CN1896108A - 特异性抗凝血物质的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，更具体地说，本发明涉及抗凝血物质与能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新的抗凝血物质或抗凝血物质与其他物质通过能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列作为寡肽连接而成的新物质，以及这些新的抗凝血物质的医药学用途。

Description

特异性抗凝血物质的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一类抗凝血物质的蛋白质结构及其制备方法和在防治血栓相关性疾病中的应用。具体而言，本发明涉及抗凝血物质与能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新物质，或抗凝血物质与其它物质通过能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新物质，以及这些新物质的医药用途。
背景技术
心血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手，血栓形成是许多心血管疾病的重要诱因，抗凝剂是防治血栓形成的重要药物。目前临床上广泛应用的抗凝剂主要是肝素，其作用是通过与抗凝血酶III(antithrombin III)结合来抑制凝血酶(thrombin)的活性，因而可能引起抗凝血酶III的减少，肝素的一个重要缺点是引发血小板减少症(thrombocytopenia)。现在又发展的低分子量肝素可以减轻肝素应用中的风险程度，但不能根本克服它的缺点。水蛭素是近年来欧洲已经上市的一个新型抗凝药物，它是凝血酶的直接抑制剂，但它对凝血酶的强抑制作用，可导致凝血相关参数，如APTT、TT等急剧升高，从而伴有全身或系统性出血风险。
现有抗凝药物存在的上述问题已经越来越多的受到人们的关注，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗凝抗栓效果，但又不引起出血副作用，使临床用药安全性提高。
为此，本发明思想的指导原则的关键是使抗凝剂活性进行特异性释放，即在正常条件下，该类物质无抗凝活性，而当凝血系统被激活，有血栓形成可能时，该类物质的抗凝活性才在血栓局部释放，营造不易形成血栓的微环境(即在可能发生血栓的局部出现抗凝活性)，甚至溶解已形成的微小栓子以达到防治血栓形成的功能。这就克服了肝素、水蛭素等抗凝剂用药引起系统性出血的风险。
例如水蛭素是由65～66个氨基酸组成的单链多肽。其氨基端可以与凝血酶催化活性位点结合，具有抗凝活性，羧基端与凝血酶的底物识别位点结合，对凝血酶有很强的特异性亲和作用。本文设计了一个封闭水蛭素氨基末端的措施，以达到降低水蛭素的抗凝活性的目的。当体内凝血系统被激活将发生血栓时，利用血栓发生过程中引发的生物化学变化的特点，使氨基末端被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在可能发生或已发生的血栓的局部发挥特异性抗凝作用，从而成为一类新型的、安全的、有效的抗凝剂。
在上述发明思想的指导下，本文对水蛭素进行了如下修饰：在水蛭素的氨基末端连接上可被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽。该水蛭素衍生物在体内正常情况下不具有抗凝活性，一旦体内凝血系统被激活，则在凝血酶或凝血因子Xa的作用下，释放水蛭素的抗凝活性，起到抗栓作用。如果在上述水蛭素衍生物的氨基末端再连接上一惰性多肽(如白蛋白)，则可使上述抗凝剂的药效时间延长，成为一个长效抗凝剂。当然，上述物质对于体内不存在血栓的部位，则无抗凝活性。因此，它不同于水蛭素、肝素等抗凝剂，是一类安全、有效的防栓剂。从而，此类特异抗凝剂对于防治血栓形成的应用具有重要意义。
发明目的
本发明的目的在于提供无抗凝活性而可以防治血栓形成的物质。
发明内容
本发明现已发现，利用凝血酶或凝血因子Xa识别序列连接抗凝血蛋白可实现对抗凝血蛋白抗凝活性的封闭。衍生的抗凝血蛋白具有如下的特征：抗凝血蛋白如水蛭素的氨基末端被凝血酶或凝血因子Xa识别序列封闭后，在体外和血液系统非血栓部位没有抗凝活性，从而避免或减小了因抗凝血蛋白如水蛭素引起的系统出血的副作用；衍生的抗凝血蛋白只有在血栓发生时，在特有的凝血酶或凝血因子Xa的作用下才释放出游离的抗凝血蛋白，发挥特异性抗凝活性。本发明基于上述特征的发现现已完成。
因此，本发明第一方面涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。
本发明再一方面涉及制备含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括将凝血酶或凝血因子Xa识别序列对应的碱基序列与抗凝血蛋白基因进行连接，另外，将含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白基因上接入惰性多肽的基因，然后这些基因构建至适合表达的载体，如pBV220，pPIC9，pPIC9K等，这些含有目的基因的重组载体在适宜的宿主中表达，例如在大肠杆菌，酵母或动物细胞体系中表达而得到新的抗凝血蛋白。
本发明再一方面涉及含有上述抗凝血蛋白及药用载体或赋形剂的药物组合物。
根据本发明，术语“抗凝蛋白”或“抗凝血蛋白”是指能够抗凝血的蛋白，如水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒等，或它们的突变体。优选水蛭素或其突变体。
根据本发明，术语“凝血酶或凝血因子Xa识别的连接肽”或“凝血酶或凝血因子Xa识别的寡肽”是指四肽序列IEGR(IleGluGlyArg)或含有IEGR的肽段，或四肽序列LGPR(LeuGlyProArg)或含有LGPR的肽段。
根据本发明，本发明的含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白优选在水蛭素氨基末端连接上IEGR或LGPR；人白蛋白与水蛭素通过连接肽EFIEGR连接而成的融合蛋白AFH(HSA-EFIEGR-HV2)或人白蛋白与水蛭素通过连接肽EFLGPR连接而成的融合蛋白ATH(HSA-EFLGPR-HV2)；多肽DAEAYV与水蛭素通过连接肽EFIEGR连接而成的融合蛋白PFH(P-EFIEGR-HV2)，或多肽DAEAYV与水蛭素通过连接肽EFLGPR连接而成的融合蛋白PTH(P-EFLGPR-HV2)。
根据本发明，本发明的含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白可在适宜的宿主系统中表达，优选在大肠杆菌或酵母中表达。
附图概述
图1显示FH和TH的核苷酸序列。
下面的实施例用来进一步说明本发明，但并不意味着对发明的任何限制。
实施例1IEGR-HV2(FH)和LGPR-HV2(TH)的制备及其防治血栓形成功能
1.FH和TH蛋白的获取
通过PCR将限制性酶切位点Xho I和凝血因子Xa识别序列IEGR或凝血酶识别序列LGPR对应的碱基序列引入HV2基因的上游，在HV2基因下游引入EcoR I酶切位点，将该基因连接到相同酶切的pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9-FH和pPIC9-TH。将pPIC9-FH和pPIC9-TH和pPIC9K用BamH I和Sal I双酶切后进行连接，得到pPIC9K-FH和pPIC9K-TH。将两个重组质粒电转化重组到酵母基因组，甲醇诱导表达。经分离纯化得到蛋白FH和TH。
2.FH和TH的抗栓作用和出血副作用分析
①FH和TH在Carrageenin诱发的小鼠尾部血栓模型中的抗栓作用，每组动物10只，给药剂量为2.5mg/kg。结果以 X±S表示，见表1。
                    表1FH和TH对小鼠尾部血栓长度的影响
  组别   NS   HV2   FH   TH
  血栓长度(cm)   3.80±1.25   1.97±1.51#   1.56±1.84#   1.00±0.70#
#P＜0.05，与NS组相比
上表说明FH和TH在体内具有抗栓功能。
②FH和TH在大鼠下腔静脉血栓模型中的抗栓作用和出血倾向，每组动物10只，给药剂量为0.5mg/kg，结果以X±S表示，见表2～表5。
                 表2FH和TH对大鼠下腔静脉血栓湿重的影响
  组别   NS   HV2   FH   TH
  血栓湿重(mg)   7.81±4.07   2.99±2.93#   3.37±2.77*   2.86±2.49#
#P＜0.05，与NS组相比
                    表3FH和TH对大鼠下腔静脉血栓模型TT的影响
  组别   TT(s)
  给药前   给药后0.5h   给药后1h   给药后2h   给药后4h
  NSHV2FHTH   31.87±2.4632.95±3.9731.84±2.2734.25±7.93   29.57±3.0762.34±20.14#32.63±2.3435.14±11.86   28.69±2.7551.21±5.67#30.63±4.8228.94±4.48   27.44±2.9237.18±7.1128.82±5.0635.44±4.49   29.61±1.9433.45±8.2430.22±4.7732.26±2.19
#P＜0.05，与给药前相比
                        表4FH和TH对大鼠下腔静脉血栓模型APTT的影响
  组别   APTT(s)
给药前 给药后0.5h 给药后1h 给药后2h 给药后4h
  NSHV2FHTH   34.40±15.2226.89±3.0231.91±12.1041.28±11.44   36.44±16.8258.19±37.48#30.18±14.3535.33±21.11   36.17±15.4339.01±13.77#35.23±12.8232.66±7.18   35.96±14.6337.05±12.77#45.00±16.9541.74±16.34   38.77±17.5940.68±14.22#35.07±18.7629.41±6.61
#P＜0.05，与给药前相比
                        表5FH和TH对大鼠下腔静脉血栓模型PT的影响
  组别   PT(s)
给药前 给药后0.5h 给药后1h 给药后2h 给药后4h
  NSHV2FHTH   16.7±0.8317.76±0.9718.00±2.9817.33±1.49   17.11±1.1620.25±1.63#19.83±6.3919.6±3.64   16.99±1.1118.68±0.9417.82±1.5617.72±2.15   17.2±1.0818.12±1.3418.97±6.1020.01±6.13   17.47±0.8419.52±5.5718.11±1.2919.89±5.39
#P＜0.05，与给药前相比
从表2～表5看出，FH和TH在大鼠下腔静脉血栓模型中具有抗栓作用，且无明显的出血副作用，而水蛭素虽然有抗栓作用，但具有明显的出血副作用。
③FH和TH在大鼠颈总动脉血栓模型中的抗栓作用和出血副作用分析，每组动物10只，结果以X±S表示。结果见表6～表9。
                    表6FH和TH对大鼠颈总动脉血栓形成的影响
组别 NS   HV(2mg/kg)   FH(mg/kg)
  1   2   4   8
  血栓形成时间(s)   774.80±142.57   1073±226#   894±238   988±231#   1096±255.9#   1296.4±341.62#
组别 NS   HV(2mg/kg)   TH(mg/kg)
  1   2   4   8
  血栓形成时间(s)   774.80±142.57   1073±226#   772±163   881±145   927.8±152.84#   1207.5±374.67#
#P＜0.05，与NS组相比
                    表7FH和TH对大鼠颈总动脉血栓模型APTT的影响
组别 NS   HV(2mg/kg)   FH(mg/kg)
  1   2   4   8
  APTT(s)   22.9±5.3   42.3±19.1※   26.4±12.9   28.3±15.5   29.1±4.5#   32.1±3.8#
组别 NS   HV(2mg/kg)   TH(mg/kg)
  1   2   4   8
  APTT(s)   22.9±5.3   42.3±19.1※   23.5±9.1   23.3±6.3   30.7±5.2#   31.9±4.9#
#P＜0.05，与NS组相比；※与其它所有实验组相比
                    表8FH和TH对大鼠颈总动脉血栓模型TT的影响
组别 NS   HV(2mg/kg)   FH(mg/kg)
  1   2   4   8
  TT(s)   32.6±7.2   305±32※   36.5±5.5*   37.4±5.7*   46.5±13.2**   49.1±11.9**
组别 NS   HV(2mg/kg)   TH(mg/kg)
  1   2   4   8
  TT(s)   32.6±7.2   305±32※   34.4±4.2   36.6±4.8*   42.5±4.4**   47.2±5.9**
*P＜0.05，与NS组相比；**P＜0.01，与NS组相比
※P＜0.01，与其它所有实验组相比
                    表9FH和TH对大鼠颈总动脉血栓模型PT的影响
组别 NS   HV(2mg/kg)   FH(mg/kg)
  1   2   4   8
  PT(s)   16.5±0.7   23.2±2.6*   19.2±6.5   22.6±7.7   22.8±3.8   23.6±3.8*
组别 NS   HV(2mg/kg)   TH(mg/kg)
  1   2   4   8
  PT(s)   16.5±0.7   23.2±2.6*   16.7±1.7   17.5±0.9   23.1±4.4   24.3±4.4*
*P＜0.05，与NS组相比
从表6可看出，FH和TH可延长大鼠颈总动脉血栓形成时间，且成剂量依赖关系，说明二者具有抗动脉血栓形成功能。从表7～表9可看出，与HV2相比，FH和TH对抗凝参数APTT、TT和PT的影响较小，说明其体内出血副作用较小，比HV2的用药安全性提高。
实施例2HSA-EFLGPR-HV2融合蛋白(ATH)和HSA-EFIEGR-HV2融合蛋白(AFH)的制备及其抗栓和抗凝活性
在人白蛋白HSA基因上下游分别加上Xho I和EcoR I酶切位点，构建不带终止密码子的HSA基因到pPIC9载体，用BamH I和EcoR I双酶切上述载体和pPIC9K载体，将HSA连接至pPIC9K载体上；用PCR方法在水蛭素基因上游加上EcoR I酶切位点和凝血酶/凝血因子Xa识别序列的编码碱基，在水蛭素下游引入Not I酶切位点；用EcoR I和Not I双酶切带凝血酶/凝血因子Xa识别序列的水蛭素基因并连接到上述构建的带HSA基因的pPIC9K载体的HSA下游，构成融合基因ATH/AFH，得质粒pPIC9K-ATH/AFH。线性化pPIC9K-ATH/AFH质粒，经电转化重组到酵母基因组，甲醇诱导表达，得到融合蛋白ATH和AFH，融合蛋白含HSA氨基酸序列、凝血酶/凝血因子Xa识别序列、水蛭素氨基酸序列三个功能区。
ATH防治大鼠下腔静脉结扎所致血栓的作用，每组动物10只，试验结果以 X±S表示，见表10和表11。
表10ATH对大鼠下腔静脉血栓形成的作用
  组别   血栓湿重(mg)
  生理盐水HV2ATH   9.957±4.0335.771±2.366#5.667±2.634#
#P＜0.05，与生理盐水组相比
                         表11ATH对大鼠外周血凝血酶时间(TT)的影响
组别   不同给药时间的TT(s)
  0h   0.5h   1h   1.5h   2h   3h
  生理盐水HV2ATH   32±6.033±6.532±6.0   33±6.5123±43#34±6.5   31±6.588±21#35±7.0   34±6.065±16#34±6.0   32±5.040±8.0#33±6.5   33±5.534±6.534±5.5
#P＜0.05，与给药前相比
表10～11结果说明HV2及ATH均有抗栓活性，但HV2可引起出血副作用，而ATH无明显的出血倾向，安全性得到提高。
实施例3P-IEGR-HV2融合蛋白(PFH)的制备及其抗栓和抗凝活性
用PCR方法在水蛭素基因上游加上EcoR I酶切位点和含凝血因子Xa识别序列的多肽(EFDAEAYVIEGR)的编码碱基，水蛭素下游引入Not I酶切位点，连接入EcoR I和Not I双酶切的pPIC9K质粒，得pPIC9K-FH重组质粒。线性化pPIC9K-FH质粒，电转化并重组到酵母基因组，甲醇诱导表达。融合目的蛋白含寡肽P(氨基酸序列为DAEAYV)、凝血因子Xa识别序列、水蛭素氨基酸序列三个功能区。
融合蛋白(PFH)的体内抗栓活性：以Carrageenin诱导的小鼠尾部血栓模型测定融合蛋白(PFH)的体内抗栓活性，并测定凝血酶时间TT值，结果以X±S表示。结果见表12。
           表12PFH对小鼠尾部血栓形成和TT的影响
组别   动物数(只)   血栓增长倍数 TT(s)
  NSHV2PFH   101010   3.011.601.60   12.9±2.7546.9±10.521.9±4.35
注：每12小时腹注给药，HV2为0.75mg/kg，等摩尔数给药PFH为0.8mg/kg，
实验用昆明小鼠，血栓增长倍数是72小时血栓长度与24小时血栓长度之比值，TT为给药后一小时测值。
上表结果说明HV2及PFH均有抗栓活性，但HV2有明显出血倾向，PFH出血倾向则大为减低。
                                    序列表
<110>军事医学科学院放射与辐射医学研究所
<120>特异性抗凝血物质的制备及其应用
<160>2
<210>1
<211>222
<212>DNA
<213>TH序列
<400>1
CTCGAGAAAA GATTGGGTCC AAGAATTACT TACACTGATT GTACAGAATC GGGTCAAAAT
TTGTGCCTCT GCGAGGGAAG CAATGTTTGC GGTAAAGGCA ATAAGTGCAT ATTGGGTTCT
AATGGAAAGG GCAACCAATG TGTCACTGGC GAAGGTACAC CGAAGCCTGA AAGCCATAAC
AACGGCGATT TCGAAGAAAT TCCAGAAGAA TATTTACAAT AA                222
<210>2
<211>222
<212>DNA
<213>FH序列
<400>2
CTCGAGAAAA GAATCGAAGG TCGTATTACT TACACTGATT GTACAGAATC GGGTCAAAAT
TTGTGCCTCT GCGAGGGAAG CAATGTTTGC GGTAAAGGCA ATAAGTGCAT ATTGGGTTCT
AATGGAAAGG GCAACCAATG TGTCACTGGC GAAGGTACAC CGAAGCCTGA AAGCCATAAC
AACGGCGATT TCGAAGAAAT TCCAGAAGAA TATTTACAAT AA                222

Claims (8)

1.含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。
2.权利要求1的抗凝血蛋白，包含水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒等，或它们的突变体。
3.权利要求2的抗凝血蛋白，包含水蛭素或其突变体。
4.权利要求1的含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其中寡肽为能被凝血酶或凝血因子Xa识别的氨基酸序列，或含有能被凝血酶或凝血因子Xa识别序列的氨基酸序列。
5.权利要求4的含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其中寡肽为能被凝血因子Xa识别的氨基酸序列IEGR或含有IEGR的肽段，或为能被凝血酶识别的氨基酸序列LGPR或含有LGPR的肽段。
6.权利要求1的含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其为在水蛭素N末端连接IEGR或LGPR的抗凝血蛋白FH和TH；人白蛋白与水蛭素通过寡肽EFIEGR连接而成的融合蛋白AFH(HSA-EFIEGR-HV2)或人白蛋白与水蛭素通过寡肽EFLGPR连接而成的融合蛋白ATH(HSA-EFLGPR-HV2)；或者多肽DAEAYV与水蛭素通过寡肽EFIEGR连接而成的融合蛋白PFH(P-EFIEGR-HV2)，或多肽DAEAYV与水蛭素通过寡肽EFLGPR连接而成的融合蛋白PTH(P-EFLGPR-HV2)。
7.制备含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括将编码IEGR或LGPR的碱基序列引入抗凝血蛋白基因的上游，通过EFIEGR或EFLGPR序列对应碱基将人白蛋白基因与水蛭素基因连接而成融合蛋白基因，然后这些基因在大肠杆菌，酵母或动物细胞体系中表达。
8.含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白及药用载体或赋形剂的药物组合物。
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