FI120312B - Ihmisen kantasolutekijän valmistamiseksi soveltuva solu - Google Patents

Description

Ihmisen kantasointekijän valmistamiseksi soveltuva solu Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI 912857.

5 Esillä oleva keksintö liittyy uusiin tekijöihin, jotka stimuloivat alkukantaisia käntäisäsoluja mukaan lukien varhaiset veren muodostumiseen liittyvät (eli hematopoi-eettiset) kantaisäntäsolut, Erityisesti keksintö koskee näiden uusien tekijöiden, niiden fragmenttien ja polypepti-10 dianalogien eli ihmisen kautasolutekijäpolypeptidin valmistamiseksi soveltuvaa nisäkkään yhdistelmäsolua.

Keksinnön tausta

Ihmisen verenmuodostus- (hematöpoieettinen) systeemi koostuu erilaisista valkoisista verisoluista· {mukaan lu-15 kien neutrofiilit, mäkröfagit, basofiUit, syöttösolut, eo-sinofiilit, T- ja B-solut), punaisista verisoluista (punasolut) sekä hyytymän muodostavista soluista (suuret luu-ydinsolut, verihiutaleet).

Arvellaan, että pienet määrät tiettyjä hematopol-20 eettisiä kasvutekijöitä vastaavat pienen lukumäärän "kan- \ tasoluja" di fferentiaatiosta erilaisiksi verisolukanta- ! isäsoluiksi, näiden solujen valtavasta lisääntymisestä seka j kypsien verisolujen lopullisesta differentiaatiosta näistä solulinjoista, Hematöpoieettinen uudistumissysteemi toimii | 25 hyvin normaaleissa olosuhteissa. Kuitenkin kun sitä rasit- \ tavat kemoterapia, säteily tai luontaiset selkäytimen va-jaakehittyneisyyteen liittyvät häiriötilat, seuraa aikahäi-syys veressä, he ovat vakavasti aneemisia, tai heitä rasittaa vakavasti verihiutaleiden niukkuus veressä. Hematopoi- j 30 eettisten kasvutekijöiden kehitys ja käyttö kiihdyttävät j luuytimen uudistumista tämän vaarallisen vaiheen kestäessä. )

Tietyissä viraalisesti indusoiduissa häiriötilois- 1 sa, kuten immuunikadossa (aids), saattaa spesifisesti tu- j houtua veriaineksia kuten T-soluja. T-soIutuotannon lisää-35 minen saattaa olla terapeuttista tällaisissa tapauksissa, ,\ il 2

Koska heraatopoieettisia kasvutekijöitä esiintyy äärimmäisen pieninä määrinä, näiden tekijöiden toteamisessa ja tunnistuksessa on luotettu sarjaan määrityksiä, jotka toistaiseksi vain erottavat eri tekijät toisistaan stimu-5 loivien vaikutusten viljeltyihin soluihin perusteella keinotekoisissa olosuhteissa.

Yhdistelmä-DNA-geneettisten tekniikoiden soveltaminen on lisännyt yksittäisten kasvutekijöiden biologisten aktiivisuuksien ymmärtämistä'.: Esimerkiksi on saatu amino-10 happo- ja DNA-sekvenssit ihmisen erytropoietiinille (EPO), joka stimuloi punasolujen tuotantoa. (Katso Iin, US-patenttijulkaisu 4 703 008, joka sisällytetään täten viitteeksi) . Yhdistelmä-DNA-menetelmiä on samoin sovellettu cDNÄtn eristykseen ihmisen jyvässolupesäkkeiiä stimuloival-15 le tekijälle, G-CSF:lle (katso Sousa, U-S-patenttijulkaisu 4 BIO 643, joka täten sisällytetään viitteeksi), sekä ihmisen jyvässolu-makrofagipesäkkeitä stimuloivalle tekijälle (GM—CSF) [Lee, et ajL, Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 4 360 - 4364/ Wong, et ai., Science 228 (1985} 810 - 814], 20 hiiren G- ja GM-CSF:lie [Yokota, et ai., Proc.Natl.-Acad. Soi. USA 81 (1984) 1070; Fung, et ai., Nature 307 (1984) 233; Gough, et ai., Nature 309 (1984} 763], sekä ihmisen makrofagipesäkkeitä stimuloivalle tekijälle (CSF-1) [Kawasaki, et ai., Science 230 (1985} 291].

25 Määritys-systeemit, joissa määritetään runsaasti li sääntyviä, mahdollisen pesäkkeen muodostavia soluja (HPP-CFC-määrityssysteemit), testaavat tekijöiden vaikutusta varhaisiin hemätopoieettisiin kantaisäsoluihin [Zont, J.Exp.Med. 159 (1984) 679 - 690]. Kirjallisuudesta löytyy 30 lukuisia raportteja tekijöistä, jotka ovat aktiivisia HPP-CFC-määrityksessä. Näiden tekijöiden lähteet on mainittu taulukossa 1. Parhaiten karakterisoituja tekijöitä käsitellään alla.

Eräs aktiivisuus ihmispernalla käsitellyssä kasvu- j 35 alustassa on nimetty synergistiseksi tekijäksi (SF). Useat j ihmiskudokset sekä ihmisen ja hiiren soimiinjät tuottavat | j 3 SF:ää, jota kutsutaan SF-1:ksi, jolla on synergistinen vaikutus CSF-l:n kanssa varhaisimman HPP-CFC:n stimuloinnissa.

•SF-1: stä on raportoitu kasvualustassa, jota on käsitelty ihmisen pernasoluilla, ihmisen istukkasolui11a, 5637- 5 soluilla (rakkosyöpäsolulinja), ja EMT-6-soluilla (hiiren rintasyöpäsolulinja). SF-1:n identiteetti on toistaiseksi määrittämättä. Alustavat raportit osoittavat interleukiini-l:n limittyviä aktiivisuuksia SF-1:n solulinjasta 5637 kanssa [Zsebo et ai., Blood 71 (1988) 962 - 968]. Kuitenkin 10 lisäraportit ovat osoittaneet, että interleukiini-1:n (IL-l:n} ja CSF-1:n yhdistelmä ei kykene stimuloimaan samaa pesä kemuqdostusta kuin mikä voidaan saada CSF-1:n ja osittain puhdistettujen valmisteiden 5637:llä käsitellystä kasvualustasta kanssa (McNieee, Blood 73 (1989) 919].

15 Raskaana olevan hiiren kohdu-uutteessa läsnä oleva

synergistinen tekijä on CSF-1. WEHX-3-solut (hiiren myelo- I

monosyyttileukemiasolulinja) tuottaa synergististä tekijää, j joka vaikuttaa IL-3:en kanssa identtiseltä. Sekä CSF-1 että j IL-3 stimuloivat hematopoieetti. siä kantaisäsoluja, jotka 20 ovat kypsempiä kuin SF-1:n kohde.

Toisen synergistisen tekijäluokan on osoitettu olevan läsnä TC-l-soluilla (luuytimestä peräisin olevia perus- j kudossoluja} käsitellyssä kasvualustassa. Tämä sclulinja tuottaa tekijää, joka stimuloi sekä. varhaisia ydin- että 25 imukudossolutyyppejä. Se on nimetty heroolymfopoieettiseksi kasvutekijä-1:ksi (HLGF-1). Sen näennäinen molekyylipaino | on 120 000 [McNiece et ai, Exp.Hematol. 16 (1988) 383]. j

Tunnetuista interleukiineista ja CSF:istä XL-l:llä, f IL~3.:lla ja CSF-1: llä on tunnistettu olevan aktiivisuutta -j 30 HPP-CFC-määrityksessä. Muita synergistisen aktiivisuuden j lähteitä, jotka mainitaan taulukossa 1, ei ole rakenteelli- ij sesti tunnistettu. Polypeptidisekvenssin ja biologisen a k- ij tiivisuuden profiilin nojalla esillä oleva keksintö koskee j molekyyliä, joka poikkeaa IL-1:stä, IL-3:sta, CSF-1:stä ja j 35 SF-1:stä. j | | i 4

Taulukko 1

Valmisteita, jotka sisältävät HEP-CFC-määrityksessä aktiivisia tekijöitä 5 Lähde1 Viite

Ihmisperna-CM [Kriegler, Blood 60 (1962) 503]

Hiiriperna-CM [Bradley, Exp·.Hematol, Today,Baum, teini., 235 (1980)] 10 R.ottaperna~CM [Bradley, supra, (1980)]

Eiirikeuhko-CM [Bradley, supra, (1980)]

Ihmisistukka-CM: [Kriegler, supra, (1982)]

Raskaana olevan hiiren kohtu [Bradley, supra, (1980.)] 15 GTC-C-CM [Bradley, supra, (1980)] RH3-CM [Bradley, supra, (1980)] PHA-PBL [Bradley, supra, (1980)j WEHI-3B-CM [McNiece, Cell Biol.Int.Rep.6 (1982) 243] | 20 EMT-6-CM [MeMiece,Exp.Hematol. 15 (1987)854] j L-solu-CM [Kriegler, Exp.Hematol. 12 (1984)844] 5637-CM [Stanley, Cell 45 (1986) 667] TC-l-CM [Song, Blood 66 (1985) 273j 25 1 CM = käsitelty kasvualusta j |

Kun proteiineja annetaan ruoansulatuskanavan uiko- \ puolisesti, ne poistuvat usein nopeasti verenkierrosta ja j

30 voivat siksi synnyttää suhteellisen lyhytaikaisen Sarinako- I

logisen aktiivisuuden. Tästä seurauksena tarvitaan mahdol- | lisesti taajaan toistuvia ruiskeita bioaktiivisia prote- ij iineja suhteellisen suurina annoksipa terapeuttisen tehon j ylläpitämiseksi. Proteiineilla, joita on modifioitu kiin- ;| 35 riittämällä niihin kovaienttisesti vesiiiukodsia polymeerejä i| kuten polyetyleeniglykoli, polyetyleeniglykolin ja polypro- ij | \ :| 5 pyleeniglykolin kopolymeerit, karboksimetyylisellulopsa, deksträani, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrrolidoni tai polyprollini, tiedetään olevan vastaaviin ei-modifioituihin proteiineihin nähden oleellisesti pitempiä puoliintumisai-5 koje veressä laskimonsisäisenä ruiskeena annettuina [Abuchowski et ai., kirjassa "Enzymes as Drugs", Holcenberg et ai,, toim., Wi1ey-1n ters c ience, New York, NY, 1981, ss.

367 - 383; Newmark et ai., J.Appi.Blochem. 4 (1982) 185 — 189; ja Katre et a.1., Proc.Natl.Acad. Soi. USA 84 (1987} 10 1487 - 1491]· Tällaiset modifikaatiot saattavat niinikään lisätä proteiinin liukoisuutta vesiliuokseen, eliminoida aggregaatiota, tehostaa proteiinin fysikaalista ja kemiallista stäbiilisuytta sekä suuresti alentaa proteiinin irnrau-nogeenisyyttä ja antigeenisyyttä. Tästä tuloksena haluttuun 15 biologiseen aktiivisuuteen in vivo voidaan päästä antamalla tällaisia polymeeri-proteiiniadditiotuotteita harvemmin tai alhaisempina annoksina kuin ei-modifioitua proteiinia.

Polyetyleeniglykolin (PEG·;:hl kiinnittäminen proteiineihin on erityisen käyttökelpoista, koska PEG;n myrkyl-20 1isyys nisäkkäissä on hyvin alhainen [Carpenter et ai. , Tö-x i co1. Appi. Phä rma o o1. 18 (1971) 35 - 40] . Esimerkiksi adenosiinideaminaasin PEG-additiotuote hyväksyttiin Yhdysvalloissa käytettäväksi ihmisillä vakavan yhdistetyn immuunikato-oireyhtymän hoidossa. PEG konjugoimalla saavutet-25 tava toinen etu on, että vähennetään tehokkaasti heterolo-gisten proteiinien immunogeenisyyttä ja antigeenisyyttä:.

Esimerkiksi ihmisproteiinin PEG-additiotuote saattaisi olla käyttökelpoinen sairauden hoitamiseksi muissa nisäkäslajeissa ilman vaaraa vakavan immuunivasteen laukaisemisesta. j 30 Polymeerejä kuten PEG:tä voidaan kiinnittää käte västi yhteen tai useampaan reaktiiviseen aminohappotähteeseen proteiinissa, kuten aminopään aminohapon alfa-aminoryhmä, lysiinisivuketjujen epsi lon - amino ryhmät :r kyste-iinisivuketjujen sulfhydryyliryhmät, aspartyyli- ja gluta-35 myylisivuketjujen karboksyyliryhmät, karboksyylipään aminohapon alfa-karboksyyliryhmä, tyrosiinisivuketjut, tai tiet- 6 tyihin asparaefiini-, seriini- tai treoniinitahteisiin kiinnitettyjen glykosyyliketjujen aktivoituihin johdannaisiin.

PEG:n lukuisia aktivoituja muotoja, jotka soveltuvat suoraan reaktioon proteiinien kanssa, on kuvattu. Käyt- 5 tökelpoisia PEG-teagensseja reaktioon proteiiniamlnoryhmien kanssa ovat karboksyylihappo- tai karbonaattijohdannaisten, aktiiviset esterit, erityisesti ne, joissa poistuvat ryhmät ovat N-hydroksisukkiniitildejM, p-nitrofenoleja, imidatsoleja tai l--hydroksi-2-nitrobentseeni-4-suXf onaatte j a. PEG- 10 johdannaiset,, jotka sisältävät maleimido- tai halo-geeniasetyyliryhmiä, ovat käyttökelpoisia reagensseja proteiinin vapaiden sulfhydryyliryhmien modiftoimiseksi. Samoin PEG-reagenssit, jotka: sisältävät amino-, hydratsiini-tai hydratsidiryhmiä, ovat käyttökelpoisia reaktioon alde-15 hydien kanssa, jotka on muodostettu proteiinien hiilihydraatti ryhmien perjodaattihapetuksellä.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyt- ; tööh tekijä, joka aikaansaa varhaisten hematöpoieettisten j kantaisäsolujen kasvua.

20 Keksinnön yhteenveto

Keksinnön kohteena on nisäkkään yhdistelmäsolu jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Esillä olevassa häkemuksesss kuvataan uusia tekijöitä, joita kutsutaan tässä: ^kantasolutekijöiksi'’ (SCF), jot-25 ka kykenevät stimuloimaan alkukantaisten: kantaisäsolujen, mukaan lukien varhaiset hematopoieettiset kantaisäsolut, kasvua. Nämä SCF:t kykenevät myös stimuloimaan ei-hemätopoieettlsia kantaSöluja kuten hermokantasoiut ja varhaiset sukusolukantasolut. Tällaisia tekijöitä ovat puhdts- j 30 tetut luontaisesti esiintyvät kantasolutekijät. Tässä kuva- | taan samoin ei-luontaisestl esiintyviä polypeptidejä, joi- | den aminohapposekvenssit jäljittelevät riittävästi luontai-sesti esiintyvän kantasolutekijän sekvenssiä, jotta niillä j on luontaisesti esiintyvän kantasoluteki jän hemätopoieetti- 35 nen biolooinen aktiivisuus. 1 j ] | 7

Esillä olevassa hakemuksessa esitetään edelleen eristettyjä DNA-sekvenssejä käytettäviksi sellaisten poly-peptidituotteiden ilmennyksen prokaryoottisissa tai euka-ryoottisissa isäntäsoluissa varmistamiseksi, joiden amino-5 happosekvenssit jäljittelevät riittävästi luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän sekvenssiä, jotta niillä on luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen aktiivisuus. Tällaisia DNA-sekvenssejä ovat: (a) DNA-s e k vens s i t, jotka esitetään kuvioissa 14B, 10 14C, 15B, 15C, 42 ja 44, tai säikeet, jotka ovat niihin nähden komplementaarisia; (b) DNA-s e kvens s i t, jotka hybridisoituvat kohdassa (a) identifioituihin DNA-sekvensseihin, tai niiden frag-mentteihin; ja 15 (c) DNÄ-sekvenssit, jotka ellei geneettinen koodi olisi degeneratiivinen hybridisoituisivat kohdissa (a) ja (b) määriteltyihin DNA-sekvensseihin.

Samoin kuvataan vektoreita, jotka sisältävät täi- i laisia DNA-sekvenssejä sekä isäntäsoluja, jotka on trans-20 formoitu tai transfektoitu tällaisilla vektoreilla. Kuvaukseen kuuluu niinikään menetelmiä SCF:n tuottamiseksi yhdis-telmä-DNÄ-tekniikoilla, sekä menetelmiä: häiriötilojen hoitamiseksi, Lisäksi esitetään farmaseuttisia: koostumuksia, jotka sisältävät SCF;ää, sekä vasta-aineita, jotka sitoutu-25 vat SCF:ään spesifisesti.

Tässä esitetään edelleen menetelmää kantasolutekijän tehokkaaksi talteen ottamiseksi SGFiää sisältävästä materiaalista, jolloin menetelmä käsittää vaiheinaan ionin-vaihtokromatografisen erotuksen ja/tai käänteisfaasineste-30 kromatografisen erotuksen. f

Esillä olevaan kuvaukseen kuuluu myös biologisesti ij aktiivinen additiotuote, jolla on aiempaa pitempi puoliin- j

tumisaika in vivo sekä tehostunut teho nisäkkäissä, ja joka J

käsittää SCF:n kovalenttisesti konjugoituna vesiliukoiseen ,| 35 polymeeriin kuten polyetyleeniglykoliin tai polyetyleeni- | glykolin ja polypropyleeniglykolin kopolymeereihin, jolloin j ] $ | -¾ | 8 mainittu polymeeri on ei-substituoitu tai substituoitu toisessa päässä alkyyliryhmäilä. Seuraaja näkökohta on menetelmä edellä kuvatun additiotuotteen valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan SCF saatetaan reagoimaan vesiliukoisen 5 polymeerin kanssa, jossa on ainakin yksi reaktiivinen ryhmä päässä, ja saatu additiotuote puhdistetaan tuotteen saamiseksi, jolla on pidentynyt puoliintumisaika verenkierrossa sekä tehostunut biologinen aktiivisuus.

Lyhyt kuvaus piirroksista 10 Kuvio 1 on anioninvaihtokromatogrammi nisMkäs-SCFrn puhdi stuks es t a.

Kuvio 2 on geelisuodatuskromatogrammi nisäkäs-SCF:n puhdistuksesta.

Kuvio 3 on vehnänalkioaggiutiniini-agaroosikroma-15 togrammi nisäkäs-SCF:n puhdistuksesta.

Kuvio 4 on kationinvaihtOkromatögrarami nisäkäs-SCF: n puhdistuksesta,

Kuvio 5 on C^kromatograrnirii nisäkäs-SCF: n puhdistuksesta.

20 Kuviossa 6 esitetään natriumdodesyylisulfaatti- (SDS-) polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) (SDS-PAGE) kuvion 5 mukaisista Ci-kolonnifraktioista.

Kuvio 7 on analyyttinen C4-kromatogrammi nisäkäs- SCF: stä.

25 Kuvio 8 esittää SDS-PAGE:ea kuvion 7 mukaisista C,5- kolonnifraktioista.

Kuviossa 9 esitetään SDS-PAGE puhdistetusta nisäkäs-SCF: stä ja deglykosyloidusta nisäkäs-SCF:stä.

Kuvio 10 on analyyttinen C4~k.romatogrammi puhdiste-3Q tusta nisäkäs-SCF:stä.

Kuviossa 11 esitetään prot e i ini s e kvent o i n ni1la saatu nisäkäs-SCF:n aminohapposekvenssi. s * “ |

Kuviossa 12 esitetään j Ä. oligonukleotideja rotan SCF-cDNA: lie 35 B.: oligonukleotideja ihmisen SCF-DNA: lie j .1 j 9 C. yleisiä oligonukleotideja.

Kuviossa 13 esitetään A, kaavio rotan SCF~cDNÄ:n vahvistamiseksi polyme-raasiketjureaktiolla (FCR) 5 B, kaavio ihmisen SCf-cDNÄ::n vahvistamiseksi PCR:11ä.

Kuviossa 14 esitetään A. sekventoihtistrategia rotan genomi-DNÄ:lie B. rotan genomi-DNA: n. nukieiinihapposekvenssi 10 C. rotan SCF-cDNÄ:n nukieiinihapposekvenssi seka rotan SCF-proteiinin aminohapposekvenssi.

Kuviossa 1,5 esitetään A, strategia ihmisen genomi-DNA:n s.ekvehtöimiseksi B. ihmisen genomi-DNA;n nukieiinihapposekvenssi j 15 C. ihmisen SCF-cDNA:n yhdistetty nukleiinihappose- | kvenssi sekä SCF-proteiinin aminohapposekvenssi. j

Kuviossa 16 esitetään ihmisen, apinan, koiran, hiiren ja rotan SCF-proteiinien rinnakkain asetetut aminohapposekvenssit.

20 Kuviossa 17 esitetään nisäkässoluilmennysvektorin VI9.8-SCF rakenne.

Kuviossa 18 esitetään nisäkäs-GHO-soluilmennys- 1 vektorin pDSVE.l rakenne. f

Kuviossa 19 esitetään Eh_ col i -ilmennysvektörin | 25 pCFM1156 rakenne. |

Kuviossa 20 esitetään I

Ά. nisäkäs-SCF:n radioimmuunimääritys j B, SDS-BAGE immuunisaostetusta nisäkäs-SC;F:stä. j .... ·]

Kuviossa 21 esitetään Western-analyysi yhdistelmä- | 30 DNA-ihmis-SCF;stä. |

Kuviossa 22 esitetään Western-analyysi yhdistelmä- j DNA-rotta—SCF:stä. ]

Kuvio 23 on pylväskuvaaja, joka esittää COS-1- j soluissa tuotetun yhdistelmä-DNA-rotta-SGFin vaikutuksen !

35 luuydinsiirtoon. J

10

Kuvio 24 esittää yhdistelraä-DNA-rotta-SGF:n vaikutuksen Steel-hiirten makrosyyttisen anemian parantamiseen.

Kuviossa 25 esitetään aäreisveren valkosolulukua (WBC) Steel-hiiriilo, joita on hoidettu yhdisteImä-DN A-5 rotta-SCF:llä.

Kuviossa 26 esitetään verihiutalelukuja Steel-hiirille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:llä.

Kuviossa 27 esitetään differentiaalinen WBC-luku

Steel-hiirille, jolta on hoidettu yhdistelmä-DNA-rptta-10 SCF1'16'!-PEG25: llä.

Kuviossa 28 esitetään imusolualasarjät Steel-hii rille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1-16*-PEG25:llä.

Kuviossa 29 esitetään yhdisteimä-ONÄ-ihmissekvens- j 15 si-SCF-hoidon vaikutus normaaleihin kädellisiin ääreisveren | WBC-luvun lisäämisessä. |

Kuviossa 3.0" esitetään yhdisteimä-DNA-ihmissekvens— | si-SCF-hoidon vaikutus normaaleihin kädellisiin hematc— s kriitti- ja verihiutalelukujen lisäämisessä. j 20 Kuviossa 31 esitetään valokuvia j A. ihmisen luuydinpesäkkeistä, joita on: stimuloitu ] yhdi s t elmä - DNA- ihmi s - SGF1_1°2; 11 a ] B. Wright-Giemsa~värjättyjä soluja kuvion 31 A mu- f kaisista pesäkkeistä. | 25 Kuviossa 32 esitetään BBS-PAGE kuviossa 33 esitetyn kromatogrämmin S-S ep h ar o s e-k o1onni f ra kt i o i st a A. pelkistintä käytettäessä B. ilman pelkistintä.

Kuvio 33 on kromatog rämmi E>. coli -perälsen yhdis-30 telmä-DNÄ-ihmis-SCF:n S-Sepharose-kolonnista...

Kuviossa 34 esitetään SDS-PAGE kuviossa 35 esitetyn ’ kromatogtammin C4-koionnifraktioista j A. pelkistintä käytettäessä j B. ilman pelkistintä, ] 35 Kuvio 35 on kromatograremi Jh_ coli -peräisen yhdis- | telmä-DNÄ-ihmis-SCF:n C4” kolonnista.. \ | 11 •KUylo 36 on kromatogrämmi CHO-peräisen yhdistelmä-DNA-xotta-SCF: n Q-Sepharose-kolonnista.

Kuvio 37 on kromatogrammi CHO-peräisen yhdiskelmä-DNA-rotta-SCF:n C4-kolonnista.

5 Kuviossa 38 esitetään SDS-PAGE kuviossa 37 esitetyn kr omat o g r amm in C ,1 - k o 1 o n n i f r a k t i o i s t a.

Kuviossa 39 esitetään SDS-PAGE puhdistetusta CHO-peräisestä yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:stä ennen deglykosylaa-Liota ja tämän jälkeen.

10 Kuviossa 40 esitetään A. geelisuodatuskxoiriatograf ia pegyloidusta yhdiste lmä - DNA- ro 11 a - S C F1 ~104 - rea, k t i o s e okses t a B. ge e i i s u odatus kromato g r afia yhdistelmä-DNA-rott a-SCF1"*—: stä.,· jota ei ole modifioitu.

15 Kuviossa 41 esitetään leimatun SCF:n. sitoutuminen, tuoreisiin leukemiaemosoluihin.

Kuviossa 42 esitetään ihrais-SCF-cDNA-sekvenssi, joka on saatu HTl080-fibrosarkoomasolulinjaata.

Kuviossa 43 esitetään autoradiokuva CQS-7-soluista, 20 jotka ilmentävät ihmis-SCF1-248: n, ja CHO-soluista, jotka ilmentävät ihmis-SCF1"'16'3: n.

Kuviossa 44 esitetään i hm.i. s - SC F- c DNA- s e kvens s i, joka on saatu 5637-rakkosyöpäsolulinjasta,

Kuviossa 45 esitetään säteilyä saaneiden hiirten 25 lisääntynyt eloonjäänti SCF-hoidon jälkeen.

Kuviossa 46 esitetään säteilyä saaneiden hiirten lisääntynyt eloonjäänti luuydinsiirteen vastaanoton jälkeen käytettäessä 5 % reisiluuta sekä SCF-hoitoa.

Kuviossa 47 esitetään säteilyä saaneiden hiirten j 30 lisääntynyt elöönjäänti luuydinsiirteen vastaanoton jälkeen | käytettäessä 0,1 ja 20 % reisiluuta sekä SCF-hoitoa.. j

Keksinnön lukuisia näkökohtia ja etuja tulee ilmei- \ siksi alan ammattilaisille heidän tutustuessaan seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen, jossa esitetään havainnoi- j 35 l.istuksia keksinnön käytännöstä sen tällä hetkellä edulli- j sinä pidetyissä suoritusmuodoissa. j : Ä 12

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä

Esillä; olevan ikuvauksen mukaan annetaan käyttöön uusia kantasDlutekijöItä ja tällaiset SCF:t kokonaisuudessaan tai osittain koodattavia 'DNA-sekvenssejä. Ilmaisulla 5 "kantäsolutekijä" tai "SCF" tarkoitetaan tässä käytettynä luontaisesti esiintyvää SCF:ää (esim. luontainen ihmis-SCF) sekä ei-luontaisesti esiintyviä (eli luontaisesti esiintyvistä poikkeavia) polypeptidejä, joiden aminohapposekvenssit ja glykosylaatio jäljittelevät riittävästi luontaisesti 10 esiintyvän kantasolutekijän vastaavia, jotta niillä on luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän heraatopoieettinen biologinen aktiivisuus. Kantasolutekijä kykenee stimuloimaan varhaisten hematopoieettisten kantaisäsölujen kasvua, jotka kykenevät kypsymään punasoluiksi, megakaryosyyteiksi, 15 jyvässöluiksif imusoluiksi ja makrofagisoluiksi. Nisäkkäit- | ten hoidosta SCF:llä seuraa absoluuttisia lisäyksiä sekä j ydin- että imusolulinjojen hematopoieettisten solujen mää- | rissä. Kantasolujen yksi leimaava ominaisuus on niiden kyky \ differentioitua sekä ydin- että imusoluiksi [Weissman, j

20 Science 241 (1988) 58 - 62] . Steel-hiirien käsittely (esi- I

merkki 8B) yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:llä johtaa lisäyksiin jyvässolujen, mcnosyytticn, punasolujen, imusolujen ja ve- | rihiutaleiden määrissä. Normaalien kädellisten käsittely f yhdistelmä-DNÄ-ihmis-SCF:llä johtaa ydin- ja imusölumäärien 25 lisäyksiin (esimerkki 8C). f

SCF:n ilmentävät sikiötasolla melaniinivarhaissolu- I

jen vaellusreitin ja kotiutuskohtien solut, sukusolut, ve- j renrauodostussolut sekä aivot ja selkäydin. il

Varhaiset hematopoieettiset kantaisäsolut rikastu-30 vat 5-fluoElurasiiiiiia (5-FU:lla) käsiteltyjen nisäkkäit- J

ten luuytimeen. Kemoterapeuttinen lääke 5-FU kuluttaa se- | lektiivisesti myöhäisiä hematopoieettisia kantaisäsoluja. j SCF on aktiivinen luuytimessä, jota on käsitelty 5-FU:11a. j

SCF:n biologinen aktiivisuus sekä sen kudosjakauma- I

35 kuvio todistavat sen keskeistä roolia sikiökehityksessä se- 1 ] ] s :·§ 1 -¾ 13 kä verenmuodostuksessa sekä sen mahdollisuuksia erilaisten kantaisäsoluvajauksien hoidossa.

Esillä oleva kuvaus antaa käyttöön DNÄ-sekvenssejä, joihin sisältyy: sellaisten Radonien mukaanotto, jotka Ovat 5 "edullisia" valituissa ei—nisäkäsisännissä ilmennettäyiksi; varustus kohdilla pilkottaviksi restriktioendonukleaaslentsyymeillä·:;· sekä varustus ylimääräisillä alku-, päätös- tai väll-DNÄ-sekvehsseillä, jotka helpottavat helposti ilmennettävien: vektorien rakentamista. Esillä oleva keksintö an-10 taa niinikään käyttöön DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat SCF: n polypeptidianalogeja tai johdannaisia, jotka poikkeavat luontaisesti esiintyvistä muodoista yhden tai useamman aminohappotähteen identiteetin tai sijaintikohdan osalta | (eli deleetioanalogit, jotka sisältävät Vähemmän kuin -kaik- j 15 ki SCF:lle spesifioidut tähteet; substituutioanaiogit, | joissa yksi tai useampi spesifioiduista tähteistä on korvattu muilla tähteillä; sekä additioanalogit, joissa yksi | tai useampi aminohappotähde on lisätty osaan polypeptidin f päässä tai keskellä), ja joilla on yhteisenä joitakin luon- | 20 taisesti esiintyvien muotojen ominaisuuksista tai ne kaikki. Esillä oleva kuvaus antaa spesifisesti käyttöön DNA- \ sekvenssejä, jotka koodittavat täysimittaisen ei-proses-soidun aminohapposekvenssin, sekä DMA- se-kv ens.se j S, jotka i koodittavat SCF:n prosessoidun muodon.

25 Uusiin kuvauksen mukaisiin DNÄ-sekvensseihin lukeu- I

.j tuu sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia sellaisten po~ | Λ lypeptidituotteiden ilmennyksen prokaryoottisissä tai eufca- | ryoot.tisissa isäntä soluissa va rmi st anti seksi,. joilla on ainakin osa luontaisesti esiintyvän SCF:n primaarirakennekon-30 formaatiosta ja yksi tai useampi sen biologisista ominaisuuksista. Kuvauksen mukaiset DMA-sekvenssit käsittävät spesifisesti: (a) DNA-sekvenssitr jotka esitetään kuvioissa 143, 14C, 15B, 15C, 42 ja 44, tai niiden komplementti i- säikeet; (b) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat (hybri-35 disaatio-olosuhteissa, jotka julkistetaan esimerkissä 3, tai ankarammissa olosuhteissa) kuvioissa 14B, 14C, 15B, :i 14 15C, 42 ja 44 esitettyihin DNA-sekvensseihih tai niiden fragmentteihin; sekä (c) DNA-sekvenssit, jatka ellei geneettinen koodi olisi luonteeltaan degeneroituva, hybridi-soituisivat kuvioissa 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ja 44 esitet-5 tyihiri DNA-sekvensseihin. Spesifisesti kohtiin {b} ja (c) sisältyvät genomi-DNA-sekvenssit, jotka koodit tavat SCF: n alleelisia varianttimuotoja, ja/tai koodittavat SCF: ää muista nisäkäslajeista, sekä valmistetut DNA-sekvenssit, jotka koodittavat SCF:ää, SCF—fragmentteja ja SCF- 10 analogeja. DNA-sekvenssit saattavat sisältää kodoneja, jotka helpottavat lähetti-RNA:h kopiointia ja luentaa mikro-bi^isännissä. Tällaisia valmistettuja sekvenssejä voidaan rakentaa helposti A.1 tönin et ai., PCT-patenttihakemus-julkaisu WÖ 83/04053, menetelmien mukaan.

15 Esillä olevan kuvauksen toisen näkökohdan: mukaan tässä kuvatut DNA-sekvenssit, jotka koodittavat polypepti-dejä, joilla on SCF-aktiivisuutta, ovat arvokkaita nisäkäs-proteiinin aminohapposekvenssistä antamansa sellaisen informaation vuoksi, jota ei tähän asti ole ollut saatavana.

20 DNA-sekvenssit ovat samoin arvokkaita tuotteina, jotka ovat | käyttökelpoisia suoritettaessa SCF-synteesi suuressä mitta-kaavasaa erilaisi11a yhdi s t eImä-DNA-te kni i koi11a. Toisin sanottuna DNA-sekvenssit, jotka kuvaus antaa käyttöön, ovat käyttökelpoisia muodostettaessa uusia ja käyttökelpoisia 25 viraälisia ja renkaan muotoisia plasmidi-DNA-vektoreita, uusia ja käyttökelpoisia transformoituja ja transfektoituja prokaryoottisia ja eukäryoottisia isäntäsoluja (mukaan lukien bakteeri- ja hiivasolut sekä nisäkässolut, jotka on kasvatettu viljelmänä) sekä uusia ja käyttökelpoisia mene- | 30 telmiä tällaisten isäntäsolujen kasvattamiaeksi viljelmänä, | jotka kykenevät ilmentämään SCF:n ja: sen sukulaistuotteita. |

Kuvauksen mukaiset DNA-sekvenssit ovat samoin sopi- j via materiaaleja käytettäviksi leimattuina koettamina eris-tehtäessä SCF:ää koOdittavaa ihmisgenomi-DNA:ta ja muita, | 35 sukulaisproteiinien geenejä sekä eDNA- ja genomi-DNÄ-sek- venssejä muille nisäkäslajeille. DNA-sekvenssit saattavat: j 4 i ;] 4¾ 15 niinikään olla käyttökelpoisia proteiinisynteesin erilaisissa 'vaihtoehtoisissa menetelmissä {esim. hyönteissolutj tai ihmisten tai muiden nisäkkäitten geeniterapiassa. Keksinnön: mukaisten DNA-sekvenssien odotetaan olevan käyttö-5 kelpoisia transgeenisten nisäkäslajien kehityksessä, jotka voivat toimia eukaryoottisina ’'isäntinä" SCF: n ja SCF-tuotteiden tuottamiseksi määrinä;. Katso yleisesti Palmiter et _ajL·, Science: 222 (1983) 809 - 814.

Esillä oleva kuvaus antaa käyttöön puhdistettua ja 10 eristettyä luontaisesti esiintyvää SCFrää (eli puhdistettuna luonnosta tai valmistettuna siten, että primaari-, sekundaari- ja tertiaarikonformaatio sekä giykosylaatiokuvio ovat identtiset luontaisesti esiintyvään materiaaliin näh- j denj , sekä ei-luontaisesti esiintyviä polypeptideja, joiden j 15 primaarirakennekonformaatio (eli aminohappotähteiden jatku- ( va sekvenssi) ja glykosylaatio jäljittelevät riittävästi j luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän vastaavia, jotta f niillä on luontaisesti esiintyvän SCF:n hematopoieettinen biologinen aktiivisuus. Tällaisiin polypeptideihin luetaan 20 johdannaiset ja analogit.

Edullisessa suoritusmuodossa SCF on tunnusoraaisesti tuote, joka on saatu ilmentämällä prokaryoottlsessa tai eu-karyoottisessa isännässä (esim. bakteeri-, hiiva-, korkeampi kasvi -, hyönteis- ja nisäkässoluissa viljelmässä) ekso- j 25 geenisiä DNA-sekvenssejä:, jotka oh saatu genomi- tai c'DNA- | kloonauksella tai geenisynteesillä. Toisin sanoen edulli- | sessa suoritusmuodossa SCF on "yhdistelmä-SGF". Ilmennys-tuotteiden tyypillisissä hiiva- (esim. Saccharomyces cere- :j visiae -) tai prokaryoottisissä (esim. E. coli -) isän- | - : | 30 täsoluissa yhteydessä ei esiinny mitään nisäkäsproteiineja. j

Ilmennystuotteiden selkarankais- [esim. ei-ihmisnisäkäs- j (esim. COS- tai CHO-) ja lintu-] soluissa yhteydessä ei j j esiinny mitään ihmisproteiineja. Riippuen käytetystä isän- j nästä keksinnön mukaiset polypeptidit voivat olla gly- j 35 kosyloituja nisäkäs- tai muilla eukaryoott.isilla hiillhyd- | raateilla tai ne voivat olla ei-glyfoosyloituja. Isäntä-solua j $ 16 voidaan muuttaa käyttämällä sen kaltaisia tekniikoita kuin kuvataan julkaisussa Lee et ai., J.Biol.Chem. 264 {1989) 13848, joka täten sisällytetään viitteeksi, Kuvauksen mukaiset poiypeptidit voivat niinikään sisältää alkumetionii-5 niaminohappotähteen (asemassa -1).,

SCF:n luontaisesti esiintyvien alleellisten muotojen lisäksi esillä oleva keksintö kattaa niinikään muita SCF-tuotteita kuten seF:n polypeptianalogit. Tällaisiin analageihih lukeutuu SCF-fragmentteja, Seuraamalla menettele) lyja edellä mainitussa Ältonin et ai. patenttihakemus julkaisussa (W0 83/04053} voidaan helposti suunnitella ja valmistaa geenejä, jotka köödittavat: sellaisten polypeptidien mikrobi-ilmennystä, joiden primaarikanformaatiat poikkeavat tässä spesifioidusta yhden tai useamman tähteen identitee-15 tin tai sijaintikohdan osalta (esim, substituutiot, lisäyk- J

set ja deleetiot päässä ja .kaskellä). Vaihtoehtoisesti j cDNA- ja genomigeenejä voidaan vaikeuksitta modifioida hy- |

vin tunnetuilla paikkaohjatun mutatoinnin tekniikoilla, I

jolloin modifikaatioita Voidaan käyttää SCF-analogien ja | 20 -johdannaisten muodostamiseksi. Tällaisilla tuotteilla on yhteisenä ainakin yksi SCF:n biologinen ominaisuus, mutta ne voivat erota muiden osalta. Esimerkkeinä kuvauksen mukaisiin tuotteisiin kuuluvat tuotteet, joita on lyhennetty j

esim. deleetloilla; tai tuotteet, jotka ovat hydrolyysin J

25 suhteen stabiilimpia (ja joilla siksi voi olla selvempää |

tai pitkäaikaisempia vaikutuksia kuin luontaisesti esiinty- I

villa tuotteilla); tai joita on muutettu yhden tai useamman j mahdollisen O-glykosylaatio- ja/tai N-glykosylaatiokeskuk--· | sen dele t-o imi se k s i tai lisäämiseksi, tai joissa yksi tai :| 30 useampi kysteiinitähde: on deletoitu tai korvattu esim. ala- ] niini- tai seriinitähtelllä, ja jotka ovat mahdollisesti j helpommin eristettävissä aktiivisessa muodossa mikrobisys- 1 teemeistä; tai joissa yksi tai useampi tyrosiinitähde on ] korvattu fenyylialaniinillä. ja jotka sitoutuvat helpommin j \ 35 tai aiempaa vähemmän helposti kohdeprotaiineihin tai resep- | toreihin kohdesolujen pinnalla. Samoin mukaan kuuluvat po- | 17 lypeptidifragmentit, jotka jäljittelevät vain osaa SCF:ään sisältyvästä jatkavasta aminohapposekvenssistä tai siihen sisältyvistä sekundaarikonformaatioieta, ja joilla fragmenteilla voi olla yksi SCF:n ominaisuus (esim, resepto-5 risitöutuminen): eikä muita (esim:, varhaisen hematopoieetti-sen solun kasvuaktiivisuus). Huomattakoon, että aktiivisuus ei ole välttämätöntä millekään yhdelle tai useammalle keksinnön mukaiselle tuotteelle, jotta sillä olisi terapeuttista käyttöä [katso Welland et ai., Blut 44 (1982) 173 - 10 175] tai käyttöä muissa yhteyksissä, kuten SCF-antago- nismimäärityksissä. Kilpailevat antagonistit saattavat olla varsin käyttökelpoisia esimerkiksi tapauksissa, joissa esiintyy SCF:n liikatuotantoa, tai ihmisen leukemiatäpauk-sissa, joissa pahanlaatuiset solut ilmentävät liian run-15 säästi SGF-reseptoreita, kuten ilmenee SCF-reseptorien liian voimakkaasta ilmennyksestä leukemiaemosoluissa (esimerkki 13) .

Kuvauksen mukaisiin polypeptidianäiogeihin voidaan soveltaa raportteja sellaisten synteettisten peptidien im-20 munologisesta ominaisuudesta, jotka oleellisesti jäljittelevät luontaisesti esiintyvissä proteiineissa, glykoprote-iin.eis.sa ja nukleoproteiineissa olemassa Olevaa aminohap- | pQsekvenssiä:. Spesifisemmin polypeptidien., joiden molekyy-lipsinö on suhteellisen alhainen, on osoitettu osallistuvan 25 immuunireaktioihin, jotka ovat kestoltaan ja laajuldeltaan samanlaisia kuin fysiologisesti merkittävien proteiinien kuten vifusa.ntlgeenleri, polypeptidihormonien ja muiden samankaltaisten immuunireaktiot. Tällaisten polypeptidien im- j muunireaktioihin lukeutuu spesifisten vasta-aineiden mu o- j 30 dostuksen indusointi inimuno log is e st i aktiivisissa eläimissä | [Lerner et ai. , Cell 23 (1981) 309 - 310; Ross et ai. , Ma- | ture 294 (1981) 654 - 656; Walter et ai., 1

Proc.Na 11,Äead.Sei.USA 77 (1980) 5197 - 5200; Lerner et I

ai., Prop..Mäti.fteael. Sei.USR 76 (1981) 3403 - 3407; Walter { 35 et ai., Proc.Natl,Äcad,Sei.USA TQ (1981) 4882 - 48:86; Wong j et ai., Proc.Natl.Acad.Sei,USA 79 (1982) 5322 - 5326; Baron j 18 et ai., Cell 2;8 (1982 ) 395 - 404; Dressman el ai., Nature 295 (1982) 185 - 160; ja Lerner, Scientific American 248 (1983) 66 - 74] , Katso myös Kaiser et ai. [Science 223 (1984) 249 - 255]/ joka koskee sellaisten synteettisten 5 peptidien biologisia ja immunologisia ominaisuuksia, joilla: likimäärin on yhteisiä sekundaarirakenteita peptidihormoni-en kanssa, mutta joilla ei ole näiden kanssa yhteistä primaari rakenne konformaatiota.

Esillä olevaan kuvaukseen kuuluu niinikään se poly-10 pep t i d i1uo k ka, jonka koodattavat sellaiset osat DNA:sta, jotka ovat komplementaarisia SCF: n ihmisen cDNA- tai gepor mi-DNA-sekvenssien proteiinikoodisäikeelle, eli "komplementaariset kääntyneet proteiinit", kuten kuvaajat Tfamontano et ai. [Nucleic Acids Res.: 12 (1984} 504 9 - 5059] .

15 Edustavia esillä olevan kuvauksen mukaisia SCF- polypeptidejä ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta SCF1-148, SCF1"162, SCF1'164, SCF1'165 ja SCF1"183 kuviossa 15C; | SCF1'"185, SCF1"108, SCF1"10® ja SCF1"248 kuviossa 42; ja SCF1'157, SCF1"1®, SCF1-161 ja SCF1"220 kuviossa 44.

20 SCF voidaan puhdistaa käyttäen alan ammattilaisille tuttuja tekniikoita. Tämä kuvaus käsittää menetelmän SCF:n puhdistamiseksi SCF:ää sisältävästä materiaalista, kuten käsitelty kasvualusta tai ihmisen virtsa, seerumi, jolloin menetelmä käsittää yhden tai useamman seuraavan kaltaisen 25 vaiheen: SCF-pitoisella materiaalilla suoritetaan ionin- vaihtokromatografia (joko kationin- tai anioninvaihtokroma-tografia); SC-F-pitoisella materiaalilla suoritetaan kään-teisfaasinestekromatograf inert erotus, jossa käytetään esi” merkiksi iimnobilisöitua C4- tai Ce-hartsia; nesteellä suo- j

30 ritetaan immobilisoitu-lektiini -kromatografia, eli SCF si- J

dotaan immobilisoituun lektiiniin ja eluoidaan käyttäen so- il keriä, joka kilpailee tästä sitoutumisesta. Yksityiskohdat j näiden menetelmien käytöstä ilmenevät selvästi kuvauksista, j jotka esitetään esimerkkien 1, 10 ja 11 mukaisissa kuvauk- | 35 slssa: SCF:n puhdistuksesta. Esimerkissä 2 kuvatut tekniikat ]

Lain et ai, US-patenttijulkaisussa 4 667 016, jotka täten $ >1 19 sisällytetään viitteeksi, ovat samoin käyttökelpoisia kan-tasolutekijän p uhd i s t uks e s s a, SCF:n isofarmit eristetään käyttäen vakiotekniikpi-ta, kuten tekniikoita, jotka esitetään yhteisesti oiriiste-5 tussa US—patentissa 5 856 298 "Erythropoietin Isoforms" (suon·. "Erytropoietiiniisofarmit") , joka jätettiin 13. lokakuuta, 1989, ja sisällytetään täten viitteeksi.

Samoin kuvaukseen kuuluu farmaseuttisia koostumuksia, jotka käsittävät terapeuttisesti tehokkaita määriä 10 keksinnön mukaisia polypeptidituotteita yhdessä sopivien, SCF-terapiassa käyttökelpoisten laimeniimien, säilytysai-neiden, liukenemista edistävien aineiden, emulgaattorien, lisäaineiden ja/tai kantajien kanssa. Tässä käytettynä "terapeuttisesti tehokkaalla määrällä" tarkoitetaan määrää, 15 jolla saadaan terapeuttinen vaikutus tiettyyn tilaan ja i tietyllä anto-ohjelmalla. Tällaiset koostumukset ovat nes- j teitä tai kylmäkuivattuja tai muutoin kuivattuja koostumuk- j siä ja niihin sisältyy laimentimia, joiden puskurisisältö j (esim. Tris-HCl, asetaatti, fosfaatti) , pH ja ioni vahvuus·. j 20 vaihtelevat, lisäaineita kuten albumiini tai gelatiini ad- f sorption pintoihin estämiseksi, pesuaineita (esim. Tween j

20, Tween 80, Pluronic F68, sappihapposuolat}, liukenemista I

edistäviä aiheita (esim. glyseroli, polyetyleeniglykoli}, f hapetuksenestoaineita (esim. askorbiinihappo, natriummeta- j

25 bisulfiitti), säilytysaineita (esim. Thimerosai, bentsyyli- I

alkoholi, pärabeenit), täyteaineita tai toonisuutta modi- ] fioivia aineita (esim. laktoosi, ..mannitol i), polymeerejä j kuten polyetyleeniglykoli kovalenttisesti proteiiniin kiin- | eitettyinä (mitä kuvataan esimerkissä 12 alla), kompleksoi- 1 30 tuja metalli-ioneja, tai materiaali on voitu sisällyttää j polymeeristen yhdisteiden kuten poiymaitohapon, polyglyko- 1 lihapon, hydrogeelin jne. h i u k kasvaImi s te i s i i n ja näiden j pinnalle, tai liposomeihin, mtkroemulsioiksi, miselleihin^ | yksilamellaarisiin tai monilamellaarisiin rakkuloihin, vä- j 35 rittömiin punasoluihin tai sferopiasteihin. Tällaiset koos tumukset vaikuttavat in vivo -vapautumisen fysikaaliseen 20 tilaan, liukoisuuteen/ staöiilisuuteen, nopeuteen, sekä SCF: n. poistumisnopeuteen in vivo. Kops tuinu ks en, valinta riippuu proteiinin, jolla SCF-aktiivisuutta on, fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista. Esimerkiksi tuote, 5 joka on saatu 3CF:n membraaniin sitoutuneesta muodosta, saattaa edellyttää pesuainetta sisältävää koostumusta. Kontrolloidun tai hitaan yaputumisen koostumuksiin lukeutuu koostaminen lipofiilisiin varastoihin (esim. rasvahapot, vahat, öljyt), Samoin keksintöön kuuluvat hiukkaskoostumuk-10 set, jotka on päällystetty polymeereillä (esim. polöksamee-rit tai polöksamiinit) sekä SCF, joka on kytketty kudoss-p.esifisten reseptorien, ligandien tai antigeenien vastaisiin vasta-aineisiin, tai kytketty kudosspesifisten reseptorien ligandeihin. Kuvauksen mukaisten koostumusten toiset 15 suoritusmuodot käsittävät hiukkasmuotoja, suojapäällystei-tä, proteäasi-inhibiittoreita tai läpäisyä edistäviä aineita eri antoteitä, mukaan lukien ruoansulatuskanavan ulkopuolista, keuhkonsisäistä, nenän tai. suun kautta tapahtuvaa, silmällä pitäen.

20 Kuvaus käsittää myös koostumuksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa muuta hematopoieettista tekijää kuten E PO, G-CSF, GM-CSF, GSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1Q, IL-11, IGF-I tai LIF (leuke-mia-inhibitiötekij a).

25 Kuvauksen mukaisia polypeptidejä voidaan "leimata" liittämällä niihin todettava merkkiaine (esim. radioleimaus :i23I:llä tai biotinylolhti) reagenssien saamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia SCF;n tai sen reseptorin käsittävien solujen toteamiseksi jä kvähtitQimiseksi kiinteistä kudos-30 näytteistä ja nestenäytteistä kuten verestä tai virtsasta.

Biotinyloitu SCF on käyttökelpoinen yhdistettynä immob i 1 i s o i t u u n str epcavid iiniin leu kem i a v a r h a i s s ö 1 u j e n \ poistamiseksi luuytlmestä autologisissä lUuydinsiirroissa, ;]

Biotinyloitu SCF on käyttökelpoinen yhdistettynä immobili- | 35: soituun streptavidiiniin kantasolujen suhteen rikastamisek- si autologisissa tai allogeeniSissa kantasoluissa: autolqgi- j j 21 sissa tai allogeenisissa luuydinsiirroissa. SCF:n toksiini-konjugaatit, kuten risiini [Uhr, Prog, Clin. Biol. Res. 288 {1989) 403 - 412],, difteriatoksiini [Moolten, JMat!. Con.Inst. 55 (1975) 473 - 4 77], ja radioisotoopit 5 ovat käyttökelpoisia suoraan syöpävastaiseen terapiaan (esimerkki 13): tai hoito-ohjelmaksi luuydinsiirtoon.

Kuvauksen mukaiset nukleiinihappotuotteet ovat käyttökelpoisia leimattuina todettavilla merkeillä (kuten rädioleimat: ja ei-isotooppileimat kuten bioti.ini) , ja käy-10 tettyinä hybridisaatioraenetelmissä ihmisen SCF-geenin aseman ja :/ta.i minkä tahansa sukulaisgeeniryhmän aseman paikantamiseksi kromosomikartalta. Ne ovat samoin käyttökelpoisia ihmisen SCF-geenihäiriötilojen tunnistamiseksi DNA-tasolia ja käytettyinä geenimerkkeinä naapurigeenien ja niiden häi-15 riöt ilo; je-n tunnistamiseksi. Ihmis-SCF-geeni on kooditettu kromosomiin .12, ja hiiren SCF-geeni asettuu kartassa kromosomiin 10 Sl-geenipaikkaan. f

SCF on käyttökelpoinen yksinään tai yhdistettynä I

muuhun terapiaan lukuisten hematopoieettisten häiriötilojen 20 hoidossa. SCF:ta voidaan käyttää yksinään tai yhden tai useamman muun hematopoieettisen tekijän kuten EPO, G-C.SF,

GM-GSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, I

XL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I tai LIF kanssa hematopoi eettisten häiriötilojen hoidossa.

25 Löytyy ryhmä kantäsoluhäiriötiloja, joille on tun~ j nusomaista vähenemä funktionaalisessa ydinmassassa, joka ] johtuu toksisesta, säteilyn aiheuttamasta tai immunologi- | sesta vauriosta ja joka voi olla hoidettavissa SCF:llä. j Äplastinen. anemia on kantasoluhäiriötilä, jossa esiintyy ] 30 hernatopoieettisen kudoksen ra s v a s i i r t ymää ja pansytopeniaa j eli kaikkien solujen vähäisyyttä veressä. SCF tehostaa he- | matopoieettista lisääntymistä ja on käyttökelpoinen aplas- j tisen anemian hoitamiseksi (esimerkki 8B) . Steel-hiiriä j käytetään ihmisen aplastisen anemian mallina [Jones, j 35 Ξχρ.HematoL. 11 (1983) 571 - 580]. Lupaavia tuloksia on j saatu käyttämällä sukulaissytokiinia, GM-CSFrää, aplastisen j anemian hoidossa [Antin et ai., Blood. 70 (1987) 129a]. Kohtauksittain esiintyvä yöajan hemoglobiinin esiintyminen virtsassa (PNH) on kantasoluhäiriötila, jolle on tunnusomaista puutteellisten verihiutaleiden ja jyvässolujea niuo-5 dostuminen sekä epänormaalit punasolut.

Löytyy monia sairauksia, joita voidaan hoitaa SCF:llä. Näitä ovat seuraavat: luuytimen korvautuminen sidekudoksella, selkäytimen kovettuminen, luun kovettuminen, etäispesäkkeitä muodostava syöpä, akuutti leukemia;, multiple pelimyelooma, Hodgkinin sairaus, lymfooma, Gaucherin sairaus, Niemann-Pick-sairaus, Letterer-Siwe-sairaus, ärsykkeitä vastaanottamaton erytroblastinen anemia, Di Guglielmo -oireyhtymä, kongestiivinen pernan laajentuma, Hodgkinin sairaus, .musta-kuume, sarkoidoosi, primaarinen pernaperäinen 15 kaikkien verisolujen liian vähäinen esiintyminen veressä, ] äkillinen, yleistynyt tuberkuloosi;, useassa elimistön koh- j dässa esiintyvä sieni-sairaus, äkillinen verenmyrkytys, ma- j laria, vitamiini B12 - ja foolihappovajaus, pyridoksiiniva- j jaus, Diamond Blackfan -anemia, liian vähäisestä pigmentis- j 20 tä johtuvat häiriötilat kuten ihon läiskittäinen väriaineen |

puutos ja valkopälvi. SCF:n punasoluja, megakaryosyytteja I

ja: jyvässoluja stimuloivia ominaisuuksiä havainnollistetaan j esimerkeissä 8B ja 8C:, |

Ei-hematopoieettisten kantasolujen, kuten varhais- | 25 sukusolujen;, hermopienaperäisten melanosyyttien,: selkäyti- f men yhdistävien hermosoluhaarakkeiden, suolen kuoppasolu- j jen, mesonefristen ja metanefristen munuaistiehyeiden ja \ hajuradan etuosan pullistuman, kasvun tehostus on hyödyt- | lista tiloissa, joissa näissä kohdissa on tapahtunut spesi- ] 3:0 finen kudosvaurio. SCF on käyttökelpoinen hermovaurion hoi- j tautiseksi ja se on hermosolujen kasvutekijä, SCF on käyttö- j kelpoinen hedeimöitysmenettelyissä in vitro tai hedelmätkö- \ myysi ilojen hoidossa. SCF on käyttökelpoinen säteilystä' tai ;j kemoterapiasta seuranneen suolivaurion hoitamiseksi. | 35 Löytyy kantasolujen myeloproliferätiivisia häiriö- \ tiloja,: kuten kaikkien eri verisolujen liiallinen tuotanto:, j 23 krooninen ydinperäinen leukemia, ytimen metaplasia./ primaarinen verihiutaleiden runsas määrä veressä ja akuutit leukemiat, joita voidaan hoitaa SCFrllä, anti-SCF-vasta-aineilla tai SCF-toksiinikonjugaateilla.

5 Löytyy lukuisia tapauksia, joissa on dokumentoitu leukemiasolujen kasvanut lisääntyminen hematopoieettisten solukasvutekijöiden G-CSF, GM-CSF ja IL-3 ansioksi [Delwel et ai., Blood 72 (1988) 1944 - 1949]. Koska monien kemote-rapeuttisten lääkkeiden menestys on riippuvainen siitä, et-10 ta syöpäsolut kiertävät aktiivisemmin kuin normaalit solut, SCF yksinään tai yhdistettynä muihin tekijöihin toimii kasvutekijänä syöpäsoluille ja herkistää ne kemoterapeuttisten lääkkeiden myrkyllisille vaikutuksille. SCF-reseptorien liiallisen runsas ilmentyminen leukemiavarhaissoluilla on 15 esitetty esimerkissä 13.

Lukuisia hematopoieettisia yhdistelmä-DNA-tekijoitä | on tutkittavina niiden kyvyn osalta lyhentää kemoterapia- j ja sädehoito-ohjelmista. seuraayaa valkosolunadiria. Vaikka nämä tekijät on varsin käyttökelpoisia tässä asianyhteydes- | 20 sä, on olemassa varhainen: hematopoleettinen osasto, joka \ vaurioituu, etenkin säteilyn vaikutuksesta, ja on repopu- | loitava ennen kuin nämä myöhemmin vaikuttavat kasvutekijät | voivat harjoittaa optimaalista vaikutustaan. SCF:n käyttö j yksinään tai yhdistettynä näihin tekijöihin lyhentää ©del- j

25 leen valkosolu- ja verihiutelanadiria, joka on seurausta J

kemoterapiasta tai sädehoidosta, tai poistaa sen. Lisäksi SCF mahdollistaa syöpä-vastäisen tai sädehoidollisen ohjel- I

man annoksen voimistamisen (esimerkki 19}. f Λ SCF on käyttökelpoinen lisäännyttämään varhaisia | 30 hematoppieettisia kantaisäsoluja syngeenisessä, allogeeni- | sessa tai autologisessa luuydinsiirrossa. Hematopoieettis- j ten kasvutekijöiden käytön on osoitettu lyhentävän aikaa, | jonka neutrofiilit tarvitsevat palautuakseen siirron jäi- j keen [Donahue et ai., Nature 321 (1986) 872 - 875; ja 'Welte j 35 et ai., J,Exp.Med. 165 (1987) 941 - 948]. Luuydinsiirroissa ] käytetään seuraavia kolmea skeenariota yksinään tai yhdis- j s 24 telmänä: luovuttajaa käsitellään pelkästään SGFlilä tai sillä yhdistettynä ituihin hemat;öpoieettisiin tekijöihin ennen luuytimen imemistä tai ääreisveren leukafereesiä siirtoon käytettävissä olevien solujen lukumäärän nostamiseksi; S luuydintä käsitellään in vitro soluluvun aktivoimiseksi tai 1 is äännyt tämise ksl ennen siirtoa:; lopuksi vastaanottajaa käsitellään luovuttajaytimen istutuksen tehostamiseksi.

SCF on käyttökelpoinen sellaisen geeniterapian tehon nostamiseksi, joka perustuu hematopoieettisten kan-10 tasolujen transfektointiin {tai tartuttamiseen retroviraa- li.se 1.1 a vektorilla) . SCF mahdollistaa transfektoitavlen varhaisten hematopoieettisten kanta!säsolujen viljelyn ja lisäämisen. Viljely voidaan suorittaa SCF:liä pelkästään tai sillä yhdistettynä IL-6:een, IL-3:een tai näihin joolem-15 piin. Kun nämä solut on transfektoitu, ne siirretään neste-siirron välityksellä luuydinsiirteenä potilaisiin, jotka kärsivät geneettisistä häiriötiloista. [Lira, Proc. Natl.

Acad. Soi. 86 (1989) 8892 - 8896]. Esimerkkejä geeneistä, jotka: ovat käyttökelpoisia geneettisten, häiriötilojen hoi-20 taraiseksi, ovat adenosiinideaminaasi, glukokerebrosidaasi, hemoglobiini ja kystinen fibroosi.

SCF on käyttökelpoinen immuunikadon (aids) tai vakavien yhdistettyjen immuunipuutostilojeh (SCID) hoitamiseksi yksinään tai muiden tekijöiden, kuten IL-7;n kanssa j 25 (katso esimerkki 14). fätä vaikutusta havainnollistaa SCF- | terapian kyky nostaa T-avustaja- (CD4+-, ÖKT4+-) imusolujen \ absoluuttista tasoa verenkierrossa. Nämä solut ovat ihmisen f immuuni ka tovi r uksen (HiVrri) primaarisia äolumaalej a, joihin | osuminen johtaa aids-immuunipuutostilaan potilaissa [Non- f 30 tagnier julkaisussa "Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus", j toim. R.C. Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 1984, ss. 'j 369 - 379]. Lisäksi SCF on käyttökelpoinen anti-HIV-lääk- j

keiden kuten AZT: n myelosuppressiivisten vaikutusten vas- I

tustamiseksi [Cogu, Life Sciences 45:4 (1989)]. 1 35 SCF on käyttökelpoinen tehostamaan hematopoieettis- ta toipumista välittömän verenmenetetyksen jälkeen.

25

In vivo -hoito SGF:llä on käyttökelpoinen immuunijärjestelmän tukemiseksi syövän: Vastaisessa taistelussa. Esimerkkiä immuunifunktion suoran, tehostuksen terapeuttisesta hyödyllisyydestä Vast' ikään kloonatulla: sytokiinil-5 ia (11-2) kuvataan julkaisussa Rosenberg et ai., N.Eng. J.Med. 513 {1987.} 148S.

SCF:n anto muiden aineiden kuten yhden tai useamman hematopoieettisen tekijän kanssa ajoitetaan väliajoin tapahtuvaksi tai aineet annetaan samanaikaisesti. Aiempi hoΧΙΟ to SCF:llä kasvattaa kantaisäsolupopulaatiota, joka tuottaa vasteen lopuksi vaikuttaville hematopoieettisille tekijöille kuten G-CSF tai EPO. AntOtie: voi olla laskimonsisäisesti, vatsaontelon sisäisesti, ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti.

15 Tämä kuvaus koskee niinikään vasta-aineita, jotka j sitoutuvat spesifisesti kantasolutekij ään. Esimerkissä 7 j alla kuvataan po-lyklonaal ist en vasta-aineiden tuotantoa. ]

Tämän kuvauksen seuraavan suoritusmuodon muodostavat mono- I

j klonaaliset vasta-aineet, jotka sitoutuvat spesifisesti j

20 SCF: ään (katso esimerkki 2.0) . Vastoin kuin tavanomaiset I

(polyklonaaiiset) vasta-ainevaimisteet, jotka tyypillisesti sisältävät erilaisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat vastaan eri määreitä (epitooppeja), kukin monoklonaalinen vas- f ta-aine kohdistuu vastaan yhtä yksittäistä antigeenimääret- ] 25 tä. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia anti- | geeni-vasta-ainesitoutUmista hyödyntävien diagnostisten ja | analyyttisten määritysmenetelmien selektiivisyyden ja spe- \ sifisyyden parantamiseksi * Samoin niitä käytetään SCF:n j

neutraloimiseksi seerumissa tai poistamiseksi siitä. Mono- I

30 klcnaalisten vasta-aineiden toinen etu on, että niitä voi- j daan syntetisoida h yb r i do oma s o i u i11a viljelmässä, jolloin j muita immunoglobuliineja ei esiinny epäpuhtauksina. Mono- j klonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa viljeltyjen j hybridoomasolujen supernatanteista tai vatsaontelonestekas- | 35 varmista, jotka on indusoitu siirrostamalla vatsaontelon | sisäisesti h yb r i do oma soluja hiiriin. Hybridoomatekniikkaa, j ] ] ] :.¾ :3, 26 jota kuvasivat alunperin Köhler ja Milstein [Eur.J.Immunol.

6 (1976) 511 - 519], on sovellettu laajalti hybridisolulin-jojen tuottamiseksi, jotka erittävät korkeina tasoina useiden spesifisten antigeenien vastaisia monoklonaalisia vas-5 ta—aineita,

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön havainnollistamiseksi t ä yde11i s emmin, jolloin esimerkkien ei tule kuitenkaan tulkita rajoittavan keksinnön kattavuutta.

Esimerkki 1 10 Kantasolutekijän puhdistus/karakterisointi buffalo- rotan maksasoluilla käsitellystä kasvualustasta A. Biologiset määritykset in vitro 1., HPP-CFC-määritys Löytyy lukuisia erilaisia biologisia aktiivisuuk- j 15 siä, jotka voidaan katsoa johtuviksi luontaisesta nisäkäs- j rotta-SCF- sekä yhdistelmä-DNA-rotta-SCF-proteiinista, Yksi |

tällainen aktiivisuus on sen vaikutus varhaisiin hematöpoi- I

eettisiin soluihin. Tämä aktiivisuus voidaan mitata määri- j

tyksellä, jossa mitataan runsaasti lisääntyviä, mahdollisen I

20 pesäkkeen muodostavia soluja {HPP-CFC) [Zsebo et ai., s up- | ra, 1988], Tekijöiden vaikutuksen varhaisiin hematopoieet-tisiin soluihin tutkimiseksi HPP-CFC-määrityssysteemissä j käytetään hiiren luuydintä, joka on saatu kyseisistä eläi- ] mistä 2 päivän kuluttua 5-fluoriurasiili- (5-FU-) käsitte— s 25 lystä. Kemoterapeuttinen lääke 5-FU kuluttaa selekttivises- | ti myöhäisiä hematopoieettisiä kantaisäsoluja, jolloin var- j haisten kantaisäsolujen ja siten tällaisiin soluihin vai- j tuttavien tekijöiden toteaminen tulee mahdolliseksi. Rotta- \ SCF pa.ljoitetaan CSF-lrn tai TL-6:n läsnä ollessa puoli- f 30 kiinteisiin agar-agar-viljelmin. Agar-agar-viljelmät si- | saltävät McCoyn täydellistä kasvualustaa (Gibco), 20 % nau- | tasikiöseerumla, 0,3 % agar-agaria ja 2 x 10s luuydinso- | lua/ml. McCoyn täydellinen kasvualusta: sisältää seuraavat | ainesosat: lx McCoyn kasvualustaa, jota on täydennetty pi- ]

35 toisuuksillä 0,1 mM pyruvaattl,: 0,24.x välttämättömiä amino- I

happoja, Ö,24x ei-välttämättömiä aminohappoja, 0,027 % nat- j j Λ & 27 riumbikarbonaattia, 0,24x vitamiineja, 0,72 mM glutamiinia, 25 pg/ml L-seriiniä ja 12 pg/ml L-asparagiinia. Luuydinso-lut saadaan Balb/c-hiiristä, joihin on ruiskutettu i.v. 1.50 mg/kg 5-FUrta. Reisiluut otetaan talteen 2 päivän kuluttua 5 hiirten 5-FU-käsittelystä ja luuydin huuhdotaan ulos. Punaisissa verisoluissa aiheutetaan lyysi punasoTulyysin aikaansaavalla reagenssilla (Beeton Dickenson) ennen -maljoikusta. Testiaineet maljoitetaan edeltävän seoksen kanssa 30 mm.:n maljoihin. 14 päivää myöhemmin lasketaan pesäkkeet 10 (< 1 mm halkaisija), jotka sisältävät tuhansia soluja. Tätä määritystä käytettiin kautta luontaisen nisäkässoluperäisen rotta-SCF:n puhdistuksen.

Tyypillisessä määrityksessä rotta-SCF aikaansaa noin 50 HPP-CFC:n lisääntymisen kohden 200 000 maljoitettua 15 solua. Rotta-SCF:llä on synergistinen aktiivisuus 5-FU;lla käsiteltyihin hiiren luuydinsoluihin; HFP-CFC-pe.säkkeitä ei muodostu yksittäisten tekijöiden .läsnä ollessa, mutta SGF:n ja, CSF-1: n tai SCF:n ja IL-6:n yhdistelmä on aktiivinen t ä s s ä määr i.fcyk s e s s ä.

20 2 . MC/9-määritys

Sekä .luontaisperäisen rotta-SCF:n että yhdistelmä-DNä-rotta^SCFin toinen käyttökelpoinen biologinen aktiivisuus on kyky aikaansaada IL-4-riippuvaisen hiirisyöt-tösOlusöXulinjan, MC/9 (ATCC CRL 8306), lisääntyminen.

25 MC/9-soluja. viljellään IL-4-lähteen kanssa ATCC CRL 8:306 | -menettelyjärjestelyn mukaisesti. Biomäärityksessä käytetty kasvualusta on RPMI 1640, 4 % nautasikiöseerumia, pitoisuudet 5 X 10~5 M 2-merka.ptoetanolia ja Ix glutamiini-pen-strep-valmistetta. MC/9-solut lisääntyvät vasteena 3CF:lie 30 ilman, että tarvitaan muita kasvutekijöitä. Tämä lisääntyminen mitataan viljelemällä: soluja ensin 24 tunnin ajan ilman kasvutekijöitä, minkä jälkeen 5 000 solua maljoitetaan 96-kuopan, kuöppalevyn kuhunkin kuoppaan testinäytteett kanssa 48 tunniksi antaen 4 tunnin ajan sykkeitä 0,5 pelillä 35 3H-tymidiiniä (spesifinen aktiivisuus 20 Ci/mmol), minkä jälkeen edelleen: liuos otetaan talteen lasikuitusuödatti- 28 mille ja mitataan sitten spesifisesti sitoutunut radioaktiivisuus. Tätä määritystä käytettiin nisäkässoluperäisen rotta-SCf ::n puhdistamiseksi ACA 54 -'geeli suodatus vaiheen, jälkeen, tämän esimerkin osa 02. Tyypillisesti SGF aikaan-5 sai 4 - 10 kertaisen lisäyksen minuutissa taustaa vastaan mitatuissa tuikeluvuissa.

3. CFD-GM

Puhdistetun nisäkäs-SCF:n, sekä luontaisesti saadun että yhdistelmä-DNA-teknisen, joka ei sisällä häiritseviä 10 pesäkestimuloivia tekijöitä (CSFriäj, vaikutus normaaliin, kuluttamatlomaan hiiriluuytimeen on varmistettu. CFU-GM-määritystä [Broxmeyar et ai., Exp. Hematol. _5 (1977) 87} I

käytetään SCF:n vaikutuksen normaaliin ytimeen arvioimisek- j s.i. Lyhyesti, kokonaisia luuydinsoluja maljoitetaan puna is- j 15 ten verisolujen lyysin jälkeen puolikiinteisiin agar-agar- ,j

viljelmiin, jotka sisältävät testiaineen. 10 päivän kulut- I

tua lasketaan pesäkkeet, jotka sisältävät > 40 solua kasit- j

tavia rykelmiä. Agar-agar-viljelmät voidaan kuivata objek-tilaseille ja solujen morfologia voidaan määrittää spesifi-20 sillä kudosopillisilla värjäyksillä. I

Normaalilla, hiiriluuytimellä puhdistettu nisäkäs- ; rottasolu-SCF oli monipuolinen CSF, joka stimuloi p.esä k- 1 keitten kasvua, jotka koostuivat epäkypsistä soluista, neutrofiilelstä, makrofageista, eosinofiiieistä ja megaka- | 25 ryosyyteistä, ilman, että tarvittiin muita tekijöitä. } 200: 000 mal j oitetusta, solusta kasvo! yli 100 tällaista pe- ij säkettä 10 päivän aikana. Sekä rotta- että ihmisyhdistelmä- | DNÄ-SCF stimuloi punasolujen tuotantoa yhdistettynä j EPOroon, katso esimerkki 9. j 30 B. Käsitelty kasvualusta B;U f falorott aina k s a - (3P.L-; 3A -soluja, jotka saatiin talletuslaitoksesta the American Type Culture Collection (ATCG CRL 1442), kasvatettiin mikrokantajilla 20 litran perfUusioyiljelysysteemissä SCF:n tuottamiseksi. Tässä svs-35 teemissä käytetään Biolafitte-fermentoria (malli ICC-20) lukuun ottamatta mikrokantajien pidätykseen käytettyjä seu- ijijjj 29 loja sekä hapetusputkitusta. 75 mikroni mesh -seulojen tukkeutuminen mikrokantajasta estetään huuhtomalla ajoittain vastasuuntaan, mihin päästään säätöventtiilien ja atk-säädcttyjen pumppujen muodostamalla systeemillä. Kukin seu-5 la toimii vaihtovuoroisesti kasvualustansyöttö- ja talteen-Qttoseulana:. Tämä oskilloiva virtauskuvio takaa, etteivät seulat tukkeudu. Hapetus saatiin silikoniputkituskierukan (pituus 50 jalkaa = n. 15 m, sisähalkaisija Q,25" = 0,64 cm, seinämäpaksuus 0,03" = 0,08 cm). BRL 3A -solujen vilje-10 lyyn käytetty kasvualusta oli minimivaatimuskasvualusta (sisälsi Karien suoloja} (Gibco), jossa oli ptoisuudet 2 glut, amiini, 3 g/litra glukoosi, ipyptoosi fosfaattia. (2,95 g·./litra.), 5 % nauta s iki ©seerumia, ja 5 % vasikahsikiöseeru-mia. Talteenottokasvualusta oli identtinen lukuunottamatta, 15 että seerumi oli jätetty pois. Reaktori sisälsi Cytodex 2 -mikrokantajia (Pharmacia) pitoisuuden 5 g/litra ja siihen f siirrostettiin 3 x 103 BRL 3A -solua, jotka oli kasvatettu \ \ rullapulloissa ja irrotettu trypsinoimalla. Solujen annettiin kiinnittyä mikrokantajiin ja kasvaa niillä 8 päivän 20 ajan. Kasvualustaa perfusoitiin reaktoriin glukoosi kulutuksesta lasketun tarpeen mukaan. Glukoosipitoisuus pidettiin noin 1,5 g:ssa/litra. 8 päivän kuluttua reaktoriin perfusoitiin 6 tilavuutta kasvualustaa, joka ei sisältänyt seerumia, valtaosan seerumista poistamiseksi (proteiinipitoi-25 suus < 50 μg/ml). Reaktoria käytettiin sitten eräkäytössä \ kunnes glukoosipitoisuus laski alle 2 g:n/litra. Tästä pisteestä eteenpäin reaktoria käytettiin jatkuvasti perfusoi-den nopeudella noin 10 litraa/päivä·. Viljelmän pH pidettiin lukemassa 6,9 ± 0,3 COa-virtausnopeutta säätämällä. Liuen-30 nut happi pidettiin yli 20 %:n ilroakyllästyksessä lisäämällä puhdasta happea tarpeen mukaan. Lämpötila pidettiin 37 ± 0,5 °C:ssa.

Edeltävästä systeemistä saatiin noin 336 litraa käsiteltyä kasvualustaa, joka ei sisältänyt seerumia, ja sitä 35 käytettiin lähtömateriaalina luontaisen nisäkässoluperäisen ]

rotta-SCF:n puhdistamiseksi. I

j $ :¾ 30 C, Puhdistus

Kaikki puhdistustyö suoritettiin 4 °C:ssa ellei toisin mainittu.

1, DEÄE-selluloosa-anioninvaihtokroBaatografia S Käsitelty kasvualusta, joka saatiin kasvattamalla seerumi vapaissa olosuhteissa BRL 3A -soluja,, kirkastettiin suodattamalla 0,45 μ: n Sarto-kapselien (Sartoriusj läpi.

Useampi eri erä (41 litraa, 27 litraa, 39 litraa, 30,2 litraa, 37,5 litraa ja 161 litraa.) käsiteltiin erikseen kon-10 sentroimalla, diasuodattamälla/puskurivaihdolla, ja DEAE-s e11u1o os a-anion i n va i h tokromato gg r af i s e s t i samaan tapaan kunkin erän kohdalla. Sitten DEAE-selluloosapoolit: yhdistettiin ja prosessoitiin edelleen yhtenä eränä tämän esimerkin osien C'2-5 mukaisesti. Tämän havainnollistamiseksi, 15 41 litran erää käsiteltiin seuraavasti. Suodatettu käsitelty kasvualusta konsentroitiin n, 700 ml:ksi käyttäen Milli- j

pore Pellicon -tangenttivirtausultrasuadatuslaitteistoa, I

jossa oli 4 polysulfonimembraanikasettia, joiden kynnysarvo oli mölekyylip.ainossa 10 000 (kokonaismemPraaniala 20 ft;3 = 20 1,9 m2; pumppausnopeus noin 1 095 ml/min ja suodatusnopeus 250 - 315 ml/min). Anioninyaihtokromätögrafiaa valmisteleva diasuodatus/puskurivaihto suoritettiin: sitten lisäämällä 500 ml 50 mM Tris-HC1-puskuria, pH 7,8, konsentraattiin, konsentroimalla toistamiseen 500 ml:ksi käyttäen tangentti·-· 25 virtausultrasuodatuslaitteistoa, ja toistamalla tämä vielä 6 kertaan, Konsentroitua/diasuOdatettua valmistetta saatiin lopulta talteen 700 ml:n tilavuus. Valmiste panostettiin DEAE-selluloosa-anioninvaihtokol.pnniin (5 x 20,4 cm; Whatman DE.-52 -hartsi), jota· oli tasapainoitettu 50 mM Tri s- | 30 HCl-puskurilla, pH 7,8. Näytteen panostuksen jälkeen kolon- | ni pestiin 2 050 ml:11a. Tris-Hci-puskuria, jolloin käytät- :j ti in suolagradienttia (0 - 300 mM NaCl Tris-HCl-puskurissa; :| 4: litran kokonaistilavuus) . Kerättiin 15 ml:n fraktioita ] virtausnopeuden ollessa 167 ml/tunti. Kromatogräfia esite- j 3:5 tään kuviossa 1. HPP-CFC-pesäkeluku viittaa biologiseen ak- j tiivisuuteen HPP-CFC-määrityksessä:; 100 μΐ mainituista ;| 31 fraktioista, analysoitiin. Näytepanostukseh ja pesun aikana kerättyjä fraktioita ai, ole esitetty kuviossa; mitään biologista aktiivisuutta ei todettu näistä fraktioista.

Kaikkien käsiteltyjen kasvualustaerien käytös, 5 joille suoritettiin konsentrointi, diasuodatus/puskuri- vaihto ja anioninvaihtokrömatografia, oli samankaltainen.

Erien proteiinipitoisuudet, jotka määritettiin Bradford!» menetelmällä [Anal.Biochem. 72 (1976) 248 - 254] käyttäen nautaseerumiaibumiinia standardina oli 30 - 50 pg/ml. Tähän 10 valmisteeseen käytetyn käsitellyn, kasvualustan kokonaistilavuus oli noin 336 litraa:, 2. ÄCA 54 -geelisuodatuskromatografia DEAE-selluloosalcolonneistaf jotka oli ajettu kullekin 6 käsitellylle kasvualustaerälle, joihin viitattiin 15 edellä (esimerkiksi fraktiot 87 - 114 kuviossa 1 esitetystä ajosta) saadut fraktiot, joilla oli biologista aktiivisuutta, yhdistettiin (kokonaistilavuus 2 900 ml) ja konsentroitiin 74 ml:n lopputilavuudeksi käyttäen Amiconin sekoitettuja kennoja ja YMlO-membraane ja. Tämä materiaali panoste t- j 20 tiin ACÄ 54 - (LKB) geelisuodat us kolonniin (kuvio 2), jota j oli tasapainoitettu 50 mM Tris-HC1-puskurilla,.· jossa oli j pitoisuus 50 mM NaCl, pH 7,4, Kerättiin 14 ml: n fraktioita | virtausnopeuden ollessa 70 ml/tunti- Inhiboivien tekijöiden j johdosta, jotka eluoituivat yhdessä aktiivisten fraktioiden ] 25 kanssa, aktiivisuushuippu {HPP-CFC-pesäkeluku) vaikuttaa 1

hajonneelta; kuitenkin aiempien kromatogrammien nojalla ak- I

tiivisuus eluoituu yhdessä pääasiallisen pfatelinipiikin | kanssa, minkä vuoksi fraktioista valmistettiin yksi pooli. s 3. Vehnänalkioagglutiniini-agaroosikromatografia ]

30 Fraktiot 70 - 112 AGA 54 -geelisuodatuskolonnista ;J

yhdistettiin (500 ml). Pooli jaettiin kahtia ja kummallekin j puolikkaalle suoritettiin kromatografia-ajo käyttäen veh-nänalkioagglutiniini-agaröosikolonnia (5 x 24,5 cm; hartsi | valmistajalta E-Y Laboratories, San Mateo, CA; vehnänalkio- j 35 agglutiniini tunnistaa tiettyjä hiilihydraattirakenteita), jota oli tasapainoitettu 20 mM Tris-HCl-puskurilla, jossa 1 j $

:::S

$ £ 3:¾ 32 oli pitoisuus 500 mM NaCl, pH 7,4, Näytepanostuksien jälkeen kolonnia pestiin noin 2 200 ml:11a kolonnipuskuria, minkä jälkeen sitoutunut materiaali elnoitiin käyttämällä liuosta, jossa oli 350 mM N-asetyyli-D-glukosamiinia lluo-5 Pettuna· kolonnipuskuriiri, alkaen kuvion 3 mukaisesta fraktiosta n. 210. Kerättiin 13,25 ml: n fraktioita virtausnopeuden ollessa 122 ml/tunti. Yksi kr.omatograf ia-a joista on esitetty kuviossa 3* Määritettäviä fraktio-osuuksia dialy-soitiin vastaan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta; 5 μΐ 10 dialysoituja materiaaleja käytettiin MC /SHftääri tykses sä (tuiketta/min-lukemat kuviossa 3) ja 10 μΐ HPp-CFC-määrityksessä (pesäkelukuarvot kuviossa 3). Voidaan havaita, että aktiivinen materiaali sitoutui kolonniin ja eluoi-tui N-asetyyli-D-glukosamiinin kanssa,: kun taas suuri osa ] 15 epäpuhtauksina läsnä olevasta materiaalista kulki kolonnin ,j läpi näytepanostuksen ja pesun aikana. j 4. S-Sepharose-nopeavirtauskationinvaihtokromato- grafia

Fraktiot 211 - 225 kuviossa 3 esitetystä vehnanal-20 kioagglutiniinikromatograflasta sekä ekvivalenttiset frak tiot toisesta ajosta yhdistettiin pooliksi (375 ml), jota dialysoitiin vastaan 25 mM natriumfOrmaattiliuosta, pH 4,2,

Alhaiselle pH.: Ile alttiiksi joutumisajan minimoimiseksi | dialyysi suoritettiin 8 tunnin aikana vastaan 5 puskurilit- | 25 raa, jolloin 8 tunnin aikana suoritettiin A vaihtoa. Tämän | dialyysiä jän päättyessä näy te tilavuus oli 480 ml ja näyt- i teen pH ja johtokyky olivat lähellä dialyysipuskurin vas- ] taavia. Näytteeseen ilmaantui saostunutta materiaalia dia- j

lyysin aikana. Tämä poistettiin sentrifugoimalla 22 000 χ I

30 g:ssä 30 minuutin ajan, ja sentrifugoidusta näytteestä saa- j tu supernatantti panostettiin S-Sepharose Fast Flow '\ -kationinvaihtokolonniin (3,3 x 10,25 cm; ha.tai valmista- j jäitä Pharmacia), jota oli tasapainoitettu natriumformaat- t.ipuskurilla. Virtausnopeus oli 465 ml/tunti ja kerättiin j 35 14,2 ml:.n fraktioita. Näytepanostuksen jälkeen kolonnia j pestiin 24 0 ml:1.1a koionnipuskuria, minkä jälkeen sitoutu- 1 33 nut materiaali, eluoitiin käyttäen gradienttia 0 - 750 mM NaCl (NaCl liuotettiin kolonnipuskuriin; gradientin kokonaistilavuus 2 200 ml)..,. alkaen kuvion mukaisesta fraktiosta n. 45, Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 4, Kerättyjen 5 fraktioiden pH säädettiin lukemaan 7 - 7,4 lisäämällä 200 μΐ 0,97 M Tris-emästä, Tuiketta/min-lukemat kuviossa 4 viittaavat jälleen biologisessa MC/9-mää r i t y ks e s s ä saatuihin tuloksiin; osuuksia mainituista fraktioista dialysoi-tiin vastaan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, ja 20 μΐ 10 käytettiin määrityksessä. Kuviosta 4 voidaan havaita, että valtaosa biologisesti aktiivisesta materiaalista kulki kolonnin läpi siihen sitoutumatta, kun taas runsaasti epäpuhtautena läsnä olevaa materiaalia sitoutui ja eluoitui suo-lagradientin mukana.

15 5. Krqmatogyafia käyttäen piidioksidiin sidottaa hiilivetyhartsia \

Fraktiot 4 - 40 kuvion 4 mukaisesta S-Sepharose- f kolonnista yhdistettiin pooliksi (540 ml) . 450 ml poolista yhdistettiin samaan tilavuuteen puskuria B (100 mM amrnoni-20 umasetaatti, pH 6:isopropanoli; 25:75) ja panostettiin virtausnopeuden ollessa 540 ml/tunti C'^kolonniin (Vydac Proteins C4; 2,4 x 2 cm), jota oli tasapalnoitettu puskurilla A (60 mM arnmoniumasetaatti, pH6: isopropanoli; 62,5:37, 5).

Näytteen panostuksen jälkeen virtausnopeus laskettiin 154 ] 25 ml;: ksi/tunti ja kolonnia pestiin 200 ml :11a puskuria A, j

Sitten käytettiin lineaarista gradienttia puskurista A pus- j kuriin B (kokonaistilavuus 140 ml) ja kerättiin 9,1 ml:n | fraktioita. Näyte-eriin S-Sepharose-kromatOgrafiapoolista, j C^-kolonnilähtönäytteestä, läpiajopoolista ja pesupoolista |

30 säädettiin pitoisuus 4 0 pg/ml nautaseerumialbumiinia lisää- J

mällä oikea tilavuus varastoliuosta, .jossa pitoisuus oli 1 i| mg/ml, ja diaiysoitiin vastaan fosfaattipuskuroitua suola- j liuosta biologista määritystä silmällä pitäen. Vastaavasti j 40 μ!:η eriä gradienttifraktioista yhdistettiin 360: yl:a.an j 35 fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 16 yg nau- j taseerumiaibuffiiinia, minkä jälkeen suoritettiin dialyysi j | : 3 'Λ 34 vastaan fosiaattipuskuroutua suolaliuosta biologista määritystä silmällä: pitäen. Nämä eri fraktiot määritettiin MC/9-määrityksellä (6,3 μ1:η näyte-eriä valmistetuista gradient-tif raitio:; sta; tuiketta/min kuviossa 5) . Määritystulokset 5 osoittivat samoin, että noin 75 % talteen saadusta aktiivisuudesta oli: läpiajo- ja pesufraktioissa:, ja 25 % gradient-ti£raktioissa:/; jotka esiintyvät kuviossa 5. SDS-PÄGE [Laemmli, Nature 227 (1970) 680 - 685; panostusgeelit si sälsivät 4 % (w/v) akryyliamidia ja erotusgeelit sisälsivät 10 12,5 % (w/v) akryyliamidia] eri fraktioiden näyteerille on esitetty kuviossa 6. Esitetyn geelin näyte-erät kuivattiin tyhjössä, minkä jälkeen ne undelleenliuotettiin käyttäen 20 μΐ näytekäsittelypuskuria (ei-pelkistävä, eli ei sisällä 2-merkaptoetanolia) ja keitettiin 5 minuutin ajan ennen pa-15 nostusta geeliin. Vyöhykkeet A ja B edustavat koionnilähto-materiaslis (75 μΐ 890 ml:sta) ja vastaavasti kolonnilä-piajoa (75 μΐ 880 ml:sta); numeroidut merkit kuviossa vasemmalla edustavat merkkien migraatioasemia (pelkistetty), joiden molekyylipainot ovat 103 kertaa ilmoitettu luku, 20 jolloin merkit ovat fosforylaasi-b (Mr = 97 4ÖÖ), nautasee- rumialbumiini (Hr - 66 200) , muna-albumiini (Mr = 42 700) , karbonihappoanhydraasi (Mr - 31 000), soijapaputrypsii- ni-inhibiittori (Mr = 21 500) ja lysotsyymi (Mr « 14 400) ; vyöhykkeet 4 - 9 edustavat vastaavia fraktioita, jotka on j

25 kerätty gradienttia käytettäessä (60 μ.1 9,1 ml:sta). Geeli J

värjättiin hopealla [Morrissey, Ana 1.., Bi ochem. 117 (1981) :j 307 - 310]. Verrattaessa vyöhykkeitä A ja B voidaan havai- j ta, että valtaosa värjätystä materiaalista kulkee kolonnin ;| läpi:. Värjätty materiaali fraktioissa 4 - 6; alueella, joka ] 30 on juuri Mr. — 31 00Q standardiasemah ylä- ja alapuolella, | osuu yksiin gradienttifraktioissa tavatun biologisen aktit- | visuuden kanssa (kuvio 5) ja edustaa biologisesti aktiivis- j ta materiaalia. Huomattakoon, että tämä materiaali tulee ] näkyviin vyöhykkeissä 4 -6, mutta ei vyöhykkeissä A ja/tai | 35 B, kosfca: huomattavasti suurempi osuus kokonaistilavuudesta: j (0,66 % kokonaisuudesta fraktioille 4 - 6 verrattuna 0,0084 | | | 35 %:iin kokonaisuudesta vyöhykkeille Ä ja B) panostettiin edeltävässä tapauksessa. Fraktiot 4 - f tästä kolonnista yhdistettiin pooi1ksi.

Kuten edellä mainittiin,· suunnilleen 75 % talteen 5 saadusta: aktiivisuudesta kulki kuvion 5 mukaisen Gp-kolonnin. läpi. Tällä materiaalilla: suoritettiin toinen kromato-grafia-ajo käyttäen Ck-hartsla oleellisesti kuten edellä kuvattiin lukuunottamatta, että käytettiin suorempaa kolonnia (1,4 k 7,8 cm) ja hitaampaa virtausnopeutta (50 - 60 10' ml/tunti) . Suunnilleen 50 S talteen saadusta aktiivisuudesta oli läpiajossa, ja 50 % gr adientt i f r akt-ioi ssa, jotka näyttivät SDS-PAGE:ssa samanlaisilta kuin kuvion 6 mukaiset aktiiviset gradlenttifraktiot. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin: pooliksi (29 ml) .

15 Analyyttinen Ck-kolonniajo suoritettiin samoin |

Oleellisesti kuten edellä esitettiin, ja fraktiot määritet- | tiin kummallakin biomäärityksella. Kuten esitetään kuviossa 7, tästä analyyttisesta: kolonnista saaduista fraktioista sekä MC./9- että HPP-CFC-bioaktiivisuudet eluoituvat saman-20 aikaisesti. SDS-FÄGE-analyysi (kuvio 8) paljastaa, että ko-lonnif^aktioissa, jotka sisältävät biologista aktiivisuutta kuminassakin määrityksessä, on läsnä proteiini, jolle Mr -n. 31 000. |

Aktiivista materiaalia toisesta (suhteellisen pie- I

25 nestä) aktiivisuuspiikistä, joka nähdään S-Sepharose- f kromatografiassa (esim. kuvio 4, fraktiot 62 - 72, aikaiset ;j fraktiot suolagradienttia käytettäessä) puhdistettiin niin- 1 ikään C^-kromatografisesti. Se osoitti samaa käytöstä SDS- | PAGE:ssa ja sen N-pään aminohapposekvenssi (katso esimerkki | 30 2D) oli samanlainen kuin materiaalin, joka saatiin S- j

Sepharose-läpiajofraktioiden C^-kromatograflasta.. ! 6. Yhteenveto puhdistuksesta

Yhteenveto edellä kohdissa 1 — 5 kuvatuista puhdis-tusvaiheista esitetään taulukossa 2.

ds 35 36

Taulukko 2

Yhteenveto nlsäkäs“SCF:n puhdistuksesta

Vaihe Tilavuus Kokonais- 5 proteiini <ml ) (mg)5 Käsitelty kasvualusta 335 700 13 475 DEÄE-selluloosa1 2 900 2 164 10 ACA-54 550 1 513

Ve hn änä 1 kl o a g g 1 u t i n i i n i - a g a ro.o si 2 3 7 5 4 31 S-Sepharose 54 O4 10

Cii-haxtsi3 57,3 0,25 - 0,406 15 1. Ilmoitetut arvot edustavat summaa arvoista, jotka saatiin tekstissä kuvatuille eri erille, { 2. Kuten edellä tässä esimerkissä kuvattiin, saos- j tunut materiaali, joka ilmaantui tämän näytteen dialyysin j aikana S-Sepharose-kromatografiaan valmistauduttaessa, 20 poistettiin sentrif ugoimalla. Sentrifugoinnin jäikeirien \

näytteen (480 ml) kokonaisproteiinipitoisuus oli 264 mg. J

3, Yhdistelmä aktiivisista gradienttifraktioista, jotka saati in kahdesta C4-kolonnista, jotka ajettiin kuva- j tun mukaisesti sarjassa. ;j i 25 4. Vain 450 ml tätä materiaalia käytettiin seuraa- j vaan vaiheeseen (tämä esimerkki, edellä). j 5. Määritettiin Bradfordin menetelmällä (supra, j 1976) ellei toisin mainittu, 6. Arvio, joka perustuu SDS-PAGE:n jälkeisen hopea- | 30 värjäyksen voimakkuuteen sekä aminohappokoostumusanalyysiin j esimerkin 2 osassa K kuvatun mukaisesti. j D, SDS-PAGE- ja glykosidaasikäsittelyt ] SBS-PÄGE pooliksi yhdistetyistä gradienttifrakti- ] öistä kahdesta suuren mittakaavan 'G4-kolonniajosta esite- -j 35 tään kuviossa: 2. 60 μΐ ensimmäisen G*.-kolonnin poolista par j nostettiin (vyöhyke 1), ja 40 μΐ toisen G^-kolonnin poolis- ] | ] i 37 ta {vyöhyke 2). Nämä geelivyöhykkeet värjäytyivät hopealla.

Mol e k y y 1 i p a .i. n ome r k i t olivat kuten kuvataan kuviossa 6. Kuten mainittiin/ cliffuusisti migroituva materiaali, joka on Mr = 31 OOC merkkiaseman ylä- ja alapuolella, edustaa bio-5 logisesti aktiivista materiaalia; näennäinen heterogeenisyys johtuu valtaosin heterogeenisyydestä glykosylaatiossa, Glykosylaation karakterisoimiseksi puhdistettua materiaalia jodattiin käyttäen 125I;tä, käsiteltiin erilaisilla glykosidaaseilla ja analysoitiin SDS-PAGE:11a {pelkistä-10 vät olosuhteet) ottaen autoradiokuvia. Tulokset esitetään kuviossa 9, Vyöhykkeet 3 ja 9, 125I-leimattu materiaali, jota ei ole käsitelty glykosidaasx11a, Vyöhykkeet 4 - 8 edustavat 12bT-leimattua materiaalia, jota on käsitelty glykosidaaseilla seuraavalla tavalla. Vyöhyke 4, neuraminidaa-15 si. Vyöhyke 5, neuraminidaasi ja O-glykanaasi. Vyöhyke 6, N-glykanaasi. Vyöhyke 7, neuraminidaasi ja N-glykanaasi.

Vyöhyke 8, neuraminidaasi, 0-giykanaasi ja N-glykanaasi.

Olosuhteet olivat 5 rnM 3-[ (3-kolamidopropyyli} dimetyyli-ammonioj-l-propaanisulfonaatti (CHAPS), 33 mM 2-merkaptö-20 etanoli, 10 mM Tris-HCl, pH 7 - 7,2, 3 tunnin ajan i 37 °C:ssa. Neuraminidaasia {organismista Arthrobacter ureafaciens; Calbiochemj käytettiin loppupitoisuutena 0,23 yksikkoM/ml, O-glykanaaSia (Genzyrae; endo-alfa-N-asetyyli-galaktosaminidaasi) käytettiin 4S. miiliyksikköä/inl. N-gly-25 kanaa siä·. (Genzyme; peptidirN-glykösidaasi-F; peptidi-N4 [N-asetyyli-beta-glukosaminyylii asparagiiniamidaasi) käytettiin pitoisuutena 10 yksikköä/ml .·

Samankaltaisia tuloksia kuin kuviossa 9 saatiin käsittelemällä ei-leimattua puhdistettua SCF:ää glykosi- :| 30 daaseilla ja tekemällä tuotteet näkyviksi värjäämällä hope- f alla SDS-PAGE:n jälkeen. |

Kun tarkoituksenmukaista, suoritettiin erilaisia | verrokki-inkubointeja. Näihin lukeutuivat: inkubointi tax- j koituksenmukaisessa puskurissa, mutta ilman glykosidaaseja, | 35 sen varmistamiseksi, että tulokset johtuivat lisätyistä ] glykosidaasivalmisteista; inkubointi glykosyloiduilla pro- ] 38 telineillä (esim. glykosyloitu yhdistelmä-DNA-ihiriiserytro-poietiini), jotka tiedettiin glykosIdaasisubstraateiksi, sen varmistamiseksi, että käytetyt glykosidaasientsyymit olivat: aktiivisia; ja inkubointi glykosidaaseilla mutta il— 5 man substraattia, sen varmistamiseksi, etteivät itse g ly— kosIdaasit myötävaikuttaneet näkyviksi tehtyihin geelinau-hoihin tai häirinneet niitä,

Giykösidaasikäsittelyjä suoritettiin myös endo-beta-N-asetyyliglukosamidaasi-F:ilä (endo-F; NEN Dupont) ja 10 endo-beta-N-asetyyliglukosaminidaasi-H:11a (endo-H; NEN Dupont) jälleen käyttäen tarkoituksenmukaisia verrokkiinku-bginteja. Olosuhteet endo-F-käsittelyssä olivat: keittämi- \ neh: 3 minuutin ajan, kun läsnä olivat pitoisuudet 1 % (w/v) { SDS:ää, 100 mM 2-merkaptoetanoli, 100 mM EDTA, 320 mM nat- ] 15 riumfosfaatti, pH 6, minkä jälkeen laimennettiin 3-kertai- -| eesti sisällyttämällä mukaan Nonidet P-40 -valmistetta (1,17 %, v/v, loppupitoisuus:}, natriumfosfaattia (200 mM, ] loppupitoisuus) ja endo:-F:ää (7 yksikköä/ml.,. loppupitoi- \ suus). Endö-H-käsittelyn olosuhteet olivat samankaltaiset j

20 lukuunottamatta, että SDS-pitoisuus oli 0,5: % (w/v) ja en- J

do-H: ta käytettiin pitoisuutena 1 pg/ml. Tulokset endo-F:llä olivat samat kuin tulokset N-glykanaasilla, kun taas endo-H:11a el ollut mitään vaikutusta puhdistettuun SCF- 1

materiaaliin. I

25 Koko joukko johtopäätöksiä voidaan tehdä edellä ku- :j vatuista glykosidaasikokeista. Eri käsittelyt N-glyka- | naasilla [joka poistaa sekä kompleksista että runsaasti j mannoosia sisältävää N-kytkettyä hiilihydraattia (Tarentino :j

et ai,, Biochemistry 24 (1985) 4 665 - 4671], endo-F: llä I

30 [joka toimii samalla tavalla kuin N-glykanaasi (Elder ja I

Alexander, Proc.Natl.Acad.Sei.USA 79 (1982) 4540 - 4544], j endo-H:11a [joka poistaa runsaasti mannoosia sisältävää ja j tiettyä hybridityyppiä edustavaa N-kytkettyä hiilihydraat- j tia (Tarentino et ai., Methods Enzymol, 50G (1978) 574 - j 35 580], neuraminidaasilla (joka poistaa siäliinihappotähtei- tä) ja O-glykanaasiila [joka poistaa tiettyjä O-kytkettyjä j ] | § $ 39 hiilihydraatteja (Lambin et ai. , Biochem. 3oc.Trans. 12 (1984) 599 - SOO], viittaavat siihen, että: läsnä on sekä N-kytkettyjä että O-kytkettyjä hiilihydraatteja; valtaosa N-kytketystä hiilihydraatista edustaa kompleksityyppiä; ja 5 sialiinihappoa on läsnä, jolloin ainakin osa siitä muodostaa osan Ο-kytketyistä ryhmistä. Joitakin tietoja mahdollisista N-kytkentäkohdista voidaan saada aminohapposekvenssi,-tiedoista (esimerkki 2) . Se tosiasia, että, käsittely iST-glykanaasiXla, endo-r:llä ja N-glykanaasi/neuraminidaasilla.

10 voi muuttaa SDS-P&GE:ssa ilmeisen heterogeenisen materiaalin nopeammin migroituviksi muodoiksi, jotka ovat hyvin paljon homogeenlsempia, sopii johtopäätökseen* jonka mukaan materiaali kokonaisuudessaan on samaa polypeptidiä, jolloin heterogeenisyyden aiheuttaa heterogeenisyys glykosylaatios- | 15 sa. Samoin merkille pantavaa on, että pienimmät muodot, j jotka: saadaan käsittelemällä eri glykosidaaseilla yhdessä, j ovat alueella Mr = 18 000 - 20 000 suhteessa SDS--PÄGE: ssa j käytettyihin malekyylipainomerkkeihin. j

Vahvistuksen siitä, että diffuusista migroituva ma- I

\ 20 terlaali Mr = 31 000 aseman SDS-PAGF,: ssa ympärillä edustaa | biologisesti aktiivista materiaalia, jolla kokcnaisuudes- j saan on sama peruspolypeptidiketju, antaa se tosiseikka, että aminohäpposekvenssitiedot, jotka saadaan tälle alueel-le migroituvasta materiaalista (esim. elektroforeettisen s

25 siirron ja käsittelyn syaanibromidilla jälkeen; esimerkki I

2), sopivat tietoihin, jotka osoitettiin eristetylle geenille, jonka ilmennys yhdistelmä-DNA-teknisesti johtaa bio- | logisesti aktiiviseen materiaaliin (esimerkki 4). j ! | \ \ 5 40

Esimerkki 2

Nisäkas-SCF: n aminohapposekvenssianalyysi Ä. Käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiällä (HPLC) puhdi s te t tu proteiini 5 Noin 5 pgrlla SCF;ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 (pitoisuus = 0,117 mg/ml), suoritettiin kään-teisfaasi-HBIC käyttäen GU-käpeahuokoskolonnia (Vydac, 300 Ä huokoshäl kaisi ja , 2 mm x 1.5 cm} . Proteiini eluoitiin lineaarisella gradientllla 97 % liikkuva faasi A (0,1-%:inen 10 trifluorietikkahäppo)/3 % liikkuva faasi B (90 % asetonit-rilliä 0, l-%: isessa. trifluorietikkahapossa) -a· 30 % liikkuva faasi A /70 % liikkuva faasi B 70 minuutissa, minkä jälkeen eluoitiin isofcraattisesti vielä 10 minuutin ajan vir- | tausnopeuden ollessa 0,2 ml/min. Puskurisokeakokeen antama j 15 tausta vähennettiin kromatogrammista, minkä jälkeen SCF j nähtiin yksittäisenä symmetrisenä piikkinä, jonka retentio- j

aika oli 70,05 min kuten esitetään kuviossa 10. Mitään mer- I

kittäviä epäpuhtauksien antamia pröteiinipiikkejä ei voitu j havaita näissä, olosuhteissa. | 20 B. Elektroforeettisesti siirrettyjen pro telininau- | hojen sekvantointi 1 SCF;ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 | (0,5 - 1,0 nriiol) käsiteltiin seuraavasti N-glykanaasilla, f joka on entsyymi, joka pilkkoo spesifisesti proteiineihin 25: kovalenttisesti kiinnittyneitä Asn-kytkettyjä hiilibydpaat- | tiryhmiä (katso esimerkki ID) . 6 ml pooliksi yhdistettyä 1 materiaalia kuvion 5 mukaisen C4-kolonnin fraktioista 4-6 | kuivattiin tyhjössä. Sitten lisättiin 150 μΐ liuosta, jossa oli pitoisuudet 14,25 CHAPS, 100 mM; 2-merkaptoetanoli, 335 | 30 mM natriumfosf aatti, pH 8,6, ja inkuboitiin 95 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitten lisättiin 300 μΐ liuosta, jossa oli j pitoisuudet 74 mM natriumfosfaatti, 15 yksikköä/ml N-glyka- | naasia, pH 8,6, ja inkubointia jatkettiin 19 tunnin ajan. j

Sitten näyte ajettiin 9 - 18-%:isossa- SDS-polyakryyli- | 35 amidi g rad i en tt igee li s s ä (paksuus 0,7 mm, 20 x 20 cm). Pro- j teiininauhat geelistä siirrettiin elektroforeettisesti po- |

S

•S

41 lyvinyylifluoridiin ('PVDF, Millipore Corp.) käyttäen 10 mM Caps-puskuria (pH 10:,5) jatkuvan virran ollessa 0,5 Amp ja ajoajan 1 tunti [Matsudaira, J, Biol. Ghern. 261 (1987) 10035 - 10038] . Siirretyt proteiininauhat tehtiin näkyviksi 5 värjäämällä Coomassie Blue "Värillä. Nauhoja esiintyi kohdissa M, - n. 29 000 - 33 000 ja M, - n. 26 000, eli degiy-kosylaatio oli vain osittainen (vertaa esimerkki ID, kuvio 9); edeltävä nauha edustaa ei-pilkottua materiaalia ja jälkimmäinen nauha edustaa materiaalia, josta N-kytketty hii-10 lihydraatti on poistettu. Nauhat leikattiin irti ja panostettiin suoraan (40 % Mr = 29 000 - 33 000 proteiinille ja 80 % Με - 26 000 proteiinille) proteiinisekventöijaan (Applied Biosystems Inc,, maili 477);. Proteiinisekvenssiana-lyysi suoritettiin käyttäen valmistajan toimittamia ohje1 -15 mia [Hewlck et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997] ja vapautuneet fenyylitiohydantoinyyliaminohapot analysoi- j tiin ''on-line" (suoraan) käyttäen mikrohuokos-Cj.e~käänteis- 1 faasl-SPLC:tä. Kumpikaan nauha ei antanut mitään signaaleja | 20 - 28 sekventöintikierroksella, mikä viittasi siihen, et- j 20 ta kumpaakaan ei voitu sekventoida Edman-kemiaa soveltava!- j la metodiikalla. Taustataso kussakin sekvensointiajossa oli | 1-7 pmpl, joka oli runsaasti alle nauhojen sisältämän \ prpteiinimäärän. Nämä tiedot viittasivat siihen, että proteiini nauhoissa oli N-päästaän salvattu.

25 C. Elekfcroforeettisesti siirretyn proteiinin CNBr- | pilkkominen in situ sekä sekvenfcoinfci

Sen varmistamiseksi, että proteiini oli tosiaan | salvattu, membraanit poistettiin sekyentoijasia (osa B) ja [ suoritettiin siirrettyjen nauhojen in situ -pilkkominen sy- | 30 aanibromidilla (CNBr) [CNBr (5 %, w/v) 70-%:ises:sä muuta- 1 haishapossa 1 tunnin ajan 45 °G:ssa], minkä jälkeen suori- j tettiin kuivaus ja sekvenssianalyysi. Todettiin voimakkaita j sekvenssisignsaleja, jotka edustivat sisäisiä peptidejä, j jotka olivat muodostuneet CNBr:n pilkkoessa metionyylipep- ] 35 tidisidoksen. | ] j .:i|

S

4 4:2

Kummastakin nauhasta saatiin identtisiä sekase-.kven-ssisignaaleja, jotka on lueteltu alla viidelle ensimmäiselle 'kierrokselle.

Identifioidut aminohapot 5 Kierros 1: Asp; Glu; Vai; Ile; Leu

Kierros 2: Asp; Thr; Glu; Ala; Pro; Vai

Kierros 3: Äsn; Sei; His; Pro; leu

Kierros 4: Asp; Asu·; Ala; Pro; Leu

Kierros 5: Ser; Tyr; Pro 10

Kummastakin nauhasta saatiin samoin samanlaiset signaalit aina kierrokselle 20, Alkuperäiset saannot olivat 40 - 115 pmol Mr = 26 000 nauhalle ja 4 0 - 150 pmol Mr = 29 000 - 33 000 nauhalle. Nämä arvot ovat verrattavia alku-15 peräisiin proteiinimoolimääriin, jotka panostettiin sekven- j toijaan. Tulokset varmistivat sen, että SGF:ää vastaavissa j proteiininauhoissa N-pää oli Salvattu. Menettelyjä, joita käytettiin käyttökelpoisen sekvenssitiedon saamiseksi N-päästä salvatusta proteiinista, olivat: (a) salpauksen 20 poisto N-päästä (katso osa D); ja (b) peptidien muodostama - j nen sisäisesti pilkkomalla CNBr:liä (katso osa E), trypsii- j nillä (katso osa F), ja Staphylococcus aureus - {kanta V-8) j proteaasilla (Glu-C) (katso osa G) . Sekvenssianalyysi voi- \ daan suorittaa, kun N-pään salpaava aminohappo on poistet- j 25 tu, tai peptidifragmentteja eristetty. Esimerkkejä kuvataan | alla yksityiskohtaisesti. j D. Sekvenssianalyysi BRL-kantasolutekijälle, jota on käsitelty pyroglutaraiinihappoaminopeptidaasilla j SCF:n aminopäässä esiintyvän salpaavan ryhmän kerni- | 30 eilisen luonteen ennustaminen oli vaikeata. Salpaus voi oi- j

la tapahtunut luennan jälkeen In vivo [F. Wold, I

Ann.Rev.Biochem. 50 (1981) 783 — 814] tai salpaus voi ta- j pahtua in vitro puhdistuksen aikana. Yleisimmin todetaan j \ kahta luennan jälkeen tapahtunutta modifikaatiota. Tietty- j 35 jen N-päsn aminohappojen, kuten Mäin, Ser:n jne., asety- j loi nti voi t apahtua N-slfa-asetyylltransferaasin kata- ;j | 43 lysoimana. Tämä voidaan varmistaa eristämällä K—paan salvattu peptidi ja suorittamalla sen massaspektrometrinen analyysi. Jos proteiinin aminopäässä on glutamiini, voi tapahtua sen gamma-amidin deamidaatio, Sen jälkeen voi tapan-5 tua g a mma-ka rbo ks y1a a t in ja vapaan N-pään syklisaatio, jossa muodostuu pyroglutamaatti. Pyroglutamaatin toteamiseksi voidaan käyttää entsyymiä pyroglutamaattiaminopeptidaasi, Tämä entsyymi poistaa pyroglutamaattitähteen, jolloin toisesta aminohaposta alkava aminopää jää vapaaksi. Sen jäl-10 keen sekventointi voidaan suorittaa Edman-kemiaa käyttäen.

SCF:ää (joka oli puhdistettu kuten esimerkissä 1; 400 piFiol) 50 rrtM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,6; sisältää ditiotreitoiia ja EDTÄ:ta) inkuhoitiin 1,5 yksiköllä vasikanmaksapyroglutamiinihappoarainQpeptidaasia (pE-AP) 16 15 tunnin ajan 37 °C:ssa, Reaktion jälkeen seos panostettiin \ suoraan proteiinisekventoijaan:. Runsas sekvenssi voitiin \ identifioida 46 kierroksella. Alkuperäinen saanto1 oli noin | 4Ö % ja kertautuva saanto oli 94,2 %. SCF:n N-pääsekvenssi | mukaan lukien M-;pään pyroglutaamiinihappo oli seuraava: | 20 | ρΞ-ΑΡ-piikkomiskeskus j 4 io | pyroGlu-Glu-31e-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp-I1e-Thr-Lys- \ m 30 ;j

Leu-Val-Äla-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Het-iVe-Thr-teu-Asn-Tyr-Val- j 40 | ATa-Gly-Het-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-Hls-xxx-lrp-Leu-Arg-Asp-___________ j xxx, ei määritetty asemaan 43 | $ j 5

25 I

i : j $ 44 Nämä tulokset osoittivat, että SCF sisältää pyro-glutamiinifrapon N-päässään.

E. CNBr-peptidien eristys ja sekvenssianalyysi SCF:ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 5 {20 - 28 pg; 1,0 - 1,5 nmol}, käsiteltiin N-glykanaasilla kuten kuvattiin esimerkissä 1. Materiaalin, jolle Mr = 26 000, konversio oli täydellinen tässä tapauksessa. Näyte kuivattiin ja. sitä pilkottiin CNEr:llä 7ö-%:isessa muurahaishapossa (5 %) 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Piik-10 fcomistuotetta laimennettiin vedellä, se kuivattiin ja uu-delleenliuotettiin sitten 0,l-%:iseen trifluorietikkahap-poon. CNBr-peptidlt erotettiin käänteisfaasi-HPLCrllä käyttäen C4-kape,ahUokoskolonnia ja eluointiolosuhteita, jotka olivat identtiset tämän esimerkin osassa Ά kuvattuihin nah-15 den, Eristettiin useita runsaita peptidifraktioita, jotka j

sekventoitiin, mistä tulokset ori koottu seuraa vaan: J

Peptidi Retentioaika Sekvenssi4 (min} GB-4 15,5 L-P-P----- j * GB-61 22,1 a. I~T-L—H-Y-V-A—G-(H) |

b. V-A-S-O-T-S-D-O-V-L-S^-^-L-G-P-E-K-D- I

S-R-i'-S-V-(_}—K—-- I

GB-8 28,:0 i).-V-L-F-S~H-.C-W-L~R-ö:-(K): | jj GB-1Q 30,. 1 ( sisältää sekvenssin CB-8) j GB-IS* 43,0 Γ-E -H-A-P-K-H-V-K.-E-S -i-K-K—P-T-R- (N)-F- | T-P-E ~ E-F-F-S-1-F-D3-R-S-1-0-A------- ] GB-14 37,3 | j.a | GB-16 Molemmat peptidit sisältä- j

vät CG-15:een nähden ident- I

j ti sen sekvenssin. ) | h ;!jj .¾ 45 1. Aminohappoja ei todettu asemissa 12, 13 ja 25*

Peptidiä b ei sekventoitu loppuun.

2. (N):ää CB-15:ssä ei todettu; se pääteltiin mahdollisen M-kytketyn glykosylaatiokeskuksen nojalla, Pep>Li- 5 dia ei sekventoitu loppuun.

3. Merkitsee kohtaa, jossa Asm on mahdollisesti muuttunut Aspiksi N-glykanaasin poistaessa N·-kytketyn sokerin , 4. Käytettiin yksikinjainkoodia: A, Ala; C, Cys; D, 10 Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, Hi s; I, Ile; K, Lys; L,

Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T,

Thr; V, Vai; W, Trp; ja Y, Tyr.

F. BRL-kantasolutekijätrypsixnifragmenttien eristys 15 ja sekventointi SCFiää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 j (2Q pg 150 pii ssä 0,1 M ammoniumbikarbonaattiliuQsta), pii- | kattiin 1 pgilla trypsiiniä 37 °C:ssa 3,5 tunnin ajan, j

Pilkkomistuotteella suoritettiin välittömästi käänteis- j 20 faasikapeahuokos-Ci-HPLC käyttäen eluointiolosuhteita, jot- | ka olivat identtiset olosuhteisiin nähden, joita kuvattiin | tämän esimerkin osassa A, Kaikkien eluöitujen peptidipiik- j kien retentioajat poikkesivat ei-piiketun SCFin (osa A) re- ]

tentioajasta· Eristettyjen peptidien sekvenssianalyysit I

25 esitetään alla: J

J

| \ j \ \ \ \ \ \ | s

:S

S

4 6

Peptidi Retentio- Sekvenssi4 aika (min)

T-l 7,1 E-S-L-K-K-P-E-T-R

Ϊ-21 28,1 V-:S-V-!_)-K

T-3 3 2,4 i-V-D-D-L-V-A-A-M-E-E-N-A-P-EC

T-42 4 0 j G N-F-T-P-E-E-P-P-S-I-F-(_)-R

T-53 46j4 a, L-V-A-E-L-P-N-D-i-M-I-T-L-H-Y-y-A-G- M-D-V-L-P-S-H-C-W-E-R bf S-I-D-A-F-K-D-F-H-V-A-S-D-T-S-D-C-V~ L-S-{ J-{ J-L-G---- T-74 72f8 E-S-E-K-K-P-S-T-R-(H)-P-T-P-E-E-F-F-

S-I-F-(_)-R

T-8 73j 6 E-S-L-K-K-P-E-T-R-R-F-T-P-E-E-F-F-S-I- F—p-R_ 1. Aminohappoa asemassa 4 ei määritetty, 2. Anihohappoa asemassa 12 ei määritetty.

3. Aminohappoja asemissa 2.0 ja 21 6:ssa peptidissä S T-5 ei identifioitu; ne määritettiin alustavasti 0- kytfcettyjen sokerien kiinnityskeskuksiksi.

4. Aminohappoa asemassa: 10 ei todettu; se pääteltiin Asn:ksi mahdollisen N-kytketyn glykosylaatipkeskuksen nojalla. Aminohappoa asemassa 21 ei todettu.

1.0 G. BRL-kantasointekijäpeptidien eristys ja sekven-fcointi pilkkomisen Jh_ aureus Glu-C-proteaasilla jälkeen SCF:llä., jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 | (20 pg 150 plussa 0,1 M ammoniumbikarbonaattilieosta) , suo- | 15 rl tehtiin pilkkominen Glu-G-proteaasiila proteaasi-subs- :] treattisuhteen ollessa 1:20. Pilkkominen suoritettiin : 37 °C:ssa 18 tuntia kestävänä. Pilkkomistuote erotettiin, välittömästi käänteisfaasi-kapeahuo:kos-C4-HPLG:llä. Kerättiin viisi runsasta peptidifraktiota, jotka sekventoitiin 20 kuten kuvataan alla.

| 47

Peptidi Retentio- Sekvenssi aika (min) S~1 5,1 R-A-P-K“N-V“K“£ S-21 27,7 S-R-V-S-V- (-K-P~F-M-L-P-P-V-A- (A) S-32 46,3 Sekvenssiä ei todettu S-S2 71,0 S-L.-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-

(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-H-V-A-S-D

S-63 72,6 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-

{N)-R-S-I-D-A-P-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D

1. Aminohappoa asemassa 6 S~2-peptidissä ei määritetty; tämä voisi olla O-kytketyn sokerin ki.innityske.skus.

5 Ala asemassa 16 S-2-peptidissä todettiin alhaisena saanto- I

na.

2. Peptidi S-3 voisi ojia N-päästä salvattu pepti- j di, joka on peräisin SCF:n .N-päästä. j 3. N sulkeissa määritettiin mahdolliseksi N-kytkelo tvn Sokerin kiinnityskeskukseksi. 1 H. BRL-kantasolu teki jän sekvenssianalyysi pilkkomisen BNPS-skafcolilla jälkeen SCF: aä (2 pg) 10 mM ammoniumbikärbonaatlliuoksessa

15 kuivattiin täydellisesti tyhjösentrifugoimalla, minkä jäi- I

i keen se uudelleenliuotettiin 100 plraan jääetikkaa. Lisät- | tiin sen määrään nähden 10 - 20 kertainen mooliylimäärä BNPS-skatolia ja seosta inkuboitiin 50 °C:ssa 60 minuutin ajan. Sen jälkeen reaktioseös kuivattiin tyhjösentrifugoi-20 maila:. Kuivattua jäännöstä uutettiin 100 piillä vettä ia toistamiseen 50 piillä vettä. Sitten yhdistetyllä uutteella 1 : s . j ;| Ϊ 48 suoritettiin sekvenssianalyysi kuten edellä kuvattiin. Todettiin seuraava sekvenssi: 1 10

Leu-Arg-Asp-Het-Val-Thr-'Hi s-Leu-Ser-Va'I ~5er-Leu-Thr-Thp-Leu-Leu-20 30 Asp-Lys-Phe-Ssr-Asn-Ile--Ser-6iu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr-Ser-ne-] le- 40

Asp-Lys-Leu-GTy-Lys-ne-Val-Asp—

Asemaa 28 ei määritetty varmuudella; se määritet-5 tiin Äsn:ksi mahdollisen lvi—kytketyn glykosyiaatiokeskuksen nojalla.

I. BRL-kanfcasolutekij an C-pään aminohappomääritys SCF“proteiininäytteellä (500 prool): suoritettiin puskurivaihto 10 mM natriumaselaattiin, pH 4,0 (lopputila.” 10 vuus 90 μΐ) ja lisättiin Bri.j-35-välmistetta pitoisuuteen 0,05 % (w/v), Proteiinin kvantitoxmiseksi otettiin 5 μ1:η 1 näyte, 4 0 μΐ näytteestä laimettiin 100 pli.ks.i lisäämällä j edellä kuvattua puskuria. Lisättiin karboksipeptidaasi~P:tä (PeniclIlium janthinelluni) entsyyiui-substraattisuhteessa 15 1:200. Pilkkomisen annettiin tapahtua 25 °C:ssa ja 20 μ1.:η näytteitä otettiin ajankohtina 0, 15, 30, 60 ja 120 min.

Pilkkominen päätettiin kunakin ajankohtana lisäämällä trif-luorietikkahapppa loppup i t o i s uu teen 5 %. Näytteet kuivattiin ja vapautuneista aminohapoista muodostettiin johdan— 20 naiset saattaalla ne reagoimaan Dabsyl-kloridin (dimetyy- liaminoatsobentseenisulfonyylikloridi) kanssa 0,2 M NaHCCb-liuoksessa (pH 9,0) 70 °C:ssa 12 minuutin ajan [Chang et ai., Methods Enzymol. 90 (1983) 41 - 48]. Aminohappojohdannaiset (1/6 kustakin näytteestä) analysoitiin kapeahupkos- |

25 käänteiaf aasi-HPLG :llä käyttäen muunnosta Changin et ai. J

menettelystä ["Techniques in Protein Chemistry", T. Hugli, j to im. Academic Press, NY, 1989, ss. 305 - 311]. Kvantita- j tiiviset koostumustulokset kunakin aj an kohtana saatiin ver- j taamalla aminohappojohdannaisstahdardeihin .(1 pmol) . Ajan- j

30 kohtana. 0 todettiin kontaminoivaa glysiiniä. Alaniini oli I

\ ainoa aminohappo, jonka määrä kasvoi inkubointiajan pide- j jfl 9 tessä, Kahden tunnin inkuboinnnin jälkeen Älä:aa todettiin kokonaismäärä 25 pmol, mikä vastaa 0,66 mol vapautunutta Ala:aa pröteiinimoplia kohden. Tämä tulos osoitti, että luontainen nisäkäs-SGF-molekyyli sisältää Ala l aa karboksyy-5 lipaässään, mikä sopii yhteen C-pään peptidin, S-2, sek venssianalyysin kanssa sen sisältäessä C-päässä Alain. Tära johtopäätös sopii niinikään karfooksipeptidaasi-p: Ile; tunnettuun spesifisyyteen [Lu et ai,, J. G hioma to g. 447 .(:1988) 351 - 364]. Esimerkiksi pilkkominen päättyy, jos sekvenssi 10 Pro-Val tulee vastaan.. Peptidin S-2 sekvenssi on S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-Ä-(A), ja se pääteltiin SCFin C-paä-peptidiksi (katso osa J tässä esimerkissä). Q-pääeekvenssi ;—;-P-V-A-(A) rajoittaa pröteaasipilkkömisen. vain a la niiniin . Peptidin S-2 aminohappokoostumus osoittaa, että. läsnä 15 ovat 1 Thr, 2 Seriiä, 3 Pro: ta, 2 Ala: aa, 3 Vai: ia;, 1 Het, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys, ja 1 Arg, mikä on kaikkiaan 16 tähdettä, Kahden AlaHiähteen toteaminen osoittaa, että tämän pep- j pidin C-päässä saattaa olla 2 Ala-tähdettä (katso taulukko osassa G). Täten BRL-SCF päättyy Ala 164:ään tai Ala j 20 165:een. j J. SCF:n sekvenssi j

Yhdistämällä tulokset, jotka saatiin sekvenssiana- j lyydeistä (1) ehyelle kantasolutekijälle sen jälkeen, kun j sen N-pään pyroglutamiinihappo oli poistettu, (2) CNBr- ( 25 peptideille, (3) trypsiinipept. ideille, ja (4) Glu-C- | peptidaasifragmenteille, pääteltiin N-pääsekvenssi ja C- ;] pääsekvenssi (kuvio 11) . N-pääsekvenssi alkaa pyrogiuta- j miinihaposta ja päättyy Met-48:aan. C-pääsekvenssi sisältää 84/85 aminohappoa (asemat 82 - 164/165). Sekvenssiä asemat ] 30 49 - 81 ei todettu mistään eristetystä peptidistä, Kuiten- | kin sekvenssi todettiin suurelle peptidille, kun BRL—SCFiää j ©li pilkottu BNPS-skatolilla kuten kuvattiin tämän esimer- j kin osassa H. Näistä lisätiedoista sekä DNA-sekvenssistä, j joka saatiin rotta-SCF:lie (esimerkki 3), N- ja C-pään sek- j 35 venssit voidaan asettaa rinnan ja kaikenkaikkinen sekvenssi | asettaa kuten esitetään kuviossa 11, Molekyylin N-päässä on | | $ ..¾ 50 pyroglutarniinihappo ja C-päässä. on alaniini, minkä varmistavat pyroglutamäättiaminopeptidsasipilkkominen ja vastaavasti karboksipeptidaasi-P”pilkkomin.en.

Sekvenssitiedoista päätellään, että Asn-72 on gly-5 kosyloitu; Asn-109 ja Asn-iSO ovat todennäköisesti gly-kosyloituja joissakin molekyyleissä mutta eivät toisissa.

Asn-65 voitiin todeta sekvenssianalyysissa ja tämän vuoksi saattaa olla, vain osittain glykosyloitu, jos sitäkään. Ser-142:ta, Thr-143;ea ja Thr-155:tä/ jotka pääteltiin DNA-sek-10 venssistä, ei voitu codeta aminohapposekvenssianalyysissa, joten ne voisivat siten olla O-kytketyn hiilihydräattikiin-nityksen keskuksia,. Nämä mahdolliset hiilihydraattikiinni-tyskeskukset on merkitty kuvioon 11; N-kytketty hiilihydraatti on merkitty lihavoidulla umpikirjaimella; O-kytketty.

15. hiilihydraatti on merkitty avoimella lihavoidulla kirjat- 1 meila. j K. BRL-kantasointekijän aminohappokoostumusanalyysi j

Materiaalia kuvion 1 mukaisesta C,3-kolonnista valmisteltiin aminohappokoostumusanalyysiin konsentroimalla ja 20 suorittamalla puskurivaihtp 50 mM ämmäniumb.ikarbonaatti liuokseen .

Kaksi 70 μΐ:n näytettä hydrolysoitiin erikseen 6 N j HClrssä,; joka sisälsi 0,1 % fenolia ja 0,05 % 2-merkap- ! toetanolia, 110 °C:ssa tyhjössä 24 tunnin ajan. Hydrolysaa- | 25 tit kuivattiin, rekonstituoitiin natriumsitraattipuskuriin | ja analysoitiin ioninvaihtokromatografisesti (Beckman malli | 6300 - a m i n o h a p p o a n a 1 y s a a 11 o r i) . Tulokset on esitetty taulu- ] kossa 3. 164 aminohapon; (prOteiinisekventointitiedoista) |

käyttäminen aminohappokoostumuksen arvioimiseksi antaa pa- I

30 remman yhteensopivuuden ennustettuihin arvoihin kuin 193 : aminohapon (pääteltyinä FGRillä: saadusta DNA-sekventointi- :{ tiedosta, kuvio 14C) käyttäminen. | s u 51

Taulukko 3

Misäkäsperäisen SGF:ii kvantitatiivinen aminohappokoostumus Äminohsppokoostumus Tähde-ennuste mol/mol proteiinia1 molekyyliä kohden2 aminohappo ajo nro 1 ajo nro 2 (a)

Asx 24,46 24,26 25 28

Thr 10.37 10.43 11 12

Ser 14 52 14 30 16 24

Glx il 44 11.37 ID ID

Pro 10 90 10 85 9 10

Gly 5,81 6,20 4 5

Ala 8,62 8,35 7/8 8

Cys nd^ nd 45

Vai 14,03 13,96 15 15

Het 4,05 3,99 6 7

Pe 8 31 S 33 9 10

Leu 17 02 16 97 16 19 ,

Tyr 2 86 2 84 3 7 j

Pbe 7,96 7 92 8 8 i

Hi s 2,11 2 11 2 3 \

Lys 10 35 11 28 12 14 |

Trp nd nd 1 1 1

Arg 4j93 4,,99 S 6 | T58 Ϊ58 164/165 T§3 |

Laskettu molekyylipaino 18,424^ j . .. .... .· ________......... . . | \ \ 158 tähteen nojalla prötelinisekvensslanalyysis- ! i 5 ta: (ei Cys eikä Trp) . | 2. Teoreettinen arvo arvioituna prote:iinisekyen.ssi~ f tiedosta (A) tai DNÄ-sekvenssitiedosta (B) . | 3. 1 - 164 -sekvenssin nojalla. | 4. nd ~ ei määritetty. ] 10 |

Koska aminohappokoosturciusanalyyseissa mukaan sisällytettiin tunnettu määrä sisäistä standardia, näytteen sisältämän proteiinin kvantitointi oli samoin mahdollista; analysoidulle näytteelle saatiin arvo 0,117 mc/ml.

52

Esimerkki 3

Rotta- ja ibmis-SGF-geenien kloonaus Ä. Rotta - SGF~ cDHÄ- fragmenttien vahvistaminen ja sekventointi 5 Rotta-SCF-proteiinin fragmenttien aminohappose kvenssin määritys mahdollisti rotta-SCF:lie spesifisten se-kasekvenssioligonufcleotidien suunnittelun. Kyseisiä oligo-nukleotideja käytettiin hybridisaatiokoettimina rotta-cDNA-ja -genomikirjastojen seulomiseksi sekä alukkeina pyrittä-10 essä vahvistamaan osia cDNA: sta käyttäen polymeraasiket:ju-reaktio- (PCR -) strategioita [Mullis et ai., Methods in En-zymol, 155 (1987) 335 - 350]. Oligodeoksinukleotidit syntetisoitiin fosforamidiittimenetelmällä [Beaucage et .ai. / |

Tetrahedron Lett . 22 (1981) 1859 - 1862; McBride et ai., ] 15 Tetrahedron Lett. 24 (1983) 245 - 248]; niiden sekvenssit \ on esitetty kuviossa 12A. Kirjaimet merkitsevät: A, adenii- j nia; T, tymiiniä; C, sytosiinia; G, guaniinia; I, inosii- j nia. Tähti (*). kuviossa 12A merkitsee oligonukleotideja, | jotka sisältävät restriktioendonukleaasitunnistussakvensse- j 20 jä. Sekvenssit on merkitty suunnassa 5' —» 3 ’ . j

Rottagenomikirjasto, rottamaksä-cDNA-kirjasto sekä 1 kaksi BRL-cDNA-kirjastoa seulottiin käyttäen 33P-Ieimattuj a f sekaoligonukleotidikoettimia:, 219-21 ja 219-22 (kuvio 12A) , joiden sekvenssit perustuivat esimerkin 2 mukaisesti saa- 25 tuun aminohapposekvenssiin. SCF-klooneja ei eristetty nais- f sä kokeissa cDNA-kloonauksen vakiomenetelmiä käyttäen [Ma- 1 niatis et ai., "Molecular .Cloning", Cold Spring Harbor, j 1982, 212 - 246]. \

Vaihtoehtoisen lähestymistavan mukaan, joka: todella ] 30 johti SCF-nukleiinihapposekvenssien eristämiseen, käytöt- j tiin PCR-tekniikoita. Tässä metodologiassa kahden DNA-aluk- j keen kattamaa DNA-aluetta vahvistetaan selektiivisesti in 1 vitro suorittamalla useita replikaatiokierroksia katalysoiden sopivalla DNA-polymeraasilla (kuten Taql-pNA-polyme- 35 raasi) deoksinukleosiditrifosfaattien läsnä ollessa lämpö- 1 . i kierrättäjässä. PCR-vahvistamisen spesifisyys perustuu kah- 1

S

$ j i $ i 53 teen oligonukleotidialukkeeseen, jotka sivuavat vahvistettavaa DNÄ-segmenttiä jä hybridisoituvat vastakkaisiin sai-keisiin. PCR, jonka spesifisyys on kaksipuolinen tietylle DNA-alueelle kompleksisessa seoksessa, suoritetaan käyttä-5 millä kahta aiukelta, joiden sekvenssit ovat riittävän spesifiset tuolle alueelle. RCR-ssä, jonka spesifisyys on yksipuolinen, käytetään yhtä aluespesifistä aiuketta ja toista alukettta, joka kykenee toimimaan alukkeena kohdekeskuk-sissa, joita esiintyy monissa tai kaikissa DNA-molekyy-10 leissä tietyssä seoksessa [Loh et ai., Science 243 (1989) 217 - 220].

Onnistuneiden PCR-vahvistamisrea ktioiden DNA-tuotte et ovat: DNÄ-sekvenssi-informaation lähteitä [Gyliensten, Biotechniques 7 (1989) 700 - 708], ja niitä voidaan käyttää 15 leimattujen, hybridisaatiokoettimien valmistamiseksi, jotka ovat oligonukleotidikpettimia pitempiä: ja spesifisempiä.

PCR-tuotteita voidaan niinikään tärkoituksenmukaisia alu-kesekvehssejä käyttäen suunnitella kloonattaviksi plasmidi- | vektoreihin, jotka mahdollistavat kooditetun. peptidituot- { 20 teen ilmennyksen.

Perusstrategia rotta~SCF-cDNA:n, DNA-sakvenssin saamiseksi hahmotellaan kuviossa 13A. Pienet nuolet osoittavat PCR-vahvistukset ja paksut nuolet osoittavat DNA-sekven-tointireaktiot. PCR:iä 90.6 ja 96.2 yhdessä DNA-sekven-25 tpinnin kanssa käytettiin osittaisen nukleiinihapposekvens-sin saamiseksi rotta-SCF-cDNA:lie. Näissä PCR;issä käytetyt alukkeet olivat sekaoiigonukleotideja, jotka perustuivat kuviossa 11 esitettyyn aminohapposekvenssiin. PCR:istä 90.6 ja 96.2 saatua sekvenssi-informaatiota käyttäen valmistet-30 tiin ainutkertaisia sekvenssialukkeita (224-27 ja 224-28, kuvio 12A), joita käytettiin seuraavissa vahvistamis- ia Ϊ sekventointireaktioissa. cDNÄ;n 5'-pään sisältävä DNA saatiin PCR:istä 90.3, 96.6 ja 625.1 käyttäen PCR:ää, jonka spesifisyys oli yksipuolinen. Lisä-; DNA-sekvenssi läheltä 35 SCF-proteiinin C-päätä saatiin PCR:stä 90.4. hopun rotta-3CF-cDNA::n koodiälueesta DMA-sekvenssi saatiin FCR-tuot- 54 teista 630.1, 630.2, 84.1 ja 84.2 kuten kuvataan alla tämän esimerkin osassa C, ;Rptta-SCF-qDNA:n. saamiseksi käytettyjä tekniikoita kuvataan alla.

RNA valmistettiin BRL-soluista kuten kuvaavat 5 Okayama et ai. [Methods Enzymol. 154 (1987) 3 - 28] . Po- lyA+-RNA eristettiin käyttäen oligo(dTj-selluloosakolonnia kuten kuvaa Jacobson julkaisussa Methods in Enzymoloqy 152 (1987) 254 - 2 61] .

1. säikeen cDNÄ syntetisoitiin käyttäen 1 pg RRL-10 polyA-t-RMA: ta templaattina ja (dT) 12-10: aa alukkeena entsyymin, Md-MLV-käänteisköpioijaentsyymi (Bethesda Research Laboratories), mukana toimitetun menettely]ärjestelyn mukaan. RNA-säiehajotus suoritettiin käyttäen 0,14 M NaOH-liuosta 84 °C:ssa 10 minuutin ajan tai inkuboimaila kiehuvassa ve-15 sihauteessa 5 minuutin ajan. Liuoksen neutraloimiseksi lisättiin ylimäärin aramoniumasetaattia ja cDNA uutettiin en- j

s in fenoli/kloroformilla ja sitten kloroformi/isoamyyli- I

alkoholilla, sekä seostettiin etanolilla. Jotta oligo(dC) -sukuisten alukkeiden käyttö PCR:issä, joiden spesifisyys on 20 yksipuolinen, olisi mahdollista, poly (dG)-jatke: lisättiin erän 1. säikeen cDNAita 3'-päähän käyttäen vasikankateen-kofvapäätytransferaasia (Boehringer Mannheim) kuten aiemmin on kuvattu [Deng et ai., Methods Enzymol. 100 (1983) 96 - 103] .

25 Ellei seuraayissa 'kuvauksissa· ole toisin, mainittu, denaturoimisvaihe kullakin PCR-kierroksella suoritettiin 94 °C: s-sä 1 minuutin kestävänä; ja pidennys suoritettiin 72 °C:ssa 3 tai 4 minuuttia kestävänä. Lämpötila ja juoton kesto vaihtelivat PCR:stä toiseen niiden edustaessa monasti j 30 kompromissia samanaikaisesti suoritettujen useiden eri ] PCR: ien arvioitujen vaatimusten välillä. Alennettaessa alu- :! j kepitoisuuksia alukevaletuotteideh kerääntymisen vähentämi- i seksi [Watson, Amplifications 2 {1989) 56] tarvittiin pi- ] tempiä juottoaikoja; kun PGR-tuotepitöisuus oli korkea, j 35 saannon kasvattamiseksi käytettiin lyhempiä juottoaikoja ja j korkeampia alukepitoisuuksia. Tärkeä tekijä juottolämpöti- j i \ \ i 5:5 laa määrättäessä oli aluke-kohdeli.it tyrni se-n arvioitu Td [Suggs et ai., kirjassa ''Developmental Biology Using Purified Genes", toim. Brown, D.D., ja Fox, C.F., Academic, New York, 1981, ss. 683 - 693]. Vahvistamisissa käytetyt ent-5 syymit saatiin joltakin kolmesta valmistajasta: Stratagene,

Promega tai Perkin-Elmer Cetus. Reaktioyhdisteitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vahvistamiset suoritettiin joko Coy Terrtpcycie -laitteessa tai Perkin-Elmer Cetus -DNA-lämpökierrättäjässä.

10 SCF-cDNA-fragmenttien vahvistaminen määritettiin t avallisesti agaroosi geeliele ktrofo reet ti s e st i et idiumbro- m.idin läsnä ollessa ja tuotteet visualisoitiin tekemällä DNA-nauhat fluoresoiviksi ultraviolettisäteilyllä stimuloiden . joissakin tapauksissa, kun odotettiin pieniä fragment- i 15 teia, PCR-tuotteet analysoitiin poiyakryyliarnidigeelielekt- ; roforeettisesti. Vaivistus siitä, että havaitut nauhat edustivat SCF-cDNÄ-fragmentieja, saatiin tarkastelemalla sopivia DNA-nauhoja seuraavassa vahvistuksessa yhtä tai useampaa sisäisesti asettunutta a liikettä käyttäen, löpnlli- | 20 nen vahvistus saatiin suorittamalla PCR-tuotteen d-ideok- j sisekventointi [Sanger et ai,, Pr0 c.N a11.Acad.Sei, USA 71 (1977) 5463 - 5467] ja vertaamalla ennakoituja luentatuot- teita SCF-peptidisekvenssi-inforraaatioon.

Alustavissa PCR-kokeissa käytettiin SCF-proteiini- Ϊ 25 sekvenssiin perustuvia sekaoligonukleotideja [Gould, [f

Proc. Natl.Acad.Sei. USA 86 (1989) 1934 - 1938]. Alla kuva- j taan PCR-vahvistuksia, jolta käytettiin DNA-sekvenssi- 1 informaation saamiseksi aminohapot -25 - 162 koodittavasta \ rotta-cDNA:sta. \ 30 PCRrssä 90,6 BRL-cDNA:ta. vahvistettiin käyttäen 4 :j pmol kumpaakin 222-11:tä ja 223-6:tä 20 μ1:η reaktiot!la- j ! vuodessa. Näytteellä PCR:n 90.6 tuotteesta suoritettiin j elektroforeesiajo agaroosigeelissä ja havaittiin odotusten mukaista kokoa suunnilleen vastaava nauha. 1 μΐ PCR:n 90.6 35 tuotetta vahvistettiin edelleen käyttäen 20 pmol kumpaakin aluteetta 222.-11 ja 223-6 50 piissä 15 kierroksella: juottaen

: ^ ;I

56 45 °C:-ssa. Osalla tästä tuotteesta suoritettiin sitten 25 vahvistamiskierrosta alukkeiden 222-11 ja 219-25 (PCR 96.2) läsnä ollessa, jolloin agaroosigeelielektroforeesissa saatiin yksi yksittäinen pääasiallinen tuotenauha. PCR: n 96.2 5 tuotteen asymmetrinen vahvistaminen samoja kahta alukettä käyttäen tuotti templaatin, joka sekventoitiin menestyksekkäästi. SCF-sekvenssien tuotteessa 96.2 edelleenvahvistami-nen selektiivisesti suori tettiin tuotteen PCR-vahvista-misena, kun läsnä olivat 222-11 ja asettunut aluke 219-21.

10 Tämän PCR:n tuotetta käytettiin templaattina asymmetriseen yahvistaniiseen sekä radioleimatun koettimen tuotantoon (PCR2).

Rotta-SCF-cDNÄ::n 5'-pään eristämiseksi el-spesifi-Sinä alukkeina käytettiin alukkeita, jotka sisälsivät 15 (dCj η-sekvenssejä, jotka olivat komplementaarista cDWA:n polyfdG)-jatkeille. PCR 90.3 sisälsi (dC)ta (10 pmol) ja 223-6:ta (4 pmol) a lukkeina, ja 3RL-cDMÄ:tä templaattina.

Reaktiotuote toimi kuten aggregaatti, jonka molekyylipainp f on hyvin korkea, jolloin se pysyi lähellä panos tuslähetettä; 20 agaroosigeelielektroforeesissa. Yksi μΐ tuoteiiuostä vah vistettiin edelleen, kun läsnä oli 25 pmol (dC) !2:ta ja 10 pmol 223-6:ta, 25 μ1:η tilavuudessa 15 kierroksella, jol loin juottaminen suoritettiin 45 °C:ssa. μΐ tätä tuotetta vahvistettiin sitten 25 kierroksella käyttäen sisäisesti 25 asettunutta äluketta 219-25 ja 201-7 (PCR 96.6). 201-7:n sekvenssi esitetään kuviossa 12C. Mitään nauhoja ei todettu agaroosigeelielektroforeesissa. Suoritettiin vielä 25 PCR-kierrosta juottaen 40 °C:ssa, minkä jälkeen todettiin yksi selvä nauha. Suoritettiin Southern blot -siirtokopiointi, 30 jolloin havaittiin yksi selvä hybridisoituva nauha. Suori- | tettiin vielä 20 PGR-kierrastä (625. .1) juottaen 45 °C:ssa f ja käyttäen 201-7:ää ja asettunutta aluketta 224-27. Sek- j j ventpinti suoritettiin asymmetrisen vahvistamisen PCR:llä j jälkeen, jolloin saatiin sekvenssi, joka ulottui pre-SCF:n j 35 oletetun signaalipeptidiköqdisekvenssin oletetun aminopään 1 ohi. Tätä sekvenssiä käyttäen. suunniteltiin oligonukleoti- : 57 diäluke 227-29, joka sisältää rotta-SCF-eDNA:n koodialueen 5'-pään* Vastaavasti 3'-DNA-sekvenssi, joka päättyy aminohappoon 162, saatiin sekventoimaila PCR 90.4 (katso kuvio 1.3A) .

5 B. Rotta-kantasolutekijä-genomi-DNA:» kloonaus

Koettimia, jotka valmistettiin vahvistamalla rotta-SCF:ää koodittavaa cDNA:ta PCRnllä kuten kuvattiin edellä osassa Ά, käytettiin kirjaston seulontaa, joka sisälsi rot-tagenomisekvensse jä (jotka saatiin valmistajalta Ci.ONTECH 1Ö Laboratories:, Inc.; kataloginro RH022 j). Kirjasto rakennettiin bakteriofagi-lambda-vektoriin EMBL-3 ΞΡ6/Τ7 käyttäen DNA:ta, joka oli saatu täysikasvuisesta urospuolisesta Sprague-Dawley-rotasta> Kirjasto, kuten sitä karakterisoi valmistaja, sisältää 2,3 x IQ6 riippumatonta kloonia, joi s-15 sa keskimääräinen inserttikoko on 16 keitä.

PCR;.ia käytettiin 32P-leimattujen koettimien muodostamiseksi, joita käytettiin genomikirjaston seulonnassa.

Koetin PCR1 (kuvio 23A) valmistettiin reaktiossa, joka sisälsi pitoisuudet 16, 7 μΜ 32p [alfa] -dÄTP, 200 μΜ dCTP, 200 j 20 μΜ dGTP, 200 μM dTTP, reaktiopuskuria, jonka oli toimitta nut Perkin Elmer Cetus, Taq-polymeraasia (Perkin Elmer Ce-tusj 0,05 yksikköä/ml, 0,5 μΜ 219-26, 0,05 μM 223-6 ja 1 μΐ templaattia 90.1, joka sisälsi kohdekeskukset kyseisille kahdelle alukkeelle. Koetin PCR .2 valmistettiin käyttäen 25 samankaltaisia reaktio-olosuhteita lukuunottamatta, että alukkcet ja templaatti vaihdettiin. Koetin PCR 2 valmistettiin käyttäen pitoisuudet 0,5 μΜ 222-11, 0,05 μΜ 219-21 ja 1 μΐ templaattia, joka oli saatu PCR 96.2:sta.

Noin 106 bakteriofagia maljoitettiin kuten ovat ku- j 30 vanneet Maniat is et ai. [supra, 1982] . Plakit siirrettiin :] j

GeneScreen^-suodattimille (22 cm x 22 cm; NEN/DuPont), j

jotka denaturoitiin, neutraloitiin ja kuivattiin kuten on I

kuvattu valmistajan toimittamassa menettelyjärjestelyssä, j

Kaksi suoda t i n s i irtoa suoritettiin kutakin maljaa kohden.

35 Suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa, jossa oli j pitoisuudet 1 M NaCl, 1 % SDS:ää, 0,1 % nautaseerumiaIbu- | 58 miinia, 0,1 % f i koi ia,,· 0,1 % polyvinyylipyrrolidonia (hyfo-ridisaatioliuos) , noin 16 tunnin ajan 65 °C:ssa ja varas-1, toitiin -20 °C:seen. Suodattimet siirrettiin tuoreeseen hybridisaatioliuokseen, joka sisälsi 32P~leimattua PCR 1 5 -koetintä pitoisuuden 1,2 x 105 tuiketta/min/ml ja hybridi-soitiin 14 tunnin ajan 65 °C:ssa. Suodattimia pestiin liuoksessa, jossa Oli pitoisuudet 0,9 M NaCl, 0, 09 M natrium-sitraatti, 0,1 % SDS:ää, pH 7,2 (pesuliuos), 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä pestiin toi.st.ami-10 seen tuoreella pesuliuoksella 30 minuutin ajan 65 °C:ssa. Bakteriofagikloonit, jotka olivat maljaalueilla, jotka vastasivat radioaktiivisia täpliä autoradiokuvissa, poistettiin maljoista ja seulottiin toistamiseen koettimilla FCRi ja PCR2. j 15 DNA positiivisista klooneista pilkottiin. restrik- | tioendonukleaaseilla BamHI, Sphl tai Sstl, ja saadut frag- j menti.t alakloonattiin pUCli9:ään ja sekventoitiin sitten. j

Strategia rott:agenomi-SCF-DNÄ:n sekventoimiseksi on esitet- | ty kaaviollisesti kuviossa 1.4 A* Tässä kuviossa viivoitus {

20 ylhäällä edustaa rottagenomi-DNÄ:n SCF-ää koodittavaa alu- I

\

että. Aukot viivassa osoittavat alueet, joita ei ole sek- I

ventoltu. Suuret laatikot edustavat eksoneja, jotka koodit- j tavat SCF-geenialueita, jolloin vastaavat kooditetut amino- j hapot on merkitty kunkin laatikon yläpuolelle. Nuolet edus- \ 25 tavat yksittäisiä alueita, jotka sekventoitiin ja joita | käytettiin röttä-SCF-geenin konsensussekvenssin kokoamises- | sa. Rotta-SCF-geenin sekvenssi on esitetty kuviossa 14B. ] Käyttäen PCR 1 -koetinta rottägenomikirjaston seu- |

lomiseksi eristettiin kloonit, j ot ka vastaavat eksoneja, I

30 jotka koodattavat. aminohapot 19 - 176 SCFlssä. Kloonien j saamiseksi eksoneille, jotka ovat ylävirtaan aminohapon 19 j koodialueesta, kirjasto seulottiin käyttäen oligonukleoti- { dikoetinta 228-30. Samaa suodat insarj aa r jota käytettiin aiemmin koettimen PCR 1 kanssa, esihybridisoitiin kuten 35 edellä ja hybridisoitiin hybridisaatioliuoksessa, joka sisälsi 32P-leimattua oligonukleotidia: 228-30 {0,03 pikomoo- i i 59 lia/ml) , 50 °C:ssa 16 tunnin ajan. Suodattimia pestiin pe-suliuoksessa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen pestiin toistamiseen tuoneella pesulinoksella 45 °C:ssa 15 minuutin ajan. Bakteriofagikloonit malja-alu-5 elila, jotka vastasivat radioaktiivisia täpliä autoradioku-vissa, poistettiin maljoista ja seulottiin toistamiseen ko-ettimellä 228-30. DNA positiivisista klooneista pilkottiin restriktioendoHukleaaseilla ja alakloonattiin kuten edellä.

Käyttäen koetinta 228-30 saatiin kloonit, jotka vastasivat 10 aminohapot -20 - 18 koodittavaa eksonia.

Tehtiin useita yrityksiä kloonien eristämiseksi, jotka vastaisivat eksonia tai eksoneita, joka sisältää/ jotka sisältävät 5'-ei-luetun alueen ja koodiaTueen aminohapoille -25 - -21. Mitään klooneja rottä-SCF-geenin 15 tälle alueelle ei ole eristetty. i C. Rotta-cDNA:n kloonaus ilmennettäväksi nisäkässo- j luissa | ...... !

Nisäkässoluiimennysjärjestelmiä suunniteltiin sen j varmistamiseksi, voitaisiinko aktiivinen rotta-SCF-polypep-20 tidituote ilmentää ja erittää nisäkässoluissa. Suunnitel tiin ilmennysjärjestelmiä typistettyjen muunnoksien rotta— SCF:stä ilmentämiseksi (SCF1'1®2 ja SCF1'164) ja proteiinin (SCF1_19j) ilmentämiseksi, joka oli ennustettu kuvion 14 C mukaisen geenisekvenssin luennasta. j 25 Mäissä tutkimuksissa käytetty ilmennysvektori oli | sukkulavektori, joka sisälsi pUC119-, SV40- ja HTLV1- \ sekvenssejä. Vektori suunniteltiin sallimaan itsenäinen f '1 replikaatio sekä E^ colissa että nisäkässöluissa sekä il- | rientämään insertoitu eksogeeninen DNA, vitaalisten DNA- | 30 sekvenssien säätelyn alaisena. Tämä vektori, joka nimettiin j

Vl9.8:ksi, ja joka sisältyy cc li -kantaan DH5, or· talle- ;j tettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collec- i] tion, 12301 Parklavm Drive, Rockville, Md. {ATCC-nro | 68124). Tämä vektori on johdannainen pSVDM19:stäf jota ku- j 35 vataan Souzan US-patenttijulkaisussa 4 810 643, joka sisäl- |

lyhetään täten viitteeksi. I

60 R o t t a - S C F1-162 - e DNA i n s e r t o i t i ia p 1 a smidive k t oriin V19,J. cDNÄ-sökvenssi esitetään kuviossa 14C. cDNA, jota käytettiin tässä rakenteessa, syntetisoitiin PC R-reaktioissa 630,1 ja 630.2, kuten esitetään: kuviossa 13A, Nämä 5 PCR:t edustavat riippumattomia vahvistuksia, joissa käytettiin synteettisiä oligonukleotldialukkeita 227-29 ja 227-30. Näiden alukkeiden sekvenssit saatiin PGR:llä muodostetusta cDNÄ:stä: kuten kuvattiin tämän esimerkin osassa A.

Reaktiot 50 μ1:η tilavuudessa käsittivät pitoisuudet lx re-10 aktiopuskuria (valmistajan Perkin Elmer Cetus pakkauksesta) , 250 μΜ dATP, 250 uM dCTP, 250 μΜ dGTP ja 250 μΜ dTTP, 200 ng oligo(dT)-aiuke-CDNA:ta, 1 pikomooli 227-29:ää, 1 pikomooli 227-3:0:ea ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus). cDNA:ta vahvistettiin 10 kierroksen ver-15 ran käyttäen 1 minuutin; denaturointia 94 °C:n lämpötilassä, juottolämpötilaa 37 °C 2 minuutin ajan ja pidennyslämpötilaa 72 °C 1 minuutin ajan. Näiden alustavien PCR-vähvistamiskierrosten jälkeen kuhunkin reaktioon lisättiin j 10 pikomoolia 227-29:ää ja 10 pikomoolia 227-30:eä. Vahvis-20 taksia jatkettiin 30 kierroksen ajan samoissa olosuhteissa lukuunottamatta, että juottolämpötilaksi vaihdettiin 55 °C. PCR-tuotteet pilkottiin restriktioendonukleaaseilia HindXII ja Sst.II. VI9.8 pilkottiin vastaavasti HindiII: 11a ja SstII:lia, ja yhdessä tapauksessa pilkottua plasmidivekto-25 f ia käsiteltiin vasikansuolen alkalisella fosfataasilla; muissa tapauksissa pilkkomisessa muodostunut suuri fragmentti eristettiin agaroösigeelistä. cDNA ligatoitiin V19.8:aan T4-polynukleQtidiligaasia käyttäen. Ligatointi-tuotteet transformoitiin transformoitumiskeipoiseen ΕΚ_ coli 30 -kantaan DH5 kuten on kuvattu [Okayama et ai., supra, ]

1987], Yksittäisistä bakteeriklooneista valmistettu DNA J

sekventoitiin Sangerin dideoksimenetelmällä. Kuviossa 17: esitetään VI9'. 8-SCF:.n rakenae' Näitä plasmideja käyttäen transfektoitiin nisäkässoluja kuten kuvataan esimerkissä 4 35 ja esimerkissä 5.

61

Ilmennys vektori rotta-SCF1"164: lie rakennettiin käyttäen samankaltaista strategiaa kuin käytettiin SCF1"162: lie, jossa cDNä syntetisoitiin käyttäen PCR-vahvis-tamista, ja insertoitiin sitten V19.8:aan. Rakenteissa käy-5 tetty cDNA syntetisoitiin PCR-vahvistamisissa VT9.8:lla, joka sisälsi SCF1_lo"-cDNÄ:n {V19. 8: SCF1"102) templaattina, käyttäen 227-29*aa alukkeena geenin 5*-päätä silmällä pitäen ja. 237-19:aä alukkeena geenin 3*-päätä silmällä pitäen. Rinnakkaisreaktiot {50 μΐ) sisälsivät pitoisuuden lx reak-10 tiopuskuria, 250 μΜ kutakin dATP;tä, dCTP:tä, dGTP:tä ja dDTTPrtä, 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia, 20 ng V19*8:SCF1' lD2:ta ja 20 pikomoolia kutakin aiuketta. cBNA:ta vahvistettiin 35 kierroksella käyttäen 94 °C:n denaturointilämpöti-laa 1 minuutin ajan, 55 °C:n juottolämpötilaa 2 minuutin 15 ajan ja 72 DC:n pidennyslämpötilaa 2 minuutin ajan. Vahvistamisien tuotteet pilkottiin restriktioendonukleaaseilla HindiII ja SstI ja insertoitiin Vl9.8:aan. Saatu vektori sisältää koodialueen SCF:n aminohapoille -25 - 164, jota s e u r aa p ä ä t ö s ko d on i.

20 cDNä rotta-SCF:n 193 aminohapon muodolle (rofcta- SCF'!"!93 ennustetaan kuvion 14C mukaisen DNA-sekvenssin luennasta) insertoitiin myös plasmidivektoriin V19.8 käyttäen 1 samankaltaista menet te ly järjestelyä; kuin käytettiin rotta- SCF*"162:lie. Tässä rakenteessa käytetty cDNA syntetisoitiin 25 PCR-reaktioissa 84.1 ja 84.2 {kuvio 13A) käyttäen oligonuk-leotideja 227-29 ja 230-25. Mama kaksi reaktiota edustavat riippumattomia: vahvistamisia eri RMA-va Imi s teista lähtien.

227-29:n sekvenssi saatiin PCR-reaktioista kuten kuvattiin tämän esimerkin osassa A ja alukkeen 230-25 sekvenssi saa-30 tiin rottagenomi-DNA:sta {kuvio 14B), Reaktiot, joiden tilavuus oli 50 μ1, koostuivat pitoisuuksista lx reaktiopus-kuria (valmistajan Perkin Elmer Cetus pakkauksesta), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP ja 250 μΜ dTTP, 200 ng oli-go(dT)-aluke-cDNA:ta, 10 pikomoolia 227-29:ää, 10 pikomoo-35 lia 230-25:ta ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus). cDNA:ta vahvistettiin 5 kierroksen ajan käyttä- § x

J

62 en 94 °C:n denaturaintilämpötilaa 1,5 minuutin ajan, 50 °G:fi juottolämpötilaä 2 minuutin ajan ja 72 °C:n pidenny s lämpötila a 2 minuutin ajan. Häiden alustavien kierrosten jälkeen vahvistamisia jatkettiin 35 kierroksen verran sa-5 maissa- olosuhteissa lukuunottamatta, että juottolämpötilak-si vaihdettiin 60 °'C, PCR-vahvistamisen tuotteita pilkottiin restriktioendonukleaasellla HindiII ja Sstl. V19.8-DMA:ta pilkottiin HindiII:11a ja Sstl:llä ja pilkkomisessa muodostunut suuri fragmentti eristettiin agaroosigeelistä.

10 cDNA ligatcitiin V19.8:aan T4-polynukleotidiligaasia käyttäen. Ligatointituotteet transformoitiin transformoltumis-kelpoiseen Ei_ coli -kantaan DH5 ja yksittäisistä bakteeri-klooneista valmistettu DNA sekventoitiin. Näillä plasmi-deilla transfektoitiin nisäkässoluja esimerkissä 4.

15 D. Ihmxs-SCF-cDNA-PCR-tuotteiden vahvistaminen ja j sekventointi \

Ihmis-SCF-cDNÄ saatiin maksakasvalnsolulinjasta |

HepG2 (AICC HB8065) käyttämällä PCR-vahvistamista kuten kuvataan kuviossa 13B. Perusstrategia oli vahvistaa ihmis- 20 cDMA;ta PCR; llä alukkeita käyttäen, joiden sekvenssit saati li n ro t ta-SCF-c DNA:st a.

RNÄ valmistettiin kuten ovat kuvaanneet Maniatis et ai, [supra, 1982]. PolyA+-RNA valmistettiin käyttäen d. liiga- dT-sellulOQsaa noudattaen valmistajan ohjeita. (Collabora- \ :¾ 25 tive Research Inc.), j 1. säikeen gDNA valmistettiin kuten kuvattiin edel- | lä BRL-cDNA:lie lukuunottamatta, että synteesissä käytet- | tiin alukkeena 2 μΜ oligonukleotidia 228-28:, joka esitetään j kuviossa 12C, ja joka sisältää lyhyen satunnaissekvenssin | 30 3'-päässä kiinnittyneenä pitempään yksittäissekvenssiin. j 228-28: n yksittäissekvenssiosa Suo kohde keskuksen PCR- i:j vahvistamiselle alukketta 228-29 ei-spesifisenä alukkeena kä yltäen. Ihmis-cDNA-sekvenssejä, jotka muistuttivat ainakin \ osittain rotta-SCF-sekvenssiä, vahvistettiin HepG2-cDNÄ:sta j 35 PCR* llä käyttäen alukkeita 227-29 ja 228-29 [PCR 22,7, kat- ij so kuvio 13B; 15 kierroksella juottaminen 60 ®C;sSä., mitä j | i 63 seurasi 15 kierrosta juottolämpötliassa 55 °C}. Agaroosi-geelielektroforeesissa ei paljastunut lainkaan erillisiä nauhoja,· vaan ainoastaan, tahra ilmeisesti kooltaan heterogeenistä DNA:ta. Rotta-SCF-cDNA:ta likeisestä muistuttavien 5 sekvenssien ensisijaiseen vahvistamiseen pyrittiin niinikään suorittamalla PCR käyttäen 1 μϊ PCR 22.7:n tuotetta ja sisäisesti asettunutta rctta-SCF-aluketta 222-11 ja alu-ketta 228-29 iPCR 24.3; 20 kierrosta juottolämpötilassa 55 °C) . Jälleen agaroosigeeleissa havaittiin vain hetero-lö geeninen, tahranomainen DNA-tuote. PCR 24.3 “tuotteiden kaksipuolisella spesifisellä vahvistamisella käyttäen aluk-keita 222-11 ja 227-30 (PCR 25.10; 20 kierrosta) saatiin yksittäinen pääasiallinen tuotenauha, joka oli saman kokoinen kuin vastaava rotta-SCF—oDNA-PCR-tuote. Sekventoimalla 15 asymmetrinen PCR-tuote- (PCR 33.1-) DNA käyttäen 224-24:ää sekventointialukkeena saatiin noin 70 emästä ihmis-SCF-sekvenssejä.

Samalla tavalla vahvistettaessa 1 μϊ PCR 22.7:n tuotetta ensin käyttäen alukkeita 224-25 ja 228-29 (PCR 20 24.7, 20 kierrosta) ja sitten alukkeita 224-25 ja 227-30

(PCR 41.11) muodostui yksi pääasiallinen nauha, joka oli saman kokoinen kuin vastaava rotta-SCF-tuote, jolloin siitä I

asymmetrisesti vahvistamalla (PCR 42.3) saatiin sekvenssi, joka oli erittäin homologinen rotta-SCF-sekvenssiin nähden 25 käytettäessä 224-24:ää sekventointialukkeena. Ainutkertaisen sekvenssin oiigodeoksinukleotideja, jotka kohdistuivat ihmis-SCF-cDNÄ:hän, syntetisoitiin ja niiden sekvenssit on esitetty kuviossa 12B.

Ihmisvastineen saamiseksi rotta-SCF:n PCRillä muo-30 dostetulie koodisekvenssille, jota käytettiin ilmennys- ja aktiivisuustutkimuksissa, suoritettiin PCR käyttäen alukkeita 227-29 ja 227-30 ja 1 μϊ PCR 22.7 -tuotetta 50 pien reaktiotilavuudessa (PCR 39.1). Vahvistaminen suoritettiin Coy Terapcycler -laitteessa. Koska ihmis-SCF-cDNA:n ja rot-35 ta-S:CF-yksittäis:alukkeen 227-30 välisen epäsopivuud,en astetta ei tunnettu, ensimmäisillä 3 kierroksella käytettiin $ | δ j 64 j uot tasaista olosuhteissa, jotka eivät olleet ankarat (37 °C) ; tämän jälkeen juottanislämpötilana oli 55 °C. Ilmaantui selvästi näkyvä nauha, jonka koko oli sama (noin 590 ep:tä) kuin rotta homologin,, ja sitä vahvistettiin edel-5 leen laimentamalla pieni osa PCR 39.Iin tuotetta ja suorittamalla PCR samoja alukfeeita käyttäen (PCR 41.1), Koska enemmän kuin; yksi nauha todettiin PCR 41.1:n tuotteissa, suoritettiin edelleen PCR:ia käyttäen sisäisesti asettuneita alukkeita. ainakin osan niiden sekvenssistä määrittämi-10 seksi ennen: kloonausta. 23 PCR-kierroksen jälkeen, joilla käytettiin alukkeita 231-27 ja 227-29 (PCR 51.2), nähtiin yksittäinen voimakas nauha. Asymmetriset PCE:t käyttäen alukkeita 227-29 ja 231-27 sekä sekventointi vahvistivat ihmis-SCF-cDUA-sekvenssien läsnäolon. PCR 41.1 -SCF-DNÄ:n 15: kloonaaminen ilmennysvektoriin V19.8 suoritettiin kuten jo kuvattiin rotta-SCF-l-162-PCR-f ragmenteille edellä; osassa C. DNA yksittäisistä bakteeriklooneista sekventoitiin San- i gerin dideoksimeneteimällä. | E, Ihmis-kantasolv tekijä-genomi-DNA:n kloonaaminen 20 PCR7-koet intä, jot a oli valmistettu cDNÄ:ta PCR:ilä vahvistamalla, katso kuvio 13E, käyttäen seulottiin ihmis-genomisekvehssejä sisältävä kirjasto. Käyttäen ribokoetin-ta, joka oli komplementaarinen osalle ihmis-SCF-cDNA:ta, katso alla, seulottiin toistamiseen positiiviset plakit.

25 PCR 7 -koetin valmistettiin lähtien PCR 41.1:n tuotteesta (kasto kuvio 133). PCR 41.1:n tuotetta vahvistettiin edelleen käyttäen alukkeita 227-29 ja 227-30. Saatu 590 ep:n fragmentti eluoitiin agarcosigaelista jä sitä vahvistettiin toistamiseen käyttäen samoja alukkeita (PCR 58.1). PCR 30 58.l:n tuote laimennettiin 1 OöQkertaisesti 5Q pii aan reak- | tioseosta, jossa oli 10 pmoi 233-13:ea, ja vahvistettiin 10 kierroksen verran. Rea ktioseo k seen lisättiin 10 pmol 227-30:ea, minkä jälkeen PCR:ää jatkettiin 20 kierroksen verran. Lisättiin vielä 80 pmol 233-13:ea, reaktiotilavuus 35 nostettiin 90 piiksi ja PCRiää jät ket ti in 15 kierroksen verran. Reaktiotuotteet laimennettiin 200-kertaisesti 50

S

65

Ui: n reaktioseokseen, lisättiin 20 pmol 231-27:ää ja 20 pmol 233-13:ea, minkä jälkeen PCR:iä suoritettiin 35 kierroksen verran käyttäen juottolämpö.t ilg.a 48 °G reaktiossa 96.1. j2P-leimatun PCR7: n valmistamiseksi käytettiin sainna-5 Iäisiä reaktio-olosuhteita, kuin käytettiin PORI:n valmistamiseksi , seuraajin poikkeuksin: 50 μ1:η reaktiotilavuu- teen PCR 96.1:· ta laimennettiin löO-kertaisestl; ainoana alukkeena käytettiin 5 pmol 231-27:ää; ja suoritettiin 45 PCR-k i e rro s t a denaturoiden 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, juot-10 taeh 48 °C:ssa 2 minuutin ajan ja pidentäen 12 °C:ssa 2 minuutin ajan.

Ribokoetin, ribokoetin 1, oli 32P-leimattu yksi säikeinen EN A, joka oli komplementaarinen h S C F-DNA-se kven s s i n nukleotideille 2 - 4 36, joka. sekvenssi esitetään kuviossa 15 15B. Vektorin rakentamiseksi tämän koettimen tuottamiseksi PCR 41.1:n: (kuvio 13B) tuote-DNA:ta pilkottiin HindlXI:llä ja EcoRUllä, minkä jälkeen se kloonattiin polyliittäjään plasmidivektorissa pGEM3 (Promega, Madison, Wisconsin). Yh-distelmä-DNÄ-pGEM3:hSCF-plasmidi-DNA linearisöitiin sitten 20 pilkkomalla Hindlll: lla:. 32P-leiinattu ribokoetin 1 valmistettiin linearisoidusta plasmidi-DNÄ:sta Promegan toimittamia ohjeita noudattaen "run-off"-kopioimalla T7-RNA- i polymeraasilla. Reaktio (3 μΐ) sisälsi 250 ng linearisoitua plasmidi-DNÄ:ta ja pitoisuuden 20 μΜ 32P-rCTP:tä (katalo-25 ginro NEG-Q08H, New England Nuclear (NEN), eikä sisältänyt lainkaan ylimääräistä ei-leimattua C7P:ta.

IhiRisgenomikirjasto saatiin valmistajalta Stratage-ne (La Jolla, CA; kataloginro 946203). Kirjasto rakennettiin bakteriofagi Lambda Fix II -vektoriin käyttäen DNÄ:ta, 30 joka oli valmistettu kaukaasialaisesta urospuolisesta istukasta. Kirjasto, valmistajan karaktefisöinnih mukaan, sisälsi 2 X 106 primaariplakkia, joissa keskimääräinen in-serttikoko oli yli 15 ke:tä. Noin 10° bakteriofagia maljoi- | tettiin kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. [supra, 1982]. ] 35 Plakit siirrettiin Gene Screen Plus™ -suodattimille (22 j cm2; NEN/DuPont) valmistajan toimittaman menettelyjärjeste- | j 66 lyn mukaan. Kutakin maljaa kohden suoritettiin kaksi suoda-tinsiirtoa.

Suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa 6XSSG <0,9'

M NaCl, 0,09 M natriumsitraatti, pH 7,5), 1 % SDS

5 60 °C:ssa. Suodattimia hybridisoitiin vastavalmistetussa liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS, joka sisälsi 32P-leimattua PCR 7 -koetinta pitoisuuden 2 x 105 tuiketta/min/ml, ja hybridi-soitiin 20 tunnin ajan 62 °C;ssa. Suodattimia pestiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS 16 tunnin ajan 62 °C:ssa. Bakterio-10 fagitulppa poistettiin malja-alueelta, joka vastasi radioaktiivisia täpliä autoradiokuvissa, ja seulottiin toistamiseen koettimella PCR 7 ja ribokoettimella 1. Toistamiseen seulominen koettimella PCR 7 suoritettiin samanlaisissa Olosuhteissa kuin käytettiin alkuperäisessä seulonnassa.

15 Uudelleenseulonta ribokoettimella; 1 suoritettiin seuraavasti; suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS, ja hybridisoitiin 62 °C:ssa 18 tunnin ajan liuoksessa 0,25 M NaPCt (pH 7,5), 0,25 NaCl, 0,001 M EDTÄ, 15 % formamidi, 7 % SDS, jossa oli ribokoetinta pitoisuus 1 x 1.06 tuiket- \ 20 ta/min/ml. Suodattimia pestiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS 30 minuutin ajan 62 °C:ssa, ja sitten liuoksessa 1XSS.C, 1 % SDS 30 minuutin ajan 62 °C:ssa. DNA; ta positiivisista, klooneista pilkottiin restriktienddnukleaaseillä BamHI, Sphl tai SstI ja saadut fragmentit alakloonattiin pUC119:ään ja 25 sekventoitiin sitten.

Käyttäen koetinta PCR 7 saatiin klooni, joka sisälsi eksoneja, jotka koodittayat aminohapot 4.0 - 176, ja tämä klooni on talletettu ÄTCC-tälletuslaitokseen (talletusnro 40681) . Muiden SCF-eksonien kloonien saamiseksi ihmis-30 genomikirjasto seulottiin ribokoettimella 2 ja oligohukle- ] otidikoettimellä 235-29. Kirjasto seulottiin samalla taval- ] la: kuin aiemmin seuraavin poikkeuksin: hybridisaatio koet- f timeen 235-29 suoritettiin 37 °C:ssa, jolloin tähän hybri- |

disäätiöön liittyvät pesut suoritettiin 1 tunnin kestävinä I

35 37 °C:ssa ja 1 tunnin kestävinä 44 °C:ssa. Positiiviset i| kloonit uudeileenseulottiin ribokoettimella 2, ribokoetti- j | 67 niellä 3 ja o li g on u k 1 e o t i ö i koettimilla 235-29 ja 236-31. Ri-boköettiinet 2 ja 3 valmistettiin käyttäen samankaltaista menettelyjärjestelyä kuin käytettiin ribokoettimen 1 tuottamiseksi seuraav in poikkeuksin: (a) yhdistelmä-DNA- 5 pGEM3:hSCF-plasmidi-DNA linearisoitiin restriktioendonukl©-aasilla PvuII (ribokoetin 2) tai PstI (ribokoetin 3), ja (b) 3P6-RNÄ-polymeraasia (Promega) käytettiin ribokoettimen 3 synt eti soimi seks i.

Kuviossa 15A esitetään strategia, jota käytettiin 10 ihmisgenomi-DNA:n sekventoimiseksi. Tässä kuviossa viivoitus ylhäällä edustaa ihmisgenomi-DNA:n SCF:ää koodittavaa aluetta. Aukot viivoituksessa merkitsevät alueita, joita ei ole sekventoitu. Suuret laatikot edustavat eksgheja, jotka koodittavat SCF-geeniaiueita, jolloin vastaavat kooditetut 15 aminohapot on merkitty kunkin laatikon yläpuolelle. Ihmis-SCF-geenin sekvenssi esitetään kuviossa 15B. Ihmis-SCF-cDNftiri BC.R·-tekniikoilla saatu sekvenssi esitetään kuviossa 15C.

F. Ilmis-SGF-aDMÄ.: n 5 1 -alueen sekvenssi 20 Sekventoitaessa PCR:ien tuotteet, joihin alukkeina käytettiin kahta geenispesifistä aluketta, paljastuu sen alueen sekvenssi, jota rajaavat kyseisten kahden alukkeen 3'-päät. Yksipuolisista PGR:istä, kuten mainittiin esimerkissä 3A, voidaan saada sivuavien alueiden sekvenssd. Yksi-25 puolista PCR:ää käyttäen laajennettiin 51-ei-luetun ihmis-5 G F-e DMA-a1ue en sekvenssiä.

1. säikeen cDNA valmistettiin poly-A+-RNÄ:Sta, joka oli ihmisen rakkosyöpäsolurinjastä 5637 (ÄTCC HTB 9}, käyttäen oligonukieotidia 228-28 (kuvio 12C) alukkeena kuten 30 kuvataan esimerkissä 3D. Lisäämällä tähän cDNA:hän dG-tähdejatkeita ja suorittamalla sitten yksipuolinen PCR-vahvistaminen käyttäen idC) «-sekvenssejä sisältäviä aluk-keita yhdistettyinä SCF-spesifisiin a liikkeisiin ei onnistuttu saamaan cDNA—fragment teja, jotka jatkuisivat ylä:vir~ j 35 taan (5') tunnetusta sekvenssistä. j 68

Pieni määrä sekvenssi-informaatiota saatiin PCR-vahvistamalla 2. säikeen s ynt ees itu otteita;·,· joihin alukkee-na käytettiin oligonukleotidia 228-28. Päässä jatketta vailla olevaa, edellä kuvattua 5637:n 1. säikeen cDNA:ta 5 (noin 50 ng) ja 2 pmol 228-28:aa inkuboitiin Klenow-polymeraasilla ja 0,5 mM:lla kutakin dÄTPrtä, dCTPrtä, dGTP: tä ja dTTP: ta 10 - 12 °C: ssa 30 minuutin ajan 10 yl:ssa lx"nick"-luentapuskuria [Maniatis et ai-., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborato-10 ry", 1982]. Vahvistamalla saatua cDNA:ta peräkkäin yksipuolisilla PCRrillä käyttäen aluketta 228-29 yhdistettynä asettuneisiin SCF-alukkeisiin (käyttöjärjestyksessä: 235- 30, 233-14, 236-31 ja lopuksi 235-29) saatiin kompleksisia tuote-seoksia, jotka näkyivät tahroina agaroosigeeleissä.

15 Merkittävää SCF-sukuisten cDNA-fragmenttien vahvistumista osoitti spesifisen tuotehäuhän. kasvava voimakkuus, mikä havaittiin vahvistettaessa verrattavia tilavuuksia peräkkäisiä yksipuolisen PCR:n tuotteita käyttäen kahta SCF-aluketta (227-2.9 ja 235-29, esimerkiksi, jolloin saadaan 20 noin 150 ep:n tuote). Yrityksissä valikoida tuotteiden tie- \ tyn kokoluokan suhteen stanssaamalla irti osia agaroosigee-litahroista ja uudelleenvahvistamalla niitä PCRillä ei useimmissa tapauksissa: onnistuttu tuottamaan tarkkarajaista nauhaa, joka sisältäisi SCF-sukuisla sekvenssejä.

.25 Yhdessä reaktiossa, PCRrssä 16.17, jossa käytettiin vain 235-29-aluketta, saatiin nauha, joka ilmeisesti syntyi 235-29:n toimiessa alukkeena tuntemattomassa kohdassa 5' -suuntaan koodialueesta odotuksia vastaavan kohdan ohella, mikä osoitettiin kartoittamalla restriktioentsyyraeillä Pvu-30 II ja PstI ja PCR-ahaiyysilla asettuneita alukkeita käyttäen. Tätä tuotetta puhdistettiin geelissä ja uudelleenvah-vistettiin käyttäen aluketta 235-29, ja sekventointia yritettiin Sangerin dideoksirnenetelmällä käyttäen 32P-lei-mattua aluketta 228-30. Saatu sekvenssi oli perustana suun-35 niteltaessa oligonukleotidia 254-9 (kuvio 1:2 Bj . Käytettäessä tätä 3'-suunnattua aluketta seuraavissa PCRrissa yhdis- | 69 t et tyriä 5'-suunnattuihin SCF’-a tukkeisiin saatiin odotusten mukaista kokoa edustavia nauhoja. Suorittamalla tällaisten PCR-tuotteiden suora Sanger-sekventointi saatiin ihmis-SCF-cDN&-sekvenssin nukleotidit 180 - 204, kuvio 15C.

5 Jotta saataisiin enemmän sekvenssiä hSCF-cDNÄ:n 5'- päästä, X. säikeen cDNA. valmistettiin 5637:n poly-Ä+-RNÄ;sta (noin 300 ng) käyttäen SCF-spesiflstä aluksita (2 pmol 233-14:ää) 16 pl:n reaktiossa, joka sisälsi 0,2 yksikköä MMLV-käänteiskopioijaentsyymiä (hankittu valmistajalta 10 BRL) ja 500 μ.Μ kutakin dNTP:tä. Suoritettiin tavanomaiset fenoli-kloroformi- ja kloroformiuutöt ja etanolisäöstus (1 M. aEimoniumasetaattiliuoksesta) , minkä jälkeen nukleiinihapot uudelleenlietettiin 20 μΐ:.aan vettä, sijoitettiin: kiehuvaan vesihauteeseen 5 minuutiksi, jäähdytettiin sitten ja 15 varustettiin päätyjatkeella käyttäen päätytrangferääsia 8 μΜ:η dÄTPitä läsnä ollessa CoClj-pitoisessa puskurissa [Deng ja Wu, Methods in Enzymology 100 96 - 103]. Tuotetta, (dÄ) n-päätyjatkettua 1. säikeen cDNÄ:ta, puhdistettiin uuttamalla fenoli-kloroformillä ja säestämällä etanolilla, 20 minkä jälkeen se uudelleenlietettiin 20 pilaan liuosta 10 mM Tris, pH 8,0, ja 1 mM EDTÄ.

Ihmis-SCF^sukuisten cDNA-5'-päätyiragmenttien rikastaminen ja vahvistaminen noin 20 ng:sta (dA)n-pääty-jatketusta 5637-cDNA:sta suoritettiin seuraavasti: alustava 25 26 kierroksen yksipuolinen PCR suoritettiin SCF-spesifisen alukkeen 236-31 läsnä ollessa ja alukkeen tai alukeseokscn | läsnä ollessa, joka sisältää (dT) n-sekvenssejä 3'-päässä j tai lähellä sitä, esimerkiksi alukkeen 221-12 tai seoksen alukkeita 220-3, 220-7 ja 220-11 (kuvio 12 Cj läsnä ollessa.

30 Näiden PCR:ien tuotteita (1 μΐ} vahvistettiin sitten toisessa sarjassa PCR:iä, joissa käytettiin alukkeita 221-12 ja 235-29. Runsas tuotenauha, joka vastasi noin 370 ep:tä, havaittiin kussakin tapauksessa agaroosigeelianalyysissa,

Osan tästä nauhasta sisältävä geelitulppa stanssattiin Irti 35 geelistä pasteur-pipetin kärjellä ja siirrettiin pieneen mikrofugiputkeen. 10 μ! vettä lisättiin ja tulppa sulatet- 70 tiln 84 °C:seen säädetyssä kuumennusykslkössä. PCR-seok-seen, joka sisälsi älukkeita 221-12 ja 235-29 (8 pmol kumpaakin) 40 piissä, sl innostettiin 2 μΐ sulatettua, laimennettua geelitulppaa. 15 kierroksen jälkeen lievästi diffuu-5 si nauha, joka vastasi noin 370 ep:tä, voitiin nähdä aga-roosigeelianalyysissa. Asymmetrisiä PCR:iä suoritettiin ylä- ja alasäikeen sek veri tointitemplaatt ien muodostamiseksi: kutakin reaktiota kohden 4 pl:lla PCR-reaktiotuotetta ja 40 pikomoolilla joko aluketta 221-12 tai aluketta 235-29 10 100 pl:n kokonaisreaktiotilavuudessa suoritettiin 25 PCR- kierrosta (1 minuutti, 95 ° C; 30 sekuntia, 55 °G; 4 0 sekuntia, 72 °C). PCR-tuoteseoksia, joissa oli käytetty aluk-keena 221-12:ta, suoraan sekventoimalla (tavanomaisten uut-tojen ja etanolisaostuksen jälkeen) 32P-leimattua aluketta 15 262-13 (kuvio 12 B) käyttäen saatiin 5'-sekvenssi nukleoti distä 1 nukleotidiin 179 (kuvio 15C).

G. Ihmisgenorax-DNA:n vahvistaminen ja sekventointi kä.n tasoin teki jän ensimmäisen koodieksonin kohdalta

Seulomalla ihmisgenomikirj astoa SCF-oligonukleo-20 tidikoettimilla: ei onnistuttu paljastamaan lainkaan klooneja, jotka sisältäisivät tunnetun osan ensimmäisestä koo- I

dieksonista. Sitten suoritettiin yritys yksipuolisen PCR-tekniikan käyttämiseksi tätä eksonia ympäröivien genomise-kvenssien vahvistamiseksi ja k.loonaamiseksi.

25 Ihmisen lämpödenaturoidun istukka-DNA:n (hankittu valmistajalta Sigma) alukelaajennus suoritettiin käyttäen DNA-polymeraasi-i:tä (Klenow-entSyymi, suuri fragmentti; Roehringer-Mannhelm} ja ei-SCF-aluketta kuten 228-28:aa tai 221-11: tä- ei-ankarissa (alhainen lämpötila} olosuhteissa, 30 kuten 12 ÖC, jotta se: suosisi alukkeen hyödyntämistä hyvin Suuressa lukumäärässä eri keskuksia. Kutakin reaktiota laimennettiin sitten 5-kertaisesti Taql-DNA-polymeraasipusku-riin, joka sisälsi Taql-polymeraasia ja 100 μΜ kutakin dNTPrtä, ja DNA-säikeiden pidennyksen annettiin tapahtua 35 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tuotetta rikastettiin sitten kantasoJ utekijän 1. eksoni -sekvenssien suhteen PCR:llä 71 SCF-1. eksoni -oligonukleotidin (kuten 254-9) ja tarkoituksenmukaisen ed-SCF-alukkeen, (228-29 tai 221-11) läsnä ollessa. Agaroosigeelielektroforeesi paljasti, että valtaosa; tuotteista oli lyhyitä (alle 300 ep:ta). Pitempien lajien 5 rikastamiseksi se osa kustakin agafoasigeelivyöhykkeestä, joka vastasi yli 300 ep:n pituutta, leikattiin irti ja. elu-oitiin elektroforeettisesti, Etanoiisaostuksen ja uudei-leenliettämisen veteen jälkeen geelissä puhdistetut PCR-tuotteet kloonattiin pGEM4-johdannaiseen,. j o ka sisälsi 10 Sfil-keskuksen Hindlll-Sfil-fragmenttina.

Pesäkkeet seulottiin ^P-leimatuIlä SCF-1. eksoni -oligonukleotidillä. Identifioitiin useita positiivisia: pesäkkeitä ja inserttien sekvenssit saatiin Sangerin menetelmällä, Saatu sekvenssi, joka ulottuu alavirtaan 1, eksonis-15 ta konsensuseksoni-intronirajan kautta naapuriintroniin, esitetään kuviossa 15B, H. SCF-cDNA-koodialueiden hiirestä, apinasta ja koirasta vahvistaminen ja sekvensointi I. säikeen cDNA valmistettiin kokonais-RNA:sta tai 20 poly-A+-RNÄ:sta, joka oli saatu apinan maksasta (hankittu valmistajalta Clontech) sekä solulinjoista NIH-3T3 (hiiri, ATCC CRL 1658) ja Dl7 (koira, ATCC CCL 183) . 1. säikeen cDNA-synteeslssä käytetty aluke oli joko ei-spesifinen alu-ke 228-28 täi SCF-aluke (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 tai 25 241-6). PCR-vahvistaminen a.iuketta 227-29 ja jotain aluk- keista 227-30, 237-19 tai 237-20 käyttäen tuotti fragmen tin, joka kooltaan vastasi odotuksia ja joka sekventoitiin joko suoraan tai kloonauksen VI9.8- tai pGEM-vektcriin jälkeen.

30 Lisää sekvenssejä läheltä SCF-cDMÄ-sekvenssien 5'- päätä saatiin PCR-vahyistaraisista, joissa käytettiin SCF-spesifistä aluketta yhdistettynä joko 254-9:ään tai 228-29:ään. Lisää sekvenssejä SCF-koodialueiden 3'-päästä saatiin PCR-vahvistamalla 230-25-alukk.eella käsiteltyä cDNÄitä 35 (hiiren kohdalla) tai 241-6-alukkeeila käsiteltyä cDNA:ta (apinan kohdalla) käyttäen jako 230-25:ta tai 241-6:ta, 72 tarpeen mukaan, sekä 31-kohdistuista SCF-aluketta. Iiäifikääh: SCF-PCR-tuotenauhoja ei saatu vastaavissa yrityksissä .vahvistaa D17-cDMA:ta. Ei-spesifistä aiukettä 228-28: käytettiin alukkeena 1. säikeen synteesissä D17-kokonais-RNÄ:s:ta, 5 ja saatua kompleksista tuOteseosta rikastettiin SCF-suku-isten, sekvenssien suhteen RCRrllä käyttäen 3*-kohdisteisia SCF-alukkeita kuten 227-29 tai 225-31 yhdistettyinä 228-29:ään. TuoteSeos pilkottiin Siilillä ja kloonattiin pGEM4-johdannaiseeh (Promega, Madison, Wisconsin), joka sisältää 10 Sfil-keskuksen Sfil-tasainen pää -fragmenttina. Saatua heterogeenistä kirjastoa seulottiin radioleimatulla 237-20:11a, ja useita positiivisia klooneja sekventaitiin:, jolloin saatiin koiran SCF-3'-pääsekvenssejä. Rinnan asetetut aminohapposekvenssit ihmisen (kuvio 42) , apinan, koiran, 15 hiiren ja rptan: kypsille SCF-proteiineille: on esitetty kuviossa 1.6.

Tunnetut SCF-aminohapposekvenssit ovat erittäin homologisia valtaosalla pituudestaan. Identtiset konsensus-signaalipeptidi.sekvenss.it sisältyvät kaikkien 5 lajin koo-20 dialueisiin, aminohappo, jonka odotetaan olevan kypsän proteiinin aminopäässä analogisesti rotta-SGF:ään nähden, on tässä kuviossa merkitty numerolla 1, Pioira-cDNA-sekvenssi sisältää kaksinaisuuden;, josta seuraa väliini/le usiini-kaksinaisuus aminohapposekvenssissä kodonin 129 kohdalla. 25 Ihmisen, apinan, rotan ja hiiren aminohapposekvenssit asettuvat rinnan ilman mitään insertioita tai deleetioita. Koi-räsekvenssissä on yksi yksittäinen ylimääräinen tähde asemassa 130 muihin lajeihin verrattuna. Ihminen ja apina eroavat vain yhdessä kohdassa, joka on valiinin (ihminen) 30' säilyvä korvaus alaniinilla (apina) asemassa 130. Ennustettu SCF-sekvenssi välittömästi ennen ja jälkeen oletettua prosessointikeskusta lähellä tähdettä 164 on erittäin säilyvä lajien välillä.

73

Esimerkki 4

Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:n ilmentäminen CÖS-l-solu- issa

Silmällä pitäen tilapäistä ilmennystä COS-l-solu-5 issa (ATGG CRL 1650) vektori VI9.8 (esimerkki 3C), joka sisälsi rotan SCF1”162- ja SCF1"i93-geenit, trans f.ektoi ti in kaksinkertaisiin 60 mm:n maljoihin [Wigler et ai., Cell 14 (1978) 725 - 731]. Plasmid! V19.8-SCF esitetään kuviossa 17. Verrokkina transfektoitiin myös inserttiä vailla oleva 10 vektori. Kudosviljelmäsupernatantteja otettiin talteen eri ajankohtina transfektoinnin jälkeen ja määritettiin niiden biologinen aktiivisuus. Taulukkoon 4 on kontu HPP-CFC-M omäärit y s tulokset ja taulukkoon 5 on koottu tulostiedot HC/9-3H“tymidiinikulutuksesta tyypillisistä transfektointi-15 kokeista. Biomääritystulokset COS-l-solusupernatanteista, jotka solut oli transfektoitu se.uraavilla plasmideilla, on esitetty taulukoissa 4 ja 5: rotta-SCF:n C-päästä lyhennetty muoto, jossa C-pää on aminohappoasemassa 162 (VI9.8- rotta-SCF1"162), SCF1"162, joka sisältää glutamiinihapon ase- -j 20 massa 81 [V19. S-rotta-SCF1"162 (Glulejih ja SCF1'162, joka si- j sältää a lärviini n asemassa 19 [V19.8-rotta-CSF1”lb2 (A.lal9) ] . Aminohapposubstituutiot olivat seurausta PCR-reaktioista, jotka suoritettiin rotta-SCF1-102;n vahvistamisen yhteydessä kuten esitetään esimerkissä 3. Yksittäisiä V19.8-rotta-25 SCF1"1'62-klooneja sekventoitiih ja todettiin kaksi aminohap- posubstituutioita sisältävää kloonia. Kuten voidaan nähdä taulukoista 4 ja 5, yhdistelmä-OKA-.rotta-SCF on aktiivinen biomäärityksissä, joita käytettiin luontaisen nisäkäs-SCF:n puhdistamiseksi esimerkissä 1.

30 j ;j :·\ | 74

Taulukko 4 HPP-CPC-määritys COS-1~supernatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DNÄ;lla transfektoiduxsta soluista 5 Näyte CM-määritys- Pesäkkeitä, kpl tilavuus (pl) /200 000 solua VI9.8, 100 0 ei inserttia 50 0 10 25 0 12 0 V19.8-rotta-SCF1"162 100 >50 50 >50 15 25 >50 12 >50 6 30

3 8 I

20 V19.8-rotta-SCF1"162 1 0 0 25 (Gl.u81) 50 10 25 2 12 0 25 VI9.8-rotta-SGf1"162 100 41 (AIai9) 50 18 25 5

12 Q

6 0 30 3 0 | $ | 7 5

Taulukko 5 MC / 93H-tymidiinikulutusmääritys CÖS-l- supsrnatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DEÄ:11a trans-fektoiduista soluista 5 Näyte CM-maäritys- Tuikkeita/min/ml tilavuus (pl) VI9.8, 25 1 936 10 ei inserttiä 12 2 252 6 2 182 3 1 682

Vig.S-SCF1'162 25 11 648 15 12 11 322 6 11 482 3 9 638 V19.8-SCF1"163 25 6 220 | 20 (Glu81) 12 5 384 6 3 692 3 1 980 VI9.8-SCF1”162 25 8 396 25 (Älal9) 12 6 646 6 4 566 3 3 182

Yhdistelirsä-DNÄ-rotta-SCFiäa ja muita tekijöitä tes- I

30 tattiin yksittäin ihmis-GFÖ-GM- [Broxmeyer et ai., supra, I

1977] määrityksessä, jossa mitataan normaalien luuydinsolu- | ien lisääntymistä, ja tulokset esitetään taulukossa 6. Tu- ] lokset COS-l-supernatanteille viljelmistä, jotka oli 4 päi- j vää aiemmin transfektoitu V19.8-SCF1”162:11a, yhdessä muiden j 35 tekijöiden kanssa, on niinikään esitetty taulukossa 6. Pe- | ] $ 8 :¾ i 76 sakeluvut ovat keskimääräisiä kolminkertaisista viljelmistä .

Yhdlstelmä-PNA-rQtta-SCF:llä on pääasiassa syner-gististä aktiivisuutta ihmisen normaalin luuytimen aktiivi-5 suuteen CFU-GM-määrityksessä. Taulukon 6 mukaisessa kokeessa SCF oli synergistinen ihmis-GM-CSF:n, ihmisen IL-3:n ja ihmisen CSF-lln kanssa:. Muissa määrityksissä synergiaa havaittiin myös G-CSF:n kanssa. Ihmisen luuydin oli jonkin verran lisääntynyt 14 päivässä rötta-SCF:n kanssa; kuiten-10 kin rykelmät koostuivat < 40 solusta. Samankaltaisia tuloksia saatiin luontaisella nisäkäsperäisellä SCF:llä.

Taulukko 6 |

Ihmis-CFU-GM-määritys COS-l-supernatanteista, jotka j

15 on saatu rottä-SCF-DNA;11a transfektoiduista soluista I

Näyte Pesäkkeitä, kpl/100 000 solua Ci SEM’)

Suolaliuos 0 | 20 GM-CSF 7 ± 1 j G-CSF 24 il | IL-3 5 ± 1 CSF-1 0 i SCF1"162 0 j 25 |

GM-CSF + SCF1*162 29 ± 6 I

G-CSF + SCF1'162 20 ± 1 j IL-3 + SCF1"162 11 ± 1 j CSF-1 + SCF1'152 4 ± 0 |

30 I

$ ] ί s ] 5 $ ) 77

Esimerkki 5

Yhdistelmä-DNA-SCF:n ilmentäminen kiinalaisen hamsterin munasarjasoluissa Tämä esimerkki koskee: stabiilia nisäkäsilmennyssys-5 teemiä SC:F:n erittämiseksi CHQ-soiuista (ATCC CCL 6:1 valikoiden DHFR-:n suhteen).

A. Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF

SCF-tuotannossa käytetty ilmennysvektori. oli VI9.8 (kuvio: 17) . Valikointimerkki, jota käytettiin stabiilien 10 transiormanttien määrittämiseksi, oli dihydrofolaafctireduk-taasigeeni plasmidissa. pDSVE.1. Plasmidi pDSVE.1 (kuvio: IS) On pDSVE-johdannainen, joka on rakennettu pilkkomalla pDSVE:tä rsstriktioentsyymillä: Sali ja llgätoimalla tuote oligonukleotidifragmenttiin, joka koostuu kahdesta oiigo-15 nukleotidista:: 5 ' TCGAC CCGGA 'ICCCC 3 ' 31 G GGCCT AGGGG AGCT 5« 20 Vektoria pDSVE kuvataan yhteisesti omistetuissa US- patenteissa julkaisunrot 025 344 ja 152 045, jotka sisällytetään täten viitteiksi. V19.8:n ja pDSVE.l:n vektoriosat sisältävät pitkiä homologiajaksoja mukaan lukien bakteeriperäisen ColEl-repIikaatioalkuköhdan sekä ampisilliini-25 resistenssigeenin ja SV40-replikaatioaXkukohdan. Tämä limittyminen saattaa myötävaikuttaa homologiseen DKÄ-yhdis-tymiseen transformointiprosessissa helpottaen siten yhteis-transförmointla.

VI9.&-S G:F-rakenteista ja pDSVE. l:stä valmistettiin 30 kalslumfosfaattiyhteissakkoja, kun läsnä oli tai ei ollut 10 pg kantajahiiri-DNA: ta, käyttäen 1,0 tai 0,1 μα pDSVE.1:ta, joka oli linearisoitu restriktioendonukleaasi1-la PvuI, ja 10 pg V19.8-SCF:ää kuvatun mukaisesti [Wiglet et al., supra, 19 7'8] . Pesäkkeet valikoitiin DHFR-geenin il-35 mennyksen pDSVE.listä perusteella. Pesäkkeet, jotka kykenivät kasvamaan ilman lisättyä hypoksantiinia ja tymidiiniä, 78 noukittiin käyttäen kloonaussylintereitä js niitä lisäänny-* tattiin itsenäisinä solulinjoina. yksittäisistä sglulin-joista saatuja solusupernatantteja testattiin MC/9-JH~ tyiTiidiinikulutusmäärityksessä. Tulokset tyypillisestä ko-5 keesta on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7 MC/9-3H-tyffiidiinikulufcusmäärifcys Stabiileista CHO- solusupernatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DNA;11a 10 transfektoiduista soluista

Transfektoitu DNA Määritetyn käsitellyn Tuikkeita/min kasvualustan tilavuus 15 VI9. 8-SCF1'152 2 33 92 6 12 34 973 6 30 657 3 14 714 1,5 7 160 20 - (ei transfektoitu) 25 694 12 1 082 6 880 3 672 25 1 1 354

B, Yhdi s telmä-DNA- ihmi s - SCF

SCF saatiin ilmennetyksi CHÖ-soluissa myös käyttäen ilmennysvektoria pDSVR-aifa-2, jota kuvataan yhteisesti 30 omistetussa patentissa juikaisunro 501 904, joka jätettiin 29. maaliskuut'a, 1990, joka täten sisällytetään viitteeksi. Tämä vektori sisältää geenin kloonien valikoimiseksi ja vahvistamiseksi DHFR-geenin ilmennyksen perusteella. Klooni pDSR-alfa-2-SCF muodostettiin kaksivaiheisella prosessilla. 35 V19,8-SCF:ää pilkottiin restriktioentsyymillä BamHI ja SCF-insertti ligatoxtiin p6EM3:n BamKI-· keskukseen. pGEM3-SCF- 79 DNA pilkottiin: Hindlllrlla ja Sällillä ja ligatoitiin pDSR-alfa-2:een, jota oli pilkottu; HindiXI:11a ja Sällillä. Sama prosessi toistettiin ihmisgeeneillä, jotka koodittavat COOH-pään aminohappoasemiä 162, 164 ja 183 kuviossa .1.50 5 esitetyssä sekvenssissä ja asemaa 248 kuviossa 42 esite-’ tyissä sekvensseissä. Vakiintuneita solulinjpja herkistettiin metotreksaatilla [Shimke kirjassa Methods in Enzymolo-qy 151 (1987) 85 - 104] pitoisuutena 10 nM DHFR-geenin sekä viereisen SCF-geenin ilmennystasojen nostamiseksi. Yhdis-10 te Intä- DNÄ*- ihmi s-SÖF: n ilmennystasot määritettiin radioim-muunimäärityksellä kuten esimerkissä 7, ja/tai indusoimalla pesäkemuodostus in vitro käyttäen ihmisen ääreisveren valkosoluja. Tämä määritys suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 9 (taulukko 12) lukuunottamatta, että ääreisverta 15 käytetään luuytimen asemesta ja inkubointi suoritetaan pitoisuuksissa· 20 % Osita, 5 % CO?: la ja 75 % Ns: ta ihmiΞΕΡΟ: n (1Q yksikköä/ml) läsnä ollessa. Tulokset tyypillisistä kokeista on esitetty taulukossa 8. Ihmis-SCF1"1^; n ilmentävä: CHO-klOoni on 25. syyskuuta, 1990, talletettu tai-20 letuslaitokseen ATCC (CRL 10557), ja nimetty j HU1164SCF17:ksi.

$ | 80

Taulukko 8 hPBL-pesäkemääritys käsitellystä kasvualustästä, joka on stabiileista CHO~solulinjoista, jotka on transfektoitu ih-mis-SGF-DNA:11a 5

Transfektoitu DNA Määritetty Pesakkeitten kasvualusta (pl) lukumääärä/105 p D S R - a 1 f a - 2 - b.S C F1 “164 50 53 10 25 45 12,5 27 6.25 13 pDS R- a 1 f a - 2 -hSC F1-162 10 43 15 5 44 2,5 31 1.25 17 0, 625 21 20 - (OHO-verrokki) 50 4

Esimerkki 6

Yhdistelmä-DNA-SCF:n ilmentäminen colissa

A. Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF

25 Tämä esimerkki koskee SCF-poiypeptidien ilmentämis tä Ek colissa käyttäen DNA-sekvenssiä, joka koodittaa [Met-1] -rotta-SCF1 "u’3:a (kuvio 14G) . Vaikka mitä tahansa sopivaa vektoria voidaan käyttää proteiinin ilmentämiseksi tätä DNA:ta käyttäen, valittiin piasmidi pCFMllSS (kuvio 19} .

30 Tämä piasmidi voidaan rakentaa helposti pGFM-836:sta (katso US-patenttijulkaisu nro 4 710 473, joka sisällytetään täten viitteeksi) tuhoamalla läsnä olevat kaksi endogeenistä j

Ndel-restriktiokeskusta täyttämällä päitä T4-polymeraasi- | entsyymiä käyttäen, minkä jälkeen tasaiset päät: ligatöidaan f 35 ja pieni DNA-sekvenssi. yksittäisten Clal- ja Kpnl-restr.ik- ] | | 81 tiokeskusten välissä substituoidaän pienellä oligonukleoti-dilla, joka esitetään alla.

51 CGAinGAlTCTASMeGAGGAAlAACATATGGTTAACSCGTTGGAATTCGGTAC 3' 3‘ T AAACT AASAT CTTGC T C C T TÄTIST ATAC CAATTGCGCAACCTTAAG C 5· 5

Proteiini-ilmennyks en säätelyn pCFM1156-plasmidissa suori tr. a a synteettinen lambda-pL-promoottori, joka puolestaan on lämpötilaherkän lambda-ei857-repressorigeenin säätelyn alainen [ja jollainen, on Ek coli -kannassa FM5 (ATCC-10 talletusnro 53911) tai Kl2-delta-Htrp] . pCFM1156-vektori rakennetaan siten, että siinä on DNA-sekvenssi, joka sisältää optimoidun ribosomisitoutumiskeskuksen ja aloituskodo-nin välittömästi 3'-suuntaan synteettisestä PL-promootto-rista. Yksittäinen Ndel-restriktiokeskus, joka sisältää 15 ÄTG-aloituskodonin, edeltää monirestriktiokeskuskloonausry-kelmää, jota seuraa lambda-t-oop-kopiointipäätössekvenssi.

Plasmidia V19.8-SCF1-193, joka sisältää rotta- SCF1_193-geenin kloonattuna PCR-vahvistetusta cDNA: sta (kuvio 1:.4C·) kuten kuvattiin esimerkissä 3, pilkottiin 20 Bglllulla ja Sstll:11a ja eristettiin 603 ep:n DNA-fragment ti . Met-aloitusködönin saamiseksi sekä rotta-SCF- poiypeptidin ensimmäisten 3 aminohappotähteen (Gin, Glu ja Ile) kodonien palauttamiseksi valmistettiin synteettinen o1i gonu kleot i d i1i i11äj ä

25 I

5' TÄTGCAGGA 3’ ( 3’ ACGTCCTCTÄG 5' jossa oli tarttuvat Ndel- ja BgHi-päät. Pieni oligonukle-30 ot id.i ja rotta-SCF^^-geenifragmentt i insertoitiin liga-toimalla pCFM1156:een yksittäisiin Ndel- ja Säti-keskuksiin kuviossa 19 esitetyssä plasmidissa. Tämän reaktion tuote on i Ime n ny s p 1 as mi d i, pG FM 115 6 - ro 11 a - S CF1_ 19 3.

pCFMl 15 6-r0tta-SGF1”193-plasinidi transformoitiin 35 transformoitumiskelpoisiin Eh coli -FM5-isähtäsoluihin.

82

Plasmidin sisältävät solut valikoitiin antibiootti- {kana-mysiini-:} resistenssimerkkigeenin perusteella,, joka sisältyy pGFMll56-vektoriin. Plasmidi-DNA eristettiin viljellyistä soluista ja synteettisen oligonukleötidin DNA-5 sekvenssi sekä sen liitos rötta-SCF^geeniin varmistettiin DNA-sekventoinni11a,

Plasiaidin pCFMll 5 6-rotta-SGF1"162 rakentamiseksi, joka kaudittaa [Met-1] -rottä-SCF^^-polypeptidiä, eristettiin ScoRI-Sstll-restriktiofragmentti V19,8-rotta- 10 SCF1-162: sta ja insertoitiin se ligatoimalla plasmidiin pCFM-rotta-SCF1'19j yksittäisiin EooRI- ja Sstll-restriktio-keskuksiin, jolloin korvattiin rotta-SCF-geenin karboksyy-lipään koodialue,

Plasmidien pCFM1156—rotta-SCF1"164 ja pCFM1156-15 rotta-SCF1-1"'1 rakentamiseksi, jotka koodattavat [Met"1]-rotta-SCF1-64- ja vastaavasti [Met"1] -rotta-SCF1"lo5-polypep-tidit, EGoRI-Sstll-restriktlöfragraentit eristettiin PCR-vahvistetusta DNA:sta, joka koodittaa SCF-geenin 3'-pään, ja suunniteltiin suorittamaan paikkaohjattuja muutoksia 20 DNA:hän alueella, joka koodittaa SCF-geenin karboksyyli-pään. DNA-vahvistamiset suoritettiin käyttäen oligonukle-otidial-ukkeitä 227-:29 ja 237-19 rakenteessa: pCFM1156:-rotta-SCF1"1*4 ja 227-29 ja 237-20 rakenteessa pCFMllSe-rotta-SCF1"165.

B. Yhdi s telmä-DNA-ihmi s-SCF

25 Tämä esimerkki koskee ihmis-SCF-polypeptidin ilmen tämistä colissa käyttäen: DNA-sekvenssiä, joka: koodittaa [Met-1] -ihmis-SCF1'184;^ ja [Met-1] -ihmis-SCF1":L83::ea [kuvio 15C) . Plasitiidia V19,8-ihmiS-SCF1"162, joka sisältää ihmis-SCpi'"02— geenin, käytettiin templaattina ihmis-SCF-geenin 30 PCR-vahvistuksessa., .Qligonukleotidialukkeita 227-29 ja 237-19 käytettiin PCR-DNÄ:n muodostamiseksi, jota sitten pilkottiin PstI- ja Sstl-restriktioendonukleaaseilla. Met-· aloituskodonin saamiseksi sekä ihmis-SCF-polypeptidin ensimmäisten 4 aminohappotähteen (Glu, Gly, Ile, Cys) kodoni-35 en palauttamiseksi valmistettiin synteettinen oligonukle-otidiliittäjä 83 5' TATGGAÄGGTATCTGCA 3' 3' ÄCCTTCCATAG 5' 5 jossa oli tarttuvat Ndel- ja Fstl-päät. Pieni pligoliittäjä ja PCR: ilä saatu ihmis-SCF-geenif ragraentti .insertoitiin 11-gatöimalla ilmennysplasmidiin pCEM1156 (kuten kuvattiin aiemmin) yksittäisiin Ndel- ja Sstll-keskuksiin kuviossa 19 esitetyssä pla smidis sa.

1G pC FM 115 6 - i hmi s- SG F1"-pla sntid i trans f o rmo i ti in tränsformoitumis kelpoisiin Ei coli -FM5-isäntäsoIuihin.

Plasmidin sisältävät solut valikoitiin antibiootti- (kana-mysiini-) resistenssimerkkigeenin perusteella, joka sisältyy pCFM1156-vektoriin. Pläsmidi-DNA eristettiin viljel-15 lyistä soluista ja ihmis-SCF-geenin DNA-sefcvenssi varmis te 11 i in DMA- s e kven t o inni Ha.

Plasmidin pöFMl 1.5.6 ~ ihftis -S.CF1'183 rakentamiseksi, joka .koodittaa [Met-1] -ihmis-SCF1"183- (kuvio 15C) polypepti- ) dia, EcoRI-Hindlll-restriktiofragmentti, joka koodittaa i:h-20 mis-SCF-geenin karboksyylipään, eristettiin pGEM-ihmis- SCFnil"ia3· sta (jota kuvataan alla), Sstl-EcoRI-restriktio-fragmentti, joka koodittaa ihmis-SCF-geenin aminopään, eristettiin pCFMllSG-ihivis-SCF1-16'1: sta, ja suurempi Hin-dlll^Sstl-restriktiofragmentti pCFMH56: sta eristettiin.

25 Nämä kolme DMA-fragmenttia ligatoitiin yhteen pCFM1156- ihmis-SCFA“1S3-plasmidin muodostamiseksi, joka sitten transformoitiin JL_ coli -FM5-isäntäsoluihin. Resäkevalikoinnin kanamysilnilääkeresistenssiä hyödyntäen jälkeen plasmidi-DNA eristettiin ja oikeasta DNA-sekvenssistä varmistuttiin 30 DNA-sekventoimalla, p G E! M - i hm i s - SC F11 <! _133 - p 1 a s m i d i on pGEM3: n johdannainen, joka sisältää EcoRI-Sphl-fragmentin, johon sisältyvät nukleotidit 609 - 820 kuviossa 15C esitetystä f ihmis-SCF-GDMÄ-sekvenssistä. EcoRI-Sphl-insertti eristet- 1 ti in tästä plasmidista. PCR: stä, jossa käytettiin oligonuk- f 35 leotidialukkeita 235-31 ja 241—6 (kuvio 12B) ja PCR:sta j 22.7 (kuvio 13B) templaattina. Älukkeen 241-6 sekvenssi pe- j ] 84 rustui ihmisgenomisekvenssiin 3'-suuntaan eksonista, joka sisältää kodonin aminohapolle 176.

C. Ihmis-SCF"1"164:ää tuottavan. EL colln fermentointi

Fermentoinnit SCF-l-164:n tuottamiseksi suoritet-5 tiin 16 litran fermentoreissa käyttäen EL_ coli FM5-K12-siätnää, joka sisälsi plasmidin pCFMl ISG-ihrnis-SCF1”104. Tuotantoviljelmän siemenvarastokantoja ylläpidettiin -80 aC:ssa 17-%:isessa glyserolissa Luria-liemessä, Siir-rostetuotantoa varten 100 μΐ sulatettua siemenvarastokantaa 10 siirrettiin 50 ml:aan Luxia-lientä 2 litran erlenmeyerkol-viin ja kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa pyöröravistelijassa (250 kierr./min).

E. coli -solupastan tuottamiseksi, jota käytettiin lähtömateriaalina ihmis-SCFl~lt,4:n puhdistuksessa, jota ku-15 vartaan tässä esimerkissä, käytettiin seuraavia fermentöin-tiolosuhteita..

Siirrosteviljelmä siirrettiin aseptisesti 16 litran fermentoriin, jossa oli 8 litran erä kasvualustaa (katso taulukko 9}. Viljelmää kasvatettiin erämuodolla kunnes vil-20 jelmän O.D.eoo oli noin 3,5. Tänä ajankohtana steriili syöttö!.luo s (syöttöliuos 1, taulukko 10) lisättiin fermentoriin käyttäen peristaltista pumppua syöttönopeuden säätelemiseksi . Syöttönopeutta nostettiin eksponentiaalisesti ajan funktiona kasvunopeuteen 0,15/tunti. Lämpötila pidettiin 25 kontrolloidusti 30 °C:ssa kasvufaasin ajan. Liuenneen hapen pitoisuutta fermentorissa pidettiin automaattisesti säätäen 50 %:n kyllästyksessä: käyttäen säätelyssä ilmavirtausnopeutta·,. sekoitusnopeutta:, astian vastapainetta ja happilisä-ystä. pH:ta fermentorissa säädettiin automaattisesti 30 7,Oraan käyttäen fosforihappoa ja ammoniumhydrOksidia. Kun O. D. g cc oli noin 30, fermentoinnin tuotantofaasi indusoitiin nostamalla fermentorin lämpötila 42 °C:seen:. Samanaikaisesti syöttöliuoksen 1 lisääminen keskeytettiin ja syöttöliu-oks.en 2 (taulukko 11) lisääminen nopeudella 200 ml/tunti 35: käynnistettiin. Noin 6 tunnin kuluttua fermentorin lämpöti lan nostosta fermentorin sisältö jäähdytettiin 15 °C:seen.

85 SCF1-104-saanto oli noin 30 mg/O.D.-litra. Sitten solupel-letti otettiin talteen sentrifugoimalla Beckman J6-B -roottoria käyttäen 3 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Talteen otettu solujasta varastoitiin jäädytettynä -70 °C:seen:.

5 Edullinen menetelmä SCF1-164: n tuottamiseksi on sa manlainen kuin edellä kuvattu menetelmä lukuunottamatta seuraavia modifikaatioita.

1) Syöttöliuöksen 1 lisääminen käynnistetään: vasta kun viljelmän O.D.soo on 5 - 6.

10 2) Syöttöliuöksen X lisäysnopeutta nostetaan hi taammin, jolloin seurauksena on hitaampi kasvunopeus (noin 0,08} .

3) Viljelmä indusoidaan O. D. soo-lukemassa 20.

4) Syöttöliuosta 2 johdetaan fermentoriin nopeudel-15 la 300 ml/tunti.

Kaikki muut suorituksen osatekijät ovat samanlaiset kuin edellä kuvatussa menetelmässä mukaan lukien kasvualusta.

Tätä menetelmää käyttäen on saatu SCF1"lo4-saantoja, 20 jotka ovat noin 35 - 40 mg/O.D.-litra O.D.-lukemassa 25. j i | § 5 86

Taulukko 9

Eräkasvualustan koostumus

Hiivauutc 10a g/litra 5 Glukoosi 5 K2KPOn 3,5 KH2PO4 4

MgS04-7H3D 1

Mad 0,625 10 Dow P-2000 “vaahdonesto 5 ml/8 litraa

Vitamiiniliuosb 2 ml/litra

Hivenmetalliliuost: 2 ml/-litra a Ellei, toisin mainittu, kaikki luetellut ainesosat 15 ovat yksiköissä g/litra.

b Hivenmetalli liuos: FeCl3-6H20, 27 g/litra;

ZnCl2-4H20, 2 g/litra; CaCl2-6H20, 2 g/litra; NasMöO^HaQ, 2 g/litra, CuS04-5H2Ö, 1,9 g/litra; konsentroitu HC1, 100 ml/litra.

20 c Vitamiiniliuos: xiboflaviini, 0,42 g/litra; pan-

toteenihappo, 5,4 g/litra; nlasiini, 6 g/litra; pyridoksii- I

ni, 1,4 g/litra; hiot iiri i..,. 0,06 g/litra; foolillappo, 0,04 I

g/litra.

25 Taulukko 10

Syö tfcöka svualu s tan koos tumus

Hiivauute 50a

Glukoosi 450 30 MgS0,r7H20 8,6

Hivenmetalliliuosb 10 ml/litra

Vitamiiniliuos0 10 mi/iitra j a Ellei toisin mainittu, kaikki luetellut ainesosat | 35 ovat yksiköissä g/litra. j s ] 87 te Hivenmetalli liuos: FeCl3-6H2Q, 27 g/litra; Ζη012·4Ή20, 2 g/litra; CaCl2-6H20, 2 g/litra; Na2Mo04*2H20, % g/litra, CuSO.r5K2Q, 1,9 g/litra; konsentroitu HC1, 100 ml/litra.

5 c Vitamiiniliuos: riboflaviini, 0,42 g/litra; pan- toteenihappo, 5,4 g/litra; niasiini, 6 g/litra; pyridoksiini, 1,4 g/litra; biotiini, 0,06 g/litra; foolihappo, 0,04 g/litra.

10 Taulukko 11

Syöttoliuoksen 2 koostumus

Tryptoni 172a

Hiivauute 86 15 Glukoosi 258 e Kaikki luetellut ainesosat ovat yksiköissä g/litra.

20 Esimerkki 7

Immuunimäärityksiä SCPin toteamiseksi

Radioirrimuunimääritys-' (RlÄ-) menettelyt, joita käytettiin SCFrn kvantitatiiviseksi toteamiseksi näytteistä, suoritettiin seuraavien menettelyjen mukaan.

25 BRL-3Ä-soluista saatua SCF-valmlstetta, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1, inkuboitiin vastaseerumin kanssa 2 tunnin ajan 37 °C:sSä> Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen näyteputket jäähdytettiin sitten jäissä, 125I-SGF:tä l lisättiin ja putkien sisältöä inkuboitiin 4 öC.:ssa ainakin 30 20 tunnin ajan. Kukin määritysputki sisälsi 500 pl inku- bointiseösta, joka koostui 50 pirsta laimennettua vastasee-* rumia, määrästä noin 60 000 tuiketta/min 125I:-SGF::ää (3,8 ,x.

107 tuiketta /min/pg), 5 piistä- trasylolia ja 0 - 400 pirsta SCE-standardia, jolloin loput tilavuudesta muodosti puskuri 35 (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 0,1 % nautaseerumialbumii-nia, 0,05 % Triton X-100 -valmistetta, 0,025 % atsidia).

88

Vastaseefuitti, oli toinen verinäyte, joka otettiin kaniinista, joka oli immunoitu luontaisella SCF-vaImisteella, jonka puhtausaste oli 50 % ja joka oli saatu B RL - 3Ά- s o 1 ui 11 a käsitellystä kasvualustasta. Vastaseerumin lopullinen laimen-5 nos määrityksessä oli 1:2 000.

Vasta-aineeseen sitoutunut 125I-SCF säestettiin lisäämällä 150 pi Staph A -tuotetta (Calbiochem). Yhden tunnin inkuböinnin huoneenlämpötilassa jälkeen näytteet sent-rifugoitiin ja pelletit pestiin kahdesti 0,75 ml:11a 10 mM 10 Tris-HGl:ää, pH 8,2, joka sisälsi pitoisuudet 0,15 M NaCl, 2 mM EDIA ja 0,05 % Triton X-100 -valmistetta. Pestyt pelletit laskettiin gamma-laskijassa sitoutuneen 12sI-SCF:n prosentuaalisen osuuden määrittämiseksi. Vailla seerumia olevaan putkeen sitoutuneet tuikkeet vähennettiin kaikista 15 loppuarvöista ei-spesifisen sitoutumisen aiheuttaman korjauksen suorittamiseksi. Tyypillinen RIA on esitetty kuviossa | 20. Xeimaamattoman standardin tuottaman 125I-SCF-sitou~ j tumisen prosentuaalinen inhibitio on annosriippuvainen (kuvio 20A), ja kuten esitetään kuviossa 20B, tutkittaessa im-20 muunisaOStettuja pellettejä SDS-PÄGE:lla ja ottamalla auto-radiokuvia ‘^I-SCF-proteiininauhan suhteen esiintyy kilpailua. Kuviossa 20B vyöhyke 1 on l25I-SCF ja vyöhykkeet 2, 3, 4 ja 5 ovat immuunisaostettua 1Z5I-SCF:ää, joka kilpailee 0, j 2, 100 ja vastaavasti 200 ng:n SCF-standardia kanssa. Kuten | 25 määritetään sekä RIA-putkissa havaitusta alenemasta vasta- | aineella saostuvia tuikkeita/min seka alenemasta im-muunisaostettua 125I-SCF-proteiininauhaa (joka migroituu i

kohtaan noin Hr = 31 000) poiyklonaalinen vasta-seerumi I

tunnistaa SCF-standardin, joka puhdistettiin kuten esimer-30 kissä 1.

Western-menettelyitä sovellettiin myös yhdistelmä-DMA-SCF-ilmennyksen EL_ coll -, COS-1- ja CHO-soluissa toteamiseksi. Osittain puhdistetulla E*, colissa ilmennetyllä rotta-SCF1_:l93:11a (esimerkki 10), CÖS-l-soluissa ilmenne-35 tyllä rötta-SCF1_lb~: 11a ja SCF1-193:11a sekä ihmis-SCF1"162:11a {esimerkit 4 ja 9) sekä CHO-soluissa ilmennetyllä rotta-'

J

89 SCF*-'162:11a (esimerkki 5) suoritettiin BDS-PÄGE. Elektroforeesin jälkeen proteiini nauhat siirrettiin 0,2 pm: n nitro-selluloosa kalvolle käyttäen Bio-Rad Transblot -laitetta 60 V:;n jännitteellä 5 tunnin ajan. Nitroseiluloosakalvoja sai-5 vattiin 4 tunnin ajan PBS:ssä, pH 7,6, joka sisälsi 10 %

Vuohi seerumia,,· minkä jälkeen inkuboiti.ln 14 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 1:200 laimennoksella joko kaniinin esi-immuuni- tai immuuniseerumia (immunöintia kuvattiin edellä) , Vastä-airie-vastaseerumikompleksit tehtiin näkyviksi 10 käyttäen: piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kaniin i-IgG-re age n s se ja (Vector Laboratories) ja 4-kloori-l-naftoli-värinkehitysreagenssia.

Esimerkit kahdesta Western-analyysista esitetään kuvioissa 21 ja 22. Kuviossa 21 vyöhykkeet 3 ja 5 ovat 200 15 pi CGS-l-soluissa tuotettua ihmis-SCF1~162: ta; vyöhykkeet 1 ja 7 ovat 200 ui COS-l-soluissa tuotettua ihmis-EPO:ta (COS-l-soluc on transfektoitu V19.8-ΕΡΌ:11a); vyöhykkeessä 8 ovat esivärjätyt molekyylipainomerkit. Vyöhykkeitä 1-4 inkuboitiin esi-immuuniseerumilla ja vyöhykkeitä 5-8 in-20 kuboitiin immuuniseerumilla. Immuuniseerumi tunnistaa spesifisesti diffuusin nauhan, jonka näennäinen MK = 30 000 daltonia, COS-I-soluista, jotka tuottavat ihmis-SCF1"162:ta, mutta eivät GOS-1-soluista, jotka tuottavat ihmis-EPO:ta.

Western-analyysissa, joka esitetään kuviossa 22, 25 vyöhykkeet 1 ja 7 ovat 1 ug osittain puhdistettua rotta-SCF1'193-valmistetta, joka on tuotettu |L_ colissa; vyöhykkeet 2 ja 8 ovat vehnänä!kioagglutiniiniagaröosissa puhdistettua COS-l-soluissa tuotettua rotta-SCF1-19·3 : ea; vyöhykkeet 4 ja 9 ovat vehnänalkioagglutiniiniagaroösissa puhdis-30 tettua CÖS-l-soluissa tugtettuä rotta-SCF1-102: ta; vyöhykkeet 5 ja 10 ovat vehnänalkioagaroosissa puhdistettua CHO- 1

soluissa tuotettua rotta-SCF1'162: ta; ja vyöhykkeessä 6 ovat I

esivärjätyt molekyylipainomerkit. Vyöhykkeitä 1 - 5 ja vyö- f

hykkeitä 6 - 10 inkuhoitlln kaniinin esi-immuuni- ja vas- I

35 taavasti immuuniseerumilla. EL_ colissa tuotettu rotta-SCF1' j 193 (vyöhykkeet 1 ja 7) migroituu näennäiseen jttole.-kyylipa.i- il j 90 noon Mj- - :n. 24 0Ö0 daltonia, kun taas COS-l-soluissa tuotettu rotta-SCF1"193 (vyöhykkeet 2 ja 8) migroituu näennäiseen molekyylipainoon Mr = 24 ODÖ - 3 6 000 daltonia. Tämä ero molekyylipainoissa on odotusten mukainen, koska nisä-5 kassolut, mutta eivät bakteerisolut, kykenevät glykosylaa-tioon. Rotta-SCF1"162: ta koodittahan sekvenssin transfek-toinnista GOS-l-soluihin (vyöhykkeet 4 ja 9) tai CHQ-solui-hin (vyöhykkeet 5 ja 10) seuraa SGF: n ilmentyminen, jonka keskimääräinen molekyylipainö on alhaisempi kuin tuotteen, 10 joka on saatu transfektoimalla SGF1'133:11a (vyöhykkeet 2 ja 8) -

Rotta-SCF1"102: n ilmennystuotteet COS-1- ja CHQ-soluista ovat sarja nauhoja,: joiden näennäinen Mr - 24 000 - 36 000' daltonia. Ilmennetyn SGF:n heterogeenisyys johtuu 15 todennäköisesti hiilihydraattivafianteista, joissa SCF-.polypeptidin glykosylaatioaste vaihtelee.

Yhteenvetona Western-anaiyysit osoittavat, että immuuniseerumi, joka on saatu luontaisella SCF:llä immunoi-duista kaniineista, tunnistaa yhdistelmä-DNÄ-SCF:n, joka on 20 tuotettu |h cqli COS-l- ja CHO-soluissa, mutta ei kykene tunnistamaan mitään nauhoja verrokkinäytteestä, joka koostuu GOS-l-soluissa tuotetusta EPO:sta. SCF-vastaseerumin spesifisyyttä edelleen tukevasti esi-immuuniseerumi samasta kaniinista ei pystynyt reagoimaan minkään rotta- tai ihmis-25 SCF-Ilmennystuotteen kanssa. |

Esimerkki 8

Yhdistelmä-DNA-SCF:n aktiivisuus in vivo A. Rotta-SCF luuydinsiirxossa CÖS-1-soluja transfektoitiin V19.8-SCF1"162:11a: suu-3:0 ren mittakaavaan kokeessa (T175 cm2 -kolvit 60 mm:n maljojen asemesta) kuten kuvattiin esimerkissä 4. Talteen saatiin noin 270 ml supernatarittia. Tällä supernatantilla suoritettiin kromatografia-aj o vehnänalkioagglutiniiniagaroosissa ja S-Sepharose-valmisteessa oleellisesti kuten kuvattiin 3.5 esimerkissä 1. Yhdistelmä-DNA-SCF: ää arvioitiin: luuydin- ] s i i r toma1lis s a, joka perustui hiiri-W/Wv-genetiikkaan. j j 91 W/Wv-hiirellä ori kantasoluvajaus, josta muiden piirteiden ohella seuraa makrosyyttinen anemia (suuria punasoluja) ja joka mahdollistaa luuytimen siirtämisen normaaleista eläimistä tarvitsematta säteilyttää vastaanottajaeläimiä [Rus-5 sei et ai., Science 144 (1964 ) 844 - 84 6] - Normaalit luovatta jakantasolut ohittavat kasvussa vajaat vastaanotta-jasolut siirron jälkeen.

Seuraavassa esimerkissä kuhunkin ryhmään kuului 6 saman ikäistä hiirtä. Luuydintä otettiin normaaleista luo-10 vuttajahiiristä ja siirrettiin W/Wv-hiiriin. Vastaanottaja-eläinten veriprofiilia seurataan eri ajankohtina siirron jälkeen ja luovuttajaytimen istutus määritetään ääreisve-risolujen muuttumisesta vastaanottajan verityypistä luovuttajan verityyppiin. Muutos vastaanottajan fenotyypistä luo-15 vuttajän fenotyyppiin todetaan tarkkailemalla punaisten verisolujen eteenpäin suuntautunutta sirontaprofiilia (FAS-CAK, Beetan Dickenson). Siirrännäisen vastaanottaneen kunkin eläimen profiilia verrattiin sekä luovattajaverrok-kieläimiin että vastaanottajaverrokkieläimiin, jotka eivät 2 0 saaneet, siirrännäistä, kunakin ajankohtana. Vertailu suoritettiin käyttäen tietokoneohjelmaa, joka perustui Koimogo-rov-Smirnov-tilastotieteeseen virtaussysteemien histogram-mien. analysoimiseksi [Yourtg, J.Hlstochem. and Cytochem. 25 (1977.) 935 “ 941] . Istutuksen riippumaton kvalitatiivinen 25 indikaattori on hemoglobiinieiektroforeesiila vastaanottajan verestä todettu hemogiobiinityyppi [Wong et ai.,

Mol.and Cell.Blol, 9 (198:9) 798 - 808], mikä sopii hyvin sopivuuden hyvyyden asteeseen määrityksessä Kolmogorov-Smirnov-tilastotieteen mukaan. : 30 Noin 3 x. 103 solua siirrettiin SCF:llä käsittele- j mättä (verrokkiryhmä kuviossa 23) C56BL/6J-luoyuttajista W/Wv-vastaanottajiin. Toinen ryhmä sai 3 x 105 luovutta-jasol.ua, joita oli käsitelty SCF:llä (600 yksikköä/ml):, 33 °C:ssa 20 minuutin ajan ja jotka ruiskutettiin yht'aikaa 35 (esikäsitel-ty ryhmä kuviossa 23) . (Yksi yksikkö SCF:ää mää-ritellään määräksi, josta seuraa puolimaksimaalinen stimu- 92 laatio MC/9-bioinäärityksessä) . Kolmannessa ryhmässä vas-taanottajahiiret saivat ruiskeet ihonalaisesti (sub-Q) noin 400 yksikön SCFiää/päivä kanssa 3 päivän ajan siitä, kun 3 x 1Ö5 1uovu 11a j a s o1ua oli ruiskutettu (Sub-Q-ruiskeryhmä 5 kuviossa 23) . Kuten kuviossa 23 esitetään, molemmissa SCF:llä käsitellyssä ryhmässä luovattajaydin tulee istutetuksi nopeammin kuin käsittelemättömässä verrokkiryhmässä.

29 päivän kuluttua siirrosta SCF:llä esikäsitelty ryhmä oli siirtynyt luovutiajafenotyyppiin. Tämä esimerkki havainnoi-10 listaa SCF-terapian käyttökelpoisuutta luuydinsiirrossä.

B. Rotta-SCF:n in vivo -aktiivisuus Steel-hiirissä Mutaatiot Sl-geenipaikassa aiheuttavat vajauksia hematopoieettisissa soluissa, pigmenttisoluissa ja sukusoluissa. Hematopoieettinen vajaus ilmenee lukumäärien 15: alenemisena, joka koskee punaisia verisoluja [Russel kirjassa Ä1 Gordon, "Regulation of Hematopoiesis",· osa I, Äp- f pleton-Century-Crafts, New York, 1970,: ss. 649 - 675], \ neutrofiilejä [Rusoettl, Proc.Soc.Exp,Blol.Med. 152 (1976) 398], monosyytteja [Shibata, J. Immunol. 135 (1985) 3905], 20 megakaryosyyttejä [Ebbe, Exp,Hemätoi. 6 (1978) 201], luontaisia tappajasoluja [Clark, Immunogene ties 12 (1981) 601 j sekä syöttösoluja [Hayashi, Dev.Biol, 109 (1985} 2341. Steel-hiiret ovat huonoja luuydinsiirrevastaanottajia, mikä johtuu niiden alentuneesta kyvystä tukea kantasoluja [Ban-25 nerman, Prog. H emä toi. 8 (1973) 131] . SCF pää koodit tavat geeni on deletoitunut Steel- (S1/S1-) hiiristä.

Steel-hiiret tarjoavat SCF-aktiivisuuden herkän in vivo -mallin. Eri yhdistelmä-DNA-SGF-proteiineja testattiin Steel-Dickie- (Sl/Sld~) hiirissä vaihtelevan mittaisia ai- | .30 kp ja. 6-10 viikon ikäiset Steel-hiiret (WCB6Fl-5i/Sid} f hankittiin laitoksesta Jackson Labs, Bar Harbor, ME. Ää- | reisverta tarkkailtiin käyttäen SYSMEX F-800 -mikrosolu- | laskijaa (Baxter, Irvine, CÄ) punasolujen, hemoglobiinin ja j verihiutaleiden määrittämiseksi. Ääreisveren valkaverisalu- | 35 lukemien (iBC) laskemiseksi käytettiin Coulter Channelyzer j 256 -laitetta (Coulter Electronics, Marietta, GA). j 93

Kuvion 24 mukaisessa kokeessa Steel-Dickie-hiiriä käsiteltiin coli -peräisellä SCF-1-164:llä, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 10, annoksena 100 ug/kg/päivä 30 päivän ajan, ja sitten annoksena 30 pg/kg/päivä vielä 30 5 päivän ajan. Proteiini koostettiin ruiskutettavaan suolaliuokseen (Abbott Labs, North Chicago,, IL·), joka sisälsi O,! %:n nautasikiöseerumia. Ruiskeet annettiin päivittäin ihonalaisesti. Ääreisverta tarkkailtiin ottamalla hännästä verta n. 50 pl kuviossa 24 mainittuina ajankohtina. Veri 10 kerättiin 3-|s isellä: EDTA:11a päällystettyihin ruiskuihin ja jaettiin EDTA-jauheella käsiteltyihin: mikrofugiputkiin (Brinkmann, Westbury, NY) . Käsiteltyjen eläinten ma.kr.os.yyt-· tisessä at emi, a saa tapahtuu merkittävä korjaus verrok-kieläiini in verrattuna. Käsittelyn loppuessa käsitellyt 15 eläimet palautuvat alkuperäiseen makrosyyttisen anemian tilaansa .

Kuvioissa 25 ja 26 esitetyssä kokeessa Steel-Dickie-hiiriä käsiteltiin eri yhdistelmä-DNA-SCF-muodoilla kuten edellä kuvattiin, jolloin kuitenkin annos oli 100 20 ug/kg/päivä, 20 päivän ajan. Kaksi coli -peräistä rotta-SCF-muotoa, SCF1”10'1 ja SCF1*193, tuotettiin kuten kuvattiin esimerkissä 10. Lisäksi testattiin coli -SCF1-164, jota oli modifioitu lisäämällä polyetyleeniglykolia (SCF1·'164- \ PEG25.) kuten esimerkissä. 12. Samoin testattiin CHO-peräinen 25 SCF1"'162, joka tuotettiin kuten esimerkissä 5 ja jota puh distettiin kuten esimerkissä 11. Eläimistä otettiin verta lävistämällä sydän 3-1:isellä EDTA:11a päällystetyillä ruiskuilla ja se jaettiin EDTA-jauheella käsiteltyihin putkiin. Äärelsveriprofiilit .20 päivän käsittelyn jälkeen on 30 esitetty kuviossa 25 valkoisille verisoluille (W3C) ja kuviossa 26 verihiutaleille. WBC-dif ferentiaalit SCF1"16"5-PEG25—ryhmälle on esitetty kuviossa 27«. Neutrofillien, mo-nosyyttien, imusolujen ja verihiutaleiden määrissä tapahtuu absoluuttisia lisäyksiä. Näyttävin vaikutus nähdään SCF1" 35 16ti-PEG25:llä.

94

Imusolualäsarjoista suoritettiin niinikään riippumaton, mittaus, josta tulostiedot on esitetty kuviossa 28.

Ihmis-CD4:n, tai T-avustajasolumetkin, hiiriekvivälentti on L3T4 [Dialynas, J,: Immunol. 131 (1983) 2445] , LyT-2 on hii- 5 riantigeeni sytotöksisten T-solujen pinnalla [Ledbetter, J, Exp,Med. 153 (1981) 1503]. Näiden antigeenien vastaisten monofclonaalisten vasta-aineiden avulla: arvioitiin T- solualasarjoja käsitellyissä eläimissä.

Täys verestä värjättiin T-imuso.lualasar joja seuraa-10 vasti. 200 μΐ täysverta otettiin yksittäisistä eläimistä EDTÄ;lla käsiteltyihin putkiin. Kussakin verinäytteessä aiheutettiin lyysi käsittelemällä steriilillä deionisoiduila vedellä 60 sekunnin ajan, minkä jälkeen näytteistä tehtiin isatoonisia käyttäen 10X Dulbeccon fosfaattipuskuroitua 15 suolaliuosta (ΡΒΞ) (Gibco, Grand Island, NY) . Tämä lyysin läpikäynyt veri pestiin 2 kertaan IX PBSillä (Gibco, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 0,1 %:lla nautasikiösee-rumia (Flow Laboratory, McLean, VÄ) ja 0,1 %:lla natriumat- | sidia,: Kukin verinäyte sijoitettiin pyöreäpoh jäiseen 96- 20 kuoppaiseen rykelmä levyyn ja sentrifugoitiin. Solupelletti (joka sisältää 2 - 10 x 105 solua) uudelleenlietettiin 20 pihaan rotan antihiiri-L3T4:ää, joka. oh kohjugpitu fy-koerytriiniin (PE) (Beeton Dickinson, Mountain View, CÄ) , ja 20 pihaan, rotan antihiiri-LyT-2: ta, joka on konjugoitu 25 fluoreseiini-isotiosynaattiin, minkä jälkeen inkuboitiiu jäissä (4 °C). 30 minuutin ajan (:B.e et ori Dickinson) . Inku- boinnin jälkeen solut pestiin Ξ kertaan IX PBShllä, jota oli täydennetty kuten edellä mainittiin. Kukin verinäyte analysoitiin sitten PÄCSCÄN-Söluanalyysisysteemissä. .{.Beetan.

30 Dickinson, Mountain View, CÄ) . Tämä systeemi .standardoitiin käyttäen standardiautokorapensaatiomenettelyitä ja Cälibrite Beads —helmiä (Beetan Dickinson, Mountain View, CÄ) . Nämä tulostiedot osoittavat absoluuttistä nousua sekä avustaja- |

T-solupopulaatioissa että sytotoksisten T-solujen lukumää- I

35 rissa. I

95 C. SCF* n in vivo -aktiivisuus kädellisissä

Ihmis-SCF-1-164 : n, joka ilmennettiin Fb_ col is: g a (esimerkki 6B) ja puhdistettiin homogeeniseksi kuten esimerkissä 10, biologista aktiivisuutta in vivo testattiin 5 normaaleissa kädellisissä. Täysikasvuisia urospuolisia paviaaneja (Papio sp.) tutkittiin kolmessa ryhmässä: käsittelemättömät, n=3; SCF:tä 100 pg/kg/päivä saatat, n-6; ja SCF-tä 30 pg/kg/päivä saavat, n=6. Käsitellyt eläimet saivat yksittäiset päivittäiset ihonalaiset SCF-ruiskeet.

10 Eläimistä otettiin verinäytteet ketamiinipidäkettä käyttäen. Näytteet täydellistä verilaskentaa, retikulosyyttilas-kentaa ja verihiutaleläskentaa varten otettiin käsittely-päivinä 1, 6, 11, 15, 20 ja 25.

Kaikki eläimet jäivät menettelyjä?:jestelyssä eloon, 15 eikä niillä ilmennyt mitään kielteisiä reaktioita SCF-terapiaan. Välkosoluluku kohosi käsitellyissä eläimissä annoksen ollessa 100 pg/kg kuten esitetään kuviossa 29. Dif- | f©rentiaa!ilukema, joka saatiin manuaalisesti Wright Giemss | -värjätyistä ääreisveritahroista, on samoin merkitty kuvi-20 oon 29. Neutrofiilien, imusolujen ja 'monosyyttien lukumäärissä tapahtui absoluuttinen lisäys. Kuten esitetään kuviossa 30, annoksella lOÖ pg/kg tapahtui niinikään nonsu: sekä hematokriittien että verihiutaleiden lukumäärissä.

Ihmis-SCF:ää (hSCF1"164, jota oli modifioitu lisää-25 mällä polyetyleeniglykolia kuten esimerkissä 12), testattiin myös normaaleissa paviaaneissa annoksena 200 ] pg/kg/päivä, joka annos annettiin jatkuvana laskiinönsisäi-senä nestesiirtoha, ja tulosta verrattiin modifioimattomaan proteiiniin. Eläimille alettiin antaa SCF.rää päivänä Ö ja 30 käsittelyä jatkettiin 28 päivän ajan. Tulokset ääreis- WBC::stä esitetään seuraavassa taulukossa. PEG:llä modifoitu | ... :ä SCF aikaansai varhaisemman nousun ääreis-WBG:ssä kuin modi- f fioimaton SCF. | j | 9:6 Käsittely annoksella 200 pg/kg/päivä hSCF1-164:ää:

Eläinnro M8832Ö Eläinnro M88129

Päivä WBC Päivä WBC

5 0 5 800 0 6 800 +7 10 700 +7 7 400 +14 12 600 +14 20 900 +16 22 000 +21 18 400 10 +22 31 100 +23 24 900 +24 28 100 +29 13 000 +29 9 600 +30 23 000 +36 6 600 +37 12 100 +43 5 600 +44 10 700 15 +51 7 800 Käsittely annoksella 200 pg/kg/päivä PEG-hSCF1-164 : ää:

Eläinnro M88350 Eläinnro MS9116

20 Päivä WBC Päivä WBC

-7 12 400 -5 7 900 j -2 11 600 0 7 400 j +4 24 700 +6 16 400 25 +7 20 400 +9 17 100 +11 24 700 +13 18 700 +14 32 600 +16 19 400 + 18 33 600 +.20 27 800 +21 26 400 +23 20 700 30 +25 16 600 +27 20 200 +28 26 900 +29 18 600 +32 9 200 +33 7 600 :5 97

Esimerkki 9

Yhdisfcelmä-DNA-ihmis-SCF: n aktiivisuns in vitro

Ihmis-SCF-cDNÄ, joka vastasi aminohappoja 1 - 162,, ja saatiin esimerkissä, 3D hahmotelluissa PCR-reaktioisSa, 5 ilmennettiin GOS-l-soluissa kuten kuvattiin rotta-SCP: lie esimerkissä 4. CÖS-l-supernatantlt määritettiin ihmisen luuydintä käyttäen sekä hiiri-HPP-CFC- ja MC/9-määri-tyksillä. Ihmisproteiini ei ollut aktiivinen testattuina pitoisuuksina kummassakaan hiirimäärityksessä; kuitenkin se 10 oli .aktiivinen ihmisen luuytimen suhteen. Määrityksen viljelyolosuhteet olivat seuraavat: ihmisen luuydintä terveistä vapaaehtoisista· luovuttajista sentrifugoitiin käyttäen Ficoll-Hypaque-gradientteja (Pharmacia) ja viljeltiin seoksessa, jossa oli 2,1 % metyyliselluloosaa, 30 % vasikansi-15 kiöseerumia, pitoisuudet 6 x 10~5 M 2-merkaptoetanoli, 2 mM glut amiini, ISCOVE-kasvualustaa (Gibco), 20 yksikköä/m.l EPGrta ja 1 x 10" solua/ml, 14 päivän ajan kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 7 % 02:ta, 10 % C02:ta ja 83 % N2: ta. Yhdistelmä-DKÄ-ihmis- sekä rotta-SCF-CQS-l-superna-20 tanteilla saadut pesäkeluvut esitetään taulukossa 12. Vain ne pesäkkeet, jotka ovat kooltaan 0,2 mm tai suurempia, on merkit ty.

Taulukko 12 25 Ihmisen luuydinpesäkkeitten kasvu vasteena SCF;lle

Transfektoitu plasxuidi Määritetty Pesäkkeitä, kpl CM-tilavuus /100 000 solua

(μΐ) ± SD

30 V19.8 (ei inserttia) 100 0 50 0 VI9. S-ihmis-SCF1"162 100 33 ± 7 | 35 50 22 ± 3 98 VI9.8-rotta-SCE1-162 100 13 ± 1 50 10 14 päivän aikajaksona kasvaneet pesäkkeet esitetään 5 kuviossa 31A (suurennos 12x) . Nuoli osoittaa tyypillistä: pesäkettä;Pesäkkeet muistuttivat hiiri-HPP-CFC-pesäkkeitä suuren kokonsa osalta (keskimäärin 0,5: mm). EPO:n läsnäolon johdosta: jotkut pesäkkeistä olivat hemoglobinisoituja. Kun pesäkkeet eristettiin, ja sentrifugoitiin objektilaseille 10 käyttäen Cytospin-laitetta (Sbandon) ja: värjättiin sitten Wright-Giemsa-värillä, vallitseva solutyyppi oli ei-diffe-rentioitunut solu, jonka tuma:solulima-suhde oli korkea kuviossa 31B esitetyn mukaisesti (suurennos 4ÖOx) . Nuolet: kuviossa 31B osoittavat seuraavia rakenteita: nuoli 1, solu-15 lima; nuoli 2, tuma; nuoli 3, solurakkuloita. Epäkypsät solut ovat luokkana suuria ja soluista tulee lisääntyvässä määrin pienempiä niiden kypsyessä [Diggs et ai. , "The Morphology of Human Blood Cells", Abbott Labs, nro 3 (1978)]. Hematopoieettisen kypsymissekvenssin varhaisten 20 solujen tumat ovat suhteellisen suuria verrattuna soluli-maan. Lisäksi epäkypsien solujen solulima värjääntyy tummemmaksi Wright“Giemsa-värillä kuin tuma. Solujen kypsyessä tuma värjääntyy tummemmaksi kuin solulima. Ihmisen luuydin-solut, jotka saadaan viijeltäessä yhdiste;lmä-'PNA--±'haai'S“.

25 SCF:11a, sopivat morfologialtaan siihen johtopäätökseen, | että SCF vaikutuksen kohde ja välitön tuote on suhteellisen epäkypsä h emä t o p o i e e 11. i n e n kantaisäsolu.

YhdisteImä-DNA-i hmi s-S G F:a ä test at t iin aga r- pesäkemäärityksissä ihmisen luuytimen suhteen sen ollessa 30 yhdistetty muihin kasvutekijöihin kuten kuvattiin edellä.

Tulokset esitetään taulukossa 13.: SCF vaikuttaa synergisti-sesti G-CSF:n, GM-CSF:n, IL-3:n ja E?C:n kanssa nostaen yksittäisten CSF:ien luuydinkohteiden lisääntymistä.

$ 99

Taulukko 13

Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:n synergia muiden ihmisso-lupesäkkeitä stimuloivien tekijöiden kanssa 5 Pesäkkeitä, kpl /105 solua {14 päivää)

Vale 0 hG-CSF 32 ± 3 10 hG-CSF + hSCF 74 + 1 hGM-CSF 14 ±: 2 hGM-GSF + hSCF 108 ± 5 h I L-3 23 + 1 hIL-3 + hSCF 108 + 3 15 LEPO 10+5 hEPO + IL-3 17 ± 1 LEPO + hSCF 86 i 10 HSCF 0 20 Yhdistelmä-DNÄ-ihmis-SCF:n toinen aktiivisuus on kyky aikaansaada pehmeässä agar-agarissa ihmisen akuutti ydinperäinen leukemia - (ÄML-} sclulinjan, KG-1 (ATCC CCL 246), lisääntymistä. COS-l-supernatantteja transfektoiduis-ta soluista testattiin KG-l-agar-kloonausmäärityksessä 25 [Koeffler et ai. , Science 200 (1978) 1153 - 1154] oleellisesti kuten kuvattiin lukuunottamatta, että soluja maljoi-tettiin määrä 3 000/ml. Tulokset kolminkertaisista viljelyistä esitetään taulukossa 14.

j ! .100

Taulukko 14 KG-1-pehmeä-agar-kloonausmäärity s

Transfektoitu Määritys- Pesäkkeitä, kpl

5 plasraidi tilavuus (pl) /3 000 solua ± SD

VI9.8 (ei inserttiä) 25 2 ± 1 VI9.8 - i hmi s - SC F1'16:' 25 14 ± 0 10 12 S + 0 6 9 ± 5 3 6 + 4 1,5 6 ± 6 15 Vig.e-rotta-SCF1"162 25 6 ± 1 ihmis-GM-CSF 50 (5 ng/ml) 14 ± 5

Esimerkki 10 20 E^_ pojissa ilmennettyjen yhdi s te lmä-DNA- SCF-tuot teiden puhdistaminen E. co li -ihmis-SCF1"'64: ää f ermentoitiin esimerkin 6C mukaisesti. Talteenoietut solut (912 g märkäpaino) lie-lettiin veteen tilavuuteen 4,6 litraa ja rikottiin käyttä-25 isällä liete 3 kertaan laboratoriohomogenisaattorin läpi (Gaulin-maili 15MH-8TBÄ) paineessa 560 kp/cm2. Sentrifugpi-malla (17 700 h g, 30 min, 4 °C) saatiin rikotusta solupel-.1 etistä koostuva fraktio, joka pestiin kerran vedellä (uu- | delleenliettäminen ja sentrifugointi toistamiseen) ja lie- 1 30 lettiin lopuksi veteen 400 ml:n tilavuuteen, ;

Pellettifraktio, joka sisälsi ei-liukoista SCF:ää j (arvio 10 - 12 g SGF:ää), lisättiin 3 950 ml:aan· tarkoituk- \ senmukaista seosta siten, että ainesosien loppupitoisuudet | seoksessa olivat 8 M urea (laatu, jonka puhtausaste oli hy-35 vin puhdas, "ultra"), 0,1 mM EDTÄ, 50 mM natriuraasetaatti, pH 6 - 7; SCF-p.iloisuudeksi arvioitiin 1,5 mg/ml. Inkuboi- 101 tiin huoneenlämpötilassa 4 tuntia ajan SCF:n tekemiseksi liukoiseksi. Jäljellä oleva ei-liukoinen materiaali poistettiin sentrifugoimalla (17 700 x g, 30 min, huoneenlämpötila) . Liukoiseksi tehdyn SCF:n uudelleenlaskostami sek-5 si/uudelleenhapettamiseksi supernatanttifraktio lisättiin hitaasti samalla sekoittaen 39,15 litraan tarkoituksenmukaista seosta siten, että ainesosien loppupito.isoudet seoksessa olivat 2,5 M urea (laatu, jonka puhtausaste oli hyvin puhdas, "ultra"), 0,01 mM EDTÄ, 5 mM natriumasetaatti, 50 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM glutationi, 0,02 % (w/v) natrium-atsidia. SCF-pitoisuudeksi arvioitiin 150 pg/ml. Sekoitettiin 60 tunnin ajan huoneenlämpötilassa [lyhemmätkin ajat (esim. n. 20 tuntia) sopivat], minkä jälkeen seos konsentroitiin puoleen käyttäen Millipore Peilieon -ultra-15 suodatuslaitteistoa, jossa oli kolme polysulfonimembraani-kasettia, joiden molekyylipainokynnys oli 10 000 {kokonaispinta-ala 460 enk), ja diasuodatettiin vastaan 7 tilavuutta 20 mM' Tris-HCl:ää, pH 8, Lämpötila konsentrointi/ult-rasuodatuksessa oli 4 dC, pumppausnopeus oli 5 litraa/min 20 ja suodatusnopeus oli 600 ral/min. Talteensaadun retentaatin lopputilavuus oli 26,5 litraa. Käyttämällä SDS-PÄGE:ea, joka suoritettiin sekä peikistäen näytteet että niitä pelkistämättä selvitettiin kiistatta, että valtaosa (> 80 .%) pel-lettif raktio-SCF·: stä liukeni inkuboinnissa 8 M ureal la ja 25 että laskpstamisen/hapetuksen jälkeen läsnä on monia SCF-lajeja (muotoja), mikä Visualisoitiin ei-pelkistettyjen näytteiden SDS-PÄGE:ila. Valtamuoto, joka vastaa oikein ha- | pettunutta SCF:ää (katso, alla), migroituu näennäiseen Mr-lukemaart noin 17 000 (ei-pelkistetty:) suhtesssa rnolekyyli-30 painomerkkeihin (pelkistettyjä), joita kuvattiin kuvion 9 yhteydessä. Muita muotoja ovat materiaali, joka migroituu näennäiseen Mr-lukemaan noin 18 - 20 000 {ei-pelkistetty} , jonka arvellaan edustavan SGF:ää, jonka ketjunsisäiset di-sulfidisillat ovat epäasialliset; ja nauhat, jotka migroi-35 tuvat näennäisiin lukemiin noin 37 000 (ei "-pelkistettyjä) tai enemmän, joiden arvellaan edustavani, eri SCF- 102 muotoja, joissa on ketjunsisäisiä disulfidisiltoja, joista seuraa SCF-polypeptidiketjuja, jotka ovat kovalenttisesti kytkettyjä muodostamaan dimeerejä tai vastaavasti suurempia oligomeerejä. Seuraavien fraktointivaiheiden tuloksena lo-5 put Eb coii -epäpuhtaudet sekä epätoivottavat SCF-muodot poistuvat siten., että saadaan näennäisesti homogeeniseksi puhdistettua SGF:ää, joka on biologisesti aktiivisessa kon-formaatiossa-

UltrasUodatusretentaatin pH säädettiin 4,5:ksi 11-10 säämällä 375 ml 10-%:ista (v/v) etikkähappoa, mikä johti näkyvän saostuneen materiaalin läsnäoloon. 60 minuutin kuluttua, jolloin suuri osa saostuneesta materiaalista oli asettunut astian pohjaan, ylemmät 24 litraa dekäntoitiin eroon ja suodatettiin Cuno^ 30SP -syväsuodattimen läpi j 15 virtausnopeudella 500 ml/inin kirkastamisen loppuunsaattaa- j iäiseksi. Sitten suodosta laimennettiin 1,5-kertaisesti li- j säämällä vettä ja se panostettiin 4 °C:ssa S-Sepharose Fast i

Flow (Pharmacia) -kolonniin (9 x 18,5 cm) , jota oli tasapaino! tettu 25 mM natriumasetaatilla, pE 4,5. Kolonnia käy-20 tattiin virtausnopeudella 5 litraa/tunti 4 °C:ssa. Näyte- pariostuk.sen jälkeen 'koionni. pestiin 5 kolonnitilavuudella (n. O litraa) kolonnipuskuria ja kolonniin sitoutunut SCF- | materiaali eluo.itiin käyttäen gradienttia 0 0,35 M NaCl koionnipuskurissa. Gradientin kokonaistilavuus oli 20 lit- ;! 25 raa ja, kerättiin 200 ml:n fraktioita. Eluutioprofiili on | esitetty kuviossa 33. S-Sepharose-kolonnista kerätyistä 1 fraktioista otetut näytteet (10 μ!) analysoitiin SDS- j PAGESlla,; joka suoritettiin sekä näytteet pelkistäen (kuvio | 32A) että niitä pelkistämättä (kuvio 32Bj. Tällaisten ana- j 30 lyysien perusteella on ilmeistä, että absorbanssi 2$.0 .·] nm:ssä (kuviot 32 ja 33) johtuu käytännöllisesti katsoen \ kokonaisuudessaan 3GF-materiaalista:. ]

Oikein hapettunut muoto on vallitseva pääasiani- ] sessa absorbanssipiikissä: (fraktiot 22 - 38, kuvio 33). VM- | 35 M is iin lajeihin (muotoihin)., joita fraktioista voidaan visualisoida, lukeutuu väärin hapettunut materiaali, jonka j 103 näennäinen Mr = 18 “ 20 000 SDS-PAGE:ssa {ei-pelkistynyt), joka esiintyy johtavassa olkapäässä pääasiallisessa absor-banssipiikissä (fraktiot 10 - 21, kuvio 32B) ; ja disiilf läikyt ket ty dimeerimateriaäli, jota esiintyy kautta absorbans-5 sialueen /fraktiot 10 - 38, kuvio 32B) .

Fraktiot 22 - 38 S-Sepharose-kolonnistä yhdistet·-tiin pooliksi, jonka pH säädettiin 2,2:ksi lisäämällä noin il ml 6 N HCl:ää, minkä jälkeen se panostettiin Vydac-Ca-kolonniin (korkeus 8,4 cm, halkaisija 9 cm}, jota oli tasa-10 painoitettu 50-%:iseila (v/v) etanolilla, joka sisälsi pitoisuuden 12,5 mM HCl (liuos A), ja jota käytettiin 4 °C:ssa. Kolonnihartsi valmistettiin liettämällä kuiva hartsi 80-%:iseen (v/v) etanoliin, jossa oli pitoisuus 12,5 mM HCl (liuos B) , minkä jälkeen sitä täsapainoitettiin liu-15 oksella A. Ennen näytteen panostusta käytettiin sokeaa gra-dienttia liuoksesta A liuokseen B (kokonaistilavuus 6 litraa), minkä jälkeen kolonnia tasapainoitettiin toistamiseen liuoksella A, Näytteen panostuksen jälkeen kolonnia pestiin 2,5 litralla liuosta A ja kolonniin sitoutunut SCF-20 materiaali eluoltiin käyttäen gradienttia liuoksesta A liuokseen B {kokonaistilavuus 18 litraa) virtausnopeuden ollessa 2 670 ml/tunti. Kerättiin 286 fraktiota, joista kukin oli 50 ml, ja joista otetut näytteet analysoitiin mittaamalla absörbanssi 280 nmrssä {kuvio 35) sekä SDS-PAGE:11a ! 25 (25 μΐ/fraktio) kuten edellä kuvattiin (kuvio (34A, pelkis tävät olosuhteet; kuvio 34B, ei-pelkistävät olosuhteet).

Fraktiot 62 - 161, jotka sisälsivät oikein hapettunutta SCF:ää erittäin puhtaana, yhdistettiin pooliksi [suhteellisen pienet määrät väärin hapettunutta monomeeriä, jonka 30 - noin 18 - 20 000 .{'ei-pelkistynyt), eluoitui myöhemmin gradient issä' (suunnilleen fraktioissa 166 - 211), jolloin myös disulfirtikytketty dimeerimateriaali eluoitui myöhemmin (suunnilleen: fraktioissa 199 - 235) (kuvio 35) ] .

Etanolin poistamiseksi fraktioiden 62 - 161 muodos-35 ta raasta poolista sekä S:CF:n konsentroimiseksi käytettiin seuraavaa menettelyä, jossa käytettiin Q-Sepharose Fast j j 104

Flow (Pharmacia) -loninvaihtohartsia:, Poolia (5 litraa) laimennettiin lisäämällä vettä tilavuuteen 15,625 litraa, jolloin etanolipitoisuudeksi tuli noin 20 % (v/v). Sitten lisättiin 1 M Tris-emästä (135 ml) pH:n nostamiseksi 8:aan, 5 ja sen jälkeen 1 M Tris-HClrää, pH 8 (23,6 ml) kokdnais-

Tris-pitoisuuden nostamiseksi 10 irtMrksi. Sitten lisättiin 10 mM Tris-HGl:iä, pH 8 (n. 15,5 litraa) kokonaistilavuuden nostamiseksi 31,25 litraksi, jolloin etanolipitoisuudeksi tuli noin 10 % (v/v). Sen jälkeen materiaali panostettiin 10 4 °C:ssa Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin (korkeus 6,5 cm, halkaisija 7 cm) , jota oli tasapainoitettu 10 mM Tris-HC1:ilä, pH 8, minkä jälkeen kolonni pestiin 2,5 litralla kolonnipuskuria. Virtausnopeus näyttepanostuksen ja pesun aikana oli noin 5,5 litraa/tunti. Sitoutuneen SCF:n eiuoi-15 miseksi liuosta 200 mM NaCl, 10 mM Tris-RCl, pH 8, pumpattiin. käänteiseen suuntaan kolonnin läpi virtausnopeudella noin 200 ml/tunti.. Kerättiin noin 12 ml:: n fraktioita, joita analysoitiin mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä ja suorittamalla SDS-PäGE kuten edellä. Fraktiot 16 - 28 yhdistet-20 'tiili. (157 ml) .

Sitten SCF:n sisältävä pooli panostettiin kahta erillistä ajoa silmällä pitäen (78,5 ml panostettiin kumpaakin varten) Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) -geeli-suoda t us kolonni i n (5 x 138 cm), jota oli tasapainoitettu 25 fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella 4 °C:ssa. Kerättiin noin 15 ml: n fraktioita virtausnopeuden ollessa noin 7 5 ml/tunti. Kummassakin tapauksessa pääasiallinen materiaali-piikki, joka absorboi 280 nm:ssä, eluoitui fraktioissa, jotka vastasivat karkeasti eluutictilavuutta noin 1 370 - 1 30 635 ml. Näitä ahsorbanssipiikkejä vastaavat fraktiot kysei sistä kahdesta kolonniajosta yhdistettiin yhdeksi pooliksi, jonka tilavuus oli 525 ml ja joka sisälsi noin 2,3 g SCF:ää. Tämä materiaali steriloitiin: suodattamalla käyttäen f

Millipofe Millipak 20 -membraanipanosta. j .) j | 105

Vaihtoehtoisesti €4-koionnista saatu materiaali voidaan konsentroida uitrasuodattamalla ja puskuri vaihtaa diasuodattaitialla ennen steriili suodatusta.

Eristetty yhdistelmä - DNA- i hmi s - S C F1 ’1 b 4 -ma t e r i a a 1 i 5 on erittäin puhdasta (> 98 % SDS-PAGE:ssa hopealla värjättäessä) ja se katsotaan farmaseuttiseksi laaduksi. Käyttäen esimerkissä 2 hahmoteltuja menetelmiä on todettu, että materiaalin aminohappokoostumus vastaa SCF-geenin analyysin perusteella odotettua koostumusta, ja että sen N-pään ami-10 nohapposekvenssi on Met-GIu-Gly-Ile... odotusten mukaisesti, jolloin Met:n pysymisen koodittaa aloituskodoni.

Menettelyillä, jotka ovat verrattavia niihin, joita hahmoteltiin EE colissa ilmennetylle ihmis-SCF1’16'3: Ile, rotta-SCF1’164 (joka samoin on ei -l.iu.koi sessa muodossa solun j 15 sisässä fermentoinnin jälkeen) voidaan ottaa talteen puhtaana siten, että sen biologinen spesifinen aktiivisuus on j

korkea. Vastaavasti ihmis-SCF1’183 ja rotta-SCF1’193 voidaan I

ottaa talteen. Rotta-SCF1’193:11a on laskostamisessa/hape- | tuksessa taipumus muodostaa enemmän eri tavoin hapettuneita: 20 lajeja, ja epätoivottavat lajit ovat vaikeammin poistettavissa kromatografisesti,

Rotta-SCF1’193 ja ihmis-SCF1"183 ovat taipuvaisia hajoamaan proteoiyyttisesti talteenoton varhaisissa vaiheissa, eli liukoiseksi tekemisessä ja laskostamisessa/hape-25 tuksessa. Ensisijainen proteolyysikohta sijaitsee tähteiden 160 ja 170 välissä. Proteolyysi voidaan minimoida manipuloimalla tarkoituksenmukaisesti olosuhteita (esim, SCF-pitoisuutta; vaihtelemalla pHita; sisällyttämällä mukaan EDTArta pitoisuus 2 - 5 mM, tai muita proteaasi-inhibiit-30 toreita), sekä, hajonneita muotoja siinä määrin, että läsnä olevat voidaan, poistaa: tarkoituksenmukaisilla fraktiointi- | vaiheilla. \

Vaikka upean käyttö liukoiseksi tekemisessä sekä | laskostamisessa/hapetuksessa on kuten hahmoteltu edullinen ;j 35 suoritusmuoto, muitakin liukoiseksi tekeviä aineita kuten 1 guanidiini-HCliää (esim, 6 M liukoiseksi tekemisessä ja ij j 106 1,25 M laskostamisessa/hapetuksessa) sekä natrium-N-lauro-yylisarkosiinia voidaan käyttää tehokkaasti. Kun nämä aineet on poistettu laskostamisen/hapet.uksen jälkeen, puhdistettuja SCF:iä, SDS—PÄGEilla määritettyinä, voidaan saada 5 talteen käyttämällä tarkoituksenmukaisia fraktiointivaihei-ta.

Lisäksi vaikka glutatiohin käyttäminen pitoisuutena 1 mM laskostamisen/hapetuksen aikana on edullinen suoritusmuoto, muitakin olosuhteita voidaan käyttää samalla tai lä-10 hes samalla teholla. Näitä ovat esimerkiksi, että 1 mM glu-tationin asemesta käytetään 2 mM glutationia seka 0,2 mM hapetettua glutationia, tai 4 mM glutationia sekä 0,4 mM hapetettua glutationia, tai 1 mM 2-merkaptoetanolia, tai muitakin tiolireagensseja.

15 Kuvattujen kromatografisten menettelyjen lisäksi \

muitakin menettelyjä, jotka ovat käyttökelpoisia SCEkien I

j talteenottamiseksi puhdistetussa aktiivisessa muodossa, j ovat hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia [esim. fenyy-li-Sepharosen (Pharmacia) käyttö, jolloin näyte panostetaan .20 neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1,7 mM ammoni-ums.ulfaa.tti, ja eluoidaan käyttäen laskevaa ammoniumsul-faattigradienttia]; immobilisöitu metalli -affiniteettikro-matografia [esim. Cu2+“ionilla varatun kelatoivan Sepharo-sen (Pharmacia) käyttö, jolloin näyte panostetaan lähes 25 neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1 mM imidatso-li> ja eluoidaan kasvavalla imidatsoligradientilla]; hyd-ro.ks y y liapat i i tt i kroma t ogr a f ia. [jolloin näyte panostetaan neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1 mM fosfaatti, ja eluoidaan kasvavalla fosfaattigradientilla] ; ja muut 30 alan ammattilaisille ilmeiset menettelyt. j

Muita ihmis-SCF-muotoja, jotka vastaavat kokona!- | s uudessa an tai osittain avointa lukualuetta, joka koodi ttaa ;j aminohapot 1 - 24 8 kuviossa 4.2, tai vastaavat avointa luku- | aluetta, jonka koodittavat vaihtovucroisesti silmukoidut | 35 mRNÄ:t, joita voi esiintyä (kuten se, joka esiintyy kuvion j 44 mukaisessa cDNÄ-sekvenssissä):, voidaan niinikään iImien- :j i ] j 107 tää collssa ja ottaa talteen puhdistetussa muodossa sa mankaltaisilla menettelyillä, kuin menettelyt, joita kuvattiin tässä: esimerkissä, ja muilla menettelyillä, jotka ovat alan ammattilaisille ilmeisiä.

5 Muotojen, jota käsittävät niinsanotun transmemhra.a- nialueen, johon viitattiin esimerkissä 16, puhdistamiseen ja koostamiseen saattaa liittyä pesuaineideh käyttäminen, mukaan lukien ei-ionisten pesuaineiden, ja lipidien, mukaan lukien fosfolipidipitoisten liposomirakenteiden.

1:0 Esimerkki 11

Yhdistelmä-DNA-SCF nisäkässoluis ta Ά. SCF:ää tuottavien CHO-solujen fermentointi Kiinalaisen hamsterin munasarja^ (CHO-) yhdisteimä-DKlA-soluja (kanta CHO pDSR-alf a-2-hSCF1”162) kasvatettiin 15 mikrokanta j illa 2.0 litran perfuusiöviljelysysteemissä ih-mis~SCF1''lo2:n tuottamiseksi. Fermentointisysteemi on samankaltainen kuin BRL 3A -solujen viljelyyn käytetty esimerkissä IB lukuunottamatta, että CHO-solujen viljelyyn käytetty kasvualusta oli seos Dulbeccon modifioitua Bagle-20 kasvualustaa (DMEM) ja Hamin F~12-ravinnekasvualustaa suh- \ teessä 1:1 (Gibr.o) , jota oli täydennetty pitoisuudella 2 mM glutamiihi, ei-välttämättomillä aminohapoilla (olemassa olevan pitoisuuden kaksinkertaistamiseksi käyttämällä 1:100 laimennoksena Gibco nro 320-1140 -tuotetta) ja 5 %:11a nau-25 tasikiöseerumia. Talteenotettu kasvualusta oli identtinen lukuunottamatta seerumin poisjättöä. Reaktoriin siirrostet-ti in 5,6 x 109 CHO-solua, jotka oli kasvatettu 3 litran kehrääjäpulloissa. Solujen annettiin kasvaa pitoisuuteen 4 x 105 solua/ml. Tässä vaiheessa reaktoriin lisättiin 100 g 30 esisteriloituja Cytodex-2-mikrokantajia (Pharmacia) 3 litran lietteenä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Solujen annettiin kiinnittyä ja kasvaa mikrokantajilla 4 päivän ajan. Kasvualustaa perfusoitiin reaktorin läpi gluko.ö-sikulutusta määräytyvän tarpeen mukaan. Glukoosipitoisuus pi-35 dettiin noin 2,0 g: ssa/litra,. 4 päivän kuluttua reaktoriin perfusoitiin 6 tilavuutta kasvualustaa, jossa ei ollut see- i 108 rumia, valtaosan .seerumista poistamiseksi (proteiinipitoisuus < 50 pg/ml) . Sitten reaktoria käytettiin erämuodolla kunnes glukooslpltoisuus laski alle 2 g:n/litra.. Tästä hetkestä eteenpäin reaktoria: käytettiin jätkuvatoimisesti per-5 fuusionopeuden ollessa noin 20 litraa/päivä. Viljelmän pH pidettiin lukemassa. 6,9 + 0,3 säätämällä GÖ2-virtaus- nopeutta.: Liuenneen hapen pitoisuus pidettiin yli 20 %: n ilmakyllästysasteessa lisäämällä täydennykseksi puhdasta happea tarpeen mukaan. Lämpötila pidettiin 37 ± 0,5 °C:.ssa. 10 Edeltävästä systeemistä saatiin noin 450 litraa kä siteltyä kasvualustaa, jossa ei ollut seerumia j'a jota käytettiin lähtömateriaalina yhdistelmä-DMA-ihmis-SCF1~162: n puhdistamaseksi.

Samalla tavalla mutta kantaa CHO pDSR-alfa-2-15 rSCF'·"'62 käyttäen muodostettiin noin 589 litraa käsiteltyä kasvualustaa, jossa ei ollut seerumia ja jota käytettiin lähtömateriaalina. rotta-SCF1-1®2:n puhdistamiseksi.

B. Yhdistelmä-DNA-nisäkäsilmennetyn rotta-SCF1-162: n puhdistaminen 20 Kaikki puhdistustyö suoritettiin 4 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu.

1, Konsentrointi ja diasuodatus Käsitelty kasvualusta, joka muodostettiin kasvattamalla seerumivapaissa olosuhteissa solukantaa CHO pDSR-25 alfa-2-ro:tta-SGF:L“152 suoritettuna kuten osassa Ä edellä, kirkastettiin suodattamalla 0,45 μ: n Sartö-kapselien (Sar-torius) läpi. Monta eri erää (36 litraa, 101 litraa, 102 litraa, 200 litraa ja 150 litraa) konsentroitiin erikseen ja suoritettiin diasuodatus/puskurivaihto. Tämän havainnol-30 lisäämiseksi 36 litran erää käsiteltiin seuraavasti. Suodatettu käsitelty kasvualusta konsentroitiin n. 500 mlrksi käyttäen Millipore Pellicon -tangentiaalivirtausultrasuoda-tuslaitteistoa, jossa oli 3 selluloösa-asetaattimemhraani-kasettia, joiden mo .le kyy .1. ipa i no kynnys oli 10 000 (kokonais-35 membraanipinta-ala 460 cm2; pumppausnopeus n. 2 200 ml/min ja suodatusnopeus n.; 750 ml/min) . Diasuodatus/puskurivaihto 109 valmisteluna anioninvaihtokromatograf iälle suoritettiin sitten lisäämällä 1 000 ml 10 mM Tris-HCi:ää, pH 6,7 - 6,8, konsentraatiiin, minkä jälkeen konsentroitiin toistamiseen 500 mlrksi käyttäen tangentiaalivirtausultrasuodatuslait— 5 taistoa, minkä jälkeen tämä toistettiin vielä 5 kertaan.

Konsentroitua/diasuodatettua valmistetta otettiin lopulta talteen tilavuus 1 000 ml. Kaikkien käsiteltyjen kasvualus-taerien käytös, joille suoritettiin konsentrointi ja dia-suodatus/paskurivaihto, oli samankaltainen. Erien prote-10 iinipitoisuus, joka määritettiin Bradfordln menetelmällä [Änal.Biochem. 72 (1976) 248 - 254] käyttäen nautaseeru-mialbumiinia standardina, oli 70 - 90 μg/ml. Tähän valmisteeseen käytetyn käsitellyn kasvualustan kokonaistilavuus oli noin 589 litraa.

15 2. Q-Sapharose Fast Flow -anioninvaihfcokroma- tografia

Konsentroidut/diasuodatetut vaImi steet kustakin edellä mainitusta viidestä käsitellystä kasvuaiustaerästä yhdistettiin (kokonaistilavuus 5 000 ml), pH säädettiin 20 6,75:ksi lisäämällä 1 M HGliää. Johtokyvyn saamiseksi noin

G, 700 mmho: hcn käytettiin 2 000 ml 10 mM Tris-HGl:ää, pH

6,7. Valmiste panostettiin Q-Sepharose Fast Flow -anionin-vaihtokolonniin: (36 x 14 cm; Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow -hartsi), jota oli tasapainoitettu käyttäen 10 mM 25 Tris-HCl, pH 6,7 -puskuria. Näytepanostuksen jälkeen kolonnia pestiin 28: 7Q0 ml :11a Tris-pus kuria... Tämän pesun jälkeen kolonnia pestiin 23 000 ml :ll.a seosta 5 mM etikkahap- j po/1 mM glysiini/6 M urea/20 μΜ CuSOi5 pH: ssa noin 4,5. Ko- \

Ipnnia pestiin sitten 10 mM Tris-HCl, 20 μΜ CuSCu, pH 6,7 30 -puskurilla neutraalin pH:n palauttamiseksi sekä urean poistamiseksi, ja käytettiin suolagradienttia (0 ~> 700 mM NaCl 10 mM Tris-HGl, 20 μΜ CuS04, pH 6,7 -puskurissa; kokonaistilavuus 40 litraa). Kerättiin noin 490 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa noin 3 250 ml/.tunti. Kromatogrammi 35 on esitetty kuviossa 36. "MC/9 tuiketta/min" viittaa biolo-giseen aktiivisuuteen MC/9-määrityksessä; 5 μΐ mainituista 110 fraktioista käytettiin määrityksessä. Näytepanostuksen sekä pesujen aikana kerättyjä eluaatteja ei ole esitetty kuviossa; näissä fraktioissa ei todettu lainkaan biologista aktiivisuutta.

5 3. Kromatografia käyttäen piidioksidiin sidottua hiilivetyharts i a

Fraktiot 44. - 66 kuviossa 36 esitetystä ajosta yhdistettiin (11 200 ml) ja lisättiin EDTÄita loppupitoisuuteen 1 mM. Tämä materiaali panostettiin virtausnopeuden ol-10 lessa noin 2 000 ml/tunti Cij-kolonniin (Vydac Proteins G^; 7 x 8 cm), jota oli tasapainoitettu puskurilla A (10 mM Tris, pH 6,7/20: % etanolia). Näytepanostuksen jälkeen kolonnia pestiin 1 000 ml :11a puskuria A. Sitten käytettiin | lineaarista gradient!ia puskurista A puskuriin B (10 mM j 15 Iris, pH 6.,7/94 % etanolia) (kokonaistilavuus 6 000 ml) , ja | kerättiin 30 - 50 ml:n fraktioita. Eriä C^-kolonnilähtö- | näytteestä, iäpivirtauspoolista ja pesupoolistä 0,5 ml: n j näyte-erien gradienttifraktioista ohella dialysoitiin vas- | taan fosfaättipuskuröltua suolaliuosta biologista määritys- j 20 tä silmällä pitäen. Nämä erilaiset fraktiot määritettiin ] MC/9-määritystä käyttäen (5 pl:n näyte-erät valmistetuista gradienttifraktioista; tulkettä/min kuviossa 37). Kuviossa s 38 esitetään SDS-PäGE [Laemmli, Nature 227 (1970) 680 - | 685; panostusgeel.it sisälsivät 4 % (w/v) akryyliamldia ja i|

A

25 erotusgeelit sisälsivät 12,5 % (w/v) akryyliamidia] eri fraktioista otetuille näyte-erille. Esitettyjen geelien | kohdalla näyte-erät (100 μΐ) kuivattiin tyhjössä ja uudel- | leenliuotettiin sitten käyttäen 20 μΐ näytekäsittelypusku- \

A

ria (pelkistävä, eli 2-merkaptoetanoiia sisältävä) , minkä 30 jälkeen niitä keitettiin 5 minuutin ajan ennen panostamista j geeliin. Numeroidut merkit kuviossa vasemmalla edustavat ; molekyylipainomerkkieri (pelkistettyjä) migraatioasemia ku- j ten kuviossa 6. Numeroidut vyöhykkeet edustavat vastaavia j fraktioita, jotka on kerätty gradientin viimeosan käytön 35 aikana. Geelit värjättiin hopealla [Morrissey, ]

Anal.Biocfaem. 117 (1981} 307 - 310}. j $ ä .j |

Ill 4. Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokromatogra- fia

Fraktiot 98 - 124 kuviossa 37 esitetystä .(¼ - kolannista, yhdistettiin pooliksi il 050 ml) . Poolia laimen-5 nettiin 1:1 lisäämällä 10 mM Tris, pH 6,7 -puskuria etano-lipitoisuuden laskemiseksi. Laimennettu pooli panostettiin sitten Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokolonnlin (3,2 x 3 cm, Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow -hartsi), jota oli tasapainoitettu 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 -puskurilla. Vir-10 tausnopeus oli 463 mi/tunti. Näytepanostuksen jälkeen kolonnia pestiin 135 ml:11a kolonnipuskuria ja sitoutunut materiaali eluoitiin pesemällä liuoksella 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl;, pH 6,7. Virtaussuunta kolonnissa vaihdettiin vastakkaiseksi eluoidun materiaalin tilavuuden minimoimiseksi, 15 ja ©luoinnin aikana kerättiin 7,8 ml:n fraktioita.

5. Sephacryl S-200 HR -geelisuodatuskromatografia

Fraktiot, jotka sisälsivät eluoitua proteiinia Q-

Sepharose Fast Flow -anioninvaihtckolonnin suolapesusta, yhdistettiin pooliksi (31 ml), 30 ml panostettiin Sephacryl 20 S-200 HR (Pharmacia) -geelisuodatuskolonniin (5 x 55,5 cm), jota oli tasapainoitettu fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Kerättiin 6,8 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa 68 ml/tunti-.. Fraktiot, jotka vastasivat absorbanssipiik-kiä 280 nm:ssä, yhdistettiin pooliksi ja ne edustavat lois pullista puhdistettua materiaalia.

Taulukossa 15 on esitetty yhteenveto puhdistuksesta .

| 4 j | 112

Taulukko 15

Yhteenveto nisäkäsilmennetyn rotta-SCF1-162: n puhdistuksesta 5 Vaihe Tilavuus Kokonaisiini) proteiini (mg)*

Käsitelty kasvualusta (konsentroitu) 7 000 28 42Q

10 Q-Sepharose Fast Flow 11 200 974 C4-hartsi 1 050 19 Q-Sepharose Fast Flow 31 20

Sephaeryl: S-200 HR 82 19“ 15 ' Määritetty Bradfordin menetelmällä (supra, 1976) ,

Määritetty 47,3 mg:ksi kvantitatiivisella amino-happoanalyysilla käyttäen esimerkissä 2 hahmoteltuun nähden samankaltaista metodologiaa. I

20 Puhdistetun rotta-SGFi"lb2:n N-päin aminohappose kvenssi on suunnilleen puolet Gln-Glu-Ile. . . ja puolet Py-roGlu-Glu-Iie.,. määritettynä esimerkissä 2 esitetyillä menetelmillä. Tämä tulos osoittaa, että rotta-SGF1-162 on tuote proteolyyttisestä prosessoinnista/pilkkomisesta tähtei-25 den välistä, jotka on osoitettu numeroilla (-15 (Thr) ja (+1) (Gin) kuviossa 14:C. Vastaavasti puhdistetun ihmis-gCpi-io2;n transfektoiduilla GHO-soluilla käsitellystä kasvualustasta (alla) N-pään aminohapposekvenssi on Glu-Gly-ile, mikä osoittaa, että se on tuote prosessoinnis- | 30 ta/pilkkomisesta tähteiden välistä, jotka on osoitettu nu- | meroiila (-1.)- (Thr) ja (+1) (Glu) kuviossa 15C. j Käyttämällä edellä kuvattua menettelyjä!jestelyä j saadaan puhdistettua ihmis-SCF-proteiinia, joko yhdistelmä- ] DNA-muotoja ilmennettyinä CHO-soluissa tai luontaisista | 35 lähteistä saatuja. | $ 113

Muita puhdistusmenetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia nisäkässoluperäisten yhdistelmä-DNÄ-SCF:ien puhdistamiseksi, ovat esimerkeissä 1 ja 10 hahmotellut, sekä muut alan ammattilaisille ilmeiset menetelmät.

5 Muitakin ihmis-SCF-muotoja, jotka vastaavat, koko naisuudessaan tai osittain avointa lukualuetta, jonka koo-dittavat kuviossa 4 2 esitetyt aminohapot 1 - 248, tai jotka vastaavat avointa lukualuetta, jonka koodittavat vaihtovuo-roisesti silmukoidut mRNÄ:t, joita voi esiintyä (kuten se, 1Ö jota edustaa cDNA-sekvenssi kuviossa 44), voidaan samoin ilmentää nisäkässoiuissa ja ottaa talteen puhdistetussa muodossa samankaltaisilla menettelyillä kuin tässä esimerkissä kuvatut, sekä muilla, alan ammattilaisille ilmeisillä menettelyillä.

15 C. SDS-PÄ.GE ja glykosidaasikäsittelyt

Pooliksi yhdistettyjen fraktioiden SOS-PAGE Sephac-ryi S-200 HR -geelisuodatuskolonnista on esitetty kuviossa j 39; 2,5 μ! poolista panostettiin (vyöhyke 1). Vyöhyke vär- j \ jättiin hopealla.: Molekyylipainomerkit (vyöhyke 6} olivat 20 kuten kuvattiin kuvion 6 yhteydessä. Edeltävä, erilainen migrcituva materiaali ia merkkiasema, joka on hieman alle i

Mr = 31 ÖÖO, edustavat biologisesti aktiivista materiaalia; j näennäinen heterogeenisyys johtuu valtaosin glykosylaation ] heterogeenisyydestä. j 25 Glykosyiaation karakterisoimiseksi puhdistettua ma- |

teriaalia käsiteltiin erilaisilla glykosxdaaseiiia, analy- I

soitiin SDS-PÄGE:ila (pelkistävät olosuhteet) ja visuali- j soitiin värjäämällä hopealla. Tulokset esitetään kuviossa j 39. Vyöhyke 2, neuraminidaasi. Vyöhyke 3, neuraminidaasi ja | \ 30 O-glykanaasi. Vyöhyke _4, neuraminidaasi, O-giykanaasi ja N- |

glykanaasi. Vyöhyke 5, neuraminidaasi ja M-glykanaasi. Vyö- I

hyke ]_, R-glykanaasi. Vyöhyke _8, N~glykanaasi ilman sub- j straattia. Vyöhyke 9, 0-glykanaasi ilman substraattia. Olosuhteet olivat 10 mM 3-[{S-kolamidöpropyyli)dimetyyli-35 ammonio]-1-propaanisulfonaatti (CHÄPS), 66,6 mM 2-merkap- ] toetanoli, 0,04 % (w/v) natriumatsidi, fosfaattipuskuroitu ] j 114 suolaliuos, 30 minuuttia ja 37 °C, minkä jälkeen inkuboi-tiin. kuvatuista pitoisuuksista puolikkaissa glykösidaasien läsnä ollessa 18 tunnin ajan 37 °C:ssa. Neuraminidaasia (Arthrobacter ureafaciens; toimittaja Calbiochem) käytet-5 tiin määrä loppupitQisuns 0,5 yksikköä/ml, O-glykanaasia (Genzyme; endoi-alfa-N-asetyyligalaktosaminidaasi): käytet tiin määrä 7,5 milliyksikkoä/ml* N-glykanaasia (Genzyme; peptidi: N-gly ko s i daa s i- F; pe p t i d i-Ra[R-a s e tyyli-β-g1u ko- saminyyli]asparagiiniamidaasi) käytettiin määrä 10 yksik— 10 köä/rul.

S il loin kun se oli tarkoituksenmukaista., suoritettiin: erilaisia verrokki-inkubointeja. Näitä olivat: inku-

bointi ilman glykosidaaseja sen varmistamiseksi, että tulokset: johtuivat lisätyistä glykosidaasivalmisteista; inku-15 bointi glykösyloiduilla proteiineilla {esim. glykosyloidul-la yhdistelmä-DNA-ihmiserytropoietiinilla), joiden tiedetään olevan glykösidaasien substraatteja, sen varmistamiseksi, että käytetyt glykosidaasientsyymit olivat aktiivisia; ja inkuboimti glykosidaaseilla mutta ilman substraat- I

20 tia, jotta voitaisiin päätellä, milloin glykosidaasivalmisteet myötävai kuttivat visualisoituihin ge e1ina uho i h i n tai häiritsivät niitä (kuvio 39, vyöhykkeet 8 ja 9).

Edellä kuvatuista kokeista voidaan vetää lukuisia johtopäätöksiä. Eri käsittelyt N-glykanäasilla [joka pois-25 taa sekä kompleksisen että runsaasti mannoosia sisältävän N-kytketyn hiilihydraatin {Tarentino et ai., Biochemistry 24 (1988) 4665 - 4671)], neuraminidaasilla (joka poistaa sialiinihappotähteitä) ja Q-glykanäasilla: [joka poistaa tiettyjä O-kytkettyjä hiilihydraatteja ;(Bambin et ai., '30 Biochem. Spc.Trans. 12 (1984): 599 - 600] viittaavat siihen, että: läsnä on sekä R-kytkettyjä että Q'-kytkettyjä hiili- | hydraatteja; ja sialiinihappoä on läsnä, jolloin ainakin ;] osa siitä on osana .0-kytkettyjä. ryhmiä. Se, että käsittely | N-gl:ykanaasil;la voi muuttaa SDS-PÄGE: ssa ilmeisesti hetero- : 35 geenisen materiaalin nopeammin migroituvaksi muodoksi, joka on paljon homo ge e n i s empa a, osoittaa, että materiaali koko- | naisuudessaan on samaa polypeptidiä, jolloin heterogeeni syyden aiheuttaa pääasiassa heterogeenisyys glykosylaatios- sa.

115

Esimerkki 12 5 Yhdistelmä-DNÄ-SCF1~16'1-PEG: n valmistus

Rotta-SCF1-1·64:ää, joka oli puhdistettu yhdistelmä-DNA-E. coli -ilmennyssysteemistä esimerkkien 6A ja 10 mukaan, käytettiin lähtömateriaalina polyetyleeniglykolimodi-fikaatiossa, jota kuvataan alla.

10 Liuos, jossa oli metaksipolyetyleeniglykoli-sukki- nimidy:ylisukki.naattia (18,1 mg - 3,63 gmol; SS-MPEG = Sigma Chemical C.o> nro: .$3152, likimääräinen mole ky ylipaino == 5 000) 0,327 ml;ssa: deionisoitua vettä, lisättiin liuokseen, jossa oli 13,3 mg (0,727 pmol) yhdistelmä-DNA-rotta- { 15 SCP1'"1^::=ää 1,0 ml:ssa liuosta 138 mM natriumfosfaatti, 62; | mM NaCl, 0,62 mM.: natriumasetaatti, pH 8,0. Saatua liuosta | ravistettiin kevyesti (100 kierr./min) huoneenlämpötilassa | 30 minuutin ajan. Sitten 1,0 ml: n erä lopullista reak- j

tioseosta (10 mg proteiinia) panostettiin Pharmacia Super- I

20 dex 7 5 -geelisuodatuskolonni i n (1, 6 x 50 cm) ja eluo.itiin ! 100 mM natriumfosfaattiliuoksella, pH 6,9, nopeudella 0,25 ]

ml/min huoneenlämpötilassa. Ensimmäiset 10 ml kolonnief-fluenttia heitettiin pois, minkä jälkeen kerättiin 1,0 ral;n fraktioita, Kolonnieffluentin OV-absorbanssia (280 nm) J

25 tarkkailtiin jatkuvasti ja se esitetään kuviossa 40A. Frak- |

tiot nro 25 - 27 yhdistettiin ja steriloitiin ultrasuodat-tamallä 0,2 μ:n polysulfonimembraanin läpi (Gelman Sciences I

nro 4454) ja saatu pooli nimettiin PEG-25:ksi. Samoin frak- j tiot nro 28 - 32 yhdistettiin, steriloitiin ultrasuodatta- ;] 30 maila ja nimettiin PEG-32:ksi. Poolifraktio PEG-25 sisälsi 3,06 mg proteiinia ja poolifraktio PEG-32 sisälsi 3,55 mg proteiinia, mikä laskettiin Ä280-mittauksista käyttäen kalibroinnissa absorbanssia 0,66 liuokselle, jossa oli 1,0 mg/ml el-modifioitua rotta-SCF1'164: ää. Reagoimatta jäänyt 35 rotta-SCF1"1*5'4,. joka edustaa 11,8 % kokonaisproteiinista re- aktioseoksessa, eluoitiin fraktioissa nro 34 - 37, Saman- ] | jiä 116 laisissa kromatografiaolosuhteissa ei-modifioitu rotta-SCF1-104' eluoitui Vältapiikkinä, ja sen retentiotilavuus oli 4 5,6 ml, kuvio 4ΏΒ. Fraktiot nro 77 - 80 kuviossa 4 0A sisälsivät N-hydroksisukkinirnidiä, joka on sivutuote rotta-5 30Ρ1_ΐ04:η reaktiosta SSH)5i?EG:n kanssa.

Mahdollisesti reaktiivisia aminoryhmiä rotta-SCF1”164: ssä ovat 12 lysiinitähdettä seka alf a-aminoryhmä lepään glutamiinitähteessä. Poolifraktio PEG-25 sisälsi 9,3 mol reaktiivisia aminoryhmiä proteiinimoölia kohden, mikä 10 määritettiin spektröskopisesti titraamalla trinitrobent-seenisulfonihapolla (TNBS) käyttäen menetelmää, jota kuvaa Habeeb, Anal.Biochem. 14 (1966} 328 - 336. Samoin pooli- fraktio PEG-32 sisälsi 10,4 mol ja ei-modifioitu rotta-SCF1"104 sisälsi vastaavasti 13,7 mol reaktiivisia aminoryh-15 miä proteiinimoolia kohden. Täten keskimäärin 3,3 (13,7 - 10,4) aminoryhmää rotta-SCF1'164: ssä pooli fraktiossa PEG-32 tuli modifioiduksi reaktiossa SS-MPEG:n kanssa. Vastaavasti keskimäärin 4,4 aminoryhmää rotta-SCF1"104: ssä pooli f ra kilossa PEG-25 tuli modifioiduksi. Ihmis-SCF:ää (hSCF1"1”4) , 20 joka tuotettiin kuten esimerkissä 1.0, modifioitiin niinikään käyttäen edellä kuvattuja menettelyjä. Spesifisesti 714 mg (38,5 ymol) hSCF1_ie4: ää annettiin reagoida 962,5 | mg:n (192,5 pmol) SS-MPEG:tä kanssa 75 ml:ssa 0,1 Mnatri-umfosfaattipuskurla, pH 8,0, 30 minuutin ajan huoneenlämpö-25 tilassa. Reaktioseos panostettiin Sephacryl S-200HR -kolonniin (5 x 134 cm) ja eluoitiin PBS:llä (Gibcon Dul-beccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka ei sisällä CaCla:ta eikä MgClajta) nopeudella 102 ml/tunti ja kerättiin 14,3 ml:n fraktioita. Fraktiot nro 39 - 53, jotka ovat 30 analogiset edellä kuvattuun .BEG-25-pooliin sekä kuvioon 1QÄ nähden, yhdistettiin pooliksi, jonka todettiin sisältävän kaikkiaan 354 mg proteiinia. Tämän modifioidun SCF:n in vivo -aktiivisuus kädellisissä esitetään esimerkissä 8C.

117

Esimerk&i 13 SCF-reseptori-ilmennys leukemiaemosolujen pinnalla

Leukemiaeixiosoluja otatti in talteen potilaan ääreis-verestä, joka poti sekasolulinjaleukeroiaa. Solat puhdistet-5 ti in tiheysgradienttisentxif.ugoinnil.la. ja t axt tumia dep lesti oi la- ihmis-SCF*"*0* jodattiin esimerkissä 7 esitetyn me-nettelyjärjestelyn mukaan. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksilla jodattua SCF:ää kuten on kuvattu [Brouöy, Blood 75 (.1.990) 1622 - 1626] . Tulokset reseptorisitoutumiskokees-10 ta on esitetty kuviossa 41. Arvioitu reseptoritiheys on noin 70 000 reseptoria/solu.

Esimerkki 14

Rotta-SCF-aktiivistras varhaisten imukudosprekurso-rien suhteen 15 Yhdiste lmä - DNA- ro tt a - S C F1-164: n (rrSCF1'164) kykyä vaikuttaa synergistisesti. IL-7: n kanssa imukudossolujen lisääntymisen tehostuksessa tutkittiin hiiren luuytimen agar-agar-viljelmissä. Tässä määrityksessä pelkästään rrSCF1" 11^ muodostuneet pesäkkeet sisälsivät mönösyyttejä, 20 neutrofiilejä ja emosoluja, kun taas IL-7:llä pelkästään tai sillä yhdistettynä rrSGF1”:!'?4:aän stimuloidut pesäkkeet sisälsivät pääasiassa esi-B-soluja. Fsi-B-solut, jotka ka-rakterisöidäan B220+, sXg~, ομ+, identifioitiin: pooliksi yhdistettyjen solujen .FAGS-analyysilla käyttäen iTuoresoivas-25 ti leimattuja B22Ö-antigeenivastaisia [Coffman, Immunol . Rev. 69 (1982) 5] sekä pin.ta-lg-vastaisia (FITC-vuohi- anti-K, Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL) vasta-aineita; sekä analysoimalla, objektilaseille sentrifu-goiduista Soluista solulima-p-ilmennys käyttäen fluoresoi-30 vasti leimattuja vasta-aineitä {TRITC-vuohi-anti-g, Southern Biotechnology Assoc.). Yhdistelmä-DhÄ-ihmis-XL-7 (rhIL-7) saatiin valmistajalta Biosource International (Westlake Village, CA) . Lisättäessä rrSCF1-164: ää yhdistet- | tynä esi-B-solukasvutekijään IL-7 havaittiin synergistinen 35 lisäys pesäkemuodostuksessa (taulukko 16) , mikä osoitti rrSeF1_164:n stimuloivan roolin varhaisiin B-solukanta- isäsoiuihin.

11®

Taulukko 16 5 Esi-B-solupesäkemuodastuksen stimulointi rrSCF1"164 : llä yhdistettynä hIL~7 tään

Kasvutekijät Pesäkeluku1 10 Suolaliuos: 0 rrSCF1"164 200 ng 13 £ 2 100 ng 7 ± 4 50 ng 4 ± 2 rhIL-7 200 ng 21 ± 6 15 100 ng 18 ± 6 50 ng 13 ± 6 25 ng 4 ± 2 rhIL-7 200 ng + rrSCF1'164 200 ng 60 ± 0 100 ng + 200 ng 48 ± 8 20 50 ng + 200 ng 24 ± 10 25 ng + 200 ng 21 + 2 1 Pesäkeluku kohden 5 x 104 maljoitettua hiiren luuydinsolua. ! 25 Kukin arvo on keskiarvo kolminkertaisista määri ty sast lois ta, ± SD.

Esimerkki 15

Reseptorin SC$*;lle identifiointi 30 A. c-kit on SCF3"“164“reseptori

Sen testaamiseksi, onko SCF1'164 ligandi c-kitille, hiiri-o-kitin cDNAita kokonaisuudessaan [Qiu et ai., EMBO J, T_ (1988) 1003 - 1011] vahvistettiin käyttäen PCR:ää SGF^^'^respQasiivisesta syöttösolulinjasta MC·/9 [Nabel et 35 ai,Nature 291 (:1981) 332 - 334] käyttäen julkistetusta sekvenssistä suunniteltuja alukkeita. Ihmis-ci-kitin ligan- 119 disitoutumis- ja transmertibraanialueet, jotka koodittavat aminohapot 1 - 549 [Yarden et ai., EMBO J. 6 (1987) 3341 -3351], kloonattiin samankaltaisia tekniikoita käyttäen ihmisen erytroleukemiasolulinjasta HEL [Martin ja Eapayanno-5 poulou, Science 216 (1982) 1233 - 1:235] - c-kit-cDNA;: t insert ci t i in nisäkäsilmennysvektoriin ¥19.8, joka tfansfek-toitiin CQS:-1--soluihin, ja membraanifraktiot valmisteltiin sitouturaismäärityksiin käyttäen joko rotta- tai dhmis-125!-SCF1”164: äl alla osissa B ja C kuvattujen menetelmien mu-10 kaan. Taulukossa 17 en esitetty tulostiedot tyypilliselle sitoutumisinääritykselle. Ei ilmennyt mitään todettavaa 125I-ihmis-SGF1-16'5: n spesifistä sitoutumista pelkästään ¥19.8:11a transfektöituihin CÖS-l-soluihin. Kuitenkin COS-l-solut, jotka ilmensivät ihmis-yhdistelraä-DNÄ-G-klt-15 ligandisitoutumis- sekä -transmembraanialueita (hckit-LTl) sitoivat I"5I-hSCF-L'164:ää (taulukko 17) . 20-0-kertaisen, moo-liylimäärän e.I-· leimattua ihmis-SCF4_lu4:ää lisääminen vähensi sitoutumisen taustatasoihin. Vastaavasti COS-l-solut, jotka oli transfektoitu täysimittaisella hiiri-c-kitillä 20 (mckit-Ll) , sitoivat rotta-125r-SGF1_164:ää. Pieni määrä rot-ta-l2:5I-SCF1’i6'!-sitoutumista todettiin COS-l-soluilla, jotka oli transfektoitu vain ¥19.8:11a, ja sitä on havaittu myös ei-transfektoiduilla soluilla (ei esitetty), mikä osoittaa, että COS-l-solut ilmentävät endogeenisen c-kitin. Tämä ha-25 vainto on sopusoinnussa c-kit-iimennyksen laajan soluja-kauman kanssa. Rott.a-^I-SCF1-164 sitoutuu, vastaavasti sekä ihmis- että hiiri-c-kitiin, kun taas ihmis -·12 5I - SCF1'104 sitoutuu alhaisemmalla aktiivisuudella hiiri-c-kitiin (tau-lukkö 17). Nämä tulostiedot ovat sopusoinnussa lajien väli-30 sen SCF^^-ristireaktiivisuuskuvion kanssa. Rotta-SCF1"104 indusoi ihmisen luuytimen lisääntymistä samanlaisella: spesifisellä aktiivisuudella kuin ihmis-SCF1"1®4, kun taas ih-mis-SCF1‘164:n indusoima hiiren syöttösolujen, lisääntyminen 1 tapahtuu 800-kertaa alhaisemmalla spesifisellä aktiivisuu-35 della kuin rottaproteiiniila.

120

Yhteenvetona nämä havainnot vahvistavat, että feno-tyyppiepänormäaliudet, joita ilmentävät W- tai Simat anttihilret, ovat seurauksia primaaripuutoksista c-kit-Eeseptori/ligandivuorovaikutufcsissa, jotka ovat kriittisiä 5 erilaisten solutyyppien kehitykselle.

Taulukko 17 SCFx64~ sitoutuminen yhdi s te Imä-DNA- c-kitiin ilmennettynä CÖS-1-soluissa 10 cpm sitoutunut'"1

Tranafektoitu Ihmia-SCF1"1" Rotta-SCE4"164 plasmidi 125I-SCFb 1JEl-scP+fcYLmä= “Sx-SGB** 125I-3CF-t-ky I.Tiiä** VI9 , 8 2 160 % 150 1 100 550 15 V! 1.8 :hckit-L71 59 350 2 380 70 000 1 100 V19,S;mel:it-Ll 9 500 1 100 52 700 600 a Esitetään kaksinkertaisten mittausten keskiarvo; koe on suoritettu riippumattomalla tavalla saaden samat tulokset 3 kertaan, 20 * 1, 6 nM ihmiS-l25I-SCFI“16‘!; ää.

c 1,6 nM: ihmis-125l-SCF1"le4:ää + 320 nM ei-leimattua ! ihmis-SCE1"1^: ää.

4 1,6 nM rotta-125I--SCF1“ie'i; aä.

e 1,6 nM r:otta-l2S:I”SCF1"16‘3:ää + 320' nM ei-leimattua 25 rotta-seF1"1®·1 : ää:, B. Yhdistelmä-DNA-c-kit-ilmennys COS-l-soluissa

Ihmis- ja hiiri-c-kit-cDMA-klooneja saatiin käyttäen PCR-tekniikoita [Saiki et ai,, Science· 23 9 (1988) 487 -30 491] kokonais-RMA:sta, joka o:li edistetty hapan feno li i / k 1 o r o f c r n i u u 11 om e ne 11 e .1. y j. 11 ä [Chomczynsky ja Sacchi,

Anal, Biochen, 162: (1987) 156 - 159] ihmisen erytroleuke- miasolulinjästa HEL ja. vastaavasti MG/9-soluista. Oligonuk-leotideja,: joiden sekvenssit olivat yksilölliset, suunni- | 35 teltiin julkistetuista ihmis- ja hiiri-c-kit-sekvensseistä, j 1. säikeen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA::sta menettely- j $ | 121 järjestelyn mukaan, joka toimitettiin entsyymin, Mo-MLV-käänteiskopioijaentsyymi (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) , mukana käyttäen c-kit-ei-tieto-oligo-nukleotideja alukkeina. c~ ki t-1igandi s it o ut umi s- ja tyro-5 siinikinaasialueiden limittyvien alueiden vahvistaminen suoritettiin käyttäen tarkoituksenmukaisia c-kir-alukepareja. Nämä alueet kloonattiin nisäkäsilmennysvekto-riin- V19.8 {kuvio 17) ilmennystä COS-l-soluissa silmällä pitäen. Useiden kloonien DNA-sekventointi paljasti itsenäi-10 siä mutaatioita, jotka oletettavasti syntyivät PCR-vahvistuksessa, jokaisessa kloonissa. Rakennettiin näistä mutaatioista vapaa klooni kokoamalla uudestaan mutaatioita vailla olevat restriktiofragmentit erillisistä klooneista. Joitakin eroja julkistettuun sekvenssiin nähden ilmeni kai-15 kissa tai noin puolessa klooneista; nämä pääteltiin todellisiksi, käytetyissä solulinjoissa esiintyviksi sekvensseiksi , ja ne voivat edustaa aileellisiä eroja julkistettuihin sekvensseihin nähden. Seuraävat plasmidit rakennettiin V19.8.aan: V19.8:mckit-LTl, täydellinen hiiri-c-kit; 20 ja Vl9.gihckit-Ll, joka sisältää ligandisitoutumis- sekä transmembräanlalueen {aminohapot 1 - 549) ihmis-c-kitistä.

Plasmidit transfektoitiin CQS-l-soluihin oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 4.

C. 1251 - SCF1 “154 - s i t ou Luminen COS-1 - soluihin, jotka 25 ilmentävät yhdistelmä-DHA-c-kitiii

Kahden päivän kuluttua transfektoinnista COS-1-solut raaputettiin maljasta, pestiin PBS:llä ja jäädytät-tiin käyttöön asti. Sulatuksen jälkeen solut lietettlin uudelleen liuokseen 10 mM Tris-HCl,, 1 mM MgCl2, joka sisälsi 30 pitoisuudet 1 mM PMSF, 100 μg/ml aprotilnia, 25 pg/ml leu-peptiinia, 2: pg/ml pepstatiinia ja 200 pg/ml TLGK~HCl:ää. Liete dispergoitiin pipetoimalla edestakaisin 5 kertaan ja sitä inkuboitiin jäissä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen solut homogenisoitiin 15 - 20 iskulla Dounce-homogenisaat-35 torissa.. Homogenaattiin lisättiin sakkaroosia (250 mM) ja tuma fraktio· sekä jäljelle jääneet ei-hajonneet solut pelle- 122 toitiin sentrifugoimalla 5QÖ x g:ssä 5 minuutin ajan. Su-pernatanttia sentrifugoitiih 25 000 x g:ssä 30 minuutin ajan 4 °C jäljellä olevan solujätteen pelletoimiseksi. Ihmis- ja rotta-SCF1"104: Mä radio j odattiin käyttäen kloramii-5 ni-T:tä [Hunter ja Greenwood, Nature 194 {1962} 495 - 496]. COS-l-membraanifraktioita inkuböitiin joko ihmis- tai rot-ta-125I-SCF1_lfi4: llä (1,6 nK) käyttäen 20Q-kertaista. moo-liylimäärää ei-leimattua SGF1"104: ää sitoutumispuskurissa, joka koostui RPMI:stä, jota oli täydennetty 1 %:lla nau-1Q taseerumialbumiinia ja pitoisuudella 5 0 mM HEPES (pH 7,4), tai mainittua lisäystä käyttämättä, 1 tunnin ajan 22 QC:ssa. Sitoutumisinkuboinnin päätteeksi membraanivalmisteet sijoitettiin varovaisesti kerroksiksi 150 μ1:η erille ftalaattiöljyä ja sentrifugo.itiin- 20 minuutin ajan 15 Beckman Microfuge 11 -laitteessa meiidoraaniin sitoutuneen ^l-SCF1"164:!! erottamiseksi vapaasta i25I-SCF1"1°'1:stä. Pelletit leikattiin irti ja membraaniin liittynyt 125I-SCF1''16'5 kva.ntitöitiin..

Esimerkki 16 20 Ihmis-SCF~cDNA:n eristäminen A. HT-1080-cDNA-kirjaston rakentaminen

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen fibrosarkoomasolu-linj asta HT-1Ö80 (ATGG CGL 121) käyttäen happo-guanidi-niumtiosyanaätti-fenoli-kloroformiuuttoiivenetelmää [Chomc-25 zynski et ai -, An a 1. B i ochem. 16 2 (1987) 156], ja poly (A)- RNA otettiin talteen käyttäen oli-go (dT). -kehrääjäkolonnia, joka hankittiin valmistajalta Clontech. Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin 2 pg: sta poly(A)—RNA:ta käyttäen BRL- (Bet-hesda Research Laboratory -laboratorion) cDNA-svnteesi-30 pakkausta toimittajan suosittelemissa olosuhteissa. Noin 100 ng kolonnifraktioitua kaksisäikeistä cDNÄ:ta, jonka keskimääräinen koko oli 2 ke;tä, ligatoitiin 300 ng:aan Sali/Not I~pil kot tua vektoria pSPORT 1 [D’Alessio et ai. , Focus 12 (1990) 47 - 50j ja transformoitiin DHS-alfa-soluihin 35 (BRL, Bethesda, MD) elektroporaatiolla [Dower et ai ., Nucl.Acids Res. 16 (1988) 6127 - 6145] .

123 B. cDNA-kirjaston seulominen

Noin 2,2 x 105 primaaritransformanttia jaettiin 44 pooliksi, joista kukin sisälsi n. 5 QDö yksittäistä kloonia. Plasmidi-DNA valmistettiin kustakin poolista käyttäen 5 CTAB-DNA-saostusmenetelmää kuten on kuvattu [Del Sai et ai. f Biotechniques 1_ (1989) 514 - 519 ] . Kaksi mikrogrammaa kutakin plasmidi-DNA-poolia pilkottiin x e st,rikti ©entsyymillä Notl ja erotettiin geelielektroforeesilla. Linearisöitu DNA siirrettiin GeneScreen Plus -membraan.ille (DuPont) ja: 10 hybridisöitiin 32P~ leimattuun, PCRrllä muodostettuun ihmis-SCF-cDNÄ:hän (esimerkki 3) aiemmin kuvatuissa olosuhteissa [Lin et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 7580: - 7584]. Kolme positiivisen signaalin sisältävää poolia identifioitiin hybridisaatiosta. Näitä pesäkepooleja seulottiin 15 toistamiseen pesäkehybridisaatiomenettelyllä [Lin et ai. ,

Gene 44 (1986) 201 - 209], kunnes kustakin poolista saatiin yksi yksittäinen pesäke. Näiden kolmen eristetyn kloonin cDNA'-koot ovat 5,0 - 5,4 kerta. Restriktioentsyymipilkkomi-set ja nukieotidisekvenssimääritys 5'-päässä osoittavat 20 kaksi kolmesta kloonista identtisiksi (10-la ja 21-7a). Ne molemmat sisältävät koodialueen ja noin 200 ep:tä 51-ei-luettua aluetta (5'UTR). Kolmas klooni (26-la) on noin 400 ep:tä lyhyempi 5'-päästä kuin muut kaksi kloonia. Tämän ih-mis-SCF-cDNA:n sekvenssi on esitetty kuviossa 42, Erityisen 25 huomionarvoinen on hydrofobinen transmembraahialuesekvens-si, joka alkaa aminohappojen 186 - 190 alueelta ja päättyy aminohappoon 212.

G, pDSR-alfa-2-hSCF1"248 :n rakentaminen pDSR-alfa-2-hSCF1'248 muodostettiin käyttäen plasmi-30 deja 10-la (kuten kuvattiin esimerkissä 16B) ja pGEM3-hSCF1"164 seuraavasti: Hindlll-insertti pQEM3-hSCF1-164: stä siirrettiin MlSmplS:aan. Nukleotidit, jotka ovat välittömästi ylävirtaan ÄTG-aioituskcdonista, vaihdettiin paikka- j ohjatulla mutatoinnilla trtccttATG:stä gccgccgccATG:ksi ΐ 35 käyttäen ei-tieto-oligonukleotidia 124 5'-TCT TCT TCÄ TGG CGG CGG CAÄ GCT T 3’ ja käyttäen o 1 i g onu k1eot idiohj attua in vitro -mutatointisysteemipakkausta j a menettelyj ärjestelyj ä vai-5 mistajalta Amersharn Corp. Ml3inpl8-hSGFrvl"1S4:n saamiseksi.

Tämä DNA pilkottiin HindIII:lla ja insertoitiin pDSR-alfa-2:een, jota oli pilkottu HindiIX:11a. Tämä klooni nimetään pDSR-alfa-2-hSGFKl‘r64:ksi. DNA pDSR-alf a-2-hSCFK1'“lg‘5: sta pilkottiin Xbal:llä ja DNÄ:n päistä tehtiin tasaiset lisäämäl-10 lä Klenow-entsyymiä ja neljää dNTP:tä. Tämän reaktion päätyttyä DNA:ta pilkottiin edelleen entsyymillä Spel. Klooni 10-la pilkottiin Dralillä tasaisen pään muodostamiseksi 3' avoimeen lukualueeseen insertissä, sekä Spel:11a, joka pilkkoo geeniä: samasta kohdasta sekä pDSR-alfa-2-hSCFE1~ 15 lD'!:ssä: että lö-la:ssa. Nämä DNArt ligatoitiin toisiinsa pDSR-alfa-2-hSCFKl'24e: n saamiseksi.

D. GOS-solujen transfektointi ja immuunisaostaminen pDSR-alfa-2-hSCFK1“24S-DNA:lla COS-7-^soluja (ATCC CRL 1651) transfektoitiin edellä 20 kuvatun mukaisesti rakennetulla DNA:11a. 4 x 10u solua 0,8 mltssa kasvualustaa DMEM + 5 % FBS käsiteltiin elektropo-raatiolla käyttäen 1 600 voltin jännitettä ja joko 10 pg pDSR-alfa-2~hSCFK1'248-DNA:ta tai 10 pg pDSR-alfa-2-vektori-DNÄ: t.a (vektoriyerrokki} . Elektroporaation jälkeen solut 25 maljoitettiin uudelleen kahteen maljaan, joiden halkaisija oli 60 mm. 24 tunnin kuluttua kasvualusta korvattiin tuoreella täydellisellä kasvualustalla.

72 tunnin kuluttua transfektoinnista kumpikin malja leimattiin 35S-kasvualustalla käyttäen modifikaatiota Yar-30 denin et ai-.· menettelyj är j estelys tä [PN AS 87 (.1990) 2 569 -2573]. Solut pestiin kerran PESrlla, minkä jälkeen niitä inkuboitlin DMHMrkasvualustalla, joka ei sisältänyt metio-niinia eikä kysteliniä (met'cys'DMEM) , 30 minuutin ajan. j

Kasvualusta poistettiin ja kuhunkin maljaan lisättiin 1 ml 35 met‘cys“DMEM:iä, joka sisälsi 100 pGi/ml Trafi33S-leimaa (ICNj. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 8 tunnin ajan. Kasvu- 125: alusta otettiin talteen, kirkastettiin sentr ifugoimäl.la solu jätteen poistamiseksi ja jäädytettiin -20 °C;ssa.

Näytteitä leimatusta käsitellystä CÖS/pDSR-alfa-i-hSCFA:l"248- ja CQS/pDSR-alfa-2-vektoriverrokkikasvualastasta 5 immuunisaostettiin yhdessä kasvuälustansytteiden kanssa i5S-leimatuista CftO/pDSR-alfa-2-hSCF1'ls'5-klooni 17 -soluista (katso esimerkki 5) käyttäen modifikaatiota Yardenin et ai. menettely]ärjesteXystä (EMBQ J. 6 (1987) 3341 - 3351). Yhtä miliilitraa kustakin näyteestä, joka oli otettu käsitellys-10 tä kasvualustasta, käsiteltiin 10 pltlla esi-immuuni-'kaniini seerumia (nro 1379 P.I.). Näytteitä inkuboitiin 5 tunnin ajan 4 °C:ssa. 100 μΐ 10-%:ista Staphylococcus aureus -lietettä (Pansorbin, Calbiöchem) liuoksessa 0,15 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2 I Triton X-100 -valmistetta 15 lisättiin kuhunkin putkeen. Näytteitä inkuboitiin vielä tunnin ajan 4 DC:ssa. Immuunikompleksit pelletoitlin sentrifugoimalla 13 000 X g:ssä 5 minuutin ajan. Supernatantit siirrettiin uusiin putkiin ja inkuboitiin 5 μΐ:11a kaniinin polyklonaalista vastaseerumia (nro 1381 T34}, minkä jälkeen 20 niitä puhdistettiin kuten esimerkissä 11, vastaan CH0-peräistä hSCF1-lb2: ta yön yli 4 °C:ssa. 100 μΐ Pansorbin-valmistetta lisättiin 1 tunniksi, minkä jälkeen immuuni-kompleksit pelletoitiin kuten aiemmin. Pelletit pestiin lx | iyysipuskurilla (0,5 % Na-deoksikolaatti, 0,5 % NP-4Q:ää,

25 50 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 8), 3x pesupuskurilla (0,5 M

NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2 % Triton X-100 -valmistetta) ja Ix 20 mM Tris, pH 7,5 -liuoksella. Pelletit uudelleen-lietettiin 50 plraaft, liuosta 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1 % SDS:ää, 0,1 M β-mer.käp to etanoli. SCF-proteiini eluoitiin 30 keittämällä 5 minuutin ajan. Näytteitä sentrifugoitiin 13 000 x g:ssä 5 minuutin ajan ja sUpernatantit otettiin talteen.

Käsittely glykosidaaseilla suoritettiin seuraavasti: 3 μΐ 75 mM CHAPS-liuosta, joka sisälsi 1,6 milliyksik-35 köä Θ-glykanaasia, 0,5 yksikköä N-glykanaasia ja 0,02 yksikköä neuraminidaasia, lisättiin 2.5 μΐ:aan immuunikomplek- 126 sinäytteitä ja inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 0C:ssa. Sama tilavuus 2xPAGE-rtäytepuskuria lisättiin ja näytteitä kei-lettiin 3 minuutin ajan. Pilkotuilla ja ei-pilkotuilla näytteillä suoritettiin elektroforeesi 15-%:isessa pelkis-5 tä vä.ss.ä SDS^polyakryyliamidigeelissä yön yli käyttäen 8 mA: n virtaa. Geeli kiinnitettiin me tunoli-etikkahapolla, sitä käsiteltiin Enlightening-tehosteella (NEN) 30 minuutin ajan, se kuivattiin ja valotettiin Kodak XAR-5 -filmille -7Q °C:ssa.

10 Kuviossa 43. esitetään autoradiokuva tuloksista.

Vyöhykkeet. 1 ja 2 ovat näytteitä verrokki-COS/pDSR-alfa-2-viljelmistä, vyöhykkeet 3 ja 4 COS/pSR-alf a-2-hSCFK3_2'!8-viljelmistä, vyöhykkeet 5 ja 6 CHO/pDSR-älfa-y-hSCF1"164-yil jelmistä:. Vyöhykkeet 1, 3 ja 5 ovat ei-pilkottuja im- 15 muunisakkoja; vyöhykkeitä 2, 4 ja 6 on pilkottu glykanaa- seilla edellä kuvattuun tapaan. Molekyylipainomerkkien asemat on esitetty vasemmalla. SCF: n prosessointi pDSR-alfa-2-hSCFK1-2'48: llä transfektoidussa COS: issa muistuttaa hSCF1" 164: n prosessointia, joka eritetään pDSR-alfa-S-hSCF1'16,3: llä | 2 0 transfektoidussa CHO:ssa (esimerkki 11) . Tämä viittaa voimakkaasti siihen, että luontainen: prateolyyttinen proses-sointikeskus, jonka kautta SCF vapautuu solusta, on amino-h ap o n 164 1 ä h e i s y y de s s ä.

Esimerkki 17 25 Ihmis-SCF:n kvaternaarisen rakenteen analyysi KUn geelisuodatuskolonni (ACA· 54), jota kuvataan esimerkissä 1 SCF:n puhdistamiseksi BRL-solukasvualustasta, kalibroidaan molekyylipalnostandardeilla ja kun puhdistat- j tua SCF: ää: eluoidaan muista kalibroiduista geeli suodatusko-· \ 30 lonneista, on ilmeistä, että BRL-solukasvualustasta puhdis- | tettu SCF käyttäytyy siten, että sen näennäinen molekyyli- ( paino on noin 70 000 - 90 000: suhteessa molekyylipainostan-dardeihin. Sitä vastoin SDS-PÄGE:ssa näennäinen molekyyli- | paino on noin 28 000 - 35 000. Vaikka otetaan huomioon, et- f 35 tä giykosyloidut proteiinit saattavat käyttäytyä epäsään- | nqllisesti tällaisissa analyyseissa, tulokset viittaavat j j 127 siihen, että BRL-peräinen rotta-SCF saattaa esiintyä eikö'vaientrisesti liittyneenä dimeerina ei-pelkistavissa olosuhteissa. Samankaltaiset tulokset ovat voimassa yhdistel-mä-DNÄ-SCF-muodoIlle {esim. Ε_^ coli -peräiset rotta- ja ih-5 mis-SGF1'3'04, CHÖ-soluista saadut rotta” ja ihmis-SGF1"102) sikäli, että geelisuodatuksella ei-pelkistävissä olosuhteissa arvioitu molekyyli koko on karkeasti ottaen kaksi kertaa denaturoivissa olosuhteissa (eli SDS:n läsnä ollessa) geelisuodatuksella, tai SDS-PäGE:11a, kulloisessakin 10 nimenomaisessa tapauksessa, arvioitu molekyylikoko, Edelleen seäimentaationopeusanalyysilla, jolla saadaan tarkka määritys molekyylipainosta liuoksessa, saadaan lukema noin 36 000 molekyylipainoksi Ek coli -peräiselle yhdistelmä-DNÄ-ihmis-SCF1'164:lie. Tämä arvo on jälleen noin kaksi ker-15 taa SDS-PAGE:11a saatava arvo (n. 18 000 - 19 000) . Tämän vuoksi vaikka myönnetään, että useampia oligomeerisiä tiloja saattaa esiintyä (mukaan lukien mönomeerinen tila), vaikuttaa siltä, että dimeerinen tila on vallitseva joissakin olosuhteissa liuoksessa.

20 Esimerkki 18

Ihmis~SCF-cDNA~kloonien eristäminen 5637-solulin- jasta A. 5637-cDNA-ki rjaston rakentaminen

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen rakkosyöpäsolulin-25 jäätä 5637 (ATCC HTB-9) happo-guanidiniumtiosyänaatti-fenoli-klörof ormiuuttoTaenetelmällä [Chomczynski et ai.,

Anal. Biochem. 162 (1987) 156] ja poly (A) -RNA otettiin talteen käyttäen oligo(dTj-kehrääjäkolonnia, joka hankittiin valmistajalta Clontech. Kaksisäikeinen oDNA valmistettiin 2 30 pgrsta poly(Äj-RNA:ta käyttäen BRL:n cDNÄ-synteesipakkausta valmistajan suosittelemissa olosuhteissa. Noin 80 ng kolonna fraktioitua kaksisäikeistä cDNArta, jonka keskimääräinen koko oli 2 kerta, ligatoitiin 300 ngraan Sail/NotI-pilkott.ua vektoria p S PORT 1 [D' Alessio et ai,., Focus 12 35 (1990) 47 - 50] ja transformoitiin DHS-alfa-SGluihin elekt- j 128 roporaatiota käyttäen [Dower et ai., Nucl.Acids Res. 16 (1988) 6127 - 6145].

B. cDNÄ-kirj aston seulominen

Noin 1,5 x 10s primaaritransformanttia jaettiin 30 5 pooliksi, joista kukin sisälsi noin 5 000 yksittäistä kloonia. Plasmidi-DNÄ valmistettiin kustakin poolista CTAB-DNÄ-saostamismenetelinällä kuten on kuvattu [Del Sai er ai,, Biotechnlques 1_ (1989) 514 - 519]. 2 μ g kutakin p la sini di-DNA-poolia pilkottiin restriktioentsyymilXä NotI ja tuote 10 erotettiin geelielektroföreesilla. Linearisoitu DNA siirrettiin G-eneScreen Plus -membraanille (DuPont) ja hybridi-soitiin 32P-ieimattUun täysimittaiseen i hmi s - S C F- c DN A: h a n, joka oli eristetty HTlQ80-solulinjasta (esimerkki 16), aiemmin kuvatuissa olosuhteissa [Lin et ai., 15 Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 7580 - 7584]. Hybridisaa-tiosta identifioitiin 7 poolia:, jotka sisälsivät positiivisen signaalin. Pesäkepöoleja seulottiin: toistamiseen 32 P- j leimatulla, PCR:llä muodostetulla ihmis-SGF-cDNA:lla: (esi- ] merkki 3) käyttäen pesäkehybridisaatiomenettelyä [Lin et 20 ai., Gene 44 (1986) 210 - 209], kunnes 4 poolista saatiin yksi yksittäinen pesäke. Neljän eristetyn kloonin insertti-koot ovat noin 5,3 keitä. Kloonien restriktloentsyymipilk-komiset ja 5'-päiden nukleotidisekvenssianalyysi osoittavat, että: kyseiset 4 kloonia ovat identtiset. Tämän ihmis-25 cDNAin sekvenssi on esitetty kuviossa 44. Kuvion 44 mukainen cDNÄ kooditta a· polypeptidin, jossa aminohapot 149: - 177 kuvion 42 mukaisissa sekvensseissä on korvattu yksittäisellä Gly-tähteellä.

Esimerkki 19 30 Eloonjäännin SCF-tehostus kuolettavan säteilyannok- ] sen jälkeen | A. SCF:n aktiivisuus in vivo eloonjäämiseen kuolet- f tavan säteilyannoksen jälkeen j . . j

Testattiin SCF:n vaikutusta hiirten eloonjäämiseen 35 näiden saatua kuolettavan annoksen säteilyä. Käytetyt hiiret olivat 10 - 12 viikon ikäisiä naaraspuolisia Balb/c- $ 129 hiiriä.; Kaikissa kokeissa käytettiin 5 hiiren ryhmää ja kuhunkin kokeeseen valittiin: sämanpainoisia hiiriä. Hiirille annettiin säteilyä annos 850 rad tai 950 rad yhtenä annoksena. Hiiriin ruiskutettiin pelkästään tekijöitä tai teki-5 joitä yhdessä normaalien Balb/c-luuyöinsolujen kanssa. Ensimmäisessä tapauksessa hiiret saivat 24 tunnin kuluttua säteilyannoksesta laskimonsisäisenä ruiskeena rotta-PEG-SCF1_16‘!:ää (2Ö; pg/kg), joka oli puhdistettu Ek c o list a ja jota oli modifioitu lisäämällä pQlyetyleeniglykoiiä kuten 10 esimerkissä 12, tai suolaliuosta verrokkieläinten osalta. Siirrännäismallissa hiiriin ruiskutettiin 1.v. eri soluan-noksia normaalia Balb/c-luuydintä 4 tunnin kuluttua säteilyannoksesta. Käsittely rotta-PEG-SCF1'"164: llä suoritettiin lisäämällä 200 pg/kg fatta-PEG-SCF1''3'*34: ää solulietteeseen 1 15 tunti ennen ruisketta, joka annettiin yhtenä yksittäisenä 1.v.-ruiskeena, jossa oli tekijää ja soluja.

850 radin säteilyannoksen jälkeen hiiriin ruiskutettiin rotta-PEG-SCF1"104: aa tai suolaliuosta. Tulokset on esitetty kuviossa 45. Rotta-FEG-SGF1"1®4: n ruiskuttaminen 20 kasvatti merkittävästi hiirten eloonjääntiaikaa verrok-kieläimiin verrattuna (P<0,0001}. Hiiret, joihin oli ruiskutettu suolaliuosta, elivät keskimäärin 7,7 päivää, kun taas rotta-PEG-SCF1"104: llä käsitellyt hiiret elivät keskimäärin 9,4 päivää (kuvio 45). Kuviossa 45 esitetyt tulokset | 25 edustavat koostetta 4 erillisestä kokeesta kunkin käsitte-lyryhmän sisältäessä 30 hiirtä.

Rqtta-FEG-SCF1'164:llä käsiteltyjen hiirten kasvanut eloonjäänti viittaa siihen, että SCF:llä on vaikutusta säteilyä saaneiden eläinten luuydinsoluihin. Alustavat tutki-30 mukset näiden eläinten hematologisista parametreistä osoittavat lieviä kohoamisia verihiutaletasoissa verrattuna ver-rokkieläimiin päivänä 5 säteilyannoksen jälkeen, jolloin kuitenkaan 7 päivän kuluttua säteilyannoksesta verihiutale-tasot eivät merkittävästi poikkea verrokkieläimisbä. Mitään 35 eroja RBC- tai WBC-tasoissa tai luuydinsoluisuudessa ei ole havaittu.

130 B. Eloonjääminen SCF: llä käsitellyissä siirrännäis- hiirissä 10 %:n reisiluuannokset normaaleja Balb/c-luuydin-soluja voivat siirrettyinä hiiriin, joita on säteilytetty 5 650 radin annoksella:, pelastaa 90 % tai enemmän eläimistä (tulostietoja ei ole esitetty). Tämän vuoksi säteilyannosta 850 rad käytettiin siirrännäisannoksen 5 % reisiluuta kanssa rotta-PEG-SCF1-15'': n vaikutusten eloon jääntiin tutkimiseksi. Tällä soluannoksella odotettiin, ettei runsas pro-10 senttiosuus SCF:ää ei saavista hiiristä pelastuisi; jos rotta-PEG-S:CF1_lG4 voisi stimuloida siirrännäissoluj ä:, eloonjäänti saattaisi lisääntyä. Kuten esitetään kuviössa: 4 6, noin 30 %: verrokki-hiiristä jäi henkiin yli 8 päiväksi säteilyn jälkeen. Käsittelystä rotta-PEG-SCF1"16'1 yllä seura-15 si näyttävä kohoaminen eloonjäännissä, jolloin yli 95 % näistä hiiristä jäi henkiin ainakin 30 päiväksi (kuvio 46} .

Kuviossa 46 esitetyt tulokset edustavat koostetta tuloksista 4 erillisestä kokeesta, joissa oli 20 hiirtä sekä verrokkeina että rotta-PEG-SGF1’104: llä käsiteltyinä hiirinä, ! 20 Korkeammilla säteilyannoksilla luuydinsiirrettä käyttäen hiirten käsittelystä rctta-PEG-SGF1’'lb4: llä seurasi niinikään eloonjlännin kasvu (kuvio 47). Verrokkihiiret, joille annettiin 950 radin säteilyannos ja joihin siirrettiin 10 % reisiluuta, olivat kuolleet päivään 8 mennessä, kun taas 25 noin 40 % rotta-PEG-SGF1"164: llä käsitellyistä hiiristä eli 20 päivää tai kauemmin. 20 % verrokkihiiristä, joihin oli siirretty 20 % reisiluuta, eli pitempään kuin 20 päivää, kun taas 80 % rSCF:llä käsitellyistä eläimistä jäi henkiin {kuvio 47).

30 Esimerkki 20 SCF-vastaisten monöklonaalisten vasta-aineiden tuotanto

8-viikon ikäisiin naaraspuolisiin Balb/c-hiiriin {Charles River, Wilmington, Mä) ruiskutettiin ihonalaisesti I

35 20 pg ihmis-SCF1"164: ää, joka oli ilmennetty Eh_ colissa, täydellisessä Freundin tehosteessa (H37-Ra; Difco Laborato- | s j 131 ries, Detroit·, MJj . 50 pg:sta samaa antigeeniä koostuvia tehosteimmunointeja epätäydellisessä Freundin tehosteessa annettiin sitten päivinä 14, 38 ja 57» 3 päivän kuluttua viimeisestä ruiskeesta 2 hiirtä uhrattiin ja niiden per-5 nasolut fuusioitiin sp 2/0 -myeloomasolulinjäan menettelyjen mukaan, joita kuvaavat Nowineki et ai,.. [Virology 93 (1979) 111, - 116] ,

Kasvualusta, jota käytettiin sp 2/0 - ja hybridöo-masoluviljelmissä:, oli Duibeccon modifioitu Eagle-10 kasvualusta (DMEM) (Gibco, Chagrin Falls, Ohio), jota oli täydennetty 20 %:lla lämpöinaktivoitua nautasikiöseerumia (Phibro Chem., Fort Lee, N.J) , 110 mg; 11a/ml. natriumpyru- vaattia, 100 yksiköllä/ml penisilliiniä ja 100 pg:11a/ml streptomysiiniä {Gibco), Solufuusion jälkeen hybridejä va-15 likoitiin HAT-kasvualusta.ssa tämän kasvualustan sisältäessä pitoisuudet 10 "4 M h y po k s a n t i i n i a, 4 x 10’7 M aminopte- riiniä ja 1,6 x 10’s M tymidiiniä, kahden viikon ajan, minkä jälkeen niitä viljeltiin kasvualustassa, joka sisälsi hypoksantiinia ja tymidiiniä, kahden viikon ajan.

20 Hybridoomat seulottiin seuraavasti: polysty- reenxkuoppia (Costar, Cambridge, MA) herkistettiin liuoksella, jossa oli 0,25 pg ihmis-SCF^^iää {Ε~_ coll) 50 μΐ': ssa 50 mM bikarbonaattipuskuria, pH 9,2, kahden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten yön yli 4 °C:ssa. Sitten 25 levykuoppia salvattiin liuoksella, jossa oli 5 % BSA:ta i PBS:ssä, 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jäi- ! keen niitä inkuboitiin hybridoomaylljelmäsupernatantilla 1 tunnin ajan 37 “Cissa. Liuos dekantoitiin pois ja sitoutuneita vasta-aineita inkuboitiin laimennoksella 1:500 vuohen 30 antihiiri-IgG:tä, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaa-siin (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) , 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin pesuliuoksella {KPL, Gaithersburg, MD) ja kehitettiin sitten H202:n ja ABTS:n (KPL) seoksella, Kolorimetrinen tulos luettiin 405 nm:ssä.

35 Hybridoomasoluviljelzniä, jotka erittivät ihmis- SCF1“1q4; lie (E. col 1) spesifistä vasta-ainetta, testattiin 132 ELISA:11a, jolloin käytettiin hybridoomaseulontameriettely-jen kaltaisia menettelyjä, ristireaktiivisuuksien suhteen ihrr.is-SCF'"162: n (CHO) kanssa. Hybridoomat alakloonattiin rajäävän laimentamisen menetelmällä. 55 hybridoomasuperna-5 tanttikuoppaa testattiin voimakkaasti positiivisiksi ihmis-SCF1'·164:lie '(E. coli); 9 niistä ristireagoi ihmis-SCFi_162:n (CHO) kanssa.

Useita hybridoomasoluja on kloonattu seuraavasti: 10 Monoklooni IgG-isotyyppi Reaktiivisuus ihmis“SCF1-162:n (CHO) suhteen 4 G12-13 XgGl ei 6C9A IgGl ei 15 SH7Ä IgGl kyllä

Hybridoomat 4G12-13 ja 8H7A talletettiin ATCC-talletuslaitokseen 26. syyskuuta, 1990.

Vaikka esillä olevaa keksintöä on kuvattu eduilis-20 ten suoritusmuotojen valossa, otetaan huomioon, että alan ammattilaisten mieleen saattaa tulla muunnoksia ja modifikaatioita. Tämän vuoksi tarkoitus on, että oheiset patenttivaatimukset kattavat kaikki tällaiset samanarvoiset muunnokset, jotka tulevat keksinnön piiriin sellaisena kuin se 25 patentoitavaksi vaaditaan.

Claims (7)

1. DNA-sekvenssillä:, joka koodi ttaa ihmisen, SCF-polypeptidin ilmentämisen, joka. on SGF 1-162, [Met’1] SCF1-lb2, SCF 1-164, [Met-1] SGF 1-164' SGF ^16^ [Met-1] SGF 1-165, SCF 1-243 25 tai [Met-1] SCF 1-248 käyttäen kuvion 42 mukaista numerointia, joka: DNÄ-sekvenssi on toiminnallisesti liitetty ilmentämisen säätelysekvenssiin; tai ii) DNA-sekvenssillä, joka koodittaa ihmisen SCF-polypeptidin ilmentämisen, joka on SCF 1-157, [Met-1] SCF 1-30 137, SCF1-160, [Met-1] SCF 1-160 , SCF 1- i61, [Met-1] SCF 1-161, SCF —y tai [Met p] SCF käyttäen kuvion 44 mukaista nume rointiä, joka DNÄ-sekvenssi on toiminnallisesti liitetty ilmentämisen säätelysekvenssiin.

1. Nisäkkään yhdistelmäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu tai transfektoitu sisältämään ih- 5 misen kant a s o1u te ki j ä po1ypept id i ä koodaajaa DNA:ta, jota on muokattu in vitro sallimaan ihmisen kantasQiutekijäpo-lypeptidin suuremman ilmentämisen homologisen rekombinaa-tiotapahtuman avulla, joka koostuu ilmentämisen säätelysekvenssin sisällyttämisestä toiminnalliseen läheisyyteen 10 ihmisen kantasolutekijää köodittävaan DNA:hän, jolloin mainittu nisäkässolu on kädellisen solu tai jyrsijän solu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nisäkkään yhdiste Inä solu, tunnettu siitä, että ilmentämisen saäte-lysekvenssi ei ole ihmisen kantasolutekijän ilmentämisen 15 säätelyse kve n s s i .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen nisäkkään yhdistelmäsolu, tunnettu siitä, että ihmisen kan-tasolutekijää koodittapa. DNA on kromasomäallsta,

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nisäkkään yhdis-20 telmäsolu, tunnettu siitä, että solu on transfektoitu tai transformoitu:

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nisäkkään yh- j 35 distelmäsolu, tunnettu siitä, että se on kiinalaisen j hamsterin munasarjasolu. j

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen nisäkkään yhdis-telmäsolu, tunnettu siitä, että kiinalaisen hamsterin munasär jasöl.u on solutin j a, jolla on talletusnumero AT CC 10557.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nisäkkään yhdis- telmäsolu, tunnettu siitä, että se on GOS-l-solulinja.