PT95524B - Novos factores poliptidicos com actividade estimuladora de celulas indiferenciadas, processo para a sua preparacao e para a preparacao de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Pensa-se que pequenas quantidades de fac/, tores de crescimento hematopoiético contribuem para a diferenciação de um pequeno número de células indiferenciadas numa variedade de células progenitoras sanguíneas para a tremenda proliferação destas células e para a diferenciação final das células sanguíneas maduras a partir dessas células. 0 sistema regenerador hematopoiético funciona bem sob condições normais. Contudo, sob condições de esforço, por quimioterapia, radiação ou doenças de mielosdisplasia natu ral, resulta um período durante o qual os doentes são gravemente leucopénicos, anémicos ou em que ocorre a trombocitopénia. 0 desenvolvimento e o uso de factores de crescimento hematopoiéticos aceleram a regeneração da medula óssea durante esta fase perigosa.

Em certas doenças induzidas por vírus, tais como a autoimuno-deficiência adquirida (SIDA), estes elementos do sangue, como as células T, podem ser destruídas especificamente.

aumento de produção de células T pode ser a terapêutica destes casos.

Devido aos factores de crescimento hemato poiético estarem presentes em quantidade extremamente pequenas, a detecção e identificação destes factores contaram com uma série de ensaios que rapidamente apenas distinguiram entre os diversos factores com base nos efeitos estimuladores sobre células cultivadas sob condições artificiais.

A aplicação de técnicas de recombinação genética clarificou a compreensão das actividades biológicas dos factores de crescimento individuais. Por exemplo, obtiveram-se as sequências de aminoácidos e de DNA da eritropoietina humana (EPO), que estimula a produção de eritrócitos. (Ver. Lin, patente de invenção norte-amerioana N2 4 703 008 aqui incorporada como referência). Os métodos de recombina ção também se aplicaram ao isolamento cDNA do factor estimu lador de colónias de granulócitos hamanos, G-CSF (Ver, Souza, patente de invenção norte-americana N2 4 810 643, aqui incorporada como referência), e do factor para a estimulação de colónias de granulócitos - macrófagos (GM-CSF) [Lee et al., Proc. Natl. Aoad. Soi. USA, 82, (198§) 4360-4364; Wong et al. , Science, 228, ( 1985), 810-814], murino G - e GM-CSF [Yokota, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 81 (1984), 1070; Fung et al., Nature, 307 (1984), 233; Gough et al., Nature, 309 (1984), 763], e o factor para a estimulação de colónias de macrófagos humanos (CSF-1) [Kawasaki et al., Science, 230 (1985), 291].

sistema de ensaio de células formadoras de colónias com potencial proliferativo alto, testa a acção e factores sobre progenitores hematopoiético jovens [Zont,

J. Exp. Med., 159 (1984), 679-690]. Existem numerosos relatórios na bibliografia sobre os factores que são activos no ensaio HPP-CFC. As origens destes factores estão indicadas no Quadro 1. A maioria dos factores bem caracterizados está descrita em seguida.

Uma actividade em meio condicionado de baço humano foi designada por factor sinérgico (SF). Vários tecidos humanos e linhas de células humanas e murinas produzem um SF, referido como SF-1 , que tem uma acção sinérgica com CSF-1 para estimular as HPP-CFC mais jovens. 0 SF-1 foi referido em meio condicionado por células de baço humanas, células de placenta humanas, células 5637 (uma linha de células de carcinoma de bexiga), e células EMT-6 (uma linha de células de carcinoma mamário do murganho). A identidade de SF-1 foi rapidamente determinada. As descrições iniciais demonstram actividades de sobreposição de interleucina-1 com SF-1 proveniente da linha de células 5637 [Z sebo et al., Blood, 71_, ( 1988) 962-968]. Contudo, outros relatórios demonstraram que a associação de interleucina-1 (IL-1) com CSF-1 não pode estimular a mesma formação de colónias que se pode obter com CSF-1 mais as preparações parcialmente purificadas de meio condicionado por 5637 [McNieee, Blood, 73, (1989) 919].

faotor sinérgico presente no extracto de útero grávido de murganho é o CSF-1. As células WEHI-3 (linha de células leucémicas mielomonocíticas murinas) produz um factor sinérgico que parece ser idêntico a IL-3. Quer o CSF-1 quer o 1L-3 estimulam os progenitores hematopoiéticos que são mais maduros do que o SF-1 alvo.

Demonstrou-se existir outra classe de factor sinérgico em meio condicionado por células TC-1, (células de estroma derivadas da medula óssea). Esta linha de células produz um factor que estimula células mielóides jovens e células linfóides. Foi designado por factor de crescimento hemo linfopolé tico 1 (HLGF-1). Apresenta um peso molecular aparente de 120 000 [McNiece et al., Exp. Hematol1_6( 1 988) , 3833.

No ensaio de HPP-CFC, demonstraram possuir actividade as interleucinas e CSFs reconhecidos, IL-1, IL-3, θ CSF-1. As outras fontes, mencionadas no Quadro 1 e que têm actividade sinérgica não foram estruturalmente identificadas. Com base na sequência polipeptídica e no perfil de actividade biológica, a presente invenção diz respeito a uma molécula que se distingue de IL-1, IL-3, CSF-1 e SF-1.

Quadro 1

Preparações contendo factores activos no ensaio com HPP - CFC

Origem 1

Baço humano CM Baço de nurganho CM

Baço de rato CM

Pulmão de murganho CM

Referência [Kriegler, Blood 60, 503 (1982)] [Bradley, Exp, Hematol. Today

Baum, ed., 285 (1980)] [Bradley, supra, (1980)] [Bradley, supra, (1980)]

Quadro 1 (Cont.) '· -V /-.--^.=23^ ‘b

Origem

Referência

Placenta humana CM [Kriegler, supra, ( 1982)]

Útero de murganho grávido [Bradley, supra (1980)]

GTC-C CM	[Bradley, supra	(1980)]
RH3 CM	[Bradley, supra	(1980)]
PHA PBL	[Bradley, supra	(1980)]
WEHI-3B CM	[McNiece, Cell Biol. Int. Rep. 6, 243(1982)]
EMT-6 CM	[McNiece, Exp. Hamatol., 15, 854	(1987)]
L-Célula CM	[Kriegler, Exp. Hematol., 12, 844	(1984)]
5637 CM	[Stanley, Cell, 45, 667	(1986)]
TC-1 CM	[Song, Blood, 66, 273	(1985)]

CM = meio condicionado.

Quando administradas -por via parenteral as proteínas são rapidamente depuradas da circulação e podem portanto provocar uma actividade farmacológica de vida relativamente curta. Gonsequentemente, as injecçSes frequentes de doses relativamente grandes de proteínas bioactivas podem ser necessárias para manter a eficácia terapêutica. As proteínas modificadas por ligação covalente de polímeros solúveis em água tais como polietilenoglicol, copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol, carboximetilcelu-

lose, desctrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina são conhecidos por exibirem semi-vidas substancialmente mais longas no sangue após injecção endovenosa do que as correspondentes proteínas não modificadas [Abuchowski et al,, In: Enzimes as Drugs Holcenberg et. al., eds. Nova Iorque, NY, Wiley-Interscience (1981) 367-383;

Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4 (1982), 185-189 e Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 1487-1491].

Estas modificações podem também aumentar a solubilidade das proteínas em solução aquosa, eliminar a agregação, reforçar a estabilidade física e química da proteína e reduzir enormemente a sua imunogenicidade e antigenicidade. Como resultado, a actividade biológica in vivo desejada pode alcançar-se mediante a administração menos frequente ou em menores doses destes compostos de adição polimero-proteína do que com as proteínas não modificadas.

A ligação de polietilenoglicol (PEG) a proteínas é particularmente útil porque o PEG tem uma toxicidade muito baixa para os mamíferos [Carpenter et al., Foxicol. Appl. Pharmacol., 18, (1971), 35-40]. Por exemplo um composto de adição de PEG de adenosina-desaminase foi aprovado nos Estados Unidos para uso em seres humanos no tratamento da síndrome de imunodeficiência combinada grave. Uma segunda vantagem oferecida pela conjugação de PEG é que reduz eficazmente a imunogenicidade e a antigenicidade de proteínas heterólogas. Por exemplo, um produto de adição de PEG com uma proteína humana

- 8 ^;'V.

^'atirías pode ser útil para o tratamento de doenças noutras espécies de mamíferos sem risco de provocar uma resposta imunológioa grave.

Os polímeros, tais como o PEG, podem ser convenientemente ligados a um ou mais resíduos de aminoácidos reactivos numa proteína, tal como o grupo alfa-amino do aminoácido amino-terminal, os grupos epsilon-amino de cadeias late rais de lisina, grupos sulfidrilo de cadeias laterais de cisteína, grupos carboxilo de cadeias laterais aspartilo e glutanilo, o grupo alfa-carboxilo do aminoácido carboxilo-terminal, cadeias laterais de tirosina, ou a derivados activados de cadeias de glicosilo ligadas a certos resíduos de aspa ragina, serina ou de treonina.

Têm sido descritas numerosas formas activadas de PEG apropriado para reacção directa com proteínas.

Os reagentes de PEG utilizáveis para reacção com grupos amino das proteínas incluem os ésteres activos de ácido carboxílico ou os derivados de carbonatos, particularmente aquelas em que os grupos removíveis são N-hidroxi-succinimida, p-nitrofenol, imidazol ou 1-hidroxi-2-nitrobenzeno-4-sulfonato. Os derivados de PEG que contêm grupos maleímido ou halogenoacetilo que são reagentes úteis para a modificação dos grupos sulfidrilo livres, da proteína. Do mesmo modo, reagentes de PEG contendo grupos amino, hidrazina ou hidrazida são úteis para a reacção com aldeídos gerados por oxidação com periodato dos grupos hidrato de carbono das proteínas.

Constitui um objectivo da presente invenção proporcionr um factor que cause o crescimento de células progenitoras hematopoiéticas jovens.

Resumo da Invenção

De acordo com a presente invenção proporcionam-se novos factores, referidos como factores de células indiferenciadas (SCF) que têm a capacidade para estimular o crescimento de progenitores primitivos incluindo células progenitoras hematopoiéticas jovens. Estes SCFs também são aptos a estimular células indiferenciadas não hematopoiéticas tais como as células indiferenciadas neurais, e células indiferenciadas de germe essenciais. Estes factores incluem os factores de células indiferenciadas que ocorrem naturalmente purificadas. A presente invenção também se refere a polipéptidos não naturais contendo sequências de aminoácidos suficientemente duplicadas do factor de células indiferenciadas de ocorrência natural, para permitir que possuam actividade bio lógica hematopoiética de factor de células indiferenciadas naturais.

A presente invenção também proporciona sequências de DNA isoladas para a utilização na expressão segura em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas de produtos polipeptídicos tendo sequências de aminoácidos suficientemente duplicativas do factor de células indiferen ciadas naturais para permitir que possuam actividade biológica hematopoiética de factor de células indiferenciadas de ocorrência natural. Estas sequências de DNA incluem:

(a) sequências de DNA indicadas nas figuras

14B, 14C, 15B, 15C, 42 e 44 ou as suas cadeias complementares;

(b) sequências de DNA que se hibridam com as sequências de DNA definidas em (a) ou com os seus fragmentos; e (c) sequências de DNA que se hibridarão com as sequências de DNA definidas nas alíneas (a) e (b) excepto para a degenerescência do código genético.

Também se proporcionam vectores contendo estas sequências de DNA e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com esses vectores. Ainda compreende a presente invenção os métodos para a produção de S,GF por técnicas de recombinação e métodos de tratamento das doenças. Adicional mente, proporcionam-se composições farmacêuticas que contêm SCF e anticorpos de ligação específica com SCF.

A presente invenção também se refere a um processo para a recolha eficiente de factor de células indiferenciadas, a partir de material contendo SCF, processo que compreende os passos de separação por cromatografia de permuta iónica e/ou por cromatografia líquida de fase inversa.

1 ί!

A presente invenção também se refere a um produto de adição biologicamente activos tenso semi-vida prolongada in vivo e potência reforçada em mamíferos, constituída por um conjugado covalente de SCF com um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol, contendo o referido polímero eventualmente, como substituinte um grupo alquilo numa das suas extremidades. Outro aspecto da presente invenção consiste num processo para a preparação do produto de adição citado anteriormente, mediante reacção de SCF com um polímero solúvel na água contendo pelo menos um grupo reactivo terminal e purificação do produto de adição resultante para se obter um produto com semi-vida de circulação prolongada e acti vidade biológica reforçada.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 representa um cromatograma de permuta aniónica da purificação de SCF de mamífero.

Figura 2 representa um cromatograma de filtração por gel da purificação de SCF de mamífero.

Figura 3 representa um cromatograma de purificação por agarose-aglutinina de germe de trigo de SCF de mamífero .

Figura 4 representa um cromatograma de permuta catiónica da purificação de SCF de mamífero.

Figura 5 representa um cromatograma em da purificação de SCF de mamífero.

Figura 6 representa a electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de fracções de coluna da Figura 5.

Figura 7 representa um cromatograma C^ analítico de SCF de mamífero.

Figura 8 representa fracções de coluna C^ de SDS-PAGE da Figura 7.

Figura 9 mostra SDS-PAGE de SCF purificado e de SCF de mamí fero desglicosilado.

Figura 10 representa o cromatograma analítico de SCF de mamífero purificado.

Figura 11 mostra a sequência de aminoácidos de SCF de mamífero derivado da sequenciação da proteína.

Figura 12 apresenta;

A. oligonucleótidos de cDNA de SCF de rato

B. oligonucleótidos de DNA de SCF humano

C. oligonucleótidos universais.

Figura 13 representa:

A. um esquema de amplificação da reacção da cadeia de polimerase de cDNA de SCF de rato.

B. um esquema para amplificação de PCR de cDNA humano.

Figura 14 representa:

A. a estratégia de sequenciação para DNA genómico de rato.

B. sequência de ácido nucleico de DNA genómico de rato.

C. sequência de ácido nucleico de cDNA de SCF de rato e a sequência de aminoácidos de proteína de SCF de rato.

Figura 15 representa:

A. a estratégia para a sequênciação de DNA genó mico humano

B. sequência de ácido nucleico de DNA genómico humano

C. sequência de ácido nucleico composto de cDNA de SCF humano e sequência de aminoácidos de proteína de SCF.

Figura 16 representa as sequências de aminoácidos alinhadas de proteína de SCF humano, de macaco, cão, murganho e rato.

Figura 17 representa a estrutura do vector de expressão em células de mamífero V1Ç.8 SCF.

Figura 18 representa a estrutura do vector de expressão

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura de células CHO de mamífero, pDSVE. 1.

representa a estrutura do vector de expressão de E. ooli pCFM1156.

representa:

A. um ensaio radioimunológico de SCF de mamífero

B. SDS-PAGE de SCF de mamífero de precipitado-imune.

representa a análise de western de SCF humano recombinante.

representa a análise western de SCF recombinante de rato.

representa um gráfico de barras mostrando o efeito de SCF de rato recombinante produzido em células COS-1 na transplantação de medula óssea.

mostra o efeito de SCF recombinante de rato sobre a cura da anemia macrocítica de murganhos Steel.

representa a contagem dos glóbulos brancos do sangue periférico (WBC) de murganhos Steel tratados com SCF recombinante de rato.

mostra a contagem de plaquetas de murganhos Steel tratados com SCF murino recombinante.

Figura 27 mostra as contagens de glóbulos brancos diferen15

ciais de - murganhos Steel tratados com SCF^ PEG 25 recombinante de rato.

Figura mostra os subconjuntos de linfócitos de murganhos tratados com

SCF

1-164 murino recombinante-PEG-25.

Figura

Figura

Figura

Figura representa o efeito de SCF de sequência humana recombinante e tratamento de primatas normais para aumentar o número de leucócitos periféricos.

representa o efeito de SCF de sequência humana y recombinante no tratamento de primatas normais para aumentar o número de hematócrifeos e o número de plaquetas.

apresenta as fotografias de:

A. colónias da medula óssea humana estimuladas com

SCF. .humano recombinante, 1-162

B. células com coloração Wright-Giensa de coió nias da Figura 31 A.

representa fracções da coluna de S-sefarose de

SDS,PAGE provenientes do cromatograma representado na Figura 33

A. com agente redutor

B. sem agente redutor.

Figura 33 representa o cromatograma de uma coluna de S-sefarose de SCF humano recombinante derivado de E. coli.

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura representa fracções de uma coluna de SDS-PAGE do cromatograma representado na Figura 35.

A. com agente redutor

B. sem agente redutor.

representa um cromatograma de uma coluna de

SCF humano recombinante derivado de E, coli.

representa um cromatograma de uma coluna de Q-sefarose de SCF murino recombinante derivado de células CHO.

representa um cromatograma de uma coluna de

SCF murino recombinante derivado de células CHO.

apresenta SDS-PAGE de fracções de coluna C^ de cromatograma representado na Figura 3739 apresenta SDS-PAGE de SCF murino recombinante derivado de CHO purificado antes e após a desglicosilação.

representa:

A. cromatografia de filtração por gel de uma mis tura reaccional de peg-SCF^ murino recombinànte';-'.

B. cromatografia de filtração por gel de SCF^^g^ murino recombinante, não modificado.

Figura 41 apresenta SCF marcado ligado a plastómeros leucé micos recentes.

Figura 42 mostra a sequência de cDNA de SCF humano obtido de uma linha de células de fibrossarcoma HT 1080.

Figura 43 mostra uma auto-radiografia de células COS-7 que exprimem SCF_{1 2}^g humano e células CHO que exprimem SCF^ humano.

Figura 44 mostra a sequência de cDNA de SCF humano obtida a partir de uma linha de células de carcinoma de bexiga 5637.

Figura 45 mostra a sobrevivência acrescida de murganhos irra diados após tratamento com SCF.

Figura 46 mostra a sobrevivência acrescida de murganhos irra diados após transplantação de medula óssea com 5$ de um fémur e tratamento com SCF.

Figura 47 mostra a sobrevivência aumentada de murganhos irra diados após transplantação de medula óssea com 0,1 e 20 ? de um fémur e tratamento com SCF.

Numerosos aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes para os especialistas na matéria, a partir da descrição pormenorizada seguinte, que proporciona aspectos práticos desta invenção nos seus aspectos actualmente preferidos.

Descrição pormenorizada da invenção

De acordo com a presente invenção proporcionam-se novos factores de células indiferenciadas e sequên cias de DNA que codificam para a totalidade ou parte desses

SCFs. A designação factor de células indiferenciadas ou SCF é utilizada aqui para referir SCF de ocorrência natural, (por exemplo SCF humano natural), assim como polipép tidos de ocorrência não natural (isto é, diferente da ocorrência natural), apresentando as sequências de aminoácidos e glicosilação suficientemente duplicativa do factor de células indiferenciadas naturais para permitir a presença de acti vidade biológica hematopoiética do factor de células indiferenciadas de ocorrência natural. 0 factor de células indife_ renciadas tem capacidade para estimular o crescimento de progenitoras hematopoiéticas precoces que são capazes de maturação para células eritróides, megacariócitos, granulócitos linfócitos e macrófagos. Tratamento com SCF de mamíferos resultando de um aumento absoluto de células hematopoiéticas das linhagens mielóide e linfóide. Uma das características de autenticidade das células indiferenciadas é a sua capacidade para se diferenciarem em células mielóides e linfóides [Weissman, Science, 241 (1988) 58-62]. 0 tratamento de murganhos Steel (Exemplo 8 B) com SCF murino recombinante origina o aumento de granulócitos, monócitos, eritrócitos , linfócitos e plaquetas. 0 tratamento de primatas normais com SCF humano recombinante origina o aumento de células mie lóides e linfóides, (Exemplo 80.

Existe expressão embrionária de SCF por células no precurso migratório e sítios de residência de mela noblastos, células de germe, células hematopoiéticas, célu las cerebrais e da medula espinal.

As células progenitoras hematopoiéticas precoces estão enriquecidas na medula óssea de mamíferos tratados com 5-Fluorouracilo (5-FU). 0 fármaco quimioterapêutico 5-FU depleta selectivamente as progenitoras hematopoi. éticas tardias. 0 SCF é activo em pós-5-FU da medula óssea.

A actividade biológica e o comportamento de distribuição tecidular de SCF demonstra o seu papel central na embriogénese e na hematopoiese, assim como a sua capa cidade para o tratamento de diversas deficiências de células indiferenciadas.

A presente invenção proporciona sequências de DNA que incluem: a incorporação de codões preferidos para a expressão por hospedeiros não mamíferos selecçionados; para cisão por enzimas endonucleases de restrição; e a provisão de outras sequências de DNA iniciais, terminais ou intermédias que facilitam a construção de vectores facil mente expressos.

A presente invenção também proporciona sequências de DNA que codificam para análogos ou derivados polipeptídicos de SCF que diferem das formas naturais quanto à identidade e localização de um ou mais resíduos de aminoácidos (isto é, análogos de delecção que não contêm a tota lidade dos resíduos especificados para SCF; análogos de substituição, em que um ou mais resíduos especificados estão substituídos por outros; e ainda análogos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é adicionado a uma porção terminal ou média do polipéptido e que partilha algumas ou todas as propriedades das formas de ocorrência natural. A presente invenção proporciona espeeificamente sequências de DNA que codificam o comprimento total da sequência de aminoácidos não processada, assim como as sequências de DNA que codificam a forma processada de SCF.

As novas sequências de DNA, desta invenção incluem as sequências que são úteis na expressão segura em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas de pro. dutos polipeptídicos contendo pelo menos uma parte da conformação estrutural inicial e uma ou mais das propriedades biológicas de SCF natural. As sequências de DNA desta inven ção contêm espeeificamente: (a) sequências de DNA indicadas nas Figuras 14B, 14C, 15B, 15C, 42 e 44 ou as suas cadeias complementares; (b) sequências de DNA que hibridam, (sob condições de hibridação descritas no Exemplo 3 ou sob condi ções mais restritas) com as sequências de DNA . representadas nas Figuras 14B, 14C, 15B, 15C, 42 e 44 ou com os seus frag mentos e (c) sequências de DNA que, com excepção da degenerescência do código genético, hibridam com as sequências de DNA representadas nas Figuras 14B, 14C, 15B, 15C, 42 e 44. Espeeificamente compreendidas em (b) e (c) estão as sequências de DNA genómicas que codificam formas de varian21tes alélicas de SCF e/ou que codificam SCF de outras espécies de mamífero e constroem sequências de DNA que codificam SCF, fragmentso de SCF e análogos de SCF. As sequências de DNA podem incorporar codões que facilitam a transcrição e a tradução de RNA mensageiro nos hospedeiros microbianos. Estas sequências de construção podem ser facilmente construí das de acordo com os métodos de Alton et al., pedido de patente de inven ção PCT publicado WO 83/04053De acordo com outro aspecto da presente invenção as sequências de DNA descritas aqui, que codificam polipéptidos apresentando actividade de SCF, são válidas para a infor mação que proporcionam no que se refere à sequência de aminoácidos da proteína de mamífero que até agora não tinha sido disponibilizada. As sequências de DNA são também válidas como produtos úteis para efectuarem a síntese em grande escala de SCF mediante uma variedade de técnicas de recombinação. Dito de um outro modo, as sequências de DNA proporcionadas pela presente invenção são úteis para gerarem novos e úteis vectores de DNA plasmídicos virais circulares, novas e úteis células hospedeiras eucarióticas e procarióticas trans formadas e transfectadas (incluindo células bacterianas e de leveduras e células de mamífero desenvolvidas em cultura) e novos e úteis métodos para o crescimento em cultura destas células hospedeiras capazes de expressão de SCF e dos seus produtos relacionados.

As sequências de DNA desta invenção são

também materiais apropriados para uso como sondas marcadas no isolamento de DNA genómico humano que codifica para SCF e para outros genes de proteínas relacionadas, assim como para cDNA e sequências de DNA genómicas e outras espécies de mamí feros. As sequências de DNA podem ainda ser úteis em vários métodos alternativos de síntese de proteínas (por exemplo em células de insectos) ou para a terapêutica genética em seres humanos ou em outros mamíferos. Espera-se que as sequências de DNA desta invenção sejam úteis no desenvolvimento de espécies de mamíferos transgénicas que possam servir como hospedeiras” eucarióticas para a produção de SCF- e de produtos de SCF em quantidade. Ver, na generalidade, Palmiter et al., Science, 222 (1983), 809-814.

A presente invenção proporciona SCF de ocorrência natural isolado e purificado (istoé, purificado a partir do natural ou do construído, de tal forma que a con formação primária, secundária e terciária e o esquema de glicosilação são idênticos ao material de ocorrência natural), assim como polipêptidos não naturais contendo a conformação estrutural primária (isto é, sequências contínuas de resíduos de aminoácidos) e glicosilação suficientemente duplicativa do factor de células indiferenciadas de ocorrência natural, de forma a permitir a posse de uma actividade biológica hematopoiética de SCF natural. Estes polipêptidos incluem derivados e análogos.

Num aspecto preferido, o SCF é caracteri-23zado por ser um produto de expressão de hospedeira procariótica ou eucariótica (por exemplo, por células de bactérias de leveduras, de plantas superiores, de insectos, de mamífe. ro em cultura), de sequência de DNA exógeno obtidas por clona gem genómica ou de cDNA ou por síntese genética. Isto é, num aspecto preferido, o SCF é o SCF recombinante. Os produtos de expressão na levedura habitual (por exemplo, Saocharomyces cerevisiae) ou em células hospedeiras procarió ticas (por exemplo de E. ooli são isentos de associação com quaisquer proteínas de mamíferos. Os produtos de expressão em vertebrados [por exemplo, em mamíferos não humanos, (por exemplo, em células COS ou CHO) ou de ases] são isentos da associação com quaisquer proteínas humanas. Dependendo do hospedeiro utilizado, os polipéptidos da presente invenção podem não ser glicosilados ou serem glicosilados eom hidratos de carbono de mamíferos ou de outros eucariotas. A célula hospedeira pode ser alterada mediante a aplicação de técnicas como as que estão descritas em Lee et al., J. Biol. Chem.,

264, (1989), 13848, aqui incorporado como referência. Os poli, péptidos desta invenção podem também incluir um resíduo de aminoácido metionina inicial (na posição-1).

Adicionalmente às formas alélicas de ocor rência natural de SCF, a presente invenção também abrange outros produtos de SCF, tais como análogos polipeptídicos de SCF. Estes análogos incluem os fragmentos de SCF. Aplicando os processos do pedido de patente de invenção publicado,

citado anteriormente, de Alton et al., (WO 83/04053), podem facilmente conceber-se e preparar-se genes que codificam para a expressão microbiana de polipéptidos que apresentam confor mações primárias que diferem das especificadas aqui em termos de identidade e localização de um ou mais resíduos, (por exemplo substituições, adições terminais e intermédias e delecções). Alternativamente, modificações de cDNA e genes genómicos podem ser facilmente realizados mediante técnicas bem conhecidas de mutagénese de sítio dirigido e utilizadas para gerar análogos e derivados de SCF. Estes produtos compartilham pelo menos uma das propriedades biológicas de SCF mas podem diferir em outras.

Por exemplo, os produtos desta invenção incluem aqueles que são obtidos, por exemplo, por delecções; ou aqueles que são mais estáveis à hidrólise (e que, portanto podem ter efeitos mais acentuados e de maior duração do que os produtos de ocorrência natural); os que foram alterados por delecção ou adição de um ou mais sítios potenciais para 0-glicosilação e/ou N-glicosilação ou que têm um ou mais resíduos de cisteína delectados ou substituídos por, por exemplo, resíduos de alanina ou de serina e que são potencialmente mais facilmente isolados sob a forma activa a partir dos sistemas microbianos; ou que comporta um ou mais resíduos de tirosina substituídos por fenilalanina e que se ligam mais ou menos facilmente a proteínas alvo ou a receptores de células alvo. Também são abrangidos os fragmentos

polipeptídicos que duplicam apenas uma parte da sequência de aminoácidos contínua ou as conformações secundárias de SCF, cujos fragmentos podem possuir uma propriedade de SCF (por exemplo, ligação com o receptor) e não outras (por exemplo, actividade de crescimento de células hematopoiéticas jovens). Deve notar-se que a actividade não é necessária para que qual quer um ou mais dos produtos desta invenção apresentem utili dade terapêutica [ver Weiland et al., Blut, 44, ( 1982), 173-175] ou utilidade em outros contextos, como sejam os ensaios do antagonismo de SCF. Antagonistas competitivos podem ser totalmente úteis em, por exemplo, casos de sobreprodução de SCF ou casos de leucemias humanas em que as células malignas sobre-exprimem receptores de SCF, como indicado pela sobreexpressão de receptores de SCF nas blastómeros leucémicos (Exemplo 13).

São aplicáveis aos análogos polipeptídicos desta invenção as referências à propriedade imunológica de pep tidos sintéticos que substancialmente duplicam a sequência de aminoácidos existente nas proteínas, glicoproteínas e nucleoproteínas de ocorrência natural. Mais especifioamente, demons. trou-se que os polipéptidos de peso molecular relativamente baixo participam em reacções imunológicas que são similares em duração e extensão às reacções imunológicas de proteínas fisiologicamente significativas como os antigénes virais, as hormonas polipeptidioas e outras. Incluídas nas reacções imuno

lógicas destes polipéptidos está a provocação para a formação de anticorpos específicos em animais com actividade imunológica. [Lerner et al., Cell, 23, (1981), 309-310; Ross et al., Nature, 294 (1981) 654-656; Walter et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 77 (1980) 5197-5200; Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, (1981) 3403-3407; Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, (1981) 4882-4886;

Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, (1982) 5322-5326; Baron et al, Cell, 28, (1982), 395-404; Dressman et al., Nature, 295 (1982) 185-160; e Lerner, Scientific American, 248 (1983) 66-74]. Consultar também, Kaiser et al. , Science, 223, (1984), 249-255 relativamente às propriedades biológicas e imunológicas de péptidos sintéticos que aproximadamente compartilham estruturas secundárias de hormonas peptidicas mas que podem não compartilhar a sua conformação estrutural primária.

A presente invenção também inclui a classe de polipéptidos codificados por fracções do DNA complementar à cadeia que codifica a proteína de sequências de cDNA humans ou de DNA genómico de SCF, isto é, proteínas de complementa ridade invertida, tal como é descrito por Tramontano et al., Nucleic Acid Res., V2 (1984) 5049-5059.1

Os polipéptidos de SCF representativos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, ^scf1_148’ ^SCF1-162’ ^SCF1-164’ ^SCF1-165-’ ^{e SCF}1-183 ^na

Figura 15C; SCF^gg, SCF^gg, e SCF^^ e SCF^^g

na Figura 42; e SCF.^^, SCF^^q, na Figura 44.

^SCF1-161 e scf,_₂₂₀

Pode purificar-se SCF mediante técnicas conhecidas. A presente invenção compreende um método para a purificação de SCF a partir de um material que contém SCF, tal como meio condicionado ou urina e soro humanos, consistindo este método em um ou mais passos tais como os seguintes: submete-se o material contendo SCF a cromatografia de permuta iónica (cromatografia de permuta catiónica ou cromato grafia de permuta aniónica); submetendo-se o material que contém SCF a separação cromatografica líquida de fase inversa incluindo, por exemplo, uma resina imobilizada ou Cg;

submete-se o líquido a cromatografia de lecitina imobilizada, isto é, ligação de SCF a lecitina imobilizada e elui-se medi, ante a utilização de um açúcar que contribui para esta ligação. Os pormenores da aplicação destes métodos tornam-se evi dentes a partir das descrições apresentadas nos Exemplos 1, e 11 para a purificação de SCF. As técnicas descritas no Exemplo 2 de Lai et al., na patente de invenção norte-americana 4 667 016, aqui incorporada como referência, também são úteis para a purificação do factor de células indiferenciadas .

As isoformas de SCF isolam-se mediante apli oação de técnicas convencionais, tais como as que estão indicadas na patente de invenção norte-americana série N2 421 444

- 28 intitulada Crythropoietin Isoforms, de propriedade comum, requerida a 13 de Outubro de 1989, e aqui incorporada como referência.

Também a presente invenção abrange composições farmacêuticas que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista terapêutico de produtos polipeptídicos desta invenção juntamente com diluentes, agentes conservantes,solu bilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos apropriados úteis na terapêutica com SCF. A expressão quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico usa-se aqui para referir uma quantidade que proporciona um efeito terapêutico para uma dada doença e com uma dada posologia. Estas composições são líquidas ou liofilizadas ou composições secas de outro modo e incluem agentes diluentes ou tampão de pH e força iónica diversos (por exemplo, Tris-HCL, acetato, fosfato), e aditivos como a albremina ou a gelatina para impedir a absorção nas superfícies, agentes tensioactivos (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de áci dos biliares), agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, polietilenoglicol), agentes anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), agentes conservantes (por exemplo, Thimerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de carga ou modificadoras da tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), a ligação covalente de polí_ meros, tais como o polietilenoglicol; às proteínas (descrito no Exemplo 22 seguinte), agentes de complexação com iões me tálicos, ou incorporação do material em preparações de partículas de compostos poliméricos, tais como o ácido poliláctioo, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., ou a lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilanelares ou multilamelares, simulações de eritrócitos ou esferoplastos.

Estas composições influenciam o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo de SCF. A escolha da composição dependerá das propriedades físicas e químicas da proteína que tem actividade de SCF. Por exemplo, um produto derivado de uma forma ligada à membrana de SCF pode requerer uma composição contendo detergente. Composições de libertação controlada ou prolongada incluem a formulação em depósitos lipófilicos (por gxemplo, ácidos gordos, ceras ou óleos). Também são abrangidas pela presente invenção as composições em partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxâmeros ou poloxa minas) e SCF acoplados a anticorpos .dirigidos contra receptores específicos dos tecidos, ligandos ou antigenes ou acoplados a ligandos de receptores específicos dos tecidos. Outros aspectos das composições desta invenção incluem formas em partículas, revestimentos de protecção, inibidores de protease ou reforçadores da infiltração para diversas vias de administração, incluindo as vias parenteral, pulmonar, nasal e oral.

A presente invenção também abrange compo- 30 sições que incluem um cu.mais de outros factores hematopoiéticos como EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,

IL—11 , IGF-I ou LIF (factor de inibição leucémieo).

Os polipéptidos desta invenção podem ser marcados por associação com uma substância marcadora detectavel (por exemplo, um radiomarcador de I ou biotimilado) para proporcionar reagentes utilizáveis para a detecção e quantificação de SCF ou células que contêm os seus receptores em tecidos sólidos e amostras líquidas, tais como o sangue e a urina.

SCF biotinilado é utilizável em con junção com estreptavidina imobilizada para remover blastos leucémicos da medula óssea em transplantes da medula óssea autólogos. 0 SCF biotimilado é utilizável conjuntamente com estreptavidina imobilizada para o enriquecimento de células indiferenciadas nas células indiferenciadas alogénicas ou au tólogas em transplantações de medula óssea alogénica ou autóloga. Os conjugados de tóxina de SCF, tal como a ricina [Uhr, Prog. Clin. Biol. Res. 288 (1989) 403-412], toxina diftérica [Moolten, J. Natl. Cono. Inst., 55 (1975), 473-477], θ de radioisótopos são utilizáveis para orientar a terapêutica anti-neoplásica (Exemplo 13) ou como um regime de condicionamento para a transplantação da medula óssea.

Os produtos de ácido nucleico desta in venção são úteis quando marcados com marcadores detectáveis (tais como os radiomarcadores e marcadores não isótopos como a biotina) e utilizados nos processos de hibridação para localizar a posição do gene de SCF humano e/ou a posição de qualquer família genética relacionada num mapa cromossómico. São também úteis para identificar as doenças genéticas de SCF humano ao nível de DNA e usados como marcadores para a identi_ ficação de genes próximos e suas doenças. 0 gene de SCF humano é codificado no cromossoma 12 e o gene de SCF murino mapeia para o cromossoma 10 no locus S1.

SCF é útil, sozinho ou em associação com outra terapêutica, para o tratamento de certas doenças hematopoiéticas. Pode utilizar-se SCF sozinho ou com um ou mais outros factores hematopoiéticos, tais como EPO, G-CSF GM-CSF, CFS-1, IL-1 , IL-2, IL-3, 11-4, 11-5, IL-6,

IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-1, IGF-I ou LIF para o tratamento de doenças hematopoiéticas.

Existe um grupo de doenças das células indiferenciadas que.é caracterizado pela redução da massa medular funcional devido a dano tóxico, de radiação ou imunológico e que pode ser tratável com SCF. A anemia aplásica é uma doença da célula indiferenciada em que existe uma substituição gorda do tecido hematopoiético e pancitopenia.

SCF aumenta a proliferação hematopoiética e é útil no tratamento da anemia aplásica (Exemplo 8B). Como animal de experiência é utilizado o murganho Steel para a anemia aplá sica humana [Jones, Exp. Hematol·., 11 (1983), 571-580]. Têm sido obtidos resultados promissores mediante a utilização de uma citocina relacionada, GM-CSF no tratamento da anemia aplásica, [Antin, et al., Blood, 70, (1987) 129a]. A hemoglobinúria noturna paroxismica (PNH) é uma doença da célula indiferenciada, caracterizada pela formação de plaque tas defeituosas e de ganulócitos defeituosos, assim como de eritrócitos anormais.

Existem muitas doenças que são tratáveis com SCF. Estas incluem as seguintes: mielofibrose, mie loesclerose, osteopetrose, carcinoma metastásico, leucemia aguda, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma, doença de Gaucher, doença de Niemann-Pick, doença de Letterer-Siwe, anemia eritroblástica refractária, sindrome de Di-Guglielmo, esplenomegalia congestiva, Kala azar, sarcoidose, pancitopenia esplénica primária, tuberculose miliar, doença por fungos disseminada, septicemia fulminante, malária, carência de vitamina B₁₂ e de ácido fólico, carên cia de piridóxina, anemia de Diamond Blackfan, doenças de hipopigmentação tais como vitiligem ou vitiligo. As proprie dades estimuladoras de SCF sobre os eritróides, megacariócitos e granulócitos estão ilustradas nos Exemplos 8B e 8C.

aumento de crescimento de células indiferenciadas não hematopoiéticas, tais como as células de germe iniciais, melanócitos derivados da cristã neural,dos axónios comissurais originados da medula espinal, as células de cripta do intestino, os túbulos renais mesonéfrieo.s ou

metanéfricos e os bolbos olfactivos, é benéfico nas doenças em que ocorrem dano dos tecidos específicos destes sítios.

SCF é útil no tratamento do dano neurológico e constitui um factor de crescimento para as células nervosas. 0 SCF é útil durante os processos de fertilização in vitro ou no tratamento da infertilidade. 0 SCF é útil para o tratamento do mal intestinal resultante da irradiação ou da quimioterapia.

Há doenças mieloproliferativas da célula indiferenciada, tal como a policitemia' vera, a leucemia mielógena crónica, a mataplasia mieloide, a trombocitemia primária e as leucemias agudas que são tratáveis com SCF, anticorpos anti-SCF ou conjugados de toxina com SCF.

Existem numerosos casos que documentam a proliferação acrescida de células leucémicas devido a fac_ tores de crescimento da célula hematopoiética G-CSF, GM-CSF e IL-3 [Delwel et al., Blood, 72 (1988) ig44-ig4g]. Dado que o sucesso de muitos fármacos quimioterapêuticos depende do facto de as células neoplásicas terem ciclo mais activo do que as células normais, o SCF sozinho ou em associa ção com outros factores actua como um factor de crescimento para as células neoplásicas e sensibiliza-as para os efeitos tóxicos dos fármacos quimioterapêuticos. A sobreexpressâo de receptores de SCF nos blastos leucémicos está descrita no Exemplo 13·

Vários factores hematopoiéticos recombinante estão a ser investigados relativamente à sua capacidade para encontrarem o nadir leucocitário resultante dos regimes de quimioterapia e de irradiação. Embora estes fac_ tores sejam muito úteis neste conjunto, existe um compartimento hematopoiético jovem que é danificado, especialmente pela radiação, e que deve ser repovoado antes de estes factores de crescimento que actuam posteriormente poderem exercer a sua acção óptima. 0 uso de SCF sozinho ou em associação com este factor abrevia ou elimina posteriormente o nadir dos leucócitos e das plaquetas resultantes da quimioterapia ou do tratamento por radiação. Além disso, o SCF permite uma intensificação da dose da posologia antineoplásica ou da irradiação (Exemplo 19).

SCF é útil para a expansão das proge nitoras hematopoiétieas jovens na transplantação singeneica, alogeneica ou autóloga da medula óssea. Demonstrou-se que o uso de factores de crescimento hematopoiético diminui o tempo / de recuperação de neutrófilos após o transplante [Donahue et al., Nature, 321, (1986) 872-875 e Welte et al., J. Exp.Med., 165 (1987) 941-948]. Para a transplantação da medula óssea, são utilizados sozinhos ou em associação os três cenários seguintes: um dador é tratado apenas com SCF ou em associa ção com outros factores hematopoiéticos antes da aspiração da medula óssea ou da leucoforese de sangue periférico

- 35 para aumentar o número de células disponíveis para a transplantação; a medula óssea é tratada in vitro para activar ou expandir o número de células antes da transplantação; finalmente, o receptor é tratado para reforçar o enxerto da medula do dador.

SCF é útil para reforçar a eficiência da terapêutica genética baseada na transfecção (ou na infecção com um vector retroviral) das células indiferencia das hematopoiéticas. 0 SCF permite a cultura e multiplicação das células progenitoras hematopoiéticas jovens que devem ser transfectadas. Pode realizar-se a cultura apenas com SCF ou em associação com IL-6 , IL-3 ou ambas. Uma vez transfectadas, estas células são depois perfundidas num transplante de medula óssea nos doentes que sofrem de doen ças genéticas. [Lim, Proc. Natl. Acad. Sei., 86 (1989) 8892-8896]. Os Exemplos de genes que são úteis para o tratamento de doenças genéticas incluem a adenosina desaminase, glucocerebrosidase, hemoglobina e fibrose cística.

SCF é útil para 0 tratamento da imunodeficiência adquirida (SIDA) ou estados de imunodeficiência associados graves (SCID) sozinho ou em associação com outros factores como a IL-7 (ver o Exemplo 14). É ilustrativo deste efeito a capacidade da terapêutica com SCF para aumentar 0 grau absoluto de linfócitos auxiliares T circulantes (CDj| + OKTjj +). Estas células são o alvo celular prin cipal do vírus de imunodeficiência humana (HIV) que conduz à

- 36 doença de imunodeficiência nos doentes com SIDA [Montagnier, in Human T-Cell Leukemia/Lynphoma Virus, ed. R.C. Gallo, Nova Iorque, Cold Spring Harbor, 1984, pp. 369-379]· Além disso,o SCF é útil para combater os efeitos mielossupressores dos fármacos anti-HIV, tal como o AZT [Gogu, Life Sciences, 45 NQ 4 (1989)].

SCF é útil para aumentar a recuperação hematopoiética após a perda de sangue aguda.

tratamento in vivo com SCF é útil oomo um inoitivador para o sistema imunológico lutar contra a neoplasia (cancro). Um exemplo da utilidade terapêutica do reforço directo da função imunológica por uma citocina clonada recentemente (IL-2) está descrita por Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. , 313 (1987) 1485.

A administração de SCF com outros agen tes tais como um ou mais outros factores hematopoiéticos,é feita em tempos diferentes ou ao mesmo tempo. 0 tratamento prévio com SCF aumenta uma população progenitora que responde aos factores hematopoiéticos que actuam terminalmente, tais como G-CSF ou EPO. A via de administração pode ser a endovenosa, a intraperitoneal subcutânea ou intramuscular .

A presente invenção também se refere a anticorpos que se ligam especificamente ao factor de células indiferenciadas.

0 Exemplo 7 seguinte descreve a produção de anticorpos policlonais. Constituem um outro aspecto da presente invenção os anticorpos monoclonais específicos ligados a SCF (ver Exemplo 20). Em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopes), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigéneo. Os anticorpos monoclonais são úteis para melhorar a selectividade e especificidade de métodos de ensaio analítico e de diagnóstico que utilizam a ligação antigenea-anticorpo. Também, são utilizados para neutralizar ou remover do soro SCF. Uma segunda vantagem dos anticorpos monoclonais é que estes podem ser sintetizados por células hibridoma em cultura, não contaminadas por oturas imunoglobulinas. Podem também preparar-se anticorpos monoclonais a partir de sobrenadantes de células hibridoma cultivadas ou de ascites indu zidas por inoculação intraperitoneal de células hibridoma no murganho. As técnicas de hibridoma descritas originalmente por Kóhler e Milstein [Eur. J. Immunol 6 (1976), 511-519] têm sido muito utilizadas para produzir linhas de células híbridas que segregam níveis altos de anticorpos monoclonais contra muitos antigenes específicos.

Os exemplos seguintes são apresentados para mais completamente ilustrarem esta invenção mas não devem ser considerados como limitativos do seu âmbito.

- 38Exemplo Ί

Purificação/caracterização do factor de células indiferenciadas de meio condicionado de oélulas de fígado de rato búfalo.

A. Ensaios biológicos in vitro

1. Ensaio HPP-CFC

Existe uma variedade de actividades bio lógicas que se podem atribuir a SCF murino de mamífero natural, assim como a proteína de SCF murino recombinante. Uma destas actividades é o efeito sobre células hematopoiéticas jovens. Esta actividade pode ser avaliada de acordo com o ensaio de células formadoras de colónias com alto potencial proliferativo (HPP-CFC) (Zsebo et al., supra (1988)]. Para investigar o efeito de factores sobre células hematopoiéticas jovens, o sistema de ensaio HPP-CFC utiliza medula óssea de murganho derivada de animais 2 dias após tratamento com 5-fluorouracilo (5-FU). 0 fármaco quimioterapêutico 5-FU depleta selectivamente as progenitoras hematopoiéticas tardias , permitindo a detecção de células progenitoras jovens e, portanto, dos factores que actuam sobre estas células. 0 SCF de rato é plaqueado na presença de CSF-1 ou IL-6 em cul turas de agar semi-sólidas. As culturas de agar contêm meio completo McCoys (GIBCO), soro bovino fetal a 20 % , agar a 0,3 % e 2 χ 10³ células de medula óssea/ml. 0 meio completo

- 39 de McCoys contém os componentes seguintes: 1 x meio de McCoys suplementado com 0,1 mM de piruvato, 0,24 x aminoáci. dos essenciais, 0,24 x aminoácidos não essenciais, 0,027 Ί> hidrogeno carbonato de sódio, 0,24 x vitaminas, glutamina 0,72 mM, 25/ug/ml de L-serina e 12 /ug/ml de L-asparagina. As células de medula óssea são provenientes de murganhos Balb/C injectados por via endovenosa com '150 mg/kg de 5-FU. Recolhem-se os fémures 2 dias após o tratamento dos murganhos com 51 FU e retiraram-se as medulas ósseas. Lisam-se os glóbulõs vermelhos com reagente para lisar glóbulos vermelhos de (Becton Dickenson) antes de se plaquearem. As substâncias em teste são plaqueadas com a mistura anterior em placas de 30 mm. Catorze dias depois, classificam-se as colónias ( j> 1 mm de diâmetro) que contêm milhares de célu las. Este ensaio utilizou-se através da purificação de SCF de rato derivado de células de mamífero naturais.

No ensaio típico, SCF de rato causa a proliferação de aproximadamente 50 HPP-CFC por 200 000 células plaqueadas. SCF murino tem uma actividade sinérgica sobre as células de medula óssea do murganho tratado com 5-FU; as colónias HPP-CFC não se formam na presença de fac tores isolados, mas a associação de SCF e de SSF-1 ou SCF com IL-6 é activa neste ensaio.

2. Ensaio MC/9

Outra actividade biológica útil de SCF natural ou recombinante é a capacidade para provocar a proli

feração da linha de mastócitos MC/9 (ATCC CRL 8306). As célu las MC/9 são cultivadas com uma fonte de IL-4 de acordo com o protocolo ATCC CRL 8306. 0 meio utilizado no bioensaio é RPMI 1640, soro bovino fetal a 4 %, 2-mercaptoetanol 5 x x 10 M e 1 x glutamina-penicilina-estreptomicina. As célu las MC/9 proliferam como resposta a SCF sem necessidade de outros factores de crescimento. Esta proliferação é avaliada primeiro por cultura das células durante 24 horas sem fac. tores de crescimento, plaqueando-se 5 000 células em cada cavidade de placas de 96 cavidades com a amostra de ensaio •0 durante 48 horas, pulsação durante 4 horas com 0,5/uCi ^JH-timidina (actividade específica 20 Ci/mmole), recolha da solução por filtros de fibra de vidro e, em seguida, avaliação da radioactividade especificamente ligada. Este ensaio foi utilizado na purificação de SCF murino derivado de células de mamífero após a fase de filtração por gel ACA 54, secção C2 deste Exemplo. Tipicamente, SCF causou um aumento de 4a 10 vezes no CPM em relação ao fundo.

3. CFU-GM

A acção de SCF de mamífero purificado, recombinante ou derivado naturalmente, isento de factores estimuladores de colónias que interferem (CSFS), foi avaliada sobre medula óssea murina não depletada normal. Utilizou-se um ensaio de CFU-GM [Broxmeyer et al., Exp. Hematol . , 5 ( 1 977) 87] para avaliar o efeito de SCF sobre

41medula óssea normal. Resumidamente, células de medula óssea total após lise dos glóbulos vermelhos foram plaqueadas em culturas de agar semi-sólido contendo a substância em ensaio. Após 10 dias, classificaram-se as colónias contendo agrupamen tos de mais de 40 células. As culturas de agar podem secar-se em lâminas de vidro e determinar-se a morfologia das células por meio de colorações histológicas especificadas.

Sobre a medula óssea de murganho normal o SCF de murino purificado foi um CSF pluripotencial, estimilador do crescimento de colónias constituídas por células imaturas, neutrófilos, macrófagos, eosinófilos e megacariócitos sem exigências de outros factores. De 200 000 células plaqueadas, mais de 100 destas colónias desenvolveram-se durante um período de 10 dias. Tanto o SCF murino como o recombinante humano estimulam a produção de células eritróides na associação com EPO (ver Exemplo 9).

B. Meio condicionado

Fizeram-se desenvolver células 3A de fígado de rato Buffalo da American Type Culture Collection (ATCC CRL 1442), em microveículos num sistema de cultura de perfusão com 20 litros, para a produção de SCF. Este sistema utiliza um fermentador Biolafitte (Model ICC-20) excepto para as sondagens utilizadas para a retenção dos microveículos e oxigenação do tubo. Redes de malha de 75 micron foram mantidas isentas de microveículo por obstrução devido a lavagens periódicas efectuadas por meio de um sis42 tema de válvulas de segurança e de bombas controaldas por computador. Cada sonda aotua alternativamente como meio de alimento e sonda de colheita. Este esquema de fluxo oscilante assegura que as sondas não se obstruam. A oxigenação foi proporcionada através de uma serpentina de tubo de sili. cone [(50 pés (1,52 m) de comprimento, por 0,25 polegadas (0,64 cm) de diâmetro interior e 0,03 polegadas (0,08 cm) de espessura da parede). Para a cultura de células 3A BRL o meio de desenvolvimento utilizado foi Meio Essencial Mínimo (com sais de Earle) (GIBCO), 2 mM de glutamina,

3g/l de glucose, fosfato de triptose (2,95 g/1), soro de bovino fetal a 5 $ e soro de vitela fetal a 5 $· 0 meio colhido foi idêntico com excepção na omissão de soro. 0 reactor continha microveículos Cytodex 2 (Pharmacia) numa 9 concentração de 0,5 g/1 e foi semeado com 3 x 10 células BRL 3A desenvolvidas em frascos redondos e retiradas por tri£ sinização. As células ficaram a ligar e a desenvolverem-se em microveículos durante oito dias. 0 meio de desenvolvimento foi perfundido através do reactor, como exigido de acordo oom o consumo de glucose. A concentração de glucose foi mantida aproximadamente em 1,5 g/1. Após oito dias, o reactor foi perfundido com seis volumes no meio isento de soro para eliminar a maior parte do soro (concentração de proteína Ζ-50/Ug/ml). Em seguida, o reactor foi operado por fases até a concentração de glucose ser inferior a 2 g/1.A partir deste ponto, o reactor operou em perfusão contínua com um caudal aproximadamente de 10 litros/dia. Manteve-se

- 43 ο ρΗ da cultura em 6,9 + 0,3 mediante ajustamento do caudal de dióxido de carbono. Manteve-se o oxigénio dissolvido superior a 20 % da saturação de ar por suplementação com oxi génio puro, se necessário. Manteve-se a temperatura a 37 + + 0,5°C.

Produziu-se aproximadamente 336 litros de meio condicionado isento de soro, aplicando-se o sistema citado anteriormente que se utilizou como material inicial para a purificação de SCF murino derivado de células de mamí fero naturais.

C. Purificação

Realizou-se toda a técnica de purificação à temperatura de 4°C, salvo indicação em contrário.

¹· Cromatografia de permuta anionica em DEAE-celulose

Clarificou-se por filtração através de cápsulas Sartocapsules 0,45/U (Santorius), meio condicionado produzido por enchimento de células BRL 3A isentas de soro. Submeteram-se vários lotes diferentes (41 litros, 27 litros, 39 litros, 30,2 litros, 37,5 litros e 161 litros), em separado, a concentração por diafiltração/permuta de tampão e por cromatografia de permuta aniónica em DEAE-celulose, de um modo idêntico para cada lote. Em seguida, reuniram-se os conjuntos de DEAE-celulose e processaram-se como um lote de acordo com o método descrito nas secções C2-5 deste Exem44 pio. Como exemplo, em seguida indica-se a preparação do lote de 41 litros. Concentrou-se meio condicionado filtrado até cerca de 700 ml por meio de um equipamento de ultrafiltração de fluxo tangencial Millipore Pellicon com quatro cassetes de membrana de polissulfona com corte de peso molecular de 10 000 (20 pés (1,85 cm ) de área de membrana total; caudal da bomba cerca de 1095 ml/minuto e taxa de filtração de 250315 ml/minuto). Efectuou-se depois a diafiltração/mudança de tampão na preparação da cromatografia de permuta aniónica mediante a adição de 500 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 ao concentrado, reconcentração até 500 ml utilizando o equipa mento de ultrafiltração de fluxo tangencial e repetição desta fase mais seis vezes. A preparação concentrada/diafiltrada foi finalmente recuperada num volume de 700 ml. Aplicou-se a preparação numa coluna de permuta aniónica de DEAE-celulose (5 x 20,4 cm; resina whatman DE-52) que tinha sido equilibrada com tampão de pH 7,8 de Tris-HCl 50 mM. Após a aplica ção da amostra lavou-se a coluna com 2050 ml de tampão TrisHCl e aplicou-se um gradiente salino (0-300 mM de MaCl em tam pão Tris-HCl; com volume total de 4 litros). Recolheram-se fracções de 15 ml com um caudal de 167 ml/h. A cromatografia está representada na Figura 1. 0 número de colónias HPP-CFC refere-se à actividade biológica no ensaio HPP-CFC; analizaram-se 100/ul das fracções citadas. As fracções recolhidas durante a aplicação da amostra e lavadas não estão representadas na Figura; nestas fracções não se detectou acti. vidade biológica.

- 45 Foi similar o comportamento de todos os lotes de meio condicionado submetidos a concentração, diafiltração/mudança de tampão e cromatografia de permuta aniónica. As concentrações de proteína dos lotes, determinadas pelo método de Bradford com [Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254] com albumina de soro bovino como padrão variaram entre 30 e 50/ig/nil. 0 volume total de meio condicionado utilizado nesta preparação foi cerca de 336 litros.

2. Cromatografia de filtração por gel ACA 54

Reuniram-se as fracções com actividade biológica provenientes dos ensaios em coluna de DEAE-celulose, para cada um dos seis lotes de meio condicionado refe rido anteriormente (por exemplo, fracções 87-114 para o ensaio representado na Figura 1) (volume total 2900 ml) e concentrou-se até um volume final de 74 ml mediante utilização de células homogéneas Amicon e membranas YM 10. Este material foi aplicado a uma coluna de filtração por gel ACA 54 (LKB) (Figura 2) equilibrada com Tris-HCl, 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4. Recolheram-se as fraoções de 14 ml com um caudal de 70 ml /hora. Dado que os factores inibidores co-eluiram com as fracções activas, o pico de actividade (número de colónias HPP-CFC) apresenta-se dividido; contudo, com base em cromatogramas anteriores, a actividade eluiu conjuntamente com o pico máximo de proteína e, portanto, fez-se uma mistura de fracções.

- 46 - \

3. Cromatografia em agarose de aglutinina de germe de trigo

Reuniram-se as fracções 70-112 da colu na de filtração por gel ACA 54 (500 ml). Dividiu-se a mistura em duas e submeteu-se cada metade a cromatografia utili zando-se uma coluna de agarose-aglutinina de germe de trigo (5 x 24,5 cm; resina dos E-Y Laboratories, San Mateo, CA; a aglutinina de germe de trigo reconhece certas estruturas de hidratos de carbono) equilibrada com Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4. Após as aplicações da amostra, lavou-se a coluna oom cerca de 2 200 ml de tampão de coluna e realizou-se a eluição do material ligado mediante a aplicação duma solução de N-acetil-D-glucosamina 350 mM dissolvida no tampão da coluna, com início na fracção próxima de 210, na Figura 3. Recolheram-se fracções de 13,25 ml com um caudal de 122 ml/hora. Um dos ensaios cromatograficos está apresentado na Figura 3· As porções das fracções a analisar foram dialisadas contra solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato; para o ensaio MC/9 utilizaram-se 5 /Ul de materiais dialisados (valores de cpm na Figura 3) © 10/ul no ensaio HPP-CFC (valores do número de colónias na Figura 3). Poude observar-se que o material activo ligado à coluna eluiu com N-acetil-D-glucosamina, enquanto a maior parte do material contaminante passou através da coluna durante a aplicação da amostra e a lavagem.

4. Cromatografia de permuta catiónica de fluxo rápido em

S-sefarose

Reuniram-se e dializaram-se contra formato de sódio (25 mM, pH 4,2, as fracções 211-225 provenien tes de cromatografia em agarose-aglutinina de germe de trigo representada na Figura 3 com as fracções equivalentes do segundo ensaio (375 ml) . Para minimizar o tempo de exposição a pH baixo realizou-se a diálise num período de 8 horas contra 5 litros de tampão com quatro mudanças durante esse período. No fim deste período de diálise, o volume da amostra foi de 480 ml e o pH e condutividade estavam próximos do tampão de diálise. 0 material precipitado apareceu ns amostra durante a diálise. Este foi retirado por centrifugação a 22 000 x g durante 30 minutos e aplicou-se o sobrenadante da amostra centrifugada a uma coluna de permuta catiónica de fluxo rápido de Sefarose-S (3,3 x 10,25 cm; resina de Pharmacia) que fora equilibrada com o tampão de formato de sódio. 0 caudal foi de 465 ml/hora e recolheram-se fracções de 14,2 ml. Após aplicação da aniostra lavou-se a coluna com 240 ml de tampão de coluna e a eluição do material ligado foi reali zada pela aplicação de um gradiente de 0-750 mM de NaCl (NaCl dissolvido em tampão da coluna; gradiente com o volu me total de 2 200 ml), com início na fracção próxima de 45, na Figura 4. 0 perfil de eluição está representado na Figura

4. As fracções recolhidas foram ajustadas para um pH de 7-7,4 pela adição de 200/ul de base de Tris 0,97 M. 0 valor de cpm

- 48 - ‘

4' ff r

representado na Figura 4 também se refere aos resultados obti dos no ensaio biológico MC/9; as porções das fracções indicadas foram dialisadas contra solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato e no ensaio utilizaram-se 20/ul. Pode observar-se na Figura 4 que a maior parte do material com actividade biológica passou através da coluna não ligado, enquanto muito do material contaminante se ligou e eluiu no gradiente salino.

5. Cromatografia com resina de hidrato de carbono ligado a sílica

Reuniram-se as fracções 4-40 da coluna de S-Sepharose, Figura 4 (540 ml). Adicionaram-se 450 ml daquela mistura a igual volume de tampão B (acetato de amó nio 100 mM, pH 6: isopropanol; 25:75) e aplicaram-se com um caudal de 540 ml/hora a uma coluna (Vydac Proteins C^; 2,4 x 2 cm) equilibrada com tampão A (acetato de amónio 60 mM, pH6: isopropanol; 62,5:37,5). Após a aplicação da amostra, reduziu-se o caudal para 154 ml/h e lavou-se a coluna com 200 ml de tampão A. Em seguida, aplicou-se um gradiente linear desde tampão A até tampão B (volume total :

: 140 ml) e recolheram-se fracções de 9,1 ml. As porções da mistura da cromatografia em S-Sepharose, a amostra da coluna , a mistura desenvolvida do ensaio e a mistura de lavagem foram ajustados para 40 /ig/ml de albumina de soro bovino mediante a adição do volume apropriado de solução de reserva com 1 mg/ml e dialisados contra solução de cloreto de sódio .f' toa»

Τ* tamponada com fosfato como preparação para o ensaio biológico. Do mesmo modo, reuniram-se alíquotas de 40 ul das fracções de gradiente com 360/ul de solução de cloreto de sódio tamponado com fosfato contendo 16 ug de albumina de soro bovino e em seguida dializou-se contra solução de cloreto de sódio tam ponada com fosfato como preparação para o ensaio biológico. Estas diversas fracções foram analisadas de acordo com o ensaio MC/9 (aliquotas de 6,3/ul das fracções de gradiente preparadas; cpm na Figura 5). Os resultados do ensaio indicaram que aproximadamente 75 % da actividade recolhida corre£ pondia ao decurso do ensaio e às fracções de lavagem e 25$ às fracções de gradiente indicadas na Figura 5. SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685; os geles limitantes continham acrilamida a 4 $ (p/v) e os geles de separação con tinham acrilamida a 12,5 $ (p/v)] de aliquotas de várias fracções, apresentam-se na Figura 6. Para o gel representado, as alíquotas da amostra foram secas sob vazio e em seguida redissolvidas utilizando 20 /j! de tampão de tratamento da amostra (não redutor, isto é, sem 2-mercaptoetanol) e submeteram-se a ebulição durante 5 minutos antes de se impregnarem no gel. As pistas A e B representam a coluna do material inicial (75/hl de 890 ml) e o desenvolvimento da coluna (75 Àil de 880 ml), respectivamente; os valores marcados à esquerda da Figura representam as posições de migração (reduzidas) de marcadores de pesos moleculares 10 superiores aos números indicados em que os marcadores são fosforilase b (M de 97 400), albumina de soro bovino (M de 66 200), ovalbumina (Μ de 42 700), anidrase carbónica (M_p de 31 000), inibidor de tripsina de soja (M de 21 500) e lisozima (M de 14 400); as pistas 4-9 representam as fracções correspondentes recolhidas durante a aplicação do gradiente (60jpl de 9,1 ml). 0 gel foi corado com prata [Morrissey, Anal. Biochem., 117 (1981) 307-310]. Pode observar-se, pela comparação das pistas A e B que a maior parte do material susceptível de ser corado passa através da coluna. 0 material corado nas fracções 4-6 nas regiões exactamente acima e abaixo da posição do padrão de de 31 000 coincide com a actividade biológica detectada nas fracções de gradiente (Figura 5) e representa o material com actividade biológica. Deve notar-se que este material está visualisado nas pistas 4 a 6, mas que não está nas pistas A e/ou B, devido a ter sido carregada uma proporção muito maior de volume total (0,66 # do total para as fracções 4-6 versus 0,0084 % do total para as pistas A e B) no primeiro caso. Reuniram-se as fracções 4-6 desta coluna.

Tal como se referiu anteriormente, aproximadamente 75 da actividade recolhida passou através da coluna , da Figura 5. Este material foi recromatografado utilizando resina , essencialmente do modo descrito anteriormente, com a diferença de se ter utilizado uma coluna maior (1,4 x 7,8 cm) e de um menor caudal (50-60 ml/hora). Aproximadamente 50 $ da actividade recuperada foi-o durante 0 desenvolvimento e 50 $ nas fracções de gradiente mostrando aspecto similar em SDS-PAGE às fracções de gradiente activo

na Figura 6. Reuniram-se as fracções activas (29 ml).

A coluna analítica foi também preparada essenoialmente do modo descrito anteriormente e as fracções foram analisadas em ambos os ensaios biológicos.Tal e como se indica na Figura 7 das fracções desta coluna analítica, eluiram conjuntamente as actividades biológicas MC/9 e HPP-CFC. A análise SDS-PAGE (Figura 8) revela a presença de proteína com M^ de aproximadamente 31 000 nas fracções da coluna que continham actividade biológica nos dois ensaios.

material activo no segundo pico de actividade (relativamente menor) observado na cromatografia em S-Sepharose (por exemplo, Figura 4, fracções 62-72, fracções iniciais no gradiente salino) também foi purificada por cromatografia C^. Exibiram o mesmo comportamento em SDS-PAGE e a mesma sequência da aminoácidos N-terminais (ver Exemplo 2D) que o material obtido na cromatografia das fracções eluídas em S-Sepharose.

6. Resumo da purificação resumo das fases de purificação descritas anteriormente em 1-5 está apresentado no Quadro 2.

Quadro 2

Resumo da purificação de SCF de mamífero

Passo	Volume (ml)	Total ς Proteína (mg)5
Meio condicionado	335 700	13 475
1 DEAE-celulose	2 900	2 164
ACA-54	550	1 513
Agarose-aglutininà _de 2 germe de trigo	375	431
S-Sepharose	5404	10
3 Resina	57,3	0,25-0,40

1. Os valores indicados representam o somatório dos valores dos diferentes lotes descritos no texto.

2. Tal como se descreveu anteriormente, neste Exemplo, o material precipitado que se observou durante a diálise da amostra na preparação para cromatografia em S-Sepharose foi removido por centrifugação. A amostra após centrifugação (480 ml) continha 264 mg de proteína total.

3. Combinação das fracções de gradiente activo das duas colunas ensaiadas na sequência descrita.

4. Apenas 450 ml deste material se utilizou para a fase seguinte (deste Exemplo, anterior).

535. Determinado pelo método de Bradford (supra, 1976), salvo indicação em contrário.

6. Avaliado, com base na intensidade da coloração de prata após SDS-PAGE e na aálise da composição de aminoácidos tal como se descreveu na secção K do Exemplo 2.

D. SDS-PAGE e tratamntos oom glicosidase

Na Figura 9 apresentam-se SDS-PAGE de fracções de gradiente reunidas provenientes de dois ensaios em grande escala em coluna Cjj. Para a primeira coluna utilizaram-se 60 ul da mistura (pista 1) e 40/Ul para a segunda coluna (pista 2). Estas pistas de gel foram coradas com prata.

Os marcadores de peso molecular foramsos referidos para a Figura 6. Tal como se referiu, o material de migração-difusão, acima e abaixo da posição do marcador de

000 representa o material com actividade biológica; a heterogeneidade aparente é em grande parte devida à heterogeneidade na glicosilação.

Para caracterizar a glicosilação, o mate125 rial purificado foi marcado com I, tratado com varias glicosidades e analisado por SDS-PAGE (sob condições de redução) com auto-radiografia. Os resultados apresentam-se na

Figura 9· As pistas 3 θ 9 correspondem ao material marcado com I sem tratamento com glicosidase. As pistas 4-8

125 representam o material marcado com I, tratado com glico-

sidases como se segue; pista 4, neuraminidase; pista 5 neuraminidase e O-glicanase; pista 6, N-glicanase; pista 7,neu raminidase e N-glicanase; pista 8, neuraminidase, O-glicanase e N-glicanase. As condições foram 5 mM de 3-C(3-colamidopropil)-dimetilamónio]-1-propano-sulfonato (CHAPS), 33 mM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de Tris-HCl, pH 7-7,2, durante 3 horas à temperatura de 37°C. A neuraminidase (proveniente de Arthorobacter ureafaciens; Calbiochem) foi utilizada a 0,23 unidades/ml de concentração final. A O-glicanase (Genzima; endo-alfa-N-acetil-galactosaminidase) foi utilizada a miliunidades/ml. N-glicanase (Genzima; péptido: N-gli- 4 oosidase F; péptido N [N-acetil-beta-glucosaminil]-asparagina-amidase) foi utilizada a 10 unidades/ml.

Resultados similares aos da Figura 9 obtiveram-se após tratamento de SCF purificado não marcado com glicosidases e visualização dos produtos por coloração com prata após SDS-PAGE.

Aquando apropriado, foram realizadas vá rias incubações de controlo. Estas incluíram; incubações em tampão adequado, isento de glicosidases, para verificar que os resultados eram devidos às preparações de glicosidases adicionadas; incubação com proteínas glieosiladas (por exemplo, eritropoiétina humana recombinante glicosilada) conhecidas como sendo substratos para as glicosidases, para verifi car que as enzimas glicosidases utilizadas eram activas; e incubação com glicosidases por si mesmas não contribuíam para obscurecer nem obscureciam as bandas de gel visualizadas.

- ^Λ

Os tratamentos com glicosida&e também se realizaram com endo-beta-N-acetilglucosamidase F (endo F; NEN Dupont) e com endo-beta-N-acetilglucosamidase H (endo H; NEN Dupont), de novo com incubações de controlo apropriados.

As condições de tratamento com endo F foram: ebulição de 3 minutos na presença de SDS a 1 $ (p/v), 100 mM de 2-mercaptoetanol, 100 mM de EDTA, 320 mM de fosfato de sódio, pH6, seguida de uma diluição de 3 vezes com a inclusão de Novidet P-40 (concentração final 1,17 %, v/ν') , fosfato de sódio (200 mM de concentração final) e endo F (concentração final 7 unidades/ml). As condições do tratamento com endo H foram similares com excepção da concentração de SDS-PAGE que foi 0,5 % (p/v) e o endo H foi utilizado na concentração de /ig/ml. Os resultados com endo F foram idênticos aos resultados com N-glicanase, embora endo H não exercesse efeito no material de SCF purificado.

Podem retirar-se numerosas conclusões das experiências com glicosidase descritas anteriormente. Os vários tratamentos com N-glicanase [que remove o complexo e o hidrato de carbono N-ligado a manose superior (Tarantino et al., Biochemistry, 24, (1985), 4665-4671, com endo F [que actua similarmente à N-glicanase (Elder e Alexander, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 (1982), 4540-4544], com endo H (que elimina a manose superior e certos tipos híbridos de hi_ dratos de carbono N-ligados (Tarentino et al., Methods Enzy mol. 50C (1978), 574-580], com neupaminidase (que elimina os

-56-/ (

''‘'-ijj-euX..

resíduos de áeido siálico) e com O-glicanase [que elimina cer tos hidratos de carbono 0-ligados (Lambin et al., Biochem.

Soe. Trans. 12, (1984) 599-600], sugerem que: estão presentes hidratos de carbono N-ligados e^: 0-ligados; a maioria dos hidratos de carbono N-ligados é de tipo complexo; e que está presente ácido siálico, pelo menos algum fazendo parte dos radicais 0-ligados. Pode-se obter dos resultados da sequência de aminoácidos alguma informação acerca dos sítios possíveis para a ligação a N-(Exemplo 2). 0 facto de o tratamento com N-glicanase, endo F e N-glicanase/neuraminidase poder converter o material heterogéneo evidenciado por SDS-PAGE em for mas de migração mais rápida, que são muito mais homogéneas,é consistente com a conclusão de que todo o material representa o mesmo polipéptido, sendo a heterogeneidade provocada pela heterogeneidade na glicosilação. Também é de notar que as formas menores obtidas pelos tratamentos combinados com as várias glicosidases estão compreendidas entre 18 000 e 20 000, relativo aos marcadores de peso molecular utilizados em SDS-PAGE.

A confirmação de que o material de migra ção/difusão com a posição em torno de M 31 000 no SDS-PAGE representa o material biologicamente activo contendo todo a mesma cadeia polipeptidica básica, é dada pelo facto de os resultados da sequência de aminoácidos derivada do material que migra nesta região (após transferência electroforética e tratamento com brometo de cianogénio; Exemplo 2) se ajustam aos demonstrados para o gene isolado cuja expressão por /

meio de DNA recombinante conduz a material biologicamente activo (Exemplo 4).

Exemplo 2

Análise da sequência de aminoácidos de SCF de mamífero

A· Cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (HPLC) de proteína purificada

Submeteram-se aproximadamente 5 ug de SCF purificado do modo descrito no Exemplo 1 (concentração = = 0,117 mg/ml) a HPLC de fase inversa utilizando uma coluna C^ de pequeno calibre (Vydac, de 300 Í de calibre, 2 mm x x 15 cm). Eluiu-se a proteína com um gradiente linear desde 97 Ί, de fase móvel A (ácido trifluoroacético a 0,1 %)/3 $ de fase móvel B (90 $ de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1 $) até 30 de fase móvel A/70 % de fase móvel B durante 70 minutos seguido por eluição isocrática durante mais 10 minutos com um caudãál de 0,2 ml por minuto. Após substração de um cromatograma do branco constituído por tampão, evidenciou-se o SCF sob a forma de um pico simétrico único com um tempo de retenção de 70,05 minutos, tal como se representa na Figura 10. Não se detectaram picos de proteína contaminante principais, sob estas condiçSes.

B. Sequnciação de bandas de proteína transferidas por electroforese

Tratou-se SCF purificado de modo des- 58 - / .1?

crito no Exemplo 1 (0,5-1,0 nmole), como se descreve a seguir, com N-glicanase, uma enzima que cliva especificamente os radicais hidrato de carbono ligados a Asn, ligados de modo covalente a proteínas (ver Exemplo 1D). Seoaram-se sob vazio 6 ml do material proveniente da reunião das fracções 4-6 da coluna da Figura 5. Em seguida, adicionaram-se 150/il de CHAPS 14,25 mM, 2-mercaptoetanol1QQ mM, fosfato de sódio, 335 mM, pH 8,6 e incubaram-se durante 95 minutos à temperatura de 37°C . Em seguida adicionaram-se 300/Ul de fosfato de sódio 74 mM, 15 unidades/ml de N-glicanase, pH 8,6 e continuou-se a incubação durante 19 horas. Em seguida, desen volveu-se a amostra num gel de gradiente de SDS-poliacrilamida

9-18 $ (espessura 0,7 mm, 20 x 20 cm). As bandas de proteína do gel foram transferidas por electroforese para difluoreto de polivinilo (PVDF, Millipore Corp.) utilizando tampão Caps 10 mM (pH 10,5) com uma corrente constante 0,5 Amp durante 1 hora [Matsudaira, J. Biol. Chem., 261 (1987) 10 035-10 038].

As bandas de proteína transferidas visualizaram-se com a coloração de Azul de Coomassie. As bandas apresentaram-se para Mp de cerca de 29 000 a cerca de 33 000 e para M^ de cerca de 26 000, isto é, a desglicosilação foi apenas parcial (vidé o Exemplo 1D figura 9); a primeira banda representa material não digerido e a última representa material de onde foi removido o hidrato de carbono N-ligado. As bandas foram retiradas e directamente introduzidas (40 % para proteína de M_r 29 000 - 33 000 e 80 $ para proteína de M^ 26 000), num sequen ciador de proteína (Applied biosystems Inc., modelo 477).Rea

- 59 - / lizou-se a análise de sequência de proteína utilizando os pro gramas fornecidos pelo fabricante [Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, (1981) 7990-7997] e os feniltio-hidantioinilaminoácidos libertados foram analisados da mesma forma utilizando HPLC de fase inversa de microporo. Nenhuma das bandas forneceu sinais para cilos de sequenciação compreendidos entre 20 e 28, sugerindo que não eram sequenciáveis por metodologia que aplica química de Edman. 0 nível residual de cada ensaio de sequenciação estava compreendido entre 1 e 7 pmoles, o que é bastante inferior à quantidade de proteína presentre nas bandas. Estes resultados sugeriram que a proteína nas bandas estava bloqueada em posição N- terminal.

C. Cisão in situ por brometo de cianogénio de proteína transferida por electroforese e sequênciação

Para a confirmação de que a proteína estava de facto bloqueada, retiraram-se as membranas do sequenciador (parte B) e realizou-se a cisão in situ por bro meto dê cianogénio (CNBr) das bandas coradas [CNBr (5 f>, p/v) em ácido fórmico a 70 $ durante 1 hora à temperatura de 45—C] seguida de secagem a análise de sequência. Detectaram-se sinais de sequência fortes que representavam os péptidos internos obtidos da cisão pelo brometo cianogénio da ligação metionilo-péptido.

Ambas as bandas geraram sinais de

- 60 sequência mistos idênticos, que em seguida se apresentam para os 5 primeiros ciclos.

Aminoácidos Identificados

Ciclo	1:	Asp;	Glu;	Vai;	Ile;	Leu
Ciclo	2:	Asp;	Thr ;	Glu;	Ala;	Pro;
Ciclo	3:	Asn;	Ser;	His;	Pro;	Leu
Ciclo	4:	Asp;	Asn;	Ala;	Pro;	Leu
Ciclo	5:	Ser;	Tyr;	Pro

Até 20 ciclos ambas as bandas forneceram sinais similares. Os rendimentos iniciais foram 40-115 pmoles para a banda de de 26 000 e 40-150 pmoles para a banda de M de 29 000 - 33 000. Estes valores são comparáveis às quantidades molares originais de proteína introduzidas no sequenciador. Os resultados confirmaram que as ban das de proteína que correspondem a SCF continham uma extremidade N bloqueadora. Os processos utilizados para a obtenção de informação útil sobre a sequência para as proteínas N-terminalmente bloqueadas incluíam: (a) desbloqueamento da extremidade N (ver secção D); e (b) geração de péptidos por cisões internas por acção do CNBr (ver secção E), por tripsina (ver secção F) e por protease (Glu-C) de Staphylococcus aureus (estirpe V-8), (ver secção G). Pode efectuar-se a análise de sequência após a eliminação do bloqueamento do ami noácido N-terminal ou após serem isolados fragmentos peptídicos. Os exemplos estão descritos em seguida pormenorizada mente.

D. Análise de sequência de factor de células indiferenciadas BRL tratadas com ácido piroglutâmico aminapeptidase

A natureza química do radical bloqueado presente na extremidade amino de SCF foi difícil de predi zer. 0 bloqueamento pode ser pós-translaccional in vivo [F. Wold, Ann. Rev. Biochem, 50 (1981) 783-814] ou pode ocorrer in vitro durante a purificação. Mais correntemênte' utiliza das são duas modificações pós-translaccionais. A acetilação de certos aminoácidos N-terminais, tais como Ala, Ser, etc., pode ocorrer catalisada por N-ç^-acetil-transferase. Isto pode confirmar-se por isolamento e análise por espectrometria de massa de um péptido bloqueado na extremidade N. Se a extremidade amino de uma proteína for a glutamina, pode ocorrer a desaminação da sua gama-amida. Em seguida, pode ocorrer uma ciclização envolvendo o grupo gama-carboxilato e a extremidade N livre para dar piroglutamato. Para a detecção do piroglutamato, pode utilizar-se a enzima piroglutamato-aminopeptidase. Esta enzima remove o resíduo piroglutamato, deixando uma extremidade amino livre a contar do segundo aminoácido. Pode utilizar-se então para a sequên ciação a química de Edman.

- 62 Incubou-se SCF (purificado do modo des crito no Exemplo 1; 400 pmoles) em tampão de fosfato de sódio mM, (pH 7,6, contendo ditiotreitol e EDTA), com 1,5 unidades de ácido piroglutâmico-amínopeptidase de fígado de vitela (pE-AP) durante 16 horas à temperatura de 37²C. Após reacção introduziu-se directamente a mistura num sequênciador de proteínas. A sequência principal foi identificada através de 46 ciclos. 0 rendimento inicial foi de cerca de 40 $ e o rendimento de repetição foi de 94,2 A sequência N-terminal do SCF incluindo o ácido piroglutâmico N-terminal é:

sítio de cisão pE-AP pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp20

Ile-Thr-Lys-Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr30 20 30

Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr-Leu-Asn-Tyr40

Val-Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp-..

xxx, não assinalado na posição 43

Estes resultados indicam que SCF contém ácido piroglutâmico na sua extremidade N.

E. Isolamento e análise de sequência de péptidos por CNBr

Tratou-se SCF purificado de acordo com o Exemplo 1 (20-28 /jg; 1,0 - 1,5 nmoles) oom N-glicanase, do modo descrito no Exemplo 1. A conversão em material de de 26 000 foi completa neste caso. Secou-se a amostra e digeriu-se com brometo de cianogénio em ácido fórmico a 70# (5 #) durante 18 horas à temperatura ambiente. Diluiu-se o digesto com água, secou-se e redissolveu-se em ácido trifluoroacético a 0,1 #. Separaram-se os péptidos provenientes de CNBr por HPLC de fase inversa utilizando uma coluna de pequeno calibre e condições de eluição idênticas às descritas na secção A deste Exemplo. Isolaram-se e sequenciaram-se várias fracções peptídicas principais, resumindo-se os resultados em seguida:

Tempo de retenção

Péptido (minutos) Sequência

CB-4 15,5

CB-c¹ 22,1

CB-8 28,0

CB-10 30,1

L-P-P—

a. I-T-L-N-Y-V-A-G-(M)

b. V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S-_-_-L_G-P-E-K-D-S-R-V-S-V-(_)-K---D-V-L-P-S-H-C-W-L-R-D-(M) (contendo a sequência de CB-8)=·

·»

Continuação

Péptido	Tepo de retenção (minutos)	„ 4 Sequencia
CB-152	43,0	E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K- K-P-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F- S-I-F-D3-R-S-I-D-A------
CB-14 e	37,3	Ambos os péptidos
CB-16		continham sequência idêntica a CB-15

1. Não sedetectaram aminoácidos nas posições 12, 13 e 25.

péptido b não foi sequenciado até ao fim.

2. (N) não foi detectado em CB-15; isto foi deduzido com base no sítio de glicosilação N-ligado potencial. 0 péptido não foi sequenciado até ao fim.

3. Designa o sítio onde Asn pode ter sido convertido em Asp após remoção de N-glicanase do açúcar N-ligado.

4. Utilizou-se o código de uma única letra:

A,Ala;	C,Cys;	D,Asp;	E,Glu;	F.Phe;	G,Gly;	H,His;
I,Ile;	K,Lys;	L,Leu;	M,Met;	N,Asn;	P,Pro;	Q,Gln;
R,Arg;	S,Ser;	T;Thr;	V,Val;	W,Trp;	e Y,Tyr

F. Isolamento e sequenciação de fragmentos trípticos de factor de células indiferenciadas BRL

Digeriu-se SCF purificado de acordo com o /

- 65- '^χ·/

Exemplo 1 (20 /ig em 150 yul de hidrogeno carbonato de amónio 0,1 M) com 1 /Ag de tripsina à temperatura de 37-C durante

3,5 horas. 0 digesto foi imediatamente introduzido numa coluna Cjj de pequeno calibre de HPCL de fase inversa usando condições de eluição idênticas às descritas na secção A deste Exemplo. Todos os picos de péptido eluido apresentavam tempos de reten ção diferentes dos de SCF não digerido (secção A). As análises de sequência dos péptidos isolados apresentam-se em seguida :

Péptido	Retenção de tempo
(minutos)	Sequência
T-1	7,1	E-S-L-K-K-P-E-T-R
1 T-2	28,1	V-S-V-(_)-K
T-3	32,4	I-V-D-D-L-V-A-A-M-E-E-N-A-P-K
T-42	40,0	N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-R
T-53	46,4 a.	L-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N- Y-V-a-g-m-d-v-l-p-s-h-c-w-l-r
	b.	S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T- S-D-C-V-L-S-(_)-(_)-L-G----
T-74	72,8	E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P- E-E-F-F-S-I-F-(_)-R
7-8	73,6	e-s-l-k-k-p-e-t-r-n-f-t-p-e-

E-F-F-S-I-F-D-R

1. Não foi identificado o aminoácido na posição 4.

2. Não foi identificado o aminoácido na posição 12.

3. Não foram identificados osaminoácidos nas posições 20 e 21 em 6 do péptido T-5; foram identificados por tentativas como sítios de ligação de açúcar 0-ligados.

4.. Não foi detectado o aminoácido na posição 10; foi dedu zido como Asn com base no sítio de glicosilação N-ligado potencial. Não foi detectado o aminoácido na posição 21.

G. Isolamento e sequenciação de pêptidos do factor de células indiferenciadas BRL após cisão de S. aureus Glu-CProtease

Submeteu-se SCF purificado do modo descrito no Exemplo 1 (20 /ig em 150 yul de hidrogenocarbonato de amónio 0,1 M) a clivagem com Glu-C protease numa relação de protease -substrato de 1:20. Efectuou-se a digestão à temperatura de 37-C durante 18 horas. Separou-se imediatamente o digesto por HPLC de fase inversa numa coluna de pequeno calibre. Recolheram-se cinco fracções peptídicas principais e sequen ciaram-se do modo descrito a seguir:

Peptidos	Tempo de retenção (minutos)	Sequência
S-1	5,1	n-a-p-k-n-v-k-e
S-21	27,7	S-R-V-S-V-(_)-K-P-F-M-L-P-P- V-A-(A)
S-32	46,3	Não se detectou sequência
S-53	71,0	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E- F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K- d-f-m-v-a-s-d
S-63	72,6	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E- F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K- D-F-M-V-A-S-D-T-S-D

1. 0 aminoácido na posição 6 do péptido S-2 não foi identificado; este poderia ser um sítio de ligação de açúcar O-ligado. 0 Ala na posição 16 do péptido S-2 foi detectado com baixo rendimento.

2. 0 péptido S-3 poderia ser péptido bloqueado na extremidade N derivado da extremidade N de SCF.

3. N entre parênteses foi identificado como um sítio poten ciai de ligação de açúcar N-ligado.

H. Análise da sequência do factor de células indiferenciadas BRL após clivagem com BNPS-escatol

Secaram-se completamente por meio de centri fugação sob vazio 2 ^ug de SCF em hidrogenocarbonato de amónio 10 mM e em seguida redissolveram-se em 100 /il de ácido acético glacial. Adicionou-se um excesso molar de 10 a 20 vezes de BNPS-escatol a esta solução e incubou-se a mistura à temperatura de 502C durante 60 minutos. Em seguida, secou -se a mistura reaccional por meio de centrifugação sob vazio. Extraiu-se o resíduo seco com 100 /Ul de água e de novo com 50 /il de água . Reuniram-se os extractos e, em seguida, submeteram-se a análise da sequência como descrito anteriormente. Detectou-se a sequência seguinte:

10

Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu20

Leu-Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr30 40

Ser-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Val-Asp---A posição 28 não foi identificada seguramente; foi identificada como Asn com base no sítio de glico silação N-ligado potencial.

I. Determinação de aminoácido C-terminal de factor de células indiferenciadas BRL

Substituiu-se o tampão de uma aliquota • λ (500 pmoles de proteína SCF por acetato de sódio 10 mM pH 4,0 (para um volume final de 90/ul) e adicionou-se Brij-35 a 0,05 $ (p/v). Retirou-se uma alíquota de 5 ?ul para doseamento da proteína. Diluiram-se 40 /ul da amostra até 100 yul com o tam pão citado anteriormente. Adicionou-se carboxipeptidase P (proveniente de Penicillium ) numa relação de enzima-substra to de 1:200. Realizou-se a digestão à temperatura de 25²C e retiraram-se alíquotas de 20 /bl ao fim de 0, 15, 30, 60 e

120 minutos. Interrompeu-se a digestão em cada um destes tempos por adição de ácido trifluoroacético até uma concentra ção final de 5 ?. Secaram-se as amostras e derivaram-se os ami noácidos libertados pela reacção com cloreto de dabsilo (cloreto de dimetilaminoazobenzenossulfonilo) em hidrogenocarbonato de sódio 0,2 M (pH 9,0) à temperatura de 702C durante 12 minutos [Chang et al., Methods Enzimol., 90 (1983) 41-48],

Os aminoácidos derivados (um sexto de cada amostra) foram ana lisados por HPLC de fase inversa em pequeno calibre com uma modificação do processo de Chang et al., [Techniques in Protein Chemistry, (T. Hugli ed.), Nova Iorque, Acad. Press,

1989, p.p. 305-311]· Os resultados da composição quantitativa em oada momento obtiveram-se por comparação com padrões dos aminoácidos derivados (1 pmole). No momento zero, detectou-se contaminação com glicina. A alanina foi o único aminoácido que aumentou com o tempo de incubação. Após 2 horas de incubação, detectou-se uma quantidade total de Ala de 25 pmoles,equi. valente a 0,66 mole da Ala libertada por mole de proteína.

Este resultado indicou que a molécula de SCF de mamífero natu70 ral contém Ala como a sua extremidade carboxilo, o que é consistente com a análise de sequência de um pêptido C-terminal,

S-2, que contém Ala C-terminal. Esta conclusão é ainda consis. tente com a especificidade conhecida de carboxipeptidase P [Lu et al., J. Chromatog., 447 (1988) 351-364]. Por exemplo, a cisão cessa quando encontra a sequência Pro-Val. 0 pêptido S-2 tem a sequência S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A) e foi considerado como o pêptido C-terminal de SCF (ver secção

J. deste Exemplo). A sequência C-temrinal de---P-V-A-(A) res.

tringe a cisão pela protease apenas à alanina. A composição de aminoácidos do pêptido S-2 indica a presença de 1 Thr,

Ser, 3 Pro,2 Ala, 3 Vai, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys e 1 Arg, totalizando 16 resíduos. A detecção de 2 resíduos Ala indica que devem existir dois resíduos Ala na extremidade C deste pêptido (ver quadro da secção G.). Deste modo, BRL SCF termina em Ala na posição 164 ou em Ala na posição 165 J. Sequência de SCF

Deduziram-se (Figura 11) uma sequência N-terminal e uma sequência C-terminal por associação dos resul. tados obtidos da análise de sequência de: (1) faotor de células indiferenciadas intacto após remoção do seu ácido piro glutâmico N-terminal; (2) péptidos CNBr; (3) péptidos de tripsina; e (4) fragmentos de peptidase Glu-C. A sequência N-terminal começa no ácido piroglutâmico e termina em Met-48. A sequência C-terminal contém 84/85 aminoácidos (nas posições de 82 a 164/165). A sequência desde a posição 49 até

à 81 não se detectou em qualquer dos péptidos isolados. Contudo, detectou-se a sequência para um grande péptido após a cisão com BNPS-escatol de BRL SCF, do modo descrito na secção H. deste Exemplo. A partir destes dados adicionais, assim como da sequência de DNA obtida a partir de SCF murino (Exemplo 3) podem-se designar as sequências N- e C-terminal e delinear a sequência completa, tal como se representa na Figura 11. A extremidade N da molécula é o ácido piroglutâmico e a extremidade C é a alanina, tal como se confirmou por digestão com piroglutamato - aminopeptidase e digestão com carboxipeptidase P, respectivamente. Da análise de sequência concluiu-se que o Asn-72 está glicosilado; Asn-109 e Asn-120 estão provavelmente glicosilados na mesma molécula mas não em outras. 0 Asn-65 foi detectado durante a análise da sequência e portanto deve estar glicosilado apenas parcialmente. 0 Ser-142, Thr-143 e Thr-155 previstos a partir da sequência de

DNA, não foram deteotados durante a análise da sequência de aminoácidos e portanto podem ser sítios de ligação de hidratos de carbono O-ligados. Estes sítios de ligação potenciais de hidratos de carbono estão indicados na Figura 11; o hidrato de carbono N-ligado está indicado por uma letra a cheio; o hidrato de carbono 0-ligado está indicado por uma letra a cheio aberta.

K. Composição de aminoácidos por análise de factor de células indiferenciadas para BRL material proveniente da coluna C^ da <,

Figura 7 foi preparado por análise da composição de aminoácidos por concentração e mudança de tampão para hidrogenocarbo nato de amónio 50 mM.

Hidrolizaram-se separadamente duas amostras de 70 /Ul em HC1 6 N contendo fenol a 0,1 $ e 2-mercaptoetanol a 0,05 $ à temperatura de 1102C sob vazio durante 24 horas. Secaram-se os hidrolisados, reconstituiram-se com tampão de citrato de sódio e analisaram-se por cromatografia de permuta iónica (num analisador de aminoácidos Beckman Modelo 6300). Os resultados estão indicados no Quadro 3- Uti zando 164 aminoácidos, [provenientes dos resultados da sequen ciação da proteína) , para calcular a composição em amonoácidos, obteve-se uma melhor concordância com os valores previs. tos do que utilizando 193 aminoácidos (como se deduzira dos resultados de sequenciação de DNA proveniente de PCR, (Figura 14C).

Quadro 3

Amino ácido	Composição quantitativa dos aminoácidos de SCF
de mamífero	Previsto por molécul;
Composição em aminoácidos	Resíduos
Moles por mole de proteína—
Ensaio N2	1 Ensaio N2 2	(A)	(B)
Asx	24,46	24,26	25	28
Thr	10,37	10,43	11	12
Ser	14,52	14,30	16	24

Quadro 3 (Cont.)

Amino ácido	Composição em aminoácidos	Previsto
f 1 Moles por mole de proteína	Resíduos	por molécula'
Ensaio N2	1 Ensaio N2 2	(A)	(B)
Glx	11 ,44	11 ,37	10	10
Pro	10,90	10,85	9	10
Gly	5,81	6 ,20	4	5
Ala	8,62	8,35	7/8	8
Cys	nd	nd	4	5
Vai	14,03	13,96	15	15
Met	4,05	3,99	6	7
Ile	8,31	8,33	9	10
Leu	17,02	16,97	16	19
Tyr	2,86	2,84	3	7
Phe	7,96	7,92	8	8
His	2,11	2,11	2	3
Lys	10,35	11 ,28	12	14
Trp	nd	nd	1	1
Arg	4,93	4,99	5	6
Total	158	158	164/165	193

Peso molecular calculado

Baseado em 158 resíduos provenientes da análise de sequência da proteína (exluindo Cys e Trp).

- 74 2.

Valores teóricos calculados a partir dos dados da sequên cia da proteína (A) ou dos dados da sequência de DNA (B).

3. Baseado na sequência de 1 a 164.

A inclusão de uma quantidade conhecida de um padrão interno na análise da composição em aminoácidos permitiu também a quantificação da proteína presente na amos tra; obteve-se um valor de 0,117 mg/ml para a amostra analisada.

Exemplo 3

Clonagem dos genes para SCF humano e murino

A. Amplificação e sequenciação de fragmentos de cDNA de

SCF murino

A determinação da sequência de aminoácidos de fragmentos de proteína de SCF murino tornou possível conceber oligonucleótidos da sequência mista específica para SCF murino. Utilizaram-se os oligonucleótictos como sondas de hibridação para sondar C.DNA murino e bibliotecas genómicas e como iniciadores para tentar amplificar fracções de cDNA utilizando estratégias de reacção em cadeia de polimerase (PCR) [Mullis et al., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-350]. Sintetizaram-se os oligodesoxinucleótidos pelo método de fosforamidite [Beaucage, et al., Tetrahedron Lett. , 22 (1981); 1859-1862; McBride, etal., Tetrahedron Lett.,24. (1983), 245-248] estas sequências estão representadas na

Figura 12A. As letras A, T, C, G e I representam respecti75 vamente adenina, timidina, citosina, guanina e inosina. 0* da Figura 12A representa oligonucleótidos que contêm sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição . As sequências estão escritas no sentido 5'—>3'Sondaram-se uma biblioteca genómica de rato, uma biblioteca de cDNA de fígado de rato e duas bibliotecas de cDNA de BRL utilizando sondas oligonucleóti32 dicas mistas marcadas com P, 219-21 e 219-22 (Figura 12A), cujas sequências se basearam na sequência de aminoáci_ dos obtida de modo descrito no Exemplo 2. Não se isolaram clones de SCF nestas experiências utilizando métodos convencionais de clonagem de cDNA (Maniatis, et al., Molecular Cloning, 1982,Cold Spring Harbor, pp, 212-246).

Uma via alternativa que resultou no isola mento das sequências de ácido nucleico de SCF envolveu a aplicação de técnicas de PCR. Nesta metodologia, a região de DNA abrangida por dois iniciadores de DNA é amplificada selectivamente in vitro por ciclos múltiplos de replicação catalisados por uma DNA polimerase apropriada, (tal como Taql DNA polimerase) na presença de desoxinucleosidotrifosfatos num termo-ciclisador. A especificidade da amplificação PCR é baseada em dois iniciadores oligonucleotídicos que flanqueiam o segmento de DNA para ser ampli ficado e hibridado para cordões opostos. 0 PCR com especifi cidade lateral dupla para uma dada região de DNA numa mistura complexa foi obtido mediante utilização de dois inicia dores com sequências suficientemente específicas para essa /

.¾ região. 0 PCR com especificidade unilateral utiliza um inicia dor de região específica e um segundo iniciador que pode ini ciar nos sítios alvos presentes em muitas ou em todas as moléculas de DNA de uma dada mistura [Loh et al., Science,

243 (1989) 217-220].

Os produtos de DNA de reacções de amplificações de PCR bem sucedidas são fontes de informação da sequência de DNA. [Gyllensten, Biotechniques, 7 (1989) 700-708] e podem ser utilizados para preparar sondas de hibridação mar cadas que possuem maior comprimento e maior especificidade do que as sondas oligonucleotídicas. Podem também conceber-se produtos de PCR com sequências iniciadoras apropriadas, para serem clonados em sectores plasmídicos que permitem a expressão do produto peptídico codificado.

A estratégia básica para a obtenção da sequência de DNA de cDNA de SCF murino está indicada na figura 13A. As pequenas setas indicam amplificações de PCR e as setas a cheio indicam reacções de sequenciação de DNA. Utilizaram-se PCRs 90.6 e 96.2 juntamente com a sequenciação de DNA para a obtenção de sequência parcial de ácido nucleico para cDNA de SCF murino. Os iniciadores utilizados nestes PCRs foram oligonucleótidos mistos com base na sequência de aminoácidos representada na Figura 11. Utilizando a informação de sequência obtida de PCRs de 90.6 e 96.2, prepararam-se iniciadores de sequência única (224-27 e 224-28, Figura 12A) e utilizaram-se nas amplificações e reacções de sequenciação

subsequentes. 0 DNA que contém a extremidade 5' de cDNA foi obtido em PCRs 90.3, 96.6 e 625.1 utilizando PCR de espe.

cificidade lateral simples. A sequência de DNA adicional perto do terminal C da proteína de SCF obteve-se em PCR 90.4. A sequência de DNA para o restante da região codificadora de cDNA de SCF murino foi obtida a partir de produtos de PCR 630.1, 630.2, 84.1 e 84.2 do modo descrito em seguida na secção C deste Exemplo. As técnicas utilizadas para obtenção de cDNA de SCF murino estão descritas em seguida.

Preparou-se RNA a partir de células BRL tal como é descrito por Okayama et al., [Methods Enzymol.,

154 (1987), 3-28]. Isolou-se Poli A+ RNA utilizando uma coluna de oligo(dT) celulose tal como é descrito por Jacobson em Methods in Enzymology, 152, (1987) 254-261.

Sintetizou-se o primeiro cordão de cDNA usando 1 /Ug de poliA+ RNA de BRL como matriz e (dT)^ -jg como iniciador de acordo com o protocolo fornecido com a enzima MO-MLV-transcriptase inversa (Bethesda Research Laboratories). A degradação da cadeia de RNA realizou-se utilizando NaOH 0,14 M à temperatura de 84^c durante 10 minutos ou a incubação em banho de água em ebulição durante 5 minutos. Para neutrali zar a solução, adicionou-se excesso de acetato de amónio e extraiu-se primeiro o cDNA com fenol/clorofórmio e, em seguida oom clorofórmio/álcool isoanúlico e precipitou-se com etanol. Para tornar possível 0 uso de iniciadores relacionados com oligo(dC) em PCRs com especificidade lateral simples, adicio

- 78 A.

nou-se uma cauda de poli(dG) à extremidade 3’ de uma oliquota de cDNA do primeiro cordão com transferase terminal de timo de vitela (Boéringer Mannheim), tal como foi descrito anteriormente por Deng et al., Methods Enzymol., 100 (1983) 96-103.

Salvo indicação em contrário nas descriões que se seguem, o passo de desnaturação para cada ciclo PCR foi realizado à temperatura de 94-C durante 1 minuto e a elongação foi realizada à temperatura de 72²C durante 3 ou 4 minutos. A temperatura e a duração da circularização foi varia vel de PCR para PCR, representando frequentemente um compromisso baseado nas exigências avaliadas a partir de vários PCRs diferentes realizados simultaneamente. Utilizaram-se tempos de circularização mais longos quando as concentrações de iniciadores se reduziram para diminuir a acumulação de artefactos de iniciador [Watson, Amplifications, 2 (1989) 56]; quando a concentração do produto de PCR foi alta utilizaram-se tempos de circulação menores e concentrações mais altas de iniciador para aumentar o rendimento. Um factor principal para a determinação da temperatura de circularização foi a estimada para a associação iniciador-alvo [Suggs et al., em Developmental Biology Using Purified Genes, eds. Brown, D.D. e Fox, C.F. ), Nova Iorque, (Academic, 1981, pp. 683-693]·

As enzimas utilizadas para as amplificações obtiveram-se em cada um dos três fabricantes: Stratagene, Promega e perkin-Elmer Cetus. Os compostos de reacção utilizados foram sugeridos pelos fabricantres. As amplificações realizaram-se num

termociclizador para DNA Coy Tempcycle ou Perkin-Elmer Cetus.

A amplificação de fragmentos de cDNA de SCF foi analisada habitualmente por electroforese em gel de agarose na presença de brometo de etídio e com visualização por fluorescência das bandas de DNA estimuladas com irradiação ultravioleta. Em alguns casos em que se anteciparam pequenos fragmentos, analisaram-se os produtos de PCR por electroforese em gel de poliaorilamida. Obteve-se a confirmação de que as bandas observadas representavam fragmentos de cDNA de SCF pela observação de bandas de DNA apropriadas após a amplificação subsequente com um ou mais iniciadores internalizados. Obteve-se a confir mação final por sequênciação de desoxi [Sanger et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 74 ( 1977) 5463-5467] do produto de -PCR e com a comparação dos produtos de translacção previstos com a informação da sequência peptídica de SCF.

Nas experiências iniciais PCR, utilizaram-se oligonucleótidos mistos com base na sequência da proteína de SCF [Gould, Proo. Natl.Acad. Sei. USA, 86 (1989) 1934-1938]. Em seguida apresentam-se as descrições das amplificações de PCR utilizadas para a obtenção da informação da sequên cia de DNA para cDNA murino que codifica os aminoácidos de -25 a 162.

Em PCR 90.6 o cDNA de BRL foi amplificado com 4 pmoles de cada um de 222-11 e 223-6 com um volume reaccional de 20 /il. Uma alíquota de PCR 90.6 foi submetida a electroforese em gel de agarose observando-se uma banda com o ./ tamanho aproximadamente igual ao esperado. Um /Ul do produto per 90.6 foi depois amplificado com 20 pmoles de cada um dos iniciadores 222-1 1 e 223-6 em 50 yUl para 15 ciclos de circularização à temperatura de 45-C. Uma porção deste produto foi em seguida submetida a 25 ciclos de amplificação na presença dos iniciadores 222-11 e 219-25 (PCR 96.2) dando uma banda de um único produto principal após electroforese em gel de agarose. A amplificação assimétrica do produto PCR 96.2 com os mesmos dois iniciadores produziu uma matriz que foi sequenciada com êxito. A amplificação selectiva posterior de sequências de SCF no produto de 96.2 foi realizada por amplificação de PCR do produto na presença do iniciador 222-11 e do iniciador 219-21 incluídos. 0 produto deste PCR foi utilizado como uma matriz para amplificação assimétrica e produção de uma sonda rádiomarcada (PCR 2).

Para se isolar a extremidade 5’ de cDNA de SCF murino, utilizaram-se como iniciadores não específicos iniciadores que continham sequências (dC)_n> complementa res das caudas poli(dG) de cDNA. PCR 90.3 continha (10 pmoles) de (dC)^ ^e 223-6 (4 pmoles), como iniciadores e cDNA de BRL como matriz. 0 produto da reacção actuou como um agres gado de peso molecular muito elevado, ficando encerrado na cavidade de carga da electroforese em gel de agarose. Amplificou-se depois 1 /il da solução do produto na presença de 25 pmoles de (dC)^ θ de 10 pmoles de 223-6 com um volume de 25/Ul para 15 ciclos, oiroularizando à temperatura de 45^C.Em seguida amplificou-se 0,5/ul deste produto para 25 ciclos com os iniciadores 219-25 e 201-7 internamente incluindo (PCR 96.6). A sequência de 201-7 está representada na Figura 12C. Não se observaram bandas na electroforese sobre gel de agarose. Realizaram-se outros 25 oiolos de PCR, ciroularizando à temperatura de 40QC, após o que se observou uma banda principal. Realizou-se a mancha de Southern para se observar uma banda de hibridação principal única. Realizaram -se 20 ciclos adicionais de PCR (625.1), circularizando-a à temperatura de 45²C, utilizando o iniciador 201-7 e o iniciador 224-27 incluídos. Realizou-se a sequenciação após am plificação assimétrica por PCR, gerando-se a sequência que se prolongava para além da extremidade amino-putativa da sequên cia codificadora de sinal peptídico de pré-SCF. Esta sequência foi utilizada para designar o iniciador oligonucleotídico 227-29 contendo a extremidade 5’ da região codificadora de cDNA de SCF murino. Do mesmo modo, a sequência de DNA 3' terminando no aminoácido 162 foi obtida por sequenciação de PCR 90.4 (ver Figura 13-A).

B. Clonagem do DNA genómico de factor de células indiferenciadas murino

Prepararam-se sondas de amplificação de PCR de oDNA que codifica SCF murino, tal como se descreve na secção A anterior e utilizaram-se para sondar uma biblioteca contendo sequências genómicas murinas (obtidas nos CLONTECH Laboratories, Inc.; N2s de catálogo RL 1022 j). A biblioteca foi construída no sector EMBL-3SP6/T7 do bacteriófago

Ζ utilizando DNA obtido de um

A biblioteca, como descrita x 10° clones independentes de 16 Kb.

rato Sprague-Dawley macho adulto, pelo fornecedor, continha 2,3 x oom uma inserção de tamanho médio

Utilizaram-se PCRs para gerar sondas marcadas com 32 p na sondagem da biblioteca genómica. Preparou-se a sonda PCR 1 (Figura 13A) numa reacção que continha ³²P[alfa]-dATP 16,7/uM, dCTP 200 /iM, dGTP 200 /iM, dTTP 200 /iM, tampão reaccional fornecido por Perkin Elmer Cetus , Taq polimerase (Perkin Elmer Cetus) a 0,05 unidades/ml, 219-26 0,05 /uM, 223-6 0,05>uM e 1 yi! de matriz 90.1 contendo sítios alvo para os dois iniciadores. A sonda PCR 2 foi preparada utilizando condições reaccionais similares excepto nos iniciadores e na matriz que foram modificados. A sonda PCR 2 foi preparada utilizando 222-11 Ó,5/UM, 219-21

0,05 /uM, e 1 /ul de matriz proveniente de PCR 96.2.

Plaquearam-se aproximadamente 10 bacteriófagos tal como é descrito por Maniatis et al. [Supra (1982)]. Transferiram-se as placas para filtros GeneScreem TM

Plus (22 cm x 22 cm; NEN/DuPont) que foram desnaturados, neutralizados e secos como está descrito num protocolo do fornecedor. Para cada placa foram realizadas duas transferências de filtro.

1M, 1 $ de SCS,

Os filtros foram pré-hibridados em NaCl 0,1 $ de albumina de soro bovino, 0,1 % de ficol, 0,1 $ de polivinilpirrolidona (solução de hibri- 83 tf' ” % dação) durante aproximadamente 16 horas à temperatura de 65-C e conservaram-se á temperatura de -20QC. Transferiram-se os filtros para solução de hibridação recente contendo uma sonda c

PCR 1 marcada com 32 P a 1,2 x 10 cpm/ml e hibridaram-se durante 14 horas à temperatura de 65²C. Lavaram-se os filtros com cloreto de sódio 0,9 M, citrato de sódio 0,09 M,

0,1 % de SDS, pH 7,2 (solução de lavagem) durante 2 horas à temperatura ambiente, seguindo-se uma segunda lavagem com solução de lavagem recente durante 30 minutos à temperatura de 65²C. Os clones bacteriofágicos das áreas das placas que cor respondiam às manchas radioactivas dos auto-radiogramas foram retiradas das placas e novamente sondadas com sondas PCR 1 e

PCR 2.

DNA dos clones positivos foi digerido com endonucleases de restrição BamHI, Sphl ou SstI e os fragmentos resultantes foram subclonados em pUC119 e em seguida sequenciados. A estratégia de sequenciação para DNA de SCF genómico murino está esquematicamente representada na Figura 14A. Nesta Figura, a linha superior representa a região de DNA genómico murino que codifica SCF. As interrupções nessa linha, indicam as regiões que não foram sequencia das. As caixas a cheio representam exons para regiões codificadoras do gene de SCF com os aminoácidos correspondentes indicados na parte superior de cada caixa. As setas representam as regiões individuais que foram sequenciadas e uti lizadas para reunir a sequência de consenso para o gene de SCF murino. A sequência para o gene de SCF murino está repre.

sentada na Figura 14B.

Utilizando a sonda PCR 1 para sondar a biblioteca genómioa murina, isolaram-se os clones correspondentes às exons que codificam os aminoácidos de 19 a 176 de SCF. Para se obterem os clones das exons a montante da região codificadora para o aminoácido 19, sondou-se a biblioteca utilizando a sonda oligonucleotídica 228-30. Pré-hibridou-se do modo descrito anteriormente o mesmo conjunto de filtros usados previamente com a sonda PCR 1 e hibridou-se numa solução de hibridação contendo a sonda oligonucleotídica 228-30 marcada com ^P (0,03 picomole/ml) à temperatura de 502C durante 16 horas. Lavaram-se os filtros com solução de lava gem à temperatura ambiente durante 30 minutos seguida de uma segunda lavagem em solução de lavagem recente à temperatura de 45²C durante 15 minutos. Retiraram-se das placas os clones bacteriofágicos destas áreas das placas, correspondendo a manchas radioactivas presentes nos autoradiogramas e sondaram-se novamente com a sonda 228-30. Digeriu-se o DNA dos clones positivos com endonucleases de restrição e subclonou-se do mesmo modo que anteriormente. Utilizando a sonda 228-30, obtiveram-se os clones correspondentes á exon codificadora dos aminoácidos -20 a 18.

Fizeram-se diversas tentativas para isolar os clones correspondentes à(s) exon(s) contendo a região 5’ não traduzida e a região codificadora para os aminoácidos -25 a -21. Não foram isolados os clones desta região do gene de

SCF murino.

c. Clonagem de cDNA murino para a expressão em células de mamífero

Delinearam-se sistemas de expressão em células de mamífero para determinar se um produto polipeptídico activo de SCF murino podia ser expresso e segregado por células de mamíferos. Conceberam-se os sistemas de expressão para exprimir versões truncadas de SCF murino (SCF, e

-1 b2 ^SCF1_164^ ^{e uma} P^r°teína (SCF^gg) prevista a partir da tradução da sequência do gene representada na Figura 14C.

vector de expressão utilizado nestes estudos foi um vector de vai-e-vem (shuttle contendo as sequências de pUC 119 , SV40 e HTLVI. 0 vector foi concebido para permitir a replicação autónoma em células de E.coUt e em células de mamífero e para exprimir o DNA exógeno inserido sob o controlo de sequências de DNA virai. Este vector, desig nado por V19.8, ancorado em E. coli DH5, está depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rookville, Md. (com ο N2 de ATCC 68124). Este vector é um vec. tor derivado de pSVDM 19 descrito por Souza na patente de invenção norte-americana, 4 810 643 incluída aqui como referência .

cDNA para SCF^ murino foi inserido no veotor plasmídico V19·8. A sequência de cDNA está representada na Figura 14C. 0 cDNA que se utilizou nesta construção foi sintetizado nas reacções de PCR 630.1 e 630.2 tal como se representa na Figura 13A. Estes PCRs representam amplificações independentes e utilizaram os iniciadores oligonucleotídicos sintéticos 227-29 e 227-30. A sequência para estes iniciadores foi obtida de cDNA gerado por PCR tal como se descreve na secção A deste Exemplo. As misturas reaccionais, com um volume de 50 ul, consistiram num tampão de reacção, (de um conjunto Perkin Elmer Cetus), dATP 250/uM, dCTP 250 /uM, dGTP 250 >uM e dTTP 250 uM e 200 ng de cDNA iniciado com oligo(dT), 1 picomole de 227-29, 1 pioomole de

227-30 e 2,5 unidades de Taq polimerase (Perkin Elmer Cetus). 0 cDNA foi amplificado durante 10 ciclos utilizando-se uma tem peratura de desnaturação de 942C durante 1 minuto e uma temperatura de circularização de 37-C durante 2 minutos e uma tempe ratura de elongação de 72SC durante 1 minuto. Após ..estas fases iniciais para a amplificação de PCR, adicionaram-se a cada uma das misturas reaccionais 10 picomoles de 227-29 e 10 picomoles de 227-30. Continuaram-se as amplificações durante 30 ciclos sob as mesmas condições, com excepção de que a temperatura de- circularização foi modificada para 55²C.0s produtos do PCR foram digeridos com as endonucleases de restrição Hind III e SstII. Digeriu-se de'^Aum modo similar V19.8 com Hind III e Sst II e num caso o vector plasmídico digerido foi tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitela; em outros casos, o grande fragmento da digestão foi isolado em gel de agarose. Ligou-se o cDNA a V19.8 por meio de T4 poli, nucleótido-ligase. Transferiram-se os produtos de ligação para a estirpe de E. coli DH5 competente do modo descrito por

Okayama, et al., supra (1987). 0 DNA preparado de clones bac

- 87 V* %

terianos individuais foi sequenciado pelo método de didesoxi de Sanger. A Figura 17 representa uma construção de V19.8 SCF. Estes plasmídicos foram utilizados para transfectar célu las de mamífero, tal como se descreve nos Exemplos 4 e 5.

Construiu-se o vector de expressão para SCF^ murino aplicando uma estratégia similar à utilizada para SCF^ na qual se sintetizou o oDNA utilizando a amplificação de PCR e se inseriu subsequentemente em V19-8.

cDNA utilizado nas construções foi sintetizado nas amplificações PCR com V19-8 contendo cDNA de SCF^ como matriz (V19.8 : SCF^ ig₂/ ²²7-29 como o iniciador para a extremidade 5’ do gene 2 237-19 como iniciador para a extremidade 3’ do gene. As misturas reaccionais duplicadas (50/Ul) conti nham 1 x tampão de reacção, 250/uM de cada um deçATP, dCTP, dGTP e dTTP, 2,5 unidades de Taq polimerase, 20 ng de V19«8:

: SCF^ e 20 picomoles de cada iniciador. Amplificou-se o cDNA durante 35 ciclos utilizando uma temperatura de desnaturação de 942c durante 1 minuto, uma temperatura de circula rização de 55²C durante 2 minutos e uma temperatura de elon gação de 722C durante 2 minutos. Digeriram-se os produtos das amplificações com as endonucleases de restrição Hind III e SstII e inseriram-se em V19.8. 0 vector resultante continha a região codificadora para os aminoácidos de -25 a 164 de SCF seguida de 1 oodão de terminação.

cDNA para uma forma de SCF murino contendo 193 aminoácidos , (SCF^ murino previsto a partir da tradução da sequência de DNA representada na Figura 14C) foi também inserido no vector plasmídico VI9-8 aplicando um protocolo similar ao utilizado para o SCF^^^ murino. 0 cDNA que se utilizou nesta construção foi sintetizado nas reacções PCR 84.1 e 84.2 (Figura 13A) utilizando oligonucleótidos 227-29 θ 230-25· As duas reacções representam amplificações independentes com início em preparações de RNA diferentes. A sequência para 227-29 foi obtida através das reacções de PCR do modo descrito na secção A deste Exemplo e a sequência para o iniciador 230-25 foi obtida a partir de DNA genónimo de rato (Figura 14B). As misturas reaccionais, com um volume de 50>1x1, eram constituídas per 1x tampão de reacção (de um conjunto Perkin Elmer Cetus), dATP 250/iM, dCTP 250 >uM, dGTP 250 >uM e dTTP 250 JUM, 200 ng de cDNA iniciatdor oligo (dT), 10 picomoles de 227-29, 10 picomoles de 230-25 e 2,5 unidades de

Taq polimerase (Perkin Elmer Cetus). Amplificou-se o cDNA durante 5 ciclos utilizando uma temperatura de desnaturação de 942c durante 1,5 minutos, uma temperatura de circularização de 502C durante 2 minutos e uma temperatura de elongação de 72-C durante 2 minutos. Após estas fases iniciais, as amplificações continuaram por mais 35 ciclos sob as mesmas condições , com excepção da temperatura da circularização que foi alterada para 602C. Digeriram-se os produtos da amplificação de PCR com as endonucleases de restrição HindIII e SsTII. Digeriu-se o DNA do vector V19-8 com HindIII e SsTII e isolou-se do gel de agarose o fragmento grande proveniente da digestão. Ligou-se o cDNA a V19.8 por meio de T4 polinucleó tido-ligase. Transformaram-se os produtos de ligação na estirpe DH5 competente de E. coli e sequenciou-se o DNA prepa rado a partir de clones bacterianos individuais. Utilizaram-se estes plasmídeos para transfectar as células de mamífero descritas no Exemplo 4.

D. Amplificação e sequenciação de produtos PCR de cDNA de

SCF humano

Obteve-se cDNA de SCF humano a partir de uma linha de células hepatoma HepG2 (ATCC HB 8065) utilizando a amplificação de PCR do modo descrito na Figura 13B.A estratégia básica consistiu em ampliar cDNA humano por PCR com iniciadores cuja sequência se obteve a partir de cDNA de

SCF murino.

Preparou-se RNA do modo descrito por Maniatis et al., [supra ( 1982)]. Preparou-se poliA+RNA utili. zando oligo dT celulose, seguindo-se as directivas dos fornecedores [Collaborative Research Inc.).

Preparou-se cDNA do primeiro cordão do modo descrito anteriormente para cDNA de BRL, com a diferença de se ter iniciado a síntese com oligonucleótido 228-28 2 /UM tal como se representa na Figura 12C, que contém uma sequência aleatória curta na extremidade de 3’ ligada a uma sequência única mais longa. A porção da sequência única de 228-28 proporciona um sítio alvo para a amplificação por PCR com o iniciador 228-29 como iniciador não específico. As

- 90 sequências de cDNA humano relacionadas com pelo menos parte das sequências de SCF murino foram ampliadas a partir de cDNA de HepG2 por PCR utilizando os iniciadores 227-29 e 228-29 (PCR 22.7, ver a Figura 13B; 15 ciclos de circularização à temperatura de 60^C seguidos de 15 ciclos de circula rização à temperatura de 55²C). A electroforese em gel de agarose revelou bandas indistintas, somente uma mancha de DNA aparentemente dimensionada de forma heterogénea. Tentou-se a amplificação preferencial posterior das sequências inti mamente relacionadas com cDNA de SCF murino, pela realização de PCR com 1 /il do produto PCR 22.7 utilizando os iniciadores 222-11 e 228-29 de SCF murino internalizados (PCR 24.3;

ciclos de circularização à temperatura de 55²C). De novo apenas se observou nos geles de agarose uma mancha heterogénea do produto de DNA. A amplificação específica lateral dupla dos produtos PCR 24.3 com os iniciadores 222-11 e 227-30 (PCR 25.10; 20 ciclos) deu origem a uma banda do produto prin cipal única de tamanho igual ao produto de PCR de cDNA de SCF murino correspondente. A sequenciação de DNA do produto de PCR assimétrico (PCR 33·1) utilizando como iniciador de sequen ciação o 224-24 deu cerca de 70 bases de sequências de SCF humano.

Do mesmo modo, a amplificação de 1 ul do produto PCR 22.7, primeiro com os iniciadores 224-25 e 228-29 (PCR 24.7, 20 ciclos) e depois com os iniciadores 224-25 e 227-30 (PCR 41.1), gerou uma banda principal com o mesmo /' /

tamanho que o produto de SCF murino correspondente, e após amplificação assimétrica (PCR 42.3) deu uma sequência que tinha maior homologia com a sequência de SCF murino do que obtida quando se utilizou o iniciador de sequenciação 224-24. Sinteti zaram-se os oligodesoxinucleótidos de sequência única alvejados no cDNA de SCF humano, representando-se as suas sequências na Figura 12B.

Para se obter a correspondente humana da sequência codificadora gerada por PCR de SCF murino, que se utilizou nos estudos de expressão e de actividade, preparou-se um PCR com os iniciadores 227-29 e 227-30 em 1 yul do produto PCR 22,7 com um volume reaccional de 50 /Ul (PCR 39-1). A amplificação foi realizada mn GjyCThnpcycler. Devido ao desconhecimento do grau de desigualdade entre cDNA de SCF humano e o iniciador 227-30 único de SCF murino, utilizaram-se condições de circularização pouco severas 37-C nos primeiros três ciclos; em seguida a circularização continuou à temperatura de 55^SC. Surgiu uma banda principal oom o mesmo tamanho (cerca de 590 pb) que a homóloga murina e foi depois ampliada por diluição de uma porção pequena do produto PCR 39,1 e PCR com os mesmos iniciadores (PCR 41.1). Dado que se observou mais de uma banda nos produtos de PCR 41.1, obteve-se mais PCR com os iniciadores internalizados para se determinar pelo menos uma porção da sua sequência antes da clonagem. Após 23 ciclos do PCR com os iniciadores 231-27 e 227-29 (PCR 51.2), apareceu uma banda única, intensa. Os PCRs assimétricos com os iniciadores 227-29 e 231-27 e sequenciação confirmaram a presença das sequências de cDNA de SCF humano. Realizou-se a clonagem de DNA de SCF PCR 41.1 no veotor de expressão V19.8 do modo descrito anteriormente para os fragmentos PCR 1-162 de SCF murino, na see ção C anterior. Sequenciou-se 0 DNA de clones bacterianos individuais pelo método didesoxi de Sanger.

E. Clonagem de DNA genómico de faotor de oélulas indiferenciadas humano

Utilizou-se uma sonda PCR 7 preparada pela amplificação de PCR de cDNA (Figura 13B), para sondar uma biblioteca contendo sequências genómicas humanas. Utili zou-se uma ribossonda complementar de uma porção de cDNA de SCF humano, ver a seguir, para voltar a sondar placas positi_ vas. Preparou-se a sonda PCR 7 começando com o produto de PCR 41.1 (ver Figura 13B). Amplificou-se depois o produto de PCR 41.1 com os iniciadores 227-29 e 227-30. Eluiu-se o fragmento com 590 pb resultante a partir de um gel de agarose e amplificou-se novamente com os mesmos iniciadores (PCR 58.1). Diluiu-se 1000 vezes o produto de PCR 58.1 num meio reaccional de 50/íl contendo 10 pmoles de 233-13 e amplificou-se durante 10 ciclos. Após a adição de 10 pmoles de 227-30 ao meio reaccional, continuou-se 0 PCR durante mais 80 pmoles de 233—13, aumentando o volume reaccional para 90 /il e continuou-se 0 PCR durante 15 ciclos. Diluiram-se os produtos da reacção 200 vezes num meio reaccional de 50 ,ul,adicionaram-se 20 pmoles de 231 e 20 pmoles de 233-13 e completou-se o PCR durante mais 35 ciclos, utilizando uma tempe/

-93-/ ratura de circularização de 482C na reacção de 96.1. Para se 32 produzir PCR7 marcado com P utilizaram-se condições reac. cionais similares às usadas na preparação de PCR 1 com as excepções seguintes: num volume reaccional de 50/ul, diluiu -se PCR 96.1 100 vezes; utilizaram-se 5 pmoles de 231-27 como único iniciador; e efeotuaram-se 45 ciclos de PCR com desnaturação à temperatura de 94^C durante 1 minuto, circularização à temperatura de 48^C durante 2 minutos e elongação à temperatura de 72^QC durante 2 minutos. A ribossonda, ribos32 sonda 1, era um RNA de cadeia simples marcado com P complementar dos nucleótidos 2-436 da sequência de DNA de SCF humano apresentada na Figura 15B. Para a construção do vector para a produção desta sonda, digeriu-se DNA do produto PCR 41.1 (Figura 13B) com HindIII e EcoRI e clonou-se num poliadaptador do vector plasmídico pGEM3 (Promega, Madison, Wisconsin). Em seguida, linearizou-se o DNA plasmídico de pGEM3 : hSCF recombinante por digestão com HindIII. Prepa32 rou-se a ribossonda 1 marcada com Pa partir do DNA pias mídico linearizado por transcrição de competição (runoff”) com T7 RNA polimerase de acordo com as instruções fornecidas pela Promega. 0 meio reaccional (3 /ul) continha 250 ng de DNA plasmídico linearizado e 20 uM de fp-rCTP (catálogo N2 NEG-008 H, New England Nuclear (NEN)) sem CTP adicional não marcado).

Obteve-se a blibioteca genómica humana na Stratagene (La Jolla, CA; N2 de catálogo 946 203)· A biblio teca foi construida no vector FixII do bacteriófago Lambda

- 94 de macho pelo for tamanho utilizando DNA preparado a partir de uma placenta Caucasiano. A biblioteca, tal como é caracterizada g

necedor, continha 2 x 10 placas primárias com um de inserção médio superior a 15 Kb. Plaquearam-se aproximada g

mente 10 baoteriófagos do modo descrito por Maniatis, et al., [supra (1982)]. Transferiram-se as placas para filtros TM 2

Gene Screen Plus (22 cm ; NEN/DuPont) de acordo com o pro tocolo do fornecedor. Realizaram-se para cada placa transferências de dois filtros.

Os filtros foram pré-hibridados em 6 x x SSC NaCl 0,9 M, citrato de sódio 0,09 M, pH 7,5), 1 % de

SDS, à temperatura de 60^0. Hib;ridaram-se os filtros em 6x x SSC recente, solução SDS a 1 % contendo a sonda de PCR7 32 5 marcada com P, a 2 x 10 cpm/ml e hibridaram-se durante 20 horas à temperatura de 622C. Lavaram-se os filtros com 6 x SSC, SDS a 1 % durante 16 horas à temperatura de 622C. Retirou-se uma porção bacteriofágica da área de uma placa que correspondia às manchas radioactivas do auto-radiograma e son dou-se novamente com a sonda PCR 7 e a ribossonda 1. A son dagem com a sonda PCR 7 foi realizada sob condições similares às da sondagem inicial. A segunda sondagem com a ribossonda 1 foi realizada do seguinte modo: pré-hibridaram-se os filtros em 6 x SSC, SDS a 1 jS e hibridaram-se à temperatura de 622C durante 18 horas em NaPO^ 0,25 M (pH 7,5),NaCl 0,25 M EDTA 0,001 M, formamida a. 15 %, SDS a 7 $ e ribossong da a 1 x 10 cpm/ml. Lavaram-se os filtros em 6 x SSC, SDS a 1 % durante 30 minutos à temperatura de 622C seguido por 1 x /' /, χ SSC, SDS a 1 $ durante 30 minutos à temperatura de 622C. Digeriu-se o DNA de clones positivos com as endonucleases Bam Hl, Sphl ou SstI e subclonaram-se os fragmentos resultantes em pUC 119 e, em seguida, sequenciou-se.

Utilizando a sonda PCR 7, obteve-se um clone que incluia as exons que codificam os aminoácidos 40 a 176 e depositou-se este clone na ATCC (com ο N2 de depósito 40 681). Para se obterem clones de outras zxons de SCF,sondou-se a biblioteca genómica humana com a ribossonda 2 e e sonda oligonucleotídica 235-29· Sondou-se a biblioteca de um modo similar ao anterior, com as excepções seguintes: a hibri dação com a sonda 235-29 realizou-se à temperatura de 372c e as lavagens durante esta hibridação foram de 1 hora à temperatura de 37²C e 1 hora à temperatura de 442C. Voltaram a sondar-se os clones positivos com a ribossonda 2, ribossonda 3 e as sondas oligonucleotídieas 235-29 e 236-31. Prepararam-se as ribossondas 2 e 3 de acordo com um protocolo similar ao uti lizado para a obtenção da ribossonda 1, com as excepções seguintes: (a) linearizou-se o DNA plasmídico pGEM3 : hSCF recombinante com as endonucleases de restrição PvuII (ribossonda 2) ou PstI (ribossonda 3) e (b) utilizou-se a SP6 RNA polimerase para a síntese da ribossonda 3 (Promega).

A Figura 15 A mostra a estratégia seguida para sequeneiar 0 DNA genómico hiimro.Ifesta figura, a linha de cima representa a região de DNA genómico humano que codifica SCF. As interrupções nessa linha indicam as regiões que não foram sequen

- 96 ciadas. As caixas a cheio representam exons codificadoras de regiões do gene de SCF com os correspondentes aminoácidos codificados por cima de cada caixa. A sequência do gene de SCF humana está representada na Figura 15B. A sequência de cDNA de SCF humano obtida por técnicas PCR está representada na Figura 15C.

F. Sequência de cDNA da região 5* de SCF humano

A sequenciação de produtos de PCRs iniciados por dois iniciadores específicos do gene revela a sequência da região ligada pelas extremidades 3’ dos dois iniciadores. Os PCRs de lado único, tal como se indica no Exemplo 3A, podem fornecer a sequências das regiões flanqueadoras.Utilizou-se PCR do lado único para prolongar a sequência da região 5’ não traduzida de cDNA de SCF humano.

Preparou-se cDNA de primeira cadeia a partir de poliA + RNA proveniente da linha de células 5637 de carcinoma de bexiga humana (ATCC HTB9) utilizando o oligonucleótido 228-28 (Figura 12C) como iniciador, tal como se des creve no Exemplo 3D. Acrescentando (tailing) este cDNA com resíduos dG, seguido de amplificação de PCR de uma cadeia, utilizando iniciadores contendo sequências (dC) em associação com iniciadores específicos de SCF, não se conseguiu a obtenção de fragmentos de cDNA prolongando-se a montante (5 ’ ) da sequência conhecida.

Obteve-se uma pequena quantidade da infor mação a partir da amplificação PCR de produtos da síntese da

segunda cadeia iniciada pelo oligonucleótido 228-28. 0 cDNA de primeira cadeia 5637 não acrescentado (untailed) descrito anteriormente (cerca de 50 ng) e 2 pmoles de 228-28 foram incubadas com polimerase de Klenow e 0,5 mM de cada dATP, dCTP e dGTP e dTTP a uma temperatura compreendida entre 10² - 12^C durante 30 minutos em 10 /il de 1 x tampão de radiomarcação (nick-translation) [Maniatis et al. , Molecular Cloning, a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]. A amplificação do cDNA resultante por PCRs de um lado sequenciais com o iniciador 228-29 associado aos iniciadores de SCF incorporados (com a seguinte ordem de utilização: 235 -30, 233-14, 236-31 e finalmente 235-29) originou misturas de um produto complexo que se apresentou como manchas (smears) sobre os geles de agarose.

enriquecimento significativo dos frag mentos de cDNA relacionados com SCF foi indicado pela crescente intensidade da banda específica do produto que se obser vou quando volumes comparáveis deprodutos de PCR de uma espé cie foram ampliados com dois iniciadores de SCF (227-29 e 235-29, por exemplo, dando um produto com cerca de 150 pb).

As tentativas para seleccionar produtos dentro de um dado in tervalo de tamanhos por remoção das partes das manchas (smears) do gel de agarose e reampliação por PCR, falharam na maioria dos casos em fornecer bem definida contendo as sequências relacionada com SCF.

Uma reacção, PCR 16.17, que continha ape nas o iniciador 235-29, originou uma banda que aparentemente

- 98 Ζ’ a

surgiu da iniciação por 235-29 num sítio 5' desconhecido da região codificadora além do sítio esperado, tal como demonstra por cartografia com as enzimas de restrição PvuII e PstI e análise PCR com iniciadores incorporados. Este produto foi purificado por gel e reampliado com o iniciador 235-29 e tentada a sequenciação pelo método didesoxi de Sanger utilizando o iniciador 228-30 marcado com P. A sequencia resultante constituiu a base para projectar o oligonucleótido 254-9 (Figura 12-B). Quando este iniciador dirigido de 3’ foi utilizado em PCRs subsequentes em associação com os iniciadores de SCF dirigidos de 5’, obtiveram-se bandas com o tamanho esperado. A sequenciação de Sanger directa destes pro dutos PCR deu os nucleótidos 180 a 204 de uma sequência de cDNA de SCF humano, Figura 15C.

Com o objectivo de obter mais sequência na extremidade 5’ de cDNA de SCF humano preparou-se cDNA de primeira cadeia a partir de poliA + RNA de 5637 (cerca de 300 ng) utilizando um iniciador específico de SCF (2 pmoles de 233-14) num meio reaccionalde 16 /il contendo 0,2 unidades de MMLV transcriptase inversa (adquirida nos BRL) e 500 /jM de dNTP. Após extracções convencionais com fenol-clorofórmio e com clorofórmio e passos de precipitação com etanol (a partir de acetato de amónio 1 M), ressuspenderam-se os ácidos nucleicos em 20 /j1 de água, colocaram-se num banho de água em ebulição durante 5 minutos e, em seguida, arrefeceram-se e acrescentaram-se (tailed) com transferase terminal na pre99 -

sença de dATP 8 juM num tampão contendo cloreto de cobalto [Deng e Wu Methods in Enzymology, 100 96-103]· Purificou-se o produto, cDNA de primeira cadeia acrescentado (tailedⁿ) com (dA) , por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol e ressuspendeu-se em 20 jaI de Tris 10 mM, pH 8,0 e EDTA 1 mM.

enriquecimento e ampliação de fragmentos da extremidade 5’ de cDNA relacionado com SCF humano de cerca de 20 ng de cDNA de 5637 acrescentado (tailed”) com (dA) foi realizado do seguinte modo: efectuaram-se 26 ciclos iniciais de PCR de um lado na presença de um iniciador 236-31 específico de SCF e um iniciador ou uma mistura de iniciadores contendo sequências (dT) na ou perto da extremidade 3’, por exemplo o iniciador 221-12 ou ‘uma mistura dos iniciadores 220-3, 220-7 e 220-11 (Figura 12C).

Os produtos (1 destes PCRs foram, em seguida, ampliados num segundo conjunto de PCRs contendo 'os iniciadores 221—

-12 e 235-29· Observou-se uma banda do produto principal com aproximadamente 370 pb em oada caso, após a análise do gel de agarose. Uma porção (plug) do gel contendo parte desta banda foi retirada deste com uma pipeta Pasteur e transferida para um pequeno tubo de microcentrífuga. Adicionaram-se 10 μΐ de água e fundiu-se a referida porção num bloco de aquecimento á temperatura de 842C. Um PCR contendo os iniciadores 221-12 e 235-29 (8 pmoles de cada) em 40 /:1 foi inoculado com 2 /:1 da porção de gel diluída e fundida. Após 15 ciclos, era visível uma banda ligeiramente difusa com

100

aproximadamente 370 pb após a análise do gel de agarose. Realizaram-se PCRs assimétricos para se gerar matrizes de sequenciação de cadeia de topo e da base; para cada reacção, 4 /il do produto reaccioanl PCR e 40 pmoles do iniciador 221-12 ou do 235-29, num volume reaccional total de 100/ul, foram submetidos a 25 ciclos de PCR (1 minuto, 95²C; 30 segundos, 55²C; 40 segundos, 722C) , A sequenciação directa das misturas do produto PCR iniciadas com 221-12 (após extrao.

ções convencionais e precipitação com etanol) com o iniciador 3?

262-13 maroada com P ( Figura 12B) deu a sequencia 5' dos nucleótidos 1 a 179 (Figura 15C).

6. Amplificação e sequenciação de DNA genómico humano no sítio da primeira exon codificadora do factor de células indiferenciadas

A sondagem de uma biblioteca genómica humana can-sondas oligonucleotídicas de SCF não permitiu a reve lação de clones contendo a porção conhecida da primeira exon codificadora. Em seguida, iniciou-se uma tentativa para uti. lizar uma técnica PCR de um lado, para amplificar e clonar sequências genómicas circundando esta exon.

A extensão do iniciador de DNA de placenta humana desnaturado pelo calor (adquirido à Sigma)foi realizada com -DNA polimerase I (enzimas de Klenow, fragmento grande; Boecheringer-Mannheim) utilizando um iniciador não SCF, tal como 228-28 ou 221-11 sob condições não restritas

101 (baixa temperatura), por exemplo, 122C, para favorecer a iniciação de um grande número de sítios diferentes. Em seguida, diluiu-se cada meio reaccional cinco vezes com tampão de TagI DNA polimerase contendo Taql polimerase e 100 yaM de cada dNTP edeixou-se processar a elongação das cadeias de DNA à temperatura de 722C durante 10 minutos. Em seguida enriqueceu-se o produto nas sequências da primeira exon de factor de células indiferenciadas por PCP na presença de uma primeira exon oligo nucleotídica de SCF (tal como 254-9) e do iniciador não SCF apropriado (228-29 ou 221-11). A electroforese em gel de aga rose revelou que estes produtos na sua maioria eram pequenos (menos de 300 pb). Para enriquecer em espécies mais longas, a porção da faixa do gel de agarose correspondendo a um comprimento superior a 300 pb foi retirada e eluída por electroforese. Após precipitação com etanol e ressuspensão em água, os produtos PCR purificados pelo gel foram clonados em um derivado de pGEM4 contendo um sítio de Sfil sob a forma de um fragmento HindIII para Sfil.

As colónias foram sondadas com uma primeira exon oligonucleotídica de SCF marcada com ^J P. Foram identificadas várias colónias positivas e obtidas as sequên cias das inserções pelo método de Sanger. A sequência resul. tante, que se prolongava a jusante da primeira exon até uma primeira exon-intron de consenso limite da intron vizinha, está representada na Figura 15B.

- 102

H. Amplificação e sequenciação das regiões codificadoras de cDNA de SCF de murganho, macaco e cão

Preparou-se cDNA de primeira cadeia a partir de RNA total ou de poliA⁺RNA de fígado de macaco (adquirida a Clontech) e proveniente das linhas de células NIH-3T3 (murganho, ATCC CRL 1658) e Dl 7 (cão, ATCC CCL 183). 0 iniciador utilizado na síntese de cDNA de primeira cadeia foi o iniciador não específico 228-28 ou um iniciador de SCF (227-30, 237-19, 237-20, 230-253 ou 241-6. A amplificação do PCR com o iniciador 227-29 e com um dos iniciadores 227-30, 237-19 ou 237-20 forneceu un fragmento do tamanho esperado que foi sequenciado directamente ou após clonagem em V19.8 ou num vector pGEM.

Obtiveram-se sequências adicionais perto da extremidade 5’ de cDNAs de SCF a partir de amplifi cações PCR utilizando um iniciador específico de SCF em associação com 254-9 ou com 228-29· Obtiveram-se outras sequências da extremidade 3’ das regiões codificadoras de SCF após amplificação PCR decDNA iniciado com 230-25 (no caso do murganho) ou com cDNA iniciado com 241-6 (no caso do macaco) ou com 230-25 ou 241-6, conforme apropriado, e com um iniciador de SCF dirigido para 3’. Não se obtiveram bandas do produto PCR de SCF em tentativas similares para amplificar cDNA de D17. Utilizou-se o iniciador não especí fico 228-28 para iniciar a síntese da primeira cadeia a par tir de RNA total de D17 e enriqueceu-se a mistura do produto

103 complexo resultante nas sequências relacionadas com SCF por PCR com iniciadores de SCF dirigidos para 3’, tais como 227-29 ou 225-31 em associação com 228-29· Cortou-se a mistura do produto em Sfil e clonou-se em um derivado de pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin) contendo um sítio Sfil como um Sfil para um fragmento de extremidade tornada coincidente. Sondou-se a biblioteca heterogénea resultante com 237-20 radiomarcado e sequenciaram-se diversos clones positivos obtendo-se as sequências da extremidade 3’ de SCF de cão. As sequências de aminoácidos alinhados de ser humano (Figura 42), de macaco, oão, murganho e das proteínas maduras de SCF de rato estão representadas na Figura 16.

As sequências de aminoácidos conhecidas têm grande homologia ao longo da maior parte do seu com primento. As sequências peptídicas de sinal de consenso idênticas estão presentes nas regiões codificadoras de todas as cinco espécies. 0 aminoácido esperado como sendo do termi nal amino da proteína madura por analogia com SCF murino é designado pelo N2 1 nesta Figura. A sequência de cDNA de cão contém uma ambiguidade que resulta em uma ambiguidade de valina/leucina na sequência de aminoácidos do codão 129.

As sequências de aminoácidos de murganho, rato, macaco e humana co-alinharam sem quaisquer inserções ou delacções. A sequência de cão apresentava um único resíduo na posição 130 quando comparada com as outras espécies. As sequências humanas e de macaco diferiam apenas numa posição, uma subs104

tituição conservativa de valina (humana) por alanina (maoaco) na posição 130- A sequência de SCF prevista imediatamente antes e após o sítio de processamento putativo próximo do resíduo 164 é grardsmente conservada entre as espécies.

Exemplo 4

Expressão de SCF murino recombinante em células COS-1

Para a expressão/transitória em células COS-1 (ATCC CRL 1650), o vector V19-8 (Exemplo 30) contendo os genes murinos SCF^ ^₂ ^{e SCF}-| 193 foi transfectado para placas de 60 mm em duplicado [Wigler et al., Cell, 14 (1978) 725-731· Na Figura 17 mostra-se 0 plasmídeo V19.6

SCF. Como controlo, também 0 plasmídeo V19-8 SCF. Como con trolo, também se transfectou o vector sem a inserção. Sobre nadantes de cultura de tecidos foram recolhidos em diversos momentos após a transfecção e analisados para determinação da actividade biológica. 0 quadro 4 resume os resultados do ensaio biológico de HPP-CFC e o Quadro 5 resume resultados da absorção de MC/9 H-timidina de experiências de transfecção típicas. Os resultados de bioensaio nos sobrenadantes de células COS-1 transfectadas com os plasmídeos seguintes estão representados nos Quadros 4 e 5: uma forma C-terminalmente truncada de SCF murino com 0 terminal C no aminoáoido da posi ção 162 (V19.8 SCFmurino), SCF^ contendo um ácido glutâmico na posição 81 [V19-8 SCF^ murino (Glu

81)] e SCF^ ^₂ contendo uma alanina na posição 19ÍV19-8 /

- 105-.

^SCF1-1 62 murino (Ala 19)]. As substituições de aminoácidos foram o produto de reacções PCR realizadas na amplificação de SCF.J ^2 murino de modo indicado no Exemplo 3· Sequencia ram-se clones individuais de V19.8 SCF. murino e veri1-162 ficou-se que dois clones continham substituições de aminoácidos. Como se pode observar nos Q.uadros 4 e 5 o SCF murino recombinante é activo no biensaio utilizado para a purificação de SCF de mamífero natural, no Exemplo 1.

Quadro 4

Ensaio HPP-CFC de sobrenadantes de células COS-1 transfeotadas oom DNA de SCF murino

Volume de N£ de colónias/

Amostra	CM analisado (,ul)	/200.000 célulasó
V19.8 (sem	100	0
inserção)	50	0
	25	0
	12	0
V19.8 murino	100	7 50
SCF1-164	50	7 50
	25	7 50
	12	750
	6	30
	3	8
V19-8 murino	S'CF1-162 100	26
(G1u81)	• 50	10

106

Quadro 4 (cont.)

Amostra

Volume de CM analisado (ul)

N° de colónias/ /200.000 células

2

0

V19.8 murino SCF^ ^₂ 100 (Ala19) 50

Quadro 5

Ensaio de incorporação de H-Timidina MC/9 de sobrenadantes de células COS-1 transfectadas com

DNA de SCF murino

Amostra	Volume de CM analisado (>ul)	cpm
v19.8 (não inserido)	25	1 936
	12	2 252
	6	2 182
	3	1 682
v19.8 SCF1_162	25	11 648
	12	11 322
	6	11 482
	3	9 638

107

Quadro 5 (oont.)

Amostra	Volume de
CM analisado Çul)	cpm
V19.8 SCF1_162	25	6 220
(G1u81)	12	5 384
	6	3 692
	3	1 980
V19.8 SCF1_162	25	8 396
(Ala19)	12	6 646
	.6	4 566
	3	3 182

Ensaiaram-se individualmente o SCF de rato recombinante e outros factores em um ensaio de CFU-GM (Broxmeyer et al., supra (1977)] que avalia a proliferação de célu las de medula óssea normais, apresentando-se os resultados no Quadro 6. No Quadro 6'também estão indicados os resultados dos sobrenadantes COS-1 provenientes de culturas de 4 dias após a transfecção com V19-8 de SCF^ em associação com outros factores. Os valores das colónias são as médias de culturas em triplicado.

SCF de rato recombinante tem principalmente actividade sinérgica sobre a medula óssea humana normal de acordo com o ensaio de CFU-GM. Na experiência represen tada no Quadro 6, o SCF teve acção sinérgica com GM-CSF humano e IL-3 humana e CSF-1 humano. Em outros ensaios, também se

108 observou sinergia com G-SCF. Houve alguma proliferação de medula óssea humana após 14 dias com SCF de rato; contudo, os agrupamentos eram compostos por40 células. Obtiveram-se resultados similares com SCF natural de mamífero.

Quadro 6

Ensaio de CFU-GM humano de sobrenadantes de células COS-1 transfectadas com DNA de

SCF murino

Amostra

N2 de colónias/100.000 células ( + MES)

Solução salina 0 gm-CSF 7+1

G-CSF 24 + 1

IL-3 5 + 1

CSF-1 0 ^SCF1-162 °

GM-CSF + SCF^^g 29 + 6

G-CSF + SCF.,_₁₆₂ 20 + 1

IL-3 + SCF₁_₁₆₂ 11 + 1

SCF-1 + SCF₁_₁₆₂ 4+0 “ 109

Exemplo 5

Expressão de SCF reoombinante em células ováricas de

Hamster chinês

Este exemplo refere-se a um sistema de expressão de mamífero estável para a secreção de SCF de células CHO (ATCC CCL 61, seleccionada para DHFR-).

A. SCF de rato recombinante

Usou-se o vector de expressão V19-8 (Figura 17) para a produção de SCF. 0 marcador seleccionável utilizado para transformantes estáveis estabelecidos foi o gene para o di-hidroftalato redutase no plasmídeo pDSVE.1. Este plasmídeo pDSVE.1 (Figura 18) é um derivado de pDSVE construído por digestão de pDSVE com a enzima de restrição SalII e ligação a um fragmento oligonucleotídico constituído por dois oligonucleótidos:

5’TCGAC CCGGA TCCCC 3'

3’ G GGCCT AGGGG AGCT 5’.

vector pDSVE está descrito nas patentes de invenção de propriedade comum norte-americanas série N^s 025 344 e 152 045, aqui incluídas como referência. A frac ção do vector V19.8 e pDSVE.1 contêm longas extensões de homo logia incluindo uma origem ColE1 bacteriana de replicação e o gene de resistência à ampicilina e a origem de replicação

110 de SV40. Esta sobreposição pode contribuir para recombinações homólogas durante o processo de transformação facilitando, deste modo, a co-transformação.

Precipitados conjuntos pelo fosfato de cálcio de construções de SCF V19.8 e de pDSVE.1 foram preparadas na presença e na ausência de 10 /ig de DNA veicular de murganho utilizando 1,0 ou 0,1 /Jg de pDSVE.1 que tinha sido linearizado com endonuclease de restrição Pvul e 10 71 g de SCF V19.8 do modo descrito por Wigler et al., supra (1978). As colónias foram seleccionadas com base na expressão do gene de DHFR de pDSVE.1. As colónias capazes de se desenvolverem na ausência da adição de hipoxantina e timidina foram repicadas utilizando cilindros de clonagem e expandidas como linhas de células independentes. Os sobrenadantes celulares provenientes das linhas de células individuais foram testados num ensaio de captação de “Έ-timidina MC/9. 0s resultados de uma experiência típica indicam-se no Quadro 7.

#·

111 .í?

Quadro 7

Ensaio de captação de H -timidina MC/9 em sobrenadantes de oélulas CHO estáveis provenientes de células transfectadas com DNA de SCF murino

Volume de condicionado

DNA transfectado_Meio ensaiado_cpm

V!9.S SCF,__i62

Nenhum

25	33	926
12	34	973
6	30	657
3	14	714
1,5	7	160
25		694
12	1	082
6		880
3		672
1	1	354

B. SCF humano recombinante

Efectuou-se também a expressão de SCF em células CHO utilizando o vector de expressão pDSVRc<2 que está descrito na patente de invenção de propriedade comum série N2 501 904 requerida a 29 de Março de 1990, aqui incluí da como referência. Este vector inclui um gene para a selecção

112 ί

Λ, e amplificação de clones com base na expressão do gene DHFR. 0 clone de pDSR^!'õ2 SCF foi gerado por um processo em dois passos. Digeriu-se.oVI9·8 SCF com a enzima de restrição BamHI e ligou-se a inserção de SCF no sítio de BamHI de pGEM3. Digeriu-se o DNA proveniente de pGEM3 SCF com HindIII e Sall e ligou-se em pDSRôf2 digerido oom HindIII e Sall. Repe tiu-se o mesmo processo para genes humanos que codificam um terminal COOH nas posições de aminoácidos 162, 164 e 183 da sequência que se apresenta na Figura 15C e na posição 248 da sequência que se apresenta na Figura 42.

Provocaram-se com metotrexato 10 nM as linhas de células estabelecidas [Shimke, in Methods in Enzimology, 151 (1987) 85-104] para aumentar os níveis de expre^ são do gene DHFR e do gene SCF adjacente. Analisaram-se os níveis de expressão de SCF humano recombinante pelo ensaio de radioimunidade, do modo descrito no Exemplo 7, e/ou pela indução da formação de colónias in vitro utilizando leucócitos de sangue periférico humano. Este ensaio foi realizado do modo descrito no Exemplo 9 (Quadro 12) com a diferença de se ter utilizado sangue periférico em vez da medula óssea e se ter efectuado a incubação com 20 % de 0g, 5 % de CO^ e 75 % de N₂ ^na presença de EPO humano (10 U/ml). Os resultados das experiências habituais estão indicados no Quadro 8.

clone CHO que exprime SOF^^ humano foi depositado a 25 deiSetembro de 1990 na ATCC (CRL 10 557) com a designação Hul64SCF17.

113Quadro 8

Ensaio de colónias hPBL	em meio condicionado
de linhas de células CHO	estáveis transfectadas
com DNA de SCF humano
Número de

Transfectado	Meio analisado	, 5 colonias/10
PDSIW2 hSCF^^^	50	53
	25	45
	12,5	27
	6,25	13
pDSR«2 hSCF^g	10	43
	5	44
	2,5	31
	1 ,25	17
	0,625	21
Nenhum (CHO de	50	4

controlo)

Exemplo 6

Expressão de SCF recombinante em E.ooli

A. SCF murino recombinante

Este Exemplo descreve a expressão em E. coli de polipéptidos de SCF por meio de uma sequência de DNA que codifica SCF^ murino [Met ] (Figura 14C).

Embora se possa utilizar qualquer vector estável para a expres.

114 são da proteína utilizando este DNA, o plasmídeo escolhido foi o pCFM1156 (Figura 19). Este plasmídeo pode ser facilmente construído a partir de pCFM 836 (ver patente de invenção norte-americana N2 4 710 473 cuja referência aqui se inclui) pela destruição de dois sítios de restrição Ndel endógenos e preenchimento da extremidade com a enzima T4 polimerase seguida de ligação nas extremidades completadas e substituição da pequena sequência de DNA entre os sítios de restrição únicos Ciai e Kpnl com 0 pequeno oligonucleótido representado em seguida.

5’ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3’

3’ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5’ controlo da expressão da proteína no pias.

mídeo pCFM115ó é feito por meio do promotor P lambda sintéL tico que, por sua vez, está sob 0 controlo de um gene repressor CI857 lambda sensível à temperatura [este é proporcionado em estirpes FM5 de E. ooli (número de depósito ATCC 53911) ou K12 Δ Htrp]. 0 vector pCFM115ó é construído de forma a apresentar uma sequência de DNA que contém um sítio de ligação ribossómica optimizado e imediatamente um codão de iniciação 3’do promotor PL sintético. Um único sítio de restrição Ndel que contém 0 codão de iniciação ATG, precede um agrupamento de clonagem de sítio de multi-restrição seguido por uma sequência de paragem de transcrição t-oop lambda.

plasmídeo V19.8 SCF₁__ig3 que contém 0

- 115

gene SCF^ murino cionado de cDNA amplificado de PCR (Figura 14C), do modo descrito no Exemplo 3, foi digerido com BglII e SstII e isolou-se um fragmento de DNA com 603 pb.

Para proporcionar um codão de iniciação Met e restaurar os codões nos três primeiros resíduos de aminoácidos (Gin, Glu e Ile) do polipéptido de SCF murino, preparou-se um adaptador oligonucleotídico sintético

5’ TATGCAGGA 3’

3’ ACGTCCTCTAG 5’ com pontas terminais Ndet e BglII. Inseriram-se o pequeno oli gonucleótido e o fragmento do gene SCF _Ω_ murino em pCFM 1156 por ligação nos únicos sítios do plasmideo Ndel e SstII, representado na Figura 19- 0 produto desta reacção é um plasmídeo de expressão, SCF _1QQ murino pCFM 1156.

Transformou-se o plasmideo SCF^ murino pCEM1156 em células hospedeiras de E. coli FM5 compe tentes. A selecção das células que continham o plasmideo fez-se com base no gene marcador de resistência ao antibiótico, (canamicina), transportado no vector pCFM1156. Isolou-se o DNA plasnídico das células cultivadas e confirmou-se . a sequência de DNA do oligonucleótido sintético e a sua junção oom o gene de SCF murino por sequenciação de DNA.

Para a construção do plasmideo SCF^ murino pCFM1156 que codifica o polipéptido SCF^ murino _ -| (Met ), isolou-se um fragmento de restrição ECORI a SstII

116

•a-.

a partir de SCF.j_.jg₂ murino de V19-8 e inseriu-se por ligação no plasmideo SCF^ ^munino pCFM nos sítios de restrição únicos EcoRI e SstII substituindo, deste modo, a região codificadora para o terminal carboxilo no gene de SCF murira.

Para a construção dos plasmídeos ^SCF1_164 murino pCFM1156 e SCF^^g murino pCFM1156 que ' -1 codificam os polipéptidos SCF₁ murino [Met ] e

SCF.j_.jg5 murino [Met ], respectivamente, isolaram-se fragmentos de restrição EcoRI a SstII de DNA amplificado por PCR que codifica a extremidade 3’ do gene SCF e concebeu-se para a introdução de alterações de sítio dirigido no DNA na região que codifica o terminal carboxilo do gene SCF. Realizaram-se as amplificações de DNA utilizando iniciadores oligonucleo tídicos 227-29 e 237-19 na construção de SCF^^^ murino pCFM1156 e 227-29 e 237-20 na construção de SCF^^ç murino pCFM1156.

B. SCF humano recombinante

Neste Exemplo descreve-se a expressão em E. coli do polipéptido de SCF humano por meio de uma _ -| sequência de DNA que codifica SCF^ -jgi| humano [Met [ e — 1

SCF. .01 humano [Met ] (Figura 15C). Utilizou-se o plasmí deo SCF.J ^g₂ humano V19.8, que contém o gene SCF₁_₁g₂ humano, como matriz para a amplificação de PCR do gene de SCF humano. Utilizaram-se os iniciadores 227-29 e 237-19 para gerar DNA de PCR que, em seguida, foi digerido com as

117 endonucleases de restrição PstI e SstII. Para se obter um codão de iniciação Met e recuperar os codões para os primei, ros quatro resíduos de aminoãcido (Glu, Gly, Ile e Cys) do polipêptido SCF humano, preparou-se um adaptador oligonucleo tídico sintético

5’ TATGGAAGGTATCTGCA 3’

3’ ACCTTCCATAG 5' com pontas terminais Ndel e PstI. Inseriram-se o pequeno adaptador oligo e o fragmento SCF humano proveniente de PCR por ligação no plasmídeo cte.expressão pCFM115ô (do modo ante, riormente descrito) nos sítios únicos Ndel e SstII do plasmí deo representado na Figura 19.

Transformou-se o plasmídeo SCF^ humano pCFM1156 em células hospedeiras E. coli FM5 competentes. A selecção das células que continham o plasmídeo foi realizada com base no gene marcador de resistência a antibiótico (cana micina), transportada pelo vector pCFM1156. Isolou-se o DNA plasmídico a partir das células cultivadas e confirmou-se a sequência de DNA do gene SCF humano por sequenciação de DNA.

Para a construção do plasmídeo SCF^ g^ humano pCFM1156 que codifica o polipêptido SCF^g^ humano [Met ] (Figura 15C), isolou-se um fragmento de restrição EcoRI a HindIII, que codifica o terminal carboxilo do gene de SCF humano, a partir de SCF^^ ^g^ humano pGEM (descrito a seguir) um fragmento de restrição SstI a EcoRI, que codifica o terminal amino do gene SCF humano, a partir de SCF^ humano pCFM1156, e isolou-se o fragmento de restrição maior HindIII a SsTI, a partir de pCFM115ó. Ligaram-se os três fragmentos de DNA conjuntamente para se formar o plasmídeo SOF^g^ humano pCFM1156 que, em seguida, foi transformado em células hospedeiras E. coli FM5. Após a selecção das colónias utilizando a resistência à canamicina, isolou-se o DNA plasmídico e confirmou-se a sequência de DNA correcta por sequênciação de DNA. 0 plasmídeo SCF^^ ^g^ -humano pGE'M é um derivado de pGEM3 que contém um fragmento EcoRI-Sphl que inclui os nucleótidos 609 a 820 da sequência de DNA de' SCF humano, representada na Figura 15C. A inserção EcoRI-Sphl deste plasmídeo foi isolada, de um PCR que utilizou os inicia dores oligonucleotídicos 235-31 θ 241-6 (Figura 12B) e PCR 22.7 (Figura 13B) como matriz. A sequência do iniciador 241-6 foi baseada na sequência genómica humana para o lado 3’ da exon que contém o codão para o aminoácido 176.

C. Fermentação de E. ooli para a produção de SCF^ g^humano ' . Efectuaram-se fermentações para a produção de SCF^ num fermentador de 16 litros utilizando uma hospedeira E. ooli K12 FM5 contendo o plasmídeo SCF^ humano pCFM1156. Mantiveram-se reservas de sementeira da cul. tura de produção à temperatura de -80^C em caldo Luria com glicerol a 17 %. Para a produção do inoculo, transferiram-se

119

100 /ul da reserva de sementeira descongelada para 500 ml de caldo Luria num balão erlenmeyer de 2 litros e desenvolveram durante a noite à temperatura de 302C num agitador rotativo (250 RPM).

Para a produção de uma pasta de células E. coli utilizada como material inicial para a purificação de SCF^ humano descrito neste Exemplo, utilizaram-se as condições de fermentação descritas a seguir.

A cultura do inóculo foi transferida assepticamente para um fermentador de 16 litros contendo 8 litros do meio (ver-Quadro 9). Desenvolveu-se um lote da cul. tura em até a DO-óOO da cultura ser aproximadamente 3,5. Neste momento, introduziu-se uma alimentação estéril (Alimen tação 1; Quadro 10) no fermentador por meio de uma tomba peristáltica para controlar o caudal de alimentação estéril. Aumentou-se exponencialmente em função do tempo o caudal de alimentação até se obter uma velocidade de crescimento de

0,15 horas . Controlou-se a temperatura a 30²C durante a fase de crescimento. A concentração do oxigénio dissolvido no fermentador foi controalda automaticamente a 50 $ da satu ração utilizando o caudal do ar, a velocidade de agitação, a contra-pressão no recipiente e um suplemento de oxigénio para o controlo. 0 pH do fermentador foi controlado automaticamente a 7,0 utilizando ácido fosfórico e hidróxido de amó nio. A uma DO-600 de aproximadamente 30, induziu-se a fase de produção da fermentação por aumento da temperatura do fermen120

tador para 42^0. Simultaneamente interrompeu-se a adição da Alimentação 1 e iniciou-se a adição da Alimentação 2 (Quadro 11), com um débito de 200 ml/hora. Aproximadamente seis horas após o aumento da temperatura do fermentador, arrefeceu-se o seu conteúdo até à temperatura de 15²C. 0 rendimento em SCF^ foi aproximadamente 30 mg/DO-L. Em seguida, recolheu-se o aglomerado celular por centrifugação numa centrífuga Beckman J6-B com a velocidade de 3 000 x g durante 1 hora. A pasta celular recolhida foi armazenada congelada à temperatura de -70²C.

Um método preferido para a produção de

SCF^^g^ é similar ao método descrito anteriormente com excepção das modificações seguintes:

1) A adição da Alimentação 1 não é iniciada até que-a-D0-600 da cultura apresente um valor compreendido entre 5 e 6.

2) A velocidade de adição da Alimentação 1 é aumentada mais lentamente, daí resultando uma velocidade de crescimento mais lenta (aproximadamente 0,08).

3) A cultura é induzida à D0-600 de 20.

4) A Alimentação 2 é introduzida no fermentador com um caudal de 300 ml/hora.

Todas as outras operações são similares aos do método descrito anteriormente, incluindo os meios.

A aplicação deste processo, permite obter rendimentos de SCF^ aproximadamente compreendidos

121 entre 35 e 40 mg/DO-L à DO = 25.

Quadro 9

Composição do lote do meio

Extracto de levedura

Glucose k₂hpo₄ kh₂po₄

M_gSO₄.7H₂O

NaCl

Anti-espuma P-2000 Dow Solução de vitamina Solução de oligoelementos⁰ a

g/litro

3,5

0,625 ml/8 litros ml/litro ml/litro

3.

A menos que especificado de outro modo todos os componentes são indicados em g/litro

Solução de oligoelementos: FeClg.óí^O, 27 g/L; Ζη01₂·4

H₂0, 2g/L; CaCl₂.6H₂0, 2 g/L; Na₂Mo0₄>2 H₂0, 2 g/L,

CuSO₄.5 H₂0, 1,9 g/litro; HC1 concentrado, 100 ml/litro.

Solução de vitaminas: ribaflavina, 0,42 g/1; ácido pantoténico, 5,4 g/litro; niacina, 6 g/litro; piridoxina,

1,4 g/litro; biotina, 0,06 g/litro; ácido fólico,

0,04 g/litro.

- 122

Quadro 10

Composição de um meio de alimentação

Extracto de levedura

Glucose

MgSO^·7H₂0

Solução de oligoalimentos

Solução de vitaminas

450

8,6 ml/litro ml/litro

- ~ V3.

A menos que especificado de outro modo todos os ingredientes estão indicados em g/litro.

Solução de oligoelementos: FeClg.6H₂O, 27 g/litro;

ZnCl₂.4 H₂0, 2 g/litro; CaCl₂.6H₂0, 2 g/litro; Na₂Mo0₄.2

H₂0, 2 g/litro, CuSO^.5 H₂0, 1,9 g/litro; HCl concentrado, 100 ml/litro.

c «*

Solução de vitaminas: riboflavina, o,42 g/litro; acida» pantoténico, 5,4 g/litro; niacina, 6 g/litro; piridoxina, 1,4 g/litro; biotina, 0,06 g/litro; ácido fólico, 0,04 g/ /litro.

Quadro 11

Triptona

Extracto de levedura

Glucose

Composição da Alimentação 2 a

172

258

Todos os ingredientes estão referidos em g/litro.

123

Exemplo 7

Ensaios imunológicos para a detecção de SCF radioimunoensaio (RIA) aplicado para a detecção quantitativa de SCF nas amostras, foi conduzido de acordo com o processo seguinte:

Uma preparação de SCF de células BRL 3A purificadas, de acordo com o descrito no Exemplo 1, foi incubada conjuntamente com anti-soro durante 2 horas à temperatura de 37-C. Após 2 horas de incubação, os tubos das amostras 125 foram arrefecidos sobre gelo, adicionados com '.;I-SCF e incu bados á temperatura de 4sc pelo menos durante 20 horas. Cada tubo de ensaio continha 500 pl de mistura de incubação constituída por 50yul de anti-soros diluídos, cerca de 60 000 cpm de ¹²^I-SCF (3,8 x 10? cpm^g), 5/il de trasilol e Ο-400 >ul de SCF padrão, com tampão (cloreto de sódio tamponado com fosfato, albumina de soro bovino a 0,1 %, Triton x-100 a 0,05 1» e 0,025 % de azida) perfazendo o volume restante. 0 anti-soro era proveniente de uma segunda recolha de um coelho imunizado com uma preparação 50 % pura de SCF natural de meio condicionado 3A BRL. A diluição final do anti-soro do ensaio foi de : 2 000.

125

Precipitou-se o I-SCF ligado ao anticorpo com a adição de 150/ul de Staph A (Calbiochem).Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, centrifugaram-se as amostras e lavaram-se os aglomerados duas vezes com 0,75ml de Tris-HCL 10 mM, pH 8,2, contendo NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM e 0,05 % de Triton x-100. Os aglomerados lavados foram contados

124 ,/

125 num contador gama para se determinar a percentagem de I-SCF ligado. As contagens dos tubos isentos de soro foram subtraídas a todos os valores finais para se corrigir a pre cipitação não específica. Na Figura 20 apresenta-se um ensaio de radioimunidade típico. A percentagem de inibição da ligação de I-SCF produzida pelo padrão não-marcado é dependente da dose (Figura 20A) e, como indicado na Figura 20B, quando se examinaram os aglomerados precipitados imunes por SDS-PAGE e autorradiografia, a banda de proteína I. . 125 -SCF e correspondente. Na Figura 20B, a pista 1 e de I125

-SCF e as pistas 2, 3, 4 e 5 são precipitados de I-SCF imunes correspondentes a 0, 2, 100 e 200 ng de SCF padrão, respectivamente. Como determinado pela diminuição do anticorpo precipitável cpm observada nos tubos do ensaio de radio imunidade e pela diminuição na banda da proteína 'I-SCF precipitada imune (migração a M 31 000 aproximadamente), os anti-soros policlonais reconhecem o padrão de SCF que foi purificado de acordo com o Exemplo 1.

Também se aplicaram procedimentos de Western para detectar SCF recombinante expresso em E. coli, células COS-1 e células CHO. Foram submetidos a um ensaio SDS-PAGE SCF^^g^ ^murino expresso em E. coli parcialmente purificado (Exemplo 10), SCF^ e SCF^^^ murinos expres.

sos em células COS-1 assim como SCF. . humano (Exemplos 4 e 9) e SCF.J ^g₂ murino expresso em células CHO (Exemplo 5). Após electroforese as bandas foram transferidas para nitrocelulose 0,2 /xm utilizando o aparelho Bio-Rad Transblot a 60V

125

ÍL durante 5 horas. Bloquearam-se os filtros de nitrocelulose durante 4 horas em PBS, pH 7,6, contendo soro de caprino a 10 #, seguido de incubação à temperatura ambiente durante 14 horas com uma diluição a 1 : 200 de soro de coelho pré-imune ou imune (imunização descrita anteriormente). Os complexos anti-soro-anticorpo foram realizados utilizando reagentes de IgG anti-coelho desenvolvida na cabra e conjugada com peroxidase de rábano (Vector laboratories) e reagente de coloração 4-cloro-1-naftol.

Nas Figuras 21 e 22 apresentam-se exemplos de duas análises Western. Na Figura 21 as pistas 3 e 5 são de SCF.J ,|g2 humano produzido por 200 yUl de células COS-1; as pistas 1 e 7 são EPO humano produzido por 200 /il de células COS-1 (Células COS-1 transfectadas com V19-8 EPO); e a pista 8 são marcadores de peso molecular, previamente corados. As pistas 1-4 foram incubadas com soro pré-imune e as faixas 5-8 foram incubadas com soro imune. 0 soro imune re. conheceu espeeificamente uma banda difusa com um peso molecular relativo aparente de M de 30 000 daltons de células COS-1 produtoras de SCF^ humano, mas não de células

COS-1 que produzem EPO humano.

No Western apresentado na Figura 22, as pistas 1 e 7 são 1 yug de uma preparação parcialmente puri ficada de SCF., humano produzido em E. coli; as pistas i — ί y J e 8 são de SCF^ murino produzido por células COS-1 purificado em aglutinina de germe de trigo-agarose; as pistas

- 126 -f e 9 são de SCF^ ^₂ murino produzido por células COS-1 puri. ficadas em aglutinina de germe de trigo-agarose; as pistas 5 e 10 são SCF₁ murino produzido em células CHO purificado em aglutinina de germe de trigo-agarose; e a pista 6 é de mar cadores de peso molecular, corados previamente. As pistas 1-5 e as pistas 6-10 foram incubadas com soro pré-imunizado de coelho ou soro imunizado de coelho. 0 SCF. _1Q_ murino produzido em E. coli (pistas 1 e 7) migra com um aparente de cerca de 24 000 daltons enquanto o SCF^ murino produzido por células COS-1 (bandas 2 e 8) migra com um M_r aparente de cerca de 24 a 36 000 daltons. Esta diferença nos pesos moleculares era esperada dado que as células bacterianas, são capa zes de glicosilação. A transfecção da sequência codificadora de SCF₁_₁g₂ murino para células COS-1 (pistas 4 e 9), ou células CHO (pistas 5 e 10), resulta na expressão de SCF com peso molecular médio menor do que o produzido pela transfecção com SCF^ 193 (pistas 2 e 8).

Os produtos de expressão de SCF^ ^₂ murino de células COS-1 e de células CHO são uma série de bandas com aparente variando entre 24 e 36 000 daltons.

A heterogeneidade do SCF expresso é devida provavelmente às variantes hidratos de carbono em que 0 polipéptido de SCF está glicosilado com diferentes extensões.

Em resumo, as análises de Western indi cam que 0 soro imune dos coelhos imunizados com SCF de mamífero natural reconhece SCF recombinante produzido em E. coli,

127 .¾ células COS-1 e células CHO mas não consegue reconhecer bandas de uma amostra de controlo constituídas por EPO produzido por células COS-1. Ainda para maior apoio da especificidade do anti-soro SCF, soro pré-imunizado proveniente do mesmo coelho não obteve reacção com qualquer dos produtos de expressão de

SCF murino ou humano.

Exemplo 8

Actividade in vivo de SCF recombinante

A. SCF murino na transplantação da medula óssea .Tr.ansfec.taram-se células COS-1 com V19.8

SCF, ,durante uma experiência em larga escala, do modo 1 -1 0 d descrito no Exemplo 4 (frascos T175 cm em substituição de placas de 60 mm).

Recolheram-se aproximadamente 270 ml de sobrenadante. Este sobrenadante foi cromatografado em agarose -aglutinina de germe de trigo e S-sefarose como essencialmente descrito no Exemplo 1. Avaliou-se 0 SCF recombinante numa experiência com transplantação de medula óssea baseado em murganhos genéticos W/W^V. 0 murganho ’W7W^V possui uma célula indiferenciada deficiente que resulta, entre outros aspectos, em anemia macrocítica (glóbulos vermelhos grandes) e permite a transplantação de medula óssea de animais normais sem necessida de irradiação dos animais recipientes [Russel et al., Science, 144 ( 1964) 844-846]. Após a transplantação o dador de células indiferenciadas normais desenvolveu as celu

- 128 /

las receptoras defeituosas.

No exemplo seguinte cada grupo continha seis murganhos em idade de acasalamento. A medula óssea foi recolhida de murganhos dadores normais e transplantada para v murganhos W/W . Seguiu-se o comportamento do sangue dos animais recipientes em diferentes momentos após a transplanta ção e determinou-se o enxerto da medula do dador pelo deslocamento das células do sangue periférico de fenótipo do receptor para o fenótipo do dador. A conversão do fenótipo do receptor no fenótipo do dador detectou-se por controlo do perfil de difusão posterior (FASCAN, Becton Dickenson) dos glóbulos vermelhos. Comparou-se o comportamento de oada ani mal transplantado com o dos animais dadores e animais recepfcores não transplantados de controlo, em cada momento. A comparação foi realizada utilizando um programa de computador baseado na estatística de Kolmogorov-Smirnov para análise de histogramas de sistemas de fluxo [Young, J. Histochem. and Cytochem., 25 (1977) 935-941]. Um indicador qualitativo independente do enxerto é o tipo de hemoglobina detectada pela electroforese da hemoglobina do sangue do receptor [Wong et al., Mol. and Cell. Biol., £, (1989) 798-808] e que se adapta com a excelência da determinação da estatística de Kolmogorov-Smirnov.

Aproximadamente 3 x 10 células foram transplantadas sem tratamento com SCF (grupo de controlo na v

Figura 23) de dadores de C56BL/6J era receptores W/W . Um

segundo grupo recebeu 3 x 10 células de dador que tinham sido tratadas com SCF (600 U/ml) à temperatura de 37²C durante 20 minutos e injectadas conjuntamente (grupo pré-tratado da Figura 23). (Uma unidade de SCF define-se como uma quantidade que provoca metade da estimulação máxima no ensaio biológico (MC/9). Num terceiro grupo, injectaram-se murganhos receptores por via subcutânea (sub-Q) com aproximadamente 400 unidades de SCF/dia durante 3 dias após transplantação de 3 x 10 células de dador (grupo injectado sub-Q da Figura 23)· Tal como se indica na Figura 23, nos grupos tratados com SCF a medula de dador foi enxertada mais rapidamente do que no grupo de controlo não tratado. Cerca de 29 dias após a transplantação, o grupo previamente tratado com SCF tinha-se convertido no fenotipo do dador. Este Exemplo ilustra a utilidade da terapêutica com SCF na transplantação da medula óssea.

B. Actividade in vivo de SCF murino em murganhos Steel

Mutações de locus S1 provocam deficiências nas células hematopoiéticas, células de pigmentos e células de germes. A deficiência hematopoiética manifesta-se sob a forma de menores números de glóbulos vermelhos Russell in Al Gordon, Regulation of Hematopoiesis, Nova Iorque Appleton-Century-Crafts, 1970, Vol. I, 649-675), neutrófilos [Ruscetti, proc. Soo. Exp. Biol. Med., 152 (1976) 398], monócitos [Shibata, J. Immunol. 135 (1985) 3905] megacariócitos [Eble, Exp. Hematol., 6. ( 1978) 201 ], células assassinas naturais [(Clark, Immunogenetics, 12 (1981)

130 601], e mastócitos [Hayashi, Dev. Biol.,109( 19 8 5 ) 234]. Os murganhos Steel são fracos receptores de transplantes de medula óssea devido à sua capacidade reduzida para suportarem células indiferenciadas [Bannerman, prog. Hematol., 8. (1973) 131]. 0 gene que codifica SCF está delectado nos mur ganhos Steel (S1/S1).

Os murganhos Steel proporciona um modelo sensível in vivo para a actividade de SCF. Testaram-se proteínas de SCF recombinante diferentes em murganhos Steel-Dickie (S1/S1^d) durante períodos variáveis. Adquiri ram-se nos Labs. Bar Harbor, ME murganhos Steel com seis a dez semanas de idade (WCB6F1 - S1/S1 ). Controlou-se o san gue periférico por meio de um contador SYSMEX F-800 de microcélulas (Baxter, Irvine, CA) para os glóbulos-vermelhos hemoglobina e plaquetas. Para a determinação dos leucócitos periféricos (WBC) utilizou-se um Coulter Channelyser 256 (Coulter Electronics, Marietta, GA). Na experiência representada na Figura 24, os murganhos Steel-Dickie foram tratados com SCF^ derivado de E. coli, purificado de acordo com o método descrito no Exemplo 10, a uma dose de 100/Ug/kg/ /dia durante 30 dias e depois a uma dose de 30 yUg/kg/dia durante mais 20 dias. A proteína foi formulada sob a forma de uma solução de cloreto de sódio injectável (Abbot Labs, North Chicago, IL) com mais 0,1 % de soro de bovino fetal. Fizeram-se as injecções diariamente por via subcutânea. Vigiou-se o sangue periférico através de sangria da cauda de cerca de 50 /ul, nos momentos indicados na Figura 24. Reco

131 lheu-se o sangue com seringas revestidas com EDTA a 3 $ e introduziu-se em tubos de microeentrífuga com EDTA em pó (Brinkmann, Westbury, NY). Houve uma correcção significativa da anemia macrocítica nos animais tratados relativamente aos animais de controlo. Após suspensão do tratamento, os animais tratados retomaram o estado inicial de anemia macrocítica .

Na experiência representada nas Figuras 25 e 26, os murganhos Steel-Dickie foram tratados com diferen tes formas recombinantes de SCF, como descrito anteriormente, mas na dose de 100 ^g/kg/dia durante 20 dias. As duas formas de SCF murino derivado de E. coli, SCF^ e SCF^ foram obtidos de acordo oom o método descrito no Exemplo 10. Além disso, ensaiou-se também SCF^ de E. coli, modificado por 'adição de polietilenoglicol, (SCF^ PEG 25) do modo descrito no Exemplo 12. Também se ensaiou SCF₁ ^₂ de CHO produzido do modo descrito no Exemplo 5 e purificado de acordo com o método descrito no Exemplo 11. Os animais foram sangrados por punção cardíaca com seringas revestidas com EDTA a 3 ? e aeondicionou-se em tubos oom EDTA em pó. Os perfis do sangue periférico após 20 dias de tratamento estão representados na Figura 25 relativamente aos leucócitos e na Figura 26 relativamente às plaquetas. Os leucócitos diferen ciais para o grupo de SCF^ ^g^ PEG 25 estão representados na Figura 27· Houve aumentos absolutos de neutrófilos, monócitos, linfócitos e plaquetas. 0 efeito mais evidente observou-se com SCF^ PEG 25.

132 Também se realizou uma avaliação independente dos subconjuntos de linfócitos apresentando-se os dados na Figura 28. 0 equivalente murino de CD4 humano, ou o marcador de células T auxiliares é L3T4 [Dialynas, J.Immu nol · , 131 (1983) 2445]· 0 LyT-2 é um antigene murino nas células T citotóxicas [Ledbetter, J. Exp. Med., 153 (1981)

1503]. Utilizaram-se anticorpos monoclonais contra estes antigenes para avaliar os subconjuntos de células T nos animais tratados.

sangue completo foi corado para sub-grupos de linfócitos T do nocb descrito.a seguir. Retiraram-se 200 microlitros de sangue completo de animais, individualmente, para tubos tratados com EDTA. Cada amostra de sangue foi sub metida a lise oom água desionizada estéril durante 60 segundos e, em seguida, isotonizada com tampão de cloreto de sódio tamponado com 10 x fosfato de Dulbecco (PBS) (Gibco, Grand Island, NY). Este sangue lisado foi lavado 2 vezes com 1 x PBS (Gibco, Grand Island, NY) suplementado comO,1 $ de soro de bovino fetal (Flow Laboratory, McLean, VA) e 0,1 $ de azi da de sódio. Cada amostra de sangue foi depositada em placas de 96 cavidades de fundo redondo e centrifugada. 0 agregado 5 celular (contendo 2-10 x 10 células), foi ressuspenso com 20 microlitros de L3T4 anti-murganho, desenvolvido no rato, conjugado com ficoeritrina (PE) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) e 20 microlitos de Lyt-2 anti murganho desenvolvido no rato, conjugado com isotiocianato de fluoresceína, incubado sobre gelo (42C) durante 30 minutos (Becton Dickin133 son). Após incubação lavaram-se as células 2 vezes em 1 x x PBS suplementado como indicado anteriormente. Ca cã amostra de sangue foi em seguida analisado num sistema de análise de células FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Este sistema foi padrunizado utilizando processos de autocompensação convencionais e Calibrite Beads (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Estes resultados indicaram um aumento absoluto nas populações de células T auxiliares assim como no número de células T citotóxicas.

C. Actividade in vivo de SCF nos primatas.

Em primatas normais, investigou-se a actividade biológica in viv.Q de SCF^ ^g^ humano expresso em E. coli (Exemplo 6 B) e purificado até à homogeneidade como descrito no Exemplo 10. Estudaram-se babuinos machos adultos (Papio sp.) em três grupos: um grupo não tratado, n = 3; SCF, 100 /ig/kg/dia, n = 6; e SCF, 30 yug/kg/dia, n = 6. Os animais tratados receberam injecções subcutâneas diárias únicas de SCF. As amostras de sangue foram obtidas nos animais sob restrição de cetamina. Recolheram-se amos, tras nos 12, 62, 112, 15°, 202 e 25² dias do tratamento para a contagem sanguínea total, contagem de reticulócitos e de plaquetas.

Os animais sobreviveram todos e não apresentaram reacções indesejáveis à terapêutica com SCF. 0 número de leucócitos aumentou nos animais tratados com 100/ug/ /

- 134 -/ /kg, tal como se representa na Figura 29. As contagens diferenciais obtidas por coloração manual de manchas (smears) de sangue periférico coradas com 0 Wright Giemsa, também se apresentam na Figura 29. Houve um aumento absoluto de neutrófilos, linfocitos e monocitos. Como se representa na Figura 30 também houve um aumento nos valores de hematrócrito assim como nas plaquetas para a dose de 100 /ug/kg.

Também se testou nos laboratórios normais SCF humano (hSCF^ modificado pela adição de polietilenoglicol do modo descrito no Exemplo 12) como a dose de 200 pg/kg.ia, administrada por perfusão endovenosa contínua e comparada com a proteína não modificada. Os animais inicia ram SCF no dia zero e foram tratados durante 28 dias. Os resultados sobre os leucócitos periféricos apresentam-se no Qua dro seguinte. 0 SCF modificado com a adição de PEG provocou um aumento mais rápido nos leucócitos periféricos do que o SCF não modificado.

Tratamento com 200 jug/kg-dia hSCF^ ηθΐ|⁵

Animal # M88320 Animal # M88129

Dia	Leucócitos	Dia	Leucócitos
0	5800	0	6800
+7	10700	+7	7400
+ 14	12600	+ 14	20900
+ 16	22000	+21	18400
+22	31100	+23	24900

135 (Cont.)

Animal # M88320	Animal	# M88129
+24	28100	+29	13000
+29	9600	+30	23000
+36	6600	+37	12100
+43	5600	+44 +51	10700 78OO
Tratamento com 200 /jg/kg-dia PEG-hSCF^	-164:
Animal	# M88350	Animal	# M89116
Dia	Leucócitos	Dia	Leucócitos
-7	12400	-5	7900
-2	11600	0	7400
+4	24700	+6	16400
+7	20400	+9	17100
+ 11	24700	+13	18700
+ 14	32600	+16	19400
+ 18	33600	+20	27800
+21	26400	+23	20700
+25	16600	+27	20200
+28	26900	+29	18600
+32	9200	+33	7600

Exemplo 9

Actividade in vitro de SCF humano recombinante

Exprimiu-se o cDNA de SCF humano corres136 pondente aos aminoácidos 1-162, obtido por reacções de PCR descritas no Exemplo 3D, em células COS-1 como descrito para SCF murino no Exemplo 4. Os sobrenadantes de COS-1 foram ensaiados em medula óssea humana assim como em ensaios com HPP-CFC murino e MC/9. A proteína humana não foi activa nas concentrações testadas em qualquer dos ensaios murinos; contudo, foi activa sobre a medula óssea humana. As condições de cultura do ensaio foram as seguintes: medula óssea humana proveniente de voluntários saudáveis centrifugada em gradiente de FicollHypaque (Pharmacia) e cultivada em metil-celulose a 2,1 #, soro de vitela fetal a 30 $, 2-mercaptoetanol 6 x 10 M, glutamina 2 mM, meio de ISCOVE (GIBCO), 20 U/ml de EPO e 1x x 10 células/ml durante 14 dias numa atmosfera humidificada contendo 7 $ de C>₂, 10 % de C0₂ e 83 % de N₂· No Quadro 12 estão indicados os números de colónias gerados com SCF humano e murino recombinantes em sobrenadantes COS-1 . Apenas se indicam as colónias com um diâmetro de 0,2 mm ou superior.

Quadro 12

Desenvolvimeto de colónias de medula óssea humana com respostas a SCF

Plasmídeo Transfectado

Volume de CM ensaiado ( /íl)

NS de colónias #/100 000 células + SD

V19.8 (sem inserção)	100	0
	50	0
V1Ç.8 SCF. humano 1 -1 02	100	33+7
	50	22+3
V19-8 SCF1_1g2 murino	100	13+1
	50	10

A?

- 137

As colónias que se desenvolveram num período de 14 dias estão representadas na Figura 31A (ampliação de 12 x). A seta indica uma colónia típica. Assemelhavam-se a colónias de HPP-CFC murino no seu tamanho (médio de 0,5 mm). Devido à presença de EPO, algumas das colónias está vam hemoglobinizadas. Quando se isolaram e centrifugaram as colónias para lâminas de vidro usando uma Cytospin (Shandon) e se coraram com wright-Giemsa, o tipo de células predominante era uma célula indiferenciada com uma relação grande núcleo/citoplasma que se apresenta na Figura 31B (ampliação 400 x). As setas da Figura 31B indicam as estruturas seguin tes: seta 1, citoplasma; seta 2, núcleo; seta 3, vacúolos. As células imaturas são uma classe de grandes células que se tornam progressivamente mais pequenas à medida que amadurecem [Diggs et al., The Morphology of Human Blood Cells, Abbott Labs, 2 (1978)]. Os núcleos das células permaturas da sequência da maturação hematopoiética são relativamente grandes em relação ao citoplasma. Além disso, o citoplasma de células imaturas toma uma coloração mais escura oom o Wright-Giemsa do que o núcleo. Nas células maduras, os núcleos tomam uma coloração mais escura do que o citoplasma. A morfologia das células da medula óssea humana que resulta da cu]L tura com SCF humano recombinante é consistente com a conclusão de que o produto alvo e imediato da acção de SCF é uma progenitora hematopoiética relativamente imatura.

SCF humano recombinante foi testado nos ensaios de colónias em agar de medula óssea humana em asso

- 138 -, ί' .¼ ciação com outros factores de crescimento do modo descrito anteriormente. Os resultados apresentam-se no Quadro 13· 0 SCF tem uma acção sinérgica com G-CSF, GM-CSF, IL-3 e EPO para aumentar a proliferação de alvos de medula óssea para CSFs individuais.

Quadro 13

Ac.ção sinérgica de SCF humano recombinante com outros factores estimulantes de colónias humanas

N2 de colónias /15³ células (14 dias)

simulação		0
hG-CSF	32	+	3
hG-CSF + hSCF	74	+	1
hGM-CSF	14	+	2
hGM-CSF + hSCF	108	+	5
hIL-3	23	+	1
hIL-3 + hSCF	108	+	3
hEPO	10	+	5
hEPO + IL-3	17	+	1
hEPO + hSCF	86	+	10
hSCF		0

A outra actividade de SCF humano recombinante é a capacidade para provocar a proliferação em agar mole da linha de células de leucemia mielogénica aguda humana

- 139 / (AML), KG-1 (ATCC CCL 246). Testaram-se sobrenadantes COS-1 de células transfectadas no ensaio de clonagem em agar de KG-1 [Koeffer et al., Science, 200 (1978) 1153-1154] como essen cialmente descrito, com a diferença de se terem plaqueado as células a 3000/ml. Os dados de culturas em triplicado estão apresentados no Quadro 14.

Quadro 14

Ensaio de clonagem em agar mole KG-1

Plasmídeo Transfectado

Volume N2 de colónias 73000 ensaiado (/ul) Células + SD

V19.8 (sem inserção )	25	2+1
V19.8 SCF1_162 humano	25	14+0
	12	8+0
	6	9+5
	3	6+4
	1,5	6+6
V19.8 SCF1_1g2 murino	25	6+1
GM-CSF humano	50 (5 ng/ml)	14+5

Exemplo 10

Purificação de produtos de SCF recombinante expressos em E. coli

Realizou-se a fermentação de SCF

1-164

140 humano de E coli de acordo com o método descrito no Exemplo 6C. As células recolhidas (912 g em peso húmido) foram suspensas em água num volume de 4,6 litros e fragmentadas por três passagens num homogeneizador de laboratório (Gaulin Model 1.5MR - 8TBA) a 562,4 kg/cm² (8000 psi). Uma fracção de aglomerado de células fragmentadas foi obtida por centrifugação (17700 x g; 30 min.; 4^0), lavada uma vez com água (ressuspensão e recentrifugação) e finalmente suspensa em água num volume de 400 ml.

A fracção do aglomerado contendo SCF insolúvel (avaliado em 10-12 g de SCF) foi adicionada a 3950ml de uma mistura apropriada de tal modo que as concentrações finais dos componentes na mistura foram: ureia 8M (grau ultra puro), EDTA 0,1 mM, acetato de sódio 50 mM, pH- 6-7; avaliou-se a concentração de SCF em 1,5 mg/ml. Realizou-se a incubação à temperatura ambiente durante 4 horas para solubilizar o SCF. 0 material restante insolúvel foi retirado por centrifugação (17700 x g; 30 min., à temperatura ambiente). Para multiplicação/reoxidação do SCF solubilizado, adicionou-se a fracção sobrenadante lentamente, sob agitação, a 39,15 litros de uma mistura apropriada de modo a obter uma concentração final dos componentes de: ureia 2,5 M (grau ultrapuro), EDTA 0,01 mM, acetato de sódio 5 mM, Tris-HCl mM, pH 8,5, glutatião 1 mM, azida de sódio 0,02 # (p/v).

A concentração de SCF foi avaliada como 150 /ig/ml. Após 60 horas à temperatura ambiente (menores períodos (por exemplo entre cerca de 20 horas) são também apropriados], sob agita141 ção, ooncentrou-se a mistura duas vezes por meio de um aparelho de ultrafiltração Millipore Peliccon oom três cassetes de membrana de polissulfona com um corte de peso molecular de 10 000 [1,4 m (15 pés) de área totalje em seguida diafiltrou-se contra 7 volumes de Tris-HCl 20 mM, pH8. A temperatura durante a concentração/ultrafiltração foi de 4sc, o caudal de bombagem foi de 5 litros/minuto e a velocidade de fil. tração foi de 600 ml/minuto. 0 volume final do ultrafiltrado recolhido foi de 26,5 litros. Mediante a utilização de SDS-PAGE realizado com ou sem redução das amostras, tornou-se evidente que a maior parte (;>80$) da fracção de SCF aglomerado é solubilizado pela incubação com ureia 8M e que após a multiplicação/oxidação estão presentes espécies múltiplas (formas) de SCF, como foi visualizado pelo ensaio SDS-PAGE em amostras não reduzidas. A forma principal, que representa SCF correctamente oxidado (ver adiante), migra com um M^ aparente de cerca de 17 000 (não reduzido) relativo a marcadores de peso molecular (reduzidos) descritos na Figura 9. Outras formas incluem material que migra com M_p aparente de cerca de 18-20 000 (não reduzido), que se pensa representar SCF oom ligações dissulfureto entre as cadeias incorrectas; e bandas que migram com M^ aparentes de cerca de 37 000 (não reduzidas), ou superiores, que se pensa representar várias formas de SCF contendo ligações dissulfureto ria cadeia que resultam em cadeias polipéptidicas de SCF que são ligadas por covalência de modo a formarem dímeros ou oligómeros maiores, respectivamente. Os pass.os de fraccionamento que

- 142 /seguem originam a remoção dos contaminantes de E. coli restantes e de formas de SCF não pretendidas, de tal modo que se obtem SCF purificado até à homogeneidade aparente na con formação com actividade biológica.

pH da fracção retida da ultrafiltração foi ajustado para 4,5 mediante a adição de 375 ml de ácido acético a 10 55 (v/v), provocando a presença de um mate rial precipitado visível. Após 60 minutos, a maior parte des te material precipitado depositou-se no fundo do recipiente e decantaram-se os 24 litros da parte superior que se filtram , TM através de um dispositivo de filtração Cuno 30SP a 500 ml/ /minuto até clarificação completa.

Em seguida, diluiu-se o filtrado 1,5 vezes com água e aplicou-se a uma coluna de caudal rápido de S-Sepharose (Pharmacia), com (9 x 18,5 cm), à temperatura de 42C equilibrada com acetato de sódio 25irM, pH 4,5. Desen volveu-se a coluna com um caudal de 5 litros/hora, à temperatura de 42C. Após a aplicação da amostra lavou-se a coluna com cinco volumes de coluna (cerca de 6 litros de tampão e o material de SCF ligado à coluna foi eluido com gradiente de cloreto de sódio de zero a 0,35 M em tampão de coluna. 0 volume de gradiente total foi de 20 litros e recolheram-se fracções de 200 ml. 0 perfil de eluição está representado na Figura 33- Retiraram-se alíquotas de ( 1° Z¹ ) das fracções recolhidas da coluna de S-Sepharose que se analisaram por SDS-PAGE, sobre as amostras reduzidas (Figura 32A) e sobre

- 143 / .¼ amostras sem redução (Figura 32B). Destas análises concluiu -se que vírtualmente toda a absorváncia a 280 nm (Figuras 32 e 33) era proveniente de material SCF.

A forma correctamente oxidada predomina no pico de absorváncia máxima (fracções 22-38, Figura 33)·

As espécies menores (formas) que se podem visualizar nas frac. ções incluem o material incorrectamente oxidado com um M_r apa rente de 18-20 000, em SDs-PAGE (não reduzido), presente no patamar que conduz ao pico de absorváncia máxima (fracções

10-21, Figura 32B); e o material dimérico ligado por dissulfureto presente na região de absorváncia (fracções 10-38, Figura 32B).

Reuniram-se as fracções 22-38 provenientes da coluna de S-Sepharose e ajustou-se o conjunto para pH 2,2 mediante a adição de cerca de 11 ml de HC1 6N e aplicou-se a uma coluna Vydac C^ (altura 8,4 cm, diâmetro 9 cm) equilibrada com etanol a 50 $ (v/v), HC1 12,5 mM (solução A) e operou-se à temperatura de 42C. A resina da coluna foi pre parada por suspensão da resina seca em etanol a 80 $ (v/v), HC1 12,5 mM (solução B) equilibrando-se em seguida com solução A. Antes da aplicação da amostra, aplicou-se como branco um gradiente desde solução A até á solução B (volume total 6 litros) e em seguida equilibrou-se a coluna com solução

A. Após a aplicação da amostra, lavou-se a coluna com 2,5 litros de solução A e o material de SCF ligado à coluna, eluiu -se com um gradiente desde solução A até à solução B (volume total 18 litrosj com um caudal de 2670 ml/hora. Recolhe- 144

-¾ ram-se 286 fracções de 280 nm (Figura 35) e por SDS-PAGE (25 /ul por fracção) do modo descrito anteriormente (Figura 34A, condições de redução; Figura 34B condições sem redução). Reuniram-se as fracções 62-161 contendo SCF correctamente oxi dado num estado muito puro [quantidades relativamente pequenas do monómero incorrectamente oxidado com Mr cerca de 18-20.000 (não reduzido) eluiram posteriormente no gradiente (fracções cerca de 166-211) e o material dimérico ligado por dissulfureto também eluiu posteriormente (fracções cerca de 199-235) (Figura 35)].

Para eliminar o etanol do conjunto das fracções 62-169 e para concentrar o SCF procedeu-se do modo descrito a seguir, utilizando resina de permuta iónica de Q-Sepharose de caudal rápido (Pharmácia). Diluiu-se o conjunto (5 litros) com água até um volume de 15,625 litros,cor rigindo-se a concentração do etanol para cerca de 20 $ (v/v). Em seguida, adicionou-se base Tris 1M (135 ml) para se obter um pH de 8 seguido por Tris-HCl 1M, pH8, (23,6 ml) para se obter uma concentração total de Tris de 10 mM. Em seguida, adicionaram-se Tris-HCl 10mM, pH 8 (cerca de 15,5 litros para se obter um volume total de 31,25 litros e a concentração de etanol de cerca de 10 $ (v/v). Em seguida, aplicou-se o mate rial à temperatura de 4sc numa coluna de Q-sepharose de cau dal rápida (altura 6,5 cm, diâmetro 7 cm) equibrada com Tris-HC1 10 mM, pH 8 e, em seguida, lavou-se a coluna com 2,5 litros de tampão de coluna. 0 caudal durante a aplicação da amostra e a lavagem foi cerca de 5,5 litros/hora. Para eluir

145 o SCF ligado, bombou-se NaCl 200 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8 na direcção inversa através da coluna a cerca de 200 ml/hora. Recolheram-se fracções de cerca de 12 ml, analizaram-se e determinou-se a absorvância a 280 nm e efectuou-se a SDS-PAGE, do modo indicado anteriormente. Reuniram-se as fracções 16-28 (157 ml).

Em seguida, aplicou-se este conjunto contendo SCF em dois ensaios cromatográficos separados (78,5 ml aplicados para cada um) a uma coluna de filtração por gel Sepharose S-200 HR (Pharmacia) (5 x 138 cm) equilibrada com cloreto de sódio tamponado com fosfato à temperatura de 42C. Recolheram-se fracções de cerca de 15 ml com um caudal de cerca de 75 ml/hora. Em cada caso o pico principal do material com absorvância a 280 nm eluiu nas fracções que cor respondiam aproximadamente a um volume de eluição compreendida entre 1370 e 1635 ml. As fracções que representam as absorvâncias máximas, nos ensaios das duas colunas foram reunidas num único conjunto de 525 ml contendo cerca de 2,3 S de SCF. Este material esterilizou-se por filtração através de um cartucho com uma membrana Millipore Millipak 20.

Alternativamente, o material proveniente da coluna pode concentrar-se por ultrafiltração e mudar-se o tampão por diafiltração antes da filtração esterilizante.

material de SCF

1-164 humano recombi ¹⁴⁶ -/ nante isolado é muito puro (t>98 % porSDS-PAGE com coloração de prata) e considera-se de grau farmacêutico. Aplicando os métodos descritos no Exemplo 2, verificou-se que o material tem uma composição de aminoácidos que condiz com a espe rada, de acordo com a análise do gene SCF e tem a sequência de aminoácidos N-terminal Met-Glu-Ile..., como esperado,com a retenção de Met codificado pelo codão de iniciação.

Pelos processos comparáveis aos descri tos para SCF^ humano expresso em E. coli pode recuperar-se SCF^ murino (também presente sob a forma insolú vel no interior da célula após fermentação) num estado purificado com actividade específica biológica elevada. Similarmente, podem recolher-se SCF humano e SCF. .mu1-183 ^1-193 rino.

SCF^ 1^3 murino, durante a duplicação/oxidação, tende a formar espécies oxidadas de forma mais variada e as espécies não pretendidas são mais difíceis de remover por cromatografia.

SCF^ ^{murin0 e} ° ^SCF1_183 são susceptíveis à degradação proteolítica durante os ros estádios de recuperação, isto é, solubilização e cação/oxidação. Um sítio principal para a proteólise localizado entre os resíduos 160 e 170. Pode diminuir-se a proteólise por uma manipulação apropriada de condições (por exemplo, concentração de SCF; variação de pH; inclusão de humano primei dupliestá

EDTA 2-5 mM, ou outros inibidores de protease) e as formas

- 147 degradadas na quantidade em que estão presentes podem ser removidas por passos de fraccionamento apropriados.

Embora a utilização da ureia para solu bilização e durante a duplicação/oxidação, como indicado, seja um aspecto preferido, podem utilizar-se eficazmente outros agentes de solubilização tais como o cloridrato de guanidina (por exemplo 6 M durante a solubilização e 1,25 M durante a duplicação/oxidação) e sarcosina N-lauroil-sarcosina de sódio. Após remoção dos agentes depois da duplicação/oxidação, pode recolher-se SCF purificados, como determinado por SDS-PAGE , com a utilização de passos de fraccionamento apropria dos.

Além disso, embora a utilização de glutatião 1 mM durante a duplicação/oxidação seja preferida, podem-se uilizar outras condições com eficácia igual ou quase igual. Estes incluem, por exemplo, a utilização em vez de glutatião 1 mM, glutatião 2 mM mais glutatião 0,2 mM ou glutatião 4 mM mais glutatião oxidado 0,4 mM ou 2-mercaptcetanol mM ou também outros reagentes de tiol.

Além dos processos cromatográficos descritos, pode ser útil a utilização de outros processos para a recuperação de SCFs numa forma activa purificada incluindo a cromatografia de interacção hidrofóbioa [por exem pio, o uso de fenil-sepharose (Pharmacia) aplicando a amostra a pH neutro na presença de sulfato de amónio 1,7 M e eluindo com um gradiente de sulfato de amónio decrescente];

148 cromatografia de afinidade de metal imobilizado [por exemplo, o uso de Sepharose de quelação (Pharmacia) carregada com ião Cu , aplicando a amostra a um pH próximo da neutralidade na presença de imidazol 1 mM e eluindo com um gradiente de imidazol crescente]; cromatografia com hidroxilapatite [que se aplica na amostra a pH neutro na presença de fosfato 1 mM e eluindo com um gradiente de fosfato crescente]; e outros processos que são do conhecimento dos especialistas na matéria.

Outras formas de SCF humano que correspondem no todo ou em parte às cadeias de leitura abertas que codificam os aminoácidos 1-248 representados na Figura 42, ou que correspondem a cadeias de leitura abertas codifica das por eventuais mRNAs provenientes de excisão/reparação alternativa (tais como representados pela sequência oDNA na Figura 44), podem também ser expressos em E. coli e recupe rados sob a forma purificada por processos similares aos des. critos neste Exemplo ou por outros processos conhecidos pelos especialistas na matéria.

A purificação e formulação das formas que incluem a chamada região de transmembrana referida no Exemplo 16 podem envolver a utilização de detergentes, inclu indo detergentes não iénicos, e lípidos, incluindo estruturas lipossómioas que contêm fosfolípidos.

- 149 - / .¾

Exemplo 11

SCF recombinante proveniente de células de mamíferos

A. Fermentação de células CHO que produzem SCF

Desenvolveram-se células (CHO) provenientes de ovário de hamster chinês, recombinantes, (estirpe CHO pDSR<\2 hSCF₁ ^₂) em microveículos em um sistema de cultura de perfusão de 20 litros para aprodução de SCF^ ^g₂ humano. 0 sistema fermentador '· é similar ao utilizado para a cultura de células BRL 3A, no Exemplo 1B, excepto no seguin te: o meio de desenvolvimento utilizado para a cultura de células CHO foi uma mistura de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e mistura nutriente de Ham F-12 numa proporção de 1:1 (GIBCO), suplementado com glutamina 2 mM, aminoácidos não essenciais (para duplicar a concentração existente pela utilização de uma diluição de 1:100 de Gibco N2 320—1140) e soro de bovino fetal a 5 55. 0 meio de colheita foi idêntico excepto na omissão do soro. 0 reactor foi inoculado com 5,6x x 10θ células CHO desenvolvidas em dois frascos giratórios de 3 litros. Deixaram-se desenvolver as células até uma con— 5 centração de 4 x 10 células/ml. Neste altura, adicionaram-se ao reactor 100 g de microveículos citodex-2 esterilizados previamente (Pharmacia), sob a forma de uma suspensão de 3 litros em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato. Deixaram-se as células a ligar e a desenvolver nos microveículos durante quatro dias. Perfundiu-se um meio de desenvolvi, mente através do reactor, conforme o necessário com base no /

150 consumo de glucose. A concentração de glucose foi mantida aproximadamente em 2,0 g/litro. Após quatro dias, perfundiu-se o reactor com seis volumes de meio isento de soro para remover a maior parte do soro (concentração de proteína 50 ^ug/ml). Em seguida, trabalhou-se com o reactor por partidas até a concentração da glucose ser inferior a 2 g/litro. A partir daqui, trabalhou-se com o reactor num caudal de perfu são contínua de aproximadamente 20 litros/dia. Manteve-se o pH da cultura em 6,9+0,3 pon ajustamento do caudal de CC>₂. Manteve-se o oxigénio dissolvido superior a 20 % da satu ração de ar mediante adição de oxigénio puro, de acordo com as necessidades. Manteve-se a temperatura em 37²C + 0,5C.

No sistema citado anteriormente obtiveram-se aproximadamente 450 litros de meio condicionado isento de soro que se utilizou como material inicial para a purificação de SCF^ ^₂ humano recombinante.

Também se obtiveram aproximadamente 589 litros de meio condicionado isento de soro de um modo similar mas utilizando a estirpe CHO pDSR c<2 rSCF^^ como material inicial para a purificação de SCF^_^g₂ murino.

n - - . - - \ _e

Puri-ficação de SCF^ .^murino expresso por mamífero recombinante

Todo o processo de purificação foi realizado à temperatura de 4sc, salvo indicação em contrário.

151

1. Concentração e diafiltração meio condicionado gerado por o desen volvimento em meio isento de soro de SCF^ murino de célu las da estirpe CHO pDSR©<2 do modo descrito na secção A anterior foi dorificado por filtração através de cápsulas sartorius de 0,45/u (Sartorius). Submeteram-se separadamente vários lotes diferentes (36 litros, 101 litros, 102 litros, 200 litros e 150 litros) a concentração e diafiltração/permuta de tampão. Para exemplificar, a transformação do lote de 36 litros foi efectuada do seguinte modo: o meio condicionado filtrado foi concentrado até cerca de 500 ml utilizando um dis. positivo de ultrafiltração de fluxo tangencial Millipore Pelico com três cassetes de membrana de acetato de celulose com um corte de peso molecular 10 000 [1,4 m (15 ft ) de área total de membrana; caudal de bombagem de cerca de 2 200 ml/minuto e caudal de filtração de cerca de 750 ml/minuto]. A diafiltração/permuta de tampão na preparação para a cromatografia de permuta aniónica foi em seguida realizada mediante a adição de 1 000 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 6,7-6,8 ao concentrado, nova concentração até 500 ml utilizando o dispositivo de ultrafiltração de fluxo tangencial, repetindo isto 5 vezes. A prepara ção concentrada/diafiltrada foi finalmente recuperada em um volume de 1 000 ml. 0 comportamento de todos os lotes de meios condicionados submetidos a concentração e diafiltração/ /permuta de tampão foi similar. As concentrações de proteína nos lotes, determinadas pelo método de Bradford [Anal. Biochem (1976) 248-254] utilizando como padrão albumina de soro

- 152 ,V

4’

bovino foram da ordem de 70-90 /ug/ml. 0 volume total de meio condicionado utilizado nesta preparação foi cerca de 589 litros.

2. Cromatografia de permuta aniónioa de fluxo rápido em

Q-sepharose

As preparações concentradas/diafiltradas de cada um dos cinco lotes de meio condicionado referidos anteriormente foram reunidas (num volume total de 5 000 ml). Corrigiu-se o pH para 6,75 por adição de HC1 1 M. Utilizaram-se 2 000 ml de HC1 10 mM pH 6,7, para obter uma condutividade de oerca de 0,700 mmho. Aplicou-se a preparação a uma coluna de permuta aniónioa de fluxo rápido de Q-Sepharose (36 x 14 cm; Pharmacia resina de fluxo rápido de Q-Sepharose) que tinha sido equilibrada com Tris-HCl 10 mM, tampão de pH 6,7. Após a aplicação da amostra, lavou-se a coluna com 28 700 ml de tampão Tris. Em seguida, a esta lavagem lavou-se a coluna com 23 000 ml de ácido acético 5 mM glicina 1 mM, ureia 6M/ CuSO^ 20/UM a pH de cerca de 4,5. Em seguida, lavou-se a coluna com Tris-HCl 10 mM, CuSO^ 20>uM, tampão de pH 6,7, para se retomar o pH neutro, removeu-se a ureia e aplicou-se um gradiente salino num total de 40 litros (0-700 mM de NaCl em Tris-HCl 10 mM, CuSO^ 20 /uM, e tampão de pH 6,7). Recolheram-se fracções de cerca de 490 ml com um caudal de cerca de 3 250 ml/hora. 0 cromatograma está representado na Figura 36. MC/9 cpm refere-se à actividade biológica no ensaio MC/9; ensaiaram-se 5 ^ul das fracções indicadas. Os

- 153·>

eluídos recolhidos durante a aplicação da amostra e lavagens não estão indicados na Figura; não se detectou actividade biológica nestas fracções.

3- Cromatografia utilizando resina de hidrocarboneto ligado a sílica

Reuniram-se as fracções 44-46 proveni entes do ensaio representado na Figura 36 (11 200 ml) e adicio nou-se EDTA até uma concentração final de 1 mM. Aplicou-se este material com um caudal de cerca de 2 000 ml/hora a uma coluna (Vydac Proteins ; 7x8 cm) equilibrada com tam pão A Tris 10 mM, pH 6,7/etanol a 20 $). Após a aplicação da amostra lavou-se a coluna com 1 000 ml de tampão A. Em seguida aplicou-se um gradiente linear desde tampão A até tampão B Tris 10 mM, pH 6,7/etanol a 94 %) (volume total 6 000 ml) e recolheram-se fracções de 30-50 ml. As porções da amostra inicial da coluna , desenvolvidas e lavadas em conjunto juntamente com alíquotas de 0,5 ml das fracções do gradiente foram dialisadas contra solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato na preparação para o ensaio biológico. Estas diversas fracções foram analisadas pelo ensaio MC/9 (aliquotas de 5/Ul de fracções de gradiente preparado; cpm na Figura 37). Na Figura 3θ apresenta-se a SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685; os geles de desenvolvimento (stacking”) continham 4 % (p/v) de acrilamida e os geles de separação continham 12,5 % (p/v) de acrilamida] de aliquotas das várias fracções. Para os geles representados, as alíquotas da amostra (100 /il) foram secas sob vazio e em seguida redissolvidas uti

154 »» lizando tampão de tratamento de amostra, 20/ul (redução, isto é, com 2-mercaptoetanol) e submetidos a ebulição durante 5 minutos antes da impregnação no gel. As marcas numeradas à esquerda da Figura representam as posições de migração dos marcadores de peso molecular (reduzidos) como na Figura 6.

As pistas numeradas representam as fracções correspondentes recolhidas durante a aplicação da última parte do gradiente. Os geles foram corados com prata [Morrissey, Anal.Biochem., 117, (1981) 307-310].

4. Cromatografia de permuta aniónica de fluxo rápido de Q-Sepharose

Reuniram-se as fracções 98-124 provenientes da coluna C^ que se representam na Figura 37 (1050 ml). Diluiu-se o conjunto a 1:1 com tampão' Tris 10 mM, pH 6,7 para reduzir a concentração de etanol. Em seguida aplicou-se o conjunto diluído a uma coluna de permuta aniónica de fluxo rápido de Q-Sepharose (3,2 x 3 cm, Pharmacia resina de fluxo rápido de Q-Sapharose ) que tinha sido equilibrada com Tris-HC1 10 mM tampão de pH 6,7· 0 caudal foi de 463 ml/hora. Após a aplicação da amostra, lavou-se a coluna com 135 ml de tampão de coluna e eluiu-se o material ligado por lavagem com Tris-HCl 10 mM, NaCl 350 mM, pH 6,7· A direcção do escoamento da coluna foi invertida para minimizar o volume de mate rial eluído e recolheram-se fracções de 7,8 ml durante a eluição.

5.

*

Cromatografia de filtração por gel Sepharose S-200HR

Reuniram-se as fracções que continham a proteína eluída proveniente da lavagem salina da coluna de panmfca aniónicai de fluxo rápido de Q-Sepharose (31 ml). Aplicaram-se 30 ml a uma coluna de filtração por gel Sepharose S-200HR (Pharmacia) (5 x 55,5 cm) equilibrada com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato. Recolheram-se fracções de 6,8 ml com um caudal de 68 ml/hora. Reuniram-se as fracções correspondentes ao máximo da absorvância a 280 nm foram recolhidas, que representam o material purificado final.

Quadro 15 apresenta o resumo da purificação .

Quadro 15

Resumo da purificação de SCF^ ^murino expresso por mamífero

Proteína

Volume (ml) total (mg)*

Meio condicionado (concen	7 000	28 420
trado)
Q-Sepharose de fluxo rápido	11 200	974
Resina C^	1 050	19
Q-Sepharose de fluxo rápido	31	20
Sephacryl S-200 HR	82	19**

*Determinado pelo método de Bradford (supra, 1976).

**Determinado como 47,3 mg por análise quantitativa de aminoácidos aplicando uma metodologia similar à descrita no Exemplo 2

- 156 -

A sequência de aminoácidos N-terminal de SCF^ ,j62 murino purificado é aproximadamente metade de Gin-Glu-Ile... e metade PyroGlu-Glu-Ile..., tal como se determina pelos métodos descritos no Exemplo 2. Este resultado indica que o SCF₁_₁g₂ murino é o produto de processamento proteolítico/cisão entre os resíduos indicados como os números (-1) (Thr) e (+1) (Gin) na Figura 14C. Do mesmo modo,

SCF^ ig₂ humano purificado proveniente de meio condicionado de células CHO transfectadas (em seguida) tem uma sequência de aminoácidos N-terminal Glu-Gly-Ile, que indica que é o produto de processamento/cisão entre os resíduos indicados como os números (-1) (Thr) e (+1) (Glu) na Figura 15C.

Utilizando-se o protocolo descrito anteriormente obter-se-à a proteína de SCF humano purificada, quer sob formas recombinantes expressas em células CHO, quer de derivação natural.

Outros métodos de purificação que são uti lizados para a purificação de SCFs recombinantes derivados de células de mamíferos incluem os que foram descritos nos Exemplos 1 a 10 e outros métodos evidentes para os técnicos.

Outras formas de SCF humano, que correspondem a toda ou parte fecadeia de leitura aberta codificada por formas de mRNAs provenientes de excisão/reparação alter nativa (tal como a sequência de cDNA representada na Figura 44) podem ainda ser expressas em células de mamíferos e recu peradas sob a forma purificada por processos similares aos

157 descritos no presente Exemplo ou por outros procedimentos evi dentes para os especialistas na matéria.

C. SDS-PAGE e tratamentos com glicosidade

Na Figura 39 representa-se a SDS-PAGE de fracções reunidas provenientes da coluna de filtração por gel Sephacnyl S-200 HR; utilizaram-se 2,5 /ul do conjunto (pista 1). A pista foi corada com prata. Os marcadores de peso mole cular (pista 6) como os descritos para a Figura 6. 0 material de migração diferente acima e ligeiramente abaixo da posição do marcador de M^ de 31 000 representa o material com actividade biológica; a heterogeneidade aparente é larga medida devida à heterogeneidade da glicosilação.

Para caracterizar o material purificado por glicosilação, tratou-se este com várias glicosidaáes e analisou-se por SDS-PAGE (condições de redução) e visualizou-se por coloração com prata. Os resultados apresentam-se na Figura 39· Pista 2., neuraminidase. Pista 3., neuraminidase e 0-glicanase. Pista 4_, neuraminidase, O-glicanase e N-glicanase. Pista 5, neuraminidase e N-glicanase. Pista

N-glicanase. Pista _8, N-glicanase sem substrato. Pista 2, O-glicanase sem substrato. As condições foram sulfonato de 3[(3-colamidopropil)dimetilamónio]-1-propano 10 mM (chaps , 2-mercaptoetanol 66,6 mM, 0,04 % (p/v) de azida de sódio, solução de cloreto de sódio tamponada, com fosfato, durante 30 minutos à temperatura de 37²C, seguido de incubação

- 158-/ a metade das concentrações indicadas, na presença de glicosidases durante 18 horas à temperatura de 37-C.

Utilizou-se uma concentração final de neuramidase de 0,5 unidades/ml (proveniente de Arthrobacter ureafaoiens; fornecido por Calbiochem.). Utilizou-se 0-gli canase (Genzyme; endo-alfa-N-acetil-galactosaminidase) na concentração<Ue 7,5 miliunidades/ml. Utilizou-se N-glicanase a 10 unidades/ml, (Genzyme; péptido: N-glicosidase F; peptido-N -[N-acetil-beta-glucosaminil]-asparagina amidase).

Quando apropriado realizaram-se várias incubações de controlo. Estas incluíram: incubação sem glicosidase, para verificar se os resultados eram devidos às preparações de glicosidase adicionadas; incubação com proteínas glicosiladas (por exemplo eritropoiétina humana recom binante glicosilada) que se sabe serem substratos para as gli. cosidades, para verificar se as enzimas de glicosidase utilizadas eram activas; e incubação com glicosidases sem substrato, para avaliar se as preparações de glicosidase contribuíram para ou abscureceram as bandas de gel visualizadas (Figura 39, pistas 8 e 9).

Numerosas conclusões podem ser retiradas das experiências descritas anteriormente. Os diversos tratamentos com N-glicanase [que remove os hidratos de carbono quer complexados quer N-ligados a manose superior (Tarentino et al., Biochemistry, 24 (1988) 4665-4671 ],com neuraminidase (que remove resíduos de ácido siálico) e com O-glicanase

159 [que remove certos hidratos de carbono, 0-ligados (Lambin et al., Biochem. Soc. Trans., 12 (1984) 299-600)], sugerem que os hidratos de carbono N-ligados e 0-ligados estão ambos presentes; o ácido siálico está presente com pelo menos algum fazendo parte dos radicais 0-ligados. 0 facto de o tratamento com N-glicanase poder converter o material hetero géneo evidenciado por SDS-PAGE numa forma de migração mais rápida que é muito mais homogénea indica que todo ou parte do material representa o mesmo polipéptido, sendo a heterogeneidade provocada principalmente pela heterogeneidade de glicosilação.

Exemplo 12

Preparação de SCF^ ^^PEG recombinante

Utilizou-se como material inicial SCF^ murino, purificado a partir de um sistema de expressão de E. coli recombinante de acordo com os Exemplos 6A e 10, para a modificação de polietilenoglicol descrita a seguir.

Adicionou-se metoxipolietilenoglicol-suc cinato de succinimidilo (18,1 mg = 3,63 /umol; SS = MPEG = = Sigma Chemical Co. N² M3152, de peso molecular aproximado= = 5 000) em 0,327 ml de água deionizada a 13,3 mg (0,727 ^Umole) de SCF^ murino recombinante em 1,0 ml de fosfato de sódio 138 mM, NaCl 62 mM, acetato de sódio 0,62mM pH 8,0. Agitou-se cuidadosamente a solução resultante (100 rpm) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida,

160 aplicou-se uma alíquota de 1,0 ml da mistura reaccional final (10 mg de proteína) a uma coluna de filtração por gel Pharma cia Superdex 75 (1,6 x 50 cm) e eluiu-se com fosfato de sódio 100 mM pH 6,9, com um oaudal de 0,25 ml/minuto à temperatura ambiente. Desprezaram-se os’-primeiros 10 ml de efluente da coluna e recolheram-se em seguida fracções de 1,0 ml. Leu-se em contínuo a absorvância no ultravioleta (280 nm) do efluente da coluna, que se apresenta na Figura 40A. Reuniram-se as fracções números 25 a 27 e esterilizou-se por ultrafiltra ção através de uma membrana de polissulfona de 0,2 yu (Gelman Sciences N2 4454) e designou-se o conjunto resultante por PEG-25. Identicamente, reuniram-se as fracções 28 a 32, esterilizou-se por ultrafiltração e designou-se por PEG-32. A mistura de fracções PEG-25 continha 3,06 mg de proteína e a mistura de fracções PEG-32 continha 3,55 mg de proteína, calculados pelas medições a A280 utilizando para a oalibração uma absorvância de 0,66 para uma· solução de 1,0 mg/ml de SCF^ murino não modificado. A parte de SCF^ que não reagiu, correspondente a 11,8 % da proteína total da mis. tura reaccional, eluiu nas fracções 34 a 37· Sob condições cromatográficas similares, SCF^ ^g^ murino não modificado eluiu como o pico principal com um volume de retenção de

45,6 ml (Figura 40B). As fracções número 77 a 80 da figura 40A continham N-hidroxissuccinimida e um produto de reacção secundário de SCF, , murino com SS-MPEG.

1-164

Os grupos amino potencialmente reactivos em SCF.] ^g^ murino incluem 12 resíduos de lisina e o grupo alfa-amino do resíduo de glutamina N-terminal. As fracções

161 /

reunidas PEG-25 continham 9,3 moles de grupos amino reactivos por mole de proteína, tal como foi determinado por titu lação espectroscópica com ácido trinitrobenzeno-sulfónico (TNBS) utilizando o método descrito por Habeeb, Anal.Biochem. , 14 (1966) 328-336. De um modo idêntico, a mistura de fracções PEG-32 continha 10,4 moles e o SCF^ ^g^ murino não modificado continha 13,7 moles de grupos amino reactivos por cada mole de proteína, respectivamente. Deste modo, um número médio de 3,3 (13,7 menos 10,4) grupos amino SCF^^g^ murino, na mistura de fracções PEG-32 foram modificados mediante reacção oom SS-MPEG. Do mesmo modo, um número médio de 4,4 grupos amino de SCF^^g^ murino, na mistura de fracções PEG-25 foram modificados. Pelos procedimentos anteriores também se modificou o SCF humano (hSCF^ ^g^) pro duzido de acordo com o método descrito no Exemplo 10. Especificamente, reagiram 714 mg (38,5 pmoles) de hSCF^ ^g^ com

962,5 mg (192,5 ^umoles) SS-MPEG em 75 ml de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 8,0, durante 30 minutos à temperatura ambiente. Aplicou-se a mistura reaccional a uma coluna de Sephacryl S-200 HR (5 x 134 cm) e eluiu-se com PBS (solu ção de cloreto de sódio tamponada com fosfato Gibco Dulbecco sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio) com um caudal de 102 ml/hora e recolheram-se fracções de 14,3 ml. Reuniram-se as fracções N2 39 a 53 análogos ao conjunto PEG-25, citado anteriormente e representado na Figura 40A e verificou-se conter um total de 354 mg de proteína. No exemplo 8C apresenta-se a actividade in vivo em primatas deste

162

SCF modificado.

Exemplo 13

Expressão do receptor de SCF em blastocitos leucémicos

Recolheram-se blastocitos leucémioos pro venientes de sangue periférico de um doente com uma leucemia mista. Purificaram-se as células por centrifugação em gradi ente de densidade e depleção de aderência.

Iodou-se SCF₁ humano de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 7· Incubaram-se as células com diferentes concentrações de SCF iodado como descrito por [Broudy, Blood 75 (1990) 1622-1626], Os resultados da experiência da ligação ao receptor estão apresentados na Figura 41. A densidade do receptor avaliou-se em aproximadamente 70 000 receptores/células.

Exemplo 14

Actividade de SCF humano em precursores linfóides jovens

Estudou-se a capacidade de SCF^ murino recombinante (rrSCF^ ig/’ para actuar sinergicamente com IL-7 para reforçar a proliferação de células linfóides, em culturas de agar de medula óssea de murganho. Neste ensaio, as colónias formadas apenas com rrSCF^ continham monócitos, neutrófilos e blastocitos, enquanto as colónias estimuladas com IL-7 sozinhoouem associação com

- 163 rrSCF^ ^g₄ continham principalmente pré-células B. As pré-células B, caracterizadas como B 220⁺, slg“, cyu⁺, foram identificadas por análise FACS de células reunidas, utilizando anticorpos marcados com fluorescência para o antigene B220 [Coffman, Immunol. Rev., 69 (1982) 5 ] e para Ig de superfície (FITC-anti-K desenvolvido na cabra, Southern Biotechnology Assoe. Birmingham, AL); e por análise de tiras de citospina para a expressão citoplásmica yU utilizando anticorpos marcados com fluorescência (TRITC-antiyu desenvolvido na cabra Southern Biotechnology Assoe.,]. Obteve-se IL-7 humana recombinante (rhIL-7) na Biosours International (Westlake Village, CA). Quando se adicionou rrSCF^ ^g₄ em associação com o factor de crescimento de pré. -células BI-7, observou-se um aumento sinérgico na formação de colónias (Quadro 16), indicando um _;papel estimulador de rrSCF^ ^g₄ sobre as progenitoras de células B jovens.

Quadro 16

Estimulação da formação de colónias de pré-células B por rrSCF^ ^g₄ em associação com hIL-7

Factores de crescimento

Número de colónias

Salina 0 rrSCF₁_₁g_l| 200 ng 13 + 2

100 ng 7 + 4 ng 4+2

164 -

-«*

Quadro 16 (Cont.)

Factores de crescimento	Número de <	colónias^
rhIL-7 200 ng		21+6
100 ng		18 + 6
50 ng		13 + 6
25 ng		4 ± 2
rhIL-7 200 ng + rrSCF^ ^g^	200 ng	60 + 0
100 ng +	200 ng	48 + 8
50 ng +	200 ng	24 + 10
25 ng +	200 ng	21+2

Ί -· * 4 „ _z

Número de colónias por 5 x 10 células de medula óssea de murganho plaqueadas

Cada valor é a média de placas em triplicado + o desvio-padrão.

Exemplo 15

Identificação do receptor para SCF

A. 0 receptor para SCF^ ^^é o Kit-C

Para verificar se SCF^ ^g^ é o ligando para Kit-C amplificou-se o cDNA para C-Kit murino completo [Qiu et al., EMBO J. , 7. 1988) 1003-101 1 ] utilizando

PCR proveniente da linha de células MC/9 reactivas a

165 ^scf1_164 t^{Nabel et} al., Nature, 291 (1981) 332-334] com ini ciadores concebidos a partir da sequência publicada. A ligação do ligando e os domínios de transmembrana de ”C-Kit humano codificado pelos aminoácidos 1-549 [Yarden et al. , EMBO J. , 6. ( 1987) 3341-3351 ], foram clonados utili zando técnicas similares da linha de células de eritroleucemia humana, HEL [Martin e Papayannopoulou, Science 216 (1982) 1233-1235].

Os cDNAs do Kit-C foram inseridos no vector de expressão de mamíferos V19.8 trasnfectado em células COS-1 e as fracções da membrana preparadas para os 125I-SCF murino ou ensaios de ligação utilizando humano de acordo com os métodos descritos nas secções B e C, a seguir. No Quadro 17 apresentam-se os resultados de um ensaio de ligação típico. Não houve ligação específica detec humano às células COS-1 transfectatável de ¹²⁵I-SCF

1-164 das apenas com V19.8. contudo, as células COS que exprimem a ligação do ligando ”Kit-C recombinante humano, mais os r 12F domínios da transmembrana (hcKit-LT1) ligaram-se a ³I-hSCF^ (Quadro 17). A adição de um excesso molar de

200 vezes a SCF^ humano não marcado reduziu a ligação para os níveis residuais. Do mesmo modo, as células COS-1 transfectadas com um Kit-C murino completo (mcKit-L1)

125 ligam-se a I-SCF^ murino. Deteotou-se a ligação de

125 uma pequena quantidade de de células COS-1 com V19.8 sozinho e também se observou nas

1-SCF.j nos transfectantes

166 células não transfectadas (não representado), o que indica que as células COS-1 exprimem o Kit-C endógeno. Esta descoberta está de acordo com a larga distribuição celular da

125 expressão do Kit-C. ^I-SCF^^^ murino liga-se identi camente ao Kit-C murino e humano embora I-SCF^ huma no se ligue com menor actividade ao Kit-C murino (Quadro 17). Este resultado é coerente com o comportamento de reac tividade cruzada entre as espécies de SCF^^^· SCF^^g^ murino, induz a proliferação da medula óssea humana com uma actividade específica similar à de' SCF^_^g₄ humano, embora a poliferação induzida por SCF^_^₄ humano de mastócitos murinos ocorra com uma actividade específica 800 vezes menor do que a proteína murina.

Em resumo, estes dados confirmam que as anormalidades fenotípicas expressas por murganhos mutantes W ou S1 são as consequências de defeitos primários nas interacções receptor Kit-C/ligando que são críticas para o desenvolvimento de diversos tipos celulares.

Quadro 17

Ligação de SCF^_₁g com Kit-C recombinante expresso em células COS-1

Plasmídeo Transfectado	SCF. >25I-SCFb ’	Humano 125 c 3I-SCF+frio	Ligação cPlZ SCF. , ..murino 125I-SCF^ 125I-SCF+frio<
V19.8	2 160	2 150	1 100	550
V1 9.8:hckit-LT1	59 350	2 380	70 000	1 100
V19.8:mckit-L1	9 500	1 100	52 700	600

- 167 - / ί

Ζ ô «*

Apresentou-se a média de determinações em duplicado; a experiência foi realizada independentemente com resultados similares, três vezes.

^125 ^I-SCF^ humano 1,6 nM °125

I-SCF^ humano 1,6 nM + SCF^ humano não marcado

320 nM d-l oq

I-SCF^ murino 1,6 nM ^e1 25

1-SCF.j murino 1,6 nM + SCF^ murino não marcado

320 nM

B. Expressão de Kit-C recombinante em células COS-1

Os clones de cDNA de Kit-C” murino e humano foram derivados utilizando técnicas PCR[Saiki et al., Scince, 239 (1988) 487-491] de RNA total isolado por um pro cedimento de extracçãõ com fenol ácido/clorofórmio [Chomczynsky e Sacchi, Anal. Biochem., 162, (1987) 156-159] da linha de células de eritroleucemia humana HEL e células MC/9, respectivamente. Os oligonucleótidos de sequência única foram concebidos a partir de sequências de Kit-C murino e humano publicadas. 0 cDNA da primeira cadeia foi sintetizado a partir de RNA total de acordo com o protocolo fornecido com a enzima, transcrição inversa Mo-MLV (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD), utilizando eomo iniciadores oligonucleótidos

168 /

/'

-¾.. ..,,**¹⁵* anti-sentido de Kit-C. A amplificação das regiões sobrepostas da ligação do ligando Kit-C e os domínios da tirosina quinase foi realizada utilizando pares apropriados de iniciadores de Kit-C. Estas regiões foram clonadas no vector de expressão de mamífero V19-8 (Figura 17) para a expressão em células COS-1. A sequência de DNA de vários clones revelou mutações independentes, presumivelmente aparecendo durante a amplificação do PCR em cada clone. Construiu-se um clone isento destas mutações mediante reunião de fragmentos de restrição isentos de mutação de clones sepa rados. Apareceram algumas diferenças da sequência publicada, em todos ou em cerca de metade dos clones; concluiu-se que estas são as sequências realmente presentes na linha de células utilizada e podem representar diferenças alélicas das sequências publicadas. Construiram-se os plasmídeos seguintes nos vectores V19.8: V19.8: mckit-LT1, o Kit-C” murino completo; e V19.8: hckit-L1 , que contém a ligação do ligando mais a região de transmembrana (aminoácidos 1-549) do Kit-C humano. Os plasmídeos foram transfectados para células COS-1 essencialmente do modo descrito no Exemplo 4.

125

C. Ligação de I-SCF^ a células COS-1 que exprimem Kit-C recombinante

Dois dias· após a transfecção, retiraram-se as células COS-1 da placa, lavaram-se com PBS e congelaram-se até utilização. Após descongelamento ressuspenderam-se as

- 169 células em Tris-HCl 10 mM, MgCl^ 1 mM contendo PMSF 1mM,

100 /ug/ml de aprotinina, 25 jug/ml de leupeptina, 2 yug/ml de pepstatina e 200 /ig/ml de TLCK-HC1.

Dispersou-se a suspensão retirando e introduzindo com uma pipeta 5 vezes, incubou-se em gelo durante 15 minutos e hemogeneizaram-se as células com 15-20 ciclos de um homogeneizador de Dounce. Adicionou-se sacarose (250 mM) ao homogeneizado e aglomeraram-se a fracção nuclear e as células residuais não fragmentadas, por centrifugação a 500 x g durante 5 minutos. Centrifugou-se o sobrenadante a 25 ooo x g durante 30 minutos à temperatura de 42C para aglomerar os fragmentos celulares restantes. Marcou-se SCF^ humano e murino com iodo radioactivo utilizando cloramina T [Hunter e Greenwood, Nature, 194 (1962) 495-496]. Incubaram-se as fracções da membrana de células COS-1 com I-SCF^ humano ou murino (1,6 nM) com ou sem um excesso 200 vezes molar de SCF^ ^g^ não marcado em tampão de ligação, constituído por RPMI suplementado com albumina de soro bovino a 1 ?e HEPES 50 mM (pH 7,4) durante 1 hora à temperatura de 222C. Na conclusão da incubação de ligação, as preparações de membrana foram cuidadosamente depositadas em 150 /Ul de ftalato em óleo e centrifugadas durante minutos numa microcentrífuga Beckman 11 para separar o

125 125 ^I-SCF^g^ ligado à membrana do ^I-SCF^ ^g^ livre.

25 cou-se ⁵I-SCF

1-164

Retiraram-se os aglomerados e quantifiassociado à membrana.

- 170

/ .¾

Exemplo 16

Isolamento de um cDNA de SCF humano

A. Construção de uma biblioteca de cDNA HT-1080

Isolou-se RNA total a partir de uma linha de células de fibrossarcoma humano HT-1080 (ATCC CCL121) por extracção ácida com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio [Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156], e recuperou-se RNA poli (A) utilizando uma coluna de rotação oligo (dT) adquirida a Clontech. Preparou-se cDNA de cordão duplo a partir de 2 /ig de R-EfcA. poli (A) com um conjunto de síntese de cDNA BRL (Bethesda Research Laboratory) sob condições recomendadas pelo fornecedor. Ligaram-se aproximadamente 100 ng de cDNA de cordão duplo fraccionado na coluna com um tamanho médio de 2Kb, com 300 ng do vector digerido com Sall/Notl pSPORTI [D'Alessio et al., Focus, 12 (1990) 47-50] e transformou-se por electroporação em células DH5 <c< (BRL, Bethesda, MD) [Dower et al., Nucl. Acids Res., _16_, (1988) 6127-6145].

B. Sondagem da biblioteca de cDNA

Dividiram-se aproximadamente 2,2 x 10 transformantes iniciais em 44 misturas, contendo cada uma cerca de 5 000 clones individuais. Preparou-se DNA plasmídico a partir de um conjunto pelo método de precipitação CTAB-DNA do modo descrito por Del Sal et al., Biotechniques,

(1989) 514-519].

Digeriram-se 2 mierogramas de cada DNA plasmídico com a enzima de restrição Not 1 e separou-se por electroforese em gel. Transferiu-se DNA linearizado para membrana GeneScreem Plus (DuPont) e hibridou-se com cDNA de 32

SCF humano gerado por PCR marcado com p (Exemplo 3) sob as condições descritas anteriormente (Lin et al., proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985) 7580-7584]. Identificaram-se da hibridação três misturas (pools) contendo sinal positivo. Estas misturas de colónias foram novamente sondadas pelo processo de hibridação de colónias (Lin et al., Gene 44 (1986) 201-209] até se obter de cada mistura uma única colónia. 0 tamanho dos cDNA destes três colones isolados situava-se entre 5,0 e 5,4 Kb. As digestões com enzimas de restrição e a determinação da sequência nucleotídica na extremidade 5' indi caram que dois dos três clones eram idênticos (10-1a e 21-7a). Continham ambos a região codificadora e a região não traduzida 5’ de 200 pb (5’ UTR). 0 terceiro clone (26-1a) era apro ximadamente 400 pb mais pequeno na extremidade 5’ do que os outros dois clones. A sequência deste cDNA de SCF humano apresenta-se na Figura 42. É de particular nota a sequência do domínio da transmembrana hidrófoba que começa na região dos aminoácidos 186-190 e termina no aminoácido 212.

C. Construção de pDSRo«r2 hSCF^ _2ΐ|θ

Obteve-se pDSR$<2 hSCF^ ^43 utilizan do os plasmídeos 10-1a (como referido no Exemplo 16B) e

172 pGEM3 hSCF^ como segue: A inserção de HindIII proveni ente de pGEM3 hSCF^ foi transferida para M13mpl8. Modificaram-se os nucleótidos imediatamente a montante do codão de iniciação ATG por mutagénese de sítio dirigido a partir de tttccttATG para gccgccgccATG utilizando o oligonucleótido anti-sentido

5’-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T3 ’ e o conjunto de sistema de mutagénese in vitro oligonucleótido-dirigida e protocolos de Amersham Corp. para se obter M13mpl8 hSCF^^ -164· Este DNA foi digerido com HindIII e inserido em pDSR^P que tinha;sido digerido com HindIII. Este clone é designado por pDSRc<2 hSCF^ -jgjj· θ DNA proveniente de pDSRo<^2 hSCFp,^ ^g^ foi digerido com Xbal e as extremidades do DNA foram tornadas coincidentes mediante a. adição do enzima de Klenow e quatro dNTPs. Após terminar esta reacção digeriu-se ainda o DNA com a enzima Spel. Digeriu-se o clone 10-1a com Dral para se obter uma extremidade 3’ coincidente com a cadeia de leitura aberta na inserção e com Spet que corta no mesmo sítio no gene em pDSR⁸*^ hSCF^^ ^g^ e em 10-1a. Ligaram-se estes DNAs para se obter pDSRor2 hSCF^^ 248*

D. Transfecção e imunoprecipitação de DNA com pDSR⁰^ hSCF_K·] _24o ^de células COS

Transfectaram-se células COS-7 (ATCC CRL 1651) com DNA construído do modo descrito anteriormente.

173 _ ζ

Ζ'

Submeteram-se a electroporação células 4 x 10° células em. 0,8mLDMEM + 5 $ FBS a 1600 V com 10/ig de DNA de pDSR<X2 hSCF^^ 248 °^{U COm 10 de DNA d0 vector} pDSR c<2 (vector de controlo). Após a eletroporação, replaquearam-se as célu las em duas placas de 60 mm. Após 24 horas substituiu-se o meio por meio completo recente.

horas depois da transfecção, mar35 cou-se cada placa com meio S de acordo com uma modificação do protocolo de Yarden et al., [PNAS, 87 (1990) 2569-2573] lavaram-se as células uma vez com PBS e em seguida incubaram-se com DMEM isento dê ;metionina e isento de cisteína durante 30 minutos (met^-cys^-DMEM). Retirou-se o meio e adicionou-se a cada placa 1 ml de metcys’DMEM contendo 100 /iCi/ /ml de marcador Trans S-Label (ICN), Incubaram-se as células durante 8 horas à temperatura de 37-C. Retirou-se o meio, clarificou-se por centrifugação para eliminar os fragmentos celulares e congelou-se à temperatura de -20^eC.

Imunoprecipitaram-se aliquotas de meio condicionado marcado de COS/pDSR 2 hSCF^^ 248 ^e 8o vector de controlo COS/pDSR c< 2 juntamente com as amostras 35 de meio de células CHO marcadas com S/pDSRof2 hSCF^_^g^ de células do clone 17 (ver Exemplo 5) de acordo com uma modificação do protocolo de Yarden et al. [EMBO, J., 6. (I987) 3341-3351]· Tratou-se 1 ml de cada amostra de meio condicionado com 10/ul de soro de coelho pré-imunizado (nS 1379 P.I.). Incubaram-se as amostras durante 5 horas à temperatura de

42C. Adicionaram-se a cada tubo 100 microlitros de uma suspen- 174 são a 10 55 de Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiocbem.) em NaCl 0,15 mM,Tris 20 mM pH 7,5, 0,2 % de Triton x-100.

Incubaram-se as amostras durante mais 1 hora à temperatura de 4²C. Reuniram-se os complexos imunes por centrifugação a 13 000 x g durante 5 minutos. Transferiram-se os sobrenadantes para novos tubos e incubaram-se com 5 /ul de anti-soro policlonal de coelho (n2 1381 TB4), purificado do modo descrito no Exemplo 11, contra hSCF^ derivados de CHO, durante uma noite à temperatura de 4²C. Adicionaram-se 100/Ul de Pansorbin durante 1 hora e aglomeraram-se os complexos imu nes como anteriormente. Lavaram-se os aglomerados 1 x com tam pão de lise (0,5 # de Na-desoxicolato, 0,5 % de NP-40, NaCl 50 mM, Tris 25 mM, pH8, 3 x com tampão de lavagem NaCl 0,5M , Tris 20 mM, pH 7,5, 0,2 % de Triton x 100) e 1 x com Tris 20 mM, pH 7,5. Ressuspenderam-se os aglomerados em 50 /il de Tris 10 mM, pH 7,5, 0,1 % de SDS, /^-mercaptoetanol 0,1 M.

Eluiu-se a proteína de SCF mediante ebulição durante 5 minutos. Centrifugaram-se as amostras a 13 000 x g durante 5 minutos e recolheram-se os sobrenadantes.

tratamento com glicosidases completou-se do seguinte modo: adicionaram-se a 25 )ul das amostras de complexo imune, 3/ul de CHAPS 75 mM contendo 1,6 mU de 0-glicanase, 0,5 U de N-glicanase, 0,o2 U de neuraminidasee incubaram-se durante 3 horas à temperatura de 37²C. Adicionou-se um volume igual de tampão de amostra 2 x PAGE e submeteu-se a ebulição durante 3 minutos. Submeteram-se as amostras digeridas e as amostras não digeridas a electrofo175

rese em gel de redução SDS-poliacrilamida a 15 % durante a noite a 8 mA. Fixou-se o gel em metanol-ácido acético, tratou-se com reforçador Enligfeéning (NEN) durante 30 minutos, secou-se e expôs-se a película Kodak XAR-5 á temperatura de -70²C.

A Figura 43 representa a auto-radiografia dos resultados. As pistas 1 e 2 são amostras das culturas de controlo C0S/pDSR<=-<2, as pistas 3 e 4 de COS/pSR°<2 hSCFg^ ₂₄g, as pistas 5 e 6 de CH0/pDSRe<'2 hSCF^ ^54· ^As pistas 1, 3 e 5 são imunoprecipitados não digeridos; as pistas 2, 4 e 6 foram digeridos como glioanases do modo descrito anteriormente. As posições dos marcadores de peso mole, cular indicam-se à esquerda. 0 processamento de SCF em células COS transfectadas com pDSRo^ 2 hSCF^.^ 248 θ muito semelhante ao de hSCF^ segregado por células CHO transfectadas com pDSRX 2 hSCF^ (Exemplo 11). Este facto sugere fortemente que o processamento proteolítico natural do sítio que liberta SCF das células está na vizinhança do aminoácido 164.

Exemplo 17

Análise da estrutura quaternária de SCF humano

Após calibração da coluna de filtração por gel (ACA 54) descrita no Exemplo 1, para a purificação de SCF proveniente de meio de células BRL com padrões de peso molecular e após eluição de SCF purificado de outras colunas

176 ~ί .¾ de filtração por gel calibradas, é evidente que o SCF purificado proveniente de meio celular BRL apresenta um peso molecular aparente de aproximadamente 70 000 - 90 000 em relação aos padrões de peso molecular. Em contraste, o peso molecular aparente por SDS-PAGE é aproximadamente 28 000-35 000. Embora se reconheça que as proteínas glicosiladas podem comportar-se de forma anómala nestas análises, o resultado sugere que SCF murino derivado de BRL pode existir sob a forma de dímero associado de modo não covalente, sob as condições de não desnaturação. Aplicam-se resultados semelhantes às formas de SCF recombinantes (por exemplo SCF^ ^g^ humano e murino derivado de E. coli, SCF^ ^g₂ humano e murino derivado de células CHO) em que o peso molecular estimado por filtração em gel sob condições de não desnaturação é aproximadamente duplo do estimado por filtração em gel sob condições de desnaturação (isto é, na presença de SDS) ou por SDS-PAGE, em cada caso particular. Além disso, a análise de velocidade de sedi mentação, que proporciona uma determinação rigorosa do peso molecular em solução, fornece um valor de cerca de 36 000 para o peso molecular de SCF^ ^g^ humano recombinante proveniente de E. coli. Este valor é de novo aproximadamente o dobro do observado por SDS - PAGE (cerca de 18 000 a 19 000). Portanto, embora se reconheça que devem existir estados oligo míricos múltiplos (incluindo o estado monomérico), parece que predomina o estado dimétrico em certas circunstânoias em solu

177

Exemplo 18

Isolamento de clones de cDNA de SCF humano proveniente da linha de células 5637

A. Construção de uma biblioteca de cDNA 5637

Isolou-se RNA da linha de células 5637 de carcinoma da bexiga humana (ATCC HTB-9), pelo método de extracção ácida com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio [Choczynski et al., Anal.Biochem, 162, (1987) 156], e recolheu-se RNA de poli (A) utilizando uma coluna de rotação oligo (dT) fornecida por Clontech. Preparou-se cDNA de cordão duplo a partir de 2 /ig de RNA poli (A) com um conjunto (Kit) de síntese de cDNA de BRL nas condições recomendadas pelo fornecedor. Ligaram-se aproximadamente 80 ng de cDNA de cordão duplo, fraccionado na coluna com um tamanho médio de 2 Kb, com 300 ng de vector pSPORT 1 digerido com Sal 1/ /Not 1 [D’Abssio et al., Focus, 12, (1990) 47-50] e transformou-se por electroporação em células DH5 °< [Dower et al., Nucl. Aoids Res., 16., ( 1 988) 6127-6145].

B. Sondagem da biblioteca de cDNA

Dividiram-se em 30 misturas (pools) aproximadamente 1,5 x 10 transformantes primárias contendo cada um cerca de 5 000 clones individuais. Breparou-se DNA plasmídico, a partir de cada mistura (pool) pelo método de precipitação de DNA por CTAB, do modo descrito por Del Sal

- 178 -

et al., Biotechniques, 7, ( 1989) 514-519]. Digeriram-se /ig de cada mistura de DNA plasmídico com a enzima de restrição Not 1 e separaram-se por electroforese em gel. Transferiu-se o DNA linearizado para membrana GeneScreem Plus (DuPont) e hibridou-se com cDNA de SCF humano completo marcado com P isolado a partir da linha de células HT 1080 (Exemplo 16) nas condições descritas previamente [Lin et al., proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985) 7580-7584]. Da hibridação identificaram-se sete misturas (pools) contendo sinal positivo. Sondaram-se novamente as misturas (pools”) de colónias utilizando cDNA de SCF humano gerado por PCR marcado com P (Exemplo 3) pelo processo de hibridação de colónias [Lim et al., Gene, 44 (1986) 201-209] até se obter uma única colónia a partir de quatro das misturas. 0 tamanho das inserções dos quatro clones isolados foi aproximadamente 5,3 Kb. As digestões com enzima de restrição e a análise de sequência nucleotídica das extremidades 5’ dos clones indicaram que os quatro clones eram idênticos. A sequência deste cDNA humano apresenta-se na Figura 44. 0 cDNA da Figura 44 codifica para um polipéptido em que os aminoácidos 149-177 das sequências da Figura 42 são substituídos por um único resíduo Gly.

Exemplo 19

Reforço por SCF da sobrevivência após irradiação letal

A. Actividade in vivo de SCF sobre a sobrevivência após irradiação letal

Testou-se o efeito de SCF na sobrevi179 vencia de murganhos após irradiação letal. Utilizaram-se murganhos com 10 a 12 semanas, fêneas, Balb/c. Em todas as experiências usaram-se grupos de 5 murganhos e agruparam-se de acordo com o peso do corpo, em cada experiência. Os murganhos foram irradiados com 850 rad ou com 950 rad numa dose única.Injectaram-se os murganhos só com factores ou com factores mais células de medula óssea de Balb/c normais. No pri meiro caso, injectaram-se os murganhos por via endovenosa, horas após irradiação com SCF^ ^g^-PEG murino (20 jug/kg), purificado a partir de E. coli e modificado por adição de polietilenoglicol do modo descrito no Exemplo 12, ou com solução saturada de cloreto de sódio para os animais de con trolo. Para a experiência de transplantação, injectaram-se os murganhos por via endovenosa com doses diversas de células de medula óssea de Balb/c normal 4 horas após a irradiação. 0 tratamento com SCF^ ^g^-PEG murino realizou-se pela adição de 200 jug/kg de SCF^ ^g^-PEG murino a uma suspensão de células 1 hora antes da injecção e administrado numa injecção única de factor mais as células.

Após a irradiação de 850 rads, injectaram-se os murganhos com SCF^ ^g^-PEG murino ou com uma solu ção de cloreto de sódio. Os resultados apresentam-se na Figura 45. A injecção de. SCF^ ^g^-PEG murino reforçou de forma signi ficativa o tempo de sobrevivência dos murganhos quando se comparou com 0 tempo dos animais de controlo (P 0,0001).Os murganhos injectados com solução de cloreto de sódio sobrevi180

V' veram em média 7,7 dias, enquanto os murganhos tratados com SCF₁_₁g^-PEG murino sobreviveram em média 9,4 dias (Figura 45). Os resultados apresentados na Figura 45 representam uma compilação de 4 experiências separadas com 30 murganhos em cada grupo de tratamento.

A maior sobrevivência dos murganhos tratados com SCF^ ^g^-PEG murino sugere um efeito de SCF sobre as células da medula óssea dos animais irradiados. Estudos pre. liminares dos parâmetros hematológicos destes animais mostraram aumentos ligeiros dos níveis de plaquetas comparadas com os dos animais de controlo 5 dias após a irradiação, enquanto 7 dias após a irradiação os níveis de plaquetas não estavam significativamente diferentes nos animais de controlo. Não sedetectaram diferenças nos valores de hematias e de leucócitos ou na celularidade da medula óssea.

B. Sobrevivência de murganhos transplantados tratados com

SCF

Quantidades de células de medula óssea de 10 # do fémur de murganhos Balb/c normais transplantada para murganhos irradiados com 850 rad podem fazer a recupera ção (rescue ”) de 90 # ou mais dos animais (dados não apresentados). Nestas condições, utilizou-se uma dose de irradiação de 850 rad com uma dose de transplante de 5 # do fémur para se estudar os efeitos de SCF^ ^g^-PEG murino sobre a sobrevivência. Com esta dose de células esperava-se que uma grande percentagem de murganhos que não receberam SCF não sobrts

181 vivessem; se o SCF^^^-PEG murino pudesse estimular as células transplantadas teria que haver um acréscimo na sobrevivência. Como se mostra na Figura 46, aproximadamente 30 56 dos murganhos de controlo sobreviveram 8 dias depois da irradiação. 0 tratamento com SCF^ ^g^-PEG murino resultou num aumento dramático da sobrevivência com mais de 95 55 de murga nhos sobreviventes pelo menos 30 dias (Figura 46). Os resultados apresentados na Figura 46 representam a compilação dos resultados de 4 experiências separadas com grupos de 20 murganhos para o controlo e para o tratamento com SCF^ ^^-PEG murino. Com doses de radiação mais elevadas, o tratamento de murganhos com SCF^ ^^-PEG murino conjuntamente com a trans plantação de medula também resultou numa sobrevivência acrescida (Figura 47). Os murganhos de controlo irradiados com 950 rads e transplantados com 1 0 55 de um fémur morreram cerca do 82 dia, enquanto aproximadamente 40 55 dos-murganhos tratados com SCF^ i^-PEG murino sobreviveram 20 dias ou mais. Dos murganhos de controlo transplantados com 20 % de um fémur 20 $ sobreviveram 20 dias enquanto os animais tratados com rSCF tiveram uma sobrevivência de 80 55 (Figura 47).

Exemplo 20

Produção de anticorpos monoclonais contra SCF

Injectaram-se murganhos fêmeas Balb/c de 8 semanas (Charles River, Xilmington, MA) por via subcutânea com 20 jjg de SCF^ humano expresso por E. coli em adjuvan te completo de Freund (H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit,

- 182 / (f

MI). Nos 142, 380 θ 57² dias administraram-se 50 /ug do mesmo antigéneo em adjuvante incompleto de Freund como imunizações de reforço. Três dias após a última injecçâo, sacrificaram-se dois murganhos e fundiram-se as células do baço com a linha de células de mieloma sp 2/0 de acordo com o processo descri, to por Nowinski et al., [Virology, 93 ( 1979) 1-11-116] · meio utilizado para a cultura de cé lulas de sp 2/0 e de hibridoma foi Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), (Gibco, Chagrin Falles, Ohio) suplementado com 20 $ de soro bovino fetal inactivado pelo calor (Phi bro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg/ml de piruvato déjsódio,

100 ϋ/ml de penicilina e 100 mcg/ml de estreptomicina (Gibco).

Após a fusão das células seleccionaram-se os híbridos em meio

HAT, o meio citado anteriormente contendo hipoxantina 10 M

-7 -5 aminopterina 4 x 10 Me timidina 1,6 x 10 M durante duas semanas e em seguida cultivados em meio contendo hipoxantina e timidina durante duas semanas.

As hibridomas foram sondadas do seguinte modo: sensibilizaram-se cavidades de poliestireno (Costar, Cambridge, MA) oom 0,25/Jg de SCF^ ^g^ humano de (E. coli) em 50 ,ul de tampão de hidrogenocarbonato 50 mM, pH 9,2, durante duas semanas à temperatura ambiente e, em seguida, durante toda a noite à temperatura de 42C. Em seguida, bloquearam-se as placas com 5 $ de BSA em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois incubaram-se com sobrenadante de cultura de hibridoma durante 1 hora à temperatura de 37²C. Decantou-se a solução e incubaram-se os anticorpos ligados

183 -

com uma diluição a 1:500 de IgG anti-murganho desenvolvido na cabra conjugado com peroxidase de rábano (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) durante 1 hora à temp£ ratura de 37²C. Lavaram-se as placas com solução de lavagem (KPL, Gaithersburg, MD) e, em seguida, desenvolveram-se com uma mistura de peróxido de hidrogénio e ABTS (KPL). Submeteu-se a colorimetria a 405 nm.

As culturas celulares hibridoma que segregavam o anticorpo específico para SCF^ ^g₄ humano (E. coli) foram ensaiadas por ELISA, do mesmo modo que nos proce dimentos de sondagem de hibridoma, para a reactividade cruzada para SCF₁ ^₂ humano (CHO). As hibridomas foram subclonadas pelo método de diluição limitante. Testaram-se 55 cavidades de sobrenadante de hibridoma fortemente positivas para SCF^ humano (E. coli); 9 destas apresentaram reacção cruzada com

SCF.J ^g₂ (CHO) humano.

Clonaram-se várias células hibridoma do seguinte modo:

Reactividade para SCF^ ^θ₂

164

Monoclone	Isotipo de IgG	humano (CHO)
4G12-13	IgG1	não
6C9A	IgG1	não
8H7A	IgG1	sim

Depositaram-se os hibridomas 4G12-13 θ 8H7A na ATCC a 26 de Setembro de 1990.

- 18.4Embora a presente invenção tenha sido descrita relativamene aos seus aspectos preferidos, compreende-se que os especialistas na matéria possam conceber variações e modificações. Portanto, considera-se que as reivindica ções apensas abrangem todas estas variações equivalentes que estão compreendidas no âmbito da invenção reivindicada.

Claims (17)

1. NOVAS REIVINDICAÇÕES

   1. - Processo para a produção de factos de células indiferenciadas, caracterizado pelo facto:

   a) de se promover o desenvolvimento, sob condições nutrientes apropriadas de células hospedeiras eucariõticas ou pro cariõticas transformadas ou transfectadas com uma sequência de ADN para a utilização na expressão correcta em uma célula hospe deira eucariótica ou procariótica de um produto polipeptldico com uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa da do factor de células de ocorrência natural para permitir a expressão da actividade biológica hematopoiética de factos de células indiferenciadas de ocorrência natural e de se escolher a sequência de DNA entre;

   -186/ // r

   i) sequências de ADN representadas a seguir:

   SEQUÊNCIA 143

   AAAGTATCZTTCTATTGGCGAAGGACATGTTTTCCcATAAGTGGT 4 5

   AAACAJlACTGTCTGCACAIAAIAATTATCTTGCTGCCGTAAAGAr 9 o

   TAGGTTAAATTCTGcCTTCGATCTAAAAACACACCCTTCTGTCAA 135

   TCCGAGGAGCAGTGTGCTAGTCTAGAGGTCTAAATGAAGGCTCCT 180

   TTCACGGTTGTATTTCTGCTCCCCAAATTGTCCACATTTAAAAGG 225

   AGAGTGCTTCTTTTCAGCCTTAGGCTCTGAATTTCATGCATTCCT 270

   CCATTTTCCGAGGTCCCccCcAAGTGATAATTCTGTTACACGTTG 315

   CTACAAGTTCATCCCTAATTGCCGTCAAGAAACTGACTGTAGAAG 3 60

   GCTTACCACAGACGTTGTAACCGACAGTAAAGCCAITGAAAGAGT 405

   AATTCAAACAGGATGGAAGCCAGGAGTATTTTGTGGCTGTTGCTC 450

   TTTTTCTTTTCAGTTTGGTGAGAGCAGCTTGAATGCTTAACATTT 495

   AAGCCATCAGCTTAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAAAAAACCC 540

   CGCTCTGGCATATTTGCACTTAACACATACGGTATAAGG7GTTAC 585

   TGGTTTGCATAGTTCTGGATTTTTTTTTTTTAAAAACTGATGGAC 630

   ThrTrpIlelleThrC

   ACCAAGAAATGTTTCTGTTCTTTGTTTAGACTTGGATTATCACTT 675 ysIleTyrLeuGlnLeuLeuLeuPheAsnEroLeuValLysThrG

   GCA777ATCT7CAACTGCTCC7AT77AATCC7CTCGTCAAAACTC 720

   1 10 lnGluIleCysÀrgAsn®roVal7hrA.spAsnValLysAspIlsT AGGAGATCTGCAGGAATCCrG7GAC7GAZAATG7AAAAGACAT7A 7 65 hrlysLeu

   187,,7

   SEQUÊNCIA 14B

   CAAAACTGGTAAGTAAAGAATGATTTTGGCATCTATAAGTCTTCC

   CTGTGCTTGCTGACCACATAGGTTCAGGGCACTCCCGACAGGAGT

   TCCCAGCTTTCTAAGATAAGGAATCACTGTACGAGTCTGAAGTGC

   TTCTTCTGGGCAAATGGGAGATGCTTAGGTCATGGAGGGTTTATC

   TGTATAACTGGCCCTTTGCACACCAACAAAGTGACTGACTGGCTT

   TTGCCTGTTACCTACTG 1007

   TCTCCAGTCCTGGGCATGGTATATACTTAGGCACCCAAGATTGGA 4 5

   TTTACAACTCAAGCATTATATATTGGACAACnACGGGGTATGAGA 90

   TATTAATGATATGTCAGGTTGGATGGATGAGTTTTCTCAAGAAAT 135

   Vai

   TCTCTTGTATTTACTCACGTTTTCATTTCTTGGTCTCTGTAGGTG 180

   AlaAsnLeuProAsnAspTyrMetlleThrLeuAsnTyrValAla GCGAATCTTCCAAATGACTATATGATAACCCTCAACTATGTCGCC 225

   GlyMetAspValLeu

   GGGATGGATGTTTTGGTATGTAGTCCACACACTTCTGAGTTGCCT 270

   TTTAGTAGCTAATGGGTGACCTGTGCTTATTCACATTGAAGACAT 315

   TATTTGCTCTTTGTCGTTTTTAGATGTTGACCTATAATTTTTCCT 360

   TCAAGCTGCTGCTAAGATTATCAGTGAGCATTTCAGTATGTGTTT 405

   TAAGCCTACTCAxTAAAAGGAAATGGCTCATCTTAGACGTAGCAA 450

   810

   855

   900

   945

   990

   -188SEQUÊNCIA 14B

   CCGATGTTAATTTTTCCCCAGGCATCTCTCAGAGGGACTTGAATG 495

   TTAAAATCATGTTAAATTTCCTCCTTGGCTATGTTATTTCTCATG 540

   GCTATGTTATTCCTATTCGTATTTCATTTAAAGGGACGGAATATT 585

   TATTGTATTTCTGAACTTTTTCAGGCATGCATCCGGGTCTTTGAA 630

   TAAAA 635

   CACTAAGACTCCTTCTAGTAATGTTTGTAATCCTGTCTGTATCGA 4 5

   ATGTCTTTGAAAACGCAGTGACTAAGCCATAAATAATCTTCCACA 9 0

   GAACGTCCAGTGGTTCATGAACTTTGTATGTGGGGGTGGGGCAAG 135

   AATTGTCTCACTATTGGTCAAGGAAGAGAAGGTAAGGTATGCAAG 180

   GGTGGTTTAATCTTCTTCCGTGGAAGGACAAAATCATCTATCATT 225

   TCCTCTGATCTCTATGCATTTGTTTGTTTTGAACTGAATCTGACT 270

   TGAGCAAGAGTTGGCGTCCTGTGTTCTGAGGAAACTCTTTGTCCT 315

   GCAGTCAGTGACTAAAAGTGCTGAGAGATCTGAAGAGCACTCTGA 360

   ATCTGCCATATTTTTAATAGATGCTTTGTCTTCTCTTTGAATTTC 405

   40 50

   ProSerHisCysTrpLeuArgAspMetValThrHisLeu

   TTCCAGCCTAGTCATTGTTGGTTACGAGATATGGTAACACACTTA 450

   SerValSerLeuThrThrLeuLeuAspLysPheSerAsnlleSer TCAGTCAGCTTGACTACTCTTCTGGACAAGTTTTCAAATATTTCT 4 95

   70 80

   GluGlyLeuSerAsnTyrSerllelleAspLysLeuGlyLysIle

   -189SEQUÊNCIA 143

   GAAGGCTTGAGTAATTATiCCATCATAGACAAACTTGGGAAAATA 540

   90 96

   ValAspAsp LeuValAl aCy sMe t G luGluAsnAl aP r oLy s GTGGATGACCTCGTGGCATGTATGGAAGAAAATGCACCTAAGGTA 585

   ACTTGGTATTCATCAGAATTATTTTTCTTATACT 619

   GAGCTCATGATGAGCAATTCACAACCACTTGTAATTCCAGCTCCA 4 5

   GAGGACATTATCCCCTCTTTGGATGCCATAGGAATCTGCTCTCAA 9 0

   ATATGTAGATACCACCTCTGCCACCTCAGCACATACATACACATA 135

   ATTAAAAAATAGAAACATTAAAGGAGTTCCAATCAATCCTTATTC 180

   TTTTCTGTATTCAGTATGCCCAGATGTAAATTCTAGGAATATGTT 225

   TTAAAGGCTAATTCTTATTTTGTAATAAGCAGCTTTAAAATTCTT 270

   AATTGTTTTTTCGGGTCACTTTATTGTCCTATTGCCACGACATTG 315

   TCCTGTCCCATTGTCTGTTATTCCTTCTGTTTTGTTTATTGTTCC 360

   CTAGTTACTTTGATCATGAGATTGACCTGTTACCCGTTGTTATTC 405

   TCTGTAGCCATTTTGAGTTGTGTCTATTAGAACAGCTGTTAAATT 450

   ACTTGAATCATTGAGGACATAGTCAATAATCTATTATGCTGATCC 4 95

   AGTCAAGTCTATGAGTTATTTGAAAACTAGAATCTTTGTTAATTA 54 0

   AsnValLys

   TTTGTTTGCTTGTTTGTTTGTTTATTATTTGTCTAGAATGTAAAA 585

   100 110

   GluSerLeuLysLysProGluThrArgAsnPheThrProGluGlu

   -190SEQUÊNCIA 14B

   GAATCACTGAAGAAGCCAGAAACTAGAAACTTTACTCC^GAAGAA 630

   120

   PhePheSerllePheAsnAxgSerlleAspAlaPheLysAspPhe TTCTTTAGTATTTTCAATAGATCCATTGATGCCTTCAAGGACTTC 675

   130 140

   MetValAlaSerAspThrSerAspCysValLeuSerSerThrLeu ATGGTGGCATCTGACACTAGTGATTGTGTGCTCTCTTCAACATTA 72 0

   148

   GlyProGluLysA

   GGTCCTGAGAAAGGTAAGGCTTTTAAGCATTTCTTGTTTAAATGT 7 65

   ACATAGAAAGCCTGAACTTCTGTAAGCCTCTACTGCTGAATCAAC 810

   TAAATGTGTTGCTGTAGAAAGAACGTGTGGGTTTTTCTGATAAAA 855

   ACAAAAAGCAAATATCAATGACTACCAATGATTATTATCTAGCTT 900

   GAGAGATATGCCCTAAGACAGCGATTCTCGATATTTCTAAATTAA 94 5

   AGAATTGTGTGATGGTGGCTCACATATTTTCTAACTGTGATATTT 990

   GCCAGGAGAGTAGAATAATGTTATTCTTCATCCCCAGAATTCCTA 1035

   AGATTTCACGTCTCATGTCTTTTCCATAAGGTTCAAACTCTGAGA 1080

   CTTGAGTTCTGAGCCTCAGCAGGTCATTCTGAATCCCCACTCTCC 1125

   CCGAGCTGGGTCCCTATGGGGGAACTAACTTCATTGCTTTCTTTT 1170

   AAAACATGACGAGTTACCAACAGCTCCTCGCTATTATAAACATGT 1215

   TCCTAAGCATGTCTGTGCATGCaATAAGCCTTCACTCTACAAGAC 1260

   AGTTATGGTGTATCGCTTGACAAAACTGAGCAGCCAAGCTGAGTA 1305

   TGAAATAATAATCTAGACTTGGGAGGCAGACCCAGCACCTACTGT 1350

   GATATTGCACTTCGCCTTTGGGGGACTCTATGATTCAAAAGTTCA 1395

   -191-

   SEQUÊNCIA 14B

   150 spSerArgV

   CCATGTAACACTGACACATTATTGCTTTCTATTTAGATTCCAGAG 1440

   160 alSerValThrLysProPheMetLeuProProValAlaAlaSerS TCAGTGTCACAAAACCATTTATGTTACCCCCTGTt GCAGCCAGTT 1485

   170 176 erLeuArgAsnAspSerSerSerSerAsn_

   CCCTTAGGAATGACAGCAGTAGCAGTAATAGTAAGTACACATATC 1530

   TGATTTACTGCATGCATGGCTCCAAGTATCCTCTATAGGAGTGTT 1575

   GCATGGACTTAAAGTTTATAAATCACTACTAATAATGCTGTTCTG 1620

   TCACTGTTATTCCTTGTATGGGCTTCCTGACAATTAAATATCTGG 1665

   TTTGTAGAATCGGATCTCCTTAGAGGTTAAGATGACCATGACAAA 1710

   ATTAGGCCAATCAACTTTCTGCGAAGGTTATTTTAAATAAGGCAC 1755

   GAAATTAATTGAAGGAAAAAAAAATACAAGCAAGGCCTTATTTTG 130 0

   AATCATGGTAGGCTTAAAATAGACTTTGTGGAGAATGTCCCTGAT 1845

   CAAAGTGGAGTTTTCAGATTTCAAGTGCATGTGCTAACTCTCCAC 19 90

   AATGTCAAGGCTATTTTCAGTTTTGTGTCTCCATATTTACTACTG 1935

   CATGTTTGGAAATTTGCTGATGCTGTTAGATTACCTAAGAATGTA 1980

   TGTTGAAGAAGAATGGACTTCTTTCCCTAAAATTTCTGTCCTCTT 2025

   TGcCCAAGAACCCAcGTTCCTGGAAGACTATCTTATTTTCATGTC 207 0

   TGTGCAATGATCATTATAAAGATTATTGAATATACTGGGAATACT 2115

   CTGGTTTCTGTTTTTACAGATTCATAATAGCTTATTCAGTCTTTA 2160

   AAGAAAGTTCTCTGAAGTCCATGCTTTAGAATGTTTCTCTATCAA 2205

   -192SEQUÊNCIA 14B

   AACTTGACCTGGACCTTAAATAAAGCTATATTTAGTCTTTTTATC 2250

   CCTGAAAAATATATTTCACAGTGTAGACATTTGATATACATCTAA 2295

   GGGAAGGATGCTGCCAGAATGCTCGGGCTGGCAGTCTACAAAGTC 2340

   CACTGCTCTCAGGATGGACTTCTGAAAGCGGAAATTGTGAACTGC 2385

   ATGCATATAACATATCAGATCCTCGAGC

   2413

   -193-

   O O o O o CM co •r O <O A rH CM <n en

   SEQUÊNCIA 14C o

   CM

   I m

   CM

   w gH cu 0 s Em Q to 0 > Em Em ai 0 0 Em 0 0 Em Em Em 0 0 0 z ri? >M ai tf 0 H Em A EM ω É* l£ Em 0 << 0 0 0 ai Em 0 E-t 0 OS 0 Q ai A Em z tf Q ai Ou ai a, 0 Em 0 O 0 Em 0 ai Em A E-J 0 0 Z «£ £ 0 to o Q tf tf ai Em Em Em 0 0 Em EM 0 A E-t A EM cu 0 u 0 tf Em > Em tf ai ai U Em Em 0 0 0 Em Em 0 tf £ 0 w ai A Em a tf ni M Em A 0 0 0 tf ai H 0 Em Em cj tf &u O rH σ ai Z ai to 0 Q < tf tf to *4 U 0 tf - >5 EM 0 Em 0 0 σ Em 0 O ai 0 O cu 0 o A Em O 0 0 O M 0 Oi CM 0 M* 0 M3 0 ffl 0 O ai O* 0 0 Em Em A H Ό 2 > Em A EM A Em A Em tf ai 2 0 Em 0 0 0 0 0 Em Em tf X > EM A EM > Em Em 0 tf tf > 0 0 0 ai tf 0 0 ai Em Em 0 tf -< A H tf <c □ ai Em 0 □ ai z 0 ai 0 0 0 Em rt* 0 0 ai z E-t CU 0 Em 0 Z EM >4 Em A EM tf ai 0 ai ai Em tf Em Em Em 0 0 0 Em Z H Em 0 0 to 0 A Em Ou O ai 0 tf tf 0 EM 0 0 0 0 Ε-· &U Em Q ai 0 > Em - CO 0 E-t Em 0 0 0 Em Em aí 0 4 Em 0 A Em tf f£ > Em to 0 >t tf Z 0 0 & 0 Em Em 0 0 EM tf Em Em A EM > Em ai A Em Z w 0 0 0 Em Em tf 0 0 Em 0 0 Fm 0 O A Em Z Z a tf tO 0 w 0 í-4 0 2 0 tf i EM 0 tf 0 0 σ O Q ai O A Em O Em 0 O A Em O z 0 0 A 0 n 0 m tf P» Em σ\ 0 Em Em 0 tf 0 E-t a EM Em 0 Em 0 > Em 0 0 0 0 ai 0 0 0 EM 0 0 tf 0 ai > Em A Em z Em M tf ai Em Em 0 ai ai 0 0 Em Em 0 Em Em

   GGCATGTATGGAAGAAAATGCACCTAAGAATGTAAAAGAATCACTGAAGAAGCCAGAAAC 420

   -194- ο

   ^S· ο

   ς· ιη ο

   ο

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   SEQUÊNCIA 15B hrGln

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   AGATACTACAAAGATAAATCAGTTGCACAAGTTCTTGAAACTCTA 4 5

   CAGTGTAATAAGGAAAAATAAGTCATGCATAAAAGCAACTATAAT ’ 90

   ACATAATAGAAAATGTTATTTTCAAGCCGATGTGTAGGTTATGTG 135

   TGTTCGAGAGAGAGAGAGAGAAGACAGATTACTTTCTGCTAGGGT 180

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   GCTAAAAAGCTGTGTTTCAAAATATTCTTTTGATGTCTCACAAAT 270

   TCAGTGGAATTCTCTTAGGTCTAAAAATATACATCTCTCTCACTT 315

   TAACTTGGTGTGCTATTGTAGATTATTGGATTAAAGCACTGCTCA 3 60

   GGGATTATGCTGCTTCTTGCCAAGCAGTCTACATTTAAAGTAGAA 4 05

   ATAAGATGTTTCTTTTGGTGCCATAAGGTATACATTTTATGCATT 450

   CTCTAGTTTTTAGAAGATACCCTAAGGGCTAAGTCTTTAACATGC 4 95

   TGCTACAAGTTTATTCCTAATTGCCATTGGGAAATTGGCTGAAGA -54 0

   AAGTTTTTAACAAAAGTTAACAATATTGTCATTGAGAGAATAATT 585

   CAAAATGGATTTTAACTAAAAGCTTTTAAAAACTTTGGTGAGCAT 630

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   SEQUÊNCIA 15B

   CTCTATAACTCATACAAATCACCATATAACACTGACACATTATTG 4 5

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   CTTTCTATTTAGATTCCAGAGTCAGTGTCACAAAACCATTTATGT 9 0

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   176 erAsnA

   GTAATAGTAAGTACATATATCTGATTTAATGCATGCATGGCTCCA 180

   ATTAGCACCTATAGGAGTATTGCATGGGCTTTCAAGGAAACTTCT 225

   ACATTTATTATTATTGATACTGTTCTGTTACTGTTATTCCTTTTA 270

   TGGTCTTCTTGAGACTTAAGTTTGTAGAATTAAATTTCCCTAGAG 315

   CTGGAGATAATGTTTAGAGAATTAGGCCAATAAATT.T

   352

   -197^ f

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   SEQUÊNCIA 15B

   CTCCTATTACAACATTTTAAGTAATGTAATATTAATTTTAAAAAT

   CTGGCCAGGCACGGTGGTTCATGCTTGTAATCCCAGCACATTGGG

   AAGCTGAGACGGGTGGATCATTTGAGGTCAGGAAGTTTGAGACAG

   CCTGGCCAACATGGTGAAACTTCCTCTCTACTAAAAATAAAAAAG

   TAGCCAGGCATGGTGGCAGGCACTTGTAATCTGAGCTACTCGAGA

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   AAGAAAACTCATCTAAGGTAACTTTGTGTTCATTGGGATTATTTT

   TCATTACGCTTCTCTAAAAACCCATGCTTCTTGGTGCTGTTGGGG

   AAAATGAGGCACCTTTATTTATGATATTTTGATTGTATAAACTTC

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   180

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   270

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   450

   495

   540

   585

   630

   675

   720

   765

   SEQUÊNCIA 15B

   ATTAGACTGGTCTTTTTGTGCATCAAGGCATTAGATGTTAAAAGT 720

   TTGAATGATTACAGATCTTAACTGATGATCACCAAGCAATTTTTC 7 65

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   AATGTTTTCCTAAAGTGGGGAAAGTAATCACTGGGTTACAATAAA 1035 α

   GGGTTTATAGAAAGCAGGTAGTGAGATATTTAGGGTCATGGATAA 1080

   TTTGTTGGTAAAACTGGCTAGTTGCACACCACTGCTGTGACTGCT 1125

   TCTTTGCTGGTCTTCTCCCCATCCTTCATAGGCAGTGAAGGACCT 1170

   TGGAGAGTTCGCTGTGTGCTGATGGGCTTGCCCCAGCTTGTTCCC 1215

   CATAATCTCTCCAGTGGGTTTCCCAGCATGTTCTATTCCCCTTCA 12 60

   CATGTCTTCCTACTCTTCTTTAAAAAGCCTAACGAAAGGAAATCT 1305

   GAAATGGCTATTCTCCCAATTCAATCAGCAGGAAGACCCTGTCAC 1350

   ATGTCAGTGGGTGTTTGCTCCTTCAGGGAACATAGAGAGGTGATT 1395

   CATTGCCCACATGTTGAAGGGACTCATCTCCCTGGTTTGTCACAT 1440

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   SEQUÊNCIA 15C

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   201-

   SEQUÊNCIA 42A

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   SEQUENCIA 42B

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   SEQUÊNCIA 44A

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   -206-

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   SEQUÊNCIA 44B

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   ATGATTCAGAAATTGGAACAGAATGTTTTACTGTGAAACTGGCACTGA 1088 ou as suas cadeias complementares

   -208- ii) sequências de ADN que hibridam com as sequências de ADN definidas na alínea i) ou os seus fragmentos; e iii) sequências de ADN que, se não fosse a degenere^ cência do código genético, hibridariam com as sequências de ADN definidas nas alíneas i) e ii); e

   b) de se isolarem os produtos peptídicos pretendidos da expressão de sequências de ADN no Vector referido.
2. 2. - Processo para a produção do factor de células indiferenciadas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN, citada antes, codificar para um factor de células progenitoras escolhido entre SCF³ 164, 164,

   SCF^1-130, SCF^1-148, SCF^{1 162}, SCF^{1 164}, SCF^1-165, SCF^1-183 da sequência 15C; SCF^1-185, SCF^{1 188}, SCF^{1 189} e SCF^1-248 da sequên cia 42; SCF^{1 157}; SCF^1-150, SCF^{1 161} e SCF^{1 220}.
3. 3. - Processo para a produção do factor de células de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN citada antes também codificar para uma metionina no factor de células indiferenciadas menos um (Met ³) do aminoãcido.
4. 4. - Processo para a produção do factor de células indiferenciadas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN citada antes codificar para um factor

   -209Ζ de células progenitoras escolhido entre (Met ¹) SCF² 164, (Met ¹) SCF^{5 164}, (Met¹) SCF^{1 130}, (Met¹) SCF^{1 148}, (Met¹) SCF^{1 162}, (Met¹) SCF^{1 164}, (Met¹) SCF^{1 165} e Met¹ SCF^{1 183} da sequência 15C; (Met¹) SCF^{1 185}, (Met¹) SCF^{1 188}, (Met¹) SCF^1-189 e (Met¹) SCF^{1 248} da sequência 42; (Met ¹) SCF^{1 160},(Met¹

   SCF¹ ^¹ e (Met ¹) SCF^{1 22}θ da sequência 44.
5. 5. - Processo para a produção de um factor de células indiferenciadas, caracterizado pelo facto de se ligar por covalência um po límero solúvel em água a um factor de células indiferenciadas pro. duzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1.
6. 6. - Processo para a produção de anticorpos específicos para o factor de células indiferenciadas,, caracterizado pelo facto de se imunizar um animal com reactividade imunológica para um factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1 e de se recuperarem os anticorpos produzidos que são específicos para o factor de células indiferenciadas.
7. 7. - Processo para a produção de anticorpos monoclonais para o factor de células indiferenciadas, caracterizado pelo facto de se imunizar um animal com reactividade imunológica para um factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o processo descri to na reivindicação 1, de se recolherem as células produtoras de anticorpos do animal imunizado, de se fundirem as células produto ras de anticorpos com uma linha de células imortal e de se recupe rarem as células fundidas capazes de manterem a produção de um an ticorpo para o factor de células.

   -210/ ff
8. 8. - Processo para se recuperar o factor de células indiferenciadas a partir de material contendo esse factor, caracterizado pelo facto de se submeter o material contendo o factor de células indiferenciadas a separação cromatogrãfica de permuta iónica.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a separação cromatogrãfica de permuta iónica ser uma separação cromatogrãfica de permuta aniónica.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de incluir ainda uma fase de separação por cromatogra. fia líquida de fase inversa.
11. 11. - Processo para a recuperação eficiente de factor de células indiferenciadas a partir de material contendo SCF, caracterizado pelo facto de incluir uma fase que consiste em submeter esse material a uma separação por cromatografia líquida de fase inversa.
12. 12. - Processo para a transferência de um gene para um mamífero, caracterizado pelo facto:

    a) de se cultivarem células indiferenciadas hematopoiéticas jovens na presença do factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1;

    b) de se transfectarem com um gene as células cultivadas na fase a) ; e

    c) de se administrarem as células transfectadas a esse

    -211Z mamífero.

    .¾
13. 13. - Processo para a transfecção de células hematopoiéticas jovens com um gene, caracterizado pelo facto:

    a) de se cultivarem células hematopoiéticas jovens com um factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o proces. so descrito na reivindicação 1; e

    b) de se transfectarem com um gene as células cultivadas na fase a).
14. 14. - Processo para o tratamento de uma doença, designadamente leu copenia, trombocitopenia, anemia, imuno-deficiência adquirida, neo plasia, lesão nervosa, infertilidade, lesão intestinal e doença mieloproliferativa, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade com eficácia terapêutica compreendida entre 10 e 300 jug/Kg/dia de um factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1.
15. 15. - Processo para reforçar um transplante de medula óssea duran te a transplantação em um mamífero caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade com eficácia terapêutica compreendida entre 10 e 300yig/Kg/dia de um factor de células indiferenciadas preparado de acordo com o processo descrito na reivindicação 1.
16. 16. - Porcesso para favorecer a recuperação da medula óssea no tratamento da aplasia medular óssea ou da supressão medular indu zidas por radiação, acção química ou quimioterapia, caracterizado

    -212/ pelo facto de se administrarem doses com eficácia terapêutica compreendidas entre 10 e 300 ia de um factor de células indiferenciadas produzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1.
17. 17. - Processo para isolar ADN codificador de factor de células indiferenciadas caracterizado pelo facto:

    a) de se obter uma sequência de aminoãcidos para o fac tor de células indiferenciadas produzido de acordo com o proces. so descrito na reivindicação 1;

    b) de se construir uma sonda oligonucleotídica correspon dente à sequência de aminoãcidos obtida na fase a);

    c) de se hibridar um oligonucleotido obtido na fase b) com uma biblioteca genõmica ou de cADN; e

    d) de se isolar o ADN híbrido que codifica para o factor de células indiferenciadas.