KR100193050B1 - 혈세포 관련 질환을 치료하기 위한 인체 유래의 간세포 인자(stemcellfactor), 그를 암호화하는 dna시퀀스, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents

혈세포 관련 질환을 치료하기 위한 인체 유래의 간세포 인자(stemcellfactor), 그를 암호화하는 dna시퀀스, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 간 세포 인자들(Stem cell factors) 및 그를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 및 그의 제조방법에 관해 발표해 놓은 것이다.
또한 본 발명은 혈 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물 및 그를 이용한 치료방법에 관해서도 발표해 놓았다.

Description

[발명의 명칭]
혈세포 관련 질환을 치료하기 위한 인체 유래의 간 세포 인자(Stem Cell Factor), 그를 암호화하는 DNA 시퀀스, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물
본원은 참고문헌으로 인용한 1989년 10월 16일자 제422,383호의 일부 계속 출원인 1990년 6월 11일자 제537,198호의 일부 계속 출원인 1990년 8월 24일자 제573,616호의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 일반적으로 혈세포 관련 질환을 치료하기 위해 초기 조혈 선조세포를 포함하는 원시 선조세포를 자극하는 간 세포 인자(stem cell factor), 특히 인체 유래의 간세포 인자 및 그러한 인자를 암호화하는 DNA 시퀀스에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이들 간 세포 인자와 그들의 단편, 폴리펩티드 유사체 및 그러한 인자를 암호화하는 DNA 시퀀스를 제조하는 방법 및 제약학적 조성물에 관한 것이다.
[본 발명의 배경]
인체의 혈액 형성(조혈)계는 다양한 백혈구 세포(호중구, 대식세포, 백혈구, 비만세포, 호산구, T 및 B세포), 적혈구세포(적혈구) 및 혈병 형성세포(거핵구, 혈소판)로 구성되어 있다. 소량의 특정 조혈 성장 인자로 인해 이들 간 세포의 거대한 증식 및 이들 주(line)로 부터 성숙 혈세포의 궁극적인 분화를 위한 소수 간 세포의 다양한 혈세포 선조로의 분화가 설명된다고 믿어진다. 조혈 재생계는 정상 조건하에서 기능을 잘 수행한다.
그러나, 화학요법 방사선, 또는 선천성 척수형성 이상증에 의해 스트레스를 받을시 말기의 환자는 심한 백혈구 감소, 빈혈, 또는 혈소판 감소가 발생한다. 조혈 성장 인자의 사용 및 전개는 이 위험한 단계동안 골수 재생을 가속화 한다.
후천성 면역 결핍증(AIDS)과 같은 특정 바이러스에 의해 유도되는 질병은 T 세포와 같은 혈액 요소가 특이하게 파괴되는 경우가 있다. T 세포 생성의 증대가 이와 같은 경우에 치료에 도움이 될 수 있다.
조혈 성장 인자는 극소량으로 존재하기 때문에, 이 인자의 검출 및 확인은 인공 조건하에서의 배양세포에 대한 자극적인 효과를 기초로 하여 상이한 인자들 중에서 구별해 내는 일련의 분석법에 달려있다.
재조합 유전 기술의 응용으로써 개별 성장 인자들의 생물학적 활성도에 대한 이해가 명백해 졌다. 예를들어, 적혈구의 생성을 자극하는 인체 에리스로포이에틴(EPO)의 아미노산 및 DNA 시퀀스를 수득하였다(본원에서 참고문헌으로 인용한 Lin의 미국 특허 제4,703,008호 참조).
또한 재조합 방법이 다음과 같은 인자들의 cDNA분리해내는데 응용되어져 왔다 : 인체의 과립구 군체 자극인자, 즉 G-CSF (본원에서 참고문헌으로 인용한 Souza의 미국 특허 제4,810,643호 참조), 및 인체의 과립구 대식세포 군체 자극인자(GM-CSF) [Lee등의,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82. 4360-4364 (1985) : wong 등의, Science, 228, 810-814 (1985)], 쥐과(科)의 G- 및 GM-CSF [Yokota 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070(1984) ; Fung등의, Nature, 307, 233(1984) ; Go㎍h등의, Nature, 309, 763(1984)], 및 인체의 대식세포 군체 자극 인자 (CSF-1) [Kawasaki 등의, Science, 230, 291 (1985)].
고도의 증식가능 군체 형성 세포(HPP-CFC) 분석계는 초기 조혈 선조세포에 대한 자들의 작용을 시험한다 [Zont의 J. Exp. Med., 159, 679-690 (1984)]. HPP-CFC 분석에서 활성인 인자에 관한 문헌에는 많은 보고가 있다.
이들 인자의 원(source)이 표1에 나타나 있다. 가장 잘 특정화된 인자에 대해서는 아래에 논의되어 있다.
인체 지라의 조정배지 내에서의 활성도는 공력 인자(SF)라 명명되었다. 몇몇 인체조직 및 인체·생쥐 세포주는 최초의 HPP - CFC 를 자극하기 위해 CSF-1과 상조하는, SF-1 이라 일컫는 SF를 생성한다. SF-1 은 인체의 지라 세포, 인체의 태반 세포, 5637세포(방광암 세포주), 및 EMT-6 세포(생쥐 유방암 세포주)에 의해 조정된 배지내에 존재한다고 보고되어져 왔다. SF-1의 동일성은 아직 결정되지 않았다. 초기 보고문은 5637 세포주로부터의 SF-1과 인터루킨-1의 중복 활성도출 입증해 준다[Zsebo 등의, Blood, 71, 962-968 (1988)].
그러나 부가 논문에서는 인터루킨-1 (IL-1)과 CSF-1의 결합이 5637 조정배지의 부분 정제한 제제 및 CSF-1 과 함께 수득될 수 있는 것과 유사한 군체 형성을 자극할 수 없다는 것을 입증하였다[McNiece의 Blood, 73 919 (1989)].
임신한 생쥐의 자궁 추출물에 존재하는 공력 인자는 CSF-1이다. WEHI-3세포(쥐 골수성 단구의 백혈병 세포주)는 IL-3와 동일한 것으로 나타난 공력 인자를 생성한다. CSF-1및 IL-3은 모두 SF-1의 표적물보다 더 성숙한 조혈 선조 세포를 자극한다.
다른 부류의 공력 인자가 TC-1 세포들(골수에서 파생된 간질세포)로 부터의 조정배지내에 존재한다고 밝혀졌다.
이 세포주는 초기 골수세포 유형 및 림프세포 유형을 모두 자극하는 인자를 생성한다. 그것은 혈 림프형성 성장인자 1(HLGF-1)이라 명명되었다. 그 인자의 겉보기 분자량은 120,000이다(McNiece 등의 Exp. Hematol., 16, 383 (1988)].
공지된 인터루킨 및 CSFs중의 IL-1, IL-3, 및 CSF-1 이 HPP-CFC분석에서 활성도를 소유하는 것으로써 확인되어져 왔다. 표1에 언급된 공력 활성도의 다른 원은 구조적으로 확인되지 않았다 .
폴리펩티드 시퀀스 및 생물학적 활성도의 측면을 기초로 하여, 본 발명은 IL-1, IL-3, CSF-1및 SP-1과는 구별되는 분자에 관해 기술하였다.
장관 투여를 하였을때, 가끔 단백질은 순환으로부터 신속히 청소되며 비교적 단명하는 제약학적 활성도가 유도될 수 있다. 결과적으로, 생체활성 단백질의 비교적 많은일회 투여량을 자주 주사하는 것이 치료 효능을 지속시켜 주기 위해 요구될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스, 텍스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프로린의 공중합체를 공유결합시킵으로써 변형된 단백질은 그에 상응하는 변형되지 않은 단백짙의 경우보다 피하 주사후 혈액내에서 상당히 긴 반감기를 나타낸다고 알려져 있다[Abuchowski 등의 Enzymes as Dr㎍s, Holcenberg 등 출판인 Wiley-Interscience, 뉴욕, 뉴욕주, 367-383 (1981), 및 Newmark등의 J. App1. Biochem4 : 185-189(1982), 및 Katre 등의 Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 84, 1487-1491 (1987)]. 또한 그러한 변형은 수용액 내에서 단백질의 가용성을 증가시키고, 응결물을 제거하고 그 단백질의 물리 화학적 안정성을 수행하고 그 단백질의 면역항원성 및 항원성을 크게 감소시킬 수 있다.
결과적으로, 생체내 바람직한 생물학적 활성도는 변형되지 않는 단백질을 덜 빈번히 투여하거나 더 소량의 투여량으로 그러한 중합체-단백질 부가물을 투여함으로써 성취될 수 있다.
단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 결합은 PEG가 포유동물에서 매우 낮은 특성을 가지기 때문에 특히 유용하다[Garpenter 등의 Toxicol. App1. Pharmacol., 18, 35-40 (1971)]. 예를들어, 아데노산 디아미나제의 PEG 부가물이 인체의 심한복합 면역 결핍증을 치료하기 위해 사용된다고 입증되었다.
PEG의 결합에 의해 제공되는 두번째 잇점은 이형 단백질의 면역항원성 및 항원성을 효과적으로 감소시키는데 있다.
예를들어, 인체 단백질의 PEG 부가물이 심한 면역반응을 유인하는 위험이 없이 다른 포유동물종에서의 질병을 치료하는데 유용할도 모른다.
PEG와 같은 중합체들이 아미노 말단 아미노산의 알파-아미노기, 리신 측쇄의 엡실론 아미노기, 시스테인 측쇄의 황화 수소기, 아스파틸 및 글루타밀 측쇄의 카르복실기, 카르복시말단 아미노산의 알파-카르복실기, 티로신 측쇄, 또는 일정 아스파라긴, 세린 또 트레오닌 잔기에 결합된 글리코실 측쇄의 활성화된 유도체와 같은 단백질내에서의 하나 이상의 재활성 아미노산 잔기에 알맞게 연결될 수 있다.
단백질과의 직접 반응에 적합한 PEG의 수많은 활성형에 대해 기술하여 왔다. 단백질의 아미노기와의 반응을 위해 유용한 PEG 시약에는 카르복실산의 활성 에스테르 또는 탄산염 유도체, 특히 N-히드록시숙신아미드, P-니트로폐놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술폰산염인 잔여기가 포함되어 있는것을 포함한다. 말레이미도 또는 할로아세틸기를 함유하는 PEG유도체가 단백질의 자유 설프히드릴기를 변형시키는데 유용한 시약이다. 또한, 아미노기, 히드라진기 또는 히드라지드기를 함유하는 PEG시약은 단백질내 탄산염기의 과요오드산염 산화에 의해 생성된 알데히드와 반응시키기에 유용하다.
본 발명의 목적은 초기 조혈 선조세포의 성장을 일으키는 인자를 제공함에 있다.
[본 발명의 요약]
본 발명에 따라 본원에서 간 세포 인자 (SCF) 라 일컫는 초기 조혈 선조세포를 포함하는 원시 선조세포의 성장을 자극하는 능력을 가지는 새로운 인자를 제공한다. 또한 이 SCFs는 중성 간 세포 및 원시 생식 간 세포와 같은 비조혈 간 세포를 자극할 수 있다. 그러한 인자에는 정제된 자연 발생적인 간 세포 인자가 포함되어 있다. 또한 본 발명은 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 자연 발생적인 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드 생성물을 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 안전하게 발현시키는데 사용하기 위한 분리된 DNA 시퀀스를 제공한다. 그러한 DNA 시퀀스는 다음을 포함한다 : (a)제14B, 14C, 15B, 15C, 42 및 44도에 제시한 DNA 시퀀스 또는 그의 상보가닥 ; (b)(a)의 DNA시퀀스에 혼성화하는 DNA시퀀스 또는 그의 단편 ; 및 (c)유전 암호의 동의성이 없을시 (a)와 (b)의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA시퀀스 및 동일한 아미노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 시퀀스.
또한 상기 DNA 시퀀스를 함유하는 벡터, 및 그러한 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주세포를 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 기술에 의해 SCF를 생성하는 방법 및 질병을 치료하는 방법을 포함한다.
부가적으로, SCF 및 이에 특이적 결합을 하는 항체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 SCF함유 물질로부터 간 세포 인자를 효과적으로 회수하는 방법 및 이온 교환 크로마토그래피 분리 단계 및/또는 역상 액체 크로마토그래피 분리 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 포유동물내에서 효능을 발휘하고 생체내에서의 반감기가 증가된 생물학적으로 활성을 띄는 부가물을 제공하는데, 그 부가물은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 공유결합된 SCF를 포함하며, 여기서 상기 중합체는 한 말단에서 알킬기로써 치환되거나 치환되지 않는다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 부가물의 제조방법에 관한 것이며, 적어도 하나의 말단 반응기를 가지는 수용성 중합체와 SCF를 반응시키는 것 및 순환 반감기가 연장된 산물 및 생물학적 활성도가 증가된 산물을 생산하기 위해 결과적으로 생성된 부가물을 정제하는 것을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 포유동물 SCF의 정제과정에서의 음이온 교환 크로마토그램이고,
제2도는 포유동물 SCF의 정제과정에서의 겔 여과 크로마그램이고,
제3도는 포유동물 SCF의 정제과정에서의 맥아 응집소-아가로스 크로마토그램이고,
제4도는 포유동물 SCF의 정제과정에서의 양이온 교환 크로마토그램이고,
제5도는 포유동물 SCF의 정제과정에서의 C크로마토그램이고,
제6도는 제5도의 C컬럼 분획의 소디움 도데실 설페이트 (SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)(SDS-PAGE)을 나타낸 것이고,
제7도는 포유동물 SCF 의 분석 C크로마토그램이고,
제8도는 제7도의 C컬럼 분획의 SDS-PAGE를 나타낸 것이고,
제9도는 정제된 포유동물 SCF 및 탈글리코실화된 포유동물 SCF의 SDS-PAGE를 나타낸 것이고,
제10도는 정제된 포유동물 SCF의 분석 C크로마토그램이고,
제11도는 단백질 시퀀스를 나타낸 것이고,
제12a도는 집쥐 SCF cDNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 나타낸 것이고,
제12b도는 인체 SCF DNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 나타낸 것이고,
제12c도는 보편적인 올리고뉴클레오티드를 나타낸 것이고,
제13a도는 집쥐 SCF cDNA의 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)증폭에 대한 개략도이고,
제13b도는 인체 SCF cDNA의 PCR증폭에 대한 개략도이고,
제14a도는 집쥐의 게놈 DNA에 대한 시퀀싱 구상도이고,
제14b도는 집쥐의 게놈 DNA의 핵산 시퀀스를 나타낸 것이고,
제14c도는 집쥐 SCF cDNA의 핵산 시퀀스 및 집쥐 SCF 단백질의 아미노산 시퀀스를 나타낸 것이고,
제15a도는 인체 게놈 DNA를 시퀀싱하기 위한 구상도이고,
제15b도는 인체 게놈 DNA의 핵산 시퀀스를 나타낸 것이고,
제15c도는 인체 SCF cDMA의 복합 핵산 시퀀스 및 SCF 단백질의 아미노산 시퀀스를 나타낸 것이고,
제16도는 인체, 원숭이, 개, 생쥐, 및 집쥐의 SCF 단백질의 정렬된 아미노산 시퀀스를 나타낸 것이고,
제17도는 포유동물 세포 형질발현 벡터 V19.8 SCF의 구조를 나타낸 것이고,
제18도는 포유동물 CHO세포 형질발현 벡터 pDSVE.1의 구조를 나타낸 것이고,
제19도는 E. coli 형질발현 벡터 pCFMl156의 구조를 나타낸 것이고,
제20a도는 포유동물 SCF의 방사선면역분석시험을 나타낸 것이고,
제20b도는 면역 침전된 포유동물 SCF의 SDS-PACE를 나타낸 것이고,
제21도는 재조합 인체 SCF의 웨스턴 분석결과를 나타낸 것이고,
제22도는 재조합 집쥐 SCF의 웨스턴 분석 결과를 나타낸 것이고,
제23도는 COS-1 세포에 의해 생성된 재조합 집쥐 SCF가 골수 이식에 미치는 영향을 나타낸 막대 그래프이고,
제24도는 강철 생쥐의 대적혈구 빈혈증을 치유함에 있어 재조합 집쥐 SCF의 영향을 나타낸 것이고,
제25도는 재조합 집쥐 SCF로 치료한 강철 생쥐의 말초 백혈구(WBC)수를 나타낸 것이고,
제26도는 재조합 집쥐 SCF로 치료한 강철 생쥐의 혈소판수를 나타낸 것이고,
제27도는 재조합 집쥐 SCF PEG25로 치료한 강철 생쥐에 대한 백혈구 백분율수를 나타낸 것이고,
제28도는 재조합 집쥐 SCF PEG25로 치료한 강철 생쥐에 대한 림프구 아부분(subset)을 나타낸 것이고,
제29도는 말초 백혈구수의 증가에 있어 정상 영장류의 재조합 인체 시퀀스 SCF치료가 미치는 영향을 나타낸 것이고,
제30도는 적혈구용적비 및 혈소판수의 증가에 있어 정상영장류의 재조합 인체 시퀀스 SCF 치료가 미치는 영향을 나타낸 것이고,
제31a도는 재조합 인체 SCF 에 의해 자극되는 인체 골수 군체를 나타낸 사진이고, 제31b도는 제31a도의 군제로부터 라이트-기엠사(wright-Giemsa) 염색 세포를 나타낸 사진이고,
제32a도는 환원제를 가지고 제33도에서 나타낸 크로마토그램으로부터의 S-세파로스 컬럼 분획을 SDS-PAGE 한 것을 나타낸 것이고,
제32b도는 환원제 없이 제33도에서 나타낸 크로마토그램으로 부터의 S-세파로스 컬럼 분획을 SDS-PAGE한 것을 나타낸 것이고,
제33도는 E.coli에서 유도된 재조합 인체 SCF의 S-세파로스 컬럼의 크로마토그램이고,
제34a도는 환원제를 가지고 제35도에서 나타낸 크로마토그램으로부터의 C컬럼 분획을 SDS-PAGE 한 것을 나타낸 것이고,
제34b도는 환원제를 없이 제35도에서 나타낸 크로마토그램으로부터의 컬럼 분획을 SDS-PAGE 한 것을 나타낸 것이고,
제35도는 E.coli에서 유도된 재조합 인체 SCF의 C컬럼의 크로마토그램이고,
제36도는 CHO에서 유도된 재조합 집쥐 SCF 의 Q-세파로스 컬럼의 크로마토그램이고,
제37도는 CHO에서 유도된 재조합 집쥐 SCF의 C컬럼의 크로마토그램이고,
제38도는 제37도에 나타낸 크로마토그램으로부터의 C컬럼 분획을 SDS-PAGE 한것을 나타낸 것이고,
제39도는 탈글리코실레이션 전·후의 정제된 CHO에서 유도된 재조합 집쥐 SCF의 SDS-PAGE를 나타낸 것이고,
제40a도는 재조합 집쥐를 PEG화 한 SCF 반응 혼합물의 겔 여과 크로마토그래피를 나타낸 것이고,
제40b도는 변형되지 않은 재조합 집쥐 SCF 의 겔 여과 크로마토그래피를 나타낸 것이고,
제41도는 신선한 백혈구 아세포에 결합하고 있는 표지된 SCF를 나타낸 것이고,
제42도는 HT1080 섬유육종 세포주에서 수득한 인체 SCF cDNA 시퀀스를 나타내 것이고,
제43도는 인체 SCF 를 형질발현시키는 COS-7세포 및 인체 SCF 를 형질발현시키는 CHO 세포로 부터의 오토래디오그래피를 나타낸 것이고,
제44도는 5637 방광암 세포주로부터 수득한 인체 SCF cDNA 시퀀스를 나타낸 것이고,
제45도는 SCF 치료후 방사선조사한 생쥐의 증가된 생존을 나타낸 것이고,
제46도는 5%의 대퇴부로써 골수 이식을 하고 SCF로 치료한후 방사선조사한 생쥐의 증가된 생존을 나타낸 것이며,
제47도는 0.1% 및 20%의 대퇴부로써 골수 이식을 하고 SCF로 치료한후 방사선조사한 생쥐의 증가된 생존을 나타낸 것이다.
본 발명의 수많은 양상 및 잇점은 바람직한 구체예로 본 발명의 실시를 상세히 설명해 놓은 다음의 상세한 설명을 고려해볼 때 이 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명에 따라, 새로운 간 세포 인자, 특히 인체 유래의 간세포인자 및 그러한 SCFs의 일부 또는 전부를 암호화하는 DNA 시퀀스가 제공된다. 본원에서 사용한 간 세포 인자 또는 SCF 라는 용어는 자연발생적인 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 비자연 발생적인(즉, 자연 발생적인 것과는 다름) 폴리펩티드뿐만 아니라 자연 발생적인 SCF(예를들어 천연 인체 SCF)를 일컫는다. 간 세포 인자는 적혈구, 거핵구, 과립구, 림프구 및 대식세포로 성숙시킬 수 있는 초기 조혈 선조의 성장을 자극하는 능력을 갖고 있다.
포유동물을 SCF로 치료하면 골수 직계 세포 및 림프 직계 세포 모두의 조혈 세포가 절대적으로 증가되는 결과가 생긴다. 간 세포의 두드러진 특징중의 하나는 골수세포 및 림프세포로의 분화능력에 있다.[Weissman의 Science, 241. 58-62 (1988)]. 재조합 집쥐 SCF로써 강철 생쥐를 치료하는 경우(실시예 8B)과립구, 단구, 적혈구, 림프구 및 혈소판이 증가된다.
재조합 인체 SCF로 정상 영장류를 치료하면 골수세포 및 림프세포가 증가되는 결과가 생긴다.(실시예 8C).
멜라닌형성세포, 생식세포, 조혈세포, 뇌 및 척수신경의 이동 경로 및 귀환지점내의 세포에 의한 SCF의 배 형질발현이 존재한다.
초기 조혈 선조세포는 5-플루오로우라실(5-FU)로 치료해 온 포유동물의 골수에 풍부하게 존재한다. 화학 치료제5-FU는 후기 조혈 선조를 선택적으로 고갈시킨다. SCF는 후 5-FU 골수에 대해 활성을 띈다.
SCF의 조직내 생물학적 활성도 및 분포 유형은 다양한 간 세포 결핍증의 치료능력 이외에 배형성 및 조혈작용에서의 중추역할을 입증해 준다. 발명은 다음을 포함하는 DNA 시퀀스를 제공한다 :
선택한 비포유동물 숙주에서의 형질발현을 위해 선호되는 삽입 코돈 ; 제한 엔도뉴클레아제 효소로 절단시키기 위한 예비 부위 ; 및 용이하게 형질발현되는 벡터의 구성을 용이하게 하는 부가적인 예비 개시, 종결 또는 중간 DNA 시퀀스.
또한 본 발명은 하나 이상의 아미노산 잔기의 동질성 또는 위치의 개념에서 보아 자연 발생적인 유형과 다르고(즉, SCF를 특정화한 전체 잔기보다 적은 잔기를 포함하는 삭제 유사체 ; 하나 이상의 특정화된 잔기가 다른 잔기로 치환된 치환 유사체 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 그 폴리펩티드의 종결부분 또는 중간부분에 더해진 부가 유사체)자생형의 특성을 전부 또는 일부 담당하는 SCF의 폴리펩티드 유사체 또는 유도체를 암호화하는 DNA 시퀀스를 제공한다.
본 발명은 특이하게 SCF의 프로쎄싱된 유형을 암호화하는 DNA 시퀀스 이외에 충분한 길이의 프로쎄싱되지 않은 아미노산 시퀀스를 암호화하는 DNA 시퀀스도 제공한다.
본 발명의 새로운 DNA 시퀀스는 자연 발생적인 SCF의 하나 이상의 생물학적 특성 및 적어도 그 일부분의 일차 구조 배열을 가지는 폴리펩티드 생성물을 원핵·진핵 숙주 세포내에서 안전하게 형질 발현시키는데 유용한 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 DNA 시퀀스는 특이하게 다음을 포함한다 : (a)제14b, 14c, 15b, 15c, 42및 44도에 제시한 DNA 시퀀스 또는 그의 상보 가닥 ; (b)제14b, 14c, 15b, 15c, 42및 44도의 DNA 시퀀스 및 그의 단편에 (실시예 3에서 기술한 혼성화 조건 또는 더 엄격한 조건하에서) 혼성화하는 DNA 시퀀스 ; 및 (c)유전 암호의 동의성이 없을시, 제14b, 14c, 15b, 15c, 42 및 44의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA 시퀀스 및 동일한 아모노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 시퀀스.
특이하게도 SCF의 대립유전자 변이체 유형 및/ 또는 다른 포유동물 종으로부터의 SCF를 암호화하는 게놈 DNA 시퀀스 및 SCF, SCF의 단편 및 SCF 의 유사체를 암호화하는 제조한 DNA 시퀀스가 포함되어 있다. 그 DNA 시퀀스에 미생물 숙주내에서 전령 RNA가 쉽게 전사되고 전이되게 하는 코돈을 삽입할 수 있다.
그와 같이 제조한 시퀀스는 Alton 등의 PCT 출원 공개 제 W083/04053 호에 기재된 방법에 따라 쉽게 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 따라, SCF 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 본원에 기술된 DNA 시퀀스는 지금까지 가치가 없었던 포유동물 단백질의 아미노산 시퀀스에 대한 관심을 불러 일으키는 정보로서의 가치가 있다. 또한 상기 DNA 시퀀스는 다양한 재조합 기술에 의한 SCF의 대규모 합성에 영향을 미치는데 유용한 산물로서의 가치가 있다.
환언하면, 본 발명에 의해 제공되는 DNA 시퀀스는 새롭고 유용한 바이러스 DNA 벡터 및 고리형 플라스미드 DNA 벡터, 새롭고 유용한 형질전환되고 형질감염된 원핵·진핵 숙주 세포(배양액내에서 배양시킨 박테리타, 효모세포 및 포유동물 세포를 포함) 및 SCF와 그의 관련 산물을 형질발현시킬 수 있는 그러한 숙주 세포를 성장 배양시키는 새롭고 유용한 방법을 생성하는데 유용하다.
또한 본 발명의 DNA 시퀀스는 다른 포유동물 종의 cDNA 및 게놈 DNA 시퀀스 이외에 관련 단백질에 대한 다른 유전자 및 SCF를 암호화하는 인체의 게놈 DNA를 분리함에 있어 표지 프로브로 사용하기에 적당한 물질이다. 또한 그 DNA 시퀀스는 단백질 합성(예를들어, 곤충 세포내에서의 단백질 합성)의 다양한 택일적 방법에 유용하거나 인체 및 다른 포유동물에서의 유전요법에 유용할 수 있다. 본 발명의 DNA 시퀀스는 SCF 및 SCF 산물을 양적으로 생산하기 위한 진핵 숙주 역할을 할 수 있는 형질전환 포유동물 종을 개발함에 있어 유용할 것이라 기대된다. 전반적으로, Palmiter 등의 Science 222, 809 - 814 (1983) 문헌을 참조 하라.
본 발명은 정제되고 분리된 자연밭생적인 SCF (즉, 자연물로부터 정제하거나 일차, 이차 및 삼차 배열, 및 글리코실레이션 유형이 자연 발생적인 물질과 동일하도록를 제조한 것) 및 자연 발생적인 SCF의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조(즉, 아미노산 잔기의 연속 시퀀스)의 일부 또는 전부를 가지는 비자연 발생적인 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 폴리펩티드는 유도체 및 유사체를 포함한다. 바람직한 유형에 있어서, SCF는 게놈 클로닝 또는 cDNA 클로닝에 의해 수득되거나 유전자 합성에 의해 수득되는 외인성 DNA 시퀀스를 원핵 또는 진핵 숙주 (예를들어 배양액내에서의 박테리아, 효모, 고등식물, 곤충 및 포유동물 세포)내에서 형진발현시킨 산물임을 특징으로로 한다. 즉, 바람직한 유형에 있어서, SCF는 재조합 SCF이다. 대표적인 효묘 (예를들어, 사카로마이세스 세레비시에) 또는 원핵 (예를들어, E.coi) 숙주세포내에서의 형질발현 산물은 모든 포유동물의 단백질과 연합하지 않는다. 척추동물 [예를들어 , 비인체포유동물 (예를들어, COS 또는 CHO) 및 조류] 세포내에시의 형질발현 산물은 인체의 모든 단백질과 연합하지 않는다.
사용한 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 또는 다른 진핵 탄수화물로써 글리코실레이션되거나 글리코실레이션되지 않을 수 있다. 그 숙주 세포는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lee등의 J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989)문헌에 기술된 기술을 이용하여 변형시킬 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 개시 메티오닌 아미노산 잔기 (위치-1)를 포함할 수 있다.
SCF의 자연 발생적인 대립 유전자형 이외에도 본 발명은 SCF의 폴리펩티드 유사체와 같은 다른 SCF 산물을 포함한다. 그러한 유사체는 SCF의 단편을 포함한다.
상기한 Alton 등의 공개 출원 (제 W083/04053 호)의 과정 이후에 하나 이상의 잔기의 동질성 또는 위치의 개념에서 여기에 특정화한 것(예를들어, 치환체, 종결 및 중간 부가체 및 삭제체)과 다른 일차 배열을 갖는 폴리펩티드를 미생물에서 형질발현시키기 위해 암호화하는 유전자를 쉽게 구상하고 제조할 수 있다. 택일적으로, cDNA의 변이체 및 게놈 유전자는 공지된 특정 부위 돌연변이유발 기술에 의해 쉽게 수행되고 SCF의 유사체 및 유도체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. SCF의 적어도 하나의 생물학적 특성을 담당하는 그러한 단백질은 다른 단백질과 다를 수 있다. 그 예로서, 본 발명의 산물은 삭제와 같은 방법에 의해 이미 짧아진 산물 ; 또는 가수분해를 위해 더 안정한 산물(그러므로, 자연 발생적인 산물보다 더 표명되거나 장기 지속 효과를 가질 수 있다) ; 또는 예를들어 알라닌 또는 세린 잔기에 의해 치환되거나 하나 이상의 삭제된 시스테인 잔기를 가지거나 하나 이상의 0-글리코실레이션 및/또는 N-글리코실레이션을 위한 가능 부위를 부가하거나 삭제하기 위해 변형시킨 산물 및 미생물계로부터 활성의 형태로 잠제적으로 더 쉽게 분리된 산물 : 또는 폐닐알라닌에 의해 치환된 하나 이상의 티로신 잔기를 가지고 목적 단백질 또는 목적 세포상의 수용체에 다소 쉽게 결합하는 산물을 포함한다 .
또한 본 발명은 SCF 이내의 연속 아미노산 시퀀스 또는 이차 배열의 부분만을 복제하는 폴리펩티드 단편을 함유하는데, 그 단편은 SCF 의 한 가지 특성(예를들어, 수용체 결합)을 가지지만 다른 특성(예를들어 초기 조혈 세포 성장 활성도)을 가질 수 없다. 그 활성도는 치료학적 유용성[Weiland 등의, Blut, 44, 173-175 (1982) 참조] 이나 SCF 길항작용의 분석에서와 같은 다른 정황에서 유용성을 가지기 위해 본 발명의 하나 이상의 산물을 필요로 하지 않는다는 점이 주목할 만하다. 예를들어 , SCF를 과다 생산하는 경우 또는 백혈구 아세포내 SCF 수용제의 과다 표출을 나타낸 (실시예 13)바와. 같이, SCF 에 대한 수용체를 암세포가 과다표출하는 인체 백혈병의 경우에 경쟁 길항질이 매우 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 유사체의 응용성은 자연 발생적인 단백질, 당단백질 및 핵단백질내에 현존하는 아미노산 시퀀스를 충분히 복제시킨 합성 펩티드의 면역학적 특성에 있음을 보고하고 있다. 더욱 구체적으로, 비교적 낮은 분자량의 폴리펩티드가 바이러스 항원, 폴리펩티드 호르몬류와 같은 생리학적으로 중요한 의미를 갖는 단백질의 면역반응의 존속기간 및 범위에 있어 유사한 면역반응에 참여하는 것으로 나타났다 . 그러한 폴리펩티트의 면역반응에는 면역학적으로 활성인 동물내에서 특이 항체를 형성하는 것도 포함된다[Lerner 등의, Cell, 23,309-310 (1981) ; RoSs 등의, Nature,294,654-656(1981) ; Walter 등의,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5197-5200(1980) ; Lerner 등의, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 78, 3403-3407(1981) ; Walter등의, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 78,4882-4886(1981) ; Wong 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,5322-5326(1982) ; Baron 등의, Cell, 28,395-404(1982) ; Dressman 등의, Nature,295,185-160(1982) ; 및 Lerner 의 Scientific American, 248,66-74 (1983)참조].
또한 펩티드 호르몬 이차구조를 대략적으로 담당하지만 그의 일차구조 배열을 담당하지 못하는 합성 펩티드의 생물학적 특성 및 면역학적 특성과 관련하여 Kaiser 등의 [Science, 223,249-255 (1984)] 문헌을 참조하라.
또한 본 발명은 인체 SCF의 cDNA 시퀀스 또는 게놈 DNA 시퀀스의 단백질 암호 가닥에 상보적인 DNA 부분, 즉, Tramontano 등의 문헌 [Nucleic Acid Res., 12, 5049-5059 (1984)참조]에 기술된 바와같이 상보성 역 단백질에 의해 암호화된 폴리펩티드 부류를 포함한다.
본 발명의 대표적인 SCF 폴리펩티드는 제15c도에 도시한 SCF , SCF , SCF , SCF 및 SCF ; 제42도에 도시한 SCF , SCF , SCF 및 SCF ; 및 제44 도에 도시한 SCF , SCF , SCF 및 SCF 을 포함하지만 이에 국한된 것은 아니다.
SCF 는 본 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 본 발명은 조정배지 또는 인체의 소변, 혈청과 같은 물질을 함유하는 SCF로부터 SCF를 정제하는 방법, 다음과 같은 하나 이상의 단계를 포함하는 방법을 포함한다 : 이온 교환 크로마토그래피(양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 중 택일)에 SCF를 함유하는 물질을 제공하는 단계 ; SCF 함유 물질을 예를들어, 부동화된 C또는 C수지와 관련있는 역상 액체 크로마토그래피에서 분리하는 단계 ; 그 액체를 부동화된 렉틴 크로마토그래피에 제공하는 즉, SCF를 부동화된 렉틴에 결합시키고 이 결합을 위해 경쟁하는 당을 이용하여 용출시키는 단계. 이 방법의 용도에 관한 상세한 설명은 SCF의 정제에 관해 설명한 실시예 1, 10 및 11에서 명백할 것이다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 Lai등의 미국 특허 제4,667,016호의 실시예2에서 언급한 기술은 간 세포 인자를 정제하는데 또한 유용하다.
SCF의 유사체는 본원에서 참고문헌으로 인용한, 에리스로포이에틴 유사체가 발명의 명칭인 1989년 10월 13일자 공동소유의 미국 특허 출원 제421,444호에서 언급한 기술과 같은 표준 기술을 이용하여 분리하였다.
SCF 치료에 유용한, 적합한 희석제, 방부제, 용해제, 에멀션화제, 보조제 및/ 또는 담체와 함께 본 폴리펩티드 산물의 치료학적 유효량을 표함하는 제약학적 조성물이 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용된 치료학적 유효량은 주어진 조건 및 투여섭생에 대하여 치료효과를 제공하는 양을 말한다. 그러한 조성물은 액체 또는 동결건조 또는 다른 방식으로 건조시킨 제제이고 다양한 완충물(예를들어, 트리스-염산, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온세기, 표면에의 흡착을 방지하기 위해 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 계면활성제(예를들어, 트윈20, 트윈80, 플루토닉 에프68, 담즙산염), 용해제(예를들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 황산화제(예를들어, 아스코르브산, 소디움 메타비설파이트), 방부제(예를들어, 티메로산, 벤질알콜, 파라벤스), 벌킹 물질 또는 탄력 변형제(예를들어, 락토스, 만니톨), 단백질에 공유결합된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체(실시예 12에 기술되어 있음), 복합화시킨 금속이온 또는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합 화합물로 구성된 미립자 제제속에 또는 리포좀, 미세에멀션, 미셀, 단일라멜라 또는 다중 라멜라구조의 운반체, 적혈구 고스트, 또는 스페로플라스트속에 삽입하는 물질을 포함한다. 그러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정도, 생체내 방출속도 및 생체내 SCF 의 청소율에 영향을 미친다.
조성물의 선택을 SCF 활성도를 갖는 단백질의 물리·화학적 성질에 달려있다. 예를들어, SCF 의 막 결합성으로부터 파생된 산물은 계면활성제를 함유하는 제제 필요로 할 수 있다. 조절되거나 지속적으로 방출하는 조성물은 친유성 저장소(예를들어, 지방산, 왁스, 오일)내에 제제를 포함한다. 또한 본 발명은 중합체(예를들어, 폴록사머 또는 폴록사민)로 피복시킨 미립자 조성물 및 조직 특이적 수용체에 대한 항체에 연결된 SCF 또는 조직 특이적 수용체의 리간드에 연결된 SCF를 포함한다. 본 발명 조성물의 다른 유형에는 미립자형, 보호막, 프로테아제 억제제 또는 장관외, 폐, 코 및 경구 투여등의 다양한 경로를 위한 투과 증강제를 포함한다.
또한 본 발명은 EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I 또는LIF(백혈병 억제 인자)와 같은 하나 이상의 부가적인 조혈인자를 가지는 조성물을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 SCF 의 검출 및 정량 측정에 유용한 시약 또는 고체 조직내 그의 수용체를 함유하고 있는 세포 및 혈액 또는 소변과 같은 액체 표본을 제공하기 위해 검출가능한 표지물질(예를들어, I 로 방사성 표지하거나 비오틴화 한 것)과 결합함으로써 표지될 수 있다.
비오틴화된 SCF 는 자가 골수 조직 이식중에 골수로부터 백혈병 아세포를 제거하기 위해 부동화된 스트렙타빈과 접합시키는데 유용하다. 비오틴화된 SCF 는 자가 또는 타가 골수 이식중에 자가 또는 타가 간 세포내의 간세포를 풍부하게 하도록 부동화된 스트렙타비딘과 접합하는데 유용하다.
티프레리아 독소 [Moolten 의 J. Natl. Con. Inst., 55,473-477(1975)참조], 리신 [Uhr 의 Prog. Clin. Biol. Res. 288,403-412(1989)참조] 및 방사성 동위원소와 같은 SCF 의 독소 접착물은 직접적인 항종양요법(실시예 13)에 유용하거나 골수 이식을 위한 조건 섭생으로서 유용하다.
본 발명의 핵산 산물은 검출가능한 표지물(방사성 표지물 및 비오틴콰 같은 비동위원소 표지물).로써 표지할 때 및 인체 SCF 유전자 위치 및/ 또는 염색체 지도내 모든 관련 유전자군의 위치를 알기 위해 혼성화 방법에 사용할 때 유용하다.
또한 그 핵산 산물은 DNA 수준에서 인체 SCF 유전자 장애를 확인하는데 유용하고 주변 유전자 및 그의 장애를 확인하기 위한 유전자 표지물로서 사용된다.
인체 SCF 유전자는 염색체 12상에 암호화되어 있고, 쥐 SCF 유전자는 S1 자리에 있는 염색체 10에 지도를 작성해 놓았다 .
SCF 는 단독으로 또는 다른 치료와 병행하여 많은 조혈장애를 치료함에 있어 유용하다. SCF 는 조혈장애를 치료함에 있어 단독으로 또는 EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I 또는 LIF와 같은 하나 이상의 부가적인 조혈 인자와 함께 사용될 수 있다.
독성물질, 방사성물질 또는 면역형성부상 때문에 기능 골수의 중량이 감소되는데에 특징이 있고 SCF 로써 치료될 수 있는 일군의 간 세포 장애가 있다. 재생불량성 빈혈은 조혈 조직의 지방 대체 및 범혈구 감소가 있는 간 세포 장애이다. SCF 는 조혈 증폭작용을 수행하고 재생불량성 빈혈을 치료하는데 유용하다(실시예 88).
인체 재생불량성 빈혈의 모델로서 강철 생쥐(steel mice)를 사용하고 있다[Jones 의 Exp. Hematol., 11. 571-580 (1983)참조].
재생불량성 빈혈을 치료함에 있어 관련 시토킨, GM-CSF을 사용함으로써 장래성 있는 결과가 수득되었다[Antin 등의, Blood, 70, 129a (1987)참조]. 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)은 비정상적인 적혈구 이외에도 결함이 있는 혈소판 및 과립구를 형성하는데 특징이 있는 간 세포 장애이다.
질병중에는 SCF 로써 치료가능한 많은 질병이 있다 : 이러한 질병에는 다음과 같은 것들이 있다. 골수섬유증, 골수경화증, 골화석증, 전이성종양, 연성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨병, 임파종, 고세병, 니만-피크병, 렛테러-시웨병, 불응성적아구 빈혈, 디구글리엘모병, 울혈성 거비증, 칼라아자르, 유육종증, 원시 비장 범혈구 감소증, 속립 결핵증, 감염균병, 섬광성 폐혈증, 말라리아, 비타민 B및 폴산 결핍증, 피리독신 곁핍증, 다이아몬드 블랙팬 종양, 얼룩증 및 백반과 같은 적색소증. 적혈구, 거핵구 및 SCF 의 과립구 자극 특성이 실시예 8B 및 8C 에 설명되어 있다.
최초의 생식세포, 신경관 유도 흑혈구, 배면척수 기원의 교련엑손, 소화관, 중신세관 및 후신세관의 음와세포 및 후각구와 같은 비 조혈 간 세포내에서의 성장은 특이 조직손상이 이 지점들에 발생하는 상태에 이롭다. SCF 는 신경학상의 손상을 치료하는데 유용하고 신경세포에 대한 성장인자이다 . SCF는 시험관내 수정과정동안 또는 불임상태를 치료할때 유용하다. SCF 는 방사요법 또는 화학요법의 결과 생기는 소장 손상을 치료하는데 유용하다.
간세포 척수 증식성 장애에는 SCF, 항 SCF 항체, 또는 SCF-독소 배합체로써 치료가능한 원발성다혈구혈증, 만성 골수성 백혈병, 골수성화생증, 원발성혈소판혈병 및 급성 백혈병이 있다.
백혈병 세포의 조혈 간 세포 성장인자 G-SCF, GM-CSF 및 IL-3로의 증가된 증식에 대해 상세히 기록한 수많은 경우가 있다[Delwel 등의 , Blood, 72, 1944-1949 (1988)참조] .
많은 화학치료제의 성공여부는 신생 세포가 정상세포보다 더 활발하게 순환한다는 사실에 의존하기 때문에, SCF 단독으로 또는 다른 인자와 결합한 SCF 가 신생 세포에 대한 성장인자로 작용하고 그 세포들을 화학치료제의 독성 효과에 민감하게 한다. 백혈아구상에 있는 SCF 수용체에 과다표출은 실시예 13에 나타나 있다.
화학요법 및 방사요법 섭생의 결과 생기는 백혈구 최하점을 줄이는 능력에 대하여 많은 재조합 조혈인자를 계속 연구하고 있다. 비록 이들 인자가 이와 같은 세팅에 매우 유용할지라도, 특히 방사요법에 의해 손상되고 이 후기-작용 성장 인자들이 그들의 최적 작용을 발휘할 수 있기전에 재집합되어야 하는 초기 조혈구획이 있다. SCF 단독 또는 이들 인자와 결합시킨 SCF 를 사용하면 화학요법 또는 방사요법 처리의 결과 생기는 백혈구 및 혈소판의 최하점을 줄이거나 말소시킨다. 게다가, SCF 는 항종양 또는 자외선 조사 섭생의 투여량 증대를 가능하게 한다(실시예 19).
SCF 는 동유전형 , 동종 또는 자기유래와 골수 이식에서 초기 조혈 선조를 확장시키는데 유용하다. 조혈성장 인자의 용도는 이식 수술후 호중구의 회복 시간을 감소 시킨다고 나타났다 [Donahue 등의, Nature, 321, 872-875 (1986) 및 Welte 등의, J. Exp. Med., 165, 941 - 948, (1987)참조].
골수 이식 수술동안, 다음 세가지 시나리오가 단독으로 또는 복합적으로 사용된다 : SCF 단독으로 또는 이식에 유용한 세포의 수를 증가시키기 위해 골수 홉출 또는 말초혈구 류코포레시스(leucophoresis) 이전에 다른 조혈 인자와 결합하여 처리한 공여자 ; 이식전에 세포수를 증가시키거나 활성화시키기 위해 시험관내에서 처리한 골수 ; 마지막으로 공여 골수의 융합을 수행하기 위해 처리한 수령자.
SCF 는 조혈 간 세포를 형질감염시키는 (또는 레트로바이러스 벡터로 감염시키는)것을 기초로 하는 효율적인 유전 요법을 수행 하는데 유용하다. SCF 는 형질감염될 초기 조혈 선조세포의 배양 및 증식을 가능하게 한다.
SCF 단독으로 또는 IL-6, IL-3 또는 IL-6 과 IL-3 둘 다를 함께 혼합하여 배양한다. 형질감염시킨 이들 세포들을 유전병을 앓고 있는 환자에게 골수 이식수술로 주입한다[Lim의 Proc. Natl. Acad. Sci, 86, 8892-8896 (1989)참조].
유전병을 치료함에 있어 유용한 유전자의 예로서는 아데신 디아미나제, 글루코세레브로시다제, 헤모글로빈 및 낭포성 섬유종을 포함한다 .
SCF 는 단독으로 또는 IL-7과 같은 다른 인자와 결합하여 후천성 면역결핍증(AIDS)또는 중증복합 면역부전증(SCID)의 치료에 유용하다(실시예14참조).
이 효과는 순환 T-헬퍼(CD4 , OKT4 )백혈구의 절대 수준을 증가시키기 위한 SCF 치료능력을 설명해 준다. 이 세포들은 에이즈 환자를 면역결핍 상태로 유도하는 인체 면역결핍 바이러스(HIV)의 일차 세포 목표물이다[Montagnier 의 HμMan T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C.Gallo 출판, 미국 뉴욕 콜드 스프링 하버, 369-379 (1984)참조]. 게다가, SCF 는 AZT 와 같은 항-HIV 약제의 골수억제 효과를 제거시키는데 유용하다[Gogu 의 Life Sciences, 45, 4번 (1989)참조]. SCF 는 급성 출혈후 조혈 회복을 수행하는데 유용하다.
생체내 SCF 치료는 종양(암)과 싸우기 위한 면역계에 대한 효능촉진제로서 유용하다. 최근에 클론화한 시토킨(IL-2)에 의한 직접 면역 기능 수행의 치료학적 유용성과 예가 Rosenberg 등의 N. Eng. J. Med., 1485 (1987)문헌에 기술되어 있다.
하나 이상의 다른 조혈인자와 같은 다른 시약과 함께 투여하는 SCF 는 일시적으로 간격을 두거나 함께 주어진다. SCF 로써 전처리하면 G-CSF 또는 EPO 와 같은 말단에 작용하는 조혈 인자와 응답하는 선조군을 확대시킨다. 투여 경로는 정맥, 복강피하 또는 근육이 될 수 있다.
또한 본 발명은 간 세포 인자에 특이하게 결합하는 항체와 관련이 있다. 아래의 실시예 7은 폴리클론 항체의 생산에 대해 기술해 놓은 것이다. 본 발명의 앞으로의 유형은 SCF 에 특이하게 결합하는 모노클론 항체를 기술한 것이다(실시예 20 참조). 상이한 결정인자들(에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 재래식 항체(폴리클론)제제와는 달리, 각 모노클론 항체는 그 항원에 대한 단일 결정인자에 대항하여 유도된다. 모노클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단법 및 분석법의 선택성 및 특이성을 개선시키는데 유용하다.
또한, 모노클론 항체는 혈청으로 부터 SCF 를 중화시키기나 제거하는데 사용된다. 모노클론 항체의 두번째 잇점은 그것들이 배양액내의 융합세포에 의해 합성될 수 있으며, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점이다. 모노클론 항체는 배양된 융합세포의 상층액 또는 융합세포를 생쥐에 복강내 접종함으로써 유도된 복수로 부터 생산될 수 있다. Kohler 및 Milstein 에 의해 처음으로 기술된 융합기술은 많은 특정 항원에 대항하여 높은 수준의 모노클론 항체를 분비하는 용합 세포주를 제조하기 위해 광범위하게 적용되어 왔다[Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)참조].
다음의 실시예는 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위함이지 본 발명의 범위를 제안하고자 함은 아니다.
[실시예 1]
버팔로 집쥐의 간(liver)세포 조정배지로 부터의 간 세포 인자의 정제/특정화
A. 시험관내 생물학적 분석
1. HPP-CFC 분석
재조합 집쥐의 SCF 단백질 이외에도 자연 포유동물 집쥐의 SCF 에 기여될 수 있는 다양한 생물학적 활성도가 있다.
그러한 활성도의 한가지는 초기 조혈 세포에 미치는 영향을 들 수 있다. 이 활성도는 고도의 증식가능 군체 형성 세포(HPP-CFC)분석법으로 측정될 수 있다[Zsebo등의 상기문헌(1988)참조]. 초기 조혈세포에 대한 인자의 영향을 조사하기 위해 HPP-CFC 분석계는 5 -플루오로우라실(5-FU)로 처리한 후 이틀된 동물로부터 유도한 생쥐 골수를 이용한다. 화학치료제 5-FU 는 후 조혈 선조를 선택적으로 소모시켜 초기 선조세포 및 그러한 세포에 대해 작용하는 인자를 검출할 수 있게 한다. 집쥐 SCF 를 반고체 아가 배양액 내의 CSF-1 또는 IL-6의 존재하에 평판화한다. 아가 배양액에는 McCoys 완전 배지(집코) 20 % 태아 소 혈청, 0.3 % 아가 및 2×10 골수 세포/ml이 포함되어 있다. McCoys 완전 배지에는 다음과 같은 성분을 포함한다 ; 0.1 mM 피루브산염으로 보충된 1×McCoys 배지, 0.24×필수 아미노산, 0.24 × 비필수 아미노산, 0.027 % 중탄산나트륨, 0.24 × 비타민, 0.72 mM 글루타민, 25 ㎍/ml L-세린 및 12 ㎍/ml L-아스파라긴. 골수세포는 150 mg/kg 5-FU 를 정맥주사한 Balb/C 생쥐로부터 수득한다. 씻어낸 생쥐 및 골수를 5-FU 로 처리한 후 이틀째 대퇴부를 채취한다. 적혈구 세포를 평판화하기 전에 적혈구 용해제(벡톤 디킨슨)로 용해시킨다.
시험물질을 30 mm 접시내에 상기 혼합물로써 평판화시킨다. 14일 후 수천개의 세포를 함유한 콜로니(직경 1 mm 보다 큼)가 기록 된다. 이 분석법은 천연 포유동물 세포에서 유도된 집쥐 SCF 의 정제에 넓리 사용되었다. 대표적인 분석에 있어서, 집쥐 SCF 는 평판화된 200,000 세포당 약 50 HPP-CFC 의 증시을 야기한다.
집쥐 SCF 는 5-FU로 처리한 생쥐 골수세포에 대해 상조적인 활성도를 갖는다 : HPP-CFC 군체는 단일 인자의 존재하에 형성하는 것이 아니라 SCF 및 CSF-1 또는 SCF 및 IL-6 의 결합형이 이 분석에서 활성이다.
2. MC/9 분석
자연적으로 유도되는 집쥐 SCF 및 재조합 집쥐 SCF 의 다른 유용한 생물학적 활성도는 IL-4 의존 쥐 성숙 세포주인 MC/9(ATCC 제 CRL 8306호)의 증식을 야기하는 능력이다. MC/9 세포를 ATCC 계 CRL 8306호의 초안에 따라 IL-4의 원료와 함께 배양한다. 생체분석에 사용된 배지에는 RPMI 1640, 4 % 태아 소 혈청, 5×10 M 2-메르캅토에탄올 및 1×글루타민-펜-스트렙이 있다. MC/9 ,세포는 다른 성장 인자를 요구함이 없이 SCF 에 응답하여 증식한다. 이 증식은 우선 그 세포들을 성장 인자없이 24시간 동안 배양하고, 시험표본을 갖는 96웰 평판의 각 웰에 5000 개의 세포를 48시간 동안 평판화하고, 0.5 μ Ci H-티미딘(고유 활성도 20Ci/mmol)로써 4시간 동안 펄싱하고, 그 용액을 유리섬유 필터상으로 채취하고난 다음, 특이적으로 결합한 방사성 활성도를 측정함으로써 측정된다.
이 분석법은 ACA 54 겔 여과 단계, 본 실시에의 부문 C2 후 포유동물 세포에서 유도된 집쥐의 SCF 를 정제할 때 사용되었다. 대표적으로, SCF 는 CPM 초과 배겅을 4 - 10배 증가시키는 직접적인 원인이 된다.
3. CFU-GU
고갈되지 않은 정상 생쥐의 골수에 대한, 군체 자극 인자(CSFs)를 간섭하지 않는, 자연적으로 유도되고 재조합된 정제한 두 포유동물 SCF 의 작용이 확인되어 왔다.
CFU-GM 분석법 [Broxmeyer 등의 , Exp. Hematol., 5, 87(1977)참조]은 정상 골수에 대한 SCF 의 영향을 평가하기 위해 사용된다.단언하면, 적혈구 세포의 용해후 전체 골수 세포는 그 시험물질을 포함하는 반 고체 아가 배양액에 평판화한다. 10일후, 40 세포의 덩어리를 포함하는 군체가 기록된다. 아가 배양물을 유리 슬라이드상에서 건조시킬 수 있고 그 세포의 형태학은 특히 조직학적 염색을 통해 결정할 수 있다.
정상 생쥐 골수상에서, 정제된 포유동물 집쥐 SCF 는 다른 인자를 요구함이 없이 비성숙 세포, 호중구, 대식세포, 호산구, 거핵구로 구성된 군체의 성장을 자극하는 다능성 CSF이다. 평판화된 200,000 세포로부터 100개 이상의 상기 군체가 10일 이상 성장한다. 집쥐 및 인체 재조합 SCF 모두 EPO 와 결합하여 적혈구 세포의 생산을 자극하며 이에 대해서는 실시예 9를 참조하라.
B. 조정배지
아메리칸 타잎 컬쳐 콜랙션으로 부터 수득한 버팔로 집쥐의 간(BRL)3A 세포 (ATCC 계 CRL 1442호)를 SCF 생성을 위한 20 ℓ 과다융합 배양계내의 소운반체상에서 성장시켰다.
이 계는 소운반체를 보유하기 위해 사용된 스크린 및 산소 공급관을 제외시킨 바이오라피테 퍼멘터 (모델 ICC-20)을 이용 한다. 75 미크론 메시의 스크린은 체크 밸브 및 컴퓨터 조절 펌프 시스템을 통해 성취된 주기 역류치환 방식에 의해 소운반체를 빠져나가지 못하게 한다. 각 스크린은 교대로 배지 영양 및 수확 스크린으로서 작용한다.
이 진동 흐름방식은 스크린의 운전이 잘 되도록하게 한다.
실리콘 관(1,524cm 길이, 0.64 cm 내경, 0.08 cm 벽)의 코일을 통해 산소가 공급된다. BRL 3A 세포를 배양하기 위해 사용하는 성장배지는 최소 필수배지(얼스의 염을 가짐) (집코) 즉 2 mM 글루타민, 3 g/L 글루코스, 트립토스 인산염 (2.95g/L), 5 % 태아 소 혈청(FBS) 및 5 % 태아 소 혈청 (FCS)을 포함하는 것이다. 수확 배지는 혈청을 생략하는것 말고는 동일하다. 그 반응물은 5 g/L 농도의 시토덱스(Cytodex) 2 소운반체 (파마시아)를 함유하며 회전병에서 성장시킨 3×10 BRL 3A 세포로 접종하고 트립신 처리에 의해 제거한다. 그 세포를 결합하도록 하여 8일 동안 소운반체상에서 성장시킨다. 성장배지는 글루코스 소모를 기준으로 하여 필요한 만큼 반응물에 살포한다. 글루코스 농도를 약 1.5g/L로 유지한다. 8일후, 반응물을 대부분의 혈청(단백질 농도 50 ㎍/ml)을 제거하기 위해 6부피의 혈청 유리 배지와 함께 살포한다. 그런다음 그 반응물을 글루코스 농도가 2 g/L 이하로 감소될때까지 배치식으로 운전한다. 이 농도 이하부터 반응물을 약 10 L/d의 연속 살포속도로 운전한다. 배양물의 pH 는 CO흐름 속도를 조절함으로써 6.9±0.3으로 유지한다.
용해 산소는 필요시 순수 산소를 공급함으로써 20 % 이상의 공기포화를 유지한다. 온도는 37 ± 0.5℃로 유지한다.
약 336리터의 무혈청 조정배지를 상기 방식으로부터 생성시켜 그것을 천연 포유동물 세포에서 유도된 집쥐 SCF의 정제를 위한 출발물질로 사용한다.
C. 정제
모든 정제 작업은 다른 지시사항이 없는 한 4℃ 에서 실시한다.
1.DEAE-셀룰로스 음이온 교환 크로마토그래피
BRL 3A 세포의 무혈청 성장에 의해 생성된 조절 배지를 0.45μ 사르토캡슐(사르토리우스)을 통한 여과에 의해 정화한다. 몇몇 상이한 배치(batches)(41L,27L,39L,30.2L,37.5L및161L)를 각 배치에 대한 유사한 유형으로, 개별적으로 농축, 투석여과/완충 교환 및 DEAE-셀룰로스 음이온 교환 크로마토그래피 하였다. DEAE-셀룰로스 푸울을 혼합하고 이 실시예의 부문 C2-5의 한 배치로서 더 진행시킨다. 이를 설명하기 위해, 41 L 배치의 취급법이 다음에 나타나 있다. 여과된 조정 배지를 10,000 분자량 절단 폴리술폰막 카세트(610 ㎠의 총 막면적 : 펌프 속도∼1095 m1/분 및 여과속도 250-315ml/분) 4개을 가진 밀리포어 펠리컨 접선 흐름 한외 여과 장치를 이용하여∼700ml 까지 농축한다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 시료에 있어 투석여과/완충 교환은 pH7.8의 50mM 트리스-HCL 500ml를 농축액에 첨가하고, 접선 흐름 한외여과 장치를 이용하여 500ml로 재농축시키고, 이 과정을 6회 반복함으로써 완수된다. 농축된/투석여과된 시료를 최종적으로 700ml의 부피로 회수한다. 그 시료를 pH7.8의 50mM 트리스-HCL 완충액으로 평형화시킨 DEAE-셀룰로스 음이온 교환 컬럼(5×20.4cm : 와트만DE-52 수지)에 적용한다.
시료적용 후, 그 컬럼을 2050ml의 트리스-HCL 완충용액으로 세척하고, 염 기울기(트리스- HCL 완충액내의 0-300mM NaCl : 총부피 4L)를 적용한다. 15ml의 분획들을 167ml/h의 유속으로 모은다. 크로마토그래피는 제1도에 도시되어 있다. HPP-CFC 군체수는 HPP-CFC 분석에 있어 생물학적 활성도를 일컫는다 : 지적된 분획으로부터 100μl를 분석한다. 시료를 적용하고 세척하는 동안 수집한 분획은 도면에 나타나 있지 않다 : 생물학적 활성도가 이 분획에서 검출되지 않았다.
농축, 투석여과/완충교환 및 음이온 교환 크로마토그래피한 모든 조정배지 배치의 반응은 유사하다. 표준물질로서의 소 혈청 알부민을 수반한 브래드포드 방법[Anal. Biochem. 72, 248-254(1976)참조]에 의해 결정된 배치의 단백질 농도는 30-50 ㎍/ml 범위내에 있다. 이 시료를 이용한 조정배지의 총 부피는 약 336 L이다.
2. ACA 54 겔 여과 크로마토그래피
상기한 여섯개의 전 배지 배치의 각각을 러닝한 DEAE-셀룰로스 컬럼으로 부터 생물학적 활성도를 가지는 분획(예를들어, 러닝을 위한 분회 87-114가 제1도에 나타나 있음)을 혼합하고(총용적 2900 ml) 아미콘 교반 세포 및 YM10막을 이용하여 최종 부피가 74 ml 가 되게 농축한다. 이 물질을 pH 7.4의 50 mM 트리스 - HCI, 50 mM NaCl 에서 평형화시킨 AcA 54 (LKB) 겔 여과 컬럼(제2 도)에 가한다. 14 ml의 분획을 70 ml/h의 유속에서 수집한다. 활성 분획과 함께 동시 용출하는 억제 인자로 인해 활성도의 피크(HPP-CFC 군체수)는 쪼개져서 나타난다 : 그러나 예기한 크로마토그램을 기초로하여 활성도는 주 단백질 피크와 함께 동시 용출되고 따라서 분획의 한 푸울이 만들어진다.
3. 맥아 응집소-아가로스 크로마토그래피
AcA 54 겔 여과 컬럼으로부터의 분획 70-112론 푸울로 만들었다(500 ml ). 푸울을 절반으로 나누고 각각의 반을 pH 7.4의 20 mM 트리스-HCI, 500 mM NaCl 에서 평판화시킨 맥아 응집소-아가로스 컬럼(5×24.5 cm : 미국 캘리포니아 산 마테오, E-Y 라보라토리스에서 수득한 수지 : 맥아 응집소는 특정 탄수화물 구조를 인지한다)을 이용하여 크로마토그래피 한다. 시료 적용 후, 그 컬럼을 약 2200 ml의 컬럼 완충액으로 세척한 다음 제3도의 분획 ∼ 210 에서 시작하여 컬럼 완충액내에 용해된 350 mM N-아세틸-D-글루코사린 용액을 가함으로써 결합 물질을 용출시킨다.
13.25 ml 의 분획을 122 ml/h의 유속에서 수집한다. 크로마토그래프 런 중 하나가 제3도에 나타나 있다. 분석할 분획의 일부를 인산염 완충 식염수에 대항하여 투석하였다 :
5μl의 투석 물질을 MC/9 분석(제3도의 cpm치) 상태에 두고, 10 μl의 투석 물질을 HPP-CFC 분석(제3도의 군체 수치 )상태에 둔다. 활성물질은 컬럼에 결합되고 N-아세틸-D-글루코사민과 함께 용출함으로써 많은 오염물질이 시료를 가하고 세척하는 동안 컬럼을 통해 통과되었음을 알 수 있다.
4. S-세파로스 고속 흐름 양이온 교환 크로마토그래피
맥아 응집소-아가로스 크레마토그래피로 부터의 분획 211-225는 제3도에 나타나 있으며 제2런과 동등한 분획을 모으고(375 ml) pH 4.2의 25 mM 소디움포메이트에 대항하여 투석한다. 낮은 pH에 노출시키는 시간을 최소화하기 위해, 투석은 5 L의 완충액에 대해 8시간 동안 네번 변화시키면서 8시간 이상 실시한다. 이 투석기간이 끝날 무렵, 표본 부피는 480 ml 이고 그 표본의 pH 및 전도성은 투석완충용액의 pH 및 전도성에 가깝다. 투석기간 동안 표본에서 침전물질이 나타난다. 이 침전물질을 30분간 22,000 ×g에서 원심분리하여 제거하고 원심분리한 표본으로부터의 상층액을 소디움포메이트 완충액에서 평형화시킨 S-세파로스 고속 흐름 양이온 교환 컬럼(3.3×10.25 cm : 파마시아로 부터 수득한 수지)에 가한다.
유속은 465 ml/h이고 14.2 ml의 분획을 수집한다. 표본을 가한후, 240 ml 의 컬럼 완충액으로 컬럼을 세척하고 제4도의 분획∼45에서 시작하는, 0-750 mM NaCl (완충액에 용해된 NaCl : 총 기울기 부피 2200 ml) 기울기를 적용함으로써 결합물질을 용출한다. 용리도는 제4도에 나타나 있다. 수집한 분획을 200 μ1 의 0.97 M 트리스 염기를 첨가함으로써 pH 7-7.4로 조절한다. 제4 도의 cpm은 MC/9 생물학적 분석에서 수득된 결과를 재언급 한 것 이다. 지정 분획의 일부를 인산염 완충 식염수에 대항하여 투석하고 20 μ1 의 투석물질을 분석상태에 둔다. 대다수의 생물학적 활성물질이 컬럼에 결합되지 않고 통과하므로써, 많은 오염물질은 결합되고 염 기울기로 용출됨을 제4도에서 알 수 있다.
5. 실리카-결합 탄화수소 수지를 이용한 크로마토그래피
제4도의 S-세파로스 컬럼으로부터 분획 4-40을 모은다(540 ml ). 그 푸울 450 ml를 동부피의 완충액 B(100 mM 암모늄 아세테이트, pH 6 : 이소프로판올 : 25 : 27)와 혼합하고 완충액 A (60 mM 암모늄 아세테이트, pH 6 : 이소프로판올 : 62.5 : 37.5)로써 평형화시킨 C컬럼(비닥 단백질 C; 2.4×2cm)에 540 ml/h 의 유속으로 가한다.
표본을 가한후, 유속을 154 ml/h 으로 감소시키고 그 컬럼을 200 ml의 완충액 A로 세척한다. 완충액 A로부터 완충액 B로의 선형 기울기(총부피 140 ml)를 적용하여 9.1 ml의 분획을 수집한다. S-세파로스 크로마토그래피로부터의 푸울 일부, C컬럼 출발 표본, 예행 푸울 및 세척 푸울은 적정 부피의 1 mg/ml 저장 용액을 첨가함으로써 40 ㎍/ml 소 혈청 알부민으로 되고 생물학적 분석을 위한 시료내의 인산염 완충 식염수에 대항하여 투석한다. 이와 유사하게 40 μl 분취량의 기울기 분획을 16 ㎍의 소 혈청 알부민을 함유하는 350 μ1 의 인산염 완충 식염수와 혼합하고, 이것을 생물학적 분석을 위한 시료내의 인산염 완충 식염수에 대항하여 투석한다. 이들 다양한 분획을 MC/9 분석법(6.3 μl 분취량의 준비된 기울기 분획들 ; 제5도의 cpm)에 의해 분석한다. 또한 이 분석결과는 예행분획 및 세척 분획내에서 약 75 %의 회복 활성도가 존재하고, 제5도에 나타낸 기울기 분획에는 25%의 회복활성도가 존재한다. 다양한 분획의 분취량을 SDS-PAGE [Laemmli 의 Nature, 227, 680 - 685(1970) : 4 %(W/V) 아크릴아미드를 함유한 중충(stacking)겔 및 12.5 % (W/V) 아크릴아미드를 함유한 분리겔]한 것이 제6도에 나타나 있다.
겔을 나타내기 위해, 표본 분취량을 진공하에 건조시킨 다음 20 μ1 표본 처리 완충액(환원되지 않음 즉 2 -메르캅토에탄올 무첨가)을 이용하여 재용해하고 겔 상에 부하하기 전 5분 동안 끓인다. 레인 A 및 B는 각각 컬럼 출발물질(890 ml 중 75 μ1) 및 컬럼 예행(880 ml중 75 μ1)을 나타낸다 : 도면 좌측의 숫자표시는 표시된 수의 10 배 되는 분자량을 갖는 표시물질의 (감소된) 이동 위치를 나타내는데, 여기서 표식물질은 포스포릴라제 b (분자량 97,400), 소 혈청 알부민(분자량 66,200), 오브알부민(분자량 42,700), 카르보닉앤 히드라제(분자량 31,000), 대두 트립신 억제제(분자량 21,500) 및 리소짐(분자량 14,400)이다 : 레인 4-9는 기울기(9.1 ml 중 60 μ1)적용 동안 수집한 상응 분획들을 나타낸다. 겔은 은으로 염색하였다[Morrissey의 Anal. Biochem., 117, 307-310 (1981)참조]. 레인 A 및 B를 비교함으로써 대다수의 염색가능물질이 그 컬럼을 통과한다는 사실을 알 수 있다. 분자량 31,000의 표준위치 이상 및 이하의 부분내에 있는 분획 4-6의 염색된물질은 기울기 분획(제5도)내에서 검출된 생물학적 활성도와 일치하고 그것이 생물학적으로 활성인 물질임을 나타낸다.
이 물질이 레인 A 및/또는 B에서가 아닌 레인 4-6에서 가시화된다는 점을 주목해야 하는데, 왜냐하면 보다 큰 비율의 총 부피(분획 4-6의 경우 총 부피비 0.66%에 대해 레인A 및 B의 경우 총 부피비 0.0084%)을 전자에 부하시켰기 때문이다. 이 컬럼으로 부터의 분획 4-6을 한데 모았다.
상기한 바와 같이, 대략 75%의 회복활성도가 제5도의 C컬럼을 통해 러닝된다. 이 물질을 필수적으로 상기한 바와같이 C수지를 이용하여 재크로마토그래피하되 보다 큰 컬럼(1.4×7.8 cm)및 더 느린 유속(전체적으로 50-64 ml/h)을 사용하는 것은 제외한다.대략 50 %의 회복 활성도가 예행에 존재하고, 나머지 50 %는 제6도의 활성 기울기 분획의 SDS-PAGE 에 대한 형상과 유사하게 나타나는 기울기 분획에 존재한다. 활성분획을 한곳에 모은다(29 ml).
또한 상기한 바와같이 분석 C컬럼을 실시하고 그 분획을 두 생물학적 분석법으로 분석한다. 제7도에 나타낸 이 분석 컬럼으로부터의 분획과 같이, MC/9 및 HPP-CFC 생활성도 모두는 동시에 용출한다. SDS-PAGE 분석 (제8도)은 양쪽 분석에서 생물학적 활성도를 함유하는 컬럼 분획들 내에서 분자량 31,000 미만의 단백질이 존재함을 나타낸다.
S-세파로스 크로마토그래피에서 나타난 두번째(상대적으로 소수) 활성도 피크 (예를들어, 제4도의 분획 62-72, 염 기울기에서의 초기 분획들)를 C크로마토그래피에 의해 또한 정재한다. 그것은 S- 세파로스 예행 분획의 C크로마토그래피에 의해 수득된 물질과 동일한 SDS-PAGE에 대한 반응을 보이고 그와 동일한 N -말단 아미노산 시퀀스(실시예 2D 참조)를 가진다.
6. 정제방법의 요약
상기 1 - 5에서 기술한 정제 단계의 용약이 표 2에 나타나 있다.
1. 주어진 수치는 본원에서 기술한 상이한 배치에 대한 수치의 합을 나타낸다.
2. 본 실시예에서 상기한 바와 같이, S -세파로스 크로마토그래피용 시료내의 표본을 투석하는 동안 나타나는 침전물질은 원심분리하여 제거한다. 원심분리한 후의 표본(480 ml)은 264 mg의 총 단백질을 함유한다.
3. 두 C컬럼으로 부터의 활성 기울기 분획들의 혼합물은 기술한 바와 같은 순서로 러닝된다.
4. 이 물질 450 ml 만을 다음 단계(상기 본 실시에)를 위해 사용한다 .
5. 다른 방식으로 지시된 것은 제외하고 브래드포드의 방법(상기문헌, 1976)으로써 결정한다.
6. SDS - PAGE 후 은 염색의 강도 및 실시에 2의 부문 K에서 기술한 바와 같은 아미노산 조성물의 분석을 기초로하여 평가 한다.
D.SDS-PAGE 및 글리코시다제 처리
두개의 대규모 C컬럼 런(run)들로부터 푸울로 만든 기울기 분획을 SDS-PAGE 한 것이 제9도에 나타나 있다.
제1 C컬럼의 경우 60 μ1의 푸울을 부하하고 (레인 1), 제2 C컬럼의 경우 40 μl의 푸울을 부하한다 (레인 2). 이들 겔 레인을 은으로 염색한다. 분자량 표식물질은 제6도에 기술한 바와 같다. 언급한 바와 같이, 분자량 31,000의 표식물질 위치의 아래 및 위에서 산만하게 이동하는 물질은 생물학적으로 활성인 물질임을 나타낸다 ; 명백한 이질성은 대부분 글리코실레이션 동안의 이질성 때문이다.
글리코실레이션을 특정화하기 위해, 정제 물질을 I 로 요오드화하고, 다양한 글리코시다제로 처리하고, 오토래디오그래피를 수반한 SDS - PAGE (환원조건)에 의해 분석한다. 그 결과는 제9도에 나타나 있다. 레인 3및 9는 글리코시다제로 처리하지 않은 I-표지 물질을 나타낸다. 레인 4-8 은 다음과 같은 글리코시다제들로서 처리한 I-표지 물질을 나타낸다 : 레인 4의 경우는 뉴라미니다제, 레인 5의 경우 뉴라미니다제 및 0-글리카나제, 레인 6의 경우 N-글리카나제, 레인 7의 경우 뉴라미니다제 및 N-글리카나제, 레인 8의 경우 뉴라미니다제, 0-글리카나제 및 N-글리카나제, 각각의 조건은 5 mM의 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 33 mM 의 2-메르캅토에탄올, 10 mM의 트리스- HCI, pH 7-7.2, 37℃에서 3시간으로 한다.
뉴라미니다제(아르트로박터 우레아페이선스로 부터 수득 ; 칼바이오켐)는 최종 농도 0.23유닛/ml 를 사용한다.
0- 글리카나제(겐자임 ; 엔도-알파-N-아세틸-갈락토사미니다제)는 최종 농도 45밀리유닛/ml 를 사용한다. N - 글리카나제(겐자임 : 펩티드 : N-글리코시다제 F ; 펩티드-N [N-아세틸-베타 글루코사미닐] 아스파라긴 아미다제)는 최종농도 10유닛/ml 를 사용한다.
제9도와 유사한 결과는 정제된 비표지 SCF 를 글리코시다제로 처리하고, SDS-PAGE 후 은으로 염색하여 생성물을 가시화할 때 수득된다. 적당한 경우에, 다양한 대조 항온을 실시한다. 이들 항온에는 다음과 같은 것을 포함한다 : 첨가한 글리코시다제 효소로 인한 결과를 입증하기 위해 글리코시다제가 없는 적당한 완충액내의 항온 ; 사용된 글리코시다제 효소가 활성적이란 사실을 입증하기 위해 글리코시다제에 대한 기질로서 알려져 있는 글리코실화된 단백질(예를들어, 글리코실화된 재조합 인체 에리스로표이에틴)을수반한 항온 : 글리코시다제 자신이 가시화된 겔 밴드에 기여하지 않거나 이를 불명료하게 하지 않는다는 것을 입증하기 위해 기질없이 글리코시다제를 수반한 항온.
또한 글리로시다제를 엔도-베타-N-아세틸글루코사미다제 F(엔도 F : NEW 듀폰) 및 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제 H (엔도 H : NEN듀폰)와 함께 처리하고 다시 적당한 대조 항온과 함께 처리한다. 엔도 F로 처리하는 조건은 다음파 같다 : 1 % (W/V) SDS , 100 mM 2-메트캅토에탄올, 100 mM EDTA, 320 mM 소디움 포스폐이트, pH 6의 존재하에서 3분간 끊임, 노니메트 P - 40 (1.17 % , V/V , 최종농도)의 세포배양물, 소디움 포스폐이트(200 mM , 최종농도) 및 엔도 F (7유닛/ml , 최종농도)로써 3배 희석한다.
엔도 H 처리 조건은 SDS 농도를 0.5 % (W/V)로 하고 엔도H를 농도 1 ㎍/ml에서 사용하는 것을 제외하고는 유사하다.
엔도 F로 처리한 결과는 N-글리카나제로 처리한 결과와 유사한 반면, 엔도 H 는 정제된 SCF 물질에 대해 아무런 영향을 미치지 못한다.
많은 결론을 상기한 글리코시다제 실험으로부터 이끌어낼 수 있다. N-글리카나제[복합 및 고-만노스 N- 결합 탄수화물(Taremtino 등의, Biochemistry 24.4665-4671(1985)) 둘다를 제거], 엔도 F [N -글리카나제(Elder 및 Alexander 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4540 - 4544(1982))와 유사하게 작용], 엔도 H [고-만노스 및 특정 혼성형 N-결합 탄수화물 (Tarentino 등의, Methods Enzymol. 50, 574 - 580 (1978))을 제거], 뉴라미니다제(시알산 잔기를 제거), 및 0-글리카나제 [특정 0-결합 탄수화물 (Lambin 등의 , Biochem. Soc. Trans. 12, 599 - 600 (1984))를 제거]와의 다양한 처리는 다음을 암시한다 : N-결합 탄수화물과 0-결합 탄수화물 모두 존재한다 : 대부분의 N-결합 탄수화물은 복합형이다 ; 0-결합 성분 부분의 적어도 다소를 갖는 시알산이 존재한다. N-결합 가능 부위에 관한 몇가지 정보는 아미노산 시퀀스 데이타(실시예 2)로 부터 수득할 수 있다. N-글리카나제, 엔도 F 및 N-글리카나제/뉴라미니다제가 이형의 물질로 전환될 수 있다는 사실은 훨씬 더 균일한 고속 이동형을 SDS-PAGE 함으로써 명백해지는데, 그러한 사실은 모든 물질이 글리코실레이션중의 이질성에 의해 야기되는 이질성을 갖는 동일한 폴리펩티드를 나타낸다는 결론과 일치한다.
또한 다양한 글리코시다제로써 복합적인 처리를 하여 수득한 최소형은 SDS-PAGE 에서 사용한 분자량 표시물질에 비하여 분자량 18,000-20,000의 범위이다.
SDS-PAGE 상에서 분자량 31,000위치 부근에 산만하게 이동하는 물짙이 모두 동일한 기본 폴리펩티드 사슬을 가지는 생물학적으로 활성인 물질을 나타낸다는 사실은, 이 부위(예를들어, 전기영동 이동 및 시아노겐 브로마이드 처리후 : 실시예 2)에서 이동하는 물질로 부터 유도한 아미노산 시퀀스 데이타는 재조합 DNA 수단에 의해 형질발현되는 분리된 유전자가 생물학적으로 활성인 물질(실시예 4)을 초래한다는 것을 증명한 것과 일치한다는 사실에 의해 확인된다.
[실시예 2]
A. 포유동물 SCF의 아미노산 시퀀스 분석
[정제된 단백질의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)]
실시예 1 (농도=0.117mg/ml)에서와 같이 정제한 약5㎍의 SCF를 C내로우보어(narrowbore)컬럼 (비닥, 300 Å와이드보어(widebore), 2 mm×15cm)를 이용하여 역상 HPLC 한다.
그 단백질을 97 % 유동상 A (0.1 % 트리플루오로아세트산)/3% 유동상 B (0.1 %트리폴루오로아세트산 내의 90 %아세토니트릴)로부터 30 % 유동상 A / 70 % 유동상 B로 70분 이내에 선형 기울기식으로 용출시킨 다음 0.2 ml /분의 유속에서 10분간 더 이소크라틱 용출한다. 완충액 블랭크 크로마토그램을 감한 후, SCF는 제10도에 나타난 바와 같이 보유시간 70.05분에서 단일 대칭 피크로서 분명해 진다.
주 오염 단백질 피크는 이들 조건하에서 검출될 수 없다.
B. 전기영동하여 이동시킨 단백질 밴드이 시퀀싱
실시예 1에서와 같이 정제된 SCF (0.5-1.0 nmol)를 단백질에 공유결합된 Asn-결합 탄수화물 성분을 특이적으로 절단하는 효소인 N-글리카나제로 처리한다(실시예 1 D참조). 제5도의 C컬럼중 분획 4-6로럭터 모은 6ml 의 물질을 진공하에서 건조시킨다. 그런 다음 150 μ1의 14.25 mM CHAP, 100 mM의 2-메르캅토에탄올, 335 mM소디움 포스폐이트, pH 8.6을 첨가하고 37 ℃ 에서 95분간 항온 한다. 그런다음 300 μ1의 74 mM 소디움포스폐이트, 15유닛/ml 의 N-글리카나제, pH 8.6을 첨가하고 19시간 동안 계속 항온한다. 그 표본을 9-18 % 의 SDS-폴리아크릴아미드 기울기 겔 (0.7 mm 두께, 20×20 cm)상에 러닝 시킨다. 겔 내의 단백질 밴드를 0.5암폐어의 일정 전류하에서 1시간 동안 10 mM캡스(Caps) 완충액 (pH 10.5)을 이용하여 폴리비닐디플루오라이드(PVDF , 밀리포어코포레이션)상에 전기영동하여 이동시킨다[Matsudaira 의 J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987)참조]. 이동된 단백질 밴드를 쿠마시 블루 염색하여 가시화한다. 밴드는 분자량∼29,000-33,000 및 분자량∼26,000 으로 존재하는데 즉, 부분적으로만 탈글리코실레이션되었음을 나타낸다(실시예 1D, 제9도 참조) : 앞의 밴드는 절단되지 않은 물짙을 나타내고 뒤의 밴드는 N-결합 탄수화물이 제거된 물질을 나타낸다. 두밴드를 잘라내어 단백질 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레미티드, 모델 477)상에 직접 부하 한다(분자량이 29,000-33,000인 단백질의 경우 40%, 분자량이 26,000인 단백질의 경우 80%). 단백질 시퀀스 분석은 제조자[Hewick 등의, J. Biol. Chem., 256 7990- 7997(1981)참조]에 의해 제공된 프로그램을 이용하여 수행하고 방출된 폐닐티오히단토이닐 아미노산은 마이크로보어 C역상 HPLC 를 이용하여 온라인 분석한다. 양쪽 밴드에는 20 -28 시퀀싱 순환에 대한 신호가 없었는데 이것은 양 밴드 모두 에드만 화학(Edman Chemistry)을 이용하는 방법학에 의해 시퀀스 결정이 불가능하다는 것을 암시한다.
각 시퀀싱 런에 대한 배경 수준은 그 밴드들내에 존재하는 단백질량보다 훨씬 적은 1-7 pmol 사이이다. 이 데이타는 그 밴드들내 단백질의 N -말단이 차단되었음을 암시한다.
C. 전기영동하여 이동시킨 단백질의 원위치 CNBr 절단 및 시퀀싱
단백질이 사실상 차단되었음을 확인하기 위해, 막을 시퀀서(B부분)로 부터 제거하고 블로팅된 밴드를 원 위치 시아노겐 브로마이드(CNBr) 절단을 실시하고 [45℃ 에서 1시간 동안 70% 포름산내의 CNBr (5% W/V)] 건조하여 시퀀스를 분석한다. 강한 시퀀스 신호가 검출되었는데 그것은 CNBr 에 의한 메티오닐 펩티드 결합 절단으로 부터 수득한 내부 펩티트를 나타낸다.
동일한 혼합 시퀀스 신호를 산출한 양 밴드는 처음의 다섯순환에 대해 아래에 기입되어 있다.
또한 양 밴드 모두 20순환 까지 유산한 신호를 산출한다.
초기 산출량은 분자량이 26,000인 밴드에 대해 40-115 pmol 이고 분자량이 29,000-33,000인 밴드에 대해 40-150 pmol 이었다. 이들 수치는 시퀀서 상에 부하된 단백질의 원 물량과 비교할 만하다. 그 결과는 SCF에 상응하는 단백질 밴드가 차단된 N-말단을 함유하였음을 확인시켜준다. N-말단이 차단된 단백질에 대한 유용한 시퀀스 정보를 수득하는데 사용하는 과정에는 다음과 같은 것이 포함되어 있다 : (a) N-말단 블록 해제 (부문 D참조) : 및 (b) CNBr (부문 E 참조), 트립신(부문 F 참조) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(균주 V-8) 프로테아제(Glu- C) (부문 G 찹조)에 의한 내부 절단으로써 펩티드를 형성. 시퀀스 분석은 차단된 N-말단 아미노산이 제거되거나 펩티드 단편이 분리된 후 진행시킬 수 있다. 아래에 실시예가 상세히 기술되어 있다.
D. 피로그루탐산 아미노펩티다제로 처리한 BRL 간 세포 인자의 시퀀스 분석
SCF 의 아미노 말단에 존재하는 차단된 성분의 화학적 성질은 예상하기 힘들다. 차단은 생체내 번역후 과정[F. Wold 의 Ann. Rev. Biochem., 50 783-814(1981)참조]이거나 시험관내 정제과정동안 발생할 수 있다. 두가지의 번역후 변형이 가장 일반적으로 관찰된다. Ala, Ser등과 같은 특정 N-말단 아미노산의 아세틸화가 발생할 수 있으며, N-α-아세틸 전이효소에 의해 촉매될 수 있다.
이는 N-말단 차단 펩티드를 분리하여 질량 스패트럼 분석함으로써 입증될 수 있다. 만일 단백질의 아미노 말단이 글루타민이라면 그의 가마-아미드의 아미드분해가 발생한다. 그런다음, 감마-카르복실레이트 및 유리 N-말단과 관련된 순환이 피로글루타메이트를 산출하기 위해 발생할 수 있다.
피로글루타메이트를 검출하기 위해, 피로글루타메이트 아미노펩티다제 효소를 사용할 수 있다. 이 효소는 피로글루타메이트 잔기를 제거하고 두번째 아미노산에서 시작하는 유리 아미노산 말단을 남겨둔다. 그런 다음 시퀀싱하기 위해 에드만 화학법을 사용할 수 있다.
50mM 소디움 포스폐이트 완충(디티오트레이톨 및 EDTA 를 함유하는 pH 7.6의 완충액)내의 SCF (실시예 1 에서와 같이 정제됨 ; 400 poml)를 37℃에서 16시간 동안 15유닛의 태아 소 간 피로글루타민산 아미노펩티다제(pE-AP)와 함께 배양한다. 반응후 그 혼합물을 단백질 시퀀서상에 직접 부하한다. 주된 시퀀스는 46순환온 통해 확인 될 수 있다. 초기 수율은 약 40% 이고 반복수율은 94.2%였다. N-말단 피로글루탐산을 포함하는 N-말단 시퀀스는 다음과 같다 :
이 결과는 SCF 가 그의 N-말단으로서 피로글루탐산을 함유한다는 것을 나타낸다.
E. CNBr 펩티드의 분리 및 시퀀스 분석
실시예 1에서와 같이 정제된 SCF (20-28 ㎍ ; 1.0-1.5 nmol)를 실시예 1에서 기술한 바와같이 N-글리카나제로 처리한다.
분자량이 26,000인 물질로의 전환은 이경우 완벽한 것이다.
그 표본을 건조시켜 실온에서 18시간 동안 70% 포름산내의 CNBr(5%)로 절단한 것을 물로 희석하고 건조하여 0.1% 트리플루오로아세트산내에 재용해시킨다. CNBr 펩티드를 C4내로우보어 칼럼 및 본 실시예의 부문 A에 기술된 바와 동일한 용출 조건을 이용하여 역상 HPLC에 의해 분리한다.
몇몇의 주된 펩티드 분획을 분리하여 시퀀싱하고, 그 결과는 다음에 간략히 나타나 있다.
1. 위치 12, 13 및 25에서는 아미노산이 검출되지 않았음. 펩티드 b는 말단에서 시퀀싱되지 않았음.
2. CB-15의 (N)는 검출되지 않았음 : 잠재적인 N - 결합 글리코실레이션 부위를 기초로 하여 추측하였음. 펩티드는 말단에서 시퀀싱되지 않았음.
3. Asn이 N-결합 당의 N-글리카나제 제거시 Asp로 전환되었으리라 추측되는 지정 부위.
4. 사용된 단일문자 코드 ; A,Ala ; C,Cys ; D,Asp ; E,Glu ; F,Phe ; G,Gly ; H,His ; I,Ile ; K,Lys ; L,Leu ; M,Met ; N,Asn ; P,Pro ; Q,Gln ; R,Arg ; S,Ser ; T,Thr ; V,Val ; W, Tyr ; 및 Y, Tyr.
F. BRL 간 세포 인자 트립신 단편의 분리 및 시퀀싱
실시예 1 에서와 같이 정제된 SCF (0.1 M중탄산 암모늄 150 μl내의 20㎍ )를 37℃ 에서 3.5시간 동안 1 ㎍의 트립신으로 소화시킨다. 소화물은 즉시 본 실시예의 부문 A에 기술된 동일한 용출 조건을 이용하여 역상 내로우보어 C4HPLC 상에 러닝한다. 용출된 모든 펩티드 피크는 소화되지 않은 SCF(부문 A)의 피크와는 다른 보유시간을 가진다. 이 분리된 펩티드의 시퀀스 분석은 아래에 나타나 있다.
1. 위치 4의 아미노산은 지정되지 않았음.
2. 위치 12의 아미노산은 지정되지 않았음.
3. 6개의 펩티드 T-5 내에 있는 위치 20 및 21의 아미노산은 확인되지 않았음 ; 그 아미노산은 0-결합 당 결합 부위로서 임시 지정되었음.
4. 위치 10의 아미노산은 검출되지 않았음 ; 그 아미노산은 잠재적인 N-결합 글리코실레이션 부위를 기초로하여 Asn이라 추측됨. 위치 21의 아미노산은 검출되지 않았음.
G. S. 아루레우스 Glu-C 프로테아제 절단후 BRL 간 세포인자 펩티드의 분리 및 시퀀싱
실시예 1에서와 같이 정제된 SCF(0.1M 중탄산 암모늄 150μl 내의 20μg)을 프로테아제에 대한 기질의 비가 1 : 20일 Glu-C 프로테아제 절단을 실시한다. 소화는 37℃에서 18시간 동안에 완성된다. 소화물을 역상 내로우보어 C4HPLC에 의해 즉시 분리한다. 다섯 개의 주된 펩티드 분획을 모으고 시퀀싱하면 다음과 같다 :
1. S-2 펩티드의 위치 6의 아미노산은 지정되지 않았음 ; 이것은 0-결합 당 부착 부위일 수 있음. S-2 펩티드의 위치 16에 있는 Ala는 낮은 산출량으로 검출되었음.
2. 펩티드 S-3은 SCF의 N-말단으로부터 유도된 N-말단 차단 펩티드일 수 있음.
3. 괄호안의 N은 잠재적인 N-결합 당 부착 부위로서 적당하였음.
H. BNPS-스카톨 절단후 BRL 간 세포인자의 시퀀스 분석
10mM 중탄산 암모늄내의 SCF(2㎍)을 진공 원심분리에 의해 완전하게 건조시킨 다음 10㎕의 결정 아세트산에 재용해한다. BNPS-스카톨의 10-20 배 몰 과량을 그 용액에 첨가하고 혼합물을 50℃에서 60분간 항온한다.
그런다음 반응 혼합물을 진공 원심분리하여 건조시킨다.
건조시킨 잔유물을 100㎕의 물로 추출하고 다시 50㎕의 물로 추출한다. 그런 다음 혼합된 추출물을 상기한바와 같이 시퀀스 분석한다. 다음의 시퀀스가 검출되었다.
위치 28은 명확히 지정되지 않은 것이다 ; 잠재적인 N-결합 글리코실레이션 부위를 기초로하여 Asn으로 지정하였음.
I.BRL 간 세포 인자의 C-말단 아미노산의 결정
SCF 단백질의 분취량(500 pmol)을 pH 4.0의 10mM 소디움 아세테이트로 완충 교환하여 (최종 부피 90㎕) Brij-35를 0.05% (W/V)까지 첨가한다. 5㎕의 분취량을 단백질의 정량분석을 위해 취한다. 그 표본 40㎕를 1000㎕가 되도록 상기 완충액을 사용하여 희석한다.
카르복시펩티다제 P(페니실리움 잔티넬룸으로부터 수득함)를 효소대 기질의 비를 1:200으로 하여 첨가한다.
25℃에서 소화시키고 0,15,30,60 및 120분에서 20㎕의 분취량을 취한다. 각 시점에서 트리플루오로 아세트산을 최종 농도 5%로 하여 첨가함으로써 소화를 종결한다.
그 표본들을 건조시키고 방출된 아미노산을 70℃, 12분간 0.2M NaHCO3(pH 9.0)에서 답실(Dabsy1) 클로라이드(디메틸아미노아조 벤젠술포닐 클로라이드)와 반응시켜 유도한다[Chang 등의, Methods Enzynol., 90, 41-48 (1983)참조].
유도된 아미노산(각 표본의 6분의 1)을 Chang 등의 방법을 변형시킨 내로우보어 역상 HPLC [Techniques in Protein Chemistry, T, H㎍li 출판, Acad. Press, NY (1989), pp. 305-311 참조]에 의해 분석한다. 각 시험에서의 정량적인 조성물의 결과는 유도된 아미노산 표준(1 pmol)과 비교함으로써 수득된다. 0시에서 오염 글리신이 검출되었다. 알라닌으로 항온시간이 증가함에 따라 증가되는 유일한 아미노산이다. 2시간 항온, Ala는 단백질 몰 당 방출된 0.66몰의 Ala와 동등한 총량 25 pmol이 검출된다. 이 결과는 천연 포유동물 SCF 분자가 그 분자의 카르복시말단으로서의 Ala 를 포함한다는것을 나타내며 C-말단 Ala를 포함하는 C-말단 펩티드 즉 S-2 의 시퀀스 분석과 일치한다. 이 결론은 카르복시펩티다제 P의 공지된 특이성 [Lu등의 J. Chromatog. 447, 351-364 (1988) 참조]과 일치한다. 예를들어, 만일 시퀸스 Pro-Val 이 마주치면 절단은 중단된다. 펩티드 S-2 는 시퀀스 S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A) 를 가지며 그것이 SCF 의 C -말단 펩티드라 추정된다(본 실시예의 부문 J 참조). C -말단 시퀸스인 ---P-V-A-(A) 는 단지알라닌에 대한 프로테아제 절단을 제한한다. 펩티드 S-2의 아미노산 조성물은 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys 및 1 Arg, 총 16잔기의 존재를 나타낸다. 2 Ala 잔기의 검출은 이 펩티드의 C -말단에 두 Ala 잔기가 있음을 나타낸다(부문 G의 표를 참조). 따라서 BRL SCF 는 Ala 164 또는 Ala 165에서 종결된다.
J. SCF의 시퀀스
(1) 곤충 간 세포 인자의 N-말단 피로글루탐산을 제거한 후의 곤충 간 세포 인자, (2) CNBr 펩티드, (3) 트립신 펩티드 및 (4) Glu-C 펩티다제 단편을 시퀀스 분석한 것에서 수득한 결과를 혼합함으로써, N -말단 시퀀스 및 C-말단 시퀀스를 연역한다(제11도). N-말단 시퀀스는 피로글루탐산에서 시작하여 Met-48 에서 끝난다. C-말단 시퀀스는 84/85 아미노산(위치 82내지 164/165)을 함유한다. 위치 49내지 81로부터의 시퀀스는 분리된 펩티드중 어느 펩티드에서도 검출되지 않았다. 그러나, 본 실시예의 부문 H 에 기술된 바와 같이 BRL SCF 의 BNPS-스카톨 절단후의 큰 펩티드에 대한 시퀀스를 검출하엾다. 집쥐 SCF(실시예 3)로부터 수득한 DNA 시퀀스 이외에도 이들 부가적인 데이타로부터 N -및 C -말단 시퀀스를 정렬하고 그 전체 시퀀스를 제11도에서와 같이 도시하였다. 그 분자의 N-말단은 피로글루타메이트 아미노펩티다제 소화 및 카르복시펩티다제 P 소화에 의해 확인된 것이다.
이 시퀀스 데이타로부터, Asn-72 가 글리코실화되고 Asn-109 및 Asn-120은 다른 분자가 아닌 몇몇 분자내에서 임시로 글리코실화된다는 결론이 내려진다. Asn-65 는 시퀀스 분석 동안에 검출될 수 있으므로 전체가 아닌 부분적으로만 글리코실화된 것으로 추측된다. DNA 시퀀스로부터 예상된 Ser-142, Thr-143 및 Thr-155는 아미노산 시퀀스 분석 동안은 검출될 수 없으므로 0-결합 탄수화물 부착 부위일 수 있다. 이 잠재적인 탄수화물 부착 부위는 제11도에 나타나 있다 ; N-결합 탄수화물은 굵은 입체 문자로 나타내고 ; 0 -결합 탄수화물은 굵은 개방 문자로 나타내었다.
K. BRL 간 세포 인자의 아미노산 조성 분석
제7도의 C4컬럼으로부터의 물질을 아미노산 조성 분석을 위해 농축하고 50 mM 중탄산암모늄으로 완충 교환하여 준비한다.두 70㎕표본을 0.1 % 폐놀 및 0.05 % 2-메르캅토에탄올을 함유하는 6 N HCI 에서 110℃, 24 시간 동안 진공상태로 하여 개별적으로 가수분해한다. 가수분해물을 건조시켜 소디움 시트레이트 완충액 내로 재구성하고, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한다(베크만 모델 6300 아미노산 분석기). 그 결과는 표 3에 나타나 있다.
아미노산 조성을 추정하기 위해 164개의 아미노산(단백질 시퀀싱 데이타로부터 수득)을 사용하면 193개의 아미노산(PCR 로부터 유도된 DNA 시퀀싱 데이타로부터 추론된 바와 같음, 제14c도)을 이용하여 추정한 아미노산 조성보다 예상치에 더 잘 일치한다.
1. 단백질 시퀀스 분석으로부터의 158 잔기를 기초로 하였음. (Cys 및 Trp은 제외)
2. 단백질 시퀀스 데이타(A) 또는 DNA 시퀀스 데이터(B)로 부터 추정한 이론치.
3. 1-164 시퀀스를 기초로 하였음.
아미노산 조정 분석에 공지량의 내부 표준물질을 포함시키면 표본내의 단백질 정량도 가능하며 ; 분석한 표본에 대해0.117 mg/ml 의 값이 수득된다.
[실시예 3]
집쥐 및 인체 SCF 에 대한 유전자 클로닝
A. 집쥐 SCF cDNA 단편의 증폭 및 시퀀싱
집쥐 SCF 단백질의 아미노산 시퀀스 단편 결정은 집쥐 SCF에 특이하게 작용하는 혼합된 시퀀스 올리고뉴클레오티드 고안을 가능하게 한다. 이 올리고뉴클레오티드는 쥐 cDNA 및 게놈 라이브러리를 선별하기 위한 혼성화 프로브로서 사용하고 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 방법을 사용하는 cDNA 부분을 증폭시키기 위한 시도에서 프라이머로서 사용한다 [Mμllis 등의 Methods in Enzymol. 155, 335-350(1987)참조]. 이 올리고뉴클레오티드를 포스포라미다이트 방법[Beaucage 등의 Tetrahedron Lett.,22,1859-1862(1981) ; McBride, 등의 Tetrahedron Lett., 24,245-248(1983) 참조]으로 합성하고 ; 그 시퀀스를 제12a도에 나타냈다. 문자는 A, 아데닌 ; T , 티민 ; C, 시토신 ; G, 구아닌 ; I, 이노신을 나타낸다.
제12a도에서 기호 * 는 제한 엔도뉴클레아제 인지 시퀀스를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 시퀀스는 5'→ 3'로 표기되었다.
집쥐 게놈 라이브러리, 집쥐 간 cDNA 라이브러리 및 두 개의 BRL cDNA 라이브러리는 32p로 표지한 혼합된 올리고뉴클레오티드 프로브, 219-21 및 219-22 (제12a도)를 사용하여 선별하며 그의 시퀀스는 실시예 2에서와 같이 수득된 아미노산 시퀀스를 기초로한 것이다. cDNA 클로닝 표준 방법 [Maniatis 등의 Molecμlar Cloning, Cold Spring Harbor212- 246 (1982) 참조] 을 사용하는 실험들에서는 SCF 클론이 분리되지 않는다. SCF 핵산 시퀀스를 분리하는 선택 방법은 PCR 기술을 이용하는 것을 포함한다.
이 방법론에 있어서, 두개의 DNA 프라이머 사이에 있는 DNA 영역을 열 순환기 내에서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 적합한 DNA 폴리머라제(TaqI DNA 폴리머라제와 같은)로 촉매되는 복제의 다중 순환에 의해 시험관내에서 선태적으로 증폭한다. PCR 증폭의 특이성은 증폭된 DNA 단편의 측면에 접하고 맞은편 가닥에 혼성화하는 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를 기초로 한다. 복합 혼합물내의 특정 DNA 영역에 대한 이중 측면 특이성을 가지는 PCR 은 그 영역에 충분히 특이하게 작용하는 시퀀스를 가지는 두 개의 프라이머를 사용함으로써 가능해 진다. 단일-측면 특이성을 가지는 PCR 은 특정 혼합물 내의 많은 또는 전체 DNA 분자상에 존재하는 표적 부위에 기동될 수 있는 하나의 부위-특이 프라이머 및 제2프라이머를 이용한다[Loh 등의 Science, 243, 217-220 (1989) 참조]. 성공적인 PCR 증폭 반응의 DNA 생성물은 DNA 시퀀스 정보원이며[Gyllensten, Biotechniques, 7,700-708 (1989) 참조] , 올리고뉴클레오티드 프로브보다 긴 길이와 높은 특이성을 가지는 표지된 혼성화 프로브를 제조하는데 사용할 수 있다. 또한 PCR 생성물은 암호화된 펩티드 생성물의 발현을 가능하게 하는 플라스미드 벡터내로 클로닝되는 적당한 프라이머 시퀀스로 고안할 수 있다.
집쥐 SCF cDNA 의 DNA 시퀀스를 수득하기 위한 기본 방법은 제13a도에 밑줄그어져 있다. 작은 화살표 PCR증폭을 나타내며 두꺼운 화살표는 DNA 시퀀싱 반응을 나타낸다. DNA 시퀀싱과 관련된 PCRs 90.6 및 96.2 를 집쥐 SCF cDNA에 대한 부분 핵산 시퀀스를 수득하기 위해 사용한다.
이들 PCRs에 사용된 프라이머는 제11도에 나타난 아미노산 시퀀스를 기초로 혼합된 올리고뉴클레오티드이다. PCRs 90.6 및 96.2로 부터 획득한 시퀀스 정보를 사용하여 독특한 시퀀스 프라이머(224-27 및 224-28, 제12a도)를 제조하고 이를 후속 증폭 및 시퀀싱 반응에 사용한다. cDNA 의 5' 말단을 포함하는 DNA 를 단일-측면 특이성 PCR을 사용하여 PCRs 90.3, 95.5 및 625.1 에서 수득한다. SCF 단백질의 C -말단에 가까운 부가 DNA 시퀀스는 PCR 90.4 에서 수득한다. 집쥐 SCF cDNA 의 암호화 부위의 나머지에 대한 DNA 시퀀스는 본 실시예의 부문 C에서 하기한 바와같이 생성물 630.1, 630.2, 84.1 및 84.2 로 부터 수득한다.
RNA 는 Okayama 등의 [Methods Enzymol. 154, 3-28 (1987)참조] 문헌에 기술된 바와 같은 BRL 세포로 부터 제조한다. 폴리 A RNA는 Jacobson 의 [Methods in Enzymology, VolμMe 152, 254-261 (1987) 참조] 문헌에 기술된 바와같은 올리고(dT) 셀룰로오스 컬럼을 사용하여 분리한다.
제1.-가닥 cDNA를 효소, Mo-MLV 역 전사효소(베데스다리서치 라보라토리스)가 보충된 프로토콜에 따라 주형으로서 1μg의 BRL 폴리 A RNA를 사용하고 프라이머로서 (dT)을 사용하여 합성한다. RNA 가닥 분해는 84℃에서 10분간 0.14M의 NaOH를 사용하거나 5분간 끓는 물 수조에서 항온시켜 실행한다.
이 용액을 중화하기 위해 과량의 아세트산암모늄을 가하고 페놀/클로로포름을 사용하여 cDNA를 일차 추출한후, 클로로포름/이소-아밀 알콜로 추출하고 에탄올로 침전한다.
단일-측면 특이성을 가지는 PCRs에서 올리고(dC)-관련 프라이머의 사용이 가능하도록 하기 위해 [Deng등의 Methods Enzymol., 100, 96-103 (1983)] 문헌에 이미 기술된 바와 같은 송아지 흉선 (뵈링거 만하임)으로 부터의 말단 전이효소를 가지는 분취량의 제1-가닥 cDNA 의 3' 말단에 폴리(dG)를 말단부가한다.
기술되어 있지 않는 과정으로는 각 PCR순환에 있어서 변성단계를 94℃ 에서 1분간으로 하고 ; 72 ℃에서 3 또는 4 분간 연장한다. 어닐링 온도 및 기간은 PCR에서 PCR까지 다양하며, 동시에 실시되는 여러개의 다른 PCRs의 추정 요구치를 기준으로 절충됨을 종종 나타낸다.
프라이머 인공산물 [Watson, Amplifications, 2, 56 (1989)참조] 의 집적을 감소시키기 위해 프라이머의 농도를 감소시킬때 보다 긴 어닐링 시간이 나타나며 ; PCR생성물 농도를 높일 때 보다 짧은 어닐링 시간과 보다 높은 프라이머의 농도를 사용하여 수득률이 증가되었다. 어닐링 온도를 결정하는 주요 요인은 프라이머-표적물 화합의 추정 Td이다.
[S㎍g 등의, in Developmental Biology Using Purified Genes eds. Brown, D.D. 및 Fox, C.F. (Academic, New York) pp. 683-693 (1981) 참조]. 증폭에 사용된 효소는 다음의 세 제조자 중에서 수득한다 : 스트라타진(Stratagene), 프로메가(Promega), 또한 페르킨-엘머시투스(Perkin-Elmer Cetus). 반응 학합물은 제조자가 제안한 대로 사용한다. 중폭은 코이 템프사이클(Coy Tempcycle) 또는 페르킨-엘머 시투스 DNA 열 순환기 중 선택하여 실행한다.
SCF cDNA 단편의 증폭은 주로 에티디움 브로마이드의 존재하에서 아가로우즈 겔 전기이동으로 분석하여 자외선 조사에 의하여 자극되는 DNA 밴드의 형광에 의해 가시화된다.
작은 단편이 예상되는 몇몇 경우에 있어서 PCR 생성물은 폴리아크릴아미드 겔 전기이동에 의해 분해된다.
관찰한 밴드가 SCF cDNA 단편을 나타내는지의 확인은 하나 또는 그 이상의 내부로 위치한 프라이머를 수반한 후속 증폭 상의 적당한 DNA 밴드를 관찰함으로서 가능하게 된다.
마지막 확인은 PCR생성물의 디데옥시 시퀀싱(Sanger 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977) 참조] 과 SCF 펩티드 시퀀스 정보를 가지는 예상 번역 생성물을 비교한다.
PCR 개시 실험에서는 SCF 단백질 시퀀스를 기초로 한 혼합 올리고뉴클레오티드를 사용한다[Goμld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1934-1938) 참조]. 다음은 집쥐 cDNA를 암호화하는 아미노산 -25 내지 162에 대한 DNA 시퀀스 정보를 얻기 위해 사용한 PCR증폭에 대해 기술한 것이다.
PCR 90.6에서, BRL cDNA 를 반응 부피 20 μℓ에서 각각 4 pmol의 프라이머 222-11 및 223-6 을 수반하여 증폭한다. PCR 90.6생성물의 분취량을 아가로우즈 겔 상에서 전기 이동시키고 예상 크기의 밴드를 관찰한다.
1㎕의 PCR 90.6 생성물을 45 ℃에서 어닐링한, 50 ㎕내의 각각 20 pmol 의 프라이머 222-11 및 223-6을 수반하여 15 순환동안 더 증폭한다. 그후 생성물 일부를 프라이머 222-11 및 219-25 (PCR 96.2)의 존재하에서 25 순환으로 증폭하고, 아가로우즈 겔 상에서 전기이동시켜 주요 생성물 단일 밴드를 수득한다. 동일한 두 프라이머를 가지는 PCR 96.2 의 비대칭 증폭 생성물은 지속적으로 시퀀싱된 주형을 생산한다. 생성물 96.2 의 SCF 시퀀스의 보다 선택적인 증폭은 프라이머 222-11및 겹끼워진(nasted) 프라이머 219-21의 존재하에서 생성물을 PCR 증폭함으로써 수행된다. 이 PCR 생성물을 비대칭 증폭 및 방사선표지 프로브 생성(PCR2)에 대한 주형으로서 사용한다.
집쥐 SCF cDNA 의 5' 말단을 분리하기 위해, cDNA 의 폴리(dG)말단에 (dC)상보적인 시퀀스를 포함하는 프라이머를 비-특이 프라이머로서 사용한다. PCR 90.3 은 프라이머로서 (dC)(10 pmol) 및 223-6 (4 Pmol)을 포함하며 주형으로서 BRL cDNA 를 포함한다. 반응 생성물은 매우 고분자량의 집적체처럼 작용하며 아가로우즈 겔 전기이동시 부하(loading) 웰 근처에 잔존한다. 1μℓ의 생성물 용액을 45℃에서 어닐링한, 부피 25㎕내의 25 pmol 의 (dC)와 10 pmol 의 15의 존재하에서 15순환동안 더 증폭한다. 이 생성물 1/2㎕를 내부에 겹끼워진 프라이머 219-25 와 201-7(PCR 96.6)로 25 순환 동안 증폭한다. 201-7의 시퀀스는 제12c도에 나타나 있다.
아가로우즈 겔 상에서의 전기이동시 밴드가 관찰되지 않는다. 40℃에서 어닐링한, 또다른 PCR을 25순환으로 증폭한 결과 현저한 하나의 밴드가 관찰된다. 서던 블로팅을 한 결과 현저한 하나의 혼성화 밴드가 관찰된다. PCR(625.1)을 45℃ 에서 어닐링한, 201-7 과 내부에 겹끼워진 프라이머 224-27을 사용하여 20순환으로 증폭한다. PCR로 비대칭 증폭한 후 시퀀싱을 실행한 결과 프리-SCF의 추정상 시그날 펩티드 암호화 시퀀스의 추정상 아미노 말단을 지나 연장된 시퀀스가 산출된다. 이 시퀀스를 집쥐 SCF cDNA의 암호화 부위의 5' 말단을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 227-29를 고안하는데 사용한다. 이와 유사하게 PCR 90.4 를 시퀀싱하여 아미노산 162에서 종결하는 3'DNA 시퀀스를 수득한다(제13a 도 참조).
B. 집쥐 간 세포(Stem cell)인자 게놈 DNA의 클로닝
상기 부문 A에 기술한 바와같이 집쥐 SCF를 암호화하는 cDNA 의 PCR 증폭으로 제조한 프로브를 집쥐 게놈 시퀀스를 포함하는 라이브러리를 선별하는데 사용한다(클론테크 라보라토리스, 인코포레이티드로 부터 구입 ; 목록 번호 제 RL1022j 호). 이 라이브러리를 성숙한 수컷 스프래그-돌레이 집쥐로 부터 수득한 DNA를 사용하여 박테리오파지 λ 벡터 EMBL-3 SP6/T7 내에 구성한다. 공급자에 의해 특정화된 이 라이브러리는 평균 삽입물 크기가 16 kb 인 2.3×10 의 독립 클론을 포한한다.
게놈 라이브러리를 선별하는데 사용된 P- 로 표지된 프로브를 생성시키기 위해 PCRs를 사용한다. 16.7 μM의 P (알파)-dATP, 200 μM 의 dCTP, 200 μM의 dGTP, 200 μM의 dTTP, 폐르킨 엘머 시투스에 의해 공급된 반응 완충액, 0.05 유닛/ml 의 Taq 폴리머라제(페르킨 엘머 시투스), 0.5 μM 219-26, 0.05 μM 223-6 및 두 프라이머에 대한 표적 부위를 포함하는 1 ㎕의 주형 90.1을 포함하는 반응으로 프로브 PCR 1 (제13a 도)을 제조한다. 프로브 PCR 2는 프라이머와 주형을 교환하는 것을 제외하고는 유사한 반응 조건하에 제조한다. 0.5μM의 222-11, 0.05μM의 219-21 및 PCR 96.2 로 부터 유도한 1 ㎕의 주형을 사용하여 프로브 PCR 2 를 제조한다.
Maniatis등의 상기문헌(1982)에 기술된 바와같이 약 10 의 박테리오파지를 평판화한한다. 그 플라크를 Genescreen Plus 필터(22cm×22 cm : NEN/듀폰)로 옮겨 제조자가 제시한 방법에 따라 변성, 중화 및 건조한다. 각 평판에 대하여 두 개의 필터 이동을 실시한다.
이 필터를 1 M NaCl, 1 % SDS, 0.1 % 소 혈청알부민, 0.1 % 피콜, 0.1 %폴 리비닐피롤리돈 (혼성화용액)내에서 65 ℃에서 약 16시간 동안 예비 혼성화한 후 -20℃에 저장한다.
P- 로 표지한 1.2×10 cpm/ml의 PCR 1프로브를 포함하는 신선한 혼성화 용액으로 그 필터를 옮긴 후 65℃에서 14시간 동안 혼성화한다. 필터를 0.9 M NaCl, 0.09 M 시트르산나트륨, 0.1 % SDS, pH 7.2 (세척용액)으로 실온에서 2시간 동안 세척한 후 신선한 세척용액으로 65℃에서 30분간 재세척한다. 오토래디오그램 상의 방사성 반점에 상응하는 평판 영역의 박테리오파지 클론을 평판 상에서 제거한 후 프로브 PCR 1 및 PCR 2로 재선별한다.
양성 클론으로 부터 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI, SphI 또는 SstI 으로 절단하고 그 결과 생성되는 단편을 pUCl19 내로 서브클로닝한 후 시퀀싱한다. 집쥐의 게놈 SCF DNA를 시퀀싱하는 방법은 제14a도에 개략적으로 나타나 있다. 이 도면에 있어서, 맨 윗 부분에 그은 선은 SCF를 암호화하는 집쥐 게놈 DNA부위를 나타낸다.
선 안의 공간은 시퀀싱되지 않은 것을 나타낸다. 큰 박스는 위의 각 박스로 표시한 암호화된 아미노산에 상응하는 SCF 유전자 부위를 암호화하는 엑손을 나타낸다.
화살표는 시퀀싱하고 집쥐 SCF 유전자에 대한 공통 시퀀스를 모으는데 사용한 개별 부위를 나타낸다. 집쥐 SCF 유전자에 대한 시퀀스는 제14b도에 나타나 있다.
집쥐 게놈 라이브러리를 선별하기 위해 PCR 1 프로브를 사용하여 SCF의 아미노산 19 내지 176을 암호화하는 엑손에 상응하는 클론을 분리한다. 아미노산 19에 대한 암호화 부위의 엑손 상류에 대한 클론을 수득하기 위하여 올리고뉴클레오티드 프로브 220-30을 사용하여 라이브러리를 선별한다.
프로브 PCR 1을 수반하여 이미 사용한 동일한 필터 세트를 상기와 같이 예비 혼성화하고 P- 로 표지한 올리고뉴클레오티드 228-30(0.03 피코몰/ml)를 포함하는 혼성화 용액 내에서 50℃에서 16시간 동안 혼성화한다. 이 필터를 실온에서 30분간 세척 용액으로 세척한 후, 신선한 용액을 사용하여 45℃에서 15분간 재세척한다.
오토래디오그램 상의 방사성 반점에 상응하는 평판 영역의 박테리오파지 클론을 평판 상에서 제거한 후 프로브 228-30 으로 재선별한다. 양성 클론으로 부터의 DNA를 제한 엔도뉴클레아계로 절단한 후 상기와 같이 서브클로닝한다.
프로브 228-30을 사용하여 아미노산-20 내지 18을 암호화하는 엑손에 상응하는 클론을 수득한다.
5'-비번역 부위 및 아미노산-25 내지-21 에 대한 암호화 부위를 포함하는 엑손에 상응하는 클론을 분리하기 위한 시도를 여러차례 하였다. 집쥐 SCF 유전자의 이 부위에 대한 클론은 분리되지 않았다.
C. 포유동물 세포내의 발현을 위한 집쥐 cDNA 클로닝
집쥐 SCF 의 활성 폴리펩티드 생성물이 포유동물 세포내에서 발현되고 분비될 수 있는지 확인하기 위하여 포유동물 세포발현계를 고안한다. 집쥐 SCF를 절두한(truncated) 변형물 (SCF 및 SCF ) 및 제14c도의 유전자 시퀀스의 번역으로부터 예상되는 단백질(SCF )의 발현을 위해 발현계를 고안한다.
이 연구에 사용한 발현벡터는 pUCl19, SV40 및 HTLVI 시퀀스를 포함하는 셔틀벡터이다. E. coli 및 포유동물 세포 모두에 있어서 자율적으로 복제가 가능하고 바이러스성 DNA시퀀스의 조절하에서 삽입 외인성 DNA가 발현 가능하도록 벡터를 고안한다. E. coli DH5 에 함유된, Vl9.8로 명명한 이 벡터를 1989년 10월 13일자로 미국 메릴랜드 로크 빌레 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타잎 컬쳐 콜래션에 기탁하였다(기탁번호 ATCC 제68124호). 이 벡터는 본원의 참고문헌으로 인용한 Souza의 미국 특허 제4,810,643호에 기술된 pSVDM19의 유도체이다.
집쥐 SCF 에 대한 DNA를 플라스미드 렉터 Vl9.8 내로 삽입한다. 이 cDNA는 제14c도에 나타나 있다. 이와 같은 구성에 사용된 cDNA는 제13a도에 나타난 바와 같이 PCR 반응 630.1 및 630.2로 합성한다.
이들 PCRs은 독립적인 증폭을 나타내며 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 227-29 및 227-30을 이용한다.
이들 프라이머에 대한 시퀀스는 본 실시예의 부문 A에 기술한 PCR로 생성시킨 cDNA로 부터 수득한다. 50㎕ 부피의 반응물은 1x 반응 완충액(페르킨 엘머 시투스 키트로부터 구입), 250μM의 dATP, 250μM의 dCTP, 250μM의 dGTP 및 250μM의 dTTP, 200 ng의 올리고 (dT)-기동된 cDNA, 1피코몰의 227-29, 1피로몰의 227-30, 및 2.5 유닛의 Taq 폴리머라제(페르킨 엘머 시투스)로 구성된다.
cDNA를 94℃의 변성 온도에서 1분간, 어닐링 온도 37 ℃에서 2분간, 연장온도 72℃에서 1분간 처리하여 10순환 동안 증폭한다. 이와 같은 PCR 증폭의 개시 순환 이후 각 반응물에 10피코몰의 227-29 및 10피코몰의 227-30을 가한다. 어닐링 온도를 55℃로 변차시키는 것을 제외하고는 동일 조건하에서 30순환동안 계속 증폭한다.
PCR의 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 SstII로 절단한다. V19.8 을 마찬가지로 HindIII 및 SstII로 절단하고, 한 경우는 절단된 플라스미드 벡터를 송아지 내장의 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 다른 한 경우는 절단물로부터의 큰 단편을 아가로우즈 겔로부터 분리한다.
cDNA를 T4 폴리뉴클레오티드 리가아제를 사용하여 V19.8에 결합시킨다. 이 결합 생성물을 [Okayama, 등의 상기 문헌(1987) 참조] 문헌에 기술한 바와같이 적당한 E. coli 균주 DH5 내로 형질전환시킨다. 각각의 박테리아성 클론으로 부터 제조한 DNA를 상기 디데옥시 방법에 의하여 시퀀싱 한다. 제17도는 Vl9.8 SCF의 구성을 나타낸다.
이들 플라스미드는 실시예 4 및 5에 기술한 바와같이 포유 동물 세포를 형질감염시키는데 사용된다.
PCR 증폭으로 cDNA를 합성하여 이후에 Vl9.8에 삽입시킨, SCF 에 사용한 것과 유사한 방법으로 집쥐 SCF 에 대한 발현 벡터를 구성하였다. 이 구성에 있어서 사용된 cDNA는 주형으로서 SCF cDNA를, 유전자의 5'-말단에 대한 프라이머로서 227-29를, 유전자의 3'-말단에 대한 프라이머로서 237-19를 포함하는 Vl9.8을 PCR 증폭하여 합성하였다.
복제 반응물 (50㎕)은 1x반응 완충계, 250μM의 각 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 2.5 유닛의 Taq 폴리머라제, 20 ng의 Vl9.8 ; SCF 및 20피코몰의 각 프라이머를 포함한다.
이 cDNA를 변성 온도 94℃에서 1분, 어닐링 온도 55℃에서 2분, 연장 온도 72℃에서 2분간 처리함으로써 35순환으로 증폭한다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 SstII로 절단한 후 Vl9.8 에 삽입한다.
그 결과 생성된 벡터는 종결코돈이 뒤따르는 SCF의 아미노산 -25내지 164에 대한 암호화 부위를 포한한다.
집쥐 SCF의 193아미노산 형태에 대한 cDNA (제14c도의 DNA 시퀀스의 번역으로 부터 집쥐 SCF 을 예상함)는 집쥐 SCF 에서와 유사한 방법으로 플라스미드 벡터 Vl9.8 로 삽입한다. 이 구성에 사용된 cDNA는 올리고뉴클레오티드 227-29 및 230-25 를 이용하는 PCR반응 84.1 및 84.2 (제13a도)로 합성한다.
그 두 반응은 상이한 RNA준비물로 부터 시작하는 독립된 증폭을 나타낸다. 227-29에 대한 시퀀스는 본 실시예의 A부문에 기술한 바와같은 PCR반응을 통하여 수득하며, 프라이머 230-25에 대한 시퀀스는 집쥐 게놈 DNA (제14b도)로 부터 수득한다. 반응물 50㎕는 1x 반응 완충제(페르킨 엘머 시투스 키트로 부터 구입), 250 μM dATP, 250 μM dCTP, 250 μM dGTP 및 250 μM dTTP, 200 ng의 올리고 (dT)- 기동된 cDNA, 10피코몰의 227-29, 10피코몰의 230-25 및 2.5유닛의 Taq 폴리머라제(페르킨 엘머 시투스)로 구성된다.
이 cDNA 를 변성 온도 94 ℃에서 1 1/2분, 어닐링 온도 50℃ 에서 2분, 연장온도 72℃에서 2분간 처리하여 5순환 동안 증폭한다. 개시 순환이후 어닐링 온도를 60℃로 변하시키는 것을 제외하고는 같은 조건으로 35순환 동안 계속하여 증폭한다. PCR 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 SstII를 사용하여 절단한다.
Vl9.8 DNA를 HindIII 및 SstII로 절단하고, 절단물로 부터의 큰 단편을 아가로우즈 겔로부터 분리한다.
cDNA 를 T4 폴리뉴클레오티드 리가아제를 사용하여 Vl9.8에 결합한다. 이 결합 생성물을 감응 E. coli 균주 DH5 내로 형질전환시킨후 각각의 박테리아성 클론으로 부터 제조된 DNA를 시퀀싱한다.
이들 플라스미드는 실시예 4의 포유동물 세포를 형질간염시키기 위해 사용한다.
D. 인체 SCF cDNA PCR생성물의 증폭 및 시퀀싱
인체 SCF cDNA를 제13b도에 밑줄 그은 부분에서와 같이 PCR 증폭을 이용하여 간암 세포주 HepG2 (ATCC 제 HB 8065호)로 부터 수득한다. 그 기본적인 방법은 시퀀스를 집쥐 SCF cDNA로 부터 수득한 프라이머를 가지고 PCR에 의해 인체 cDHA를 증폭하는 것이다.
RNA 는 Maniatis 등의 상기문헌 (1982) 에 기술한 바와같이 제조한다. 플리 A ＋ RNA는 제조자의 지시에 따라 올리고 dT 셀룰로오즈를 사용하여 제조한다(콜라보라티브 리서치 인코포레이티드).
첫째 가닥 cDNA는 제12c도에 나타나는 바와같이 2 μM의 올리고뉴클레오티드 228-28로 합성을 기동시키는 것을 제외하고는 상기 BRL cDNA에 대해 기술한 바와같은 방법으로 제조하며, 이는 3' 말단의 짧은 랜덤 시퀀스를 보다 긴 유일한 시퀀스에 결합시키는 것을 포함한다. 이 유일한 시퀀스의 228-28부분은 비-특이 프라이머로서 프라이머 228-29와 함께 PCR에 의해 증폭되기 위한 표적 부위를 제공한다.
집쥐 SCF 시퀀스의 최소한의 부분과 관련된 인체의 cDNA시퀀스는 프라이머 227-29 및 228-29 (PCR22.7, 제13도 참조 : 60℃에서 15순환 어닐링 후, 55℃에서 15순환 어닐링)를 사용하여 PCR에 의한 HepG2 cDHA 로 부터 증폭된다.
아가로우즈 겔 전이이동은 뚜렷한 밴드는 나타나지 않았으며, 균일하지 않은 크기의 DNA의 흐린 무늬만 나타낸다.
쥐 SCF DNA 와 보다 밀접하게 관련된 시퀀스의 우선적인 증폭은 내부에 겹끼워진 쥐 SCF 프라이머 222-11 및 프라이머 228-29를 사용하는 PCR 22.7 생성물 1 μℓ로 PCR 을 수행하여 실행한다. (PCR 24.3 ; 20 순환 55℃에서 어닐링). 다시 아가로우즈 겔 상에 균일하지 않은 DNA 생성물의 흐린 얼룩만이 나타난다. 프라이머 222-11 및 227-30을 가지는 PCR 24.3생성물의 이중-측면 특이증폭 (PCR 25.10 ; 20 사이클)은 대응하는 집쥐 SCF cDNA PCR 생성물과 같은 크기의 단일 주요 생성물 밴드를 나타낸다.
시퀀싱 프라이머로서 224-24를 사용하는 비대칭 PCR 생성물(PCR 33.1) DNA의 시퀀싱은 약 70염기의 인체 SCF 시퀀스를 제공한다.
이와 유사하게 첫째는 프라이머 224-25 및 228-29와 함께 PCR 22.7 생성물 1 ㎕를 증폭하고(PCR 24.7, 20순환), 그 다음은 프라이머 224-25 및 227-30과 함께 중폭한(PCR 41.11) 결과 대응하는 집쥐 SCF생성물에서와 같은 크기의 하나의 주요 밴드를 나타내며, 그 후 비대칭 증폭함으로써 (PCR 42.3) 시퀀싱 프라이머로서 224-24를 사용할 때 쥐 SCF 시퀀스에 매우 동질인 시퀀스를 산출한다. 인체 SCF cDNA에 표적을 둔 유일한 시퀀스 올리고디옥시뉴클레오티드를 합성하고 그 시퀀스를 제12b도에 나타냈다.
발현 및 활성도 연구에 사용되는 집쥐 SCF PCR로 생성되는 암호화 시퀀스의 인체 대응물을 수득하기 위하여 프라이머 227-29 및 227-30을 가지는 PCR을 부피 50㎕의 반응물의 1㎕ PCR 22.7 상에 형성시킨다(PCR 39.1)
증폭은 코이 탬프사이클러 (Coy Tempcycler)로 실행한다.
인체 SCF cDNA 와 집쥐 SCF 유일 프라이머 227-30 사이의 잘못 대응된 정도가 밝혀지지 않았으므로 첫째 세 순환에 대해서는 낮은 정도의 어닐링(37℃)를 사용하고 ; 그 후 55℃에서 어닐링시킨다. 집쥐 상동체에서와 같은 크기(약 590 bp)의 현저한 밴드가 나타났고, 그 후 같은 프라이머를 사용하여 PCR 39.1생성물의 작은 일부와 PCR을 희석함으로써 더 증폭한다(PCR 41.1). PCR 41.1 생성물에서는 한 밴드 이상이 나타났으므로 클로닝하기 전에 그 시퀀스의 적어도 일부를 결정하기 위하여 겹끼워진 내부 프라이머를 가지는 PCR을 실행한다.
프라이머 231-27 및 227-29 로 PCR을 23순환시킨 후(PCR 51.2) 강한 단일 밴드가 나타났다. 프라이머 229-27 및 231-27 비대칭을 수반하는 비대칭 PCRs 및 시퀀싱은 인체 SCF cDNA 시퀀스의 존재를 확실시한다. 발현벡터 Vl9.8 내로 PCR 41.1 SCF DAN의 클로닝은 상기 부문 C의 집쥐 SCF 1-162 PCR 단편에 대해 이미 기술한 바와같이 실행한다. 각각의 박테리아성 콜론으로부터 DNA는 상기디데옥시 방법에 의하여 시퀀싱한다.
E. 인체의 간 세포 인자 게놈 DNA의 클로닝
제13b도에 나타나는 바와 같이, cDNA 의 PCR 증폭으로부터 제조한 PCR7 프로브를 인체 게놈 시퀀스를 포함하는 라이브러리를 선별하는데 사용한다. 하기한 바와 같이 인체 cDNA의 일부에 상보적인 리보프로브를 양성 플라크를 재선별하는데 사용한다. PCR7 프로브는 PCR 41.1 의 생성물(제13b도 참조)로 출발하여 제조한다. PCR 41.1의 생성물을 프라이머 227-29 및 227-30을 사용하여 보다 더 증폭한다.
그 결과 생성되는 590 bp 단편을 아가로우즈 겔로부터 용리하고 동일 프라이머를 사용하여 재증폭한다. (PCR 52.1).
PCR 58.1의 생성물을 10pmole 의 233-13을 포함하는 50 ㎕ 반응물로 1000 배 희석하고 10 순환동안 증폭한다. 이 반응물에 10 pmole 의 227-30을 가한 후, PCR을 20 순환동안 지속시킨다. 80 pmole 의 233-13을 가하고, 그 반응물 부피를 90 ㎕ 로 하고 PCR을 15 순환동안 지속시킨다.
그 반응 생성물을 50 ㎕반응물로 200 배 희석하고 20 pmole 의 231-27 및 20 pmole 의 233-13을 가한 후, 어닐링 온도 48℃ 로 PCR을 35 순환동안 실행한다(PCR 96.1).
P­로 표지한 PCR7을 제조하기 위하여 다음을 제외하고는 PCR1을 제조하는데 사용한 것과 유사한 반응 조건을 사용한다 : 반응물 부피 50 μℓ에서 PCR 96.1을 100 배 희석하고 : 5 pmole 의 231-27을 단일 프라이머로서 사용하고 : 변성온도 94℃에서 1분, 어닐링 온도 48℃에서 2분, 연장온도 72℃에서 2 분간 PCR을 45순환동안 실행한다.
리보프로브인 리보프로브 1은 제15b도에 나타나는 hSCF DNA 시퀀스의 뉴클레오티드 2-436 에 상보적인 P-로 표지한 단일가닥 RNA 이다. 이 프로브의 생성을 위한 백터를 제조한기 위하여 PCR 41.1(제13b도) 생성물 DNA를 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고, 플라스미드 벡터 pGEM3 (위스콘신 매디슨 프로메가사로부터 구입)의 폴리링커로 클로닝한다.
재조합 pGEM3 : hSCF 플라스미드 DNA는 그후 HindIII 로 절단함으로써 선형화된다. P-로 표지한 리보프로브 1은 프로메가사에서 제공한 지시에 따라 T7 RNA 폴리머라제로 선형화된 플라스미드 DNA 를 연속 전사하여 제조한다.
반응물(3μ1)은 250ng 의 선형화된 플라스미드 DNA 및 표지되지 않은 부가 CTP를 수반하지 않은 20μM 의 P-rCTP (뉴잉글랜드 뉴클리어(NEN) 목록 제 NEG -008H 호)를 포함한다.
인체 게놈 라이브러리는 스트라타진(캘리포니아 라 졸라 : 목록 제 946203 호)으로부터 수득한다. 이 라이브러리를 코카서스인 남아 태반으로부터 제조한 DNA를 사용하여 박테리오파지 람다 픽스 II백터 내에서 구성한다.
공급자에 의해 특정화된 이 라이브러리는 15kb 보다 큰 평균 삽입 크기를 가지는 2×10 의 일차플라크를 포함한다.
Maniatis 등의 상기 문헌(1982)에 기술된 바와같이 약 10 의 박테리오파지를 평판화한다. 그 플라크를 GeneScreen Plus 필터(22 cm × 22 cm ; NEN / 듀폰)로 제조자가 지시한 방법에 따라 옮긴다. 두 필터를 각 평판에 대하여 이동한다.
이 필터를 6XSSC(0.9 M Nacl, 0.09 M 시트르산 나트륨, pH 7.5), 1% SDS, 60℃에서 예비혼성화한다. 이 필터를 2×10 cpm/ml 의 P-로 표지한 PCR 7 프로브를 포함하는 신선한 6XSSC, 1 % SDS 용액에서 혼성화하고 62℃에서 20시간 동안 혼성화한다. 이 필터를 62℃에서 16시간 동안 6XSSC, 1% SDS 로 세척한다. 오토래디오그램상의 방사성 반점에 대응하는 평판 부위로부터 박테리오파지 플러그를 제거한 후 프로브 PCR 7 및 리보프로브 1 로 재선별한다.
개시 선별에 사용된 것과 유사한 조건하에서 PCR 7 의 재선별을 실시한다. 리보프로브 1 의 재선별은 다음과 같다 : 필터를 6XSSC, 1% SDS에서 예비혼성화한 후0.25M NaPO,(pH7.5), 0.25 M Nacl, 0.001 M EDTA, 15% 포름아미드, 7% SDS 및 1×10 cpm/ml 의 리보프로브 내에서 62℃에서 18시간 동안 혼성화한다. 이 필터를 6XSSC, 1% SDS 로 62℃에서 30분간 세척한 후, 1XSSC, 1% SDS 62℃ 30분간 세척한다. 양성 클론의 DNA를 제한 엔도누클레아제 BamHI, SphI, 또는 SstI 으로 절단하고 그 결과 생성되는 단편을 PUC119로 서브클로닝한 후 시퀀싱한다.
프로브 PCR 7을 사용하여 아미노산 40내지 176을 암호화하는 엑손을 포함하는 클론을 수득하고 이 클론을 1989년 10월 13일자로 아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션에 기탁하였다(ATCC 기탁번호 제40681호). 부가 SCF 엑손에 대한 클론을 수득하기 위하여 인체 게놈 라이브러리를 리보프로브 2 및 올리고 뉴클레오티드 프로브 235-29 로 선별한다. 이 라이브러리를 다음 부분을 제외하고는 상기와 같은 방법으로 선별한다: 37℃에서 프로브 235-29 로 혼성화하고, 이 혼성화물을 37℃에서 1 시간, 44℃에서 1 시간 세척한다. 양성 클론을 리보프로브 2, 리보프로브 3과 올리고뉴클레오티드프로브 235-29 및 236-31로 재선별한다. 리보프로브2 및 3은 다음을 제외하고는 리보프로브 1을 제조하는데 사용한 방법과 유사한 방법으로 제조한다 : (a) 재조합 pGEM3 : hSCF 플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 PvuII (리보프로브 2) 또는 Pst I (리보프로브 3)으로 선형화되며, (b) Sp6 RNA 플러머라제(프로메가)는 리보프로브 3을 합성하는데 사용한다.
제15a도는 인체 게놈 DNA를 시퀀싱하는데 사용되는 방법을 나타낸다. 이 도면에 있어서, 윗 부분에 그은 선은 SCF를 암호화하는 인체 게놈 DNA부위를 나타낸다.
선 안의 공간은 시퀀싱되지 않은 부위를 가리킨다.
큰 박스는 위의 각 박스에 지시된 암호화된 아미노산에 대응하는 SCF 유전자 부위를 암호화하는 엑손을 나타낸다. 인체 SCF 유전자의 시퀀스는 제15BE 에 나타나 있다.
인체 SCF cDNA 의 시퀀스를 수득하는 PCR 기술을 제15c도에 나타나 있다.
F. 인체 SCF cDNA 5' 부위의 시퀀스
PCRs를 두 개의 유전자-특이 프라이머로 기동시켜 수득한 생성물의 시퀀싱은 두 개의 프라이머의 3' 말단에 의해 둘러싸이는 부분의 시퀀스를 나타낸다. 실시예 3A에서 가리키는 바와같이 단일-측면 PCRs는 측면부위의 시퀀스를 산출할 수 있다. 한-측면 PCR은 인체 SCF cDNA의 5 -비번역 부분의 시퀀스를 연장하는데 사용된다.
제1가닥 cDNA는 실시예 3D에 기술된 바와같은 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 228( 제12c도)을 사용하여 인체 방광암세포주 5637 (ATCC HTB 9)의 폴리 A RNA 로부터 제조한다. dG 잔기를 가지고 이 cDNA를 말단부가한 후 SCF-특이 프라이머와 함께 (dC)n 시퀀스를 포함하는 프라이머를 사용하여 단일-측면 PCR 증폭한 결과 공지된 시퀀스의 상류 (5 ')을 연장시키는 cDNA 단편을 산출하는데 실패하였다.
올리고뉴클레오티드 228-28 에 의해 기동된 제2가닥 생성물의 PCR 증폭을 통하여 약간의 시퀀스 정보를 얻었다. 말단부가되지 않은 상기 5637 의 제1가닥 cDNA (약 50 ng) 및 2 pmol 의 228-28을 클레노우 폴리머라제 및 각각 0.5 mM의 dATP,dCTP,dGTP 및 dTTP 로 10-12℃에서 30 분간10μ1의 1x 닉-번역 완충용액［Maniatis 등의, Molecμlar Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory (1982)참조］내에서 배양한다.
겹끼워진 SCF 프라이머(용도상 : 235-30, 233-14, 236-31 및 최종적으로 235-29)와 함께 프라이머 228-29로 연속적인 단일-측면 PCRs를 실행하여 그 결과 생성되는 cDNA를 증폭하여 아가로우즈 겔상에 흐린 얼룩으로서 나타나는 복합 생성물 혼합물을 산출한다. SCF - 관련 cDNA 단편의 상당한 증가는 연속적인 단일-측면 PCR 생성물의 비교가능한 부피를 두 SCF 프라이머(227-29, 예를들면 약 150bp의 생성물을 산출함)로 증폭시킬 때 관찰되는 특이 생성물 밴드의 증가하는 강도에 의해 나타난다. 아가로우즈 겔상의 흐린 얼룩의 일부를 구멍내어 생성물의 특정 크기 범위를 선택하였으나 대부분의 경우 PCR에 의한 재증폭의 시도는 SCF-관련 시퀀스를 포함하는 매우 뚜렷한 밴드 생성에 실패하였다.
단지 235-29 프라이머만을 포함한 한 반응, PCR 16 .17에 있어서는 제한 효소 PvuII 와 PstI 및 겹끼워진 프라이머를 수반하는 PCR분석에 의한 지도화에서와 같이, 예상부위 이외에 암호화 부위의 밝혀지지 않은 5' 부위에서 235-29 에 의하여 기동됨으로서 명백한 밴드가 생성된다. 이 생성물을 겔-정제하고, 프라이머 235-29 로 재증폭한 후, P-로 표지한 프라이머 228-30을 사용하여 상기 디데옥시 방법으로 시퀀싱을 시도한다. 그 결과 생성되는 시퀀스는 올리고뉴클레어티드 254-9의 고안에 기초가 된다(제1b도).
이 3' 지시된 프라이머를 5' 지시된 SCF 프라이머와 함께 후속 PCRs에 사용할 때 예상한 크기의 밴드를 얻을 수 있다.
이와 같은 PCR 생성물의 직접적인 상기 시퀀싱은 제15c도에서와 같이 인체 SCF cDNA 시퀀스의 뉴클레오티드 180 내지 204를 산출하였다.
hSCF cDNA 의 5' 말단에서 보다 많은 시퀀스를 수득하기 위햐여 0.2 U MMLV 역전사효소(BRL 사로부터 구입) 및 500 μM의 각 dNTP를 포함하는 16μL 반응물내 SCF-특이 프라이머(2 pmol의 233-14)를 사용하여 5637 폴리 A RNA (약 300 ng)으로부터 제1가닥 cDNA를 제조한다. 표준 페놀-클로로포름 및 클로로포름 추출과 에탄을 침전(1 M 아세트산암모늄으로부터)단계 후, 핵산을 20μL의 물로 재현탁하고 5 분간 끊는 물 수조에 놓아둔 후, 냉각시키고 CoCl-함유 완충용액［Deng 및 Wu 의 Methods in Enzymology, 100, pp. 96-103 참조］내의 8μM dATP 존재하에서 말단 전이효소로 말단부가한다.
(dA)-* 말단부가 제1가닥 cDNA 생성물을 페놀-클로로포름 추출로 정제하고, 에탄올 침전한 후, 20 μL 의 10 mM 트리스, pH 8.0 및 1 mM EDTA 내에서 재현탁한다.
약 20 ng 의 (dA)-말단부가 5637 cDNA로부터 인체 SCF-관련 cDNA 5 ' 말단 단편의 증가 및 증폭은 다음과 같다 : 3' 말단 또는 그에 가까운 (dT)시퀀스를 포함하는 SCF-특이 프라이머 236-31 및 프라이머 또는 프라이머 혼합물, 예를들어 ,프라이머 221-12 또는 프라이머 220-3, 220-7 및 220-11 의 존재하에서 개시 26 순환의 단일-측면 PCR을 실행한다(제12C도).
이들 PCRs 의 생성물(1 μ1)을 프라이머 221-12 및 235-29를 포함하는 제2 세트의 PCRs로 증폭한다. 아가로우즈 겔 분석의 각 경우에 약 370 bp의 주요생성물 밴드가 관찰된다.
파스퇴르 피펫의 끝으로 겔에 구멍을 내어 이 밴드의 일부를 포함하느 겔 플러그를 작은 마이크로퓨지 관으로 이동시킨다. 10μL의 물을 첨가하고 84℃ 열 차단으로 플러그를 용융한 다. 프라이머 221-12 및 235-29(각각 8 pmole) 을 포함하는 PCR 40 μL에 용융하고, 희석한 겔 플러그 2 μL을 주입한다. 15 순환 후, 약 370 bp의 약간 흩어진 밴드가 아가로우즈 겔상의 분석에서 가시화되었다. 상부 및 하부 가닥 시퀀싱 주형을 생성하기 위해 비대칭 PCRs를 실행한다 : 전체 반응물 부피 100 μL에 4 μL의 PCR 반응 생성물 및 40 pmol 의 프라이머 221-12 또는 프라이머 235-29를 포함하는 각 반응물을 PCR25 순환(95℃ 1분 ; 55℃ 30초 : 72℃ 40초)하였다. P - 로 표지한 프라이머 262-13을 수반하는 221-12 기동된 PCR 생성물 혼합물(표준 추출 및 에탄올 침전 형성 후)의 직접 시퀀싱(제12b도)으로 5 ' 시퀀스 뉴크레오티드 1 내지 179가 산출된다(제15C도).
G. 간 세포 인자의 제1 암호화 엑손 부위에서 인체 게놈 DNA의 증폭 및 시퀀싱인체 게놈 라이브러리를 SCF 올리고뉴클레오티드 프로브를 가지고 선별한 결과 제1암호화 엑손의 공지된 부분을 포함하는 어떤 클론이라도 밝혀내지 못했다. 그 후 이 엑손을 둘러싸는 클론 게놈 시퀀스와 증폭을 위한 단일-측면 RCR 기술을 사용한 시도를 개시하였다.
열-변성 인체 태반 DNA (시그마사로부터 구입)의 프라이머 연장은 매우 많은 수의 다른 부위에서 기동이 가능하게 하기 위하여 12℃와 같은 엄격하지 않은 조건(낮은 온도)하에서 228-28 또는 221-11과 같은 비-SCF 프라이머를 사용하여 DNA 폴리머라제 I (크레노우 요소, 큰 단편 ; 뵈링거-만하임)으로 실시한다.
그 후 가 반응물을 TapI 폴리머라제를 포함하는 TapI DNA 폴리머라제 완충용액 및 가 100 μM의 dNTP로 5 배 희석하고, 72℃에서 10분간 처리하여 DNA 가닥의 연장을 가능하게 한다. 그 후 이 생성물을 SCF 제1 엑손 올리고뉴클레오티드(254-99와 같은) 및 적당한 비-SCF 프라이머(228-29 또는 221-11)의 존재하에서 PCR 에 의하여 간 세포 인자 제1 엑손 시퀸스를 증가시킨다. 아가로우즈 겔 전기이동은 생성물 대부분에서 짧았다(300bp 이하). 보다 긴 종(species)으로 증강시키기 위하여 300 bp 이상의 길이에 상응하는 각 아가로우즈 겔 레인의 부분을 자르고 전기이동식으로 용리시킨다. 에탄올 침전한 후 물로 재현탁하고, 겔 정제한 PCR 생성물을 HindIII 과 같은 sfiI 부위 내지 sfiI 단편을 포함하는 pGEM4 의 유도체내로 클로닝한다.
32로 표지한 SCF 제1 엑손 올리고뉴클레오티드로 군체를 선별한다. 몇몇 양성 군체가 확인되었으며 그 삽입물의 시퀀스를 상기 방법에 의해 수득하였다.
제1 엑손으로부터 칸센서스 엑손 인트론 경계를 거쳐 인접 인트론으로 하류가 연장되는 결과적인 시퀀스를 제15b도에 나타냈다.
H. 생쥐, 원숭이 및 개로부터의 SCF cDNA 암호화 부위의 증폭 및 시퀀싱
제1가닥 cDNA는 원숭이의 간(클론테크사로부터 구입)으로부터 및 NIH-3T3 세포주 (생쥐, ATCC CRL, 1658) 및 D17 (개, ATCC CCL 183)의 전체 RNA 또는 폴리 A RNA로부터 제조한다. 제1가닥 cDNA의 합성에 사용된 프라이머는 비특이성 프라이머 228-28 또는 SCF 프라이머(227-30, 237-19, 237-20, 230-25, 또는 241-6)둘 중의 하나이다. 프라이머 227-29 및 프라이머 227-30, 237-19 또는 237-20 중의 하나와의 PCR 증폭은 직접 또는 V19.8 이나 pGEM 벡터내로 클로닝한 후 시퀀싱한, 예상 크기의 단편을 수득한다.
SCF cDNA 의 5 ' 말단 근처의 부가 시퀀스를 프라이머 254-9 또는 228-29 중 하나와 함께 SCF-특이 프라이머를 이용하는 PCR 증폭으로부터 수득한다. SCF 암호화 부위의 3' 말단에서의 부가 시퀀스는 상기에서 지적한 바와같이 230-25. 또는 241-6 및 3'-방향 SCF 프라이머로의 230-25로 기동된 cDNA(생쥐의 경우에 있어서)또는 241-6으로 기동된 cDNA(원숭이의 경우에 있어서)의 PCR 증폭후에 수득된다. D17 cDNA를 증폭하기 위한 유사한 시도에서는 SCF PCR 생성물 밴드가 수득되지 않았다.
비특이 프라이머 228-28을 D17 전체 RNA 로부터 제1가닥 합성을 기동하는데 사용하며, 그 결과 생성된 복합 생성물 혼합물을 228-29 와 함께 227-29 또는 225-31 과 같은 3'-방향 SCF 프라이머를 수반한 PCR에 의해 SCF-관련 시퀀스에 대해 강화한다. 이 생성물 혼합물을 SfiI 로 절단하고 블런트말단 단편에 대한 SfiI로서 SfiI 부위를 함유하는 pGEM4의 유도체 (위스콘신 매디슨 프로메가(promega)) 내로 클로닝한다.
그 결과 생성된 이종성 라이브러리를 방사성 표지한 237-20 으로 선별하고, 여러 가지 양성 클론을 시퀀싱하여 SCF 3' 말단 시퀀스를 수득한다. 인체 (제42도), 원숭이, 개, 생쥐 및 집쥐 SCF 성숙 단백질의 배열된 아미노산 시퀀스는 제16도에 나타나 있다.
공지 SCF 아미노산 시퀀스는 전체 길이의 거의 대부분에 걸쳐 높은 상동성이다. 동일한 칸센서스 시그날 펩티드 시퀀스가 다섯가지 종의 암호화 부위에 존재한다.
집쥐 SCF 와 유사한 성숙 단백질의 아미노 말단에 존재하리라 여겨지는 아미노산을 제16도에서 숫자 1로 나타내었다.
개 cDNA 시퀀스는 아미노산 시퀸스내의 코돈 129에서의 발린/루신의 모호성에 기인하는 모호성을 내포한다.
인체, 원숭이, 집쥐 및 생쥐의 아미노산 시퀀스는 어떠한 삽입이나 삭제없이 배열된다. 개의 시퀀스는 다른 종들과 비교해서 위치 130에서 하나의 별도의 잔기를 가진다.
인간과 원숭이는 단지 한 위치, 위치 130에서 발린(인체)이 알라닌(원숭이)으로 보존적 치환됨이 다르다. 잔기 164 근처에서 추정상 프로쎄싱 부위의 직전 및 직후의 예상 SCF 시퀀스는 두 종 사이에 거의 보존된다.
[실시예 4]
COS-1 세포 내에서 재조합 집쥐SCF의 발현
COS-1 세포(ATCC CRL 1650)내에서의 일시적 발현을 위하여, 집쥐 SCF 및 SCF 유전자들을 포함하는 벡터 V19.8 (실시예 3C)을 60 mm 이중 평판내로 형질감염시킨다［Wigler등의, Cell, 14, 725-731(1978)참조]. 이 플라스미드 V19.8 SCF는 제17도에 나타나 있다. 조절용으로, 삽입하지 않은 상기 벡터도 형질감염시킨다. 형질감염후 여러 시점에서 조직배양 상청액을 수확하고, 생물학적 활성도를 분석하다.
표 4 는 HPP-CFC 생물학적 분석 결과의 요약이고, 표 5 는 전형적인 형질감염 실험으로부터 얻은 MC/9 H-티미딘 섭취 데이터를 요약한 것이다. 다음의 플라스미드로 형질감염시킨 COS-1 세포로부터 얻은 상청액의 생물학적 분석 결과가 표 4 및 표 5 에 나타나 있다 : 아미노산 위치 162에서 C-말단을 가지는 집쥐 SCF의 C-말단 절두형 (V19.8 집쥐 SCF ), 위치 81에서 글루타민산을 함유하는 SCF ［V19.8 집쥐 SCF (Glu 81) 및 위치 19에서 알라닌을 함유하는 SCF ［V19.8 집쥐 SCF (Ala 19)］. 아미노산 치환체는 실시예 3에서 나타낸 바와같이 집쥐 SCF 의 증폭으로 수행된 PCR 반응 생성물이다.
V19.8 집쥐 SCF 각각의 클론을 시퀸싱하여 두 개의 클론이 아미노산 치환체를 가짐을 발견하였다. 표 4 및 표 5에서 나타낸 바와같이, 재조합 집쥐 SCF는 실시예 1에서 천연 포유동물 SCF를 정제하는데 사용한 생물학적 분석에서 활성이다.
정상 골수세포의 증식을 측정하는 인체 CFU-GM ［Broxmeyer 등의 상기문헌(1977)참조］ 분석으로 재조합 집쥐 SCF 및 다른 인자들을 개별적으로 시험하여, 그 데이터를 표 6 에 나타냈다.
다른 인자들과 함께 V19.8 SCF 로 형질감염시킨 후 4 일간 배양하여 COS-1 상청액에 대한 결과 또한 표 6 에 나타냈다. 군체수는 3증 배양의 평균이다.
재조합 집쥐 SCF 는 일차적으로 CFU-GM 분석에서 정상 인체 골수에 대한 상승적 활성도를 갖는다. 표 6 의 실험에서 SCF는 인체 GM-CSF, 인체 IL-3 및 인체 CSF-1 과 상승작용한다. 다른 분석에서, 또한 G-CSF 와도 상승작용이 관찰되었다. 집쥐 SCF를 수반한 14 일 후에 인체 골수는 다소 증식되었으나, 그 집합체는 40 세포로 구성되었다.
천연 포유동물에서 유도된 SCF로도 유사한 결과가 수득된다.
[실시예 5]
중국산 햄스터 난소세포내의 재조합 SCF의 발현
이 실시예는 CHO 세포 (DHFR-선택 ATCC 제 CCL 61 호)로부터 SCF 분비에 대한 안정한 포유동물 발현계에 관한 것이다.
A. 재조합 집쥐 SCF
SCF 생성용으로 사용된 발현벡터는 V19.8 (제17도)이다.
안정한 형질전환체를 이루기 위해 사용한 선택가능한 표식물은 플라스미드 pDSVE. 1 내의 디히드로엽산 환원효소에 대한 유전자이다. 플라스미드 pDSVE. 1 (제18도)은 제한효소 SalI로 pDSVE를 절단하고 두 개의 올리고뉴클레오티드
5' TCGAC CCGGA TCCCC 3'
3' G GGCCT AGGGG AGGT 5'
로 이루어진 올리고뉴클레오티드 단편에 결합함으로써 구성한 pDSVE 의 유도체이다.
벡터 pDSVE 는 본원에서 참고문헌으로 인용한 공동 소유의 미국 특허출원 번호 제 025,344 및 152,344 호에 기술되어 있다.
V19.8 및 pDSVE. 1 벡터의 일부는 박테리아성 CO1E1 복제기원과 암피실린 내성 유전자 및 SV40 복제 기원을 함유하는 상동성의 긴 신장부분을 포함한다. 이러한 중복은 형질전환과정동안의 상동성 재조합에 기여할 수 있고, 따라서 공동-형질 전환을 용이하게 한다.
［Wigler 등의 상기문헌(1978)참조］에서 설명한 바와같이 제한엔도뉴클레아제 PvuI 및 10 ㎍의 V19.8 SCF 로 선형화시킨 pDSVE. 1 의 1.0 또는 0.1㎍을 사용하여 생쥐의 캐리어 DNA 10㎍의 존재하에 또는 부재하에서 V19.8 SCF 구성물과 pDSVE. 1 의 인산칼슘 공동-침전물을 제조한다.
pDSVE. 1 로부터 DHFR 유전자의 발현에 기초하여 군체를 선택한다. 하이포크산틴 및 티미딘의 부가없이 성장할 수 있는 군체를 클로닝 실린더를 사용하여 골라내고 개별 세포주로서 팽창시킨다. 각각의 세포주로부터의 세포상청액을 MC/93H-티미딘 섭취분석으로 시험한다. 전형적인 실험의 결과는 표 7 에 나타나 있다.
B.재조합 인체 SCF
CHO 세포에서 SCF의 발현은 또한 본원에서 참고문헌으로 인용한 1990년 3월 29일자 출원된 공동소유의 출원 번호 제501, 904 호에 기술된 발현벡터 pDSVR α 2를 사용하여 획득한다.
이 벡터는 DHFR 유전자의 발현에 근거한 클론의 선택 및 증폭에 대한 유전자를 포함한다. 클론 pDSRa2 SCF는 2단계 과정에 의해 생성된다. V19.8 SCF를 제한효소 BamHI로 절단하여 pGFM3의 BamHI 부위내로 SCF 삽입물을 결합한다.
pGEM3 SCF로부터의 DNA를 HindIII 및 salI로 절단하고, HindIII 및 salI로 전단된 pDSR α2내로 결합한다.
제15c도에 나타나 시퀀스의 아미노산 위치 162,164 및 183과 제42도에 나타낸 시퀀스의 위치 248에서 COOH-말단을 암호화 하는 인체 유전자에 대해 동일한 과정을 반복한다.
완성된 세포주를 10nM의 메토트렉세이트로 공격하여 ［Shimke의 in Methods in Enzymology, 151, 85-104 (1987)참조］DHFR 유전자와 그에 인접한 SCF 유전자의 발현 수준을 증가시킨다.
재조합 인체 SCF의 발현수준을 실시예 7에서와 같이 방사선 면역측정 및/또는 인체 말초혈액 백혈구를 사용하는 시험관 내군체 형성 유발로 분석한다. 이 분석은 골수 대신에 말초혈액을 사용하고 인체 EPO(10 u/ml) 존재하의 20% O2, 5% CO2및 75% N2에서 배양을 실시한 것을 제외하고는 실시예 9 (표 12)에 기술한 대로 수행한다. 전형적인 실시예로부터의 결과는 표 8 에 나타나 있다. 인체 SCF1-164를 발현시키는 CHO 클론을 Hμ164SCF17로 명명하고 1990년 9월 25일에 ATCC (제 CRL 10557 호)에 기탁하였다.
[실시예 6]
E. coli에서 재조합 SCF의 발현
A. 재조합 집쥐 SCF
이 실시예는 ［Met ］집쥐SCF1-193을 암호화하는 DNA 시퀀스(제14c도)의 수단에 의한 SCF 폴리펩티드의 E. coli 내 발현에 관한 것이다. 이 DNA를 사용한 단백질의 발현에 대해 어떠한 적합한 벡터라도 사용될 수 있음에도 불구하고, 선택한 플라스미드는 pCFM1156(제19도)이다.
이 플라스미드는 T4 폴리머라제로 말단을 채운 후 블런트 말단 결합하여 두 개의 내인성 NdeI 제한부위를 파괴하고 아래의 작은 올리고뉴클레오티드로 유일한 ClaI 및 KpmI 제한부위 사이의 작은 DNA 시퀀스를 치환함으로써 pCFM 836 (본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 제4,710,473 호 참조)으로부터 용이하게 구성할 수 있다 :
pCFM1156 플라스미드내에서 단백질발현의 조절은 온도감수성의 람다 CI857 억제 유전자 ［E.coli 균주 FM5 (ATCC 기탁 번호 제53911 호)또는 K12ΔHtrp에서 제공된 바와같음］의 조절하인 합성 람다 PL프로모터의 수단에 의한다.
pCFM1156 벡터는 최적화된 리보좀 결합부위 및 합성 PL 프로모터의 3' 에 바로 접하는 개시코돈을 포함하는 DNA 시퀀스를 갖도록 구성된다. ATG 개시코돈을 포함하는 유일한 NdeI 제한 부위는 람다 t-oop 전사 종결시퀀스가 뒤따르는 다중-제한부위 클로닝 집합체에 우선한다.
실시예 3에 기술된 바와같이 PCR 증폭 cDNA (제14c도)로 클로닝한 집쥐 SCF1-193유전자를 포함하는 플라스미드 V19.8 SCF1-193을 Bg1II 및 SstII로 절단하고, 603 bp DNA 단편을 분리한다. 메티오닌 개시코돈을 제공하고 집쥐 SCF 폴리펩티드의 처음 세 아미노산 잔기 (Glu, Glu 및 Ile)에 대한 코돈들을 회복하기 위하여, NdeI 및 Bg1II 점착성 (Sticky)말단을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드 링커,
5' TATGCAGGA 3'
3' ACGTCCTCTAG 5'
를 제조한다. 작은 올리고뉴클레오티디와 집쥐 SCF1-193유전자 단편을 제19도에 제시한 플라스미드내 유일한 NdeI 및 SstII 부위에서 pCFM1156 내로 결합하여 삽입한다.
이 반응 생성물이 발현 플라스미드, pCFM1156 집쥐 SCF1-193이다.
pCFM1156 집쥐 SCF1-193플라스미드를 감응 FM5 E.coli 숙주세포내로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유세포에 대한 선택은 pCFM1156 벡터상에 운반되는 항생물질(카나마이신)내성 표식 유전자를 기초로 한다. 플라스미드 DNA를 배양 세포로부터 분리하고, 합성 올리고뉴클레오티드 및 집쥐 SCF 유전자에 대한 그의 결합을 DNA 시퀀싱하여 확정한다.
[Met-1] 집쥐 SCF1-162폴리펩티드를 암호화하는 풀라스미드 pCFM1156 집쥐 SCF1-162를 구성하기 위하여, EcoRI 내지 SstII 제한단편을 V19.8 집쥐 SCF1-162로부터 분리하여, 집쥐 SCF 유전자의 카르복시 말단에 대한 암호화 부위가 치환되도록 유일한 EcoRI 및 SstII에서 플라스미드 pCFM 집쥐 SCF1-193내로 결합하여 삽입한다.
각각 [Met-1] 집쥐 SCF1-164및 [Met-1] 집쥐 SCF1-165폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pCFM1156 집쥐SCF1-164및 pCFM1156 집쥐 SCF1-165를 구성하기 위하여, EcoRI 내지 SstII 제한단편을 SCF 유전자의 3 ' 말단을 암호화하는 PCR 증폭 DNA로부터 분리하여, SCF 유전자의 카르복시 말단을 암호화하는 부위의 DNA에서 특정부위 변화를 초래하도록 고안한다. DNA 증폭은 pCFM1156 집쥐 SCF1-164의 구성에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 227-29 및 237-19 와 pCFM1156 집쥐 SCF1-165의 구성에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 227-29 및 237-20을 사용하여 수행한다.
B.재조합 인체 SCF
이 실시예는 [Met-1] 인체 SCF1-164및 [Met-1] 인체 SCF1-183(제15c도)를 암호화하는 DNA 시쿼스의 수단에 의한 인체 SCF 폴리펩티드의 E .coli 내 발현에 관한 것이다.
인체 SCF1-162유전자를 함유하는 플라스미드 V19.8 인체 SCF1-162를 인체 SCF 유전자의 PCR 증폭용 주형으로서 사용한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 227-29 및 237-19를 사용하여 PCR DNA를 생성한 다음 이를 PstI 및 SstII 제한 엔도뉴클레아제로 절단한다. 메티오닌 개시코돈을 제공하고 인체 SCF 폴리펩티드의 처음 네 개의 아미노산 잔기 (Glu, Gly, Ile, Cys)에 대한 코돈을 회복하기 위하여, NdeI 및 Bg1II 점착성말단을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 제조한다.
5' TATGGAAGGTATCTGCA 3'
3' ACCTTCCATAG 5'
작은 올리고 링커 및 PCR 유도 인체 SCF 유전자 단편을 제19도에 나타낸 플라스미드내 유일한 NdeI 및 SstII 부위에서 발현플라스미드 pCFM1156 (예기한 바와같이)을 결합하여 삽입한다. pCFM1156 인체 SCF1-164플라스미드를 감을 FM5 E. coli 숙주세포내로 형질전환시킨다. 플라스미드-함유 세포에 대한 선택은 pCFM1156 벡터상에 운반되는 항생물질(카나마이신)내성 표식유전자를 기초로 한다. 플라스미드 DNA를 배양 세포로부터 분리하고 인체 SCF 유전자의 DNA 시퀀싱하여 확정한다.
[Met-1] 인체 SCF1-183(제15c도) 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pCFM1156 인체 SCF1-183을 구성하기 위하여, 인체 SCF 유전자의 카르복시 말단을 암호화하는 EcoRI 내지 HindIII 제한단편을 pGEM 인체 SCF114-183(하기되어 있음) 으로부터 분리하고, 인체 SCF 유전자의 아미노말단을 암호화하는 SstI 내지 EcoRI 제한단편을 pCFM1156 인체 SCF1-164로부터 분리하고, 또한 pCFM1156으로부터 보다 큰 HindIII 내지 SstI 제한단편을 분리한다. 세 개의 DNA 단편을 서로 결합하여 pCFM1156 인체 SCF1-183플라스미드를 형성한 다음 이를 FM5 E.coli 숙주 세포내로 형질전환시킨다. 카나마이신 약물 내성을 이용하여 군체를 선택한 후에, 플라스미드 DNA를 분리하고, 정확한 DNA 시퀀스를 DNA 시퀀싱하여 확정한다. pGEM 인체 SCF114-183플라스미드는 EcoRI-SphI 단편을 포함하고 제15c도에 나타난 인체 SCF cDNA 시퀀스의 뉴클레오티드 609 내지 820을 포함하는 pGEM3의 유도체이다. 이 플라스미드내의 EcoRI-SphI 삽입물을 주형으로서 올리고뉴클레오티드 프라이머 235-31 및 241-6 (제12b도)와 PCR 22.7 (제13b도)을 사용한 PCR로부터 분리한다. 프라이머 241-6의 시퀀스는 아미노산 176에 대한 코돈을 포함하는 엑손의 3' 면의 인체 게놈 시퀀스를 기초로 한다.
C.인체 SCF1-164를 생성하는 E. coli 의 발효
SCF1-164의 생성을 위한 발효는 플라스미드 pCFM1156 인체 SCF1-164를 포함하는 FM5 E. coli 숙주를 사용하여 16리터 발효조내에서 실시한다. 생성된 배양물의 종자주를 루리아욕즙(Luria broth)에서 17%글리세롤내-80℃에서 유지시킨다. 접종물을 생성하기 위하여, 해동된 종자주 100 μ1을 2 L 삼각플라스크내의 500ml 의 루리아육즙에 옮기고, 회전교반기(250 RPM)상에서 30%에서 밤새 성장시킨다.
이 실시예에서 개요한 인체 SCF1-164를 정제하기 위한 출발 물질로서 사용한 E. coli 세포 페이스트를 생성하기 위하여, 다음의 발효조건들을 사용한다.
접종주 배양물을 8 L 의 배치(batch) 배지 (표 9를 참조)를 함유하는 16 L 발효조로 무균적으로 옮긴다. 배양물의 OD-600이 약 3.5 가 될 때가지 배치 모드에서 배양물을 성장시킨다. 이 때에 공급속도를 조절하기 위하여 연동펌프를 사용하여 무균공급물 (공급물 1, 표10)을 발효조내로 도입시킨다. 공급 속도를 시간에 대해 지수적으로 증가시켜 0.15hr-1의 성장속도를 갖도록 한다. 온도는 성장기동안 30℃로 조절한다. 발효조내의 용해된 산소농도는 공기유속, 교반속도, 용기의 역압력 및 조절용의 산소보충을 이용하여 50%포화로 자동적으로 조절된다.
발효조의 pH는 인산과 수산화암모늄을 사용하여 7.0으로 자동적으로 조절된다. 약 30의 OD-600에서 발효온도를 42℃로 증가시킴으로 발효의 생성기를 유도한다.
동시에 공급물 1의 공급을 중지하고, 200 ml/hr의 속도로 공급물 2(표 11)의 공급을 시작한다. 발효조의 온도를 증가시키고나서 대략 6시간 후에 발효조의 내용물을 15℃까지 냉각시킨다. SCF1-164의 수득율은 대략 30 mg/OD-L이다. 그 다음에 베크만 J6-B 로터로 3000 xg에서 1시간 동안 원심분리하여 세포펠릿을 수확한다.
수확한 세포 페이스트를 -70℃에서 냉동보관한다.
SCF1-164를 생성하는 바람직한 방법은 아래의 변형조건들을 제외하고는 상기 방법과 유사하다.
1)배양물의 OD-600이 5-6에 도달하기 전까지는 공급물 1 의 공급을 시작하지 않는다.
2)보다 낮은 성장속도(약 0.08)가 되도록 공급물 1의 공급속도를 보다 천천히 증가시킨다.
3)OD-600 값 20에서 배양을 유도한다.
4)300 ml/hr의 속도에서 공급물 2를 발효조내로 도입한다.
배지를 포함한 모든 다른 조작들은 상기한 방법과 유사하다.
이 과정을 이용하면, OD = 25에서 SCF1-164가 대략 35-40 mg/OD-L 의 수득율로 얻어진다.
a 달리 언급이 없는 한, 모든 성분은 g/L로 기재하였음.
b 비타민 용액 : 리보플라빈, 0.42g/L ; 판토텐산, 5.4g/L ; 나이아신, 6g/L : 피리독신, 1.4g/L ; 비오틴, 0.06g/L ; 엽산, 0.04g/L.
c 미량금속용액 :FeCl₃· 6HO, 27g/L ; ZnCl₂. 4HO, 2g/L ; CaCl₂. 6HO, 2g/L ; Na₂MoO₄· 2HO, 2g/L ; CuSO₄· 5HO, 1.9g/L : 진한염산, 100ml/L.
a 달리 언급이 없는 한, 모든 성분은 g/L로 기재하였음.
b 미량금속 용액 : FeCl₃· 6HO, 27g/l ; ZnCl₂· 4H₂O, 2g/L ; CaCl₂· 6HO, 2g/L ;Na₂MoO₄· 2HO, 2g/L ; CuSO₄· 5HO, 1.9g/L; 진한염산, 100ml/L.
c 비타민 용액 : 리보플라빈, 0.42 g/L ; 판토텐산, 5.4 g/L ; 나이아신, 6g/L ; 피리독신, 1.4 g/L ; 비오틴, 0.06g/L ; 엽산, 0.04 g/L.
a 모든 성분은 g/L로서 기재하였음.
[실시예 7]
SCF의 검출을 위한 방사선 면역측정법
시료내의 SCF의 정량적 검출에 적용하는 방사선 면역측정(RIA)방법은 아래의 과정에 따라 실시한다.
실시예 1 에서와 같이 정제한 BRL 3a 세표로부터의 SCF 시료를 항혈청과 함께 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 2시간 동안의 배양후, 시료 시험관들을 얼음 상에서 냉각시키고, I-SCF를 가하여 이 시험관들을 4℃에서 적어도 20시간 동안 배양한다. 각 분석시험관은 50 μ1의 희석된 항혈, 약 60,000 cpm의 I-SCF(3.8 ×10 cpm/㎍), 5μ1 의 트라실롤 및 0-400 μ1의 SCF 표준 및 나머지 부피를 채우는 완충용액 (인산염 완충식염수, 0.1 % 소 혈청 알부민, 0.05% 트리톤 X-100, 0.025% 아지드)로 구성된 배양혼합물 500 μ1을 포함한다. 항혈청은 BRL 3A 조정배지로 부터의 천연 SCF의 50% 순수시료로 면역시킨 토끼의 2차 시험사혈물이다.
이 분석에서 최종 항혈청희석은 1 : 2000이다.
항체-결합 I-SCF를 스타프 에이(Staph A)(칼바이오켐사)를 가하여 침전시킨다. 실온에서 1시간 배양한 후, 이 시료를 원심분리하여 펠릿을 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA 및 0.05%트리톤 X-100을 함유하는 pH 8.2의 10mM 트리스-HCI 0.75 ml로 2회 세척한다. 세척한 펠릿을 감마 계수기로 I-SCF 결합물의 백분율을 결정한다. 모든 최종값에서 혈청이 결여된 시험관의 결합 계수를 감하여 비특이성 침전에 대해 보정한다. 전형적인 RIA는 제20도에 나타나 있다. 비표지 표준물에 의해 생성된 I-SCF 결합의 저해율은 용량-의존적이고 (제20a도), 제20b도에 나타난 바와같이 , 면역-침전 펠릿을 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피에 의해 시험하였을 때, I-SCF단백질 밴드는 경쟁적이다.
제20b도에서, 레인 1은 I-SCF이고, 레인 2, 3, 4 및 5는 각각 0,2,100 및 200ng의 SCF 표준으로 경쟁시킨 면역-침전 I-SCF이다. RIA 시험관에서 관찰된 항체-침전성 cpm의 감소 및 면역-침전 I-SCF 단백질 밴드(대략 Mr 31,000으로 이동)의 감소 두가지 모두에 의해 결정된 바와같이, 폴리클론항혈청은 실시예 1 에서와 같이 정제된 SCF 표준으로 인식된다.
E. coli COS-1 및 CHO 세포에서 발현된 재조합 SCF를 검출하는데 웨스턴 방식도 또한 적용된다. 부분적으로 정제된 E. coli에서 발현된 집쥐 SCF (실시예 10), COS-1 세포에서 발현된 집쥐 SCF 및 SCF 뿐만 아니라 인체 SCF (실시예 4 및 9) 및 CHO 세포에서 발현된 집쥐 SCF (실시예 5)를 SDS-PAGE 한다. 전기이동 후, 바이오-래드 트란스블롯장치 (Bio-Rad Transblot apparatus)를 사용하여 60 V에서 5 시간 동안 단백질 밴드를 0.2 μ m 니트로셀룰로오스로 옮긴다. 니트로셀룰로오스 필터를 pH 7.6에서 10% 염소 혈청을 포함하는 PBS 내에서 4 시간 동안 차단시킨 다음 토끼의 예비-면역 혈청이나 면역혈청 (상기한 면역화) 둘 중 하나와 함께 실온에서 14시간 배양한다. 항체-항혈청 복합체를 호스래디쉬퍼옥시다아제-결합 염소 항-토끼 IgG 시약 (벡터 라보라토리스) 및 4-클로로-1-나프톨 발색제를 사용하여 가시화 한다.
두가지 웨스턴 분석의 실시예는 제21도 및 제22도에 나타나 있다. 제21도에서, 레인 3 및 5는 200 μ1 의 COS-1세포에서 생성된 인체 SCF 이고 : 레인 1 및 7은 200 μ1 의 COS-1 세포에서 생성된 인체 EPO(V19.8 EPO로 형질감염 시킨 COS-1 세포) ; 및 레인 8은 예비-염색한 분자량 표식물이다. 레인 1-4는 예비-면역혈청으로 배양하고, 레인 5-8은 면역혈청으로 배양한 것이다. 특히 면역 혈청은 인체 SCF 를 생성하는 COS-1세포로부터 30,000달톤의 겉보기 분자량을 지닌 확산밴드를 인식하지만, 인체 EPO를 생성하는 COS-1세포에서는 인식하지 않는다.
제22 도에 나타난 웨스턴 분석에서, 레인 1 및 7은 E. coli에서 생성된 1 ㎍의 부분적으로 정제한 집쥐 SCF 시료이고 ; 레인 2 및 8 은 소맥아 응집소-아가로스로 정제한, COS-1 세포에서 생성된 집쥐 SCF 이고 ; 레인 4 및 9 는 소맥아 응집소-아가로스로 정제한, COS-1 세포에서 생성된 집쥐 SCF 이고 ; 레인 5 및 10 은 소맥아 응집소-아가로스로 정제한 CHO 세포에서 생성된 집쥐 SCF 이고 ; 레인 6 은 예비-염색한 분자량 표식물이다. 레인 1-5 와 레인 6-10은 각각 토끼의 예비-면역 혈청 및 면역혈청으로 배양한 것이다.
E. coli에서 생성된 집쥐 SCF (레인 1 및 7)은 약 24,000달톤의 겉보기 분자략으로 이동하는 반면에, COS-1 세포에서 생성된 집쥐 SCF (레인 2 및 8)은 24-36,000달톤의 겉보기 분자량으로 이동한다. 이러한 분자량 차이는 포유동물 세포는 글리코실레이션 할 수 있지만 박테리아는 그렇지 않기 때문이라 여겨진다. 집쥐 SCF 를 암호화하는 시퀀스를 COS-1 (레인 4 및 9) 내로, 또는 CHO 세포 (레인 5 및 10)내로 형질감염시킨 결과 SCF (레인 2 및 8)을 형질감염시켜 생성된 SCF 보다 낮은 평균 분자량 지닌 SCF가 발현된다.
COS-1 및 CHO 세포의 집쥐 SCF 발현 생성물은 24-36,000달톤 사이의 겉보기 분자량 범위인 일련의 밴드이다.
발현된 SCF의 이질성은 탄수화물 변이체에 기인하리라 여겨지며, 여기에서 SCF 폴리펩티드는 서로 다른 정도로 글리코실화된다. 요약하면, 웨스턴분석법은 천연 포유동물 SCF로 면역시킨 토끼로부터 얻은 면역혈청은 E. coli , COS-1 및 CHO세포에서 생성된 재조합 SCF를 인식하지만 COS-1 세포에서 생성된 EPO로 구성된 대조 시료에서는 어떠한 밴드도 인식하지 못함을 나타낸다. SCF 항혈청의 특이성에 관한 다른 증거에서, 동일한 토끼로부터의 예비-면역혈청은 어떠한 집쥐 또는 인체 SCF 발현 생성물과도 반응하는데 실패하였다.
[실시예 8]
재조합 SCF의 생체내 활성도
A. 골수이식에서 집쥐 SCF
COS-1세포를 실시예 4 에 기술한 바와같이 대규모 실험 (60 mm접시 대신 T175 cm²플라스크)으로 V19.8 SCF 로 형질감염시킨다. 약 270 ml의 상청액을 수확한다. 이상청액을 실시예 1 에 기술한 바와같이 필히 소맥아 응집소-아가로스와 S-세파로스로 크로마토그래피한다. 재조합 SCF를 생쥐 w/w 유전자를 기초로 한 골수이식 모델로 평가한다. w/w 생쥐는 다른 특징 가운데 대적혈구성빈혈(대적혈구)을 가져 오고 수용자 동물의 방사선 조사가 필요없이 정상 동물로부터 골수이식이 되도록하는 간(幹)세포 결손을 갖는다[Russ 등의 Science, 140, 844-846 (1964) 참조] .정상 공여자 간세포는 이식후 결손 수용자 세포보다 더 성장한다.
다음 실시예에서 각 그룹은 짝지은 6 살난 생쥐를 갖는다.
골수를 정상 공여자 생쥐에서 수확하여 w/w 생쥐에 이식한다.
다음 수용자 동물의 혈액 프로필이 이식후 다른 시간에 이루어지고 공여자 골수의 접종은 수용자에서 공여자 표현형으로 말초 혈액 세포가 변화됨으로써 측정된다. 수용자에서 공여자 표현형으로의 전환은 적혈구의 전방 산란 프로필(FASCAN, 벡톤 딕킨슨)을 모니터링하여 검출한다. 이식된 각 동물의 프로필을 두 공여자 및 수용자 비이식 대조 동물과 각 시점에서 비교한다. 비교는 유동시스템의 히스토그램을 분석한 콜모고로브-스미르노브(Kolmogorov-Smirnov) 통계를 주로한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 행한다.[Young 의 J. Histochem. and Cytochem., 25, 935-941 (1977) 참조]. 접종의 독립 질적지표는 수용 혈액의 헤모글로빈 전기이동법에 의하여 검출된 헤모글로빈유형이고[Wong등의 Mo1.and Cell.Biol., 9, 788-808(1988)참조] 콜모고로브-스미르노브 통계에서의 측정 적합도와 일치한다.
약 3×10 세포를 SCF 처리 (제23도의 대조그룹)없이 C56 BL/6J 공여자에서 w/w수용자로 이식한다. 두 번째 그룹에게 37℃에서 20분동안 처리하고 함께 주사한 3×10 공여자 세포를 주입한다(제23도의 예비처리 그룹). (SCF의 한 단위는 MC/9 생물학적 분석에서 반-최대 자극을 가져오는 양으로 정의 한다). 세 번째 그룹에서 수용자 생쥐에 3×10 공여자 세포를 이식한 후 3 일 동안 약 400 U SCF/일를 피하(SUb-Q)주사한다(제23도의 SUb-Q 주사 그룹 ). 제23도에 나타난 바와같이, 두 SCF-처리그룹에서 공여자 골수는 비처리된 대조 그룹보다 더 빠르게 접종된다. 이식후 29일까지 SCF 예비처리 그룹은 공여자 표현형으로 전환된다. 이 실시예는 골수이식에서 SCF 치료법의 유용성을 설명한 것이다.
B. 강철 생쥐에서 집쥐 SCF의 생체내 활성도
S1 유전자위치에서의 돌연변이는 조혈세포, 색소세포, 배세포의 결핍으로 일어난다. 조혈세포 결손은 적혈구 [Russe11의 In:Al Gordon, Regμlation of Hematopoiesis, Vol.I, 649-675, Applenton-Century-Crafts, New York, (1970) 참조], 호증구 [Ruscetti의 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 152, 398 (1976) 참조], 단핵세포 [Shibata 의 J. Immunol. 135, 3905 (1985)참조] 거핵세포 [Ebbe 의 Exp. Hematol., 6 ,201 (1978) 참조] 천연 킬러세포 [Clark 의 Immunogentics, 12, 601 (1981) 참조]와, 비만세포[Hayashi 의 Dev. Biol., 109, 234 (1985) 참조]의 수가 감소되어 나타난다.
강철 생쥐는 간 세포를 지지하는 능력이 감소되므로 골수이식의 수용자로서 불충분하다[Bannerman 의 Prog, Hematol.,8,131(1973), 참조]. SCF를 암호화하는 유전자는 강철(S1/S1) 생쥐에서 제거된다.
강철 생쥐는 SCF 의 활성도에 대한 민감한 생체내 모델을 제공한다. 다른 재조합 SCF 단백질을 시간 범위에 따라 변하는 강철-디키(S1/S1 )생쥐에서 시험한다. 6-10주된 강철 생쥐(WCB 6FI-S1/S1 를 메인 바하버에 소재하는 잭슨 라보라토리스에서 구입한다. 말초혈액을 적혈구, 헤모글로빈 및 혈소판의 시스멕스 에프-800 (SYSMEX F-800)미혈구 계산기 (캘리포니아 이르빈에 소재하는 박스터에서 구입)로 모니터링한다. 말초 백혈구(WBC)수의 계산은 코울터 채널 라이저 256 (Coμlter Channelyzer 256)을 사용한다(조지아 마리에타에 소재하는 코울터 일렉트로닉스에서 구입).
제24도의 실험에서, 강철-디키 생쥐를 30일 동안 100 ㎍/Kg/일의 투여량으로, 실시예 10에서와 같이 정제하고, SCF1-164에서 유도한 E.coli으로 처리한 다음, 20일 동안 30 ㎍/kg/일의 투여량으로 더 처리한다. 단백질을 주사가능한 식염수(일리노이스 노스시카고에 소재하는 아보트 라보라토리스에서 구입) + 0.1%태아 소 혈청에서 제`형화한다.
주사는 매일 피하에 행한다. 말초 혈액을 제24도에 나타낸 시간에서∼50 μ1 을 꼬리사혈하여 모니터링한다. 혈액을 3% EDTA피복주사기에 수집하고 분말 EDTA마이크로퓨즈 시험관 (뉴욕 웨스트베리에 소재하는 브린크만에서 구입)에 투입한다.
대조동물에 비하여 처리 동물에서 대적혈구성 빈혈의 현저한 보정이 나타난다. 처리를 중지하면, 처리 동물은 대적혈구성 빈혈의 최초 상태로 되돌아 간다.
제25도와 제26도에 나타낸 실험에서, 강철-디키 생쥐를100 ㎍/kg/일의 투여량으로 20일 동안 SCF의 다른 재조합 형태를 수반하여 상술한 바와같이 처리한다. 두 형태의 E.coli 유도 집쥐 SCF, SCF 및 SCF 은 실시예 10에 기술된 바와같이 제조한다. 더우기, 실시예 12에서와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 가하여 변성시킨, E.coli SCF (SCF PEG25) 도 시험한다. 또한, 실시에 5에서와 같이 제조하고 실시예 11에서와 같이 정제한 SCF 에서 유도된 CHO도 시험한다. 동물을 33％ EDTA 피복주사기로 심장 파열로써 사혈을 일으키게하고 EDTA분말 시헙관에 투입한다. 처리 20일후 말초혈액 형상을 백혈구(WBC)에 대하여는 제25도에 나타내고 혈소판에 대하여는 제26도에 나타냈다. SCF PEG2S그룹에 대한 WBC분별은 제27도에 나타나 있다.
여기에서 호중구, 단핵세포, 림프구와 혈소판의 절대적 증가가 나타난다. 가장 극적인 효과는 SCF PEG25에서 볼 수 있다.
또한 림프구 아부분(Subset)의 측정을 독립적으로 행하여 데이타를 제28도에 나타냈다. 인체 CD4의 쥐 상당물 또한 헬퍼 T세포의 표식뭍은 L3T4이다 [Dialynas의 J. Immunol, 131,2445(1983) 참조]. LyT-2는 세포독성 T 세포에 대한 쥐 항원이다[Ledbetter의 J. Exp. Med.,153, 1503 (1981) 참조]. 이들 항원에 대한 모노클론 항체를 사용하여 처리동물에서 T 세포 아부분을 평가 한다.
전혈을 다음과 같이 T 림프구 아부분에 대해 염색한다.
200 마이크로리터의 전혈을 개개의 동물에서 사혈하여 EDTA 처리 시험관에 넣는다. 혈액의 각 시료를 60초 동안 무균 탈이온수로 용균한 다음, 10×둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS) (뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 집코로부터 수득)와 등삼투압시킨다. 이와같이 용균시킨 혈액을 1×PBS (뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 집코드로부터 수득)로 2회 세척하고 0.1％ 태아 소 혈청(버지니아 맥린에 소재하는 플로우 라보라토리에서 수득)과 0.1％아지드 나트륨으로 보충한다.
혈액의 각 시료를 둥근 바닥 96웰의 클러스터 접시로 옮기고 원심분리한다. 세포 펠릿(2－10×10 세포함유)을 피코에리트린(PE) (캘리포니아 마우틴 뷰에 소재하는 벡톤 디킨슨에서 수득)과 결합된 20 마이크로리터의 집쥐 항-생쥐 L3T4 및 30분 동안 얼음(4℃)에서 항온한 이소티오시안산플루오레스세인 (벡톤디킨슨)와 결합된 20마이크로리터의 집쥐 항-마우스 LyT-2에 재현탁한다. 배양한 다음 세포를 상기와 같이 보충된 1×PBS로 2회 세척한다. 혈액의 각 시료를 FACScan세포 분석시스템(캘리포니아 마우틴 뷰에 소재하는 벡톤 디킨슨에서 수득)으로 분석한다.
이 시스템을 표준 보상 과정과 보정비이드(Calibrite Beads) (캘리포니아 마운틴 뷰에 소재하는 벡톤 디킨슨에서 수득)을 사용하여 표준화한다.
이들 데이터는 헬퍼 T세포 개체군 이외에 세포 독성 T세포수에 있어 절대적 증가를 나타낸다.
C. 영장류에서 SCF의 생체내 활성도
E. coli (실시예 6B)에서 발현되고 실시예 10에서와 같이 균질하게 정제된 인체 SCF 1-164를 정상 영장류에서 생체내 생물학적 활성도에 대하여 시험한다.
성숙한 수컷 비비(Papio Sp.)를 세 그룹으로 연구한다 : 비처리, n=3 ; SCF 100 ㎍/kg/일, n=6 : 및 SCF 30 ㎍/kg/일, n=6, 처리 동물에는 매일 일회 SCF를 피하주사한다. 혈액 표본은 케타민 억제하의 동물에서 수득한다. 전혈구계수, 망상 적혈구 계수 및 혈소판 계수의 표본은 처리 1,6,11,15,20 및 25일에 수득한다.
모든 동물은 상기 프로토콜에서 생존했고 SCF 치료에 대한 부작용이 없었다. 백혈구 계수는 제29도에 나타난 바와같이 100㎍/kg 처리 동물로 증가한다. 라이트 김사(Wright Giemsa) 염색한 말초혈액 도말로부터 수동으로 얻은 백분율수는 제29도에 표시되어 있다. 여기서 호중구 림프구와 단핵세포가 절대적으로 증가한다. 또한 제30도에 나타난 바와같이, 적혈구 용적비와 혈소판에서 100㎍/kg 투여량으로 증가를 나타낸다.
또한 인체 SCF (실시예 12에서와 같이 폴리에틸렌 클리콜을 기하여 변성시킨 hSCF )를 200 ㎍/kg- 일의 투여량으로 연속정맥 주입하여 정상 비비에서 시험하고 변성되지 않은 단백질과 비교한다. 동물은 0일에서 SCF로 시작하여 28일동안 처리한다. 말초 WBC에 대한 결과는 다음표에 나타냈다. PEG변성 SCF는 비변성 SCF 보다 말초 WBC에서 더 빠른 상승을 가져 온다.
200 ㎍/kg-일 hSCF 로 처리 :
[실시예 9]
재조합 인체 SCF의 시험관내 활성도
실시예 3D에서 기술한 PCR 반응에 의해 수득한 아미노산 1-162에 상응하는 인체 SCF의 cDNA를 실시예4의 집쥐 SCF에 대해 기술한 바와같이 COS-1 세포에서 발현한다. COS-1 상청액을 사람 골수에서는 물론 쥐 HPP-CFC와 MC/9 분석으로 분석한다.
인체 단백질은 어떤 쥐분석에서도 시험한 농도에서 활성적이지 않으나 인체 골수에서는 활성적이다.
분석의 배양조건은 다음과 같다 : 건강하게 자생한 인체 골수를 피콜-하이파크 그래디언트(파마시아)상에서 원심분리하고 7％ 02, 10% CO2및 83％ N2를 함유하는 습도가 있는 대기에서 14일 동안 2.1% 메틸 셀루로오스, 30%태아 송아지 혈청, 6×10-5M2-메르캅토에탄올, 2mM 글루타민, 이스코브(ISCOVE)배지 (집코), 20u/m1 EPO와 1×105세포/m1에서 배양한다.
재조합 인체 및 집쥐 SCF COS-1 상청액에서 생성된 군체수는 표 12에 나타나 있다. 단 0.2mm의 크기 또는 그 이상의 군체만 표시했다.
14일 기간 이상 성장한 군체는 제31a도에 나타나 있다 (배율 12×). 화살표는 대표적인 군체를 나타낸다.
이 군체는 큰 크기(평균 0.5mm)의 쥐 HPP-CFC 군체와 유사하다. EPO의 존재로 인하여 다소의 군체는 헤모글로빈화된다. 콜로니를 시토스핀(Cytospin)(산돈)을 사용하여 유리 슬라이드 상에서 분리하고 원심분리한 다음 라이트-깁사로 염색하면 우세한 세포 유형은 제31b도에 도시한 바와같은 큰핵 : 세포질 비율을 갖는 비분화 세포였다(배열 400×). 제31b도의 화살표는 다음과 같은 구조를 가리킨다 : 화살표 1, 세포질 ; 화살표 2, 핵 ; 3, 액포. 등급에 따라 미성숙 세포는 커지고, 이 세포는 이들이 성숙함에 따라 점진적으로 더 작아진다 [Diggs 등의 The Morphology of HμMan Blood Cells, Abbott Labs, 3 (1978) 참조]. 조혈성숙 시퀀스를 갖는 초기 세포의 핵은 세포질에 비하여 비교적 크다. 더불어 미성숙 세포의 세포질은 라이트-깁사로 핵보다도 더 짙게 염색된다. 세포가 성숙할 때 핵은 세포질 보다 더 짙게 염색된다. 재조합 인체 SCF와의 배양으로부터 초래된 인체 골수세포의 형태는 SCF가 작용한 표적물과 즉시 생성물이 비교적 미성숙한 조혈 선조가 되는 결과를 가져온다.
상기한 바와같이 다른 성장 인자와 함께 인체 골수에 대한 한천 군체 분석으로 재조합 인체 SCF를 시험한다.
그 결과는 표 13에 나타나 있다. SCF를 G-CSF, GM-CSF, IL-3 및 EPO를 수반하여 합성하고 개개의 CSFs에 대한 골수 표적물의 증식을 증가시킨다.
재조합 인체 SCF의 다른 활성도는 인체 급성 골수성백혈병(AML) 세포주, KG-1 (ATCC 제 CCL 246호)의 연한천에서 증식을 유발하는 능력이다. 형질감염시킨 세포에서 수득한 COS-1 상청액은 3000/m1로 세포를 평판화함을 제외하고는 필히 기술한 바와 같이 KG-1 한천 클로닝 분석[Koeffler등의 Science, 200, 1153-1154 (1978) 참조]으로 시험한다.
삼중 배양의 데이터는 표14에 제시되어 있다.
[실시예 10]
E. coli 내에서 발현된 재조합 SCF 생성물의 정제
E. coli 인체 SCF 의 발효는 실시예 6C에 따라서 행한다.
수확한 세포 (912g 습윤 중량)를 4.6L의 부피로 물에 현탁하고 8000psi에서 실험실 균질기 (가울린 모델 15MR-8TBA)에 3회 통과시켜서 파괴한다. 파괴된 세포펠릿 분획을 원심분리(17700×g 30분, 4℃)하여 수득하여 물로 1회 세척하고 (재현탁 및 재원심분리), 최종적으로 400ml의 부피로 물에 현탁한다.
불용성 SCF (10-12g의 SCF로 추정)를 함유하는 펠릿 분획을, 혼합물 성분의 최종농도가 8M요소(초순도급), 0.1mM EDTA, 50mM 아세트산나트륨, pH 6-7인 3950ml의 적당한 혼합물에 가하며 SCF의 농도는 1.5mg/ml로 추정된다. SCF가 가용화되도록 4시간 동안 실온에서 항온한다. 잔류 불용성 물질을 원심분리하여 제거한다(17700×g, 30분, 실온). 가용화된 SCF의 재생성/재산화에 있어서, 상청액 분획을 혼합물 성분의 최종 농도가 2.5M 요소(초순도급), 0.01mM EDTA, 5mM 아세트산나트륨, 5mM 트리스-HC1, pH8.5, 1mM글루타티온, 0.02％(wt/vol) 아지드 나트륨인 39.15 L의 혼합물 에 교반하면서 서서히 가한다. SCF 농도는 150㎍/ml 로 추정된다. 실온에서 60 시간후 [더 짧은 시간(예를들어∼20시간)도 적합하다], 교반하면서, 혼합물을 세 개의 10,000분자량 차단 폴리술폰막 카세트(총면적 457.2cm )를 갖는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 두배로 농축한 다음, 7부피의 20mM 트리스-HCI, pH 8에 대하여 격리여과한다. 농축/한외여과하는 동안의 온도는 4℃이고, 펌프율은 5L/분이고, 여과율은 600ml/분이다.
회수된 잔류물의 최종부피는 26.5L이다. 시료의 감소가 있거나 감소없이 행하는 SDS-PAGE를 사용하여, 대부분(＞80％)의 펠릿분획 SCF는 8M 요소와의 배양에 의하여 가용화되고, 접힘/산화후 다종(형태)의 SCF가 비감소 시료의 SDS-PAGE에 의하여 가시화됨으로서 존재함을 알 수 있다.
정확히 산화된 SCF(하기참조)를 나타내는 주형태는 제9도에 나타낸 분자량 표식물 (감소)에 비하여 약 17,000의 겉보기 분자량(비감소)으로 이동한다.
다른 형태는 부정확한 사슬내에 이황화물 결합을 갖는 SCF를 나타내는 것으로 여겨지는, 약 18-20,000(비감소)의 겉보기 분자량으로 이동하는 물질 ; 및 이량체 또는 더 큰 소중합체를 각기 형성하도록 공유결합하는 SCF 폴리펩티드 사슬을 초래하는, 사슬내 이황화물 결합을 갖는 여러 가지 SCF 형태를 나타내는 것으로 생각되는 37,000(비감소) 또는 그 이상의 범위의 겉보기 분자량으로 이동하는 밴드를 포함한다.
다음 분획화 단계는 잔류하는 E. coli오염물 및 원치않는 SCF형을 제거하므로서, 생물학적 활성 입체형태를 갖고, 뚜렷한 균질성으로 정제된 SCF를 수득한다.
한외여과 잔류물의 pH는 가시적 침전물의 존재를 유도하는, 375ml의 10％(vol/vol) 아세트산을 가하여 4.5로 조절한다.
60분후, 이 점에서 많은 침전물을 용기 바닥에 침강시켜, 상부 24L을 따라내고 500ml/분으로 Cuno 30SP 심부 여과기를 통하여 여과하여 정화를 완료한다.
여과물을 물로 1.5배 희석한 다음 25mM 아세트산나트륨, pH4.5에서 평형화시킨 S-세파로스 고속 흐름(파마시아)컬럼 (9×18,5cm)에 4℃에서 가한다. 컬럼은 4℃에서 5L/h의 유속으로 흐른다. 시료를 가한 후 컬럼을 결합되는 5컬럼 부피(∼6L)의 컬럼 완충액과 SCF물질로 세척하고, 컬럼 완충용액내 0내지 0.35M NaCl의 기울기로 용리한다.
전체 기울기 용적은 20L이고 200ml의 분획을 수집한다 용리도는 제33도에 나타나 있다. S-세파로스 컬럼에서 수집한 분획으로부터의 분취량(10μ1)있거나(제32a도) 감소없이(제32b도)행하는 SDS-PAGE에 의하여 분석한다. 이와같은 분석으로부터, 280nm에서의 실제 모든 흡광도(제32도와 제33도)는 SCF물질에 기인함을 알 수 있다.
정확하게 산화된 형태는 주흡광도 피크(분획 22∼38,제33도)에서 우세하다.
분획에서 가시화될 수 있는 미량종(형태)은 주흡광도 피크(분획10∼21,제32b도)의 리이딩 쇼율더(leading shoμlder)에 존재하는, SDS-PAGE (비감소)에서 18-20,000의 겉보기 분자량을 갖는 부정확하게 산화된 물질 ; 및 전체 흡광도 부분(분획 10∼38,제32b도)에 존재하는 이황화물-결합 이량체 물질을 포함한다.
S-세파로스 컬럼으로부터의 분획 22-38을 풀링하고, 이 풀에 약 11ml의 6N HC1을 가하여 pH2.2로 조절하고 50％(vol/vol)에탄올, 12.5mM HC1(용액A)로 평형화시킨 비닥 C컬럼(높이8.4cm, 직경9cm)에 가하고 4℃에서 조작한다.
컬럼 수지는 건성수지를 80％(vol/vol) 에탄올, 12.5mM (용액B)에 현탁시킨 다음, 이를 용액A와 평형화시켜 제조한다.
시료를 가하기 전에 용액A내지 용액B(전체 부피 6L)의 블랭크 기울기를 가한 다음 컬럼을 용액(A)로 재평형화 시킨다.
시료를 가한 후, 컬럼에 결합되는 2.5L의 용액A와 SCF물질로 컬럼을 세척하고 2670ml/h의 유속으로, 용액A내지 용액B(전체 용적 18L)의 기울기로 용리한다. 각기 50ml의 286분획을 수집하고, 분취량을 280nm에서의 흡광도(제35도) 및 상기(제34a도, 감소상태 ; 제34b도 비감소 상태)와 같은 SDS-PAGE(분획당 25μ1)에 의하여 분석한다.
고도로 경제된 상태에서 정확히 산화된 SCF를 함유하는 분획 62-161을 풀링한다[약18-20,000의 분자량(비감소)을 갖는 부정확하게 산화되는 비교적 소량의 단량체를 기울식으로 후에 용리하고 (분획 166-211에 대하여), 또한 이황화물-결합 이량체 물질도 후에 용리한다(분획 199-235에 대하여) (제35도)].
분획 62-161의 풀에서 에탄올을 제거하고, SCF를 농축하기 위하여 Q-세파로스 고속 흐름(파마시아)이온 교환 수지를 이용한 다음 공정을 사용한다. 풀(5L)을 물로 희석하여 15.625L의 부피가 되게하고, 에탄올 농도를 액 20％(vol/vol)로 한다. 그런다음 1M 트리스 염기(135ml)를 가하여 pH8까지 되게 한 다음 1M 트리스-HC1, pH8,(23.6ml)를 가하여 전체 트리스 농도가 10mM이 되게한다.
다음 10mM트리스-HC1 pH8 (~15.5L)을 가하여 전체 부피가 31.25L이고 에탄올 농도가 약 10%(vol/vol)가 되게한다.
물질을 10mM 트리스-HC1, pH8로 평형화시킨 Q-세파로스 고속 흐름 컬럼(높이6.5cm, 직경7cm)에 4℃에서 가한 다음 컬럼을 2.5L의 컬럼 완충액으로 세척한다.
시료를 가하고 세척하는 동안 유속은 약5.5L/h로 한다.
결합된 SCF를 용리시키기 위하여, 200mM NaC1, 10mM 트리스-HC1, pH8을 약 200m1/h로 컬럼에서 역방향으로 펌프한다. 약12m1의 분획을 수집하여 280nm에서의 흡광도와 상기 SDS-PAGE에 의하여 분석한다. 분획 16-28을 풀링한다(157m1). SCF를 함유하는 풀을 4℃에서 인산염-완충 식염수로 평형화시킨 세파크릴 S-200HR (파마시아) 겔 여과 컬럼에 두 개의 분리 크로마토그래프 런 (각각 78.5ml 사용)에 가한다.
다음 약15ml의 분획을 약 75ml/h의 유속으로 수집한다.
각 경우에 280nmdml 흡광도를 갖는 주요 피크의 물질을 대략 1370 내지 1635ml의 용리 부피에 해당하는 분배우으로 용리한다. 두 개의 컬럼 런에서 흡광도 피크를 나타내는 분획을 약 2.3g의 SCF를 함유하는 525ml 의 단일 풀과 혼합한다.
이 물질을 밀리포어 밀리파크(Millipore Millipak)20막 카트리지를 사용하는 여과에 의하여 살균한다.
택일적으로 C컬럼에서 나온 물질을 한외여과하여 농축할 수 있고 완충액은 살균여과전에 격리여과하여 교환할 수 있다.
분리된 재조합 인체 SCF 물질은 고순도이고 (은-염색한 SDS-PAGE에 의하여 〉98％)제약등급을 갖는 것으로 고려된다. 실시예 2에서 기술한 방법을 사용하여 상기 물질이 SCF 유전자 분 것으로 예상되는 아미노산 조성물 공유도를 갖고 개시 코돈에 의하여 암호화된 Met의 잔류로 예상되는 N-말단 아미노산 시퀀스 Met-Glu-Gly-Ile...,을 가진다고 밝혀졌다.
E. coli 에서 발현된 인체 SCF 에 대하여 기술한 방법과 비교할 수 있는 방법에 의하여, 집쥐 (발효후 세포내에서 불용성 형태로 존재한다)는 높은 생물학적 고유활성도를 갖는 경제된 상태로 회수할 수 있다. 인체 SCF 집쥐 SCF 도 비슷하게 회수할 수 있다. 산포/산화하는 동안 집쥐 SCF 은보다 다양하게 산화된 종을 형성하는 경향이 있고, 원치않는 종은 크로마토그래피로 제거하기가 더 어렵다. 집쥐 SCF 과 인체 SCF 은 회수 초기단계, 즉 가용화 및 산포/산화동안에 단백질분해를 일으키는 경향이 있다.
단백질 분해의 최초 부위는 잔기 160과 170사이에 위치한다. 단백질 분해는 적당한 조작조건(예를들어 SCF 농도 ; pH변화 ; 2∼5mM의 EDTA 또는 다른 프로테아제 억제제 포함) 에 의하여 최소화시킬 수 있고 분해된 형태는 이들이 존재하는 범위까지 적당한 분획화 단계에 의하여 제거할 수 있다.
전술한 바와같이 가용화 및 산포/산화동안에 요소를 사용함은 바람직한 구체예이나, 또한 구아니딘-HCl (예를들어, 가용화시 6M와 산포/산화시 1.25M)과 나트륨N-라우로일 사르코신과 같은 다른 가용화제를 효과적으로 이용할 수 있다.
산포/산화후 가용화제를 제거하면 SDS-PAGE에 의하여 측정한 바와 같이, 정제된 SCF를 적당한 분획화 단계를 사용하여 회수 할 수 있다.
또한, 산포/산화시 1mM의 글루타티나온을 사용함은 바람직한 구체예이나, 다른조건도 동일 또는 거의 동일한 효과로 이용할 수 있다. 예를들어, 이들은 1mM 글루타티온 대신에 2mM 글루타티온+0.2mM 산화글루타티온, 또는 4mM 글루타티온+0.4mM글루타티나오, 또한 1mM메르캅토에탄올, 또는 다른 티올 시약의 사용을 포함한다.
전술한 크로마토그래피 방법 이외에, 정제된 활성형으로 SCF를 회수하는데 유용한 다른 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 [예를들어, 1.7M 황산암모늄의 존재하의 중성 pH에서 시료를 가하고 황산암모늄을 감소시키는 기울기로 용리하는, 폐닐-세파로스(파마시아)의 사용] ; 고정화 금속 친화성 크로마토그래피[예를들어, 1Mm이미다졸 존재하의 중성에 가까운 pH에서 시료를 가하고 이미다졸을 증가시키는 기울기로 용리하는, Cu 이온으로 충전된 킬레이팅-세파로스(파마시아)의 사용] ; 히드록실아파티트 크로마토그래픽[1mM 인산염 존재하의 중성 pH에서 시료를 가하고 인산염을 증가시키는 기울기로 용리한다] ; 및 본 분야의 숙련된 기술자에게 자명한 다른 방법을 포함한다.
제42도에서 아미노산 1-248에 의하여, 암호화된 오픈리딩 프레임의 전부나 일부에 상응하는, 존재 가능한, 택일적으로 스플라이싱된 mRNAs (제44도에서 cDNA 배열로 표시한 것과 같은 것)에 의하여 암호화된 오픈리딩 프레임에 상응하는, 인체 SCF의 다른 형태도 E. coli 내에서 발현시킬 수 있고 본 실시예에 서술된 것과 유사한방법에 의해서나 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 다른 방법에 의하여 정제된 형태로 회수할 수 있다.
실시에 16에서 언급한 소위 막통과 부위를 포함하는 형태의 경제와 조성을 비-이온성 세정제를 함유하는 세정제 및 인지 질-함유 리포솜 구조를 포함하는 지질의 사용을 포함한다.
[실시예 11]
포유동물 세포의 재조합 SCF
[SCF를 생성하는 CHO 세포의 발효]
재조합 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (균주 CHO pDSR α2 hSCF )를 인체 SCF 를 생성하기 위한 20리터의 관류 배양 시스템의 마이크로캐리어에서 성장시킨다.
발효조시스템은 다음을 제외하고는, 실시예 1B BRL 3A세포 배양에 사용한 것과 유사하다 : CHO 세포의 배양에 사용한 성장배지는 2mM 글루타민, 비필수 아미노산(1: 100으로 희석한 집코#320-1140을 사용하여 기존 농도를 두배로함)과 5％ 태아 소혈청으로 보충한, 1 : 1 비율의 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM)와 햄의 F-12영양소 혼합물의 혼합물(집코)이다. 수확 배지는 혈청 제거를 제외하고는 동일하다.
반응물을 두 개의 3-리터 회전 플라스크에서 성장시킨 5.6×10 CHO 세포로 접종한다. 4×10 세포ml의 농도로세포가 성장하도록 한다. 이 시점에서 100그람의 예비 살균된 사이토 덱스-2 마이크로캐리어(파마시아)를 인산염완충식염수에 현탁시킨 3-리터의 현탁액으로서 반응물에 가한다. 세포를 마르크로캐리어에 부착하여 4일 동안 성장시킨다.
성장배지를 글루코오스 소모를 기초로 필요하면 반응물을 통하여 관류시킨다. 글루코오스 농도는 약2.0g/L에서 유지한다 4일 후에 반응물에 6부피의 혈청-유리 배지를 관류시켜 대부분의 혈청(단백질 농도〈50㎍/ml)을 제거한다.
반응물을 글루코오스 농도가 2g/L 이하로 감소될때까지 배치식으로 조작한다. 이후에 반응물을 약 20L/일의 연속 관류율로 조작한다. 배양물의 pH는 CO유속을 조절하여 6.9±0.3으로 유지한다. 가용화된 산소는 필요에 따라 순수 산소로 보충하므로서 20％이상의 공기 포화를 유지한다.
온도는 37± 0.5℃에서 유지한다.
약 450리터의 혈청-유리 조정배지를 상기 시스템에서 생성하고 재조합 인체 SCF 를 정제하기 위한 출발물질로서 사용한다.
또한 약 589리터의 혈청-유리조정배지를 균주 CHO pDSR α2 rSCF 를사용하여 유사한 형태로 생성하고 집쥐-SCF 를 정제하기 위한 출발물질로서 사용한다.
[재조합 포유동물에서 발현된 의 정제]
모든 정제작업은 다른 언급이 없는한 4℃에서 행한다.
[농축 및 투석여과]
상기 A부문에서 행한 바와같이 세포균주 CHO pDSR α2 집쥐 SCF 를 혈청-유리 성장시켜 생성한 조정 배지를 0.45μ 사르토캡슐(사르토리우스)을 통한 여과에 의하여 정화시킨다.
몇몇 다른 배치 (36 L,101 L,102 L, 200 L 및 150L)를 개별적으로 농축하고 격리여과/완충액 교환한다. 예를들어, 36 L 배치의 취급은 다음과 같다. 여과된 조정배지를 세 개의 10,000 분자량 차단 아세트산 셀룰로스막 카세트(총막면적 457.2cm : 펌프율∼2,200ml/분 및 여과율∼750ml/분)을 갖는 밀리포어 펠리콘 접선 흐름 한외여과장치를 사용하여∼ml로 농축한다. 음이온 교환 크로마토그래피에 대한 시료의 투석여과/완충액교환은 1000ml의 10ml트리스-HCl, pH 6.7∼6.8을 가하여 농축한 다음, 접선 흐름 한외여과 장치를 사용하여 500ml로 재농축하고, 이를 5회 더 반복한다. 최종적으로 농축/투석여과한 시료를 1000ml의 부피로 회수한다. 농축 및 투석여과/완충액교환을 한 모든 조정배지 배치의 작용은 유사하다.
표준으로서 소 혈청 알부민을 갖는 브래드포드법[Anal. Bioch. 72. 248-254(1976)참조]에 의하여 측정한 배치의 단백질 농도는 70∼90㎍/ml 이다.
이 시료에 이용한 조정배지의 총부피는 약 589L이다.
[Q-세파로스 고속 흐름 음이온 교환 크로마토그래피]
상기 언급한 다섯 개의 조정배지 배치 각각으로부터의 농축/투석 여과한 시료를 혼합한다(총부피 5,000ml).
1M HCl을 가하여 pH를 6.75까지 조절한다. 시료를10mM트리스-HCl, pH6.7 완충용액으로 평형화시킨 Q-세파로스 고속흐름 음이온 교환 컬럼(36×14cm : 파마시아 Q-세파로스 고속 흐름 수지)에 가한다. 시료를 가한 후, 컬럼을 28,700ml의 트리스 완충액으로 세척한다.
이와같이 세척한 후, 컬럼을 약 pH4.5에서 23.000ml의 5mM 아세트산/1ml 글리신/6M요소/20μM CuSO로 세척한다.
컬럼을 10mM 트리스-HC1, 20μM CuSOpH 6.7 완충액으로 세척 한 뒤 중성pH로 바꾸어 요소를 제거하고, 염 기울기(10mM 트리스-HC1, 20μM CuSOpH 6.7완충액 ; 40L의 부피)적용한다. 약 490ml의 분획을 약 3,250ml/h의 유속에서 수집한다. 크로마토그램은 제36도에 나타나 있다. MC/9cpm 이란 MC/9 분석에서 생물학적 활성도를 언급한 것이고 ; 지적된 분획 5μ1을 분석한다. 시료를 가하는 동한 수집된 용출액과 세척액은 도면에 나타나 있지 않다.
생물학적 활성도는 이들 분획에서는 검출되지 않는다.
[실리카-결합 탄화수소 수지를 사용한 크로마토그래피]
제36도에 나타낸 런에서의 분획 44-66을 혼합이고(11,200ml) EDTA을 1mM의 최종 농도로 가한다.
이 물질을 완충액 A(10mM트리스 pH 6.7/20％에탄올)로 평형화시킨 C컬럼(비닥 단백질 C: 7×8cm)에 약2000ml/h의 유속으로 가한다. 완충액 A 내지 완충액 B(10mM 트리스 pH 6.7/94％ 에탄올)(총부피6000ml)의 선형 기울기를 가한 다음, 30-50ml의 분획을 수집한다. 0.5ml 분취량의 기울기분획 이외에 C출발시료, 순차이동(runthro㎍h) 풀 및 세척 풀의 일부를 생물학적 분석용 시료에서 인산염-완충식염수로 투석한다.
이들 여러 가지 분획을 MC/9분석 (5μ1 분취량의 제조된 기울기 분획 ; 제37도의 cpm)에 의하여 분석한다. 여러 가지 분획 분취량의 SDS-PAGE [Laemmi의 Nature 227, 680-685 (1970) ; 4％(w/v) 아크릴아미드를 함유하는 스태킹겔과 12.5％(w/v) 아크릴아미드를 함유하는 분리겔]은 제38도에 나타나 있다. 나타낸 겔의 시료 분취량(100μ1)을 진공하에서 건조한 다음 20μ1의 시료 처리 완충액 (감소, 즉-메르캅토에탄올로)를 사용하여 재용해시키고 겔상에 부하하기 전에 5분오안 끓인다.도면 좌측의 번호표시는 제6도에서와 같이 분자량 표식물(감소)의 이동위치를 나타낸 것이다. 레인 번호는 최후 부분의 기울기를 적용하는 동안 수집된 상응 분획을 나타낸 것이다. 겔을 은-염색한다[Morrissey의 Anal. Bioch. 117, 307-310 (1981)참조].
[Q-세파로스 고속 흐름 음이온 교환 크로마토그래피]
제37도에 나타낸 C컬럼에서의 분획98-124를 모은다(1050ml). 풀을 10mM트리스, pH6.7완충액으로 1 : 1로 희석하여 에탄올 농도를 감소시킨다. 그런 다음 희석된 풀을 10mM트리스-HC1, pH6.7완충액으로 평형시킨 Q-세파로스고속흐름 음이온 교환 컬럼(3.2×3cm, 파마시아 Q-세파로스 고속 흐름 수지)에 가한다. 유속은 463ml/h 이다. 시료를 가한 후, 컬럼을 135ml의 컬럼 완충액으로 세척하고 결합된 물질은 10mM 트리스-HC1, 350mM NaCl, pH6.7로 세척하여 용리한다. 컬럼의 흐름 방향을 역으로하여 용리된 물질의 부피를 최소화하여, 7.8ml분획을 용리하는 동안 수집한다.
[세파크릴 S-200 HR겔 여과 크로마토그래피]
Q-세파로스 고속 흐름 음이온 교환 컬럼의 염세척으로 용리된 단백질을 함유하는 분획을 모은다(31ml).
30ml를 인산염- 완충식염수로 평형화시킨 세파크릴 S-200 HR (파마시아)겔 여과 컬럼(5×55.5cm)에 가한다. 6.8ml의 분획을 68ml/h의 유속으로 수집한다. 280nm에서의 흡광도 피크에 상응하는 분획을 모으면 최종정제된 물질이 나타난다.
표 15는 정제에 관한 요약을 나타낸 것이다.
정제된 집쥐 SCF 의 N-말단 아미노산 시퀀스는 실시예 2에 개요한 방법으로 측정된 바와같이 대략 절반의 Gln-Glu-Ile-와 절반의 PyroGlu-Glu-Ile-ILE-이다. 이러한 결과는 집쥐 SCF 가 제14c도에서 번호(-1) (Thr)과 (+1)(Gln)으로 표시한 잔기 사이의 단백질 분해 프로쎄싱/절단의 생성물임을 나타낸다.
또한, 형질감염시킨 CHO세포 조정배지(하기)에서의 정제된 인체 SCF 는 이것이 제15c도에서 번호 (-1) (Thr)과 (+1)(Glu)로 표시한 잔기 사이의 프로쎄싱/절단의 생성물임을 나타내는 N-말단 아미노산 시퀀스 Glu-Gly-Ile를 갖는다.
상기한 프로토컬을 사용하여 CHO세포에서 발현된 재조합형이나 아니면 자연적으로 유도된 경제된 인체 SCF를 생성할 것이다.
포유동물 세포 유래의 재조합 SCFs를 정제하는데 사용되는 부가 정제 방법에는 실시예 1과 10에 개요한 방법과 본 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 다른 방법이 포함된다.
제42도에 제시한 아미노산 1-248에 의하여 암호화된 오픈리딩 프레임의 전부나 일부에 상응하거나 기존하는 택일적으로 스플라이싱된 mRNAs (제44도에서 cDNA 시퀀시로 나타낸 것과 같음)에 의하여 암호화된 오픈 리딩 프레임에 상응하는 다른 형태의 인체 SCF도 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있고, 본 실시예에 기술한 방법과 유사한 방법 및 분야의 숙련된 기술자들에게 자명한 방법에 의하여 정제된 형태로 회수할 수 있다.
[SDS-PAGE 및 글리코시다아제 처리]
세파크릴 S-200 HR겔 여과 컬럼에서 모은 분획의 SDS-PAGE를 제39도에 나타내고 ; 2.5μ1의 풀을 부하한다(레인 1).레인을 은-염색한다. 분자량 표식물(레인 6)은 제6도에 서술된 바와같다. 분자량 31,000 표식물 위치 이상 및 약간 이하의 다른 이동물질은 생물학적 활성물질을 나타내고 ; 현저한 이종성 글리코실레이션의 이질성에 크게 기인한다.
글리코실레이션을 특정화하기 위하여, 정제된 물질을 여러가지 글리코시다아제로 처리하여 SDS-PAGE (감소 조건)로써 분석하고 은-염색하여 가시화한다. 결과는 제39도에 나타나 있다. 레인 2, 뉴라미니다아제, 레인 3, 뉴라미니다아제와 0-글리카나아제, 레인 4, 뉴라미니다아제, 0-글리카나아제 및 N-글리카나아제, 레인 5, 뉴라미니다아제와 N-글리카나아제, 레인 7, N-글리카나아제, 레인8, 기질이 없는 N-글리카나아제, 통로 9, 기질이 없는 0-글리카나아제, 조건은 10mM 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸 암모니오]-1프로판술포네이트(CHAPS), 66.6mM 2-메르캅토에탄올, 0.04％(wt/vol) 아지드 나트륨, 인산염 완충식염수이고, 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, 37℃에서 18시간 동안 글리코시다아제의 존재하에 서술한 농도의 반으로 배양한다. 뉴라미니다아제 (아트로박터 우레아파시엔스로부터 수득; 칼바이오켐에서 구입)는 0.5유닛/ml 최종 농도로 사용한다. 0-글라카나아제(겐짐; 엔도-알파-N-아세틸 갈락토스아미니다아제)는 7.5밀리유닛/ml로 사용하고 N-글리카나아제(겐짐; 펩티드:N-글리코시다아제F ; 펩티드-N[아세틸-베타-글루코스 아미닐] 아스파라긴 아미다제)는 10 유신/ml로 사용한다.
여러 가지 대조적 배양을 적당히 행할 수 있다. 이들예는 다음과 같은 것이 포함된다 : 첨가된 글리코시다아제 제제로 인하여 결과가 나타남을 입증하는, 글리코시다아제가 결여된 배양 ; 사용한 글리코시다아제 효소가 활성임을 입증하는, 글리코시다아제용 기질로 알려진 글리코실레이션된 단백질 (예를들어, 글리코실레이션 재조합 인체 예리스로포이에틴)로 배양 ; 및 글리코시다아제 제제가 가시화된 겔 밴드(제39도, 레인 8과9)에 기여하거나 불투명하게 하는 것을 판단하는, 기질이 아닌 글리코시다아제로 배양.
다수의 결론은 상기 실험으로부터 유도할 수 있다. N-글라카나아제 [이는 복합 및 높은-만노스 N-결합 탄수화물(Tarentino 등의 Biochemistry 24,4665-4671 (1988))을 제거한다. 뉴라미니다아제(이는 시알산 잔기를 제거한다) 및 0-글라카나아제 [이는 특정0-결합 탄수화물 Lambin 등의 Biochem. Soc. Trans. 12, 599-6000(1984)를 제거한다]를 수반한 여러 가지 처리는, N-결합과 0-결합 탄수화물 둘다 존재하되 ; 이중 최소한 몇몇에는 0-결합성분의 일부를 가지는 시알산이 존재합을 암시한다. N-글라카나아제와의 처리로 SDS-PAGE에 의하여 나타나는 이질성 물질을 훨씬 많은 균질성을 갖는 보다 빠른-이동형태로 전환시 킬 수 있다는 사실은 모든 물질이 글리코실레이션의 이질성에 의하여 주로 야기되는 이질성을 갖는, 동일한 폴리펩티드를 나타냄을 알려준다.
[실시예 12]
재조합 SCF- PEG의 제조
실시예 6A와 10에 따른 재조합 E. coli 발현계로 부터 정제한 집쥐SCF- 를 하기한 폴리에틸렌 글리콜 변성용 출발물질로서 사용한다.
0.327ml 탈이온수내의 메톡시폴리에틸렌 그리콜-숙신이미딜 숙시네이트(18.1mg=3.63 μmol ; ss-MPEG=시그마 케미컬 캄파니 제M3152호, 대략 분자량 =5,000)를 1.0ml의 138mM 인산나트륨 62mM NaCl, 0,62mM아세트산나트륨, pH8.0내의 13.3mg(0.727mol)에 가한다. 결과적으로 생성된 용액을 30분 동안 실온에서 가볍게 (100rpm)교반한다.
1.0ml분취량의 최종 반응 혼합물 (10mg단백질)을 파마시아 슈퍼덱스(Pharmacia Superdex)75겔 여과 컬럼에 가한 다음 100mM인산나트륨, pH 6.9로 실온에서 0.25ml/속도로 용리한다. 첫 번째 10mL의 컬럼 유출액의 자외선 흡광도(280nm)를 연속적으로 모니터링하여 제40a도에 나타냈다. 분획 번호 25내지 27을 혼합하여 0.2μ폴리술폰막(겔만 사이언서 번호 4454)을 통하여 한외여과하여 살균하고, 결과적으로 생성된 풀을 PEG-25로 명명한다.
또한, 분획번호 28내지 32를 혼합하여 한외여과하여 살균하고, PEG-32로 명명한다. 1.0mg/mL용액의 비변성 집쥐 SCF 에 대한 0.66의 흡광도를 보정용으로 사용하여 A280 측정에서 계산하면, 모아진 분획 PEG-32는 3.06mg의 단백질을 함유하고 모아진 분획 PEG-32는 3.55mg의 단백질을 함유한다. 반응 혼합물에서 총 단백질중 11.8%을 나타내는 미반응 집쥐 SCF 을 분획번호 34내지 37로 용리한다. 유사한 크로마트그래피 조건하에서 비변성 집쥐 SCF 는 제40b도, 45.6ml의 잔류부피를 갖는 주요 피크로서 용리된다. 제40a도에서 분획번호 77내지 80은 N-히드골시숙신이미드, SS-MPEG를 갖는 집쥐SFG 의 반응 부산물을 함유한다.
집쥐 SCF 의 잠재적 반응 아미노기는 12리신 잔기와 N-말단 글루타민 잔기의 알파 아미노기를 포함한다.
Habeeb의 Anal. Biochem. 14 : 328-336(1966)문헌에 서술된 방법을 사용하여 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS)을 수반한 분광 기적정에 의하여 측정한 바와 같이 풀 분획 PEG-25는 9.3mol 반응 아미노기/단백질을 함유한다.
또한, 풀 분획 PEG 32 10.4 mol반응 아미노기/mol단백질을 함유하고 비변성 집쥐 SCF 는 13.7 mol 반응 아미노기/mol 단백질을 각각 함유한다.
따라서, 풀 분획 PEG-32에서 집쥐 SCF 의 3.3 (13.7-10.4) 아미노기의 평균을 SS-MPEG와 반응시키면 변형된다. 또한, 풀 분획 PEG-25에서 집쥐 SCF 의 4.4아미노기의 평균도 유사하게 변형된다. 실시예10에서와 같이 제조한 인체 SCF(hSCF )도 전술한 방법을 사용하여 변형시킨다. 특히, 714mg (38.5μmol) hSCF 를 실온에서 30분 동안, 75mL의 0,1M인산나트륨 완충액, pH 8.0 에서 965.5 mg (192.5 μmol) SS-MPEG 와 반응시킨다. 반응 혼합물을 세파크릴 S-200 HR컬럼(5×134cm)에 가하여 102mL/h의 속도로 PBS (집코 둘베코의 CaC1와 MgC1가 결여된 인산염-완충 식염수)로 용리하고, 14.3mL의 분획을 수집한다. 상기한 PEG-25풀과 유사하며 제40a도에 제시한 분획 번호 39-53을 모아 총354mg의 단백질이 함유됨을 밝혔다. 영장류에서 이러한 변형 SCF외 생체내 활성도는 실시예 8C에 나타나 있다.
[실시예 13]
[백혈병 아세포에서 SCF수용체 발현]
다른 계통의 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 백혈병아세포를 수확한다. 세포를 밀도 기울기 원심분리와 부착성 상실에 의하여 정제한다.인체 SCF 를 실시예 7의 프로토콜로 요오드화 한다. 세포를 기술한 바와같이 다른 농도의 요오드화 SCF (Broody의 Blood, 75 1622-1626 (1990) 참조]와 배양한다. 수용체 결합 실험의 결과는 제41도에 나타나 있다. 평가된 수용체 밀도는 약70,000 수용체/세포이다.
[실시예 14]
[초기 림프구양 선구물질에 대한 집쥐 SCF활성도]
IL-7과 상승작용하여 림프구양 세포 증식을 증진시키는, 재조합 집쥐 SCF 의 능력을 생쥐 골수의 한천 배양으로 연구한다. 이 분석에서 단독 rrSCF 를 수반하여 형성된 콜로니는 단핵세포, 호중구 및 아세포를 함유하는 반면에, IL-7단독으로 또는 rrSCF 와 함께 자극된 군체는 주로 프리-B 세포를 함유한다.
B220 , sIg , Cμ 로서 특정화 되는 프리-B 세포는 B22O 항원 [Coffman 의 Immunol, Rev., 69,5 (1982)] 과 표면 Ig(FITC-염소 항-K, 앨라배마 버밍감에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이션에서 수득)에 대한 형광-표지 항체를 사용한 풀 세포의 FACS분석 ; 및 형광-표지항체(TRITC-염소 항-μ, 서던 바이오테크놀로지 어소시에이션)를 사용한 세포질μ 발현용 시토스핀 슬라이드의 분석에 의하여 확인된다.
재조합 인체 IL-7 (rhIL-7)은 바이오소스 인터내셔날(Biosource International) (캘리포니아 웨스트레이크 빌리지)로 부터 수득한다. rrscp 를 프리-B세포 성장인자 IL-7과 함께 가하면, 콜로니 형성의 상승작용 증가가 관찰되며, 이는 초기 B세포 선조에 대한 rrSCF 의 자극적 역할을 나타내는 것이다
1.평판화된 5×10 생쥐 골수세포당 군체수 각 값은 삼중접시±SD의 평균치이다.
[실시예 15]
[SCF의 수웅체의 확인]
A.C-키트는 SCF 의 수용체이다.
SCFI-164가 C-키트의 리간드인가의 여부를 시험하기 위하여, 공지된 시퀀스로 고안한 프라이머틀 갖는 SCF 반웅성 비만 세포주 MC/9 [Nabel 등의 Nature, 291,332-334(1981) 참조로부터의 PCR을 사용하여 전체 쥐 C-키트에 대한 CDNA [Qiu등의EMBO J., 7, 1003-1011 (1988) 참조]을 증폭한다. 아미노산 1-549 [Yarden 등의 EMBO J., 6, 3341-3351 (1987) 참조]에 의하여 암호화된, 인체 C-키트의 리간드 결합과 막통과 도메인을 인체 적백혈병 세포주, HEL [Martin및 Papayannopoμlou의 Science, 216, 1233-1235(1982)참조]로 부터 유사한 기술을 사용하여 클로닝한다. C-키트 cDNAS 를 포유동물 발현벡터 Vl9.8 내로 삽입하여 COS-1세포내로 형질감염시키고, 하기 부문 B와 C에 기술한 방법에 따라 집쥐나 아니면 인체 I-SCF 를 사용하는 결합 분석용으로 막 분획을 제조한다. 표 17은 대표적인 결합 분석의 데이터를 나타낸다. 여기서 Vl9.8단독으로 형질감염시킨 COS-1세 포에 대한 I 인체 SCF 의 검출가능한 특이 결합은 존재하지 않는다. 그러나, 막통과 도메인을 더한 인체 재조합 C-키트 리간드 결합 (hckit-LTl)을 발견하는 COS-1세포는 1-hSCF 와 결합한다 (표 17).
비표지 인체 SCF 을 200배의 초과 몰로 가하면 바탕수준까지 결합이 감소된다. 또한, 전체 길이의 쥐C-키트 (mckit-Ll)로 형질간염시킨 COS-1세포는 집쥐 I-SCF 와 결합한다. 소량의 집쥐 I-SCF 결합이 단독 V19.8을 수반한 COS-1세포 형질감염체에서 검출되고 비형질감염시킨 세포 (나타내지 않음)에서도 검출되는데 이는 COS-1세포가 내인성 C-키트를 발현함을 나타내는 것이다.
이러한 발견은 C-키트 발현의 광범위한 세포분포에 의한 것이다. 집쥐 I-SCF 가 인혜 및 쥐 C-키트 모두에서 유사하게 결합되는 반면에, 인체 I-SCF 는 더 낮은 활성도로 쥐C-키트에 결합한다(표 17). 이러한 데이타는 종들 사이의 SCF 교차-반응성의 유형과 일치한다. 집쥐 SCF 가 인체 SCF 와 유사한 고유 활성도를 갖는 인체골수의 증식을 유도하는 반면 쥐 비만 세포의 증식을 유도하는 인체 SCF 는 집쥐 단백질보다 더 적은 800배의 고유활성 도를 유발한다 .
요약하면, 이와같은 발견으로 W또는 S1돌연변이 생쥐에 의하여 발현되는 표현형 이상은 다른 세포형의 발생에 임계적인 C-키트 수용체/리간드 상호작용에서 일차 결함의 결과임이 확인된다.
a. 이중 측정의 평균을 나타낸다 ; 실험은 유사한 결과를 갖도록 개별적으로 3회 실시한다.
b. 1.6 nM 인체 I-SCF
c. 1.6 nM 인체 I-SCF + 320 nM비표지 인체 I-SCF
d. 1.6 nM 집쥐 I-SCF
e. 1.6 nM 집쥐 I-SCF + 320 nM 비표지 집 쥐 SCP
B. COS-1세포에서 재조합 C-키트의 발현
각각의 인체 적백혈병 세포주 HEL과 MC/9세포를 산 페놀/클로로포름 추출 [Chomczynsky 및 Sacchi 의 Anal, Biochem., 162,156-159 (1987)참조] 하여 분리한 총 RNA로부터 PCR기술 [Saiki등의, Science, 239, 487-491 (1988)] 을 사용하여 인체 및 쥐C-키트 cDNA 클론을 유도한다. 유일한 시퀀스 올리고뉴클레오티드는 공지된 인체 및 쥐 C-키트 시퀀스로 부터 고안한다. 제1가닥 cDNA는 프라이머로서 C-키트 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 효소, MO-MLV역전사 (매릴랜드 베데스다에 소재하는 베데스다 리서치 라보라토리스에서 수득)가 제공된 프로토콜에 따라 총 RNA로 부터 합성한다. C-키트 리간드 결합과 티로신 키나아제 도메인의 중복부분의 증폭은 적합한 C-키트 프라이머쌍을 사용하여 행한다. 이들 부분을 COS-1세포내 발현을 위한 포유동물 발현 벡터 Vl9.8 (제17도)내로 클로닝한다.
몇몇 클론의 DNA시퀀싱은 모든 클론에서 PCR증폭동안 일어날수 있는, 독립 돌연변이를 나타낸다. 이들 돌연변이의 클론 유리는 개별 클론으로 부터 돌연변이-유리 제한 단편을 재결합하여 이루어 진다. 공지된 시퀀스와 다소의 차이는 클론 모두나 약 반에서 나타나되, 이들을 사용한 세포주에 존재하는 실제 시퀀스라고 결정하며 공지 시퀀스와 대립유전자 차이를 나타낸다. 다음 플라스미드는 인체 C-키트의 막통과 부위를 더한 리간드 결합 (아미노산 1-549)을 갖는 V 19.8 : V 19.8 : mckit-LTI, 전체 쥐 C-키트 ; 및 V 19.8 : hcKit-Ll 으로 구성된다.
이 플라스미드를 실시예 4에 기술된 바와같이 필히 COS-1세포내로 형질감염 시킨다.
C. 재조합 C-키트를 발현하는 COS-1세포에 결합하는 I-SCF
형질감염 2일 후, COS-1세포를 접시에서 긁어 모아, PBS로 세척하고, 사용할매까지 냉동시킨다. 녹인 후, 세포를 1 mM PMSF, 100 ㎍/ml아프로티닌, 25 ㎍/ml류펩틴, 2㎍/ml 펩스타틴과 200㎍/ml TLCK-HC1을 함유하는 1mM MgCl10mM 트리스-HCI에 재현탁한다. 현탁액을 5회 피펫으로 위아래로 옮겨서 분산시켜 15분 동안 얼음에서 항온하고 이 세포를 15-20스트로크(stroke)의 다운스(Dounce), 균질기로 균질화한다. 수크로스(250mM)를 균질물에 가하고, 핵분획과 비파괴 잔류 세포를 50분 동안 500×g으로 원심분리하여 펠릿으로 만든다. 상청액을 4℃에서 30분 동안 25,000g으로 원심분리하여 잔류 세포 찌꺼기를 펠릿으로 만든다. 인체 집쥐 SCF 를 클로르아민-T [Hunter 및 Greenwood의 Nature, 194, 495,496(1962) 참조]를 사용하여 방사성 요오드화한다. COS-1막 분획을, 1％소 혈청 알부민과 50mM HEPES(pH7.4)로 보충한 RPMI으로 된 결합 완충액내에 200배 몰 초과량의 비표지 SCF 를 갖거나 갖지 않는 인체나 아니면 집쥐 I-SCF (1.6nM)로 22℃에서 1시간 동안 배양한다. 결합 배양의 종결된 후, 막 시료를 150μ1의 프탈레이트 오일상에 서서히 적하하고 베크만 마이크로 퓨즈 11에서20분 동안 원심분리하여 막 결합 I-SCF 를유리 I-SCF 에서 분리시킨다. 펠릿을 절단하고 막 결합 I-SCF 를 정량한다.
[실시예 16]
인체 SCF cDNA 의 분리
A. HT-1080 cDNA 라이브러리의 구성
총 RNA를 산 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법[콤진스 등, Anal.Biochem. 162,156 (1987)] 으로 인체 섬유육종 세포주 HT-1080 (ATCC 제CCL 121호)에 분리하고,폴리(A) RNA 를 클론테크(Clontech)에서 구입한 올리고 (dT) 스핀 컬럼을 사용하여 회수한다. 이중-가닥 cDNA 를 공급자가 권고한 조건하에서 BRL (베데스다 리서치 라보라토리) cDNA 합성 키트로 2㎍ 폴리(A) RNA 로 부터 제조한다.
2kb의 평균 크기를 갖는 약 100ng의 컬럼 분획된 이중-가닥 cDNA 를 300ng 의 SalI/NotI 으로 절단시킨 벡터 pSPORT1 [D'Alessio 등의 Focus,12,47-50(1990) 참조] 예 결합시키고 일렉트로포레이션 [Dower 등의 Nucl. Acids Res., 16,6127-6145(1988) 참조]에 의하여 DH5α (매릴랜드 베데스다에 소제하는 BRL 에서수득]세포내로 형질전환시킨다.
B. cDNA 라이브러리의 선별
약 2.2×10 의 일차 형질전환체를 각기∼5000의 개별 클론을 함유하는 44 풀로 나눈다. 플라스미드 DNA 를 DelSal 등의 Biotechniques, 7,514-519 (1989) 문헌에 기술된 CTAB-DNA 침전법에 의하여 각 풀로부터 제조한다. 2 마이크로그람의 각 플라스미드 DNA 풀을 제한 효소 NOtI로 절단하고 겔 전기이동법에 의하여 분리한다. 선형화된 DNA를 진스크린 플러스 (GeneScreen Plus) 막(듀폰)상에 옮기고 예기한 조건 [Lin 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580-7584 (1985) 참조] 하의 P-표지 PCR 생성 인체 SCF cDNA (실시예 3) 와 혼성화한다.
각 풀에서 단일 군체를 수득할 때까지 이들 군체의 풀을 군체 -흔성화법 [Lin 등의 Gene 44, 201-209(1986) 참조]에 의하여 재선별한다. 이들 세개의 분리된 클론의 cDNA 크기는 5.0-5.4 kb 이다. 5' 말단에서 제한효소 절단 및 뉴클레오티드 시퀀스 측정으로 세 클론중 두개가 동일함을 알 수 있다(10-la와 21-7a). 이들은 둘 다 암호화 부위와 약 200 bp 의 5' 비번역 부위(5'UTR)를 함유한다. 세번째 클론 (26-la) 은 5' 말단에서 다른 두 클론보다 더 짧은 약 400 bp 를 갖는다.
이러한 인체 SCF cDNA 의 시퀀스는 제42도에 나타나 있다.
아미노산 186-190의 부위에서 시작하여 아미노산 212 에서 종결하는 소수성 막통과 도메인 시퀀스가 특히 주목할 만하다.
C. pDSRα2 hSCF 의 구성
pDSRα2 hSCF 을 다음과 같은 플라스미드 10-la (실시예 16B 에서 기술)와 pGEM3 hSCF .를 사용하여 생성한다 : pGEM3 hSCF 에서의 HindIII 삽입물을 M13mp18 로 전이시킨다.
ATG 개시 코돈의 바로 상류에 있는 뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드 5'-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T3'와 애머샴 코포레이션의 올리고뉴클레오티드-유도 시험관 내 돌연변이유발 시스템 키트 및 프로토콜을 사용하여 tttccttATG에서 gccgccgcc/ATG로 특정부위 돌연변이 유발로 변화시켜 M13mp18 hSCF 를 생성한다. 이 DNA 을 HindIII 으로 절단하여 HindIII 으로 절단한 pDSRα2 에 삽입한다. 이 클론을 pDSRα2 hSCF 로 명명한다. pDSRα2 hSCF 로부터의 DNA을 XbaI 으로 절단하고 클레노우 효소와 네 개의 dNTPs 를 가하여 이 DNA를 블런트 말단으로 만든다.
이러한 반응이 종결된 후 DNA을 효소 SpeI 으로 더 절단한다. 삽입물내 오픈 리딩 프레임에 대한 블런트 말단 3' 이 생성되도록 클론 10-1 을 DraI 로 절단하고 pDSRα2 hSCF 와 10-1 둘 다의 유전자 내 동일한 부위에서 절단하는 SpeI 로 절단한다. 이들 DNAs 를 함께 결합하여 pDSRα2 hSCF 을 생성한다. D. pDSRα2 hSCF DNA 을 수반한 COS 세포의 형질감염 및 면역침전
COS-7 (ATCC 제 CRL 1651호) 세포를 상기한 바와같이 구성한 DNA로 형질감염시킨다. 0.8 ml DMEM + 5%FBS 내의 4×10 세포를 10 ㎍ pDSRα2 hSCF DNA 또는 10 ㎍ pDSRα 2 벡터 DNA (벡터 대조) 둘 중 하나로 1600 V 에서 일렉트로포레이션한다. 일렉트로포레이션 후, 세포를 두개의 60-㎜ 접시에 놓는다. 24시간 후, 배지를 신선한 완전배지로 바꾼다.
형질감염 72 시간 후, Yarden 등의 (PNAS 87, 2569-2573, 1990참조) 문헌의 방법을 변형하여 각 S-배지로 표지한다.
세포를 PBS 로 1회 세척한 다음 30분 동안 메티오닌-유리,시스테인-유리 DMEM (met-cys-DMEM) 에 배양한다.
배지를 제거하고 100 μCi/ml Tran s-Label (ICN) 을 함유하는1 ml met cys-DMEM 을 각 접시에 가한다. 세포를 8시간 동안 37 ℃ 에서 배양한다. 배지를 수확하고 원심 분리에 의하여 청징화하여 세포 찌꺼기를 제거하고 -20 ℃에서 냉동한다. COS/pDSRα2 hSCF 및 COS/pDSRα2 벡터 대조의 표지한 조정배지의 분취량을 Yarded 등 (EMBO, J., 6, 3341-3351, 1987참조) 의 문헌의 방범을 번형하여 S-표지 CHO/PDSR α2 hSCF 클론 17 세포 (실시예 5참조)의 배지 시료와 함께 면역침전 시킨다 .1ml 의 조정배지의 각 시료를 10μ1의 예비-면역 토끼 혈청 (#1379 P.I.)으로 처리한다.
시료를 4 ℃ 에서 5시간 동안 배양한다. 0.15 M NaCl, 20 mM 트리스 (pH 7.5), 0.2 % 트리톤 X-100 내의 스타필로코쿠스아우레우스 (판소르빈, 칼바이오켐) 10% 현탁액의 100마이크로미터를 각 시험관에 가한다. 시료를 4℃ 에서 한시간 더 배양한다. 면역 복합물을 5분 동안 13,000xg 으로 원심분리하여 펠릿으로 만든다. 상청액을 새시험관으로 옮기고 실시예 11 에서와 같이 정제한, 5μ1 토끼 폴리클론 항혈청 (#1381 TB4)과 함께 CHO 유도 hSCF 에 대하여 4℃ 에서 밤새 배양한다. 100μ1 판소르빈을 1시간 동안 가하고 면역 복합물을 전술한 바와같이 펠릿으로 만든다.
펠릿을 용균 완충액 (0.5% Na-데옥시콜레이트, 0.5% Np-40,50 mM NaCl, 25 M 트리스 pH 8)으로 1회, 세척 완충액 (0.5M NaCl, 20 mM 트리스 pH 7.5 , 0.2% 트리톤 X-100) 로 3회, 20 mM 트리스 pH 7.5 로 1회 세척한다. 펠릿을 50 μ1 의 10mM 트리스 pH 7.5, 0.1 % SDS, 0.1 M β-메르캅토에탄올에 재현탁한다.
SCF 단백질을 5분 동안 끓여서 용리한다. 시료를 5분 동안 13,000xg 으로 원심분리하고 상청액을 회수한다. 글리코시다아제와의 처리는 다음과 같이 행한다 : 1.6 mU 0-글리카나아제, 0.5 U N-글리카나아제 및 0.02 U 뉴라미니다아제를 함유하는 3마이크로리터의 75 mM CHAPS를 25μ1 의 면역 복합물 시료에 가하고 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 동부피의 2 X PAGE 시료 완충액을 가하고 시료를 3분간 끓인다. 절단 및 비절단 시료를 15% SDS-폴리아크릴아미드 환원성 겔상에서 8 mA로 밤새 전기이동 한다. 겔을 메탄올-아세트산에서 고정시키고, 엔라이트닝 (Enlightening) 증진제 (NEN)로 30분간 처리하여, 건조하고-70℃ 에서 코닥 XAR-5 필름에 노출시킨다.
그 결과는 오토래디오그래프로 제43도에 나타나 있다. 레인 1과 2는 대조 COS/pDSRα2 배양물의 시료, 레인 3과 4는 COS/pSRα2 hSCF 배양물의 시료, 레인 5와 6은 CHO/pDSRα2 hSCF 배양물의 시료이다. 레인 1,3 및 5는 절단되지 않은 면역 침전물이고 ; 레인 2,4및 6은 상기한 바와같이 글리카나아제로 절단된 것이다. 분자량 표식물의 위치는 좌측에 나타나 있다. pDSRα2hSCF 로 형질감염시킨 COS에서 SCF 의 프로쎄싱은 pDSRα2 hSCF 로 형질감염시킨 CHO 에서 분비된 hSCF 의 프로쎄싱과 아주 유사하다(실시예11). 이것은 세포에서 SCF 를 유리하는 자연적인 단백질 분해 프로쎄싱 위치가 아미노산 164의 부에 있음을 강하게 암시한다.
[실시예 17]
인체 SCF 의 사차 구조 분석
표준 분자량을 갖는 BRL 세포 배지로 부터 SCF 를 정제하기 위하여 실시예 1 에 기술된 겔 여과 컬럼 (ACA 54)를 보정하고 다른 보정된 겔 여과 컬럼으로 부터 정계된 SCF 를 용리한 결과 BRL세포 배지로부터 정제한 SCF 가 표준 분자량에 비하여 약 70,000-90,000 의 겉보기 분자량으로 작용하는 것을 알 수 있다. 대조적으로, SDS-PAGE 에 의한 겉보기 분자량은 약 28,000-35,000 이다. 이는 글리코실레이션된 단백질이 상기 분석에서 비정상적으로 작용하는 것이 인정되므로 그 결콰는 BRL-유도 집쥐 SCF가 비-변성 조건하에 비공유결합 이량체로서 존재하는 것을 암시한다. 유사한 결과가 비-변성 조건하의 겔 여과에 의하여 평가되는 분자 크기가 각기 특별 경우에, 변성 조건 (즉, SDS 의 존재)하의 겔 여과에 의하여,또는 SDS-PAGE에 의하여 평가되는 것의 약 2배인 재조합 SCF 형태 (예를들어 E. coli에서 유도된 집쥐 및 인체 SCF , CHO세포에서 유도된 집쥐 및 인체 SCF )에도 적용된다. 더욱이 용액내 부자량의 측정을 정확하게 하는 침강속도 분석은 E.coli- 유도 재조합 인체 SCF 의 분자량이 약 36,000임을 나타낸다 이값은 SDS-PAGE에 의한 값의 약 2배이다(∼18,000-19,000).
따라서,다중 올리고머 상태(단량체 상태포함)가 존재할 수 있을 것으로 인정되는 반면 이량체상태가 용액의 몇몇 환경하에서는 우세함을 나타낸다
[실시예 18]
5637 세포주로부터 인체 SCF cDNA 클론의 분리
A. 5637cDNA 라이브러리의 구성
총 RNA 를 산구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법[Chomczynski 등의 Anal. Biochem, 162, 156 (1987) 참조]에 의하여 인체 방광 암종세포주 (ATCC 제 HTB-9호)로 부터 분리하고 폴리(A)RNA 을 클론테크에서 구입한 올리고 (dT)스핀 컬럼을 사용하여 회수한다. 이중-가닥 cDNA 을 공급자가 권고한 조건하에서 BRL cDNA합성키트로 2 ㎍ 폴리(A) RNA 로부터 제조한다. 2kb의 평균 크기를 갖는 약 80ng의 컬럼분획된 이중-가닥 cDNA 를 300 ng Sall/Notl 절단 벡터 pSPORT 1 [D'Alessio 등의 Focus, 12,47-50 (1990) 참조] 에 결합시켜, 일렉트로포레이션 [Dower 등의 Nucl. Acids Res., 16, 6127-6145(1988) 참조]에 의하여 DH5α 세포내로 형질 전환시킨다.
B. cDNA 라이브러리의 선별
약1.5x105의 일차 형질전환체를 각기 약 5000의 개별 클론을 함유하는 30 풀로 나눈다. 플라스미드 DNA를 CTAB-DNA 침전법 [Del Sal 등의 Biotechniques, 7,514- 519 (1989) 참조]에 의하여 각 풀로부터 제조한다. 2 마이크로그람의 각 플라스미드 DNA 풀을 제한 효소 NotI 로 절단하고 겔 전기이동하여 분리한다 . 성형화된 DNA 을 진스크린 플러스막(듀폰)에 옮기고 전술한 조건 [Lin등의 Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 82, 7580-7584 (1985)참조] 하에서 HT1080 세포주 (실시예 16)으로부터 분리한 P-표지 완전한 길이의 인체 SCF cDNA와 혼성화한다. 양성신호를 갖는 7개의 풀이 혼성화에 의해 확인되었다. 4개의 풀로부터 단일 콜로니가 수득 될 때까지 콜로니 혼성화 방법 [Lin등의 Gene, 44, 201-209 (1986)]에 의하여 P-표지 PCR 생성 인체 SCF cDNA 로 재선별한다. 네개의 분리된 클론의 삽입물 크기는 약 5.3 kb 이다.
클론의 5'-말단의 제한효소 절단 및 뉴클레오티드 시퀀스 분석은 네개의 클론이 동일함을 나타낸다. 이 인체 cDNA의 시퀀스는 제44도에 나타나 있다. 제44도의 cDNA는 제42도의 시퀀스의 아미노산 149-177을 단일 Gly잔기로 대체한 폴리펩티드를 암호화한다.
[실시예 19]
치사 방사선조사 후 SCF생존 증진
A. 치사 방사선조사 후 생존에 대한 SCF의 생체내 활성도
치사 방사선조사 후 생쥐의 생존에 대한 SCF의 효과를 시험한다.
사용한 생쥐는 10-12 주된 암컷 Balb/c이다. 5마리 생쥐 그룹을 모든 실험에 사용하고 생쥐는 각 실험에서 체중으로 짝지운다. 생쥐를 일회 투여량으로 850라드나 950 라드로 조사한다. 생쥐에 인자 단독 또는 정상 Balb/c골수 세포를 더한 인자를 주사한다.
첫번째 경우에, 조사 24시간 후, E. coli 에서 정제하고 실시 예 12에서와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 가하여 변형한 집쥐PEG-SCF (20 ㎍/kg)를 생쥐에게 정맥내주사하고, 대조 동물에는 식염수를 주사한다. 이식 모델용으로 쥐에 조사
4시간 후 정상 Balb/c 골수의 여러가지 세포 투여량을 정맥내주사한다. 집쥐 PEG-SCF 를 수반한 처리는 주사하기 1시간 전에 200 ㎍/kg 의 집쥐 PEG-SCF 를 세포 현탁액에 가하여 행하고 세포를 더한 인자를 일회 정맥내 주사한다. 850 라드로 조사한 후 생쥐에 집쥐 PEG-SCF 또는 식염수를 주사한다. 그 결과는 제45도에 나타나 있다. 집쥐 PEG-SCF 를 주사하면 대조 동물에 비하여 (P0.0001) 생쥐의 생존 시간이 현저하게 증가된다. 식염수를 주사한 생쥐는 평균 7.7일 생존한 반면에 집쥐 PEG-SCF 처리 생쥐는 평균 9.4일 생존했다(제45도). 제45도에 나타낸 결과는 각 처리 그룹에서 30마리 생쥐로 행한 4가지 개별 실험을 모은 것이다. 집쥐 PEG-SCF 로 처리한 생쥐의 생존증가는 조사한 동물의 골수 세포에 대한 SCF 의 효력을 암시한다.
이들 동물의 혈액학적 변수를 예비 연구하면 조사후 5일째에 대조 동물에 비하여 혈소판 수준이 약간 증가되나 조사후 7일째 혈소판 수준은 대조동물과 현저하게 다르지 않았다. RBC또는 WBC 수준 또는 골수세포 충실성(Cellμlarity) 에서 차이는 나타나지 않았다.
B. SCF 로 처리한 이식 생쥐의 생존
850 라드로 조사한 생쥐에 이식한 10 %대퇴골의 정상 Balb/c골수세포의 투여량은 90% 또는 그 이상의 동물을 구조할 수 있다(데이타는 없음). 그러므로, 850라드의 조사량을 5% 대퇴부의 이식체 조사량으로 사용하여 생존에 관한 집쥐 PEG-SCF 4 의 효과를 연구한다. 이러한 세포 조사량에서는, SCF 를 수용하지 않은 생쥐가 큰 퍼센트로 생존하지 못하는 것이 예상되며 ; 만약 집쥐 PEG-SCF 가 이식된 세포를 자극할 수 있으면 생존을 증가시킬 수 있을 것이다.
제46도에 나타난 바와같이, 조사후 8 일이 지나서 약30%의 대조 생쥐가 생존했다. 집쥐 PEG-SCF 와의 처리는 결과적으로 최소한 30 일 이상 생존한 이들 생쥐의 95%이상이 극적인 생존 증가를 가져왔다(제46도). 950라드로 조사하고 10 % 대퇴부로 이식한 대조 생쥐는 8일까지 죽은 반면에, 집쥐 PEG-SCF 로 처리한 약 40 % 의 생쥐는 20일 또는 더 오래동안 생존했다. 20% 의 대퇴부로 이식한 20% 의 대조 생쥐가 20 일 지나서 생존한 반면에 rSCF 처리동물의 80% 가 생존했다(제47도).
[실시예 20]
SCF에 대한 모노클론 항체의 생성
8-주된 암컷 Balb/c생쥐 (메사츄세츠 윌밍톤에 소재하는 찰스리버에서 수득)에 프로인트 완전 보조액 (H37-Ra ; 미시간 디트로이트 딥코 라보라토리스에서 수득)에서 E. coli로 부터 발현된 20㎍의 인체 SCF 를 피하주사한다. 프로인트 불완전 보조액내 50㎍ 의 동일 항원을 14,38및 57일에 연속투여하고 추가자극 면역화한다. 최종 주사후3 일째에 2마리의 생쥐를 죽여 이들의 비장 세포를 Nowinski 등의, Virology93, 111-116(1979)문헌에 선술된 방법에 따라 sp /0 골수종주와 융합시킨다. sP 2/0 과 하이브리도마의 세포 배양용으로 사용한 배지는 20% 열비활성 태아 소 혈청 (뉴저지 포트리에 소재하는 피브로 켐에서 수득), 110 mg/ml 피루브산 나트륨, 100 U/ml 페니실린 및100 mcg/ml스트렙토마이신(집코)으로 보충한 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM) 이다. 세포융합 후, 잡종세포를 2주동안, 10 M 히포크산틴, 4×10 아미노프테린 및 1.6X1O M 티딘을 함유하는 상기 배지, HAT배지에서 선택한 다음, 히포크산틴과 티미딘을 함유하는 배지에서 2주 동안 배양한다. 하이브리도마를 다음과 같이 선별한다 : 폴리스티렌 웰 (메사츄세츠 캠브리지에 소재하는 코스타에서 수득)을 실온에서 두시간 동안 50㎍의 50 mM중탄산염 완충액(pH 9.2)내의 0.25㎍ 의인체 SCF (E. coli)로 감작시킨 다음, 4℃에서 밤새 감작시킨다. 실온에서 30분 동안 PBS내의 5% BSA로 평판을 차단시킨 다음, 37 ℃ 에서 한 시간 동안 하이브리도마 배양 상청액으로 배양한다. 용액을 따라내고 결합된 항체를 37℃ 에서 한 시간 동안 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (인디애나 인디애나 폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임 바이오케미컬스에서 수득)에 결합된 염소-항-생쥐 IgG의 1 : 500희석물에 배양한다.
세척액 (매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 KPL)으로 평판을 세척한 다음 HO와 ABTS (KPL)의 혼합물로 현상한다.
비색법은 405 nm 에서 행한다.
인체 SCF (E. coli) 에 대한 항체 특이성을 분비하는 하이브리도마 선별 방법과 동일한 ELISA로 시험한다.
희석법을 한정하여 하이브리도마를 서브클론한다. 55 웰의 하이브리도마 상청액으로 인체 SCF (E. coli) 에 대한 강한 양성을 시험하고 ; 이들 중 9개는 인체 SCF ( CHO)와 교차반응한다.
몇몇 하이브리도마를 다음과 같이 클로닝한다 :
하이브리도마 8H7A및 4G12-13은 각각 1990년 9월 26일자 ATCC 제 HB 10560호 및 1990년 9월 26일자 ATCC제 HB10561호로 기탁하였다.
본 발명은 바람직한 구체예의 용어로 설명한 것이며, 본 분야의 숙련된 기술자들은 변형과 수정이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 첨부한 특허청구의 범위는 본 발명의 범위 이내의 상응하는 모든 변형을 포함하고자 한다.

Claims (76)

  1. 제15c도에 제시한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자(SCF)의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드.
  2. 제42도에 제시한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드.
  3. 제44도에 제시한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드.
  4. 제1항 또는 2항에 있어서, 간 세포 인자가 인체 SCF 임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제3항에 있어서, 간 세포 인자가 인체 SCF 임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지되, 외인성 DNA 시퀀스의 원핵 또는 진핵 발현 생성물임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서,외인성DNA 시퀀스는 cDNA 시퀀스임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서 외인성 DNA 시퀀스는 게놈 DNA 시퀀스임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 외인성 DNA 시퀀스의 원핵 또는 진핵 발현 생성물이되, 상기 외인성 DNA 시퀀스가 자율적으로 복제하는 플라스미드나 바이러스성 벡터에 의해 운반됨을 특징으로 하는 폴리펩티드 .
  10. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지되, 검출 가능한 표지물질과 공유결합됨을 더 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 자연 발생적인 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드 생성물을 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 발현시킨는데 사용하기 위한 DNA 시퀀스에 있어서, 이 DNA 시퀀스는 (a) 제15b도, 제15c도 및 제42도에 제시한 DNA 시퀀스 또는 그의 상보 가닥 ; (b) (a) 의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA 시퀀스 또는 그의 단편; 및 (c) 유전암호의 동의성이 없을시, (a)와(b)의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA 시퀀스 및 동일한 아미노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 시퀀스 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  12. 자연발생적인 간세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드 생성물이 되도록 제11항의DNA형질전환 시키거나 형질 감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포.
  13. 제12항에 있어서, 숙주세포가 E. coli 임을 특징으로 하는 숙주세포.
  14. 제12항에 있어서, 숙주세포가 포유동물 세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
  15. 원핵 또는 진핵 숙주내에서 발현시킨 제11항의 DNA 시퀀스의 비-자연발생적인 폴리펩티드 생성물.
  16. 제15항에 따른 cDNA 시퀀스.
  17. 제15항에 따른 게놈 DNA 시퀀스.
  18. 제11항에 있어서, E. coli 세포내의 발현을 위해 선호되는 하나 이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  19. 제11항에 있어서, 포유동물 세포내의 발현을 위해 선호되는 하나 이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  20. 제11항에 있어서, 효모 세포내의 발현을 위해 선호되는 하나 이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  21. 제11항에 있어서, DNA 시퀀스가 인체 SCF 의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  22. 제21항에 있어서, DNA 시퀀스는 제42도에 따른 번호를 사용하는 SCF 1-162, SCF 1-164, SCF 1-165 및 SCF 1-248중에서 선택한 인체 SCF 폴리펩티드의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  23. 제11항 및 제18-22 항중 어느 한 항에 있어서 DNA 시퀀스가 상기 폴리펩티드 N-말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  24. 제11항 및 제18-22 항중 어느한 항에 있어서 DNA 시퀀스가 검출 가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  25. 제24항에 있어서, 표지물질이 방사성 표지물질임을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  26. 제11항 및 제15-23 항 중 어느 한 항의 DNA 를 포함하는 생물학적 기능의 플라스미드 또는 바이러스성 DNA 벡터.
  27. 자연 발생적인 간 세포 인자의 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기 폴리펩티드가 숙주세포에서 발현되도록 제11항의 DNA 시퀀스로 형질감염시키거나 형질전환시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포를 적합한 영양 조건하에서 배양하고, 이 DNA 시퀀스의 원하는 발현 폴리펩티드 생성물을 분리함을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제15c 및 42도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 아미노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기 폴리펩티드가 숙주세포에서 발현되도록 이 폴리펩티드를 암호화하는 DNA시퀀스로 형질전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포를 적합한 영양 조건하에서 배양하고, 상기 시퀀스의 원하는 발현 폴리펩티드 생성물을 분리함을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 자연 발행적인 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드 생성물을 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 발현시키는데 하기 위한 DNA 시퀀스에 있어서, 이 DNA 시퀀스는 (a) 제44도에 제시한 DNA 시퀀스 또는 그의 상보가닥 ; (b) (a) 의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA 시퀀스 또는 그의 단편 ; 및 (c) 유전암호의 동의성이 없을시, (a)와 (b) 의 DNA 시퀀스에 혼성화하는 DNA 시퀀스 및 동일한 아미노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 시퀀스 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  30. 자연 발생적인 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드 생성물이 발현되도록 제29항의 DNA시퀀스로 형질 전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포.
  31. 제30항에 있어서, 숙주세포가 E.coli 임을 특징으로 하는 숙주세포.
  32. 제30항에 있어서, 숙주세포가 포유동물 세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
  33. 원핵 또는 진핵 숙주내에서 발현시킨 제29항의 DNA 시퀀스의 비-자연 발생적인 폴리펩티드 생성물.
  34. 제33항에 따른 cDNA 시퀀스.
  35. 제33항에 따른 게놈 DNA 시퀀스.
  36. 제29항에 있어서, DNA 시퀀스가 E. coli 세포내의 발현을 위해 선호되는 하남이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  37. 제29 항에 있어서, DNA 시퀀스가 포유동물 세포내의 발현을 위해 선호되는 하나 이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  38. 제29항에 있어서, DNA 시퀀스가 효모 세포내의 발현을 위해 선호되는 하나 이상의 코돈을 포함함을 특징으로하는 DNA 시퀀스.
  39. 제29 항에 있어서, DNA 시퀀스가 인체 SCF 의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 시퀀스
  40. 제39항에 있어서, DNA 시퀀스가 제44도에 따른 번호를 사용하는 SCFmetl-157, SCF1-157, SCFmetl-160, SCF1-160, SCFmet1-161,SCF1-161, SCFmetl-220 또는 SCF1-220 의 발현을 암호화함을 특징 으로 하는 DNA 시퀀스.
  41. 제29항 및 제36-40 항중 어느 한항에 있어서 DNA 시퀀스가 상기 폴리펩티드의 N-말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 DNA시퀀스.
  42. 제29항 및 제36-40 항 어느 한항에 있어서 DNA 시퀀스가 검출가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로하는 DNA 시퀀스.
  43. 제42항에 있어서, 상기 표지물질이 방사성 표지물질임을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
  44. 제29항 및 제33-41 항 중 어느 한항의 DNA를 포함하는 생물학적 기능의 플라스미드나 바이러스성 DNA 벡터.
  45. 제44도에 제시한 아미노산 시퀀스를 가지는 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서, 상기 폴리펩티드가 숙주세포에서 발현되도록 이 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 시퀀스로 형질전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포를 적합한 영양 조건하에서 배양하고, 상기 DNA 시퀀스의 원하는 발현 폴리펩티드 생성물을 분리함을 특징으로 하는 제조방법.
  46. 제44도에 제시한 시퀀스에 따르는 SCFmetl-157, SCF1-157, SCFmetl-160, SCF1-160, SCFmetl-161, SCF1-161, SCFmet1-220 또는SCF1-220 중 선택한 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 시퀀스로 형질전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주세포를 적합한 영양 조건하에서 배양하고, 상기 DNA 시퀀스의 원하는 발현 폴리펩티드 생성물을 분리함을 특징으로 하는 제조방법.
  47. 제71,72,78-81 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 제27 또는 28항의 제조방법으로 제조한 폴리펩티드의 유효량과 제약학적으로 용인 가능한 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  48. 제3및 5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 제45 또는 46항의 제조방법으로 제조한 폴리펩티드의 유효량과 제약학적으로 용인 가능한 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  49. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여함을 특징으로하는 인체를 제외한 포유동물의 조혈 치료방법.
  50. 제49항에서 있어서, 상기 치료는 백혈구 감소증의 치료, 혈소판 감소증의 치료, 빈혈증의 치료, 이식수술시 골수의 융합을 강화시키는 방법, 방사선, 화학약품 또는 화학요법에 의해 유발된 골수무성형증이나 골수억제증의 치료시 회복을 강화시키는 방법, 신경 손상의 치료, 불임증의 치료, 장 손상의 치료, 후천성 면역 결핍증의 치료 및 화학요법에 대해 세포를 감작시키는 방법 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 치료방법.
  51. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조 또는 전부를 가지는 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 포유동물의 신경 손상, 불임증 또는 장 손상 치료방법.
  52. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 포유동물의 조혈 치료방법에 있어서, EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2,IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 1ㄴ-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-1 및 LIF중에서 선택한 적어도 하나의 부가 조혈인자를 투여함을 특징으로 하는 치료방법.
  53. (i) 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드와 조혈세포를 배양하고, (ii) 외인성 DNA 로 상기 배양세포를 형질강염시키는 단계로 구성되는, 외인성 DNA 로 조혈세포를 형질감염시킨는 방법.
  54. (i) 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드가 함유된 제약학적으로 용인가능한 담체 ; 및 (ii) 골수세포나 말초 혈액 선조세포 배양용 배지의 제조에 적합한 성분으로 구성된 골수세포나 말초 혈액 선조세포 배양용 성분을 함유하는 키트.
  55. 제54항에 있어서 성분은 EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1,IL-1, IL2, IL-3, 1L-4, IL-5, 1L-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-1 및 LIF중에서 선택한 적어도 하나의 부가 조혈인자를 함유함을 특징으로 하는 키트.
  56. (i) 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드를 함유하는 적합한 배지에 조혈세포를 가하고, (ii)이 조혈세포의 성장을 위한 적합한 조건을 제공하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 시험관 내의 조혈세포의 배양방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 적합한 배지는 EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-1 및 LIF중에서 선택한 적어도 하나의 부가 조혈인자를 함유함을 특징으로 하는 배양방법.
  58. 제56항에 있어서, 조혈세포는 골수세포임을 특징으로 하는 배양방법 .
  59. 제56항에 있어서, 조혈세포는 말초 혈액 간 세포임을 특징으로 하는 배양방법
  60. 제57항에 있어서, IL-3, IL-6 및 G-CSF 가 상기 부가 조혈인자임을 특징으로 하는 배양방법.
  61. 수용성 중합체와 공유결합된, 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드를 함유하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포 인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드와 선택적으로 결합한 항체
  64. 제15c도, 제42도 및 제44도에 제시한 시퀀스 중에서 선택한 시퀀스를 갖는 자연 발생적인 포유동물 간 세포인자의 전형적인 하나 이상의 조혈 생물학적 특성과 그의 일차 구조의 일부 또는 전부를 가지는 폴리펩티드에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 알라닌이나 세린 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  65. 제15항에 있어서, 상기 DNA 시퀀스가 상기 폴리펩티드의 N-말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징하는 폴리펩티드 생성물.
  66. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N -말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 cDNA 시퀀스.
  67. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N -말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 게놈 DNA 시퀀스.
  68. 제15항에 있어서, 상기 DNA 시퀀스가 검출가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로 하는 폴리펩티드 생성물.
  69. 제16항에 있어서, 검출 가능한 표지 물질과 공유 결합됨을 특징으로 하는 cDNA 시퀀스.
  70. 제17항에 있어서, 검출가능한 표지물질과 공유결합될을 특징으로 하는 게놈 DNA 시퀀스.
  71. 제33 항에 있어서, 상기 DNA 시퀀스가 상기 폴리펩티드의 N -말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 폴리펩티드 생성물.
  72. 제34항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N -말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 cDNA시퀀스.
  73. 제35항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N -말단 위치에서 메티오닐 잔기의 발현을 암호화함을 특징으로 하는 게놈 DNA 시퀀스.
  74. 제33항에 있어서, 상기 DNA 시퀀스가 검출가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로 하는 폴리펩티드 생성물.
  75. 제34항에 있어서, 검출가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로 하는 cDNA 시퀀스.
  76. 제35항에 있어서, 검출가능한 표지물질과 공유결합됨을 특징으로 하는 게놈 DNA 시퀀스.
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