CN1280136A - 欧米加－海螺毒素变体多肽的基因序列、氨基酸序列以及它们的制备方法和医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及欧米加－海螺毒素(MⅦA)变化多肽的氨基酸及基因序列及这些多肽的制备方法,以及用MⅦA变体多肽治疗疼痛及减少神经细胞损伤。它将天然欧米加－海螺毒素的第12位的甲硫氨酸改为丙氨酸或甘氨酸或异亮氨酸或缬氨酸,并在DNA水平上,将欧米加－海螺毒素及其变体多肽的基因串联成多聚体,用原核或真核表达系统制备欧米加－海螺毒素及其变体多肽的串联多聚体。
Description
本发明涉及欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体多肽的氨基酸及基因序列及这些多肽的制备方法，以及用MVIIA变体多肽治疗疼痛及减少神经细胞损伤。
天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)是一个由二十五个氨基酸组成的多肽[1]，它是N-型钙离子通道的抑制剂，该离子通道主要分布在神经组织上，参与神经冲动，包括痛觉的传导，通过抑制N-型钙离子通道的活力可以抑制痛觉传导[4、5]，且在神经细胞受到伤害性刺激时，可以减少或防止神经细胞的损伤及死亡[6、7]。
本发明所涉及的欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体也是一组由二十五个氨基酸组成的多肽，它们与天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)的不同之处在于其第十二位的氨基酸。在天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)中，该位点为甲硫氨酸(Met)，而在本发明所涉及的变体中，该位点为丙氨酸(Ala)，或甘氨酸(Gly)，或亮氨酸(Leu)，或异亮氨酸(Ile)，或缬氨酸(Val)。这些变体也是N-型钙离子通道的抑制剂，但由于氨基酸组成的变异，使得这些变体获得了天然多肽母体所不具有的性质。
天然海螺毒素可以从海螺中用生物提取的方法获得，亦可用多肽化学合成的方法获得。这二种方法均有局限性，如原料来源的局限性，或生产成本昂贵等等。天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)中的甲硫氨酸(Met)在空气中易被氧化，其结果是使该多肽丧失N-型钙离子通道抑制剂的活力。本发明包含的内容之一为设计和产生天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)的变体以及制备这些变体多肽的方法，以克服上述缺点。
现有的镇痛药物有许多局限性，比如以吗啡为代表的鸦片类镇痛药会导致人体对其产生耐受性[2]，为达到满意的镇痛疗效，吗啡的用药剂量必须不断增加，而剂量的增加又导致副作用的增加，其二，吗啡对某些疼痛，如某些神经性疼痛，晚期肿瘤病人的疼痛无明显疗效。吗啡的另一缺点是它能导致人体对它的成瘾性及依赖性[2]。由于缺乏有效且副作用小的镇痛药，许多病人的疼痛得不到适当的镇痛治疗，尤其是手术后病人的疼痛及以那些对吗啡不敏感的病人的疼痛。本发明包含的另一内容是用欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体多肽治疗疼痛及保护神经细胞，使其免受损伤。
本发明的目的就是为了解决上述问题，提出一种欧米加-海螺毒素变体多肽的基因序列、氨基酸序列以及它们的制备方法和医药用途。
本发明的技术解决方案：Ⅰ．欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体多肽的特点
天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)与本发明所涉及的其变体的区别在于第十二位的氨基酸，在天然产物中该位为甲硫氨酸，在本发明所涉及的变体中为丙氨酸(Ala)，或甘氨酸(Gly)，或亮氨酸(Leu)，或异亮氨酸(Ile)，或缬氨酸(Val)。变体具有如下特性：
1．某些变体比天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)对N-型膜电位敏感型钙离子通道(VSCC)具有更强的亲和力。实验表明，12位为丙氨酸取代的变体(Ala12-MVIIA)比天然MVIIA对VSSC的亲和力增加了20％，因此是一个比天然产物更强的N-型VSCC抑制剂。
2．变体具有比天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)更高的稳定性
天然欧米加-海螺毒素的稀溶液在空气中极不稳定，其生物活力很快降低或消失。导致该不稳定性的原因是因为其12位的甲硫氨酸(Met)被氧化。12位甲硫氨酸被氧化的MVIIA比其还原型的生物活力降低10倍以上。在本发明所涉及的变体中，12位的甲硫氨酸被不易被氧化的氨基酸取代，使变体在空气中极其稳定，为证实本发明而做的实验表明：0．1 mg／ml的天然MVIIA水溶液或生理盐水溶液在室温下很快被氧化而失去生物活力，而0．1 mg／ml的12位为丙氨酸的变体(Ala12-MVIIA)水溶液或生理盐水溶液在室温下4星期后仍保持其生物活力。
3．变体比天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)更利于用本发明所涉及的原核或真核表达系统制备相应多肽。
本发明涉及的生产该多肽的方法之一为将变体多肽基因的DNA序列串联成基因的多聚体，基因与基因之间放置特定的间隔序列。由此形成的基因多聚体在原核或真核表达系统中翻译成变体多肽的多聚体。该多聚体中各单体多肽之间由含有甲硫氨酸的间隔序列分开。利用溴化氰可以断裂甲硫氨酸的羧基参与形成的肽键的特点，将变体多肽的多聚体断裂成单体(详见实例一)。天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)的序列中含有一个甲硫氨酸(第十二位)，因而不能用溴化氰水解的方法制备。Ⅱ．欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的制备
用基因工程的方法在原核或真核细胞表达系统中表达欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽为本发明的内容之一。其方法如下：在欧米加-海螺毒素及其变体多肽基因的DNA序列5’及3’端分别加上同尾酶的识别序列，所谓同尾酶是指限制性内切酶中具有识别和水解不同核苷酸顺序，但产生相同粘性末端的限制性内切酶。由此产生的粘性未端相连后不能再被同尾酶识别及切割。例如：Pst Ⅰ和Nsi Ⅰ分别识别和水解不同的核苷酸序列，CTGCAG为Pst Ⅰ的识别序列，ATGCAT为Nsi Ⅰ的识别序列。二者水解其识别序列的核苷酸后产生相同的粘性末端TGCA。将这二个酶形成的粘性末端相连后产生一新的核苷酸序列ATGCAG，它不能被Pst Ⅰ或NsiⅠ再切开。通过重复同尾酶水解，连接反应等步骤，构建多肽基因的重复串联多聚体，由此形成的多聚体中，基因单体与单体之间有一段间隔序列，这段序列包括由DNA限制性内切酶的识别序列相连而成的序列，以及根据需要而在DNA限制性内切酶的3’或5’端添加的特定核苷酸序列。将多肽基因的串联多聚体用基因工程的方法在原核或真核表达系统中表达成多肽的串联多聚体，间隔序列翻译成的氨基酸将被用来作为将多肽的串联多聚体加工成单体的断裂及加工位点。多聚体断裂、加工成单体的方法可以用化学反应或酶切反应。
本发明所涉及的多肽生产方法与其它的方法(如从海螺中提取或用多肽化学合成法)相比具有如下特点：①生产成本低；用本发明所涉及的方法生产欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的成本为用多肽化学合成法生产成本的1／8-1／16。②对环境的污染少。
实例一具体示范了用本发明所涉及的方法制备欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体多肽的方法之一。在该例中，第12位的氨基酸为丙氨酸(Ala)，变体多肽的代号为Ala12-MVIIA。Ⅲ．用欧米加-海螺毒素变体多肽治疗疼痛
欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽是N-型膜电位敏感型钙离子通道(VSCC)的抑制剂。该离子通道仅存在于神经细胞上，主要分布在胞体，树突，树突体及突触前端。其功能为调节去极化导致的钙流入，从而控制一系列细胞内钙离子浓度依赖性的过程，如神经细胞的兴奋性，神经递质的释放[3]，第二信使系统的激活及基因转录。欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽镇痛的机制之一是通过抑制N-型VSCC而抑制痛觉传入神经元释放神经递质，从而阻止痛觉信号的传导。
用欧米加-海螺毒素及其变体多肽作镇痛治疗具有如下特点：
1．具有很强的镇痛效率：其镇痛效率比目前临床上使用的最强的镇痛药吗啡高1000倍以上，且镇痛效果可以维持很长时间。临床实验表明：骨转移的肿瘤病人在对吗啡已不再敏感以后，通过蛛网膜下腔给予0．02微克Ala12-MVIIA(12位为丙氨酸的MVIIA变体)，疼痛消失，且无疼痛状态维持了72小时。
2．欧米加-海螺毒素(MVIIA)变体多肽不导致人体对其的耐受性，因而在连续使用时不需要增加剂量。
3．副作用小。以吗啡为代表的鸦片类(opioids)镇痛药导致人体对其的耐受性，用药剂量需不断增加，因而副作用也不断增加。欧米加-海螺毒素变体多肽具有较专一的作用位点，且用药剂量少，镇痛效果强，因而副作用小。
4．无成瘾性，可以长期使用。
用欧米加-海螺毒素作镇痛治疗的适用症即可以是对鸦片类镇痛药敏感的疼痛，也可以是对鸦片类镇痛药不敏感的疼痛。
用欧米加-海螺毒素治疗疼痛的给药途径可以是任意一种有疗效的给药途径，举例如下：1．蛛网膜下腔给药，2．硬膜外给药，3．口服，4．鼻粘膜给药，5．通过皮肤表面吸收，6．将药品直接给在疼痛部位或其附近，如伤口及神经等附近。7．血管内给药，8．肌肉注射给药，等等。
根据各种给药途径的特点，可以采取一些措施以增加疗效。如：使用脂质体、表面活性剂、高渗盐溶液、多聚体离子交换等方法，以增加多肽对硬膜、皮肤、鼻粘膜等的通透性；口服给药时，可以将多肽包在微胶囊中。某些给药途径可以用输液泵连续给药，如硬膜外或蛛网膜下腔给药；某些给药途径可以将多肽缓慢释放，如通过表皮吸收给药，或将多肽包埋在伤口的缝线中。
用欧米加-海螺毒素变体多肽治疗疼痛的几个实例如下：
1．手术后病人的镇痛：手术病人往往在术前已有蛛网膜下腔插管，术后将变体多肽一次性，或间断，或连续给入蛛网膜下腔，用以控制疼痛。
2．肿瘤病人晚期疼痛的治疗：这些病人往往已对鸦片类镇痛药不敏感。可以通过输液泵将变体多肽输入硬膜外或蛛网膜下腔；可以连续给药，也可以由病人自控给药，或间断给药。
3．神经性疼痛的治疗：这些病人的疼痛往往很剧烈，且对鸦片类镇痛药不敏感。可以通过蛛网膜下腔或硬膜外用输液泵给药的方式，长期连续给药，或病人自控给药，也可以将变体多肽直接给入病变的神经附近。Ⅳ用欧米加-海螺毒素及其变体多肽保护神经细胞
病理情形下，细胞内钙离子浓度升高是导致神经细胞损伤及死亡的重要原因，缺氧导致的神经细胞损伤或死亡即是实例之一。N-型膜电位敏感型钙离子通道(VSCC)是导致神经细胞内钙离子浓度升高的途径之一。欧米加-海螺毒素变体多肽是N-型VSCC的抑制剂，它通过抑制N-型VSCC从而抑制细胞内钙离子浓度的升高[8]。为证实本发明而做的实验表明：大鼠大脑全球性缺氧15分钟后，通过静脉一次性给入Ala12-MVIIA 5 mg／kg，神经细胞的死亡可以减少5-8倍，且15分钟缺氧处理后恢复给氧6小时至24小时给入Ala12-MVIIA，均可观察到类似的结果。
本发明涉及了用欧米加-海螺毒素变体多肽治疗任何原因造成的神经细胞损伤，尤其包括缺氧导致的神经细胞损伤。导致缺氧的原因很多，脑中风和脑创伤为二个实例。给药途径可以是任何一种能达到疗效的方法，但静脉给药是一个最简便易行的途径。
实例一 用大肠杆菌表达系统表达Ala12-MVIIA(12位为丙氨酸的欧米加-海螺毒素MVIIA)
1．Ala12-MVIIA单体基因的构建：
Ala12-MVIIA基因单体用DNA合成仪合成。所有氨基酸的密码子均选用在大肠杆菌中有较高表达效率的密码子，合成产物用HPLC纯化。
2．Ala12-MVIIA表达基因的构建
为了在大肠杆菌中表达Ala12-MVIIA的多聚体，需在Ala12-MVIIA基因单体的5’及3’端添加一核苷酸序列，其中包括克隆时需要的限制性内切酶的识别位点，供多体加工成单体时使用的氨基酸的密码子等。用聚合酶链式反应(PCR)完成单体基因5’及3’端的修饰，PCR的引物序列如下：
5’引物
5’C A T A T G C T G C A G A T G T G C A A A G G T A A A G G TG C T
Nde Ⅰ Pst Ⅰ Met 1 2 3 4 5 6Ala12-MVIIA
3’引物
5’C T C G A G A T G C A T A C C G C A T T T A C C G G A A C G G C A G GA A C C
Xho Ⅰ Nsi Ⅰ Gly 25 24 23 22 21 20 19 18Ala12-MVIIA
5’引物包括了二个限制性内切酶(Nde Ⅰ及Pst Ⅰ)的识别及切割位点，甲硫氨酸的密码子，Ala12-MVIIA第一到第五氨基酸的核苷酸序列。3’引物包含了二个限制性内切酶(Xho Ⅰ及Nsi Ⅰ)的识别及切割位点，甘氨酸的密码子，Ala12-MVIIA第18到25位氨基酸的核苷酸序列。甲硫氨酸和甘氨酸是将Ala12-MVIIA多聚体加工成单体时的加工／断裂位点。
以DNA合成仪合成的Ala12-MVIIA单体基因为模板，5’及3’引物为引物进行PCR反应，将纯化后的反应产物，即Ala12-MVIIA基因单体，用TA克隆的方法克隆到TA 2-1质粒中，所得质粒为Ala12-MVIIA／TA质粒。将该质粒转化到大肠杆菌E coli Top10中，制备Ala12-MVIIA／TA质粒DNA并通过序列测定验证其正确性。
3．Ala12-MVIIA基因多聚体的构建
将Ala12-MVIIA／TA质粒用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切割，得到二个DNA片段：含有TA载体质粒的TA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段及含有Ala12-MVIIA基因单体的Ala12-MVIIA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段。
将分离纯化的Ala12-MVIIA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段分成二部分：一部分用Pst Ⅰ酶切割，另一部分用Nsi Ⅰ酶切割。Pst Ⅰ和Nsi Ⅰ为同尾酶，即它们识别和切割不同的DNA序列，但产生同样的粘性末端。将含有这两个酶产生的粘性末端的DNA片段连接在一起即形成Ala12-MVIIA基因的二体，且不再能被Pst Ⅰ或Nsi Ⅰ中的任何一个酶切开。将Ala12-MVIIA基因双体克隆到TA载体质粒的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ位点之间，即形成含有Ala12-MVIIA基因的二体的质粒：Ala12-MVIIA Ⅱ／TA质粒。用该质粒转化E．coli Top 10以扩增、制各质粒DNA。
以Ala12-MVIIAII／TA为起始单元，从重复上述步骤即得到含有Ala12-MVIIA基因四体Ala12-MVIIA ⅣV／TA质粒。以Ala12-MVIIA Ⅳ／TA为起始单元，重复上述步骤即可得到八体基因多聚体Ala12-MVIIA Ⅷ／TA质粒。测定八聚体的DNA序列以证明其正确性。
4．多聚体Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a表达质粒的构建
将Ala12-MVIIA基因八聚体从Ala12-MVIIA Ⅷ／TA质粒中用Nde Ⅰ及XhoⅠ切出，重新克隆到表达质粒pET 29a的Nde Ⅰ及Xho Ⅰ位点之间。
将Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a转化到表达宿主菌BL21(DE3)中即形成工程菌Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a／BL21(DE3)。
5．Ala12-MVIIA多肽多聚体的表达及纯化
挑取工程菌Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a／BL21(DE3)单菌落培养过夜。将过夜菌按2％按种至液体培养基如LB中，在37℃培养至0D600=0．8，加入0．5mM IPTG诱导Ala12-MVIIA八聚体多肽的表达，诱导后继续培养3小时，然后离心收集菌体。用pET29a表达载体所表达的产物的C末端带有6个组氨酸(His)，因而可以用Ni-Sephorose亲和层析纯化Ala12-MVIIA八聚体多肽，产物经SDS电泳鉴定纯度在90％以上，Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a质粒的表达产物如下：
溴化氰 Amidase断裂位点 作用位点
6．Ala12-MVIIA多肽多聚体的化学裂解及单体纯化
将纯化后的Ala12-MVIIA多聚体按1 mg／ml的浓度溶于溴化氰溶液中，溴化氰溶液用70％的甲酸配制，浓度为5 mg／ml。将Ala12-MVIIA多聚体的溴化氰溶液在室温置通风橱中反应24小时，以断裂甲硫氨酸的羧基参与形成的肽键，本例中为Met-Cys之间的肽键。反应完毕后加入8倍体积的10M NaOH以中和溴化氰。将裂解产物超滤，脱盐，冻干。RP-HPLC纯化。加5mM的β-Me 40℃ 6小时。稀释100倍，敞口避光空气氧化数日，用艾伦试剂测量无游离巯基时，透析，超滤浓缩后溶于磷酸缓冲液中，用Amidase断裂由甘氨酸(Gly)氨基参与形成的肽键，在本例中为Cys-Gly，其反应结果是使半胱氨酸的羧基酰胺化，反应结束后加三氯醋酸终止反应。RP-HPLC纯化。附图是Ala12-MVIIA基因双体的构建示意图。如附图：将二端加有限制性内切酶切点的Ala12-MVIIA基因DNA单体克隆到TA 2-1载体质粒中，所得质粒为Ala12-MVIIA／TA。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ将Ala12-MVIIA基因切出，并进一步用Nsi Ⅰ或Pst Ⅰ消化，将酶切产物与经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切割的TA 2-1质粒用连接酶相连，其产物为含有Ala12-MVIIA基因双体的质粒Ala12-MVIIA Ⅱ／TA。附件：天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)及本发明所涉及的其变体多肽的氨基酸序列。序列Ⅰ(Ala12-MVIIA)：C K G K G A K C S R L A Y D C C T G S C R S G K C序列Ⅱ：C K G K G A K C S R L G Y D C C T G S C R S G K C序列Ⅲ：C K G K G A K C S R L L Y D C C T G S C R S G K C序列Ⅳ：C K G K G A K C S R L I Y D C C T G S C R S G K C序列Ⅴ：C K G K G A K C S R L V Y D C C T G S C R S G K C天然欧米加-海螺毒素(MVIIA)：C K G K G A K C S R L M Y D C C T G S C R S G K C参考文献：1．Olivera Bm．，Gray WR．，Zeikus R．，McIntosh JM．，Varga J．，RivierJ．，Santos V．，Cruz LJ． (1985)Peptide Neurotoxins from fish-hunting cone snails． Science 230：1338-432．Wang YX．，Gao D．，Pettus M．，Phillips C．，BowersoxSS．(2000)Interactions of intrathecally administeredziconotide，a selective blocker of neuronal N-type voltage-sensitive calcium channels， with morphine on nociceptions inrats．Pain84：271-2813．SeagarM．，Takahashi M． Interactions between presynaptic calciumchannels and proteins implicated in synaptic vesicle tratfickingand exocytosis．Journal of Bioenergelics and Biomembranes30(4)：347-564．White DM．，Cousins MJ．(1998) Effect of subcutaneousadministration of calcium channel blockers on nerve injury-induced hyperalgesia． Brain Research 801(1-2)：50-85．Malmberg AB．，Yaksh TL．(1995)Effect of continuous intrathecalinfusion of omega-conopeptides，N-type calcium-channel blockers，on behavior and antinociception in the formalin and hot-platetests in rats． Pain 60(1) ：83-906．Imaizumi T．，Kocsis JD．，Waxman SG．(1999)The role of voltage gatedCa2+ channels in anoxic injury of spinal cord white matter．BrainResearch 817 (1-2) ：84-927．Takizawa S．，Matsushima K．，Fujita H．，Nanri K．，Ogawa S．，Shinohara Y．(1995)A selective N-type calcium channel antagonistreduces extracellular glutamate release and infarct volume infocal cerebral ischemia．Journal of Cerebral Blood flow andMetabolism 15 (4) ：611-88．Samii A．，Badie H．，Fu K．，Luther RR．，Hovda DA．(1999) Effectsof an N-type calcium channel antagonist (SNX 111；Ziconotide)oncalcium-45 accumulation following fluid-percussion infury．Journal of Neurotrauma 16(10)：879-92．
Claims (14)
1．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的氨基酸序列Ⅰ，其特征在于将天然欧米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改为丙氨酸(Ala)，其氨基酸序列Ⅰ为：
1 5 10 15 20 25
C K G K G A K C S R L A Y D C C T G S C R S G K C
2．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的氨基酸序列Ⅱ，其特征在于将天然欧米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改为甘氨酸(Gly)，其氨基酸序列Ⅱ为：
1 5 10 15 20 25
C K G K G A K C S R L G Y D C C T G S C R S G K C
3．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的氨基酸序列Ⅲ，其特征在于将天然欧米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改为亮氨酸(Leu)，其氨基酸序列Ⅲ为：
1 5 10 15 20 25
C K G K G A K C S R L L Y D C C T G S C R S G K C
4．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的氨基酸序列Ⅳ，其特征在于将天然欧米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改为异亮氨酸(Ile)，其氨基酸序列Ⅳ为：
1 5 10 15 20 25
C K G K G A K C S R L I Y D C C T G S C R S G K C
5．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的氨基酸序列Ⅴ，其特征在于将天然欧米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改为缬氨酸(Val)，其氨基酸序列Ⅴ为：
1 5 10 15 20 25
C K G K G A K C S R L V Y D C C T G S C R S G K C
6．翻译产物的氨基酸序列分别为序列Ⅰ，序列Ⅱ，序列Ⅲ，序列Ⅳ，序列Ⅴ的DNA序列。
7．用原核或真核细胞表达系统制备欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽。
8．一种欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的制备方法，其特征在于在DNA水平上，将欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的基因串联成多聚体，用原核或真核表达系统制备欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的串联多聚体。
9．按权利要求书8所述的欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的制备方法，其特征在于利用DNA限制性内切酶中的同尾酶具有识别和水解不同核苷酸序列，但产生相同的粘性末端，且当二者的粘性末端相连后不能再被同尾酶识别及切割的特点，在MVIIA及其变体基因DNA序列的5’端及3’端分别加上同尾酶的识别序列，通过重复用同尾酶水解，连接反应等步骤，构建MVIIA及其变体基因的串联多聚体。
10．按权利要求书8所述的欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的制备方法，其特征在于根据欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的氨基酸及DNA序列的特点，在构建其基因的重复串联多聚体时利用同尾酶本身的识别序列，或在同尾酶识别序列的5’端或3’端加入适当的核苷酸序列，从而使串联重复的各MVIIA及其变体单体基因间存在特定的间隔序列，这些间隔核苷酸序列在翻译成氨基酸后，成为将欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的多聚体加工成单体多肽的断裂、加工位点。
11．按权利要求书10所述的欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体多肽的制备方法，其特征在于用化学或酶学方法将欧米加-海螺毒素(MVIIA)及其变体基因的串联多聚体的表达产物，即多肽的串联多聚体断裂或切割，加工成单体多肽。
12．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的医药用途，其特征在于它用于镇痛治疗，例如：手术后镇痛，肿瘤病人的镇痛，爱滋病人的镇痛，神经性疼痛的治疗，烧伤及烫伤病人的镇痛等等。
13．一种欧米加-海螺毒素变体多肽的医药用途，其特征在于保护神经细胞，以减少或防止神经细胞的损伤及死亡，造成神经细胞损伤或死亡的原因可以为任意一种，尤其包括由于缺氧导致的神经细胞损伤，脑中风及创伤为二个实例。
14．按权利要求书12和13所述的欧米加-海螺毒素变体多肽的医药用途，其特征在于治疗疼痛及神经细胞损伤的给药途径可以为任何一种能达到疗效的方式，例如蛛网膜下腔给药，硬膜外给药，疼痛部位局部给药，通过体表吸收的方式给药，血管内给药，腹腔给药等等。
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