavassiliou . Biochim. Biophys. Acta 1776 (2007) 1-9.
[15] Siren, A.L. y Ehrenreich, H. Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. (2001) 251(4): 179-184.
[16] Neurodegenerative disorders, Public health - European commission . http : //ec . europa . eu/health/maj or chronic diseases/ diseases/brain neurological/index en.htm
[17] Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050-The Global voice on Dementia. Alzheimer's disease International. http : //www .alz.co.uk/research/G8-policy-brief.
[18] NIH meeting advances Alzheimer's research agenda. Fogarty International Center. Advancing Science for Global Health.
http : //www . fic . nih . gov/news/globalhealthmatters/march-april-2015 /pages/nih-alzheimers-research-summit. aspx
[19] Toledo Atucha, J. Alzheimer. Real Invest Demenc. (2011), 47: 16-23.
[20] Mawadda Alnaeeli, LiWang, Barbora Piknova, Heather Rogers, Xiaoxia Li, and Constance Tom Noguchi. Anatomy Research International. Volume 2012, Article ID 953264, 15 pages
[21] Masuda, S. y col. J. Biol. Chem. (1993) 268(15): 11208-11216.
[22] Wolf y col. Thromb Haemost (1997), 77:1020 1024.
[23] P.J. Stohlawetz, L. Dzirlo, N. Hergovich, E. Lackner, C. Mensik, H.G. Eichler, E. Kabrna, K. Geissler, B. Jilma. Blood 95 (2000) 2983-2989.
[24] Cases A y col. Kidney Internacional (1992), 42:668-672.
[25] Beguin Y., Haematologica (1999), 84:541-547.
[26] M. Leist, P. Ghezzi, G. Grasso, R. Bianchi, P. Villa, M. Fratelli, C. Savino, M. Bianchi, J. Nielsen, J. Gerwien, P. Kallunki, A.K. Larsen, L. Helboe, S. Christensen, L.O. Pedersen, M. Nielsen, L. Torup, T. Sager, A. Sfacteria, S. Erbayraktar, Z. Erbayraktar, N. Gokmen, O. Yilmaz, C. Cerami-Hand, Q.W. Xie, T. Coleman, A. Cerami, M. Brines. Science 305 (2004) 239-242.
[27] T. Mennini, M. De Paola, P. Bigini, C. Mastrotto, E. Fumagalli, S. Barbera, M. Mengozzi, B. Viviani, E. Corsini, M. Marinovich, L. Torup, J. Van Beek, M. Leist, M. Brines, A. Cerami, P. Ghezzi. Mol. Med. 12 (2006) 153-160.
[28] Siren, A.L. y col. Neurotherapeutics (2009), 6(1): 108-127.
[29] Erbayraktar, S. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. (2003), USA 100: 6741-6746.
[30] M. Mattio, N. Ceaglio, M. Oggero, N. Perotti, I. Amadeo, G. Orozco, G. Forno, R. Kratje, M. Etcheverrigaray . Biotechnol Prog 27 (2011) 1018-1028.
[31] Dotti CG, Sullivan CA, Banker GA. 1988. J Neurosci (1988) 8:1454-1468
[32] Das KP, Freudenrich TM, Mundy WR. Neurotoxicol Teratol (2004) 26:397-406
[33] Rochefort NL, Konnerth A. EMBO Rep. (2012) Aug; 13 (8) :699-708. DOI : 10.1038/embor .2012.102.
[34]Suetsugu M, Mehraein P. Acta Neuropathol.
(1980) 50 (3) : 207-10.
[35] Hutsler JJ1, Zhang H. Brain Res. (2010) Jan 14;1309:83-94. DOI: 10.1016/j .brainres .2009.09.120.
[36] Alfonso J., Fernandez M. E., Cooper B., Flugge G. and
Frasch A. C. Proc. Natl Acad. Sci. (2005) USA 102, 17196- 17201.
[37 ] Ippolito, D.M. , Eroglu, C., Journal of Visualized Experiments. (2010) Exp. 45:2270. DOI: 10.3791/2270.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
CONSEJO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Y TECNICAS (CONICET)
UNIVERSDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTIN
<120> MODIFIED HUMAN ERYTHROPOIETIN
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<210> 11
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 72_74
<400> 11
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcaacgct 300
acgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 12
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - MUTEIN 72_74
<400> 12
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Asn Ala Thr Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 13
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 76_78
<400> 13
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgaacg gaacggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 14
<211> 193
<212> PRT
<213> AA- MUTEIN 76_78
<400> 14
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Asn Gly Thr Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 15
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 98_100
<400> 15
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca agaatgtgac cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 16
<211> 193
<212> PRT
<213> AA- MUTEIN 98_100
<400> 16
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Asn Val Thr Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 17
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 104
<400> 17
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga aacctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 18
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - MUTEIN 104
<400> 18
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Asn Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 19
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 106_108
<400> 19
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgaaca ccacgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 20
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - MUTEIN 106_108
<400> 20
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Asn Thr Thr Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 21
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 149
<400> 21
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcacgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 22
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - MUTEIN 149
<400> 22
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Thr
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 23
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - MUTEIN 151_153
<400> 23
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gaacaagacg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 24
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - MUTEIN 151_153
<400> 24
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Asn Lys Thr Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 25
<211> 579
<212> DNA
<213> DNA - hEPO
<400> 25
atgggcgtgc acgaatgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgcct 60
ctgggactgc ctgtgctggg cgctcctcct agactgatct gcgactcccg ggtgctggaa 120
agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180
tccctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaagtga acttctacgc ctggaagcgg 240
atggaagtgg gccagcaggc tgtggaagtg tggcagggac tggctctgct gagcgaggct 300
gtgctgagag gacaggccct gctcgtgaac tcctcccagc cttgggaacc cctgcagctg 360
cacgtggaca aggctgtgtc cggcctgaga tccctgacca ccctgctgag agcactggga 420
gcccagaaag aggccatctc tccacctgac gccgcctctg ctgctcctct gagaaccatc 480
accgccgaca ccttcagaaa gctgttccgg gtgtactcca acttcctgcg gggcaagctg 540
aagctgtaca ccggcgaggc ttgccggacc ggcgacaga 579
<210> 26
<211> 193
<212> PRT
<213> AA - hEPO
<400> 26
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
Claims (26)
- 글리코실화를 위한 컨센수스 부위(consensus site)의 첨가를 통해 단독이량체성 또는 헤테로이량체성 수용체에 대한 결합 부위의 적어도 하나의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는, 신경보호 및 신경가소성 능력을 유지하는, 천연 에리트로포이에틴과 관련하여 0.5% 미만의 조혈 활성을 지닌, 변형된(modified) 사람 에리트로포이에틴.
- 제1항에 있어서, 수용체에 대한 이러한 결합 부위가 위치: 45-47, 15-17, 104, 98-100, 106-108, 149, 151-153, 76-78, 72-74, 62-64, 65-67, 및 이의 조합이 포함되는 아미노산의 세트로부터 선택되는 변형된 사람 에리트로포이에틴.
- 제1항에 있어서, 상기 돌연변이가 다음을 포함하는 세트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 사람 에리트로포이에틴:
a. Lys45Asn 및 Asn47Thr;
b. Tyrl5Asn 및 Leul7Thr;
c. Serl04Asn;
d. Ala98Asn 및 SerlOOThr;
e. Thrl06Asn 및 Leul08Thr;
f. Leul49Thr;
g. Glyl51Asn 및 Leul53Thr;
h. Arg76Asn 및 Gln78Thr;
i. Glu72Asn 및 Val74Thr;
j. Glu62Asn 및 Trp64Thr; 및
k. Gln65Asn 및 Leu67Thr. - 제1항에 있어서, 사람 에리트로포이에틴과 관련하여 0.2% 이하의 조혈 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 사람 에리트로포이에틴.
- 제1항에 있어서, 조혈 활성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 변형된 사람 에리트로포이에틴.
- 제1항에 있어서, 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: ll, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호:19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 변형된 사람 에리트로포이에틴.
- 제1항에 있어서, 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 16, 서열 번호: 18, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 및 서열 번호: 24를 포함하는 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 사람 에리트로포이에틴.
- 서열 번호: l, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: ll, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 적어도 포함하는 핵산.
- 서열 번호: l, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 벡터.
- 서열 번호: l, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 서열 번호: l, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 렌티바이러스 벡터.
- 서열 번호: l, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: ll, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된 핵산 분자를 포함하는, 유전적으로 변형된 세포.
- 제12항에 있어서, N-글리칸의 첨가를 허용하는 동물 또는 식물 세포주 또는 임의의 세포 숙주를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 세포.
- 제12항에 있어서, 동물 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 세포.
- 제12항에 있어서, CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21, 및 HeLa를 포함하는 세트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 세포.
- 치료학적 유효량의 제1항에 따른 변형된 사람 에리트로포이에틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS), 운동 뉴우런 질환(motor neurons disease), 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 척수소뇌실조증(spinocerebellar atrophies), 크로이펠츠-야콥 질환(Creutzffeld-Jakob disease), 손상 질환(disabling disease), 예를 들면, 우울증 또는 조현병(schizophrenia), 발달 질환(developmental disease), 예를 들면, 다운 증후군(Down Syndrome), 뇌혈관 발작으로부터의 신경 조직 손상 및 두개내 외상(cranioencephalic trauma)을 포함하는 세트로부터 선택된 병리의 치료를 위한, 치료학적 유효량의 제1항에 따른 변형된 사람 에리트로포이에틴을 포함하는 것에 의해 특징화된, 약제학적 조성물.
- 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측색 경화증(ALS), 운동 뉴우런 질환, 헌팅톤 질환, 척수소뇌실조증, 크로이펠츠-야콥 질환, 손상 질환, 예를 들면, 우울증 또는 조현병, 발달 질환, 예를 들면, 다운 증후군, 뇌혈관 발작으로부터의 신경 조직 손상 및 두개내 외상을 포함하는 세트로부터 선택된 병리의 치료를 위한, 제1항에 따른 변형된 사람 에리트로포이에틴의 용도.
- 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 변형된 사람 에리트로포이에틴을 수득하기 위한 방법:
a. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
b. 패키징 세포(packaging cell)의 적어도 하나의 공-형질감염 벡터를 구축하는 단계;
c. 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 당해 핵산 서열을 함유하는 상기 렌티바이러스 입자를 생산하는 상기 패키징 세포를 공-형질감염시키는 단계;
d. 단계 c의 패키징 세포에 의해 생산된 이러한 렌티바이러스 입자를 수거하는 단계;
e. 변형된 사람 에리트로포이에틴을 발현 및 폴딩(folding)할 수 있는 세포를 단계 d로부터의 상기 렌티바이러스 입자로 형질도입시키는 단계;
f. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단계 e에서의 세포를 선택하는 단계;
g. 단계 f로부터의 세포를 배양하여 이들이 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 발현하도록 하는 단계; 및
h. 상기 변형된 사람 에리트로포이에틴을 단리 및 정제하는 단계. - 제19항에 있어서, 상기 단계 a에서 핵산 서열이 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 21, 및 서열 번호: 23을 포함하는 세트로부터 선택된, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 단계 b가 세포내로 렌티바이러스 입자의 도입을 허용하는 벡터, 매트릭스 단백질, 캡시드, 프로테아제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 인테그라제를 암호화하는 벡터; 변형된 사람 에리트로포이에틴 서열을 포함하는 전달 벡터(transfer vector); 및 상기 전달 벡터의 핵 외수송(nuclear export)을 유도하는 벡터를 포함하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 단계 e에서 상기 세포가 CHO.K1, HEK293, NSO, BHK-21, 및 HeLa를 포함하는 세트로부터 선택되는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 단계 h가 항-rhEPO 항체, 및 용출물을 포함하는 면역친화성에 의한 정제인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 용출물이 글리신, 아세트산-NaCl, 아세테이트 염, 시트르산, 인산염, 에탄올, 이소프로필 알코올, 디옥산, 에틸렌 글리콜, 트리스-HCl, 및 이의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 용출물이 글리신, 아세트산-NaCl을 포함하는 그룹으로부터 선택된, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 용출물이 0.1 M 글리신(pH=2); 0.15 M 글리신(pH=2.5), 및 0.2 M 아세트산, 0.15 M NaCl(pH=3)을 포함하는 그룹으로부터 선택된, 방법.
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