EA017377B1 - Слитый белок эритропоэтина - Google Patents
Слитый белок эритропоэтина Download PDFInfo
- Publication number
- EA017377B1 EA017377B1 EA200970782A EA200970782A EA017377B1 EA 017377 B1 EA017377 B1 EA 017377B1 EA 200970782 A EA200970782 A EA 200970782A EA 200970782 A EA200970782 A EA 200970782A EA 017377 B1 EA017377 B1 EA 017377B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- epo
- fusion protein
- fragment
- carbamoylated
- fusion proteins
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 69
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 11
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 4
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 3
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 2
- 230000003018 neuroregenerative effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 abstract 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 abstract 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 44
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 4
- 101100505385 Mus musculus Gpd1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 4
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 3
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 2
- 208000027905 limb weakness Diseases 0.000 description 2
- 231100000861 limb weakness Toxicity 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 208000010713 partial hind limb paralysis Diseases 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 101150015653 IAA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028662 IAA13 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000006503 Janus Kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010019437 Janus Kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000010455 autoregulation Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000508 hormonal effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Heat Treatment Of Articles (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным слитым белкам, в которых эритропоэтин (ЕРО) соединен через его С-конец с Fc-фрагментом, и при этом указанные рекомбинантные слитые белки, дополнительно, являются карбамоилированными по первичным аминам слитого белка. В частности, данное изобретение относится к карбамоилированным слитым белкам EPO-Fc, в которых по крайней мере один, предпочтительно два или более аминных остатков лизина и/или N-концевой аминокислоты указанного слитого белка являются карбамоилированными. Карбамоилированные слитые белки EPO-Fc настоящего изобретения, имеющие пониженную гематопоэтическую активность, тогда как восстанавливающая активность в ткани, т.е. восстанавливающая активность по отношению к нервным клеткам, остается неизменной или даже увеличивается по сравнению с немодифицированными слитыми белками EPO-Fc. Кроме того, данное изобретение относится к способу получения подобных слитых белков и к фармацевтическим композициям, содержащим их, а также к применению таких слитых белков и фармацевтических композиций для лекарственной терапии.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным слитым белкам, в которых эритропоэтин (ЭПО) присоединен к белку-носителю, в частности к антителу или фрагменту антитела, такому как Есфрагмент, где указанные рекомбинантные слитые белки карбамоилированы. Кроме того, данное изобретение также относится к способу получения подобных слитых белков и к фармацевтическим композициям, содержащим их, а также к применению подобных слитых белков и фармацевтических композиций для лекарственной терапии.
Уровень техники
Эритропоэтин (ЕРО) - хорошо известный гликопротеин, первоначально идентифицированный по его гормональным эффектам на костный мозг и вовлеченный в рост и развитие зрелых эритроцитов. Помимо этой гематопоэтической активности, недавно было обнаружено, что ЕРО также функционирует как сильнодействующая, локально образующаяся молекула, подавляющая метаболический стресс во многих тканях. Защитные функции ЕРО в ткани опосредованы его взаимодействием с эритропоэтиновым рецептором. В мозгу, например, ЕРО и его рецептор образуются локально, модулируются метаболическими стрессорами и обеспечивают нейропротективные и противовоспалительные функции (Поддге11, 8.А. (2004) Ехрегй Ορίη 1пуекйд Огидк; 13 (11): 1517-9). В спинном мозгу ЕРО обеспечивает благоприятные эффекты, в том числе ингибирование апоптоза и некроза нейронов, олигодендроцитов и эндотелиальных клеток, наименьшее образование каверн, уменьшение перекисного окисления липидов, мобилизация эндотелиальных клеток-предшественников, стимулирование ангиогенеза и восстановление сосудистой ауторегуляции (Соло. А. ей а1. (2002), Ргос. Ыайй. Асаб. 8ей. И8А; 99(14): 9450-5; Ьейкй М. (2004), 8сйепее; 305 (5681): 239-42). Было показано, что ЭПО передает сигнал по пути модуляции элементов ядерного фактора (№)-карраВ, а также посредством янус-киназа 2/переносчиков сигнала и системы активаторов транскрипции-5 (Оогю А. (2005), Ыеигокигдегу; 56(4):821-7; Огакко О. (2005), Ыеигокигдегу; 56 (4):821-7).
При химической модификации, т. е. карбамоилировании, по крайней мере одной первичной аминогруппы лизинов и/или Ν-концевой аминокислоты ЕРО, гематопоэтическая активность данного цитокина значительно снижается, в то время как его защитная активность в ткани, т.е. его восстанавливающая активность по отношению к нервным клеткам, остается, по существу, неизменной или даже увеличивается по сравнению с некарбамоилированным ЕРО.
АО 2006/014466 и АО 2006/002646 раскрывают способ получения и применение карбамоилированного ЕРО при различных медицинских показаниях.
Так как ЕРО имеет относительно короткий период полувыведения из сыворотки крови и поскольку из уровня техники хорошо известно, что слияние константной области иммуноглобулина с неиммуноглобулиновым белком может заметно продлить период полувыведения из сыворотки крови указанного неиммуноглобулинового белка, были сделаны некоторые попытки связать иммуноглобулиновый фрагмент с ЕРО. Например, АО 99/02709 раскрывает способ получения и применение слитых белков, содержащих ЕРО и Ес-фрагмент иммуноглобулина, при этом слитые белки ЕРО-Ес имеют увеличенный период полувыведения ίη у1уо относительно природного ЕРО.
Из АО 2005/063808 известно, что дополнительного улучшения фармакокинетики, т.е. увеличенных периодов полувыведения из сыворотки крови и повышенной ίη у1уо активности слитых белков ЕРО-Ес можно добиться посредством мутаций, делеций или вставок специфических аминокислот.
Соответственно существует необходимость в упрощенной и более дешевой ЕРО терапии, т.е. требующей менее частое введение ЕРО, для лечения заболеваний, при которых желательна неизменная или даже повышенная восстанавливающая активность в ткани, т.е. восстанавливающая активность ЕРО по отношению к нервным клеткам, в то время как гематопоэтическая активность ЕРО менее желательна или даже не желательна и поэтому ее следует уменьшить. Подобные заболевания включают, но не ограничиваются, дисфункции или нарушения любой из двух или обеих центральной (ЦНС) и периферической (ПНС) нервных систем, и, в частности, включают заболевания, которые связаны или вызываются нервными повреждениями, такими как физические нервные поражения в результате, например, механического воздействия.
Сущность изобретения
Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы улучшить известные слитые белки ЕРО-Ес, которые имеют увеличенный период полувыведения из сыворотки крови по сравнению с неслитыми белками ЕРО, посредством химической модификации, т.е. карбамоилирования, с получением модифицированных слитых белков ЕРО-Ес, которые имеют, кроме увеличенного периода полувыведения из сыворотки крови, пониженную гематопоэтическую активность, но, несмотря на это, неизменную или увеличенную восстанавливающую активность по сравнению с немодифицированными слитыми белками ЕРО-Ес.
Модифицированные слитые белки ЕРО-Ес в соответствии с настоящим изобретением являются пригодными для лечения заболеваний или дисфункций любой из двух или обеих центральной (ЦНС) и периферической (ПНС) нервных систем, в том числе заболеваний, которые вызываются или связаны с физическим повреждением нервов, вызванным, например, механическим воздействием, теплом или излучением. Одним из предпочтительных свойств модифицированных слитых белков ЕРО-Ес по настоя- 1 017377 щему изобретению является то, что их можно вводить в более высоких терапевтических дозах по сравнению с традиционными ЕРО или ЕРО-Ес для той же цели, и, по существу, без увеличения неблагоприятных побочных эффектов на гематопоэтическую систему, т.е. картину крови.
Соответственно цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить модифицированный рекомбинантный слитый белок ЕРО, в котором ЕРО присоединен к белку-носителю, в частности к иммуноглобулину или иммуноглобулиновому фрагменту, такому как Ес-фрагмент, конкретнее к Есфрагменту молекулы 1дС, и при этом указанный рекомбинантный слитый белок дополнительно модифицирован посредством карбамоилирования.
Еще одна цель данного изобретения заключается в том, чтобы обеспечить способ получения подобного карбамоилированного рекомбинантного слитого белка ЕРО-Ес.
Еще одна цель данного изобретения заключается в том, чтобы обеспечить фармацевтические композиции, содержащие подобный карбамоилированный рекомбинантный слитый белок ЕРО-Ес.
В еще одном аспекте данное изобретение относится к применению подобного карбамоилированного рекомбинантного слитого белка ЕРО-Ес для лекарственной терапии.
В еще одном аспекте данное изобретение относится к применению фармацевтических композиций, содержащих подобный карбамоилированный рекомбинантный слитый белок ЕРО-Ес для лекарственной терапии.
Принцип данного изобретения дополнительно описывается в независимых пунктах формулы изобретения, тогда как содержание зависимых пунктов формулы изобретения представляет собой различные варианты осуществления данного изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает результаты исследования восстановления опорно-двигательного аппарата (ОДА) у крыс после закрытой травмы, при последовательном введении карбамоилированного слитого белка ЕРО-Ес в соответствии с настоящим изобретением.
Ось ординат = шкала ВеаФе-Вгезпайап-Вазво (ВВВ); ось абсцисс = избранные моменты времени до и после закрытой травмы; ргаеОР = до закрытой травмы; группа 1 = животные, получавшие белок гйЕРО (контроль); группа 2 = ничего не получавшие животные (плацебо группа); группа 3 = животные, получавшие некарбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес (сравнительная группа); группа 4 = животные, получавшие карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес (экспериментальная группа); группа 5 = животные, получавшие метилпреднизолон (сравнительная группа).
Фиг. 2 показывает результаты оценки эффекта карбамоилированного слитого белка ЕРО-Ес на мышиную модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) на различных стадиях развития ЭАЭ посредством определения показателя ЭАЭ.
Ось ординат = шкала показателя экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ); ось абсцисс = дни после начала введения;
фиг. 2А = ранняя обработка: животные, получавшие либо карбамоилированный слитый белок ЕРОЕс (исследуемая группа 1), либо ФБР (контрольная группа 2), введение начинали на 18 день после индукции ЭАЭ;
фиг. 2В = промежуточная обработка: животные, получавшие либо карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес (исследуемая группа 3), либо ФБР (контрольная группа 4), введение начинали на 28 день после индукции ЭАЭ;
фиг. 2С = поздняя обработка: животные, получавшие либо карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес (исследуемая группа 5), либо ФБР (контрольная группа 6), введение начинали на 52 день после индукции ЭАЭ.
Систематизация подробной информации о группах мышей находится в табл. 2. Фиг. 2А-2С показывают средний показатель ЭАЭ животных из каждой группы.
Подробное описание изобретения
В своем первом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает химически модифицированные, т.е. карбамоилированные, рекомбинантные слитые белки ЕРО-Ес, имеющие существенно увеличенный период полувыведения из сыворотки крови по сравнению с неслитыми белками ЕРО и одновременно имеющие пониженную гематопоэтическую активность по отношению к немодифицированным слитым белкам ЕРО-Ес плюс восстанавливающую активность по отношению к нервным клеткам, которая неизменна или даже больше, чем соответствующая активность немодифицированных белков ЕРО или слитых белков ЕРО-Ес.
Понятие слитый белок ЕРО-Ес, используемое в контексте данного документа, относится к белку, содержащему фрагмент ЕРО и Ес-фрагмент. Понятие фрагмент ЕРО, используемое в контексте данного документа, охватывает человеческий полноразмерный эритропоэтин дикого типа или природный эритропоэтин человека или из других источников, а также эритропоэтиноподобные молекулы, в том числе биологически активные фрагменты эритропоэтина, аналоги, модификации, мутанты и производные эритропоэтина. Понятие Ес-фрагмент, используемое в контексте данного документа, охватывает домены, происходящие из константной области иммуноглобулина, предпочтительно из человеческого иммуноглобулина, в том числе фрагмент, аналог, модификация, мутант или производное константной области.
- 2 017377
Соответствующие иммуноглобулины включают 1дС, т.е. подклассы 1дС 1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 и другие классы.
Понятие биологическая активность эритропоэтина, на которое ссылаются в контексте данного документа, следует понимать как способность ЕРО или ЕРО-подобных молекул взаимодействовать с эритропоэтиновым рецептором.
Биологически активная ЕРО-подобная молекула обычно имеет значительную схожесть или идентичность аминокислотной последовательности (например, лежащую в диапазоне по крайней мере от 55% до около 65, 75, 80% и даже вплоть до около 90-95% идентичности) с соответствующей последовательностью ЕРО дикого типа или природного ЕРО и обладает одной или более функциями ЕРО дикого типа.
Используемое в контексте данного документа понятие биологически активный фрагмент означает фрагмент, который может оказывать биологический эффект, схожий с полноразмерным белком. Подобные фрагменты могут образовываться в результате амино- и карбоксиконцевых делеций, а также в результате внутренних делеций. Они также включают усеченные и гибридные формы эритропоэтина. Усеченные формы представляют собой более короткие модификации эритропоэтина, в которых отсутствует один или более Ν-концевых и/или С-концевых остатков.
Слитый белок ЕРО-Ес по настоящему изобретению может быть соединен различными способами. Либо Ес-фрагмент присоединен через его С-конец к Ν-концу фрагмента ЕРО, т.е. слитый белок ЕРО-Ес с Ес-фрагментом к Ν-концу слитого белка ЕРО-Ес, либо, что является предпочтительным в настоящем изобретении, Ес-фрагмент присоединен через его Ν-конец к С-концу фрагмента ЕРО.
Кроме того, ЕРО-фрагмент и Ес-фрагмент могут быть соединены либо непосредственно конец к концу, либо опосредованно через линкер, например пептидный линкер, вставленный между ЕРОфрагментом и Ес-фрагментом.
Соответственно настоящее изобретение в первом аспекте относится к рекомбинантному слитому белку ЕРО, имеющему увеличенный физиологический период полувыведения и пониженную гематопоэтическую активность по сравнению с ЕРО ίη νίνο и, кроме того, имеющему нейрорегенеративную активность ίη νίνο, отличающемуся тем, что он содержит Ес-фрагмент молекулы человеческого 1дС и фрагмент эритропоэтина (ЕРО), предпочтительно фрагмент человеческого эритропоэтина, в котором Есфрагмент непосредственно соединен через его Ν-конец с С-концом фрагмента ЕРО, где слитый белок модифицирован посредством карбамоилирования.
Обычно карбамоилирование белков часто встречается в виде побочного эффекта применения мочевины при очистке белков и в результате высоких уровней мочевины в сыворотке крови вследствие спонтайного разложения мочевины до цианата. Цианат является инициатором карбамоилирования первичных аминов, в том числе первичных аминов в белках, и легко реагирует со свободным аминоостатком лизина и Ν-концевой аминокислотой белка, например гликопротеина ЕРО. Процесс карбамоилирования посредством цианата является рН-зависимым и может также протекать, хотя и в меньшей степени, с другими аминокислотами белка, в том числе аргинином, цистеином, тирозином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой и гистидином.
Препаративное карбамоилирование проводят посредством реакции предварительно определенного количества цианата с предварительно определенным количеством белка. Степень карбамоилирования зависит от времени реакции между цианатом и белком и от концентрации цианата и/или целевого белка.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к такому слитому белку ЕРО-Ес, в котором по крайней мере один, предпочтительно два или более остатка лизина и/или Ν-концевой аминокислоты указанного слитого белка карбамоилированы.
Карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес по настоящему изобретению может содержать дополнительные модификации в Ес-фрагменте, такие как аминокислотные мутации, как, например, аминокислотные вставки, аминокислотные делеции или консервативные или неконсервативные аминокислотные замещения. В частности, в уровне техники широко описаны аминокислотные замещения в Ес-фрагменте с целью дополнительного увеличения периода полувыведения из сыворотки крови слитых белков, например слитых белков ЕРО-Ес, посредством уменьшения или исключения Ес рецепторного связывания или комплементсвязывающей активности. Слитый белок ЕРО-Ес может также иметь дополнительные модификации в эритропоэтиновом фрагменте, такие как аминокислотные мутации, как, например, аминокислотные вставки, аминокислотные делеции, консервативные или неконсервативные аминокислотные замещения или аминокислотные дегликозилирования, которые понижают способность связывания с ЕРО рецептором и/или повышают биологическую активность эритропоэтина.
Обычно константной областью иммуноглобулина является природный или полученный синтетически полипептид, гомологичный С-концевому домену иммуноглобулина, который получается при расщеплении папаином. Константная область тяжелой цепи иммуноглобулина может включать 1 домен (СН1) константной области тяжелой цепи, шарнирную область, 2 домен (СН2) константной области тяжелой цепи и 3 домен (СН3) константной области тяжелой цепи.
Соответственно Ес-фрагмент по настоящему изобретению может включать шарнирную область, СН2 и/или СН3 домен. Ес-фрагмент может, кроме того, включать целую или часть шарнирной области, СН2 и/или СН3 домен.
- 3 017377
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к такому слитому белку ЕРО-Рс, который имеет Рс-фрагмент, содержащий шарнирную область, СН2 домен и СН3 домен, взятый из человеческого 1§С.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к такому слитому белку ЕРО-Рс, в котором соединение между ЕРО-фрагментом и Рс-фрагментом осуществляется в шарнирной области.
Обычно слитый белок ЕРО-Рс по настоящему изобретению получают способами рекомбинантной экспрессии, используя методики, хорошо известные специалистам в данной области техники. Для того чтобы получить гликозилированный рекомбинантный слитый белок ЕРО-Рс с характером гликозилирования, который, по существу, является таким же, как и у природных ЕРО и иммуноглобулинов, предпочтительным является применение эукариотических клеток для рекомбинантной экспрессии слитых белков ЕРО-Рс. Рекомбинантно экспрессированные белки секретируются в среде для культивирования в виде отдельных полипептидных цепей с образованием мономеров слитого белка ЕРО-Рс, но они могут также секретироваться в среде для культивирования в димерной или мультимерной форме, при этом полипептидные цепи соединяются друг с другом посредством дисульфидных связей.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к такому слитому белку ЕРО-Рс, в котором два мономера слитого белка ЕРО-Рс соединяются друг с другом с образованием гомодимера.
Секретируемые рекомбинантно полученные белки можно выделить из клеточной среды для культивирования и далее очистить при помощи хорошо известных в уровне техники методик.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к способу получения карбамоилированного рекомбинантного слитого белка ЕРО-Рс, содержащего Рс-фрагмент молекулы человеческого 1дС и ЕРО-фрагмент, предпочтительно человеческий ЕРО-фрагмент, в котором Рс-фрагмент непосредственно присоединен через его Ν-конец к С-концу ЕРО фрагмента, где способ включает:
получение молекулы ДНК, кодирующей слитый белок ЕРО-Рс; трансформирование клетки-хозяина указанной молекулой ДНК;
экспрессию указанного слитого белка ЕРО-Рс, кодируемого указанной молекулой ДНК; получение из культуры указанного слитого белка ЕРО-Рс;
очистку указанного слитого белка ЕРО-Рс и карбамоилирование указанного слитого белка ЕРО-Рс посредством взаимодействия указанного слитого белка ЕРО-Рс с цианатом, где по крайней мере один, предпочтительно два или более остатков лизина и/или Ν-концевая аминокислота слитого белка являются карбамоилированными.
Слитые белки ЕРО-Рс по настоящему изобретению сочетают предпочтительный увеличенный период полувыведения из сыворотки крови, полученный посредством соединения ЕРО-фрагмента с Рсфрагментом иммуноглобулина, с пониженной гематопоэтической активностью при одновременном поддержании неизменной или даже повышенной восстанавливающей активности по отношению к нервным клеткам за счет карбамоилирования по крайней мере одного первичного амина белка.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к подобному слитому белку ЕРО-Рс для применения в качестве лекарственного средства.
Обычно подобный слитый белок ЕРО-Рс можно применять вместо карбамоилированного ЕРОбелка во всех случаях, когда требуется лечение карбамоилированным ЕРО. В частности, такой слитый белок ЕРО-Рс применяют для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и/или периферической нервной системы.
Например, подобный слитый белок ЕРО-Рс можно применять для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из инсульта, ишемического явления в ЦНС помимо инсульта, закрытой травмы, травмы спинного мозга, травматического повреждения мозга и нейродегенеративного заболевания.
Благодаря увеличенному периоду полувыведения из сыворотки крови слитых белков ЕРО-Рс по изобретению по сравнению с карбамоилированными неслитыми белками ЕРО, фармацевтические композиции, содержащие подобные слитые белки ЕРО-Рс требуют менее частого введения по сравнению с фармацевтическими композициями, содержащими карбамоилированные неслитые белки ЕРО. Следовательно, лечение по настоящему изобретению слитыми белками ЕРО-Рс является намного более благотворным для пациента, нуждающегося в подобном лечении.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей подобный слитый белок ЕРО-Рс, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится, но не ограничивается, к подобной фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения. Поскольку эффективная ЕРОтерапия требует терапевтических уровней ЕРО в сыворотке крови, то желательно, чтобы подобные фармацевтические композиции применялись в виде раствора для инъекций, в котором слитый белок ЕРО-Рс по настоящему изобретению присутствует в смеси с веществами фармацевтически приемлемых носителей. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения подобные фармацевтические композиции обеспечиваются в галеновой форме подходящей для внутривенной или подкожной инъекции.
- 4 017377
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к применению подобных фармацевтических композиций для лечения заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и/или периферической нервной системы.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к применению подобных фармацевтических композиций для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из инсульта, ишемического явления в ЦНС, отличного от инсульта, закрытой травмы, травмы спинного мозга, травматического повреждения мозга и нейродегенеративного заболевания.
Для более полного понимания данного изобретения, описанного в контексте данного документа, изложены следующие примеры. Данные примеры служат только для иллюстративных целей и не следует считать, что они ограничивают данное изобретение в каком-либо отношении.
Примеры
Пример 1. Получение и исследование карбамоилированных слитых белков ЕРО-Ес.
a) Конструирование вектора экспрессии, кодирующего слитый белок ЕРО-Ес.
Слитый белок Еро-Ес создавали посредством ПЦР синтеза человеческого гена ЕРО и фрагмента шарнир-СН2-СН3 человеческого ГдС1. ЕРО устанавливался на Ν-конце структуры и присоединялся к шарнирной области человеческого ГдС1. Для секреции белка в культуральный супернатант использовали сигнальную последовательность эритропоэтина, которая амплифицировалась вместе с кДНК ЕРО. Такая структура делает возможной секрецию гомодимерной молекулы ЕРО-Ес.
кДНК человеческого ЕРО амплифицировали из плазмиды рНЕро посредством ПЦР с применением олигонуклеотидов еро Ьаск ВатН1 (предназначенных для того, чтобы присоединяться к специфическому сайту рестрикции ВатНГ на 5'-конце фрагмента ДНК) и еро йуЬ Ыпде Гог. давая в результате фрагмент ДНК длиной в 576 пар оснований (еро Ьаск ВатН1: 5' СССССАТСССССАТСССССТССАССААТСТСС 3' ЦЕС) Ш N0: 1]; еро йуЬ Ыпде Гог: 5' АСАТТТССССТСТСТСТССССТСТССТССАСС 3' ЦЕС ГО N0: 2]). Фрагмент шарнир-СН2-СН3 человеческого ГдС1 амплифицировали из плазмиды р2С12НС посредством ПЦР с применением олигонуклеотидов СН3 для №П (предназначенных для того, чтобы присоединяться к специфическому сайту рестрикции №Е на 3'-конце фрагмента ДНК) и Ыпде йуЬ еро Ьаск, давая в результате фрагмент ДНК длиной в 671 пар оснований (СН3 Гог №ГГ: 5' СССССССССССТСАТТТАСССССАСАСАСС 3' ЦЕС ГО N0: 3]; Ыпде йуЬ еро Ьаск: 5' АСАССССАСАСАСАССССАААТСТТСТСАС 3' |8ЕЦ ГО N0: 4]). Амплификацию проводили в общем объеме 50 мкл, применяя 20 нг плазмидной матрицы, 10 пмоль каждого олигонуклеотида, 250 мкМ нуклеотидов, 1хбуфер для ПЦР и 5 единиц термостабильной ДНК-полимеразы Тад. Обе реакции ПЦР осуществляли за 25 циклов при 94°С в течение 20 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин.
После очистки двух фрагментов при помощи набора для очистки 01адшск (О|адеп) проводили синтез ПЦР в объеме 50 мкл, используя 50 нг кДНК шарнир-СН2-СН3 ГдС1, 50 нг кДНК ЕРО, 250 мкМ нуклеотидов, 1хбуфер для ПЦР и 5 единиц ДНК-полимеразы Тад. На первой стадии провели 6 циклов при 94°С в течение 20 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. После добавления 10 пмоль каждого из внешних праймеров (еро Ьаск ВатНГ и СН3 для продолжали ПЦР еще на 25 циклов при 94°С в течение 20 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 1,5 мин.
После этого продукт ПЦР очищали посредством препаративной гель-экстракции и набора для гельэкстракции из 01адеп. Полученную кДНК ЕРО-Ес включали в ВатНГЖоГГ открытый эукариотический вектор экспрессии, содержащий промотор человеческого СМУ (цитомегаловирус) и трансформировали в ТС1 штамме Е.соН. 10 нг ЕРО-Ес-фрагмента и 5 нг вектора рЕСМУ, 1 единицу ДНК лигазы Т4 и 1хбуфер для лигирования (№\ν Епд1аий Вю1аЬ§) применяли для лигирования в общем объеме 10 мкл в течение 1 ч при 37°С. Положительные клоны распознавали посредством ПЦР-скрининга при помощи внешних праймеров. Правильность кДНК Еро-Ес в конечной плазмиде рСМУ_ЕроЕс проверяли посредством анализа последовательности и рестрикционного анализа.
b) Экспрессия и очистка слитого белка ЕРО-Ес.
Препаративный синтез плазмиды (рСМУ ЕроЕс) на стадии а) применяли для трансфекции негативных клеток СНО дигидрофолатредуктазы. Для трансфекции клеток липофектином использовали две плазмиды рСМУ_ЕроЕс и р2_йШг в соотношении 20:1. Отбор трансфицированных клеток начинали через 24 ч после трансфекции (ЭМЕМ 4 мМ Ь-Глутамин и 10% диализованная фетальная телячья сыворотка (ФТС)), а когда клоны начинали расти оказывали воздействие метотрексатом (МТХ) (0,05 мкМ и 0,1 мкМ МТХ). После отбора и выделения лучшего из полученных клонов культивирование переводили в безбелковые условия. Клеточный супернатант получают в результате периодической ферментации с добавлением субстрата, при этом жизнеспособность клетки составляет 80%.
Супернатант подвергают гель-фильтрации (размер поры 0,2 мкм) и добавляют 1 М ТРИС до конечного показателя рН 8,5, а затем пропускают через колонку с протеин А-сефарозой, уравновешенную 0,025 М ТРИС буферной солью, рН 8,5 и элюируют 0,1 М глицином, рН 3,5. Показатель рН элюируемой фракции продукта представлял собой измеряемый показатель рН и при необходимости его доводили до рН 7,0-7,5 при помощи 1 М ТРИС, рН 8,0.
- 5 017377
с) Получение карбамоилированного слитого белка ЕРО-Ес.
Исходное вещество для данного процесса очищали, в супернатанте культуры присутствует рекомбинантный человеческий слитый белок ЕРО-Ес, описанный выше, обычно включающий все изоформы слитого белка, что обеспечивает высокий выход необходимого конечного продукта.
Сначала белковую концентрацию рекомбинантного слитого белка человеческого ЕРО-Ес доводили до 4-7 мг/мл посредством ультрафильтрации (например, мембрана, отсекающая 10 кД). Готовили раствор КОСЫ-бората посредством растворения 60 мг/мгслитого белка ЕРО-ЕС в 0,6 М Ыа-боратном буферном растворе, рН 8.
Затем раствор слитого белка ЕРО-Ес смешивали с раствором КОСЫ-бората в соотношении 1:1 и полученный раствор инкубировали в течение 48 ч при 37°С. Окончательный карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес получили посредством гель-фильтрации (например, Сефадекс 025) в ФБР. Концентрацию карбамоилированного слитого белка ЕРО-Ес определяли по ОИ 280нм согласно калибровочной кривой слитого белка ЕРО-Ес, которую получали посредством анализа ЕБ18А.
Последующее определение степени карбамоилирования подтвердило, что все свободные аминогруппы, по существу, были карбамоилированы.
Пример 2. Исследование восстановления опорно-двигательного аппарата у крыс после закрытой травмы.
В эксперименте на животных ίη νίνο исследовали восстанавливающую активность по отношению к нервным клеткам карбамоилированного слитого белка ЕРО-Ес по сравнению с немодифицированным слитым белком ЕРО-Ес. Карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес и немодифицированный слитый белок ЕРО-Ес получали, как описано в примере 1.
крыс линии Спраг Доули с весом 240-260 г разделили на пять групп, содержащих шесть животных (группа 1), семь животных (группы 2, 4 и 5) или восемь животных (группа 3). Животных анестезировали смесью Кетавета (110 мг/кг) и Ромпуна (12 мг/кг), вводимой внутрибрюшинно, после чего следовала ламинэктомия на уровне Т-11. После того как спинной мозг подвергли воздействию (ламинэктомия), животные получают закрытую травму спинного мозга 150 кдин посредством применения Импактора ΙΗ 400 (Ртесхкюп 8ук1етк & ФкйитепФйоп, ЬехшдФп, ΚΥ, И8А). Через 1 ч после повреждения животные получали инъекцию однократной дозы соответствующего белка (см. табл. 1). Восстановление опорно-двигательного аппарата оценивали по шкале оценок Вакко-ВеаФе-Втекпайап через три дня, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели, пять недель и шесть недель после получения закрытой травмы. Шкала оценок Вакко-ВеаФе-Втекпайап представляет собой 21-балльную шкалу, которая систематически детализирует функционирование движений в суставе задней конечности, способность передвигаться, степень точного регулирования координированного передвижения и устойчивость торса.
Таблица 1
Классификация групп в исследовании мышей
| группа 1 | получавшая 1000 единиц/кг (эквивалент 10 мкг/кг рекомбинантного человеческого ЕРО (гЬЕРО); контрольная группа |
| группа 2 | получавшая ИаС1 внутрибрюшинно; плацебо группа |
| группа 3 | получавшая 30 мкг/кг гЕЕРО-Гс |
| группа 4 | получавшая 30 мкг/кг карбамоилированного г11ЕРО-Гс |
| группа 5 | получавшая 30 мкг/кг метилпреднизолона (МР23) |
Животных подвергали воздействию в открытом поле и наблюдали в течение пятиминутного периода через три дня, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели, пять недель и шесть недель после получения закрытой травмы. Фиг. 1 показывает значения по шкале Вакко-ВеаФе-Вгекпайап, полученные в данном эксперименте.
Было обнаружено, что введение карбамоилированного гйЕРО-Ес (группа 4) и гйЕРО-Ес (группа 3) значительно улучшает восстановление опорно-двигательного аппарата по сравнению с контрольными группами (группы 1 и 2). Напротив, животные, получавшие метилпреднизолон (группа 5), почти не проявляли какого-либо отличия от контрольных животных. В то время как контрольные животные достигают стационарного состояния приблизительно через четыре недели и далее не проявляют никакого восстановительного улучшения, животные групп 3 и 4 (слитый белок ЕРО-Ес и карбамоилированный слитый белок ЕРО-Ес соответственно) показывают непрерывные и значительные улучшения в течение периода восстановления свыше шести недель.
Также было обнаружено, что введение карбамоилированного гйЕРО-Ес (группа 4) значительно улучшает восстановление опорно-двигательного аппарата по сравнению с гйЕРО-Ес (группа 3), в частности непосредственно после закрытой травмы. На третий день животные, обработанные гйЕРО-Ес, показали лишь экстенсивное движение одного сустава или двух суставов (значение 2 или 3 по шкале оценок Вакко-ВеаФе-Вгекпайап, соответственно), в то время как животные, получавшие карбамоилированный гйЕРО-Ес, показали экстенсивное движение по крайней мере двух суставов и слабое движение третьего
- 6 017377 сустава или экстенсивное движение всех трех суставов задней конечности (значение 6 или 7 по шкале оценок Вавво-ВеаШе-Вгевпайаи соответственно).
Пример 3. Оценка эффекта карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс на мышиную модель рассеянного склероза.
В эксперименте на животных ίη νίνο исследовали эффект карбамоилированного слитого белка ЕРОРс на ранней, промежуточной и поздней фазе развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). ЭАЭ можно моделировать у грызунов, например у мышей, и он является общепринятой животной моделью для демиелинизирующих расстройств, таких как рассеянный склероз (МС). Мышиная модель ЭАЭ имитирует рецидивирующее и ремиттирующее течение болезни, характерное для МС.
Карбамоилированный слитый белок ЕРО-Рс, используемый в данном эксперименте, получали, как описано в примере 1.
ЭАЭ моделировали у 11 женских особей мышей С57ВБ/6 посредством иммунизации миелинолигодендроцитарным гликопротеином (МОГ35-55) (δηνίηο. С. е1 а1. (2006), 1. №иго1ттипо1 172 (1-2): 2737). Кратко, готовили раствор МОГ35-55 с концентрацией 4 мг/мл в ФБР. Термоинактивированные бактерии МусоЬас1епит 1иЬетси1о515 суспендировали в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) до концентрации 8 мг/мл. Полученную суспензию эмульгировали с раствором МОГ35-55. Затем каждой мыши вводили подкожно 100 мкл полученной эмульсии, по 50 мкл в каждый бок. В заключение каждому животному дважды вводили внутривенно 250 нг коклюшного токсина, растворенного в ФБР, один раз непосредственно после иммунизации и еще раз через 48 ч после иммунизации.
Для того чтобы исследовать эффект карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс на различных стадиях развития ЭАЭ, животных с модельным ЭАЭ разделили на исследуемую группу (пять животных) и контрольную группу (шесть животных). Животные в исследуемой группе получали карбамоилированный слитый белок ЕРО-Рс в дозе 50 мкг/кг массы тела, тогда как контрольная группа получала только ФБР. Введение посредством внутрибрюшинной инъекции либо карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс, либо ФБР начинали через 18 дней (ранняя обработка), 28 дней (промежуточная обработка) или 52 дня (поздняя обработка) после иммунизации. Кроме того, каждую исследуемую группу и контрольную группу дополнительно разделили на три подгруппы (см. табл. 2). Обработку осуществляли в течение 30 дней и животные получали дозу каждый второй день.
Таблица 2
Классификация групп в исследовании мышей
| ранняя обработка (первое введение через 18 дней после иммунизации) | группа 1 (три животных) | получавшая карбамоилированный слитый белок ЕРО-Гс в дозе 50 мкг/кг массы тела, исследуемая группа |
| группа 2 (три животных) | получавшая ФБР, контрольная группа | |
| промежуточная обработка (первое введение через 28 дней после иммунизации) | группа 3 (одно животное) | получавшая карбамоилированный слитый белок Е₽О-Гс в дозе 50 мкг/кг массы тела, исследуемая группа |
| группа 4 (два животных) | получавшая ФБР, контрольная группа | |
| поздняя обработка (первое введение через 52 дня после иммунизации) | группа 5 (одно животное) | получавшая карбамоилированный слитый белок ЕРО-Гс в дозе 50 мкг/кг массы тела, исследуемая группа |
| группа 6 (одно животное) | получавшая ФБР, контрольная группа |
Контролировали клиническое состояние животных и развитие заболевания. Кроме того, неврологические расстройства, проявляемые животными, оценивали количественно по показателю ЭАЭ каждый день в течение лечения в соответствии с системой оценок, показанной в табл. 3 (ВиббеЬетд, В.8. е1 а1. (2004), 1. №иго1ттипо1 153(1-2):158-70).
- 7 017377
Таблица 3
Показатель ЭАЭ
| показатель | клинические признаки заболевания |
| 0 | клиническая патология отсутствует |
| 0, 5 | частичная слабость конечностей или небольшая потеря мышечного тонуса |
| 1 | слабость конечностей |
| 1,5 | немного хромающая походка |
| 2 | частичный паралич задних конечностей |
| 2,5 | частичный паралич задних конечностей и частичное волочение задних конечностей |
| 3 | паралич задних конечностей |
| 3,5 | паралич задних конечностей и частичный паралич передних конечностей |
| 4 | паралич (тетраплегия) |
| 5 | агония или смерть |
Фиг. 2А-2С представляют показатели ЭАЭ, полученные в данных экспериментах на животных, при этом каждая фигура показывает средний показатель животных из каждой группы.
Было обнаружено, что введение карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс (группы 1, 3 и 5) уменьшает частоту рецидивов на ранней (фиг. 2А), промежуточной (фиг. 2В) и поздней фазе (фиг. 2С) развития ЭАЭ по сравнению с контролем (группы 2, 4 и 6). В то время как показатели ЭАЭ контрольных животных колебались вверх-вниз, у животных, получавших карбамоилированный слитый белок ЕРО-Рс, наблюдали, что показатель ЭАЭ, т.е. интенсивность заболевания, никогда не превышал показатель в начале обработки.
Также было обнаружено, что раннее введение карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс (фиг. 2А) оказывает лучший эффект на развитие ЭАЭ, чем позднее введение карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс (фиг. 2С) по сравнению с соответствующим контролем. В частности, на фиг. 2А можно увидеть, что на 30 день после начала введения средний показатель животных, получавших карбамоилированный слитый белок ЕРО-Рс (исследуемая группа), уменьшился на 65,2%, тогда как средний показатель контрольных животных уменьшился лишь на 46,1%.
Результаты данных экспериментов наводят на мысль о положительном эффекте карбамоилированного слитого белка ЕРО-Рс на развитие ЭАЭ.
- 8 017377
Список последовательностей <110> РоХутип δοίβηΐίίίσ 1гптипЫо1одХзсЬе ЕогзсИипд СтЬН <120> СЛИТЫЙ БЕЛОК ЭРИТРОПОЭТИНА <Х30> ВЕР-Ю286-ИО <Х40> РСТ/ЕР2008/00131Х <141> 2008-02-20 <150 ЕР 07003659.5 <151> 2007-02-22 <150> и$ 60/894,948 <151> 2007-03-15 <160> 4 <170> РаТепНп νεΓΒίοη 3.3 <210> 1 <211> 32 <212> ДКН <213> Искусственная <220>
<223> праймер еро Ьаск ВатН1 <400>1 дддддакссд ссаСдддддс дсасдаасдг сс <2Х0>2 <211>32 <212> ДКН <213> Искусственная <220>
<223> праймер еро пуЬ Мпде £ог <400>2 адахссдддс ЕсСсТдкссс сЪдГссЬдса дд <210>3 <211>30 <212> ДКН <213> Искусственная <220>
<223> праймер СНЗ £ог Νο£Ι <400>3 ддддсддссд сГсакХСасс сддадасадд <210>4 <211>30 <212> ДКН <213> Искусственная <220>
<223> праймер Ыпде ЪуЬ еро Ъаск <400> 4 асаддддаса дададсссаа аТсС£д£дас
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантный слитый белок ЕРО, имеющий увеличенный физиологический период полувыведения и пониженную гематопоэтическую активность по сравнению с ЕРО ίη νίνο и дополнительно имеющий нейрорегенеративную активность ίη νίνο, отличающийся тем, что он содержит Ес-фрагмент молекулы человеческого 1дС и фрагмент эритропоэтина (ЕРО), предпочтительно фрагмент человеческого эритропоэтина, в котором Ес-фрагмент непосредственно соединен через его Ν-конец с С-концом фрагмента ЕРО, и где слитый белок модифицирован посредством карбамоилирования.
- 2. Слитый белок по п.1, в котором по крайней мере один, предпочтительно два или более остатков лизина и/или Ν-концевая аминокислота указанного слитого белка являются карбамоилированными.
- 3. Слитый белок по п.1 или 2, в котором Ес-фрагмент содержит шарнирную область, домен СН2 и домен СН3, полученные из человеческого 1дС.
- 4. Слитый белок по любому из пп.1-3, в котором слияние осуществляется в шарнирной области.
- 5. Слитый белок по любому из пп.1-4, в котором два мономера слитого белка ЕРО-Ес соединены друг с другом и образуют гомодимер.
- 6. Способ получения карбамоилированного рекомбинантного слитого белка ЕРО-Ес, содержащего Ес-фрагмент молекулы человеческого 1дС и ЕРО-фрагмент, предпочтительно фрагмент человеческого эритропоэтина, в котором Ес-фрагмент непосредственно соединен через его Ν-конец с С-концом фрагмента ЕРО, где способ включает:получение молекулы ДНК, кодирующей слитый белок ЕРО-Ес;трансформирование клетки-хозяина указанной молекулой ДНК;экспрессию указанного слитого белка ЕРО-Ес, кодируемого упомянутой молекулой ДНК; получение из культуры указанного слитого белка ЕРО-Ес;очистку указанного слитого белка ЕРО-Ес и карбамоилирование указанного слитого белка ЕРО-Ес посредством взаимодействия цианата с указанным слитым белком ЕРО-Ес, где по крайней мере один, предпочтительно два или более остатков лизина и/или Ν-концевая аминокислота слитого белка являются карбамоилированными.
- 7. Слитый белок по любому из пп.1-5 для применения в качестве лекарственного средства.
- 8. Применение слитого белка по любому из пп.1-5 для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и/или периферической нервной системы.
- 9. Применение по п.8, в котором заболевание выбирают из группы, состоящей из инсульта, ишемического явления в ЦНС, отличного от инсульта, закрытой травмы, травмы спинного мозга, травматического повреждения мозга и нейродегенеративного заболевания.
- 10. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по любому из пп.1-5, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно для парентерального введения.
- 11. Фармацевтическая композиция по п.10, применяемая в виде раствора для инъекций.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20070003659 EP1961821B1 (en) | 2007-02-22 | 2007-02-22 | Erythropoietin fusion protein |
| US89494807P | 2007-03-15 | 2007-03-15 | |
| PCT/EP2008/001311 WO2008101680A1 (en) | 2007-02-22 | 2008-02-20 | Erythropoietin fusion protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200970782A1 EA200970782A1 (ru) | 2010-08-30 |
| EA017377B1 true EA017377B1 (ru) | 2012-12-28 |
Family
ID=37972378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200970782A EA017377B1 (ru) | 2007-02-22 | 2008-02-20 | Слитый белок эритропоэтина |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9085640B2 (ru) |
| EP (1) | EP1961821B1 (ru) |
| JP (1) | JP5588684B2 (ru) |
| KR (1) | KR101539120B1 (ru) |
| CN (1) | CN101688210B (ru) |
| AT (1) | ATE433492T1 (ru) |
| AU (1) | AU2008217202B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0807786A2 (ru) |
| CA (1) | CA2678986C (ru) |
| DE (1) | DE602007001273D1 (ru) |
| DK (1) | DK1961821T3 (ru) |
| EA (1) | EA017377B1 (ru) |
| ES (1) | ES2327170T3 (ru) |
| PL (1) | PL1961821T3 (ru) |
| WO (1) | WO2008101680A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2239569A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-13 | Lophius Biosciences GmbH | Method for polypeptide transfer into cells |
| WO2016111575A1 (ko) * | 2015-01-09 | 2016-07-14 | 주식회사 제넥신 | 지속형 epo 제제를 이용한 빈혈 치료 방법 |
| KR101847169B1 (ko) * | 2015-10-07 | 2018-04-09 | 주식회사 녹십자 | 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999002709A1 (en) * | 1997-07-10 | 1999-01-21 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins |
| WO2006014466A2 (en) * | 2004-07-02 | 2006-02-09 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Novel carbamylated epo and method for its production |
| WO2007070983A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Apollo Life Sciences Limited | Transdermal delivery of pharmaceutical agents |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1234731C (zh) * | 2003-01-30 | 2006-01-04 | 旭华（上海）生物研发中心有限公司 | 具有高度生物活性的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白 |
| PT1699821E (pt) | 2003-12-31 | 2012-08-23 | Merck Patent Gmbh | Proteína de fusão fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada |
| EP1771190A4 (en) * | 2004-07-02 | 2009-07-22 | Kenneth S Warren Inst Inc | METHOD FOR THE PRODUCTION OF COMPLETELY CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN |
| BRPI0513029A (pt) | 2004-07-07 | 2008-04-22 | Lundbeck & Co As H | método para produzir uma proteìna de eritropoietina carbamilada, proteìna de eritropoietina carbamilada, composto, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma doença ou condição crÈnica, sub-crÈnica e aguda e de tratamento de uma doença do sistema nervoso central ou sistema nervoso periférico, e, uso de um composto |
| JP2010510794A (ja) * | 2006-11-28 | 2010-04-08 | ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途 |
-
2007
- 2007-02-22 PL PL07003659T patent/PL1961821T3/pl unknown
- 2007-02-22 AT AT07003659T patent/ATE433492T1/de active
- 2007-02-22 DE DE200760001273 patent/DE602007001273D1/de active Active
- 2007-02-22 ES ES07003659T patent/ES2327170T3/es active Active
- 2007-02-22 EP EP20070003659 patent/EP1961821B1/en active Active
- 2007-02-22 DK DK07003659T patent/DK1961821T3/da active
-
2008
- 2008-02-20 KR KR1020097017538A patent/KR101539120B1/ko active IP Right Grant
- 2008-02-20 US US12/449,639 patent/US9085640B2/en active Active
- 2008-02-20 WO PCT/EP2008/001311 patent/WO2008101680A1/en active Application Filing
- 2008-02-20 JP JP2009550675A patent/JP5588684B2/ja active Active
- 2008-02-20 CN CN2008800057337A patent/CN101688210B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-02-20 EA EA200970782A patent/EA017377B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-02-20 AU AU2008217202A patent/AU2008217202B2/en not_active Ceased
- 2008-02-20 BR BRPI0807786 patent/BRPI0807786A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-02-20 CA CA2678986A patent/CA2678986C/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999002709A1 (en) * | 1997-07-10 | 1999-01-21 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins |
| WO2006014466A2 (en) * | 2004-07-02 | 2006-02-09 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Novel carbamylated epo and method for its production |
| WO2007070983A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Apollo Life Sciences Limited | Transdermal delivery of pharmaceutical agents |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DOGGRELL S.A.: "A neuroprotective derivative of erythropoietin that is not erythropoietic". EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS 2004 UNITED KINGDOM, vol. 13, no. 11, 2004, pages 1517-1519, XP002432576, ISSN: 1354-3784, page 1518, right-hand column, paragraph 3-5 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2678986A1 (en) | 2008-08-28 |
| AU2008217202A1 (en) | 2008-08-28 |
| JP5588684B2 (ja) | 2014-09-10 |
| KR20090122430A (ko) | 2009-11-30 |
| JP2010520859A (ja) | 2010-06-17 |
| AU2008217202B2 (en) | 2014-06-12 |
| WO2008101680A1 (en) | 2008-08-28 |
| BRPI0807786A2 (pt) | 2014-06-24 |
| PL1961821T3 (pl) | 2010-01-29 |
| CN101688210A (zh) | 2010-03-31 |
| DE602007001273D1 (de) | 2009-07-23 |
| US20100203050A1 (en) | 2010-08-12 |
| EP1961821B1 (en) | 2009-06-10 |
| EP1961821A1 (en) | 2008-08-27 |
| US9085640B2 (en) | 2015-07-21 |
| CA2678986C (en) | 2016-04-19 |
| ES2327170T3 (es) | 2009-10-26 |
| ATE433492T1 (de) | 2009-06-15 |
| DK1961821T3 (da) | 2009-10-12 |
| KR101539120B1 (ko) | 2015-07-29 |
| CN101688210B (zh) | 2013-08-14 |
| EA200970782A1 (ru) | 2010-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230265143A1 (en) | Recombinant human epo-fc-fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo | |
| JPH10503371A (ja) | 新規化合物 | |
| EP3121198B1 (en) | Recombinant human g-csf dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases | |
| BRPI0814465B1 (pt) | Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica | |
| US11883464B2 (en) | Nerve growth factor fusion protein, preparation method and use thereof | |
| EA017377B1 (ru) | Слитый белок эритропоэтина | |
| TWI554520B (zh) | 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白 | |
| US20240131114A1 (en) | Nerve growth factor fusion protein, preparation method and use thereof | |
| CN109824780A (zh) | 一种用于研发药物的双功能融合蛋白平台 | |
| CN116802301A (zh) | Tnfr2与april/baff受体的融合蛋白 | |
| JPS6312285A (ja) | Ｂ細胞分化因子をコードする遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |