KR101539120B1 - 에리트로포이에틴 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에리트로포이에틴(EPO)이 자기 C-말단을 통하여 Fc 단편에 연결되는 재조합 융합 단백질에 관계하는데, 이들 재조합 융합 단백질은 융합 단백질의 일차 아민(primary amine)에서 카르바모일화에 의해 더욱 변형된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 융합 단백질의 최소한 1개, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 리신 아민 잔기 및/또는 N-말단 아미노산이 카르바모일화되는 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다. 본 발명의 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질은 변형되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질과 비교하여, 조혈 활성(hematopoietic activity)이 감소하는 반면 조직 재생 활성(tissue regenerative activity), 다시 말하면, 신경 세포 재생 활성(nerval cell regenerative activity)이 불변하거나 더욱 강화된다. 본 발명은 또한, 이들 융합 단백질의 제조 공정과 이들을 함유하는 제약학적 조성물, 그리고 의학적 요법(medical therapy)을 위한 이들 융합 단백질과 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
에리트로포이에틴
Description
본 발명은 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO)이 단백질 담체, 더욱 구체적으로, 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, Fc 단편에 연결된 재조합 융합 단백질에 관계하는데, 여기서 이들 재조합 융합 단백질은 카르바모일화(carbamoylation)에 의해 더욱 변형된다. 본 발명은 또한, 이들 융합 단백질의 제조 공정과 이들을 함유하는 제약학적 조성물, 그리고 의학적 요법(medical therapy)을 위한 이들 융합 단백질과 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
널리 공지된 당단백질(glycoprotein)인 에리트로포이에틴(EPO)은 초기에, 골수(bone marrow)에 대한 호르몬 효과가 확인되었고, 성숙 적혈구 세포(mature red blood cell)의 성장과 발달에 관여한다. 이러한 조혈 활성 이외에, EPO는 최근에, 많은 조직에서 대사 스트레스(metabolic stress)를 완화시키는 강력한 국소 생산된 분자로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. EPO의 조직 보호 활성(tissue protective activity)은 에리트로포이에틴 수용체와의 상호작용을 통하여 매개된다. 가령, 뇌에서 EPO와 이의 수용체는 국지적으로 생산되고, 대사 스트레스인자(metabolic stressor)에 의해 조절되며, 신경보호(neuroprotective)와 소염(anti-inflammatory) 기능을 제공한다(Doggrell, SA. (2004) Expert Opin Investig Drugs; 13(11): 151 7-9). 척수(spinal cord)에서 EPO는 뉴런(neuron), 희돌기아교세포(oligodendrocyte)와 내피 세포(endothelial cell)의 아폽토시스(apoptosis)와 괴사(necrosis)의 저해, 더욱 적은 공동화(cavitation), 지질 과산화(lipid peroxidation)의 감소, 내피 전구 세포(endothelial progenitor cell)의 동원, 혈관신생(angiogenesis)의 촉진과 혈관 자동조절기능(vascular autoregulation)의 복원을 비롯한 유익한 효과를 제공한다(Gorio, A. et al (2002) Proc Natl Acad Sci U S A; 99(14):9450-5; Leist M. (2004) Science; 305(5681):239-42). EPO는 핵 인자(nuclear factor, NF)-kappaB 경로의 구성원의 조절을 통하여, 그리고 야누스 키나아제(janus kinase)-2/신호 변화체(signal transducer)와 전사 활성체(activator of transcription)-5 시스템에 의해 신호하는 것으로 밝혀졌다(Gorio A. (2005) Neurosurgery; 56(4):821-7; Grasso G. (2005) Neurosurgery; 56(4):821-7).
EPO의 리신(lysine) 및/또는 N-말단 아미노산의 최소한 하나의 일차 아미노기의 화학적 변형(chemical modification), 다시 말하면, 카르바모일화에 의해, 이러한 사이토킨(cytokine)은 카르바모일화되지 않은 EPO와 비교하여, 조혈 활성이 현저하게 감소하는 반면, 이의 조직 보호 활성, 다시 말하면, 이의 신경 세포 재생 활성이 실질적으로 불변하거나 더욱 강화된다.
WO 2006/014466과 WO 2006/002646에서는 카르바모일화된 EPO의 제조와 다양한 의학적 증상에서 이의 용도를 개시한다.
EPO의 혈청 반감기(serum half-life)가 상대적으로 짧고, 비-면역글로불린 단백질(non-immunoglobulin protein)에 면역글로불린 불변 영역(immunoglobulin constant region)의 융합(fusion)이 상기 비-면역글로불린 단백질의 혈청 반감기를 상당히 연장시킬 수 있는 것으로 당분야에 널리 알려져 있기 때문에, 면역글로불린 단편을 EPO에 연결하는 접근법이 다수 존재한다. 가령, WO 99/02709에서는 EPO와 면역글로불린의 Fc 부분(portion)을 포함하는 융합 단백질(fusion protein)의 생산과 이용을 개시하는데, 여기서 이들 EPO-Fc 융합 단백질은 자연 발생 EPO와 비교하여, 증가된 생체내 반감기를 갖는다.
WO2005/063808로부터, EPO-Fc 융합 단백질의 약물동태(pharmacokinetics)의 더욱 향상, 다시 말하면, 연장된 혈청 반감기와 증가된 생체내 효능이 특정 아미노산의 돌연변이(mutation), 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)에 의해 획득될 수 있음을 확인할 수 있다.
따라서 EPO의 불변하거나 더욱 강화된 조직 재생 활성, 다시 말하면, 신경 세포 재생 활성이 바람직하고, 이와 동시에 EPO의 조혈 활성이 덜 바람직하거나 바람직하지 않고, 따라서 축소되어야 하는 질환의 치료를 위하여 간소화되고 더욱 저렴한 EPO 요법, 다시 말하면, 더욱 낮은 빈도의 EPO 투여가 요구된다. 이들 질환에는 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS), 또는 둘 모두의 기능부전(malfunction) 또는 손상이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 구체적으로, 예로써 기계적 충격(mechanical impact) 이후에 물리적 신경 손상(physical nerval damage)과 같은 신경 손상과 연관되거나 이러한 신경 손상에 의해 유발되는 질환이 포함된다.
본 발명의 요약
따라서 본 발명의 목적은 융합되지 않은 EPO 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 갖는 공지된 EPO-Fc 융합 단백질을 화학적 변형, 다시 말하면, 카르바모일화로 향상시켜 변형된 EPO-Fc 융합 단백질을 획득하는 것인데, 이들 융합 단백질은 연장된 혈청 반감기 이외에, 변형되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질과 비교하여 감소된 조혈 활성과 불변하거나 강화된 재생 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 변형된 EPO-Fc 융합 단백질은 예로써, 기계적 충격, 열 또는 방사선에 의해 유발된 신경의 물리적 손상에 의해 유발되거나 이러한 물리적 손상과 연관된 질환을 비롯한, 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS), 또는 둘 모두의 질환 또는 기능부전의 치료에 적합하다. 본 발명의 변형된 EPO-Fc 융합 단백질의 유익한 특징 중의 하나는 이들이 동일한 목적을 위하여 전통적인 EPO 또는 EPO-Fc와 비교하여 더욱 높은 치료 용량(therapeutic dose)으로, 그리고 조혈기관(hematopoietic system), 다시 말하면, 혈구수(blood count)에 대한 바람직하지 않은 효과를 본질적으로 증폭시키지 않으면서 투여될 수 있다는 점이다.
따라서 본 발명의 목적은 EPO가 단백질 담체, 구체적으로, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 예를 들면, Fc 단편, 더욱 구체적으로, IgG 분자의 Fc 부분에 연결되는 변형된 재조합 EPO 융합 단백질을 제공하는 것인데, 이러한 재조합 융합 단백질은 카르바모일화에 의해 더욱 변형된다.
본 발명의 다른 목적은 이런 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질의 제조 방법을 제시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이런 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 의학적 요법을 위한 이런 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질의 용도에 관계한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의학적 요법을 위한 이런 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
본 발명의 원리는 독립항에서 더욱 기술되는 반면, 본 발명의 다양한 구체예는 종속항의 요부(subject matter)이다.
도 1에서는 본 발명에 따른 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 차후 투여 이후에, 타박 손상후 쥐에서 이동 회복(locomotor recovery) 결정의 결과를 보여준다. 세로좌표 = Beattie-Bresnahan-Basso 척도; 가로좌표 = 타박 손상 전후에 선택된 시점; praeOP = 타박 손상 이전; 1 군 = rhEPO 단백질(대조)로 치료된 동물; 2 군 = 치료되지 않은 동물(위약 군); 3 군 = 카르바모일화되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질로 치료된 동물(비교 군); 4 군 = 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료된 동물(실험 군); 5 군 = 메틸프레드니솔론(methylprednisolon)으로 치료된 동물(비교 군).
도 2에서는 EAE 스코어의 결정으로, EAE 진행의 상이한 단계에서 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE) 생쥐 모형에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질 효과의 평과 결과를 보여준다. 세로좌표 = 실험적 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 스코어 척도; 가로좌표 = 투여 시작후 일자; 도 2A = 초기 치료: 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질(검사; 1 군) 또는 PBS(대조; 2 군)로 치료된 동물, 투여는 EAE 유도후 18일 시점에 시작되었다; 도 2B = 중기 치료: 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질(검사; 3 군) 또는 PBS(대조; 4 군)로 치료된 동물, 투여는 EAE 유도후 28일 시점에 시작되었다; 도 2C = 후기 치료: 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질(검사; 5 군) 또는 PBS(대조; 6 군)로 치료된 동물, 투여는 EAE 유도후 52일 시점에 시작되었다. 생쥐 군 배열에 관한 상세한 정보는 표 2에서 제시된다. 도면 2A 내지 2C에서는 각 군에 이용된 동물의 평균 EAE 스코어를 도시한다.
첫 번째 구체예에서, 본 발명에서는 융합되지 않은 EPO 단백질과 비교하여 현저하게 연장된 혈청 반감기, 변형되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질과 비교하여 감소된 조혈 활성, 그리고 변형되지 않은 EPO 또는 EPO-Fc 융합 단백질의 상응하는 활성과 비교하여 불변하거나 더욱 향상된 신경 세포 재생 활성을 갖는 화학적으로 변형된, 다시 말하면, 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질을 제시한다.
본 명세서에서, "EPO-Fc 융합 단백질"은 EPO 부분과 Fc 부분을 포함하는 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서, "EPO 부분"은 인간 또는 다른 출처로부터 전장 야생형 또는 자연 발생 에리트로포이에틴, 그리고 에리트로포이에틴의 생물학적 활성 에리트로포이에틴 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 비롯한 에리트로포이에틴-유사 분자를 포괄한다. 본 명세서에서, "Fc 부분"은 면역글로불린, 바람직하게는 인간 면역글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 도메인, 예를 들면, 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포괄한다. 적합한 면역글로불린에는 IgG, 다시 말하면, 하위분류 IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4, 그리고 다른 분류가 포함된다.
본 명세서에서, 에리트로포이에틴의 "생물학적 활성"은 에리트로포이에틴 수용체와 상호작용하는 EPO 또는 EPO-유사 분자의 능력을 의미한다.
생물학적 활성 EPO-유사 분자는 전형적으로, 야생형 또는 자연 발생 EPO의 상응하는 서열과 실질적인 아미노산 서열 유사성 또는 동일성(즉, 최소한 55%에서 대략 65%, 75%, 80%, 그리고 최대 90-95% 범위의 동일성)을 공유하고, 야생형 EPO의 기능 중에서 한 가지 이상을 보유한다.
본 명세서에서, "생물학적 활성 단편"은 전장 단백질과 유사한 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 단편을 의미한다. 이들 단편은 아미노(amino)-와 카르복시(carboxy)-말단 결실에 의해, 그리고 내부 결실(internal deletion)에 의해 산출될 수 있다. 이들에는 에리트로포이에틴의 절두된 형태와 하이브리드 형태 역시 포함된다. "절두된" 형태는 하나 이상의 N-말단 및/또는 C-말단 잔기가 부재하는, 에리트로포이에틴의 더욱 짧은 이형이다.
본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질은 상이한 방식으로 서로 연결될 수 있다. Fc 부분은 자기 C-말단을 통하여 EPO 부분의 N-말단에 연결되거나(즉, EPO-Fc 융합 단백질은 EPO-Fc 융합 단백질의 N-말단을 지향하는 Fc 부분을 보유한다), 또는 적절하게는, Fc 부분은 자기 N-말단을 통하여 EPO 부분의 C-말단에 연결된다.
게다가, EPO 부분과 Fc 부분은 말단과 말단에 의해 직접적으로, 또는 EPO 부분과 Fc 부분 사이에 삽입되는 링커(linker), 예를 들면, 펩티드 링커(peptide linker)를 통하여 간접적으로 서로 융합될 수 있다. 따라서 첫 번째 측면에서, 본 발명은 생체내에서 EPO와 비교하여 향상된 생리학적 반감기와 감소된 조혈 활성, 그리고 생체내에서 신경재생 활성을 갖는 재조합 EPO 융합 단백질에 관계하는데, 상기 융합 단백질은 인간 IgG 분자의 Fc 부분과 에리트로포이에틴(EPO) 부분, 바람직하게는 인간 에리트로포이에틴 부분을 포함하고, 여기서 Fc 부분은 자기 N-말단을 통하여 EPO 부분의 C-말단에 직접적으로 연결되고, 상기 융합 단백질은 카르바모일화에 의해 변형된다.
일반적으로, 단백질의 카르바모일화는 단백질 정제에서 요소(urea) 이용의 부작용으로서, 그리고 요소의 시안산염으로의 자발적 분해(spontaneous decomposition)에 의한 높은 요소 혈청 수준의 결과로써 빈번하게 발생한다. 시안산염은 단백질 내에서 일차 아민을 비롯한 일차 아민의 카르바모일화를 주도하고, 단백질, 예를 들면, EPO 당단백질의 리신과 N-말단 아미노산의 유리 아미노 잔기(free amino residue)와 쉽게 반응한다. 시안산염에 의한 카르바모일화 과정은 pH-의존성이고, 정도가 덜하긴 하지만, 아르기닌(arginine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)과 히스티딘(histidine)을 비롯한, 단백질의 다른 아미노산에서도 발생할 수 있다.
예비 카르바모일화는 미리 결정된 양의 시안산염을 미리 결정된 양의 단백질과 반응시킴으로써 수행된다. 카르바모일화 정도는 시안산염과 단백질 사이에 반응 시간, 그리고 시안산염 및/또는 원하는 단백질의 농도에 좌우된다.
다른 측면에서, 본 발명은 융합 단백질의 최소한 1개, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 리신 잔기 및/또는 N-말단 아미노산이 카르바모일화되는 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다.
본 발명의 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질은 Fc 부분에서 추가의 돌연변이, 예를 들면, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, 또는 보존성이나 비-보존성 아미노산 치환과 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 특히, Fc 부분에서 아미노산 치환은 Fc 수용체 결합 또는 보체(complement) 고정 활성을 감소시키거나 소멸시킴으로써, 융합 단백질, 예를 들면, EPO-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 더욱 연장하기 위하여 기존 문헌에서 폭넓게 개시된다. EPO-Fc 융합 단백질은 에리트로포이에틴 부분에서 추가의 돌연변이, 예를 들면, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, 보존성이나 비-보존성 아미노산 치환, 또는 EPO 수용체에 대한 결합 친화성(binding affinity)을 감소시키고 및/또는 에리트로포이에틴의 생물학적 활성을 증가시키는 아미노산 탈당화(deglycosylation)와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일반적으로, 면역글로불린의 불변 영역은 파파인 절단(papain digestion)으로 산출되는, 면역글로불린 C-말단 도메인에 상동한 자연 발생 또는 합성된 폴리펩티드로 정의된다. 면역글로불린 중쇄(heavy chain)의 불변 영역은 중쇄 불변 영역 1 도메인(CH1), 힌지 영역(hinge region), 중쇄 불변 영역 2 도메인(CH2)과 중쇄 불변 영역 3 도메인(CH3)을 포함할 수 있다.
따라서 본 발명의 Fc 부분은 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Fc 부분은 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인의 전체 또는 일부를 더욱 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 IgG로부터 유래된 힌지 영역, CH2 도메인과 CH3 도메인을 포함하는 Fc 부분을 보유하는 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다.
다른 측면에서, 본 발명은 EPO 부분과 Fc 부분 상에 융합이 힌지 영역에서 달성되는 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다.
일반적으로, 본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질은 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용한 재조합 발현 방법에 의해 산출된다. 자연 발생 EPO와 면역글로불린에서와 거의 동일한 당화 패턴(glycosylation pattern)을 갖는 당화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질을 획득하기 위하여, EPO-Fc 융합 단백질의 재조합 발현에 진핵 세포(eukaryotic cell)를 이용하는 것이 바람직하다. 재조합 방식으로 발현된 단백질은 EPO-Fc 융합 단백질 단량체를 형성하는 단일 폴리펩티드 사슬로서 배양 배지(culture medium)에 분비되지만, 폴리펩티드 사슬이 이황화 결합(disulfide bond)을 통하여 서로 연결되면 이합체 또는 복합체 형태로 배양 배지에 분비될 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 2개의 EPO-Fc 융합 단백질 단량체가 서로 연결되어 동종이합체를 형성하는 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다.
분비되고, 재조합 방식으로 산출된 단백질은 당분야에 널리 공지된 기술에 의해 세포 배양 배지로부터 분리되고 더욱 정제될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 IgG 분자의 Fc 부분과 EPO 부분, 바람직하게는 인간 EPO 부분을 포함하는 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질의 제조 방법에 관계하는데, 여기서 Fc 부분은 자기 N-말단을 통하여 EPO 부분의 C-말단에 직접적으로 연결되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
- EPO-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 제조하는 단계;
- 상기 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
- 상기 DNA 분자에 의해 인코딩된 EPO-Fc 융합 단백질을 발현시키는 단계;
- EPO-Fc 융합 단백질을 수집하는 단계;
- EPO-Fc 융합 단백질을 정제하는 단계;
- 시안산염(cyanate)을 EPO-Fc 융합 단백질과 반응시킴으로써 EPO-Fc 융합 단백질을 카르바모일화시키는 단계,
여기서 상기 융합 단백질의 최소한 1개, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 리신 잔기 및/또는 N-말단 아미노산이 카르바모일화된다.
본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 부분에 EPO 부분의 융합으로 획득되는 유익한 연장된 혈청 반감기, 감소된 조혈 활성, 그리고 상기 단백질의 최소한 하나의 일차 아민의 카르바모일화에 기인한 불변하거나 더욱 향상된 신경 세포 재생 활성을 합병한다.
다른 측면에서, 본 발명은 약물로서 이용을 위한 EPO-Fc 융합 단백질에 관계한다.
일반적으로, EPO-Fc 융합 단백질은 카르바모일화된 EPO로 치료가 필요한 때마다, 카르바모일화된 EPO 단백질 대신에 이용될 수 있다. 구체적으로, 이런 EPO-Fc 융합 단백질은 중추신경계(CNS) 및/또는 말초신경계 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에 이용된다.
가령, EPO-Fc 융합 단백질은 발작(stroke), 발작 이외에 CNS에서 허혈 현상(ischemic event), 타박 손상(contusion injury), 척수 손상(spinal cord injury), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury)과 신경변성 질환(neurodegenerative disease)으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에 이용될 수 있다.
카르바모일화된 융합되지 않은 EPO 단백질과 비교하여 본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질의 연장된 혈청 반감기로 인하여, 이런 EPO-Fc 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물은 카르바모일화된 융합되지 않은 EPO 단백질을 함유하는 제약학적 조성물과 비교하여 더욱 낮은 빈도의 투여를 요구한다. 이런 이유로, 본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질로 치료는 이런 치료를 요하는 환자에서 훨씬 편의하다.
다른 측면에서, 본 발명은 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 EPO-Fc 융합 단백질을 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다.
다른 측면에서, 본 발명은 비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물에 관계하지만 이에 국한되지 않는다. 효과적인 EPO 요법이 치료적 EPO 혈청 수준을 필요로 하기 때문에, 이런 제약학적 조성물은 본 발명의 EPO-Fc 융합 단백질이 제약학적으로 허용되는 담체 물질과의 혼합물로 존재하는 경우에 주사 용액(injection solution)으로 개작하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이런 제약학적 조성물은 정맥내(intravenous) 또는 피하(subcutaneous) 주사에 적합한 생약 형태(galenic form)로 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 중추신경계(CNS) 및/또는 말초신경계 질환의 치료를 위한 이런 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
다른 측면에서, 본 발명은 발작(stroke), 발작 이외에 CNS에서 허혈 현상(ischemic event), 타박 손상(contusion injury), 척수 손상(spinal cord injury), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury)과 신경변성 질환(neurodegenerative disease)으로 구성된 군에서 선택되는 질환의 치료를 위한 이런 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
본 명세서에 기술된 발명이 더욱 완전하게 이해되도록 하기 위하여. 아래의 실시예가 열거된다. 이들 실시예는 예시를 목적으로 하고, 본 발명을 결코 한정하지 않는다.
실시예 1: 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 제조와 특성화
a) EPO-Fc 융합 단백질를 인코딩하는 발현 벡터의 작제:
Epo-Fc 융합 단백질은 인간 EPO 유전자와 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 단편의 융합-PCR로 산출하였다. EPO는 구조체(construct)의 N-말단에 배치하고 인간 IgG1의 힌지 영역에 융합시켰다. 배양 상층액(culture supernatant) 내로 단백질의 분비를 위하여, EPO cDNA와 함께 증폭된 에리트로포이에틴 신호전달 서열을 이용하였다. 이러한 구조는 동종이합체성 EPO-Fc 분자의 분비를 가능하게 한다.
인간 Epo cDNA는 올리고뉴클레오티드 epo back BamHI(상기 DNA 단편의 5' 말단으로 유일한 BamHI 제한 부위를 부가하도록 설계됨)와 576 bp DNA 단편을 발생시키는 epo hyb hinge를 이용한 PCR로 플라스미드 phEpo로부터 증폭시켰다(epo back BamHI: 5' GGGGGATCCGCCATGGGGGTGCACGAATGTCC 3'[SEQ ID NO 1]; epo hyb hinge: 5' AGATTTGGGCTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3'[SEQ ID NO 2]). 이러한 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 단편은 올리고뉴클레오티드 CH3 for NotI(상기 DNA 단편의 3' 말단으로 유일한 NotI 제한 부위를 부가하도록 설계됨)와 671 bp DNA 단편을 발생시키는 hinge hyb epo back을 이용한 PCR로 플라스미드 p2G12HC로부터 증폭시켰다[CH3 for NotI: 5' GGGGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG 3'[SEQ ID NO 3]; hinge hyb epo back: 5' ACAGGGGACAGAGAGCCCAAATCTTGTGAC 3'[SEQ ID NO 4]): 증폭은 20 ng 플라스미드 주형, 10 pmol의 각 올리고뉴클레오티드, 250 μM 뉴클레오티드, 1xPCR 완충액과 5 단위(unit)의 열안정성(thermostable) Taq 중합효소를 이용하여 50 ㎕의 총 체적(total volume)으로 수행하였다. 양쪽 PCR 반응은 94℃에서 20초, 56℃에서 30초와 72℃에서 1분의 25회 주기로 수행하였다. Qiaquick 정제 키트(Qiagen)로 이들 두 단편의 정제 이후에, 50 ng IgG1 힌지-CH2-CH3 cDNA, 50 ng EPO cDNA, 250 μM 뉴클레오티드, 1xPCR 완충액과 5 단위의 Taq 중합효소를 이용하여 50 ㎕ 체적으로 융합 PCR을 수행하였다. 첫 번째 단계에서, 94℃에서 20초, 60℃에서 30초와 72℃에서 1분의 6회 주기를 수행하였다. 10 pmol의 각 외부 프라이머(epo back BamHI와 CH3 for NotI)를 첨가한 이후, 94℃에서 20초, 56℃에서 30초와 72℃에서 1.5 분의 25회 주기 동안 PCR을 지속하였다.
그 다음, PCR 산물은 Qiagen으로부터 예비 겔 추출(preparative gel extraction)과 겔 여과(gel extraction) 키트로 정제하였다. 생성된 EPO-Fc cDNA는 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 BamHI/NotI 열린 진핵 발현 벡터 내로 삽입하고 대장균(E. coli) 균주 TG1로 형질전환시켰다. 10 ng의 EPO-Fc 단편과 5 ng의 pECMV 벡터, 1 단위의 T4-리가아제와 1 x 결찰 완충액(ligation buffer)(New England Biolabs)을 37℃에서 1시간 동안 10 ㎕의 총 체적으로 결찰에 이용하였다. 양성 클론은 이들 외부 프라이머를 이용한 PCR-스크리닝(screening)으로 확인하였다. 최종 플라스미드 pCMV_EpoFc에서 Epo-Fc cDNA의 정확도는 서열과 제한 분석으로 검증하였다.
b) EPO-Fc 융합 단백질 발현과 정제:
단계 a)로부터 대규모 플라스미드 제조물(pCMV_EpoFc)은 디하이드로엽산환원효소(dihydrofolate-reductase) 음성 CHO 세포의 형질감염(transfection)에 이용하였다. 이들 플라스미드 pCMV_EpoFc와 p2_dhfr은 리포펙틴(lipofectin)을 이용한 세포의 형질감염에 20:1 비율로 이용하였다. 형질감염된 세포의 선별은 형질감염(DMEM 4mM L-글루타민과 10% 투석된 FCS) 이후 24시간 시점에 시작하고, 클론(clone)이 성장하기 시작하면 MTX 압력(0.05 μM과 0.1 μM MTX)을 가하였다. 최고 실행 클론의 선별과 분리 이후에, 배양을 단백질 없는 조건으로 변경하였다. 세포 상층액은 80%의 세포 생존도(cell viability)로 유가(fed batch) 발효액으로부터 회수하였다.
상층액은 크기 여과하고(0.2 ㎛ 구멍 크기), 1 M Tris를 8.5의 최종 pH로 첨가하고, 이후 0.025 M Tris-완충된 염수, pH 8.5로 평형화된 단백질 A-세파로오스 칼럼에 통과시키고 0.1 M 글리신, pH 3.5로 용출하였다. 용출된 산물 분획물(product fraction)의 pH를 pH 측정하고, 필요하면 1 M Tris, pH 8.0으로 pH 7.0 - 7.5로 설정하였다.
c) 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 생산:
이러한 과정을 위한 출발 물질(starting material)은 배양 상층액 내에 존재하는 융합 단백질의 모든 동족체(isoform)를 전형적으로 포함하는 앞서 기술된 바와 같은 정제된 재조합 인간 EPO-Fc 융합 단백질인데, 이는 원하는 최종 산물(end product)의 높은 수율을 가능하게 한다.
먼저, 재조합 인간 EPO-Fc 융합 단백질의 단백질 농도를 한외여과(ultrafiltration)(가령, 10 kD 컷오프(cut off)를 갖는 막)에 의해 4-7 ㎎/㎖로 조정하였다. KOCN-붕산염(borate) 용액은 0.6 M Na-붕산염 완충액, pH 8에 60 ㎎/㎎EP0-Fc 융합 단백질을 용해시킴으로써 제조하였다.
이후, EPO-Fc 융합 단백질 용액은 1:1 비율로 KOCN-붕산염 용액과 혼합하고, 생성 용액은 37℃에서 48시간 동안 항온 처리하였다. 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질은 PBS에서 겔 여과(gel filtration)(가령, Sephadex G25)로 최종 조제하였다. 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 농도는 ELISA에 의해 결정된, EPO-Fc 융합 단백질의 보정 곡선(calibration curve)에 따라서 OD280nm로 결정하였다.
카르바모일화 수준의 차후 결정에서, 실질적으로 모든 유리 아미노 기가 카르바모일화되는 것으로 확인되었다.
실시예 2: 타박 손상후 쥐에서 운동 회복(locomotor recovery)의 결정
동물 실험에서, 변형되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질과 비교하여 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 생체내 신경 세포 재생 활성을 분석하였다. 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질과 변형되지 않은 EPO-Fc 융합 단백질은 실시예 1에 개시된 바와 같이 산출되었다.
240 - 260 g 체중을 갖는 35마리 Sprague-Dawley 쥐는 6마리 동물(1 군), 7마리 동물(2, 4와 5 군) 또는 8마리 동물(3 군)로 구성되는 5개 군으로 분할하였다. 이들 동물은 복강내 주입된 Ketavet(110 ㎎/㎏)와 Rompun(12 ㎎/㎏)의 혼합물로 마취시키고, 이후 T-11 수준에서 추궁절제술(laminectomy)을 수행하였다. 척수(spinal cord)를 노출시킨 이후에, 이들 동물에 IH 400 Impactor(Precision Systems & Instrumentation, Lexington, KY, USA)를 이용하여 150 kdyne의 척수 타박 손상을 가하였다. 손상후 1시간 시점에, 이들 동물에 개별 단백질의 단일 용량을 주사하였다(표 1 참조). 운동 회복(locomotor recovery)은 타박 손상후 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주와 6주 시점에 Basso-Beattie-Bresnahan 평가 척도(rating scale)로 평가하였다. Basso-Beattie-Bresnahan 평가 척도는 관절 움직임(joint movement)의 뒷다리 기능(hind limb function), 걸음 능력(stepping ability), 공조된 걸음의 섬세한 제어 수준과 몸통 안정성(trunk stability)을 체계적으로 상술하는 21-포인트 척도이다.
| 1 군 | 1000 단위/㎏(10 ㎍/㎏) 재조합 인간 EPO(rhEPO)로 치료된 동물; 대조군 |
| 2 군 | NaCl i.p.로 치료된 동물; 위약 군 |
| 3 군 | 30 ㎍/㎏ rhEPO-Fc로 치료된 동물 |
| 4 군 | 30 ㎍/㎏ 카르바모일화 rhEPO-Fc로 치료된 동물 |
| 5 군 | 30 ㎎/㎏ 메틸프레드니솔론(MPSS)으로 치료된 동물 |
동물은 개활지(open field)에서 노출시키고, 타박 손상후 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주와 6주 시점에 5분간 관찰하였다. 도 1에서는 본 실험에서 획득된 Basso-Beattie-Bresnahan 척도에 관한 수치를 개시한다.
카르바모일화된 rhEPO-Fc(4 군)과 rhEPO-Fc(3 군)의 투여는 대조군(1 군과 2 군)과 비교하여 운동 회복을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 메틸프레드니솔론으로 치료된 동물(5 군)은 대조 동물과 거의 차이가 없었다. 대조 동물은 대략 4주후 안정 상태(steady state)에 도달하고 더 이상의 재생 향상(regenerative improvement)을 보이지 않는 반면, 3 군과 4 군(각각, EPO-Fc 융합 단백질과 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질)의 동물은 6주 회복 기간 동안 지속적이고 현저한 향상을 보인다.
또한, 카르바모일화된 rhEPO-Fc(4 군)의 투여는 특히, 타박 손상 직후에 rhEPO-Fc(3 군)과 비교하여 운동 회복을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 3일 시점에, rhEPO-Fc로 치료된 동물은 1개 관절 또는 2개 관절의 넓은 움직임(각각, Basso-Beattie-Bresnahan 평가 척도에서 수치 2 또는 3)을 보이는 반면, 카르바모일화된 rhEPO-Fc로 치료된 동물은 뒷다리의 최소한 2개 관절의 넓은 움직임과 세 번째 관절의 좁은 움직임, 또는 3개 관절 모두의 넓은 움직임(각각, Basso-Beattie-Bresnahan 평가 척도에서 수치 6 또는 7)을 보였다.
실시예 3: 다발성 경화증(multiple sclerosis)의 생쥐 모형에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 효과 평가
동물 실험에서, 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 진행의 초기, 중기와 후기 단계에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 생체내 효과를 분석하였다. EAE는 설치류, 예를 들면, 생쥐에서 유도될 수 있고, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)과 같은 탈수초성 질환(demyelinating disorder)에 대한 폭넓게 인정되는 동물 모형이다. EAE 생쥐 모형은 MS의 전형적인 재발성(relapsing)과 이완성(remitting) 과정을 모방한다.
본 실험에 이용된 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질은 실시예 1에 개시된 바와 같이 산출되었다.
EAE는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein)(MOG35-55)을 이용한 면역화(immunization)로 11마리 C57BL/6 암컷 생쥐에서 유도하였다(Savino, C. et al. (2006) J Neuroimmunol 172(1-2):27-37). 간단히 말하면, PBS에서 MOG35-55의 4 ㎎/㎖ 용액을 제조하였다. 가열 사멸된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(Difco H37RA)은 8 ㎎/㎖의 농도로 불완전 프레운드 어쥬번트(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)에 현탁시켰다. 현탁액은 MOG35-55 용액으로 유화시켰다. 이후, 각 생쥐에서 100 ㎕의 에멀젼을 피하에 주입하고, 50 ㎕를 한쪽 옆구리에 주입하였다. 최종적으로, PBS에 용해된 250 ng의 백일해(Pertussis) 독소를 각 동물에서 2회: 면역화 직후에 1회와 면역화후 48시간 시점에 1회 정맥내 주입하였다.
EAE 진행의 상이한 단계에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 효과를 분석하기 위하여, EAE 유도된 동물은 검사군(5마리 동물)과 대조군(6마리 동물)으로 분할하였다. 검사군 동물은 50 ㎍/㎏ 체중 용량에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료한 반면, 대조군에는 PBS만 투여하였다. 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질 또는 PBS의 복강내 주사에 의한 투여는 면역화후 18일(초기 치료), 28일(중기 치료) 또는 52일(후기 치료) 시점에 시작하였다. 각 검사군과 대조군은 3개 하위군(subgroup)으로 더욱 분할하였다(표 2 참조). 치료는 30일 동안 수행하고, 동물은 격일로 1회분이 투여되었다.
| 초기 치료 (면역화후 18일 시점에 투여 시작) |
1 군(3마리 동물) | 50 ㎍/㎏ 체중 용량에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료됨; 검사군 |
| 2 군(3마리 동물) | PBS로 치료됨; 대조군 | |
| 중기 치료 (면역화후 28일 시점에 투여 시작) |
3 군(1마리 동물) | 50 ㎍/㎏ 체중 용량에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료됨; 검사군 |
| 4 군(2마리 동물) | PBS로 치료됨; 대조군 | |
| 후기 치료 (면역화후 52일 시점에 투여 시작) |
5 군(1마리 동물) | 50 ㎍/㎏ 체중 용량에서 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료됨; 검사군 |
| 6 군(1마리 동물) | PBS로 치료됨; 대조군 |
동물의 임상적 상태(clinical condition)와 질환 진행을 모니터하였다. 또한, 이들 동물에서 관찰되는 신경학적 결함(neurological deficit)을 표 3에 제시된 등급 체계(grading system)에 따라서, 치료 동안 매일 EAE 스코어로 정량적으로 평가하였다(Buddeberg, B. S. et al. (2004) J Neuroimmunol 153(1-2): 158-70).
| 스코어 | 질병의 임상적 징후 |
| 0 | 임상적 비정상 없음 |
| 0.5 | 부분적인 꼬리 약화 또는 근긴장(muscle tone)의 약간의 상실 |
| 1 | 꼬리 약화 |
| 1.5 | 약간의 어색한 걸음걸이(clumsy gait) |
| 2 | 뒷다리 부전 마비(paresis) |
| 2.5 | 뒷다리 부전 마비와 뒷다리의 부분적인 질질 끌림(dragging) |
| 3 | 뒷다리 마비(paralysis) |
| 3.5 | 뒷다리 마비와 앞다리 부전 마비 |
| 4 | 마비(tetraplegy) |
| 5 | 빈사 또는 폐사 |
도면 2A 내지 2C에서는 이들 동물 실험으로부터 획득된 EAE 스코어를 개시하는데, 여기서 각 도면은 각 군에 이용된 동물의 평균 EAE 스코어를 도시한다.
카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 투여(1, 3과 5 군)는 대조(2, 4와 6 군)와 비교하여 EAE 진행의 초기 단계(도 2A), 중기 단계(도 2B)와 후기 단계(도 2C)에서 재발률(relapse rate)을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 대조 동물의 EAE 스코어는 위아래로 변동하는 반면, 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료된 동물의 경우에 EAE 스코어, 다시 말하면, 질병 강도는 치료 시작 시점에서보다 결코 높지 않는 것으로 관찰되었다.
또한, 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 초기 투여(도 2A)는 개별 대조와 비교할 때, 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 후기 투여(도 2C)보다 EAE 진행에 대한 더욱 유익한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더욱 구체적으로, 투여 시작후 30일 시점에, 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질로 치료된 동물(검사)의 평균 스코어는 65.2% 감소하는 반면, 대조 동물의 평균 스코어는 46.1% 감소한다는 것을 도 2A로부터 확인할 수 있다.
이들 실험으로부터 결과는 EAE 진행에 대한 카르바모일화 EPO-Fc 융합 단백질의 긍정적인 효과를 암시한다.
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<120> ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN
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acaggggaca gagagcccaa atcttgtgac 30
Claims (15)
- 생체내에서 EPO와 비교하여 향상된 생리학적 반감기와 감소된 조혈 활성(hematopoietic activity), 그리고 생체내에서 신경재생 활성(neuroregenerative activity)을 갖는 재조합 EPO 융합 단백질에 있어서, 재조합 EPO 융합 단백질은 인간 IgG 분자의 Fc 부분 및 에리트로포이에틴(EPO) 부분을 포함하고, 여기서 Fc 부분은 자기 N-말단을 통하여 EPO 부분의 C-말단에 직접적으로 연결되고, 상기 융합 단백질은 카르바모일화(carbamoylation)에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 재조합 EPO 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 에리트로포이에틴(EPO) 부분은 인간 에리트로포이에틴 부분인 것을 특징으로 하는 재조합 EPO 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 융합 단백질의 최소한 1개의 리신 잔기와 N-말단 아미노산 중에서 한쪽 또는 양쪽이 카르바모일화되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, Fc 부분은 인간 IgG로부터 유래된 힌지 영역(hinge region), CH2 도메인과 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 융합은 힌지 영역에서 발생하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 청구항 5에 있어서, 2개의 EPO-Fc 융합 단백질 단량체가 서로 연결되어 동종이합체(homodimer)를 형성하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 약물로서 이용되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 인간 IgG 분자의 Fc 부분 및 EPO 부분을 포함하는 카르바모일화된 재조합 EPO-Fc 융합 단백질의 제조 방법에 있어서, 여기서 Fc 부분은 자기 N-말단을 통하여 EPO 부분의 C-말단에 직접적으로 연결되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:- EPO-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 제조하는 단계;- 상기 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;- 상기 DNA 분자에 의해 인코딩된 EPO-Fc 융합 단백질을 발현시키는 단계;- EPO-Fc 융합 단백질을 수집하는 단계;- EPO-Fc 융합 단백질을 정제하는 단계;- 일정량의 시안산염(cyanate)을 일정량의 EPO-Fc 융합 단백질과 반응시킴으로써 EPO-Fc 융합 단백질을 카르바모일화시키는 단계,여기서 상기 융합 단백질의 최소한 1개의 리신 잔기와 N-말단 아미노산 중에서 한쪽 또는 양쪽이 카르바모일화된다.
- 청구항 8에 있어서, 에리트로포이에틴(EPO) 부분은 인간 에리트로포이에틴 부분인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 약물로 이용되는 것을 특징으로 하는 재조합 EPO 융합 단백질.
- 중추신경계(central nervous system, CNS) 또는 말초신경계(peripheral nervous system)의 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물에 있어서, 청구항 1에 따른 융합 단백질 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 이때 상기 질환은 뇌졸중(stroke), 뇌졸중 이외에 CNS에서 허혈 현상(ischemic event), 타박 손상(contusion injury), 척수 손상(spinal cord injury), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 그리고 신경변성 질환(neurodegenerative disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 비경구 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 주사 용액(injection solution)으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 청구항 8에 있어서, EPO-Fc 융합 단백질은 세포 배양 배지의 상층액으로부터 수거되고, 정제된 EPO-Fc 융합 단백질은 세포 배양 배지의 상층액에 존재하는 모든 동족제(isoform)을 포함하고, 카르바모일화는 상기 모든 동족체를 포함하는 정제된 EPO-Fc 융합 단백질을 이용하여 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 11에 있어서, 조성물은 재조합 EPO 융합 단백질을 발현시키는 세포 배양물의 상층액에 존재하는 융합 단백질의 모든 동족체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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