CN100422209C

CN100422209C - 海螺毒素变体多肽化合物、制备方法和用途

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Publication number: CN100422209C
Application number: CNB2005100226723A
Authority: CN
Inventors: 张治国; 杨仑; 连桂芳; 徐朗莱
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: CN1793169A

Abstract

本发明公开了两个阿尔法—海螺毒素变体多肽化合物、编码这种多肽化合物的基因、这种多肽的制备方法和用途。属于生物领域。该肽由成熟的阿尔法—海螺毒素肽经过氨基酸替换、修饰和生物活性筛选而得，氨基酸序列方向N 端到C端为：GCCADPRCNYDHPEIC；通过化学合成或基因工程方法制备，具有拮抗神经元型烟碱样乙酰胆碱受体的活性，在受体研究和药物开发中具有重要价值，在制备镇痛药物和神经损伤修复中的应用和在治疗癌痛、艾滋病痛、神经痛、糖尿病相关疼痛以及风湿引起的疼痛等疼痛中的应用具有很好的效果。

Description

海螺毒素变体多肽化合物、制备方法和用途

技术领域

本发明涉及两种多肽化合物，其制备方法及其作为药物的应用，属于生物领域。

背景技术

长期以来，临床普遍采用杜冷丁、美沙酮以及吗啡等药物来缓解癌痛、关节炎和神经痛等顽固性疼痛。这类药物在临床应用中会出现药量递增、耐受、药效持久性差乃至成瘾等局限性，由此导致许多病人的疼痛得不到适当的镇痛治疗，尤其是手术后疼痛和对吗啡不敏感病人的疼痛。因此，筛选高效、低耐受、持久非成瘾的镇痛新药已成为必需。

目前，此类候选药物中有一类以富含半胱氨酸的多肽为代表。它们化学性质稳定，镇痛作用均强于吗啡且效果持久，没有阿片类药物的种种缺陷。据报道，目前具镇痛活性的此类多肽包括蝎哺乳动物毒素[中国专利，申请号CN01128235.5]、蝎昆虫毒素[Rong-Jin Guan，Chun-Guang Wang，Miao Wang，et al.A depressant insect toxinwith a novel analgesic effect from scorpion Buthus martensii Karsch.BBA，2001，1549：9-18]、蛇毒[中国专利，申请号CN02114746.9]、蜘蛛毒素[王贤纯，梁宋平，罗泽民.虎纹捕鸟蛛毒素-I突变体A1Y-HWTX-I的固相合成和生物学活性测定.中国生物化学与分子生物学报，2000，16(3)：357-362]和海螺毒素，而海螺毒素MV II A已经FDA批准上市，MV II A的变体多肽[中国专利，专利号ZL00109828.4]和海螺毒素SO3已获得中国专利授权[中国专利，专利号ZL99106070.9]。

由于种种原因，暂未有蝎毒用于开发镇痛药物的成功报道。蛇毒由于分子量较大而抗原性较强，使用中会引发过敏问题，蜘蛛毒素为电压敏感性钙通道拮抗剂，其作用靶点(N型钙离子通道)位于中枢神经系统，因此给药需脊椎管内注射[陈嘉勤，陈威华，邓梅春等.一种新型N型电压敏感性钙通道拮抗剂虎纹蜘蛛毒素-I对大鼠内脏痛模型镇痛作用的研究，第一军医大学学报，2005，25(1)：10-14]，使用不便。MV II A和SO3同属于欧米加-海螺毒素，也均因药靶为钙通道而给药不便。尽管SO3的开发者做了让药物透过血脑屏障的尝试，但至今未见成功应用的报道。此外，MV II A如使用不当则会导致大鼠明显的运动能力障碍，并可能引发N型钙离子通道中心位点阻塞及其外周自律机能的紊乱[Penn R D，Paice J A.Adverse effects associated with theintrathecal administration of ziconotide，Pain，2000，85：291-296]。

近年来，有数种同属富含半胱氨酸却非欧米加家族的海螺毒素肽被报道具有优于MV II A的镇痛活性[国际专利，申请号WO0044769]。它们中部分是通过诘抗外周神经系统中神经元型烟碱样乙酰胆碱受体(nAChr)，阻断外周神经系统对痛感的传导来达到镇痛效果，因此无需脑室或脊髓给药，可进行肌肉、脂肪、腹腔或皮下等注射[Satkunanathan N，Livett B，Gayler K，et al.Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviatesneuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones，Brain Research，2005，1059(2)：149-158]，大大方便了应用。

天然阿尔法-海螺毒素(Vc1.1)是一个由十六个氨基酸组成的多肽，具有拮抗神经元型烟碱样乙酰胆碱受体(nAChr)的活性。该受体与痛觉的传导相关，适当地抑制该受体可以起到镇痛作用，且在神经细胞受到伤害后，能够加速神经损伤的恢复[Sandall D W，Satkunanathan N，Keays D A，et al.A novel R-Conotoxin identifiedby gene sequencing is active in suppressing the vascular response to selectivestimulation of sensory nerves in vivo，Biochemistry，2003，42：6904-6911]。而在Vc1.1发现的5年前，Quiram等[Quiram P A，ine S M.Structural dlements ina-Conotoxin ImI essential for binding to neuronal a7-rReceptors.JBC，1998，273(18)：11007-11011]就已经对另一种阿尔法-海螺毒素(ImI)进行了不同形式的氨基酸替换和修饰，这些不同的分子改性使得ImI与nAChr的结合常数呈现不同的变化倍数(从0.798倍到1907倍)。

Vc1.1可以从海螺中直接提取而获得，但原料来源不足；亦可用化学合成的方法获得，但成本极高。因此，对于多肽化合物，基因工程方法可能是一个好的制备或生产方案。

发明内容

技术问题本发明的目的是针对上述镇痛药物的现有技术基础及其局限性，公开一种较天然阿尔法-海螺毒素Vc1.1具强镇痛活性的变体多肽AP2.1及其非酰胺化形式的分子AP2.0，同时公开了其制备方法及在制备镇痛和神经损伤修复药物中的应用。

技术方案

两种阿尔法-海螺毒素变体多肽化合物，其特征在于，氨基酸序列方向N端到C端为：

AP2.1 GCCADPRDNYDHPEIC*

AP2.0 GCCADPRDNYDHPEIC

其中，AP2.1具有酰胺化的C端，*-表示酰胺化。

此外还有包含该多肽序列的蛋白或融合蛋白，以及在它们基础上通过单独或组合采取氨基酸缺失、取代、添加以及共价和非共价修饰手段所获得的化合物。

制备AP2.1和AP2.0的方法

1化学合成方法

AP2.1和AP2.0的制备方法可以采用直接合成或基因工程的方法。对于直接合成，可以采用固相化学合成法：通过多步反应获得肽-树脂复合物，将复合物裂解、洗涤后进行凝胶层析获得目标肽，在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中用空气氧化法进行复性。

2基因工程制备方法

根据大肠杆菌密码子的偏好性，设计能够以正确的读码框插入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间的核苷酸序列：ggtacc gac gac gac gac aag GGTTGC TGC GCT GAC CCG CGT GAC AAC TAC GAC CAC CCG GAA ATC TGC taa gaattc(顺序为5’到3’)。其中，下划线部分为限制性酶切位点，斜体部分为肠激酶酶切位点，大写字母部分为编码区。这样设计使得AP2.1基因编码区能够以正确的读码框插入肠激酶位点和EcoRI酶切位点之间。按照分子克隆中常规的技术，合成上述序列的双链，并制造KpnI和EcoRI的粘性末端，将所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间。测序验证读码框正确性和插入的正确性，从而获得重组载体pET-32-AP2.1。上述几个步骤示意于图1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组基因工程菌株EBAP2.1。在T7强启动子的开启表达作用下，经过低温(22℃)长时间(24h)诱导后，表达的Trx-AP2.1融合蛋白(硫氧还原蛋白-AP2.1融合蛋白)可占菌体总蛋白的50％以上。破碎菌体后，该融合蛋白可经金属离子亲和层析柱上吸附、复性和肠激酶切割而获得具生物活性的AP2.0，这种物质可用作镇痛药物。

最后，还可以对产物C末端进行酰胺化从而获得更高活性和更强稳定性的AP2.1。

有益效果

天然Vc1.1与AP2.1的作用对象是神经元型nAChr，两者化学结构和性质上的区别在于(1)后者C端进行了酰胺化；(2)前者第四位氨基酸为Ser，后者为Ala；(3)Vc1.1的分子量为1806.6，AP2.1为1794.7；(4)前者等电点为4.29，后者为4.37。天然ImI和Vc1.1及其变体序列如下所示(*表示酰胺化)这些化学结构和基本性质上的差异决定了后者在镇痛效果和稳定性上具有突出的优越性。

ImI GCCSDPRDAWRC

ImI变体1 GCCADPRDAWRC

ImI变体2 GCCSDPRDAWRC*

AP2.1 GCCADPRDNYDHPEIC*

AP2.0 GCCADPRDNYDHPEIC

Vc1.1 GCCSDPRDNYDHPEIC

1.Vc1.1变体比天然化合物Vc1.1具有更强的nAChr结合常数，但结合常数增加的程度适当

根据本说明书背景中所述：海螺毒素ImI的变体与nAChr的结合常数或比天然ImI下降、或增加微小、或过强(结合常数增加达1907倍)。下降或增加过少无法达到生物活性优化的目的，过强则会完全导致nAChr丧失正常功能，在应用中会呈现很大的毒性，因此无法用作药用。

Vc1.1与ImI同源，因此，我们以“加强结合，但不能过分”为原则，进行了Vc1.1的性质优化工作。我们制备了多种可能适宜药用的变体，并用镇痛模型和毒理学实验来筛选出最适宜的化合物。最后发明了两种变体：AP2.1和C末端不进行酰胺化形式的分子AP2.0。它们相对于天然分子具有更好的镇痛活性更长的镇痛时间。根据本说明书前述参考文献15中的方法，我们进行了结合常数实验。实验结果表明：两者分别使其与nAChr的结合常数相对于Vc1.1提高了80.9％和53％。这是由于酰胺化使带负电的C端羧基成为不带电的酰胺基，从而减少了海螺毒素与nAChr结合面在负电荷上的排斥作用，相反却增强了疏水作用；进行第四位氨基酸Ser到Ala的替换即去掉Ser中的羟基，这样减少了空间位阻，从而使得结合适当地紧密了。然而这两种改变均是恰当而温和的修饰，并没有很大程度地改变分子整体的电性分布和空间结构，因而使这些变体仍然呈现一种较好的可逆结合。本发明中的AP2.1相对于天然分子来说，分子量略微降低，等电点基本不变，分子性质没有极大的变化，结合常数适当增加。这种在关键位点的恰到好处的改变使得Vc1.1变体的药理作用本质仍然是拮抗nAChr，而药用效果得以显著提高。

2.AP2.1和AP2.0相对于Vc1.1有更好的镇痛活性

由于变体分子AP2.1和AP2.0均恰当地增加了与nAChr的结合常数，适当地增加了拮抗nAChr的活性，适当地增加了对疼痛传导的阻断作用，使得该变体分子具有了更好的镇痛活性。

动物实验表明，在皮下注射同等剂量的Vc1.1、AP2.1和AP2.0后，在1h、4h、16h的时刻，AP2.1和AP2.0的镇痛活性均显著优于前者。

3.AP2.1和AP2.0相对于Vc1.1有更好的化学稳定性

由于改性可能恰当地减少了分子所带电荷，增强了疏水作用，使得分子在疏水力作用下团聚得更加紧密，从而实现化学稳定性的提高。

实验表明，Vc1.1在37℃下48小时基本丧失镇痛活性(只有原活性的13.5％)，而AP2.1和AP2.0在同样的实验条件下分别保持原活性85.8％和81.7％。

4.AP2.1和AP2.0相对于Vc1.1有更长的镇痛时间

由于1.1和1.3中所阐述的原因：更强的nAChr结合活性和更好的化学稳定性，这两方面因素的综合起来，使得变体分子能够发挥更长的镇痛时间。

动物实验表明，在皮下注射同等剂量的Vc1.1、AP2.1和AP2.0后，16h的时刻，AP2.1和AP2.0的镇痛活性均显著优于前者，在24h时刻，Vc1.1已经基本丧失镇痛活性，而AP2.1和AP2.0依然保持一定的镇痛活性。

5.AP2.1和AP2.0制备成本低

而相对于化学合成，基因工程制备这两种变体多肽的方法具有如下的优越性：

相对于多肽合成制备方法和一般的基因工程发酵的方法，本发明中的制备工艺由于主要核心操作都在亲和层析柱上进行，使得产物纯化步骤少。全部的纯化工艺仅需要吸附、复性、切割、洗脱四个步骤，大大减少仪器设备、人员、原料和能源的投入。

本工艺的核心部件是金属离子亲和层析柱。这是一种可以反复再生且效果优良的层析柱，其再生的成本很低。

此外，利用本发明中的制备工艺所得产物经反相HPLC检测，将峰面积积分后计算得知，一次纯化的纯度可达95.4％上，由此可见具有较高的纯度。该实验检测波长为215nm，上样量100μL。乙腈洗脱浓度从0％到100％。柱型为SOURCE 5RPC ST。相对于化学合成制备方法和一般的基因工程发酵，本工艺制得的产物纯度高，因此可降低下游的纯化成本。

经过经济核算，用本发明所涉及的方法生产阿尔法一海螺毒素(Vc1.1)及其变体多肽(AP2.1和AP2.0)的成本为用化学合成法生产成本的1/20。

6.Vc1.1变体在镇痛中的应用

1)镇痛活性高

据文献报道，海螺毒素MV II A的镇痛活性比吗啡高1000倍以上，且持续长久。其机制是通过抑制中枢神经系统中的N型钙离子通道而发挥其镇痛效力。Vc1.1的镇痛机理是拮抗神经元型烟碱样乙酰胆碱受体(nAChr)的活性。适当地抑制该受体可阻止痛觉信号的传导，从而起到镇痛作用。并且神经细胞受到伤害后，Vc1.1能够加速神经损伤的恢复。经小鼠醋酸扭体模型实验表明，Vc1.1的镇痛活性优于MV II A，而Vc1.1的变体多肽AP2.1的镇痛效果和持续时间均显著优于天然Vc1.1。因此本专利所述Vc1.1的变体多肽可以作为另一种的高活性镇痛药物。

2)给药方便

海螺毒素MV II A的药靶位于中枢神经系统，因此需颅内注射蛛网膜下腔给药或椎管内注射。在临床麻醉和镇痛上，中枢神经系统给药的原则是：(1)必须掌握相应的风险知识；(2)必须是经其它外科方法治疗无效的病例；(3)必须是口服或常规治疗无效的病例。这显然大大限制了其使用。

Vc1.1、AP2.1和AP2.0在使用上比MV II A方便许多。动物实验表明，这三种化合物可通过皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射等发挥其镇痛效果。这是因为其药靶神经元型nAChr位于外周神经系统。Vc1.1及其变体可以阻断痛觉向中枢神经系统的传导。

除前述几种给药途径外，本发明所指的给药途径是任意一种可以达到疗效的方法，但皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射最为简单易行。

3)作为药物具有低耐受性，无成瘾性

AP2.1和AP2.0不具有阿片类镇痛药所导致的耐受性和成瘾性。为达满意的镇痛疗效，吗啡的用药剂量必须不断增加，从而导致副作用的积累。同时，吗啡对某些神经痛，晚期肿瘤病人的疼痛等无明显疗效。众所周知，吗啡的使用还会导致依赖性。动物实验表明，AP2.1和AP2.0和其天然肽一样，达到同样得镇痛效果的前提下，在实验期间无需增加剂量，由此可知连续使用不会产生明显的耐受性，也不会对其产生依赖。

4)副作用小

AP2.1和AP2.0由于药靶确切、作用位点专一、与药靶结合强度恰到好处、用量低、用药剂量无需不断增加，因此具有很小的副作用。

5)用途广泛

由于药靶不同于阿片类药物，AP2.1和AP2.0适用于所有阿片类镇痛药敏感型和不敏感型的疼痛。本发明中针对AP2.1或AP2.0的应用是指它们作为缓解疼痛、修复神经损伤的候选药物或先导药物的应用。具体而言是指在治疗癌痛、艾滋病痛、神经痛、糖尿病相关疼痛以及风湿引起的疼痛等疼痛中的应用。同时也涵盖了Trx-AP2.1融合蛋白作为药物中间体在药物生产中的应用。

6)有效作用时间长

实验表明，适当剂量的皮下注射，AP2.1的镇痛效果可以维持24小时。AP2.0和Vc1.1的有效作用时间也远远长于MV II A。

附图说明

图1.pET-32a-AP2.1构建过程

左上为KpnI、EcoRI双酶切的具有粘性末端的线性载体；右上为单链合成、退火、连接所构建的包含肠激酶酶切位点编码序列、AP2.1编码区以及KpnI、EcoRI粘性末端的序列；两者经T4连接酶连接构成pET-32a-AP2.1重组载体

图2.1h时刻AP2.1、AP2.0、MV II A的镇痛效果比较

皮下注射后1h，生理盐水组和MVIIA组差异极显著(p＜0.01)，Vc1.1组和MVIIA组差异极显著(p＜0.01)，AP2.1组和AP2.0组差异显著(P＜0.05)

图3 1h、4h、16h时刻AP2.1、AP2.0和MV II A的镇痛效果对比

图中，在所有时刻，所有组与生理盐水在扭体抑制率上的差异均为极显著(p＜0.01)，在1小时时刻，AP2.1、AP2.0组和Vc1.1组差异显著(p＜0.05)，Vc1.1组和MV II A组差异极显著(p＜0.01)，AP2.1组和AP2.0组差异极显著(P＜0.01)。在4小时时刻，除AP2.0组和Vc1.1组之间差异不显著外，其余各组间均差异极显著(p＜0.01)。在16小时时刻，除AP2.1组和AP2.0组之间差异显著(p＜0.05)外，其余各组间均差异极显著(p＜0.01)

具体实施方式：

一种阿尔法一海螺毒素变体多肽化合物，其氨基酸序列方向N端到C端为：

AP2.1 GCCADPRDNYDHPEIC*

AP2.0 GCCADPRDNYDHPEIC

其中，AP2.1具有酰胺化的C端，*-表示酰胺化。

(一)合成编码AP2.1或AP2.0的基因并重组入pET-32a(+)表达载体，并构建发酵用基因工程菌

1.据大肠杆菌密码子的偏好性，设计能够以正确的读码框插入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间的核苷酸序列：ggtacc gac gac gac gac aagGGTTGCTGCGCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGC taa gaattc(顺序为5’到3’)。其中，下划线部分为限制性酶切位点，斜体部分为肠激酶酶切位点，大写字母部分为AP2.1基因编码区，从而使得AP2.1基因编码区能够以正确的读码框插入肠激酶位点和EcoRI酶切位点之间。

2.根据上述设计的基因序列，分别合成以下单链DNA(方向5’到3’)：

S1 CGACG ACGACGACAA GGGTTGCTGC gCTGACCCGC GTTGCA

S2 ACGCGGGTCA GcGCAGCAAC CCTTGTCGTC GTCGTCGGTA CAS1 ACTA CGACCACCCG GAAATCTGCT AAG

AS2 AATTCTTAGC AGATTTCCGG GTGGTCGTAG TTGCA

3.上述所有单链DNA均用多核苷酸激酶在其5’端添加磷酸基团。

4.将步骤3所得DNA按照以下方案进行退火：S1和S2进行退火；AS1和AS2进行退火，退火反应程序如下：

94℃5min；3个循环：每个循环1min，每分钟降低8℃；6个循环：每个循环1min，每分钟降低4℃；12个循环：每个循环1min，每分钟降低2℃；室温30min。

5.记S1和S2退火产物为S，AS1和AS2退火产物为AS。将S与AS连接得到图1右上方中所示序列。

6.按照分子克隆中常规的双酶切技术，将所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间。测序验证读码框正确性和插入的正确性，从而获得重组载体pET-32-AP2.1。上述几个步骤示意于图1。

7.分别将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组基因工程菌株。

(二)诱导表达以及表达产物的纯化、复性和融合蛋白切割

1.工程菌在氨苄青霉素的选择压下生长，至对数生长末期(OD₆₀₀＝0.8)时，加入0.1mM的IPTG进行诱导。22℃诱导24h后，收获菌体。

2.菌体经过2000r/min离心富集后超声破碎。收集包含体，用2M尿素洗涤后溶解于8M尿素和8mM的β-巯基乙醇，室温封口反应12h。

3.将上述反应物结合到Ni-NTA或Ni-IDA亲和层析柱上，随后用空气饱和的复性缓冲液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗涤浸泡24h以上。

4.用肠激酶酶切缓冲液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl₂；50mM NaCl；pH7.4)洗涤浸泡12h以上。

5.按照每单位肠激酶切割5mg融合蛋白的用量将酶加入柱内，室温反应48h以进行充分酶切。

6.用肠激酶酶切缓冲液洗脱经过切割下来的肽，纯度可达95％以上。

7.用丝氨酸型羧肽酶催化目标肽的C末端酰胺化反应。

(三)AP2.1和AP2.0经腹腔注射镇痛活性优于Vc1.1和MV II A

用醋酸扭体法测定AP2.1和AP2.0的镇痛活性。ICR小鼠体重20g左右，雌雄各半，随机分组，每组8只。腹腔注射0.1μM浓度的肽溶液0.5mL/20gbw。给药后1h时，腹腔注射0.8％的醋酸0.2mL/20gbw，记录15min内的小鼠扭体次数。每组取平均值，并和生理盐水对照组比较扭体次数差异的显著性。结果如图2所示，AP2.1和AP2.0的镇痛效果均显著强于Vc1.1。而Vc1.1的镇痛效果显著强于MV II A。

(四)AP2.1和AP2.0经一次腹腔注射的镇痛时间延续优于Vc1.1和MV II A

如同实施例3的镇痛药筛选模型，分别比较1h、4h、16h时刻AP2.1、AP2.0、Vc1.1和MV II A的镇痛效果，以1h时刻生理盐水组作为对照，测定扭体抑制率。结果如图3所示，AP2.1和AP2.0在1h和16h时刻的镇痛效果均显著强于Vc1.1。而Vc1.1的镇痛效果在1h、4h和16h时刻显著强于MV II A。同时，AP2.1和AP2.0的有效作用时间均长于Vc1.1，且AP2.1比AP2.0的有效作用时间更长。

Claims

1. 阿尔法-海螺毒素变体多肽化合物，其特征在于，氨基酸序列方向N端到C端为：

AP2.1：GCCADPRCNYDHPEIC*或

AP2.0：GCCADPRCNYDHPEIC

其中，AP2.1具有酰胺化的C端，*-表示酰胺化。

2. 编码权利要求1所述多肽化合物的基因。

3. 包含权利要求2所述基因的载体，其特征是，该载体在相容性宿主细胞中并且当宿主处于合适的生长状态下时能够生成权利要求1所述多肽化合物。

4. 制备权利要求1所述多肽化合物的方法，其特征是，通过化学合成的技术路线来制备。

5. 权利要求1多肽化合物在制备镇痛药物或神经损伤修复药物中的应用。